CN112203680A - 用于细胞疗法的表型标记和相关方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用于在细胞疗法中使用的方法、组合物和制品，所述细胞疗法涉及给予一个或多个剂量的治疗性T细胞组合物；以及用于在所述细胞疗法中使用的方法、组合物和制品。所述T细胞组合物的细胞表达重组受体或其他转基因受体，所述重组受体如为嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)，所述其他转基因受体如T细胞受体(TCR)。本公开文本的实施方案的特征(包括所给予细胞的剂量或细胞的单位和/或所给予细胞的表型)提供了各种优点，如被给予所述T细胞组合物的受试者的一致给药、较低毒性风险和/或增加的反应。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求以下申请的优先权：2017年12月8日提交的名称为“用于细胞疗法的表型标记和相关方法(PHENOTYPIC MARKERS FOR CELL THERAPY AND RELATED METHODS)”的美国临时申请62/596,775；2018年3月14日提交的名称为“用于细胞疗法的表型标记和相关方法(PHENOTYPIC MARKERS FOR CELL THERAPY AND RELATED METHODS)”的美国临时申请号62/643,165；2018年4月13日提交的名称为“用于细胞疗法的表型标记和相关方法(PHENOTYPIC MARKERS FOR CELL THERAPY AND RELATED METHODS)”的美国临时申请号62/657,716；以及2018年8月9日提交的名称为“用于细胞疗法的表型标记和相关方法(PHENOTYPIC MARKERS FOR CELL THERAPY AND RELATED METHODS)”的美国临时申请号62/716,967；将其内容通过引用以其整体并入。
通过引用并入序列表
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。序列表以2018年12月7日创建的名为735042014540SeqList.txt的文件提供，其大小为35,461字节。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本涉及细胞疗法，所述细胞疗法涉及给予一个或多个剂量的治疗性T细胞组合物；以及涉及用于在所述细胞疗法中使用的方法、组合物和制品。所述T细胞组合物的细胞表达重组受体或其他转基因受体，所述重组受体如为嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)，所述其他转基因受体如T细胞受体(TCR)。本公开文本的实施方案的特征(包括所给予细胞的剂量或细胞的单位和/或所给予细胞的表型)提供了各种优点，如被给予所述T细胞组合物的受试者的一致给药、较低毒性风险和/或增加的反应。
背景技术
多种免疫疗法和/或细胞疗法可用于治疗疾病和病症。例如，过继细胞疗法(包括涉及给予表达对目的疾病或障碍具有特异性的嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR))和/或其他重组抗原受体的细胞的那些过继细胞疗法，以及其他过继免疫细胞和过继T细胞疗法)在癌症或其他疾病或障碍的治疗中可以是有益的。需要改进的方法。提供了满足此类需求的方法和制品。
发明内容
本文提供了含有表达重组受体的T细胞的治疗性组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约50％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约60％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约70％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约80％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。
在一些实施方案中，所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD8+T细胞或由其组成；所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD4+ T细胞或由其组成；所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD8+和CD4+ T细胞或由其组成；所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含至少或至少约30％、50％、95％、96％、97％、98％或99％或100％的CD8+ T细胞或由其组成；所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含至少或至少约30％、50％、95％、96％、97％、98％或99％或100％的CD4+ T细胞或由其组成；和/或所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含大约1:1或大约在1:3与3:1之间或大约在1:2与2:1之间的CD4+:CD8+ T细胞或由其组成。
本文提供了方法、组合物和制品，其涉及或包含基于限定数量的细胞单位剂量，所述细胞如CD8+T细胞亚型或CD4+T细胞亚型或其表达重组受体的细胞、或一定比率的这种CD8+和CD4+T细胞亚型。在一些实施方案中，所述组合物中总数量的T细胞、或所述组合物中总数量的表达所述重组受体的T细胞对CCR7呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中总数量的T细胞、或所述组合物中总数量的表达所述重组受体的T细胞对CD27呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中总数量的T细胞、或所述组合物中总数量的表达所述重组受体的T细胞对CCR7和CD27呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物包含细胞的一个或多个单位剂量。
在一些实施方案中，所述细胞亚型对细胞表面标记呈阳性，所述细胞表面标记如为中枢记忆表型和/或其中所述细胞表面标记为CCR7和/或CD27。在一些实施方案中，所提供的方法、组合物和制品与细胞疗法(如工程化T细胞疗法)结合使用，用于治疗疾病和病症(包括各种肿瘤)。
本文提供了制品。在一些实施方案中，所提供的制品包括容器，所述容器包含存在于一种或多种治疗性组合物中的细胞的一个或多个单位剂量，所述单位剂量包含表达(任选地被工程化以表达)重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞，其中细胞的单位剂量包含限定数量的表达(任选地表面表达)7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；和用于向患有疾病或病症的受试者给予所述治疗性组合物，任选地其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积的说明书。
本文提供了制品。在一些实施方案中，所提供的制品包括容器，所述容器包含存在于一种或多种治疗性组合物中的细胞的一个或多个单位剂量，所述单位剂量包含表达(任选地被工程化以表达)重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞，其中细胞的单位剂量包含限定数量的表达(任选地表面表达)分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27+的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD7+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；和用于向患有疾病或病症的受试者给予所述治疗性组合物，任选地其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积的说明书。
本文还提供了治疗性组合物。在一些实施方案中，所述治疗性组合物包含表达重组受体的T细胞，其中所述组合物中T细胞的总数量(或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量)的至少或至少约、或为或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性，任选地其中：所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD8+T细胞或由其组成；所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD4+T细胞或由其组成；所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD8+和CD4+T细胞或由其组成；所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含至少或至少约30％、50％、95％、96％、97％、98％或99％或100％的CD8+T细胞或由其组成；所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含至少或至少约30％、50％、95％、96％、97％、98％或99％或100％的CD4+T细胞或由其组成；所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含大约1:1或大约在1:3与3:1之间或大约在1:2与2:1之间的CD4+:CD8+T细胞或由其组成。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包括本文所述的任何治疗性组合物。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+细胞；和/或其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CD27+细胞；和/或其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CD27+细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+/CD27+细胞；和/或其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量或组合物包含在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x107或约1x 107之间的表达重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞(每个都包含端值)，和/或所述单位剂量或组合物包含不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x106、或不超过约5x 105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+。在一些实施方案中，所述单位剂量包含在3x 106或约3x106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+；或者所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+。
在一些实施方案中，细胞或组合物的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，细胞或组合物的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。在一些实施方案中，所述限定数量或比率是进一步基于CCR7和/或CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。在一些实施方案中，所述限定数量的细胞进一步表达或不表达CCR7和/或CD45RA，任选地其中所述限定数量的细胞进一步为CCR7+或CD45RA-细胞。
在一些实施方案中，所述限定数量或比率是进一步基于CD27和/或CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。在一些实施方案中，所述限定数量的细胞进一步表达或不表达CD27和/或CD45RA，任选地其中所述限定数量的细胞进一步为CD27+或CD45RA-细胞。在一些实施方案中，所述限定数量进一步包含表达或不表达CD27和/或CD45RA的细胞，任选地其中所述限定数量进一步包含CD27+或CD45RA-细胞。在一些实施方案中，细胞或组合物的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞。在一些实施方案中，细胞或组合物的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–。
本文还提供了制品，其包括：容器，所述容器包含存在于一种或多种治疗性组合物中的细胞的一个或多个单位剂量，所述单位剂量包含表达，任选地被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞，其中细胞的单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；和用于向患有疾病或病症的受试者给予所述治疗性组合物，任选地其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积的说明书。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+/CD27+细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+/CD27+细胞。在一些实施方案中，所述单位剂量包含在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或至少约3x 106、4x106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。在一些实施方案中，所述单位剂量包含在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x107之间的总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，所述限定数量或比率是进一步基于CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。在一些实施方案中，所述限定数量的细胞进一步表达或不表达CD45RA，任选地其中所述限定数量的细胞进一步为CD45RA-细胞。在一些实施方案中，所述限定数量进一步包含表达或不表达CD45RA的细胞，任选地其中所述限定数量进一步包含CD45RA-细胞。
在一些实施方案中，在任选地根据相同方法产生的多种制品或单位剂量或组合物之间，所述单位剂量中表达CCR7的细胞(CCR7+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
在一些实施方案中，表达所述重组受体的细胞的所述单位剂量或数量包含在1x105或约1x 105与5x 108或约5x 108之间、在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD3+细胞(受体+/CD3+细胞)或总CD3+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，表达所述重组受体的细胞的所述单位剂量或数量包含不超过约5x 108、不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD3+细胞或总CD3+细胞。
在一些实施方案中，CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是活的或有活力的此类细胞的总数量。在一些实施方案中，CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是不表达凋亡标记的此类细胞的总数量和/或是凋亡标记阴性(–)的此类细胞的总数量，其中所述凋亡标记为膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。
在一些实施方案中，所述说明书指定给予包含在多种单独组合物中的多个单位剂量。在一些实施方案中，所述多种单独组合物包括含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的一种的第一组合物以及含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的另一种的第二组合物。在一些实施方案中，所述第一组合物包含CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述第一组合物包含CD4+T细胞。
在一些实施方案中，所述说明书指定间隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟，或同时地给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积以及所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
在一些实施方案中，所述说明书指定在给予所述含有CD4+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。在一些实施方案中，所述说明书指定在给予所述含有CD8+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
在一些实施方案中，所述重组受体是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。在一些实施方案中，重组受体能够结合靶抗原，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关、为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在一些实施方案中，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。在一些实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原。
在一些实施方案中，所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-AI)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特有的抗原、或与通用标签相关的抗原，和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在一些实施方案中，所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，所述重组受体包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。在一些实施方案中，所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。在一些实施方案中，所述片段包含scFv。
在一些实施方案中，所述重组受体包含细胞内信号传导区域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链、任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
在一些实施方案中，所述重组受体进一步包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域进一步包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
在一些实施方案中，所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞对受试者而言是自体的。在一些实施方案中，所述T细胞对受试者而言是同种异体的。
本文还提供了治疗方法。在一些实施方案中，所述治疗方法涉及向患有疾病或病症的受试者给予本文所述的任何治疗性组合物或包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物的一个或多个单位剂量和/或对应于此类单位剂量的体积。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；和/或在根据所述方法治疗的一组受试者之间，所述单位剂量中表达CCR7的细胞(CCR7+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
本文还提供了治疗方法。在一些实施方案中，所述治疗方法涉及向患有疾病或病症的受试者给予本文所述的治疗性组合物或包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物的一个或多个单位剂量和/或对应于此类单位剂量的体积，任选地其中：细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；和/或在根据所述方法治疗的一组受试者之间，所述单位剂量中表达CD27的细胞(CD27+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CD27+细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+细胞。在一些实施方案中，所述单位剂量包含在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+。在一些实施方案中，所述单位剂量包含在3x 106或约3x106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+；或者所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，所述限定数量或比率是进一步基于CD27和/或CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。在一些实施方案中，所述限定数量或比率是进一步基于CCR7和/或CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。在一些实施方案中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–。
在一些实施方案中，还提供了治疗方法，其中所述方法涉及向患有疾病或病症的受试者给予本文所述的任何组合物的一或多个单位剂量。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；以及在根据所述方法治疗的一组受试者之间，所述单位剂量中表达CCR7的细胞(CCR7+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
本文还提供了治疗方法，其中所述方法涉及向患有疾病或病症的受试者给予包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物和/或对应于此类单位剂量的体积。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；以及在根据所述方法治疗的一组受试者之间，所述单位剂量中表达CCR7的细胞(CCR7+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+/CD27+细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+/CD27+细胞。在一些实施方案中，所述单位剂量包含在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞；和/或至少约3x 106、4x106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。在一些实施方案中，所述单位剂量包含在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞；和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x107之间的总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，所述限定数量或比率是进一步基于CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。在一些实施方案中，所述限定数量或比率是进一步基于CD45RA-细胞的数量。在一些实施方案中，所述限定数量的细胞进一步表达或不表达CD45RA，任选地其中所述限定数量的细胞进一步为CD45RA-细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在1x 105或约1x 105与5x 108或约5x 108之间、在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD3+细胞(受体+/CD3+细胞)或总CD3+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过约5x 108、不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD3+细胞或总CD3+细胞。
在一些实施方案中，CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是活的或有活力的此类细胞的总数量。在一些实施方案中，CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是不表达凋亡标记的此类细胞的总数量和/或是凋亡标记阴性(–)的此类细胞的总数量，其中所述凋亡标记为膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。
在一些实施方案中，所述方法涉及给予包含在多种单独组合物中的多个单位剂量。
在一些实施方案中，所述多种单独组合物包括含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的一种的第一组合物以及含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的另一种的第二组合物。在一些实施方案中，所述第一组合物包含CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述第一组合物包含CD4+T细胞。
在一些实施方案中，所述方法涉及间隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟，或同时地给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积以及所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
在一些实施方案中，所述方法涉及在给予所述含有CD4+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
在一些实施方案中，所述方法涉及在给予所述含有CD8+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
在一些实施方案中，所述重组受体是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。在一些实施方案中，重组受体能够结合靶抗原，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关、为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在一些实施方案中，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。在一些实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原。
在一些实施方案中，所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特有的抗原、或与通用标签相关的抗原，和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在一些实施方案中，所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，所述重组受体包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。在一些实施方案中，所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。在一些实施方案中，其中所述片段包含scFv。
在一些实施方案中，所述重组受体包含细胞内信号传导区域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链、任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
在一些实施方案中，所述重组受体进一步包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域进一步包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
在一些实施方案中，所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞对受试者而言是自体的。在一些实施方案中，所述T细胞对受试者而言是同种异体的。
本文还提供了确定用于治疗受试者的工程化T细胞的剂量单位的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达所述重组受体和CCR7(受体+/CCR7+)的T细胞的数量、百分比或比率。在一些实施方案中，所述方法包括，基于所述受体+/CCR7+细胞的数量、百分比或比率，确定用于给予至患有疾病或病症的受试者的细胞的一个或多个单位剂量，其中所述单位剂量包含限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
本文还提供了确定用于治疗受试者的工程化T细胞的剂量单位的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及(a)在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达所述重组受体和CD27(受体+/CD27+)的T细胞的数量、百分比或比率；和(b)基于所述受体+/CD27+细胞的数量、百分比或比率，确定用于给予至患有疾病或病症的受试者的细胞的一个或多个单位剂量，其中所述单位剂量包含限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
本文还提供了产生包含T细胞组合物的单位剂量的组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达所述重组受体和CCR7和CD27(受体+/CCR7+/CD27+)的T细胞的数量、百分比或比率。在一些实施方案中，所述方法包括向容器填充所述组合物的全部或一部分和任选的另一种溶液以实现所述T细胞组合物的单位剂量，其中所述单位剂量包含限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。在一些实施方案中，所述方法包括向容器填充所述组合物的全部或一部分和任选的另一种溶液以实现所述T细胞组合物的单位剂量，其中所述单位剂量包含限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
本文还提供了产生包含T细胞组合物的单位剂量的治疗性组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向容器填充T细胞组合物的全部或一部分以实现所述T细胞组合物的单位剂量，所述T细胞组合物包含含有特异性地结合与疾病或病症相关的抗原的重组受体的T细胞，其中所述单位剂量包含限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+ T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
本文还提供了产生包含T细胞组合物的单位剂量的治疗性组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向容器填充T细胞组合物的全部或一部分以实现所述T细胞组合物的单位剂量，所述T细胞组合物包含含有特异性结合与疾病或病症相关的抗原的重组受体的T细胞，其中所述单位剂量包含限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+。在一些实施方案中，所述单位剂量包含在3x 106或约3x106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+；或者所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，所述单位剂量进一步包含限定数量的包含表达或不表达CD27和/或CD45的细胞的细胞，任选地其中所述单位剂量进一步包含限定数量的包含CD27+或CD45RA-细胞的细胞。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述治疗性组合物中评估表达或不表达CD27和/或CD45RA的T细胞的数量、百分比或比率，任选地为CD27+或CD45RA-的T细胞的数量、百分比或比率。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–。
本文还提供了确定用于治疗受试者的工程化T细胞的单位剂量的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达所述重组受体和CCR7和CD27(受体+/CCR7+/CD27+)的T细胞的数量、百分比或比率。在一些实施方案中，所述方法包括，基于所述受体+/CCR7+/CD27+细胞的数量、百分比或比率，确定用于给予至患有疾病或病症的受试者的细胞的一个或多个单位剂量，其中所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
本文还提供了产生包含T细胞组合物的单位剂量的组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达所述重组受体和CCR7和CD27(受体+/CCR7+/CD27+)的T细胞的数量、百分比或比率。在一些实施方案中，所述方法包括向容器填充所述组合物的全部或一部分和任选的另一种溶液以实现所述T细胞组合物的单位剂量，其中所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
本文还提供了产生包含T细胞组合物的单位剂量的治疗性组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向容器填充T细胞组合物的全部或一部分以实现所述T细胞组合物的单位剂量，所述T细胞组合物包含含有特异性结合与疾病或病症相关的抗原的重组受体的T细胞，其中所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+/CD27+细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或至少约3x 106、4x106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。在一些实施方案中，所述单位剂量包含在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x107之间的总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，所述单位剂量进一步包含限定数量的包含表达或不表达CD45的细胞的细胞，任选地其中所述单位剂量进一步包含限定数量的包含CD45RA-细胞的细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述治疗性组合物中评估表达或不表达CD45RA的T细胞的数量、百分比或比率，任选地为CD45RA-的T细胞的数量、百分比或比率。
还提供了用于产生包含基因工程化细胞的细胞组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及从来自受试者的生物样品提供包含目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞的输入组合物。在一些实施方案中，所述方法涉及向所述输入组合物中引入编码重组受体的多核苷酸。在一些实施方案中，所述方法涉及在所述引入之前、期间和/或之后刺激所述输入组合物中的所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，所述刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。在一些实施方案中，所述方法产生输出组合物，所述输出组合物包含限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞，和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
还提供了用于产生包含基因工程化细胞的细胞组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及向输入组合物中引入编码重组受体的多核苷酸，其中所述输入组合物包含从来自受试者的生物样品提供的目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞，并且在所述引入之前、期间和/或之后通过在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞来刺激所述输入组合物，所述刺激导致所述细胞的激活和/或增殖；并且其中所述方法产生输出组合物，所述输出组合物包含限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞，和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
还提供了用于产生包含基因工程化细胞的细胞组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及从获自受试者的生物样品中分离目标数量的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标数量的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞，从而产生输入组合物。在一些实施方案中，所述方法涉及向所述输入组合物中引入编码重组受体的多核苷酸。在一些实施方案中，所述方法涉及在所述引入之前、期间和/或之后刺激所述输入组合物中的所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，所述刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。在一些实施方案中，所述方法产生输出组合物，所述输出组合物包含限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
还提供了用于产生包含基因工程化细胞的细胞组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及向输入组合物中引入编码重组受体的多核苷酸，其中所述输入组合物通过从获自受试者的生物样品中分离目标数量的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标数量的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞而产生，并且在所述引入之前、期间和/或之后通过在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞来刺激所述输入组合物，所述刺激导致所述细胞的激活和/或增殖；并且其中所述方法产生输出组合物，所述输出组合物包含限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞，和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
在一些实施方案中，所述输入组合物包含目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞。
在一些实施方案中，所述输入组合物包含目标百分比的CD4+/CCR7+、CD4+/CD27+、CD4+/CCR7+/CD27+、CD4+/CCR7+/CD45RA-、CD4+/CCR7+/CD45RA+、CD8+/CCR7+、CD8+/CD27+、CD8+/CCR7+/CD27+、CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或CD8+/CCR7+/CD45RA+细胞。
在一些实施方案中，所述输出组合物包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+、受体+/CD8+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA+细胞与受体+/CD4+/CCR7+、受体+/CD4+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA+细胞；或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+、受体+/CD8+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+、受体+/CD4+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
在一些实施方案中，所述方法还涉及确定用于给予至患有疾病或病症的受试者的T细胞组合物的一个或多个单位剂量，其中所述单位剂量包含所述输出组合物的全部或一部分，所述输出组合物包含：限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；或者限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+细胞、CD4+/CCR7+细胞、CD8+/CD27+细胞、CD4+/CD27+细胞、CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的(每个都包含端值)总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、总受体+/CD4+/CD27+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞；和/或至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+；和/或至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或至少约3x 106、4x 106、5x106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞；和/或在3x 106或约3x106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+，和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+；和/或所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+；和/或所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间；和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间；和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，所述单位剂量进一步包含限定数量的包含表达或不表达CD45的细胞的细胞，任选地其中所述单位剂量进一步包含限定数量的包含CD45RA-细胞的细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述提供或分离之前确定表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。
在一些实施方案中，所述一种或多种刺激剂能够激活T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞；能够诱导通过TCR复合物的信号；和/或能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的增殖。
在一些实施方案中，所述一种或多种刺激剂包含与TCR复合物的成员结合、任选地与CD3特异性地结合的一级药剂。在一些实施方案，所述一种或多种刺激剂进一步包含与T细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂。在一些实施方案中，所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。在一些实施方案中，所述一级和二级药剂包含抗体，任选地其中所述一种或多种刺激剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体一起孵育。在一些实施方案中，所述一种或多种刺激剂存在于固体支持物(任选地珠)的表面上。在一些实施方案中，所述一种或多种刺激剂选自CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7，包含由抗原受体特异性地识别的抗原的疫苗，以及特异性地结合抗原受体的抗独特型抗体或其组合。
在一些实施方案中，所述治疗性组合物为本文所述的任何组合物。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向患有疾病或病症的受试者给予所述治疗性组合物，任选地其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
在一些实施方案中，在根据所述方法治疗的一组受试者之间，所述单位剂量中表达CCR7的细胞(CCR7+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在1x 105或约1x 105与5x 108或约5x 108之间、在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD3+细胞(受体+/CD3+细胞)或总CD3+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过约5x 108、不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD3+细胞或总CD3+细胞。
在一些实施方案中，CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是活的或有活力的此类细胞的总数量。在一些实施方案中，CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是不表达凋亡标记的此类细胞的总数量和/或是凋亡标记阴性(–)的此类细胞的总数量，其中所述凋亡标记为膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。
在一些实施方案中，所述方法涉及给予包含在多种单独组合物中的多个单位剂量。
在一些实施方案中，所述多种单独组合物包括含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的一种的第一组合物以及含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的另一种的第二组合物。在一些实施方案中，所述第一组合物包含CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述第一组合物包含CD4+T细胞。
在一些实施方案中，所述方法涉及间隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟，或同时地给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积以及所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
在一些实施方案中，所述方法涉及在给予所述含有CD4+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。在一些实施方案中，所述方法涉及在给予所述含有CD8+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
在一些实施方案中，所述重组受体是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。在一些实施方案中，重组受体能够结合靶抗原，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关、为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在一些实施方案中，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。在一些实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原。
在一些实施方案中，所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特有的抗原、或与通用标签相关的抗原，和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在一些实施方案中，所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述重组受体包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。在一些实施方案中，所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。在一些实施方案中，所述片段包含scFv。
在一些实施方案中，所述重组受体包含细胞内信号传导区域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链、任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
在一些实施方案中，所述重组受体进一步包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域进一步包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
在一些实施方案中，所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞对受试者而言是自体的。在一些实施方案中，所述T细胞对受试者而言是同种异体的。
在本文提供的任何实施方案的一些方面，所提供的治疗性组合物或单位剂量中的所述细胞与某些功能属性相关，所述功能属性包括依赖于所述重组受体的活性或存在的某些重组受体(例如CAR)依赖性活性，例如在由重组受体识别的抗原的存在下诱导或介导的活性。在一些实施方案中，功能属性包括较高水平的细胞因子(例如IL-2)的产生。在本文提供的任何实施方案的一些方面，所述功能属性包括较低水平的细胞因子(例如IFNγ或IL-13)的产生。在一些实施方案中，此类细胞因子的较高或较低水平是相对于参考组合物而言，在所述参考组合物中包含未限定数量的特定表型细胞和/或其中特定表型细胞未处于根据本文提供的实施方案的特定限定比率下。在一些实施方案中，参考组合物是其中包含频率或数量更大的具有效应子或分化表型的T细胞的参考组合物。
在一些方面，在根据本文提供的任何实施方案向一组受试者之一给予治疗性组合物或单位剂量后，所述受试者组中的多名受试者在给予后展现与功效、持久性增加和/或毒性降低相关的一个或多个特征。在一些实施方案中，所述受试者组中的多名受试者可能展现以下和/或与以下相关：药代动力学参数、降低的发生毒性或不良事件的可能性和/或特定的反应、功效或存活结果。在一些实施方案中，所述受试者是怀疑患有疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，与用参考组合物治疗的受试者的相似组相比，所述一个或多个特征得到改善，在所述参考组合物中包含未限定数量的特定表型细胞和/或其中特定表型细胞未处于根据本文提供的实施方案的特定限定比率下。在一些实施方案中，参考组合物是其中包含频率或数量更大的具有效应子或分化表型的T细胞的参考组合物。
在一些方面，在根据本文提供的任何实施方案向一组受试者之一给予治疗性组合物或单位剂量后，所述受试者组中的多名受试者可能展现以下和/或与以下相关：特定的药代动力学参数，如最大(峰值)血浆浓度(Cmax)、峰值时间(即出现最大血浆浓度(Cmax)的时间；Tmax)、最小血浆浓度(即治疗剂(例如CAR+T细胞)的剂量之间的最小血浆浓度)；Cmin)、消除半衰期(T1/2)和曲线下面积(即通过描绘时间与治疗剂CAR+T细胞的血浆浓度产生的曲线下面积；AUC)。在一些方面，在给予治疗性组合物或单位剂量后，所述组中的多名受试者可能展现以下或与以下相关：所给予的细胞的最大(峰值)血浆浓度(Cmax)升高。在一些实施方案中，在所述组中的多名受试者中观察到所述治疗性组合物或单位剂量的细胞的长期持久性。
在一些方面，在根据本文提供的任何实施方案向一组受试者之一给予治疗性组合物或单位剂量后，所述受试者组中的多名受试者可能展现以下和/或与以下相关：发生毒性或不良事件(如细胞因子释放综合征(CRS)或严重CRS(sCRS)或神经毒性(NT)或严重NT(sNT))的可能性降低。
在一些方面，在根据本文提供的任何实施方案向一组受试者之一给予治疗性组合物或单位剂量后，所述受试者组中的多名受试者可能展现以下和/或与以下相关：特定的反应、功效或存活结果，如部分反应(PR)或部分缓解、完全反应(CR)或完全缓解、无进展存活期(PFS)、客观反应(OR)、总存活期(OS)、无事件存活期(EFS)、反应持续时间(DOR)增加或存活率增加。在一些方面，在给予治疗性组合物或单位剂量后，所述组中的多名受试者可能展现以下或与以下相关：无进展存活期(PFS)增加无进展存活期(PFS)增加。
在任何所提供实施方案的一些实施方案中，例如，在根据所述方法或根据所述制品中提供的信息治疗的受试者群体中，所述方法和/或用途和/或根据所述制品给予细胞的单位剂量实现某些结果和/或与某些降低的毒性风险相关。在一些方面，至少35％、至少40％、至少50％或至少60％的根据所述方法治疗的受试者实现可持续超过3个月、超过6个月或超过12个月的完全反应(CR)或完全缓解、无进展存活期(PFS)、客观反应(OR)、总存活期(OS)、无事件存活期(EFS)、或反应。在任何所提供方法的某些实施方案中，大于或大于约50％的根据所述方法治疗的受试者不展现3级或更高级的细胞因子释放综合征(CRS)或3级或更高级的神经毒性。在一些实施方案中，此类受试者不展现早发型CRS和/或神经毒性，如不展现早于开始给予后3天的CRS发作和/或不展现早于开始给予后5天的神经毒性发作。在任何所提供方法的一些实施方案中，大于或大于约30％、35％、40％或50％的根据所述方法治疗的受试者不展现任何等级的细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性。
还提供了通过本文所述的任何方法产生的输出组合物。
还提供了通过本文所述的任何方法确定或产生的单位剂量。
还提供了包含本文所述的任何单位剂量的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含药物载体。
还提供了治疗方法，其包括向哺乳动物受试者给予本文所述的任何输出组合物、单位剂量或药物组合物的全部或一部分。
还提供了本文所述的任何输出组合物、单位剂量或药物组合物的全部或一部分用于治疗癌症的用途。
还提供了本文所述的任何输出组合物、单位剂量或药物组合物的全部或一部分在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
还提供了本文所述的任何输出组合物、单位剂量或药物组合物的全部或一部分，用于在治疗癌症中使用。
本文提供了含有表达结合至抗原的重组受体的T细胞的治疗性细胞组合物，其中在用刺激剂刺激后：所述组合物中表达所述重组受体的CD4+ T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％能够产生选自白介素2(IL-2)和/或TNF-α的细胞因子；和/或所述组合物中表达所述重组受体的CD4+ T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的。在一些实施方案中，所述组合物中表达所述重组受体的CD4+ T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％能够产生选自白介素2(IL-2)和/或TNF-α的细胞因子。在一些实施方案中，所述组合物中表达所述重组受体的CD4+ T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的。在一些实施方案中，所述组合物中表达所述重组受体的CD4+ T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因产生所述细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α而是多功能的。
在一些实施方案中，所述刺激剂是非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂。在一些实施方案中，所述非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂是多克隆刺激剂。在一些实施方案中，所述非特异性或非抗原依赖性刺激剂包括PMA/离子霉素、抗CD3/抗CD28、植物凝集素(PHA)或伴刀豆球蛋白A(ConA)。在一些实施方案中，所述非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂包括PMA/离子霉素。在一些实施方案中，所述刺激剂特异性地结合所述重组受体，任选地其中所述刺激剂是抗原特异性刺激试剂和/或含有由所述重组受体特异性识别的抗原或其部分。在一些实施方案中，在细胞内细胞因子测定中测量细胞因子的产生。
在一些实施方案中，所述组合物含有所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性，任选地进一步对CD45RA的表面表达呈阴性。
在一些实施方案中，所述T细胞是从受试者获得的原代细胞。在一些实施方案中，所述受试者患有癌症，任选地其中所述癌症是白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，所述受试者是在获得细胞时被鉴定为或已知具有高肿瘤负荷的受试者。在一些实施方案中，如果受试者中肿瘤的尺寸积和(SPD)高于或高于约30cm2、40cm2、50cm2、60cm2或70cm2，则所述受试者具有高肿瘤负荷；和/或如果来自受试者的生物样品(任选地血清样品)中的C反应蛋白(CRP)高于或高于约5毫克/升、10毫克/升、15毫克/升、20毫克/升、25毫克/升、30毫克/升、40毫克/升或50毫克/升，则所述受试者具有高肿瘤负荷。在一些实施方案中，如果所述受试者中肿瘤的SPD高于或高于约50cm2，则所述受试者具有高肿瘤负荷。在一些实施方案中，如果所述生物样品中的CRP高于或高于约20毫克/升，则所述受试者具有高肿瘤负荷。
在一些实施方案中，所述治疗性细胞组合物富含CD4+ T细胞和/或所述工程化组合物中所述总重组受体+细胞的至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约97％，或所述组合物中所述总细胞的约60％至99％、约75％至99％、约85％至99％、或约90％至99％(每个都包含端值)为CD4+。在一些实施方案中，所述治疗性细胞组合物富含CD3+ T细胞、富含CD4+和CD8+ T细胞和/或所述工程化组合物中所述总重组受体+细胞的至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约97％，或所述组合物中所述总细胞的约60％至99％、约75％至99％、约85％至99％、或约90％至99％(每个都包含端值)为CD3+或CD4+和CD8+。在一些实施方案中，所述治疗性细胞组合物以如下的CD4+与CD8+ T细胞的比率含有CD4+和CD8+ T细胞：在大约1:3与大约3:1之间，任选地在大约1:2与2:1之间。
在一些实施方案中，所述重组受体是或含有嵌合受体和/或重组抗原受体。在一些实施方案中，重组受体能够结合靶抗原，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关、为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在一些实施方案中，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。在一些实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在一些实施方案中，所述重组受体是或含有功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述重组受体含有：含有抗原结合结构域的细胞外结构域和含有细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区域。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是或含有抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。在一些实施方案中，所述片段含有通过柔性接头连接的抗体可变区。在一些实施方案中，所述片段包含scFv。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或含有初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或含有CD3链、任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述重组受体进一步含有设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域进一步含有共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域含有T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域含有CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
在一些实施方案中，所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞对受试者而言是自体的。
本文提供了制品，其包括含有本文所述的治疗性细胞组合物的容器，和用于向患有疾病或病症的受试者给予所述治疗性细胞组合物，任选地其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积的说明书。在一些实施方案中，所述说明书指定给予包含在多种单独组合物中的多个单位剂量。在一些实施方案中，所述多种单独组合物含有：包含含有CD8+T细胞和CD4+T细胞中的一种的治疗性细胞组合物的第一组合物和含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的另一种的第二组合物，所述第二组合物含有表达所述重组受体或对所述抗原或对由所述疾病或病症表达的细胞具有特异性的重组受体的细胞，任选地其中所述第二组合物是本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，所述说明书指定在不超过48小时间隔内、在不超过36小时间隔内、在不超过24小时间隔内、在不超过12小时间隔内、在不超过6小时间隔内、在不超过2小时间隔内、在不超过1小时间隔内，或同时地给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积以及所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。在一些实施方案中，所述说明书指定在给予所述含有CD4+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
本文提供了治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者给予一个或多个单位剂量的本文所述的治疗性细胞组合物。在一些实施方案中，所述治疗性组合物是：含有CD8+ T细胞和CD4+ T细胞中的一种的第一治疗性细胞组合物，并且所述一个或多个单位剂量进一步包含含有所述CD8+ T细胞和CD4+ T细胞中的另一种的第二治疗性细胞组合物，所述第二组合物含有表达所述重组受体或对所述抗原或对由所述疾病或病症表达的细胞具有特异性的重组受体的细胞，任选地其中所述第二组合物是本文所述的任何组合物。
在一些实施方案中，所述第二治疗性细胞组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性，任选地进一步对CD45RA的表面表达呈阴性。在一些实施方案中，所述第二治疗性细胞组合物富含CD8+ T细胞和/或所述工程化组合物中所述总重组受体+细胞的至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约97％，或所述组合物中所述总细胞的约60％至99％、约75％至99％、约85％至99％、或约90％至99％(每个都包含端值)为CD8+。
在一些实施方案中，所述第一治疗性组合物和第二治疗性组合物在彼此的48小时或约48小时内、36小时或约36小时内、24小时或约24小时内、12小时或约12小时内、6小时或约6小时内、2小时或约2小时内或1小时或约1小时内给予。在一些实施方案中，含有所述CD8+ T细胞的所述第二治疗性细胞组合物在含有CD4+ T细胞的所述第一组合物之前给予。在一些实施方案中，细胞的所述一个或多个单位剂量含有限定比率的CD4+与CD8+ T细胞，所述比率为或为大约1:3和大约3:1，任选地为或为大约1:2和大约2:1，任选地为或为约1:1。
本文提供了用于治疗受试者的方法，所述方法包括(A)测定含有表达重组受体的T细胞的工程化细胞组合物中的指示所述组合物中工程化细胞的功能或表型的因子，所述因子选自(i)对CCR7和/或CD27呈表面阳性，并且任选地对CD45RA呈表面阴性的表达所述重组受体的T细胞的百分比；和/或(ii)在用刺激剂刺激后能够产生IL-2、TNF-α和/或IFN-γ的表达所述重组受体的CD4+ T细胞的百分比；和(B)向患有疾病或病症的受试者给予疗法，所述给予选自：(1)如果指示所述工程化T细胞组合物的细胞的功能或表型的因子等于或高于阈值，则向所述受试者给予含有表达重组受体的T细胞的工程化细胞组合物的细胞的一个或多个单位剂量；或(2)如果指示所述工程化T细胞组合物的细胞的所述功能或表型的所述因子低于所述因子的阈值，则给予选自以下的疗法：(a)所述工程化细胞组合物的细胞的一个或多个单位剂量和能够增加所述工程化细胞组合物的T细胞在所述受试者中的扩增、增殖或功效的药剂，(b)增加剂量的所述工程化细胞组合物的细胞，任选地与给予至患有相同疾病或病症但展现所述阈值或更大的所述因子的类似处境受试者的所述一个或多个单位剂量相比为增加的；或(c)除了一个或多个单位剂量的所述工程化细胞组合物以外的用于治疗所述疾病或病症的替代性治疗性治疗，其中所述因子的所述阈值选自(i)所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性；和/或(ii)所述组合物中表达所述重组受体的CD4+ T细胞的总数量的为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％在用刺激剂刺激后能够产生白介素2(IL-2)或TNF-α；和/或(iii)所述组合物中表达所述重组受体的CD4+ T细胞的总数量的为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因在用刺激剂刺激后产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的。
本文提供了用于治疗受试者的方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者给予疗法，所述给予选自：(1)如果指示含有表达重组受体的T细胞的工程化细胞组合物的细胞的功能或表型的因子等于或高于阈值，则向所述受试者给予所述工程化T细胞组合物的细胞的一个或多个单位剂量；或(2)如果指示所述工程化T细胞组合物的细胞的所述功能或表型的所述因子低于所述因子的阈值，则给予选自以下的疗法：(a)所述工程化细胞组合物的细胞的一个或多个单位剂量和能够增加所述工程化细胞组合物的T细胞在所述受试者中的扩增、增殖或功效的药剂，(b)增加剂量的所述工程化细胞组合物的细胞，任选地与给予至患有相同疾病或病症但展现所述阈值或更大的所述因子的类似处境受试者的所述一个或多个单位剂量相比为增加的；或(c)除了一定剂量的所述工程化细胞组合物以外的用于治疗所述疾病或病症的替代性治疗性治疗，其中所述因子的所述阈值选自(i)所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性；和/或(ii)所述组合物中表达所述重组受体的CD4+ T细胞的总数量的为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％在用刺激剂刺激后能够产生白介素2(IL-2)或TNF-α；和/或(iii)所述组合物中表达所述重组受体的CD4+ T细胞的总数量的为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因在用刺激剂刺激后产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的。
在一些实施方案中，所述细胞组合物的细胞对于受试者是自体的。在一些实施方案中，在给予所述一个或多个单位剂量后，至少35％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％、或至少75％的根据所述方法治疗的所述受试者实现持续至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少9个月或至少12个月的无进展存活期。在一些实施方案中，在给予所述一个或多个单位剂量后，至少35％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％、或至少75％的根据所述方法治疗的所述受试者未出现疾病进展且持续至少或至少约3个月、至少或至少约4个月、至少或至少约5个月、至少或至少约6个月、至少或至少约9个月或至少或至少约12个月。在一些实施方案中，根据所述方法治疗的受试者实现生物样品(任选地血液或血清样品)中的细胞组合物的细胞的药代动力学特性的改善，所述药代动力学特性是与一组具有相同疾病或病症且被给予相似剂量的包含表达所述重组受体的T细胞但其中所述指示细胞功能或表型的因子低于所述阈值的自体细胞组合物的类似处境受试者相比，平均而言有所改善。在一些实施方案中，所述药代动力学特性是所述生物样品中细胞的随时间的总暴露(AUC)或峰值数量。
本文提供了预测对治疗性T细胞组合物的反应可能性的方法，所述方法包括：(a)测定含有表达重组受体的T细胞的工程化细胞组合物中的指示所述组合物中工程化细胞的功能或表型的因子，所述因子选自(i)对CCR7和/或CD27呈表面阳性，并且任选地对CD45RA呈表面阴性的表达所述重组受体的T细胞的百分比；和/或(ii)在用刺激剂刺激后能够产生IL-2、TNF-α和/或IFN-γ的表达所述重组受体的CD4+ T细胞的百分比；和(b)在给予含有一定剂量的所述工程化细胞的细胞疗法后确定反应可能性，其中如果所述因子等于或高于阈值，则将所述受试者鉴定为在给予所述疗法后可能实现持久反应或无进展存活期，任选地持续至少3个月；或者如果所述因子低于阈值，则将所述受试者鉴定为不可能对所述疗法展现持久反应或无进展存活期，其中所述因子的所述阈值选自：(i)所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性；和/或(ii)所述组合物中表达所述重组受体的CD4+ T细胞的总数量的为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％在用刺激剂刺激后能够产生白介素2(IL-2)或TNF-α；和/或(iii)所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因在用刺激剂刺激后产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的。
在一些实施方案中，所述细胞组合物的细胞对于受试者是自体的。在一些实施方案中，如果将所述受试者鉴定为可能对所述疗法实现持久反应或无进展存活期，则向所述受试者给予所述工程化T细胞组合物的细胞的一个或多个单位剂量。在一些实施方案中，所述一个或多个单位剂量含有在1x 105或约1x 105与5x 108或约5x 108之间、在1x 105或约1x105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总T细胞(受体+/T细胞)或总T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述一个或多个单位剂量含有不超过约5x 108、不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/T细胞或总T细胞。在一些实施方案中，所述因子的所述阈值为：所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。在一些实施方案中，所述因子的所述阈值为：所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。在一些实施方案中，所述因子的所述阈值为：所述组合物中表达所述重组受体的CD4+ T细胞的总数量的为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％能够产生选自白介素2(IL-2)和/或TNF-α的细胞因子。在一些实施方案中，所述因子的所述阈值为：所述组合物中表达所述重组受体的CD4+ T细胞的总数量的为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的。在一些实施方案中，所述因子的所述阈值为：所述组合物中表达所述重组受体的CD4+ T细胞的总数量的为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因产生所述细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α而是多功能的。
在一些实施方案中，如果将所述受试者鉴定为不可能实现持久反应或无进展存活期，则向所述受试者给予选自以下的疗法：(a)一定剂量的所述工程化细胞组合物的细胞和能够增加所述工程化细胞组合物的T细胞在所述受试者中的扩增、增殖或功效的药剂，(b)增加剂量的所述工程化细胞组合物的细胞，任选地与给予至患有相同疾病或病症但展现实现对所述细胞疗法的无进展存活期或持久反应的可能性的类似处境受试者的剂量相比为增加的；或(c)除了一定剂量的所述工程化细胞组合物以外的用于治疗所述疾病或病症的替代性治疗性治疗。
在一些实施方案中，所述方法包括给予一种疗法，所述疗法含有一定剂量的所述工程化细胞组合物的细胞和能够增加所述工程化细胞组合物的T细胞在所述受试者中的扩增、增殖或功效的药剂，其中所述药剂是对所述CAR具有特异性的抗独特型抗体或其抗原结合片段、免疫检查点抑制剂、代谢途径调节剂、腺苷受体拮抗剂、激酶抑制剂、抗TGFβ抗体或抗TGFβR抗体或细胞因子。在一些实施方案中，在给予所述治疗性T细胞组合物之前、同时或之后给予所述药剂。
在一些实施方案中，所述受试者是在所述测定时和/或在所述给予之前被鉴定为或已知具有高肿瘤负荷的受试者。在一些实施方案中，如果受试者中肿瘤的尺寸积和(SPD)高于或高于约30cm2、40cm2、50cm2、60cm2或70cm2，则所述受试者具有高肿瘤负荷；和/或如果来自受试者的生物样品(任选地血清样品)中的C反应蛋白(CRP)高于或高于约5毫克/升、10毫克/升、15毫克/升、20毫克/升、25毫克/升、30毫克/升、40毫克/升或50毫克/升，则所述受试者具有高肿瘤负荷。在一些实施方案中，如果所述受试者中肿瘤的SPD高于或高于约50cm2，则所述受试者具有高肿瘤负荷。在一些实施方案中，如果所述生物样品中的CRP高于或高于约20毫克/升，则所述受试者具有高肿瘤负荷。
在一些实施方案中，所述刺激剂是非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂。在一些实施方案中，所述非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂是多克隆刺激剂。在一些实施方案中，所述非特异性或非抗原依赖性刺激剂含有PMA/离子霉素、抗CD3/抗CD28、植物凝集素(PHA)或伴刀豆球蛋白A(ConA)。在一些实施方案中，所述非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂含有PMA/离子霉素。在一些实施方案中，所述刺激剂特异性地结合所述重组受体，任选地其中所述刺激剂是抗原特异性刺激试剂和/或包含由所述重组受体特异性识别的抗原或其部分。在一些实施方案中，在细胞内细胞因子测定中测量细胞因子的产生。
在一些实施方案中，所述重组受体是或含有嵌合受体和/或重组抗原受体。在一些实施方案中，重组受体能够结合靶抗原，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关、为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在一些实施方案中，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。在一些实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在一些实施方案中，所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述重组受体含有：含有抗原结合结构域的细胞外结构域和含有细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区域。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是或含有抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。在一些实施方案中，所述片段含有通过柔性接头连接的抗体可变区。在一些实施方案中，所述片段包含scFv。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或含有初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或含有CD3链、任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述重组受体进一步含有设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域进一步含有共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域含有T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域含有CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
在一些实施方案中，所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞对受试者而言是自体的。
本文提供了产生治疗性T细胞组合物的方法，所述方法包括(a)在刺激条件下孵育输入组合物，从而产生经刺激组合物，其中所述输入组合物含有限定数量的不表达凋亡标记(凋亡标记阴性(–))的T细胞；和(b)将重组受体引入到来自所述经刺激组合物的细胞中，从而产生工程化细胞组合物，其中所述引入包括使所述经刺激组合物的所述细胞与包含编码所述重组受体的多核苷酸的药剂接触。在一些实施方案中，所述凋亡标记阴性T细胞是或含有凋亡标记阴性CD3+细胞、凋亡标记阴性CD8+细胞、凋亡标记阴性CD4+细胞、或凋亡标记阴性CD8+细胞和凋亡标记阴性CD4+细胞。在一些实施方案中，所述凋亡标记是膜联蛋白V。在一些实施方案中，所述凋亡标记是激活的半胱天冬酶3。在一些实施方案中，所述限定数量的T细胞含有至少50x 106个所述凋亡标记阴性T细胞，任选地凋亡标记阴性CD4+和/或凋亡标记阴性CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述限定数量的T细胞含有至少100x 106个所述凋亡标记阴性T细胞，任选地凋亡标记阴性CD4+和/或凋亡标记阴性CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述限定数量的T细胞包括在100x 106或约100x 106与500x 106或约500x 106之间的凋亡标记阴性T细胞，任选地凋亡标记阴性CD4+和/或凋亡标记阴性CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述限定数量的T细胞包括300x 106或约300x 106个凋亡标记阴性T细胞，任选地凋亡标记阴性CD4+和/或凋亡标记阴性CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，以占所述输入组合物中的总T细胞的百分比计，凋亡标记阴性T细胞的百分比大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约90％、或大于或大于约95％。在一些实施方案中，在所述孵育之前，从生物样品中分离、选择或富集凋亡标记阴性T细胞，任选地凋亡标记阴性CD4+和/或凋亡标记阴性CD8+ T细胞。
本文提供了产生治疗性T细胞组合物的方法，所述方法包括(a)从生物样品中分离、选择或富集不表达凋亡标记(凋亡标记阴性(–))的T细胞群，任选地凋亡标记阴性CD4+和/或凋亡标记阴性CD8+ T细胞，从而获得输入组合物；(b)在刺激条件下孵育输入组合物，从而产生经刺激组合物；和(c)将重组受体引入到来自所述经刺激组合物的细胞中，从而产生工程化细胞组合物，其中所述引入包括使所述经刺激组合物的所述细胞与包含编码所述重组受体的多核苷酸的药剂接触。
在一些实施方案中，所述生物样品包括从受试者获得的原代T细胞。在一些实施方案中，所述受试者是人受试者。在一些实施方案中，所述生物样品是或含有全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。在一些实施方案中，所述生物样品含有单采术产物或白细胞单采术产物。在一些实施方案中，在从受试者获得所述生物样品之后不超过36小时从所述生物样品中分离、选择或富集所述T细胞。在一些实施方案中，在从所述受试者获得生物样品之后不超过36小时将所述生物样品在低温保护剂的存在下低温冷冻并且在分离、选择或富集所述细胞之前解冻，任选地其中在即将分离、选择或富集所述细胞之前或在此之前不超过6小时、不超过4小时、不超过2小时或不超过1小时内将所述经低温冷冻的样品解冻。
在一些实施方案中，所述孵育是在一种或多种细胞因子的存在下，任选地在无血清培养基中进行。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7、和/或重组IL-15。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子包含：在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-2；在100IU/mL与1,000IU/mL之间的重组IL-7；和/或在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-15。在一些实施方案中，所述刺激试剂含有与TCR复合物的成员特异性地结合、任选地与CD3特异性地结合的一级药剂，任选地其中所述一级药剂是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述刺激试剂进一步含有与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS，任选地其中所述二级药剂是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。在一些实施方案中，所述一级药剂和/或二级药剂存在于固体支持物的表面上。在一些实施方案中，所述固体支持物是或包含珠。在一些实施方案中，所述一级药剂和二级药剂固定或可逆地结合在包含多种链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的低聚物颗粒试剂的表面上。
在一些实施方案中，将所述输入组合物在刺激条件下孵育12小时至36小时，包含端值，任选地为或约24小时。在一些实施方案中，所述接触是通过病毒转导，任选地用逆转录病毒载体、任选地慢病毒载体来进行。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在促进所述工程化细胞的增殖和/扩增的条件下培育所述工程化组合物，从而产生包含所述工程化T细胞的输出组合物。在一些实施方案中，所述培育是在一种或多种细胞因子的存在下，任选地在无血清培养基中进行。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7、和/或重组IL-15。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子含有：在50IU/mL与400IU/mL之间的重组IL-2；在100IU/mL与2,000IU/mL之间的重组IL-7；和/或在50IU/mL与400IU/mL之间的重组IL-15。
在一些实施方案中，所述输入组合物以2:1与1:2之间的CD4+与CD8+T细胞比率含有CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，或者所述输入组合物以2:1与1:2之间的CD4+与CD8+ T细胞比率含有凋亡标记阴性CD4+ T细胞和凋亡标记阴性CD8+ T细胞。在一些实施方案中，将所述CD4+ T细胞和CD8+ T细胞从相同生物样品或来自所述生物样品的样品中单独地选择、分离或富集，并且在所述孵育之前合并。在一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，所述输出组合物含有所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性；和/或所述组合物中表达所述重组受体的CD4+ T细胞的总数量的至少或至少约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％在用刺激剂刺激后能够产生白介素2(IL-2)或TNF-α；和/或所述组合物中表达所述重组受体的CD4+ T细胞的总数量的至少或至少约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因在用刺激剂刺激后产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的。在一些实施方案中，所述刺激剂是非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂。在一些实施方案中，所述非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂是多克隆刺激剂。在一些实施方案中，所述非特异性或非抗原依赖性刺激剂包括PMA/离子霉素、抗CD3/抗CD28、植物凝集素(PHA)或伴刀豆球蛋白A(ConA)。在一些实施方案中，所述非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂含有PMA/离子霉素。在一些实施方案中，所述刺激剂特异性地结合所述重组受体，任选地其中所述刺激剂是抗原特异性刺激试剂和/或含有由所述重组受体特异性识别的抗原或其部分。在一些实施方案中，在细胞内细胞因子测定中测量细胞因子的产生。
附图说明
图1A显示用于以DL1和DL2给予的CAR T细胞组合物中存在的CD3+CAR+T细胞的数量。图1B显示用于以DL1和DL2给予的CAR T细胞组合物中存在的CD4+CAR+和CD8+CAR+细胞、CD4+CAR+TNF-α+细胞和CD8+CAR+TNF-α+、CD4+CAR+CCR7+细胞和CD8+CAR+CCR7+细胞的数量。图1C显示用于以DL1和DL2给予的CAR T细胞组合物中存在的CD4+CAR+和CD8+CAR+细胞、CD4+CAR+CCR7+细胞和CD8+CAR+CCR7+细胞的数量。
图2描绘在来自87名已经被给予抗CD19 CAR表达细胞的受试者的血液样品中，通过流式细胞术使用对截短的受体具有特异性的抗体评估的CAR表达CD3+细胞/μL血液的中值(±四分位数)数(CD3，圆形；N＝87)；或通过定量聚合酶链式反应(qPCR)使用对编码CAR的载体中存在的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)具有特异性的引物评估的整合CAR转基因的拷贝/μg基因组DNA的中值(±四分位数)数(qPCR，正方形；N＝85)。将流式细胞术中CAR+细胞检测的截止值设为CAR+门中≥25个事件，并且qPCR的检测限为≥12.5个CAR转基因拷贝/μg基因组DNA。
图3A显示CCR7+细胞百分比(在CD4+CAR+和CD8+CAR+细胞群中)分别相对于CD4+CAR+细胞和CD8+CAR+细胞的药代动力学参数(如通过给予细胞疗法的受试者的血液中CD4+CAR+细胞的AUC0-28或CD8+CAR+细胞的AUC0-28所指示)的绘图。每个点表示单独患者，其中单独点的明暗处理指示患者是接受剂量水平1(DL1)还是剂量水平2(DL2)。图3B显示类似的绘图，所述绘图是针对观察到展现高(在此评估中，通过大于或等于50cm2的直径积和(SPD)值指示的)或低(小于50cm2的SPD值)治疗前肿瘤负荷(在治疗前淋巴细胞清除化学疗法时评估的)的受试者单独地指示的。图3C描绘CD4+CAR+CCR7+细胞和CD8+CAR+CCR7+细胞的数量相对于给予细胞疗法的受试者的血液中CD4+CAR+细胞的AUC0-28或CD8+CAR+细胞的AUC0-28的绘图，以及相关系数和关联p值。图3D至图3J描绘CCR7+或CCR7+CD27+CD4+或CD8+CAR+T细胞百分比相对于CD4+CAR+T细胞(图3A、图3D-图3F)和CD8+CAR+T细胞(图3G-图3J)的药代动力学参数(AUC0-28和Cmax)的绘图，以及相关系数和关联p值。
图4A至图4B描绘在CD4+CAR+细胞中的CCR7+CD27+细胞百分比相对于CD4+CAR+组合物在用由CAR识别的抗原(CD19)刺激时的IFNγ(图4A)和IL-2(图4B)分泌的绘图。
图5A至图5B描绘在CD8+CAR+细胞中的CCR7+CD27+细胞百分比相对于CD4+CAR+组合物在用由CAR识别的抗原(CD19)刺激时的IL-5(图5A)和IL-13(图5B)分泌的绘图。
图6A至图6D显示给予CAR+T细胞组合物的受试者的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线，所述受试者分为给予含有在CD4+CAR+T细胞中(图6A关于无进展存活期，图6C关于反应持续时间)和在CD8+CAR+T细胞中(图6B关于无进展存活期，图6D关于反应持续时间)百分比高于或低于某个阈值水平的CCR7+CD27+CAR+T细胞的组合物的组。
图7A至图7B显示描绘在给予至受试者的细胞组合物中，在CD4+CAR+细胞中的CCR7+CD27+细胞百分比(图7A)或CD4+CAR+细胞的IFNγ分泌(图7B)随受试者是否继续发展细胞因子释放综合征(CRS；0级相对于1级或更高级)而变化的盒式图。图7C至图7D显示描绘在给予至受试者的细胞组合物中，在CD4+CAR+细胞中的CCR7+CD27+细胞百分比(图7C)或CD4+CAR+细胞的IFNγ分泌(图7D)随受试者是否继续发展神经毒性(NT；0-2级相对于3级或更高级)而变化的盒式图。
图8A显示基于t分布随机邻域嵌入(tSNE)的示例性多参数表型分析。图8B显示针对CCR7和CD27表达从所述分析中(在图8A上绘制的形状的边界内)鉴定出的细胞亚型的示例性流式细胞术绘图。
图9A至图9C显示对表型和功能属性(图9A)和转录组学(图9B)以及表观基因组分析(图9C)的示例性偏最小二乘判别分析(PLS-DA)评估，以鉴定在给予CAR+T细胞组合物后6个月时在展现完全反应(CR)的受试者与展现进行性疾病(PD)或部分反应(PR)的受试者之间有区别的变量。
图10A显示工程化前组合物中CD4+CCR7+CD27+细胞的频率相对于工程化细胞组合物中CD4+CAR+CCR7+CD27+细胞的频率的绘图(Spearman等级次序相关系数：0.591)。图10B显示工程化前组合物中CD8+CCR7+CD27+细胞的频率和工程化细胞组合物中CD8+CAR+CCR7+CD27+细胞的频率的绘图(Spearman等级次序相关系数：0.357)。
图11A至图11D描绘了来自从扩增和非扩增的过程产生的CAR+ T细胞组合物的结果，所述过程涉及基于珠的刺激试剂(珠)和在基础培养基中孵育(珠-基础培养基)或低聚物刺激试剂(低聚物)。图11A描绘了对CCR7和CD27两者均呈阳性的CD4+和CD8+ T细胞的百分比。图11B描绘了CD4+CAR+T细胞中CCR7+CD27+细胞的百分比。图11C描绘了CD8+CAR+T细胞中CCR7+CD27+细胞的百分比。图11D展示了在制造过程期间的不同日期(包括第1天的激活(激活d1)、第2天的转导(转导d2)和开始培育后的不同时间(d4 INOC+2、d6 INOC+4、d7INOC+5))从来自示例性扩增过程中的代表性供体产生的CCR7+CD27+细胞的百分比。
图12显示工程化前分离的CD4+和CD8+ T细胞组合物以及工程化后的CD4+和CD8+治疗性CAR+T细胞组合物的T细胞克隆性(应用香农(Shannon)指数)。
图13A和图13B分别显示在治疗性组合物的CD4+/CAR+T细胞中，具有“高”或“低”百分比的产生IL-2或TNFα的细胞的患者的无进展存活期曲线(Cox比例风险(顶部)和最佳分割(底部))，如使用最大选择秩统计量确定的。
图14显示在6个月时展现完全反应(CR)(三角形)或反应丧失/无反应(圆圈)的受试者中临床结果与基线直径积和(SPD)和基线C反应蛋白(CRP)水平的关系。
图15显示由在6个月时展现完全反应(CR)(三角形；1)或反应丧失/无反应(圆圈；0)的高基线SPD/CRP受试者产生的治疗性T细胞组合物中IL-2/CD4+/CAR+细胞的百分比。
图16显示输入组合物中对凋亡标记激活的半胱天冬酶3呈阳性的细胞的示例性三分位数截止值的无进展存活期曲线。
图17显示经富集输入T细胞组合物中对凋亡标记激活的半胱天冬酶3呈阳性的细胞的百分比，所述百分比随起始单采术样品的年龄(即在单采术与其在富集T细胞之前的进一步处理之间的时间长度(例如，以小时计)变化的样品)而变化。左绘图显示CD4+/激活的半胱天冬酶3+细胞的百分比，并且右绘图显示CD8+/激活的半胱天冬酶3+细胞的百分比。
具体实施方式
本文提供了方法、组合物和制品，其与细胞疗法(如工程化T细胞疗法)结合使用，用于治疗疾病和病症(包括各种肿瘤)。所提供的实施方案涉及含有工程化T细胞的治疗性T细胞组合物，所述工程化T细胞例如被工程化以表达重组蛋白如表达重组受体的那些，所述重组受体被设计用于识别和/或特异性地结合与所述疾病或病症相关的分子并在与此类分子结合后引起反应，例如针对此类分子的免疫应答。受体可包括嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)；和其他转基因抗原受体，包括转基因T细胞受体(TCR)。
在一些方面，所提供的实施方案涉及以下方面，其中细胞表型(例如表面标记的存在和/或表达、和/或表面标记的不存在或缺乏表达)与给予T细胞组合物的受试者中治疗性T细胞组合物的功能或活性、药代动力学参数(例如，暴露或最大细胞浓度)、发生毒性(如细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性(NT))的可能性的风险和/或细胞疗法的结果(例如对细胞疗法的反应)有关，和/或可以提供关于治疗性T细胞组合物的效力的信息。在一些方面，所提供的实施方案基于以下观察结果：某些细胞表型(例如，一种或多种表面标记的表达、一种或多种细胞因子的产生)与药代动力学参数、反应的可能性和/或发生毒性的可能性相关。在一些实施方案中，在用于给予的T细胞组合物(例如，药物组合物)中，细胞表面标记(如7型C-C趋化因子受体(CCR7)、CD27和CD45RA或其组合)的表达和/或表达的不存在与药代动力学参数和/或反应或毒性结果正相关或负相关。在一些方面，在本文中观察到，与分化程度较低的T细胞产物相关的表型和功能属性或在幼稚样或中枢记忆T细胞子集中富集的产物的表型和功能属性与以下相关联或展现与以下的关系：在给予至受试者后改善的药代动力学特性或反应，如反应和/或无进展存活期的持久性。
所提供的实施方案的方面还涉及给予或提供包含一定数量、比率、百分比和/或比例的细胞的单位剂量，所述单位剂量是某种表型(如指示细胞群的表型)的细胞的数量的函数，包括用于与治疗性T细胞组合物的给药结合使用。在一些方面，所提供的实施方案允许一致的给药和/或给予。在一些方面，所提供的实施方案可以用于评估某些结果的可能性和/或某一药代动力学参数的值、毒性的风险和/或细胞疗法的反应、效力或功效。在一些方面，所提供的方法可以在被给予一定剂量的治疗性T细胞组合物的受试者中控制、改善或降低毒性的风险，同时确保T细胞组合物的效力。还提供了含有细胞并且设计用于根据此类给药方案给予的制品。
在一些实施方案中，所提供的方法、剂量、单位剂量、组合物和制品是基于以下观察结果：当确定细胞疗法的适当剂量和/或释放或产生用于疗法的细胞组合物时，考虑某些表型(例如表面标记的表达)及其组合可能是有利的。在某些可用的方法中，剂量是基于特定细胞类型(如被工程化以展现出特定的活性的那些，如对工程化受体呈阳性的那些)的数量。例如，在某些可用的方法和剂量中，剂量是基于观察到的或推测的在存活的工程化T细胞或其子集(如存活的细胞毒性(例如，CD8+)工程化T细胞)的数量(或数量/患者体重)之间的关系。在各种情况下，此类数量可能与功效和/或安全性结果(如反应和/或毒性(如神经毒性、脑水肿和CRS)的风险)有关系。本文提供了基于如下观察结果的实施方案：尽管如此，在一些情况下，此类度量并非始终与受试者中的药理学参数、毒性(CRS或NT)的风险充分相关，特别是在不考虑其他变量的情况下。因此，仅依赖于此类度量来定义剂量和评价释放的产物的方法可能不完全令人满意。例如，在一些情况下，对于安全且有效的细胞疗法，此类方法可能无法达到某一治疗范围或窗口。本文提供了解决此类缺点的方法(包括治疗、给药、剂量确定和测定方法)、治疗性组合物和制品。
在一些方面，所提供的实施方案允许给予受控且一致剂量的细胞，从而最小化受试者中的功效和/或安全性结果的变化。在一些方面，基于细胞的特定子集(例如，基于细胞表型)的限定数量、比率、百分比和/或比例控制细胞的剂量允许理解具有特定表型的细胞子集对治疗性组合物中包含的细胞的健康状况、效力和/或功效的影响。此类方法可以用于确定和/或计算细胞疗法中细胞的一致且精确的有效剂量和/或控制细胞疗法的药代动力学参数。提供了基于表达特定表面标记和/或具有特定表型的细胞的数量、比率、百分比和/或比例来确定此类剂量(包括用于给予的单位剂量)的方法、含有使用此类方法确定的剂量以及用于给予的说明书的制品和试剂盒、和相关治疗方法。在一些方面，所提供的实施方案允许基于用于在受试者中给予的治疗性组合物中CD4+和CD8+CAR+T细胞以及任选地其CCR7+、CD27+和/或CD45RA-子集的数量的一致性和严格控制，鉴定工程化细胞组合物中的细胞的属性和与药代动力学(PK)和临床结果(如反应和毒性)的潜在关联性。用于给予的细胞组合物中CAR+细胞的总数量的这种一致性和严格控制可以为评估和控制用于给予的工程化细胞组合物中细胞的其他方面的策略提供基础。
在一些方面，所提供的实施方案允许给予展现低变化性、是纯的且含有精确剂量的CAR+T细胞组合物，从而允许鉴定各种细胞属性与临床结果(如反应和毒性)之间的关系。在一些方面，所提供的实施方案是基于以下观察结果：表达与某些表型(如分化程度较低的表型)相关的标记的细胞群展现某些功能谱(例如，细胞因子产生)。在一些方面，如在对CAR进行抗原特异性刺激时，CCR7+CD27+CD4+CAR T细胞产生减少的IFNγ和增加的IL-2，并且在一些方面，CCR7+CD27+CD8+CAR T细胞产生减少的IL-5和IL-13。在一些实施方案中，被给予的含有CAR+T细胞的细胞组合物(其中组合物中一定百分比的细胞展现分化程度较低的状态和/或是CCR7+CD27+的)如与含有较低百分比的此类细胞群的组合物相比，与期望的或改善的药代动力学参数、安全性事件和增加的持久反应相关。
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其全文并入，并入程度如同每个单独的出版物通过引用单独并入一般。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中所述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.治疗性T细胞组合物的剂量和剂量确定
本文提供了方法、组合物和制品，其与细胞疗法(如工程化T细胞疗法)结合使用，用于治疗疾病和病症(包括各种肿瘤)。所提供的实施方案涉及确定用于给予至受试者的剂量的方法、相关治疗方法、含有细胞剂量的组合物以及相关制品和试剂盒。在一些方面，所提供的实施方案涉及以下方面：其中用于给予的组合物中细胞的细胞表型(例如，表面标记的存在和/或表达、表面标记的不存在和/或缺乏表达和/或产生一种或多种细胞因子(例如，IL-2)的能力)与药代动力学参数(例如，暴露或最大细胞浓度)的值或测量值有关、相关联或相关。在一些方面，所述表型和/或参数还与在给予T细胞组合物的受试者中细胞的活性和/或功能和/或发生毒性(如细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性(NT))的可能性和/或细胞疗法的结果(例如对细胞疗法的反应)，如反应和无进展存活期的持久性有关、相关联或相关。
在一些方面，所提供的实施方案涉及确定和/或给予所述细胞组合物的剂量，例如细胞组合物的一个或多个单位剂量和/或对应于此类单位剂量的体积。在一些方面，细胞的所述剂量富含具有特定表型的生物活性工程化T细胞，例如具有高或相对高百分比的所述生物活性工程化T细胞。在一些方面，所述剂量是基于具有特定表型的生物活性工程化T细胞的数量。在一些方面，生物活性是指未被程序化以经历细胞死亡的细胞(例如，非凋亡细胞或未显示进入凋亡途径的指征的细胞)的特性。在一些方面，剂量是基于具有特定表型的生物活性工程化CD8+T细胞的数量，和/或，其中剂量是基于具有特定表型的生物活性工程化T细胞的总数量。
在一些实施方案中，所述方法确保单位剂量在一种或多种特定组合物中包含相对一致的具有特定表型的工程化细胞的数量、比例、比率和/或百分比。在一些方面，所述一致性与相对一致的活性、功能、药代动力学参数、毒性结果和/或反应结果相关或有关。在一些实施方案中，能够具有一致的活性、功能、药代动力学参数、毒性结果和/或反应结果(例如，持久反应、持久无进展存活期)的工程化细胞的百分比是或包括：所述组合物中工程化细胞(例如，T细胞)的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体、对CCR7和/或CD27呈表面阳性、任选地进一步对CD45RA的表面表达呈阴性的工程化细胞(例如，T细胞)的总数量的至少或至少约、或为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，所述工程化细胞(例如，T细胞)进一步对凋亡标记，如激活的半胱天冬酶3或膜联蛋白V呈阴性。在一些实施方案中，能够具有一致的活性、功能、药代动力学参数、毒性结果和/或反应结果(例如，持久反应、持久无进展存活期)的工程化细胞的百分比是或包括：所述组合物中工程化细胞(例如，T细胞)的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体、对凋亡标记(例如，半胱天冬酶-3、膜联蛋白V)呈阴性的工程化细胞(例如，T细胞)的总数量的至少或至少约、或为或约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％。在一些实施方案中，能够具有一致的活性、功能、药代动力学参数、毒性结果和/或反应结果(例如，持久反应、持久无进展存活期)的工程化细胞的百分比是或包括：所述组合物中工程化CD4+ T细胞的总数量、或能够产生选自白介素2(IL-2)和/或TNF-α的细胞因子的表达所述重组受体的工程化CD4+ T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，能够具有一致的活性、功能、药代动力学参数、毒性结果和/或反应结果(例如，持久反应、持久无进展存活期)的工程化细胞的百分比是或包括：所述组合物中工程化CD4+ T细胞的总数量、或因产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的表达所述重组受体的工程化CD4+ T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多。在一些实施方案中，所述组合物中能够具有一致的活性、功能、药代动力学参数、毒性结果和/或反应结果(例如，持久反应、持久无进展存活期)的工程化细胞是或包括本文所述的一种或多种表型。因此，在一些实施方案中，能够具有一致的活性、功能、药代动力学参数、毒性结果和/或反应结果(例如，持久反应、持久无进展存活期)的工程化细胞的百分比是或包括表型的百分比的组合。在一些实施方案中，有待用作治疗性组合物的组合物是基于组合物(例如输出组合物)中包括一种或多种表型的细胞的百分比选择的。
在一些方面，在多名受试者、多种组合物和/或多个剂量中，所述数量、比例、比率和/或百分比是相对一致的，例如，在组合物或单位剂量中具有特定表型(例如表达CCR7(CCR7+)和/或具有产生一种或多种细胞因子的能力)的细胞的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。在一些方面，在组合物或单位剂量中具有特定表型(例如表达CCR7(CCR7+)和/或具有产生一种或多种细胞因子的能力)的细胞的数量或比率与在通过所述过程产生的多种T细胞组合物中所述数量或比率的平均值相比变化不超过20％或不超过10％或不超过5％，和/或与这个平均值相比变化不超过一个标准差，或者在所确定的多种T细胞组合物或剂量中变化不超过20％或不超过10％或不超过5％。
在一些实施方案中，所述方法涉及确定和/或给予细胞，例如表达重组受体(如CAR)的工程化T细胞的一个或多个单位剂量。在一些方面，所述方法涉及给予细胞的一个或多个单位剂量，其中所述细胞的一个或多个单位剂量富含具有特定表型(如特定表面标记表型和/或指示功能活性，如产生一种或多种细胞因子的能力)的细胞，和/或含有高或相对高百分比的所述细胞。在一些方面，所述单位剂量是基于工程化T细胞的特定子集，例如具有特定表型(如特定表面标记表型和/或指示功能活性，如产生一种或多种细胞因子的能力)的细胞的数量、百分比、比率、频率和/或比例来确定。在一些实施方案中，工程化或治疗性细胞组合物可以通过产生输出组合物的方法产生，如与用于产生所述工程化输出组合物的起始材料或输入组合物相比，所述输出组合物含有或富含具有此类表型或功能属性的细胞。本文描述了工程化或治疗性细胞组合物(如根据用于产生工程化细胞的方法产生的输出组合物，包括在任何这种组合物的一个或多个单位剂量中)的细胞的示例性表型和功能属性。
在一些方面，细胞标记包括指示细胞健康状况、细胞的活力和/或凋亡状态的标记。在一些方面，示例性标记包括CD3、CD4、CD8、CCR7、CD27、CD45RA、膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。在一些方面，示例性标记包括CCR7、CD27和/或CD45RA。在一些方面，示例性标记包括CCR7和/或CD27。在一些方面，示例性标记是CCR7。在一些方面，示例性标记是CD27。
在一些方面，所提供的方法还涉及评估所述治疗性组合物的细胞表型，例如标记，例如CD3、CD4、CD8、CCR7、CD27、CD45RA、膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3的表达。在一些实施方案中，表型包括抗原特异性功能。在一些实施方案中，表型包括例如在用重组受体(例如CAR)特异性结合和/或识别的抗原刺激时细胞因子的产生或分泌。在一些实施方案中，表型包括细胞因子的产生，所述细胞因子例如与特定细胞类型相关的细胞因子，如与Th1、Th2、Th17和/或Treg亚型相关的细胞因子。
在一些方面，所提供的方法涉及确定合适的剂量，例如用于给予至患有疾病或病症的受试者的含有工程化T细胞的治疗性组合物的一个或多个单位剂量。在一些方面，所述方法还涉及评估含有工程化T细胞的治疗性组合物中工程化T细胞的特定子集，例如具有特定表型(如特定表面标记表型)的细胞的数量、百分比、比率、频率和/或比例。在一些实施方案中，所提供的方法涉及在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达所述重组受体和CCR7(受体+/CCR7+)的T细胞的数量、百分比或比率。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达或不表达CD27和/或CD45RA的T细胞的数量、百分比或比率。用于评估的其他示例性表型标记和/或评估方法描述于下文中，例如，章节I.A中。在一些方面，可以基于任何所述评估来确定单位剂量。在一些方面，所述方法还涉及评估表达重组受体(例如CAR)或重组受体的替代标记的细胞的数量、百分比、比率、频率和/或比例。可以基于对本文所述的任何表型标记的数量、百分比、比率、频率和/或比例的评估来确定剂量，例如一个或多个单位剂量。
A.确定细胞表型
在一些实施方案中，细胞组合物中的细胞表型、或此类表型的水平或百分比与在给予T细胞组合物的受试者中细胞的活性和/或功能和/或发生毒性(如细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性(NT))的可能性和/或细胞疗法的结果(例如对细胞疗法的反应)，如反应和无进展存活期的持久性相关联或相关。在一些实施方案中，包括具有特定表型的细胞的组合物，并且更特别地，具有此类特定表型的细胞的百分比与临床结果，如持久反应和/或无进展存活期相关联。在一些实施方案中，表型通过以下方式来确定：评估一种或多种特定分子的存在或不存在，所述一种或多种特定分子包括可以由T细胞组合物内的细胞或细胞亚群积累或产生的表面分子和/或分子。在一些实施方案中，表型直接或相反地指示或表示T细胞组合物内的细胞或细胞群的生物活性。在一些实施方案中，表型可以包括细胞活性，如响应于刺激物而产生因子(例如细胞因子)。在某些实施方案中，进行细胞组合物的评估以鉴定、检测或定量细胞组合物的表型。在特定实施方案中，进行细胞组合物的测量以鉴定、检测或定量特定分子的存在、不存在、表达程度或水平。
设想在一些情况下，细胞组合物(例如工程化T细胞组合物)的表型可以取决于许多因素，包括但不限于用于产生细胞组合物的起始细胞材料的表型(例如单采术产物或白细胞单采术产物)和经历处理以产生细胞组合物的细胞材料的表型。因此，在一些实施方案中，在起始材料和/或经历处理以产生细胞组合物的材料以及最终细胞组合物的细胞中评估表型。
在一些实施方案中，表型指示细胞的活力。在一些实施方案中，表型指示凋亡的不存在、凋亡的早期阶段的不存在或凋亡的晚期阶段的不存在。在一些实施方案中，表型是指示凋亡、早期凋亡或凋亡的晚期阶段不存在的因子的不存在。在一些实施方案中，表型是T细胞的亚群或子集(如重组受体表达T细胞(例如CAR+T细胞)、CD8+T细胞、或CD4+T细胞)的表型。在一些实施方案中，表型是未被激活、和/或缺乏一种或多种激活标记的表达或一种或多种激活标记的表达被减少或较低的细胞的表型。在一些实施方案中，表型是未被消耗和/或缺乏一种或多种消耗标记的表达或一种或多种消耗标记的表达被减少或较低的细胞的表型。
在一些实施方案中，表型通过一种或多种特定分子在细胞中的存在、不存在或表达水平来指示，所述一种或多种特定分子是例如指示表型的某些表面标记(例如表面蛋白)、指示表型的细胞内标记、或指示表型的核酸、或指示表型的其他分子或因子。在一些实施方案中，表型是或包含所述一种或多种特定分子的阳性或阴性表达。在一些实施方案中，特定分子包括但不限于表面标记(例如，膜糖蛋白或受体)；与凋亡或活力相关的标记；或指示免疫细胞状态的特定分子(例如，与激活、消耗或成熟或幼稚表型相关的标记)。在一些实施方案中，用于基于特定分子评估或测量、计数和/或定量细胞的任何已知方法都可以用于确定表型的细胞的数量。
在一些实施方案中，表型是或包括在细胞中一种或多种特定分子的阳性或阴性表达。在一些实施方案中，阳性表达由细胞中特定分子的可检测量指示。在某些实施方案中，可检测量是在细胞中特定分子的任何检测量。在特定实施方案中，可检测量是在细胞中大于背景(例如背景染色、信号等)的量。在某些实施方案中，阳性表达是大于阈值(例如预定的阈值)的特定分子的量。同样地，在特定实施方案中，具有特定分子的阴性表达的细胞可以是未确定具有阳性表达的任何细胞，或者是缺乏可检测量的特定分子或高于背景的可检测量的特定分子的细胞。在一些实施方案中，如果特定分子的量低于阈值，则细胞具有特定分子的阴性表达。作为常规技能，本领域技术人员将理解如何定义阈值来定义特定分子的阳性和/或阴性表达，并且所述阈值可以根据特定参数(例如但不限于检测的测定或方法、特定分子的身份、用于检测的试剂和仪器)来定义。
可以用于检测特定分子和/或分析细胞表型的方法的例子包括但不限于生化分析；免疫化学分析；图像分析；细胞形态学分析；分子分析如PCR、测序、高通量测序、DNA甲基化的确定；蛋白质组学分析，如蛋白质糖基化和/或磷酸化模式的确定；基因组学分析；表观基因组学分析(例如ChIP-seq或ATAC-seq)；转录组学分析(例如RNA-seq)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述方法可以包括评估免疫受体库，例如T细胞受体(TCR)的库。在一些方面，可以在高通量方法、自动化方法中和/或通过基于单细胞的方法来评估任何表型的确定。在一些方面，大规模或全基因组方法可用于鉴定一种或多种分子标签。在一些方面，大规模或全基因组方法可用于鉴定与疗法结果(例如功效和安全性)或药代动力学参数相关的分子标签。在一些方面，可以确定细胞中的一种或多种分子标签，例如特定RNA或蛋白质的表达。在一些实施方案中，通过图像分析、PCR(包括标准PCR和PCR的所有变化形式)、微阵列(包括但不限于DNA微阵列、用于微小RNA的MMchips、蛋白质微阵列、细胞微阵列、抗体微阵列和碳水化合物阵列)、测序、生物标记检测或用于确定DNA甲基化或蛋白质糖基化模式的方法来分析表型的分子特征。在特定实施方案中，特定分子是多肽，即蛋白质。在一些实施方案中，特定分子是多核苷酸。
在一些实施方案中，通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来确定特定分子的阳性或阴性表达，所述一种或多种抗体或其他结合剂分别与在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记+)或以相对较高水平表达(标记高)的一种或多种表面标记特异性地结合。在特定实施方案中，阳性或阴性表达通过流式细胞术、免疫组织化学或用于检测特定标记的任何其他合适的方法来确定。
在特定实施方案中，用流式细胞术来评估特定分子的表达。流式细胞术是基于激光或基于阻抗的生物物理学技术，用于细胞计数、细胞分选、生物标记检测和蛋白质工程，通过将细胞悬浮在流体流中并使其流经电子检测仪器来进行，。它允许每秒对高达数千个颗粒的物理和化学特征同时进行多参数分析。
可以将由流式细胞仪产生的数据在单一维度上绘制以产生直方图，或者在二维点图中或甚至在三维中绘制。可以基于荧光强度，通过创建一系列子集提取依序分离这些图上的区域，称之为“门”。存在用于诊断和临床目的(尤其是与免疫学有关的)的特定门控方案。通常以对数标度制作图。因为不同的荧光染料的发射光谱重叠，所以必须以电子方式以及计算方式对检测器的信号进行补偿。使用流式细胞仪累积的数据可以使用软件进行分析，所述软件是例如JMP(统计软件)、WinMDI、Flowing Software和基于网络的Cytobank)、Cellcion、FCS Express、FlowJo、FACSDiva、CytoPaint(也称为Paint-A-Gate)、VenturiOne、CellQuest Pro、Infinicyt或Cytospec。
流式细胞术是本领域的标准技术，并且技术人员将容易地理解如何设计或调整方案来检测一种或多种特定分子并分析数据以确定一种或多种特定分子在细胞群中的表达。用于流式细胞术的标准方案和技术发现于以下文献中：Loyd“Flow Cytometry inMicrobiology”；Practical Flow Cytometry，Howard M.Shapiro；Flow Cytometry forBiotechnology，Larry A.Sklar；Handbook of Flow Cytometry Methods，J.PaulRobinson等人；Current Protocols in Cytometry,Wiley-Liss Pub,Flow Cytometry inClinical Diagnosis,v4,(Carey、McCoy、和Keren编),ASCP Press,2007；Ormerod,M.G.(编辑)(2000)Flow Cytometry-A practical approach.第3版.Oxford University Press,牛津,英国；Ormerod,M.G.(1999)Flow Cytometry.第2版.BIOS Scientific Publishers,牛津；以及Flow Cytometry-A basic introduction.Michael G.Ormerod,2008。
在一些实施方案中，将细胞通过表型分选以进行进一步分析。在一些实施方案中，通过荧光激活的细胞分选(FACS)对在同一细胞组合物内的不同表型的细胞进行分选。FACS是专门类型的流式细胞术，其允许基于每个细胞的特定光散射和荧光特征，将细胞的异质混合物分选到两个或更多个容器中，每次一个细胞。它是有用的科学仪器，因为它提供对来自单独细胞的荧光信号的快速、客观和定量的记录以及对特别感兴趣的细胞的物理分离。
在一些实施方案中，表型包括总T细胞的数量或总CD3+T细胞的数量。在特定实施方案中，T细胞组合物，例如含有表达重组受体或CAR的细胞的治疗性T细胞组合物，可以包括T细胞的一种或多种不同的亚型。在一些实施方案中，表型是或包括T细胞亚型的身份。T细胞的不同的群体或亚型包括但不限于效应T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、幼稚T细胞、CD4+细胞、和CD8+T细胞。在某些实施方案中，T细胞亚型可以通过检测特定分子的存在或不存在来鉴定。在某些实施方案中，特定分子是可以用于鉴定T细胞亚型的表面标记。
在一些实施方案中，表型是一种或多种特定分子的阳性或高水平表达，所述一种或多种特定分子是表面标记，例如CD3、CD4、CD8、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD4、CD8、CD45RA、和/或CD45RO。在某些实施方案中，表型是T细胞的或T细胞的亚群或子集的表面标记，如基于一种或多种表面标记的阳性表面标记表达，例如，CD3+、CD4+、CD8+、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、和/或CD45RO+。在一些实施方案中，表型是一种或多种特定分子的阳性或高水平表达，所述一种或多种特定分子是表面标记，例如7型C-C趋化因子受体(CCR7)、分化簇27(CD27)、分化簇28(CD28)、和分化簇45RA(CD45RA)。在某些实施方案中，表型标记包括CCR7、CD27、CD28、CD44、CD45RA、CD62L、和L-选择素。在一些实施方案中，表型是一种或多种特定分子的阴性表达或表达的不存在，所述一种或多种特定分子是表面标记，例如CD3、CD4、CD8、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD4、CD8、CD45RA、和/或CD45RO。在某些实施方案中，表型是T细胞的或T细胞的亚群或子集的表面标记，如基于一种或多种表面标记(例如，CD3-、CD4-、CD8-、CD28-、CD62L-、CCR7-、CD27-、CD127-、CD4-、CD8-、CD45RA-、和/或CD45RO-)的表面标记表达的不存在。在一些实施方案中，表型是一种或多种特定分子的阴性表达或表达的不存在，所述一种或多种特定分子是表面标记，例如7型C-C趋化因子受体(CCR7)、分化簇27(CD27)、分化簇28(CD28)、和分化簇45RA(CD45RA)。在某些实施方案中，表型标记包括CCR7、CD27、CD28、CD44、CD45RA、CD62L、和L-选择素。
在某些实施方案中，表型是或包括CD27、CCR7和/或CD45RA的阳性或阴性表达。在一些实施方案中，表型是CCR7+。在一些实施方案中，表型是CD27+。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+。在一些实施方案中，表型是CD45RA-。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是CD27+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+/CD45RA-。
在某些实施方案中，表面标记指示重组受体(例如CAR)的表达。在特定实施方案中，表面标记是重组受体(例如CAR)的表达，其在一些方面可以使用抗体(如抗独特型抗体)来确定。在一些实施方案中，指示重组受体的表达的表面标记是替代标记。在特定实施方案中，这种替代标记是已经修饰以具有极少或无活性的表面蛋白。在某些实施方案中，替代标记在编码重组受体的同一多核苷酸上编码。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列与编码标记的核酸序列可操作地连接，任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或引起核糖体跳跃的肽(例如2A序列，例如T2A(例如SEQ ID NO:6和17)、P2A(例如SEQID NO:18和19)、E2A(例如SEQ ID NO:20)或F2A(例如SEQ ID NO:21))的核酸分开。在一些情况下，外在标记基因可以与工程化细胞结合使用，以允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还促进细胞自杀。
示例性替代标记可以包括截短的细胞表面多肽，例如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(EGFRt，SEQ ID NO:7或16所示的示例性EGFRt序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其经修饰形式。EGFRt可以含有由抗体西妥昔单抗
或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以用于鉴定或选择已经用EGFRt构建体和重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所述受体的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，标记例如替代标记包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体的全部或部分(例如截短形式)(例如tEGFR)。在一些实施方案中，编码所述标记的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列，例如，T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO 2014031687所披露的任何一种。例如，标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:7或16中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:7或16至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，标记是或包含荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(如超折叠GFP)、红色荧光蛋白(RFP)(如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌(E.coli)的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。
在某些实施方案中，表型包括表面标记CD3、CD4、CD8中的一种或多种、和/或重组受体(例如CAR)或其指示重组受体(例如CAR)的表达或与重组受体(例如CAR)的表达相关的替代标记的表达(例如表面表达)。
在特定实施方案中，通过作为表面标记的一种或多种特定分子的表达来鉴定表型。在某些实施方案中，表型是或包括CD3、CD4、CD8和/或重组受体(例如CAR)的阳性或阴性表达。在某些实施方案中，所述重组受体是CAR。在特定实施方案中，表型包括CD3+/CAR+、CD4+/CAR+、和/或CD8+/CAR+。
在某些实施方案中，表型是或包括CD27、CCR7和/或CD45RA和/或重组受体(例如CAR)的阳性或阴性表达。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CAR+。在一些实施方案中，表型是CD27+/CAR+。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+/CAR+。在一些实施方案中，表型是CD45RA-/CAR+。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD45RA-/CAR+。在一些实施方案中，表型是CD27+/CD45RA-/CAR+。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+/CD45RA-/CAR+。
在一些实施方案中，表型是活力。在某些实施方案中，表型是标记的阳性表达，所述标记指示细胞经历正常功能性细胞过程和/或尚未经历坏死或程序性细胞死亡或并非处于经历坏死或程序性细胞死亡的过程中。在一些实施方案中，可以通过细胞的氧化还原电位、细胞膜的完整性或线粒体的活性或功能来评估活力。在一些实施方案中，活力是在测定中不存在与细胞死亡相关的特定分子，或不存在细胞死亡的指征。
在一些实施方案中，表型是或包含细胞活力。在某些实施方案中，可以通过在本领域中的许多常规手段来检测、测量和/或评估细胞的活力。此类活力测定的非限制性例子包括但不限于染料摄取测定(例如，钙黄绿素AM测定)、XTT细胞活力测定、和染料排除测定(例如，台盼蓝、伊红或丙啶染料排除测定)。活力测定可用于确定细胞剂量、细胞组合物和/或细胞样品中的活细胞的数量或百分比(例如，频率)。在特定实施方案中，表型包括细胞活力以及其他特征(例如，重组受体表达)。
在某些实施方案中，表型是或包括细胞活力、活CD3+、活CD4+、活CD8+、活CD3+/CAR+、活CD4+/CAR+、活CD8+/CAR+、活CD4+/CCR7+/CAR+、活CD8+/CD27+/CAR+、活CD4+/CD27+/CAR+、活CD8+/CCR7+/CD27+/CAR+、活CD4+/CCR7+/CD27+/CAR+、活CD8+/CCR7+/CD45RA–/CAR+或活CD4+/CCR7+/CD45RA–或其组合。
在特定实施方案中，表型是或包括凋亡的不存在和/或细胞正在经历凋亡过程的指征。凋亡是程序性细胞死亡的过程，所述过程包括导致特征性细胞变化和死亡的一系列定型的形态学和生物化学事件。这些变化包括出泡、细胞皱缩、核碎裂、染色质凝聚、染色体DNA断裂、和全面mRNA降解。凋亡是一种充分表征的过程，并且与各个阶段相关的特定分子是本领域中熟知的。
在一些实施方案中，表型是凋亡的早期阶段的不存在、和/或与凋亡的早期阶段相关的指示物和/或特定分子的不存在。在凋亡的早期阶段，细胞和线粒体膜的变化变得明显。在细胞的细胞质和细胞核中生物化学变化也很明显。例如，凋亡的早期阶段可以通过某些半胱天冬酶(例如，2、8、9和10)的激活来指示。在特定实施方案中，表型是凋亡的晚期阶段的不存在、和/或与凋亡的晚期阶段相关的指示物和/或特定分子的不存在。凋亡的中期至晚期阶段的特征在于膜完整性的进一步丧失、染色质凝聚和DNA断裂，并且包括生物化学事件如半胱天冬酶3、6和7的激活。
在某些实施方案中，表型是与凋亡相关的一种或多种因子的阴性表达，所述一种或多种因子包括已知启动凋亡的促凋亡因子，例如死亡受体途径的成员、线粒体(内在)途径的激活成员，如Bcl-2家族成员(例如Bax、Bad和Bid)以及半胱天冬酶。在一些实施方案中，表型是阴性或低量的凋亡标记。在某些实施方案中，表型是凋亡标记的阴性表达。在某些实施方案中，表型是不存在指示物，例如膜联蛋白V分子，所述指示物当与细胞组合物一起孵育或接触细胞组合物时优先结合正在经历凋亡的细胞。在一些实施方案中，表型是或包括指示细胞中的凋亡状态的一种或多种标记的表达。
在一些实施方案中，表型是作为凋亡标记的特定分子的阴性(或低)表达。各种凋亡标记对本领域普通技术人员而言是已知的，并且包括但不限于一种或多种半胱天冬酶(即激活的半胱天冬酶(例如活性半胱天冬酶))的活性的增加、PARP切割的增加、Bcl-2家族蛋白(细胞死亡途径的成员(例如Fas和FADD))的激活和/或易位、核皱缩的存在(例如，通过显微镜监测)和染色体DNA断裂的存在(例如，染色体DNA梯状条带的存在)或使用包括TUNEL染色和膜联蛋白V染色的凋亡测定。
半胱天冬酶是在天冬氨酸残基之后切割蛋白质的酶，所述术语源自“半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶”。半胱天冬酶参与凋亡，因此半胱天冬酶(如半胱天冬酶-3)的激活指示凋亡的增加或再次发生。在某些实施方案中，可以通过普通技术人员已知的方法来检测半胱天冬酶激活。在一些实施方案中，与激活的半胱天冬酶特异性结合(即，与切割过的多肽特异性结合)的抗体可以用于检测半胱天冬酶激活。在另一个例子中，半胱天冬酶活性的荧光色素抑制剂(FLICA)测定可以用于通过检测半胱天冬酶-3对乙酰基Asp-Glu-Val-Asp 7-酰胺基-4-甲基香豆素(Ac-DEVD-AMC)的水解(即检测发荧光的7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的释放)来检测半胱天冬酶-3激活。FLICA测定可以用于通过检测通过多种半胱天冬酶处理的底物的产物来确定半胱天冬酶激活(例如，FAM-VAD-FMK FLICA)。其他技术包括使用激活发光的半胱天冬酶-8四肽底物(Z-LETD-氨基萤光素)、半胱天冬酶-9四肽底物(Z-LEHD-氨基萤光素)、半胱天冬酶-3/7底物(Z-DEVD-氨基萤光素)、半胱天冬酶-6底物(Z-VEID-氨基萤光素)或半胱天冬酶-2底物(Z-VDVAD-氨基萤光素)的CASPASE-
半胱天冬酶测定(PROMEGA)。
在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶-1、激活的半胱天冬酶-2、激活的半胱天冬酶-3、激活的半胱天冬酶-7、激活的半胱天冬酶-8、激活的半胱天冬酶-9、激活的半胱天冬酶-10和/或激活的半胱天冬酶-13在细胞中的阴性表达。在特定实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-。在一些实施方案中，半胱天冬酶的前体形式(酶原切割形式)(如上述任何形式)也是指示凋亡存在的标记。在一些实施方案中，表型是或包括半胱天冬酶的前体形式(如半胱天冬酶-3的前体形式)的不存在或阴性表达。
在一些实施方案中，凋亡标记是切割的聚ADP-核糖聚合酶1(PARP)。PARP在凋亡的早期阶段期间被半胱天冬酶切割。因此，切割的PARP肽的检测是凋亡的标记。在特定实施方案中，表型是或包括切割的PARP的阳性或阴性表达。
在一些实施方案中，凋亡标记是检测细胞中与凋亡相关的特征的试剂。在某些实施方案中，试剂是膜联蛋白V分子。在凋亡的早期阶段期间，脂质磷脂酰丝氨酸(PS)从质膜的内部小叶易位到外部小叶。PS通常受限于健康和/或非凋亡细胞中的内膜。膜联蛋白V是一种以高亲和力优先结合磷脂酰丝氨酸(PS)的蛋白质。当与荧光标签或其他报告物缀合时，膜联蛋白V可以用于快速检测凋亡的这种早期细胞表面指示物。在一些实施方案中，PS在外膜上的存在将持续到凋亡的晚期阶段。因此，在一些实施方案中，膜联蛋白V染色是凋亡的早期和晚期阶段二者的指征。在某些实施方案中，将膜联蛋白(例如膜联蛋白V)用可检测的标记进行标记，并且与在细胞组合物中的细胞一起孵育、暴露于在细胞组合物中的细胞和/或与在细胞组合物中的细胞接触，以例如通过流式细胞术检测正在经历凋亡的细胞。在一些实施方案中，将荧光标记的膜联蛋白(例如膜联蛋白V)用于将细胞染色以供流式细胞术分析(例如使用膜联蛋白-V/7-AAD测定)。适合于用膜联蛋白进行凋亡检测的替代性方案包括利用放射性标记的膜联蛋白V的技术和测定。在某些实施方案中，表型是或包括膜联蛋白的阴性染色，例如膜联蛋白V-。在特定实施方案中，表型是或包括外质膜上PS的不存在。在某些实施方案中，表型是或包括不被膜联蛋白(例如膜联蛋白V)结合的细胞。在某些实施方案中，在外膜上缺乏可检测的PS的细胞是膜联蛋白V-的。在特定实施方案中，在与标记的膜联蛋白V一起孵育之后在测定(例如流式细胞术)中未被膜联蛋白V-结合的细胞是膜联蛋白V-的。
在特定实施方案中，表型是膜联蛋白V-、膜联蛋白V-D3+、膜联蛋白V-CD4+、膜联蛋白V-CD8+、膜联蛋白V-CD3+/CAR+、膜联蛋白V-CD4+/CAR+、膜联蛋白V-CD8+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-、激活的半胱天冬酶3-/CD3+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+、激活的半胱天冬酶3-/CD3+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+、膜联蛋白V-/CD4+/CCR7+/CAR+、膜联蛋白V-/CD8+/CD27+/CAR+、膜联蛋白V-/CD4+/CD27+/CAR+、膜联蛋白V-/CD8+/CCR7+/CD27+/CAR+、膜联蛋白V-/CD4+/CCR7+/CD27+/CAR+、膜联蛋白V-/CD8+/CCR7+/CD45RA–/CAR+或膜联蛋白V-/CD4+/CCR7+/CD45RA–；激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CCR7+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CD27+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CD27+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CCR7+/CD27+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CCR7+/CD27+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CCR7+/CD45RA–/CAR+或激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CCR7+/CD45RA–或其组合。
特定实施方案考虑，对凋亡标记的表达呈阳性的细胞正在经历程序性细胞死亡，显示降低的免疫功能或没有免疫功能，并且具有减弱的经历激活、扩增能力(如果存在)，和/或结合抗原以启动、进行或促进免疫应答或活性。在特定实施方案中，表型被定义为激活的半胱天冬酶的阴性表达和/或膜联蛋白V的阴性染色。
在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-(半胱天冬酶3-)和/或膜联蛋白V-。
表型包括通常与T细胞的一种或多种亚型或亚群或其表型相关的一种或多种标记的表达或表面表达。T细胞亚型和亚群可以包括CD4+和/或CD8+T细胞及其亚型，所述CD4+和/或CD8+T细胞及其亚型可以包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)，效应记忆T(TEM)、TEMRA细胞或终末分化的效应记忆T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些方面，表型包括与分化程度较低的细胞子集或分化程度较高的子集相关的表达或标记或功能，例如，抗原特异性功能(如细胞因子分泌)。在一些实施方案中，表型是与分化程度较低的子集相关的那些表型，如CCR7+、CD27+和白介素2(IL-2)产生中的一种或多种。在一些方面，分化程度较低的子集也可能与治疗功效、自我更新、存活功能或移植物抗宿主病有关。在一些实施方案中，表型是与分化程度较高的子集相关的那些表型，如干扰素-γ(IFN-γ)或IL-13产生中的一种或多种。在一些方面，分化程度较高的子集也可能与衰老和效应子功能有关。
在一些实施方案中，表型是或包括暴露于其同源抗原的记忆T细胞或记忆T细胞子集的表型。在一些实施方案中，表型是或包括记忆T细胞，如TCM细胞、TEM细胞或TEMRA细胞、TSCM细胞、或其组合的表型(或与其相关的一种或多种标记)。在特定实施方案中，表型是或包括一种或多种特定分子的表达，所述一种或多种特定分子是记忆和/或记忆T细胞或其亚型的标记。在一些方面，与TCM细胞相关的示例性表型可以包括CD45RA-、CD62L+、CCR7+和CD95+中的一种或多种。在一些方面，与TEM细胞相关的示例性表型可以包括CD45RA-、CD62L-、CCR7-和CD95+中的一种或多种。
在特定实施方案中，表型是或包括作为幼稚T细胞的标记的一种或多种特定分子的表达。
在一些实施方案中，表型是或包括记忆T细胞或幼稚T细胞。在某些实施方案中，表型是作为记忆标记的一种或多种特定分子的阳性或阴性表达。在一些实施方案中，记忆标记是可以用于定义记忆T细胞群的特定分子。
在一些实施方案中，表型是或包括非记忆T细胞或其亚型的表型或与非记忆T细胞或其亚型相关一种或多种标记；在一些方面，表型是或包括与幼稚细胞相关的表型或一种或多种标记。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA+。在某些实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD45RA+。在一些实施方案中，表型是或包括中枢记忆T细胞的表型。在特定实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是或包括CCR7-/CD27+/CD28+/CD45RA-。在某些实施方案中，表型是或包括TEMRA细胞或TSCM细胞的表型。在某些实施方案中，表型是或包括CD45RA+。在特定实施方案中，表型是或包括CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+。在一些实施方案中，表型是或包括CD27+/CD28+、CD27-/CD28+、CD27+/CD28-、或CD27-/CD28-中的一种。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+/CD45RA+。在某些实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD45RA+。在特定实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD27+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是或包括CCR7-/CD27+/CD45RA-。在某些实施方案中，表型是或包括CD45RA+。在特定实施方案中，表型是或包括CCR7-/CD27-/CD45RA+。
在一些实施方案中，表型是或包括任何前述表型特性，并且进一步包括重组受体的表达，如与记忆T细胞或记忆亚型相关并表达CAR的表型，或与表达CAR的幼稚细胞相关的表型。在某些实施方案中，表型是或包括表达CAR的中枢记忆T细胞或中枢记忆干T细胞的表型。在特定实施方案中，表型是或包括表达CAR的效应记忆细胞的表型。在一些实施方案中，表型是或包括表达CAR的TEMRA细胞的表型。在特定实施方案中，表型是或包括CAR+/CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA-；CAR+/CCR7-/CD27+/CD28+/CD45RA-；CAR+/CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+；CAR+/CD27+/CD28+；CAR+/CD27-/CD28+；CAR+/CD27+/CD28-；或CAR+/CD27-/CD28-。在特定实施方案中，表型是或包括CAR+/CCR7+/CD27+/CD45RA-；CAR+/CCR7-/CD27+/CD45RA-；CAR+/CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+；CAR+/CD27+；CAR+/CD27-；CAR+/CD27+/CD28-；或CAR+/CD27-/CD28-。
在某些实施方案中，表型是或包括对凋亡标记呈阴性的T细胞的表型。在某些实施方案中，表型是或包括对凋亡标记呈阴性的幼稚细胞。在一些实施方案中，凋亡标记是激活的半胱天冬酶3。在一些实施方案中，凋亡标记是通过膜联蛋白V的阳性染色。
在特定实施方案中，表型是或包括表达CAR的对凋亡标记呈阴性的记忆T细胞或其亚型的表型。在特定实施方案中，表型是或包括表达CAR的对凋亡标记呈阴性的记忆T细胞或特定亚型的表型。在某些实施方案中，表型是或包括表达CAR的对凋亡标记呈阴性的幼稚细胞。在某些实施方案中，表型是或包括表达CAR的对凋亡标记呈阴性的中枢记忆T细胞或TSCM细胞或幼稚细胞的表型。在特定实施方案中，表型是或包括表达CAR的对凋亡标记呈阴性的效应记忆细胞的表型。在某些实施方案中，表型是或包括膜联蛋白V-/CAR+/CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA-；膜联蛋白V-/CAR+/CCR7-/CD27+/CD28+/CD45RA-；膜联蛋白V-/CAR+/CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+；膜联蛋白V-/CAR+/CD27+/CD28+；膜联蛋白V-/CAR+/CD27-/CD28+；膜联蛋白V-/CAR+/CD27+/CD28-；或膜联蛋白V-/CAR+/CD27-/CD28-。在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA-；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7-/CD27+/CD28+/CD45RA-；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27+/CD28+；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27-/CD28+；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27+/CD28-；或激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27-/CD28-。在某些实施方案中，表型是或包括膜联蛋白V-/CAR+/CCR7+/CD27+/CD45RA-；膜联蛋白V-/CAR+/CCR7-/CD27+/CD45RA-；膜联蛋白V-/CAR+/CCR7-/CD27-/CD45RA+；膜联蛋白V-/CAR+/CD27+/CD28+；膜联蛋白V-/CAR+/CD27-/CD28+；膜联蛋白V-/CAR+/CD27+；或膜联蛋白V-/CAR+/CD27-。在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶-/CAR+/CCR7+/CD27+/CD45RA-；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7-/CD27+/CD45RA-；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7-/CD27-/CD45RA+；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27+/CD28+；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27-/CD28+；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27+；或激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27-。
在特定实施方案中，表型是或包括CD27+/CD28+、CD27-/CD28+、CD27+/CD28-、CD27-/CD28、或其组合。在一些实施方案中，表型是或包括CAR+/CD27+/CD28+、CAR+/CD27-/CD28+、CAR+/CD27+/CD28-、CAR+/CD27-/CD28-、或其组合。在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27+/CD28+、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27-/CD28+、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27+/CD28-、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27-/CD28-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括膜联蛋白V-/CAR+/CD27+/CD28+、膜联蛋白V-/CAR+/CD27-/CD28+、膜联蛋白V-/CAR+/CD27+/CD28-、膜联蛋白V-/CAR+/CD27-/CD28-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括CD27+、CD27-、CD27+、CD27-、或其组合。在一些实施方案中，表型是或包括CAR+/CD27+、CAR+/CD27-、CAR+/CD27+、CAR+/CD27-、或其组合。在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27+、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27-、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27+、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括膜联蛋白V-/CAR+/CD27+、膜联蛋白V-/CAR+/CD27-、膜联蛋白V-/CAR+/CD27+、膜联蛋白V-/CAR+/CD27-、或其组合。
在特定实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD28+、CCR7-/CD28+、CCR7+/CD28-、CCR7-/CD28-、或其组合。在一些实施方案中，表型是或包括CAR+/CCR7+/CD28+、CAR+/CCR7-/CD28+、CAR+/CCR7+/CD28-、CAR+/CCR7-/CD28-、或其组合。在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7+/CD28+、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7-/CD28+、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7+/CD28-、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7-/CD28-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括膜联蛋白V-/CAR+/CCR7+/CD28+、膜联蛋白V-/CAR+/CCR7-/CD28+、膜联蛋白V-/CAR+/CCR7+/CD28-、膜联蛋白V-/CAR+/CCR7-/CD28-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括CCR7+、CCR7-、CCR7+、CCR7-、或其组合。在一些实施方案中，表型是或包括CAR+/CCR7+、CAR+/CCR7-、CAR+/CCR7+、CAR+/CCR7-、或其组合。在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7+、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7-、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7+、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括膜联蛋白V-/CAR+/CCR7+、膜联蛋白V-/CAR+/CCR7-、膜联蛋白V-/CAR+/CCR7+、膜联蛋白V-/CAR+/CCR7-、或其组合。
在一些实施方案中，表型是或包括消耗标记的阳性或阴性表达。在某些实施方案中，表型是或包括与消耗相关的特定分子的阳性或阴性表达。在某些实施方案中，特定分子是与消耗或与消耗相关的质量(例如较差效应子功能或抑制性受体表达)相关的任何分子。在特定实施方案中，表型是免疫检查点抑制剂的阳性或阴性表达。在特定实施方案中，消耗标记是CTLA-4、FOXP3、PD-1、TIGIT、LAB-3、2B4、BTLA、TIM3、VISTA、或CD96、或其组合。在某些实施方案中，表型是CTLA-4、FOXP3、PD-1、TIGIT、LAB-3、2B4、BTLA、TIM3、VISTA、或CD96、或其组合的阳性或阴性表达。在特定实施方案中，表型是PD1和/或FOXP3的阳性或阴性表达。
在一些实施方案中，表型是或包括在表达重组受体或CAR的CD3+细胞中消耗标记的阳性或阴性表达。在特定实施方案中，表型是或包括在表达重组受体或CAR的CD4+细胞中消耗标记的阳性或阴性表达。在一些实施方案中，表型是或包括消耗标记的阳性或阴性表达和CD3+以及重组受体或CAR的阳性表达。在特定实施方案中，表型是或包括在表达重组受体或CAR的CD4+细胞中消耗标记的阳性或阴性表达。在一些实施方案中，表型是或包括在表达重组受体或CAR的CD8+细胞中消耗标记的阳性或阴性表达。在特定实施方案中，消耗标记是CTLA-4、FOXP3、PD-1、TIGIT、LAB-3、2B4、BTLA、TIM3、VISTA、或CD96中的一种或多种。在特定实施方案中，消耗标记是PD1和/或FOXP3。
在特定实施方案中，表型是或包括PD1-/CD3+、PD1-/CD4+、PD1-/CD8+、PD1-/CD3+/CAR+、PD1-/CD4+/CAR+、PD1-/CD8+/CAR+、PD1-/膜联蛋白V-、PD1-/膜联蛋白V-/CD3+、PD1-/膜联蛋白V-/CD4+、PD1-/膜联蛋白V-/CD8+、PD1-/膜联蛋白V/-CD3+/CAR+、PD1-/膜联蛋白V-/CD4+/CAR+、PD1-/膜联蛋白V-/CD8+/CAR+、PD1-/激活的半胱天冬酶3-、PD1-/激活的半胱天冬酶3-/CD3+、PD1-/激活的半胱天冬酶3-/CD4+、PD1-/激活的半胱天冬酶3-/CD8+、PD1-/激活的半胱天冬酶3-/CD3+/CAR+、PD1-/激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+、PD1-/激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+、或其组合。
在某些实施方案中，表型是或包括FOXP3-/CD3+、FOXP3-CD4+、FOXP3-/CD8+、FOXP3-/CD3+/CAR+、FOXP3-/CD4+/CAR+、FOXP3-/CD8+/CAR+、FOXP3-/膜联蛋白V-、FOXP3-/膜联蛋白V-/CD3+、FOXP3-/膜联蛋白V-/CD4+、FOXP3-/膜联蛋白V-/CD8+、FOXP3-/膜联蛋白V/-CD3+/CAR+、FOXP3-/膜联蛋白V-/CD4+/CAR+、FOXP3-/膜联蛋白V-/CD8+/CAR+、FOXP3-/激活的半胱天冬酶3-、FOXP3-/激活的半胱天冬酶3-/CD3+、FOXP3-/激活的半胱天冬酶3-/CD4+、FOXP3-/激活的半胱天冬酶3-/CD8+、FOXP3-/激活的半胱天冬酶3-/CD3+/CAR+、FOXP3-/激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+、FOXP3-/激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+、或其组合。
在某些实施方案中，表型是与T细胞激活相关的特定分子的阴性表达。在一些实施方案中，表型是或包括作为激活标记的一种或多种特定分子的阴性表达。通常，T细胞激活需要两种同时发生的信号。第一种是T细胞受体复合物(TCR)与携带肽抗原的主要组织相容性复合物(MHC)分子的结合。第二种是通过共刺激受体CD28与在APC表面上的蛋白质(如B7-2或B7-1)结合提供的。在某些实施方案中，所述特定分子与TCR激活相关，例如，由于T细胞激活而被激活、改变或表达。在一些实施方案中，所述特定分子与CD28受体的激活相关，例如，由于T细胞激活而被激活、改变或表达的分子。
在特定实施方案中，表型是或包括作为激活标记的一种或多种特定分子的阴性表达。在某些实施方案中，激活标记是CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD71、CD154、CD40L、CD127、LAG3、Ki67或其组合中的一种或多种。在某些实施方案中，表型是CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD71、CD154、CD40L、CD127、LAG3、或Ki67中的一种或多种的阴性或阳性表达。在某些实施方案中，表型是或包括CD25、CD127、LAG3、Ki67或其组合的表达。
在一些实施方案中，表型是或包括在表达重组受体或CAR的CD3+细胞中激活标记的阳性或阴性表达。在特定实施方案中，表型是或包括在表达重组受体或CAR的CD4+细胞中激活标记的阳性或阴性表达。在一些实施方案中，表型是或包括在表达重组受体或CAR的CD8+细胞中激活标记的阳性或阴性表达。在特定实施方案中，激活标记是CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD71、CD154、CD40L、CD127、LAG3、或Ki67中的一种或多种。在特定实施方案中，激活标记是CD25、CD127、LAG3、Ki67、或其组合。
在特定实施方案中，表型是或包括激活标记的阳性或阴性表达以及CD3+、CD4+、CD8+、CD3+/CAR+、CD4+/CAR+、CD8+/CAR+、膜联蛋白V-、膜联蛋白V-/CD3+、膜联蛋白V-/CD4+、膜联蛋白V-/CD8+、膜联蛋白V/-CD3+/CAR+、膜联蛋白V-/CD4+/CAR+、膜联蛋白V-/CD8+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-、激活的半胱天冬酶3-/CD3+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+、激活的半胱天冬酶3-/CD3+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+、或其组合。
在一些实施方案中，通过对刺激物(例如触发、诱导、刺激或延长免疫细胞功能的刺激物)的反应来评估表型。在某些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育细胞，表型是或包括对刺激的反应。在特定实施方案中，表型是或包括响应于一种或多种刺激而产生或分泌可溶性因子。在一些实施方案中，表型是或包括响应于一种或多种刺激而缺乏或产生或分泌可溶性因子。在某些实施方案中，可溶性因子是细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，细胞因子是TNFa。
所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和经设计以激活细胞的任何其他药剂))。在一些实施方案中，刺激细胞并且通过是否产生或分泌可溶性因子(例如细胞因子或趋化因子)来确定表型。在一些实施方案中，刺激是非特异性的，即不是抗原特异性刺激。在一些实施方案中，刺激包括PMA和离子霉素。在一些实施方案中，将细胞在刺激条件或刺激剂的存在下孵育约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约18小时、约24小时、约48小时，或孵育在1小时与4小时之间、在1小时与12小时之间、在12小时与24小时之间的持续时间，或孵育超过24小时。
在一些实施方案中，将细胞用药剂刺激，所述药剂是对重组受体具有特异性的抗原或其表位，或者是结合和/或识别重组受体的抗体或其片段，或其组合。在一些实施方案中，所述重组受体是CAR，并且所述药剂是对所述CAR具有特异性的抗原或其表位，或者是结合和/或识别所述CAR的抗体或其片段，或其组合。在特定实施方案中，通过在靶细胞的存在下孵育细胞来刺激细胞，所述靶细胞具有由所述CAR识别的抗原的表面表达。在某些实施方案中，所述重组受体是CAR，并且所述药剂是结合所述CAR的抗体或其活性片段、变体或部分。在某些实施方案中，与所述CAR结合的所述抗体或其活性片段、变体或部分是抗独特型(抗ID)抗体。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够刺激或激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些方面，所述药剂开启或启动T细胞中的TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括例如结合至固体支持物(如珠)的抗体，如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的那些抗体(例如抗CD3、抗CD28)；和/或一种或多种细胞因子。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂是PMA和离子霉素。
在特定实施方案中，表型是或包括响应于一种或多种刺激而产生或分泌细胞因子。细胞因子的产生和/或分泌有助于免疫应答，并涉及不同的过程，包括抗病毒蛋白的诱导和T细胞增殖的诱导。细胞因子不是预先形成的因子，而是响应于细胞激活而快速产生和分泌。可以通过本领域已知的任何合适的技术测量、检测和/或定量细胞因子的产生或分泌。
在某些实施方案中，表型是一种或多种细胞因子的产生。在一些实施方案中，从相同细胞产生两种或更多种细胞因子可以指示此类细胞的多功能特征。在特定实施方案中，通过细胞内细胞因子染色来测量、检测和/或定量一种或多种细胞因子的产生。通过流式细胞术进行的细胞内细胞因子染色(ICS)是非常适合于在单细胞水平上研究细胞因子产生的一种技术。它检测在细胞刺激后在内质网内的细胞因子的产生和积累，从而允许鉴定对于特定细胞因子的产生呈阳性或阴性的细胞群或基于阈值将高产和低产细胞分离。在一些实施方案中，如上所述，可以使用非特异性刺激(例如不是抗原特异性刺激)来进行刺激。例如，PMA/离子霉素可用于非特异性细胞刺激。在一些实施方案中，刺激可以通过如下药剂进行，所述药剂是对重组受体(例如CAR)具有特异性的抗原或其表位，或者是结合和/或识别重组受体的抗体或其片段，或其组合。ICS还可以与其他流式细胞术方案结合用于使用细胞表面标记或用MHC多聚体进行免疫表型分析，以获得特定细胞亚群中的细胞因子产生，使ICS成为极其灵活和通用的方法。用于测量或检测细胞因子产生的其他单细胞技术包括但不限于ELISPOT、有限稀释和T细胞克隆。
在一些实施方案中，表型是如在用对重组受体具有特异性和/或由重组受体识别的抗原刺激重组受体后，细胞因子的产生。在特定实施方案中，表型是如在用对重组受体具有特异性和/或由重组受体识别的抗原刺激重组受体后，细胞因子的产生的缺乏。在特定实施方案中，表型是对于细胞因子的产生呈阳性或者是高水平的细胞因子产生。在某些实施方案中，表型是对于细胞因子的产生呈阴性或者是低水平的细胞因子产生。细胞因子可以包括但不限于白介素-1(IL-1)、IL-1β、IL-2、sIL-2Ra、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL 27、IL-33、IL-35、TNF、肿瘤坏死因子α(TNFα)、CXCL2、CCL2、CCL3、CCL5、CCL17、CCL24、PGD2、LTB4、干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α、MIP-1β、Flt-3L、分形趋化因子和/或IL-5。在一些实施方案中，表型包括细胞因子的产生，所述细胞因子例如与特定细胞类型相关的细胞因子，如与Th1、Th2、Th17和/或Treg亚型相关的细胞因子。在一些实施方案中，示例性Th1相关细胞因子包括IL-2、IFN-γ和转化生长因子β(TGF-β)，并且在一些情况下参与细胞免疫应答。在一些实施方案中，示例性Th2相关细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，并且在一些情况下与体液免疫和抗炎特性相关。在一些实施方案中，示例性Th17相关细胞因子包括IL-17A和IL-17F，并且在一些情况下例如在炎症反应期间参与募集嗜中性粒细胞和巨噬细胞。
在一些实施方案中，表型是或包括细胞因子的产生。在某些实施方案中，表型是或包括多于一种细胞因子的产生(例如多功能的)。在某些实施方案中，表型是或包括一种或多种细胞因子的产生的缺乏。在某些实施方案中，表型是或包括IL-2、IL-5、IL-13、IFN-γ或TNF-α中的一种或多种的产生或其缺乏。在某些实施方案中，表型是或包括IL-2、IL-13、IFN-γ或TNF-α中的一种或多种的产生或其缺乏。在一些实施方案中，表型是细胞因子的产生的存在、和/或细胞因子的高水平产生的存在。在一些实施方案中，表型是细胞因子的低的、减少的或不存在的产生。
在一些实施方案中，表型是或包括细胞因子的内部(细胞内)产生，例如，如在刺激剂的存在下或在刺激条件下在分泌被阻止或抑制时评估的。在一些实施方案中，刺激剂是非特异性刺激剂，例如不与例如重组受体(例如CAR)上的抗原结合结构域结合的刺激剂。在一些实施方案中，刺激剂是PMA/离子霉素，其可以充当非特异性刺激剂。在一些实施方案中，刺激剂是特异性刺激剂，例如是如下刺激剂：是对重组受体(例如CAR)具有特异性的抗原或其表位，或者是结合和/或识别重组受体的抗体或其片段，或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括细胞因子的内部产生的缺乏或不存在。在某些实施方案中，当用ICS测定评估超过一种细胞因子的产生时，表型是或包括一种或多种细胞因子的内部量。在某些实施方案中，表型是或包括IL-2、IL-5、IL-13、IFN-γ或TNF-α中的一种或多种的内部量，如通过ICS测定评估的。在一些实施方案中，表型是或包括一种或多种细胞因子的低内部量或缺乏可检测量，如用ICS测定评估的。在某些实施方案中，表型是或包括IL-2、IL-5、IL-13、IFN-γ或TNF-α的低内部量或缺乏可检测量，如用ICS测定评估的。在一些实施方案中，表型包括例如通过多重测定或评估多功能性的测定对多种细胞因子的评估(参见例如，Xue等人,(2017)Journal for ImmunoTherapy of Cancer 5:85)。在一些实施方案中，细胞因子表达的缺乏与细胞的活性和/或功能和/或反应和无进展存活期的持久性相反地相关联或相关。在一些实施方案中，在细胞组合物(例如，输出组合物、治疗性细胞组合物)中减少根据任何已知方法或本文所述的方法所评估具有减少的、极少的或没有细胞因子产生的细胞。
特定实施方案考虑，表型可以包括细胞因子的产生、或细胞因子产生的缺乏或低量。这可能取决于若干种因素，所述因素包括但不限于细胞因子的身份、为了检测细胞因子而进行的测定、以及与所述测定一起使用的刺激剂或刺激条件。例如，在一些实施方案中，考虑表型是或包括如通过ICS指示的IL-13产生的缺乏或低水平，而在一些实施方案中，表型是或包括如通过ICS指示的IFN-γ的产生。
在一些实施方案中，表型是或包括一种或多种细胞因子的产生以及CD3+、CD4+、CD8+、CD3+/CAR+、CD4+/CAR+、CD8+/CAR+、膜联蛋白V-、膜联蛋白V-CD3+、膜联蛋白V-CD4+、膜联蛋白V-CD8+、膜联蛋白V-CD3+/CAR+、膜联蛋白V-CD4+/CAR+、膜联蛋白V-CD8+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-、激活的半胱天冬酶3-/CD3+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+、激活的半胱天冬酶3-/CD3+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+、或激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括在CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+中一种或多种细胞因子的产生。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是IL-2、IFN-γ和/TNF-α。在一些实施方案中，表型是或包括在CD4+/CAR+细胞中IL-2的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在CD4+/CAR+细胞中TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在CD4+/CAR+细胞中IL-2和TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在CD4+/CAR+细胞中IL-2和IFN-γ的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在CD8+/CAR+细胞中TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在CD8+/CAR+细胞中IFN-γ和TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+细胞中IL-2的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+细胞中TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+细胞中IL-2和TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+细胞中IL-2和IFN-γ的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+细胞中TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+细胞中IFN-γ和TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在膜联蛋白V-/CD4+/CAR+细胞中TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在膜联蛋白V-/CD4+/CAR+细胞中IL-2和TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在膜联蛋白V-/CD4+/CAR+细胞中IL-2和IFN-γ的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在膜联蛋白V-/CD8+/CAR+细胞中TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在膜联蛋白V-/CD8+/CAR+细胞中IFN-γ和TNF-α的产生。在一些实施方案中，此段落中描述的表型与持久的反应和无进展存活期正相关。因此，在一些实施方案中，在细胞组合物(例如，输出组合物、治疗性细胞组合物)中最大化或增加包括这些表型的细胞。在一些实施方案中，所述细胞组合物包括所述组合物中能够产生选自白介素2(IL-2)和/或TNF-α的细胞因子的CD4+ T细胞(如表达重组受体(例如CAR)的工程化CD4 T细胞)的总数量的至少或至少约、或为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，所述细胞组合物包括所述组合物中因产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的CD4+ T细胞(如表达重组受体(例如CAR)的工程化CD4 T细胞)的总数量的至少或至少约、或为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％或更多。
在一些实施方案中，表型是或包括一种或多种细胞因子的产生的缺乏。在某些实施方案中，表型是或包括一种或多种细胞因子的产生的缺乏和CD3+、CD4+、CD8+、CD3+/CAR+、CD4+/CAR+、CD8+/CAR+、膜联蛋白V-、膜联蛋白V-CD3+、膜联蛋白V-CD4+、膜联蛋白V-CD8+、膜联蛋白V-CD3+/CAR+、膜联蛋白V-CD4+/CAR+、膜联蛋白V-CD8+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-、激活的半胱天冬酶3-/CD3+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+、激活的半胱天冬酶3-/CD3+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+、或激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+、或其组合。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是IL-2、IFN-γ和/TNF-α。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+细胞中IL-2的产生的缺乏。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+细胞中TNF-α的产生的缺乏。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+细胞中IL-2和TNF-α的产生的缺乏。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+细胞中IL-2和IFN-γ的产生的缺乏。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+细胞中TNF-α的产生的缺乏。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+细胞中INF-γ和TNF-α的产生的缺乏。在一些实施方案中，此段落中描述的表型与持久的反应和无进展存活期负相关。因此，在一些实施方案中，在细胞组合物(例如，输出组合物、治疗性细胞组合物)中最小化或减少包括这些表型的细胞。例如，在一些实施方案中，包括此段落的表型的细胞构成细胞组合物(例如，输出组合物、治疗性细胞组合物)中总细胞的小于2％、5％、10％、15％、20％、或25％。
在特定实施方案中，表型是或包括IL-2、IL-13、IFN-γ或TNF-α中的一种或多种的内部量的存在或不存在(如用ICS测定评估的)，和特定细胞类型的细胞子集或细胞的一种或多种特定标记。在一些实施方案中，表型是或包括IL-2、IL-13、IFN-γ或TNF-α中的一种或多种的产生或其缺乏以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。在某些实施方案中，表型是或包括IL-2的产生以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。在一些实施方案中，表型是或包括IL-2的缺乏或低产生以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。在一些实施方案中，表型是或包括IL-13的产生以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。在一些实施方案中，表型是或包括IL-13的产生以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。在某些实施方案中，表型是或包括IL-13的缺乏或低产生以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。在一些实施方案中，表型是或包括IFN-γ的产生以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。在某些实施方案中，表型是或包括TNF-α的产生以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。在某些实施方案中，表型是或包括TNF-α的缺乏或低产生以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。
可以根据所提供的方法评估或确定单独的或组合的任何一种或多种所述表型。在一些实施方案中，表型是CD3+、CD3+/CAR+、CD4+/CAR+、CD8+/CAR+、或其组合。
在某些实施方案中，表型是或包括CD3+。在某些实施方案中，表型是或包括CD3+/CAR+。在一些实施方案中，表型是或包括CD8+/CAR+。在某些实施方案中，表型是或包括CD4+/CAR+。
在特定实施方案中，表型是或包括膜联蛋白-/CD3+/CAR+。在一些实施方案中，表型是或包括膜联蛋白-/CD4+/CAR+。在特定实施方案中，表型是膜联蛋白-/CD8+/CAR。
在特定实施方案中，表型是或包括细胞内IL-2的缺乏或低量和CD4+/CAR+。在特定实施方案中，表型是细胞内IL-13的缺乏或低量和CD4+/CAR+。在一些实施方案中，表型是IL-13的细胞内表达的缺乏或低量和CD8+/CAR+细胞。在特定实施方案中，表型是细胞内TNF-α的缺乏或低量和CD4+/CAR+。
在某些实施方案中，表型是或包括CD8+/CAR+。在某些实施方案中，表型是或包括膜联蛋白-/CD8+/CAR+。
在一些实施方案中，表型包含产生细胞因子的一种或组合的指示物，其任选地对抗原或重组受体是非特异性的和/或是多克隆产生的，其中所述一种或多种细胞因子是IL-2、IL-13、IL-17、IFN-γ或TNF-α。在一些实施方案中，在测定(任选地细胞内细胞因子染色测定)中测量产生的指示物，所述测定包括将T细胞组合物的样品与多克隆药剂、抗原特异性药剂或结合重组受体(任选地CAR)的药剂一起孵育。在一些实施方案中，所述药剂是或包含PMA和离子霉素，或者是或包含T细胞受体或T细胞受体复合物激动剂。在一些实施方案中，表型包括激活标记的阴性表达，其中所述激活标记选自CD25、CD127、LAG3、Ki67及其组合。在一些实施方案中，表型包括消耗标记的阴性表达，其中所述消耗标记是PD1或FOXP3基因产物或其组合。在一些实施方案中，表型包括幼稚表型或记忆表型，任选地其中所述记忆表型包括T效应记忆表型、T中枢记忆表型或表达CD45RA的T效应记忆表型(Temra)。
在一些实施方案中，重组受体依赖性(例如CAR)活性是促炎性细胞因子(任选地，TNF-α、IFN-γ、和IL-2中的一种或组合)的产生或积累的量度。在一些实施方案中，参考量度是在包含重组受体(例如CAR)的多种(任选地至少10种、至少15种、至少20种)参考治疗性T细胞组合物中的量度的平均值，其中：(i)已经观察到或确定了每种参考治疗性T细胞组合物在向受试者给予后产生可接受的安全性特征，任选地其中所述受试者患有表达所述抗原或与所述抗原相关的疾病或病症；和/或(ii)已经观察到或确定了每种参考治疗性T细胞组合物在向受试者给予后产生所需的功效，任选地其中所述受试者患有表达所述抗原或与所述抗原相关的疾病或病症。
在某些实施方案中，确定、测量、获得、检测、观察和/或鉴定细胞组合物的特定表型的数量、倍数或分数。在一些实施方案中，细胞组合物是T细胞组合物。在某些实施方案中，细胞组合物含有表达重组受体(例如CAR)的细胞。在特定实施方案中，细胞组合物是含有表达重组受体的细胞的治疗性T组合物，所述治疗性T组合物可以给予至受试者以治疗疾病或病症。在某些实施方案中，表型的细胞的数量是细胞组合物的所述表型的细胞的总量。在某些实施方案中，表型的细胞数量是在细胞组合物的剂量中存在的所述表型的细胞的总数量。在特定实施方案中，表型的细胞的数量是在细胞组合物的样品中存在的所述表型的细胞的数量。在一些实施方案中，表型的细胞的数量可以表示为在细胞组合物、或其剂量或样品中存在的所述表型的细胞的频率、比率和/或百分比。
在特定实施方案中，变换表型的细胞的数量、倍数或分数，例如以压缩所述数量、倍数或分数的相关值的范围。在一些实施方案中，所述变换是对数据集中的每个点的确定性数学函数的任何应用，例如，用变换的值y＝f(x)替换每个数据点x，其中f是函数。通常，可以应用变换使得数据显得更接近地符合要应用的统计推断程序的假设，或者改善图的可解释性或外观。在大多数情况下，用于变换数据的函数是可逆的，并且通常是连续的。通常将所述变换应用于可比测量值的集合。合适的变换的例子包括但不限于对数和平方根变换、倒数变换和次方变换。在某些实施方案中，通过对数变换来变换表型的细胞的数量、倍数或分数。在某些实施方案中，对数变换是常用对数(log10(x))、自然对数(ln(x))或二进制对数(log2(x))。
B.确定给药和给予
在一些实施方案中，治疗性组合物或其剂量以有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)含有细胞。在一些实施方案中，组合物以有效减少疾病或病症负荷的量包括细胞。在一些实施方案中，组合物以在给予所述组合物的一组受试者之间提供更一致的结果(例如反应和/或安全性结果)和/或更一致的药代动力学参数的量包括细胞。在一些实施方案中，组合物以有效促进持久的反应和/或无进展存活期的量的包括细胞。在一些方面，所提供的方法涉及针对细胞表型评估含有T细胞的治疗性组合物，并且基于此类结果确定剂量。
在一些实施方案中，确定剂量以在一种或多种特定组合物中包含相对一致的数量、比例、比率和/或百分比的具有特定表型的工程化细胞。在一些方面，所述一致性与相对一致的活性、功能、药代动力学参数、毒性结果和/或反应结果相关或有关。在一些方面，在多名受试者、多种组合物和/或多个剂量中，所述数量、比例、比率和/或百分比是相对一致的，例如，在组合物或单位剂量中具有特定表型(例如表达CCR7(CCR7+)或产生细胞因子(例如产生IL-2、TNF-α或IFN-γ))的细胞的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。在一些方面，在组合物或单位剂量中具有特定表型(例如表达CCR7(CCR7+))的细胞的数量或比率与在通过所述过程产生的多种T细胞组合物中所述数量或比率的平均值相比变化不超过20％或不超过10％或不超过5％，和/或与这个平均值相比变化不超过一个标准差，或者在所确定的多种T细胞组合物或剂量中变化不超过20％或不超过10％或不超过5％。在一些实施方案中，多名受试者包括至少10名受试者，如至少15名、至少20名、至少25名、至少30名、至少40名、至少50名、至少60名、至少70名、至少80名、至少90名、至少100名或更多名受试者。
在一些方面，所述剂量，例如一个或多个单位剂量是基于工程化T细胞的特定子集，例如具有特定表型(如特定表面标记表型)的细胞的数量、百分比、比率、频率和/或比例来确定。在一些方面，细胞表型是基于特定细胞标记(例如表面标记)的表达和/或表达的不存在来确定。在一些方面，细胞标记包括指示细胞的活力和/或凋亡状态的标记。在一些方面，示例性标记包括CD3、CD4、CD8、CCR7、CD27、CD45RA、膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。在一些方面，示例性标记是CCR7。在一些方面，示例性标记是CD27。在一些方面，示例性标记包括CCR7和/或CD27。在一些方面，示例性标记包括CCR7、CD27和/或CD45RA。
在一些实施方案中，提供了涉及向受试者给予一个或多个单位剂量的治疗性T细胞组合物(如本文所述的任一种和/或通过本文提供的方法确定的任何单位剂量)的方法。
在一些实施方案中，提供了如下方法，所述方法涉及向患有疾病或病症的受试者给予单位剂量的T细胞组合物，所述T细胞组合物包含含有特异性地结合至与所述疾病或病症相关的抗原的重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))的细胞，其中给予限定数量的治疗性组合物的总重组受体表达细胞(受体+)、总CD8+重组受体表达细胞(受体+/CD8+)，和/或给予此类细胞的单位剂量，其中所述单位剂量含有限定数量、百分比、比率、频率和/或比例的具有某一表型的细胞，所述表型例如CCR7+/CD4+、CCR7+/CD8+、CD27+/CD4+、CD27+/CD8+、CD45RA+/CD4+、CD45RA+/CD8+、CCR7–/CD4+、CCR7–/CD8+、CD27–/CD4+、CD27–/CD8+、CD45RA–/CD4+、CD45RA–/CD8+、CCR7+/CD27+/CD4+、CCR7+/CD27+/CD8+、CCR7+/CD45RA–/CD4+、CCR7+/CD45RA–/CD8+、CCR7–/CD45RA–/CD4+、CCR7–/CD45RA–/CD8+、CCR7–/CD27–/CD4+、CCR7–/CD27–/CD8+。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+细胞。在一些实施方案中，所述限定数量或比率是进一步基于CD27和/或CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CD27+细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CD27+细胞。在一些实施方案中，所述限定数量或比率是进一步基于CCR7和/或CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+/CD27+细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+/CD27+细胞。在一些实施方案中，所述限定数量或比率是进一步基于CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。
在一些实施方案中，单位剂量中的细胞数量是期望以一定剂量给予至特定受试者(如已经衍生出细胞的受试者)的细胞的数量或重组受体表达细胞或CAR表达细胞的数量、或某一表型的此类细胞(例如表达或不表达选自CD3 CD4、CD8、CCR7、CD27、CD45RA、膜联蛋白V、或激活的半胱天冬酶3的一种或多种标记的细胞)的数量、百分比、比率、频率和/或比例。在一些实施方案中，单位剂量中的细胞数量是细胞的数量或重组受体表达细胞或CAR表达细胞的数量、或某一表型的此类细胞(例如CCR7+、CD27+、CD45RA+、CD45RA–、CD4+、CD8+、CD3+、凋亡标记阴性(例如膜联蛋白V–或半胱天冬酶3–)细胞，或对任何前述项中的一种或多种呈阳性或阴性的细胞)的数量、百分比、比率、频率和/或比例。
在一些实施方案中，单位剂量中的细胞数量是期望以一定剂量给予至特定受试者(如已经衍生出细胞的受试者)的细胞的数量或重组受体表达细胞或CAR表达细胞的数量、或某一表型的此类细胞(例如CCR7+/CD4+、CCR7+/CD8+、CD27+/CD4+、CD27+/CD8+、CD45RA+/CD4+、CD45RA+/CD8+、CCR7–/CD4+、CCR7–/CD8+、CD27–/CD4+、CD27–/CD8+、CD45RA–/CD4+、CD45RA–/CD8+、CCR7+/CD27+/CD4+、CCR7+/CD27+/CD8+、CCR7+/CD45RA–/CD4+、CCR7+/CD45RA–/CD8+、CCR7–/CD45RA–/CD4+、CCR7–/CD45RA–/CD8+、CCR7–/CD27–/CD4+、CCR7–/CD27–/CD8+；和凋亡标记阴性(例如膜联蛋白V–或半胱天冬酶3–)细胞)的数量、百分比、比率和/或比例。在一些实施方案中，单位剂量含有限定数量的细胞或限定数量的重组受体表达细胞或CAR表达细胞、或限定数量、百分比、比率和/或比例的某一表型的此类细胞(例如CCR7+/CD4+、CCR7+/CD8+、CD27+/CD4+、CD27+/CD8+、CD45RA+/CD4+、CD45RA+/CD8+、CCR7–/CD4+、CCR7–/CD8+、CD27–/CD4+、CD27–/CD8+、CD45RA–/CD4+、CD45RA–/CD8+、CCR7+/CD27+/CD4+、CCR7+/CD27+/CD8+、CCR7+/CD45RA–/CD4+、CCR7+/CD45RA–/CD8+、CCR7–/CD45RA–/CD4+、CCR7–/CD45RA–/CD8+、CCR7–/CD27–/CD4+、CCR7–/CD27–/CD8+；和凋亡标记阴性(例如膜联蛋白V–或半胱天冬酶3–)细胞、和/或其任何子集)。
在一些实施方案中，单位剂量是基于以下来确定：细胞组合物中的细胞或一种或多种细胞类型的数量和/或细胞或细胞类型的频率、比率和/或百分比，所述细胞或细胞类型例如单独群体、表型或亚型，如具有以下表型的那些：膜联蛋白V–/CCR7+/CAR+；膜联蛋白V–/CCR7+/CAR+/CD4+；膜联蛋白V–/CCR7+/CAR+/CD8+；膜联蛋白V–/CD27+/CAR+；膜联蛋白V–/CD27+/CAR+/CD4+；膜联蛋白V–/CD27+/CAR+/CD8+；膜联蛋白V–/CCR7+/CD27+/CAR+；膜联蛋白V–/CCR7+/CD27+/CAR+/CD4+；膜联蛋白V–/CCR7+/CD27+/CAR+/CD8+；膜联蛋白V–/CCR7+/CD45RA–/CAR+；膜联蛋白V–/CCR7+/CD45RA–/CAR+/CD4+；膜联蛋白V–/CCR7+/CD45RA–/CAR+/CD8+；膜联蛋白V–/CCR7–/CD45RA–/CAR+；膜联蛋白V–/CCR7–/CD45RA–/CAR+/CD4+；膜联蛋白V–/CCR7–/CD45RA–/CAR+/CD8+；膜联蛋白V–/CCR7–/CD27–/CAR+、膜联蛋白V–/CCR7–/CD27–/CAR+/CD4+；膜联蛋白V–/CCR7–/CD27–/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CAR+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CAR+/CD4+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3–/CD27+/CAR+；激活的半胱天冬酶3–/CD27+/CAR+/CD4+；激活的半胱天冬酶3–/CD27+/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CD27+/CAR+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CD27+/CAR+/CD4+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CD27+/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CD45RA–/CAR+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CD45RA–/CAR+/CD4+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CD45RA–/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7–/CD45RA–/CAR+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7–/CD45RA–/CAR+/CD4+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7–/CD45RA–/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7–/CD27–/CAR+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7–/CD27–/CAR+/CD4+；和/或激活的半胱天冬酶3–/CCR7–/CD27–/CAR+/CD8+；或其组合。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在5x 105或约5x 105与5x 107或约5x 107之间、在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞或受体+/CD4+/CCR7+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少或至少约5x 107、1x 107、5x 106、1x 106、或至少约5x105个总受体+/CD8+/CCR7+细胞或受体+/CD4+/CCR7+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在5x 105或约5x 105与5x 107或约5x 107之间、在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CD27+细胞或受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少或至少约5x 107、1x 107、5x 106、1x 106、或至少约5x105个总受体+/CD8+/CD27+细胞或受体+/CD4+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少或至少约1x 106、2x 106、3x 106、4x106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或至少或至少约1x 106、2x 106、3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含在3x106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞；和/或在3x106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CCR7+细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少或至少约1x 106、2x 106、3x 106、4x106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或至少或至少约1x 106、2x 106、3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含在3x106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CD27+细胞；和/或在3x106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在5x 105或约5x 105与5x 107或约5x 107之间、在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少或至少或至少约5x 107、1x 107、5x 106、1x 106、或至少或至少约5x 105个总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少或至少约1x 106、2x 106、3x 106、4x106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或至少或至少约1x 106、2x 106、3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过或不超过约1x 108、不超过或不超过约5x 107、不超过或不超过约1x 107、不超过或不超过约5x 106、不超过或不超过约1x 106、或不超过或不超过约5x 105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在1x 105或约1x 105与5x 108或约5x 108之间、在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD3+细胞(受体+/CD3+细胞)或总CD3+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过或不超过约5x 108、不超过或不超过约1x 108、不超过或不超过约5x 107、不超过或不超过约1x 107、不超过或不超过约5x 106、不超过或不超过约1x 106、或不超过或不超过约5x 105个总受体+/CD3+细胞或总CD3+细胞。
在一些实施方案中，CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是活的或有活力的此类细胞的总数量。在一些实施方案中，CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是不表达凋亡标记的此类细胞的总数量和/或是凋亡标记阴性(–)的此类细胞的总数量，其中所述凋亡标记为膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。
在一些实施方案中，在本文提供的包含表达重组受体的T细胞的任何组合物中，所述组合物中T细胞的总数量的(或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的)至少或至少约、或为或约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。
在一些实施方案中，在本文提供的包含表达重组受体的T细胞的任何组合物中，所述组合物中T细胞的总数量的(或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的)至少或至少约、或为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％能够产生选自白介素2(IL-2)和/或TNF-α的细胞因子。在一些实施方案中，能够产生IL-2和/或TNF-α的T细胞是CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，在本文提供的包含表达重组受体的T细胞的任何组合物中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少或至少约、或为或约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的15％或约15％至90％或约90％、20％或约20％至80％或约80％、30％或约30％至70％或约70％、或40％或约40％至60％或约60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+。在一些实施方案中，在本文提供的包含表达重组受体的T细胞的任何组合物中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少或至少约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的15％或约15％至90％或约90％、20％或约20％至80％或约80％、30％或约30％至70％或约70％、或40％或约40％至60％或约60％(每个都包含端值)是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+。在一些实施方案中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少或至少约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的15％或约15％至90％或约90％、20％或约20％至80％或约80％、30％或约30％至70％或约70％、或40％或约40％至60％或约60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–。
在一些实施方案中，在本文提供的包含表达重组受体的T细胞的任何组合物中，所述组合物或所述单位剂量中所述总受体+/CD8+细胞的至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％，或所述组合物或所述单位剂量中所述总受体+/CD8+细胞的50％或约50％至90％或约90％、60％或约60％至90％或约90％、70％或约70％至80％或约80％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+或受体+/CD8+/CCR7+/CD27+。在一些实施方案中，在本文提供的包含表达重组受体的T细胞的任何组合物中，所述组合物或所述单位剂量中所述总受体+/CD4+细胞的至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％，或所述组合物或所述单位剂量中所述总受体+/CD4+细胞的50％或约50％至90％或约90％、60％或约60％至90％或约90％、70％或约70％至80％或约80％(每个都包含端值)是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+、或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–。在一些实施方案中，所述组合物中所述总受体+/CD8+细胞的至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+；或者所述组合物中所述总受体+/CD4+细胞的至少或至少约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％是受体+/CD4+/CCR7+/CD27+。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过或不超过约1x 108、不超过或不超过约5x 107、不超过或不超过约1x107、不超过或不超过约5x 106、不超过或不超过约1x 106、或不超过或不超过约5x 105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过或不超过约1x 108、不超过或不超过约5x 107、不超过或不超过约1x 107、不超过或不超过约5x 106、不超过或不超过约1x 106、或不超过或不超过约5x 105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及给予含有限定数量的细胞的剂量。在一些实施方案中，所述剂量，如细胞的所述限定数量，如为CCR7+/CD4+、CCR7+/CD8+、CD27+/CD4+、CD27+/CD8+、CD45RA+/CD4+、CD45RA+/CD8+、CCR7–/CD4+、CCR7–/CD8+、CD27–/CD4+、CD27–/CD8+、CD45RA–/CD4+、CD45RA–/CD8+、CCR7+/CD27+/CD4+、CCR7+/CD27+/CD8+、CCR7+/CD45RA–/CD4+、CCR7+/CD45RA–/CD8+、CCR7–/CD45RA–/CD4+、CCR7–/CD45RA–/CD8+、CCR7–/CD27–/CD4+、或CCR7–/CD27–/CD8+的CAR+细胞的限定数量在或在约5.0x 106与2.25x 107之间、5.0x 106与2.0x 107之间、5.0x 106与1.5x 107之间、5.0x 106与1.0x 107之间、5.0x 106与7.5x 106之间、7.5x 106与2.25x 107之间、7.5x 106与2.0x 107之间、7.5x 106与1.5x 107之间、7.5x106与1.0x 107之间、1.0x 107与2.25x 107之间、1.0x 107与2.0x 107之间、1.0x 107与1.5x107之间、1.5x 107与2.25x 107之间、1.5x 107与2.0x 107之间、2.0x 107与2.25x 107之间。在一些实施方案中，这种剂量(如细胞的这种限定数量)是指在所给予的组合物中的总重组受体表达细胞。在一些方面，所给予的限定数量的重组受体表达细胞是呈凋亡标记阴性(-)的细胞，并且任选地其中所述凋亡标记是膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。
在一些实施方案中，所述单位剂量的细胞的剂量含有一定数量的细胞，如限定数量的细胞，在至少或至少约5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、10x 106与约15x 106之间的重组受体表达细胞，如为CCR7+/CD4+、CCR7+/CD8+、CD27+/CD4+、CD27+/CD8+、CD45RA+/CD4+、CD45RA+/CD8+、CCR7–/CD4+、CCR7–/CD8+、CD27–/CD4+、CD27–/CD8+、CD45RA–/CD4+、CD45RA–/CD8+、CCR7+/CD27+/CD4+、CCR7+/CD27+/CD8+、CCR7+/CD45RA–/CD4+、CCR7+/CD45RA–/CD8+、CCR7–/CD45RA–/CD4+、CCR7–/CD45RA–/CD8+、CCR7–/CD27–/CD4+、或CCR7–/CD27–/CD8+，和/或呈凋亡标记阴性(-)且CD8+的重组受体表达细胞，任选地其中所述凋亡标记是膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。
在一些实施方案中，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物将一定剂量的细胞给予受试者。在一些实施方案中，所述剂量的大小或时间安排是根据所述受试者的特定疾病或病症来确定。在一些情况下，鉴于所提供的描述，针对特定疾病的所述剂量的大小或时间安排可以凭经验来确定。
在一些实施方案中，细胞的所述剂量包含在2x 105或约2x 105个细胞/kg与2x 106或约2x 106个细胞/kg之间，如在4x 105或约4x 105个细胞/kg与1x 106或约1x 106个细胞/kg之间或在6x 105或约6x 105个细胞/kg与8x 105或约8x 105个细胞/kg之间。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包含不超过2x 105个细胞(例如，抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如不超过或不超过约3x 105个细胞/kg、不超过或不超过约4x105个细胞/kg、不超过或不超过约5x 105个细胞/kg、不超过或不超过约6x 105个细胞/kg、不超过或不超过约7x 105个细胞/kg、不超过或不超过约8x 105个细胞/kg、不超过或不超过约9x 105个细胞/kg、不超过或不超过约1x 106个细胞/kg、或不超过或不超过约2x 106个细胞/kg。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包含至少或至少约或为或约2x 105个细胞(例如，抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如至少或至少约或为或约3x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或约4x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或约5x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或约6x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或约7x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或约8x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或约9x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或约1x 106个细胞/kg、或至少或至少约或为或约2x 106个细胞/kg。
在某些实施方案中，向受试者给予为或约10万至为或约1000亿个细胞和/或每公斤受试者体重的该细胞量的范围的细胞或细胞亚型的单独群体，例如像为或约10万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约5亿个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)、为或约100万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约5亿个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，如为或约1000万至为或约1000亿个细胞(例如，为或约2000万个细胞、为或约3000万个细胞、为或约4000万个细胞、为或约6000万个细胞、为或约7000万个细胞、为或约8000万个细胞、为或约9000万个细胞、为或约100亿个细胞、为或约250亿个细胞、为或约500亿个细胞、为或约750亿个细胞、为或约900亿个细胞或由前述任何两个值限定的范围)，并且在一些情况下，为或约1亿个细胞至为或约500亿个细胞(例如，为或约1.2亿个细胞、为或约2.5亿个细胞、为或约3.5亿个细胞、为或约4.5亿个细胞、为或约6.5亿个细胞、为或约8亿个细胞、为或约9亿个细胞、为或约30亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤受试者体重的这些范围之间的任何值。剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。在一些实施方案中，细胞的所述剂量是细胞的平坦剂量或细胞的固定剂量，使得细胞的所述剂量与受试者的体表面积或体重无关或不基于受试者的体表面积或体重。
在一些实施方案中，例如，在所述受试者是人的情况下，所述剂量包括少于约5x108个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如在为或约1x106至为或约5x 108个此类细胞的范围内，如为或约2x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1x 108、1.5x 108、或5x 108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，例如，在所述受试者是人的情况下，所述剂量包括多于或多于约1x 106个总重组受体(例如CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)并且少于或少于约2x 109个总重组受体(例如CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如在为或约2.5x 107至为或约1.2x109个此类细胞的范围内，如为或约2.5x 107、5x 107、1x 108、1.5x 108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的所述剂量包含为或约1x 105至为或约5x108个总CAR表达(CAR表达)T细胞、为或约1x 105至为或约2.5x 108个总CAR表达T细胞、为或约1x 105至为或约1x 108个总CAR表达T细胞、为或约1x 105至为或约5x 107个总CAR表达T细胞、为或约1x 105至为或约2.5x 107个总CAR表达T细胞、为或约1x 105至为或约1x 107个总CAR表达T细胞、为或约1x 105至为或约5x 106个总CAR表达T细胞、为或约1x 105至为或约2.5x 106个总CAR表达T细胞、为或约1x 105至为或约1x 106个总CAR表达T细胞、为或约1x106至为或约5x 108个总CAR表达T细胞、为或约1x 106至为或约2.5x 108个总CAR表达T细胞、为或约1x 106至为或约1x 108个总CAR表达T细胞、为或约1x 106至为或约5x 107个总CAR表达T细胞、为或约1x 106至为或约2.5x 107个总CAR表达T细胞、为或约1x 106至为或约1x 107个总CAR表达T细胞、为或约1x 106至为或约5x 106个总CAR表达T细胞、为或约1x 106至为或约2.5x 106个总CAR表达T细胞、为或约2.5x 106至为或约5x 108个总CAR表达T细胞、为或约2.5x 106至为或约2.5x 108个总CAR表达T细胞、为或约2.5x 106至为或约1x 108个总CAR表达T细胞、为或约2.5x 106至为或约5x 107个总CAR表达T细胞、为或约2.5x 106至为或约2.5x 107个总CAR表达T细胞、为或约2.5x 106至为或约1x 107个总CAR表达T细胞、为或约2.5x 106至为或约5x 106个总CAR表达T细胞、为或约5x 106至为或约5x 108个总CAR表达T细胞、为或约5x 106至为或约2.5x 108个总CAR表达T细胞、为或约5x 106至为或约1x 108个总CAR表达T细胞、为或约5x 106至为或约5x 107个总CAR表达T细胞、为或约5x 106至为或约2.5x 107个总CAR表达T细胞、为或约5x 106至为或约1x 107个总CAR表达T细胞、为或约1x107至为或约5x 108个总CAR表达T细胞、为或约1x 107至为或约2.5x 108个总CAR表达T细胞、为或约1x 107至为或约1x 108个总CAR表达T细胞、为或约1x 107至为或约5x 107个总CAR表达T细胞、为或约1x 107至为或约2.5x 107个总CAR表达T细胞、为或约2.5x 107至为或约5x 108个总CAR表达T细胞、为或约2.5x 107至为或约2.5x 108个总CAR表达T细胞、为或约2.5x 107至为或约1x 108个总CAR表达T细胞、为或约2.5x 107至为或约5x 107个总CAR表达T细胞、为或约5x 107至为或约5x 108个总CAR表达T细胞、为或约5x 107至为或约2.5x 108个总CAR表达T细胞、为或约5x 107至为或约1x 108个总CAR表达T细胞、为或约1x 108至为或约5x 108个总CAR表达T细胞、为或约1x 108至为或约2.5x 108个总CAR表达T细胞、为或约或2.5x 108至为或约5x 108个总CAR表达T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的所述剂量包含从或从约2.5x 107至为或约1.5x 108个总CAR表达T细胞，如从或从约5x 107至或至约1x 108个总CAR表达T细胞。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的所述剂量包含至少或至少约1x 105个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x 105个CAR表达细胞、至少或至少约5x 105个CAR表达细胞、至少或至少约1x 106个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x 106个CAR表达细胞、至少或至少约5x106个CAR表达细胞、至少或至少约1x 107个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x 107个CAR表达细胞、至少或至少约5x 107个CAR表达细胞、至少或至少约1x 108个CAR表达细胞、至少或至少约1.5x 108个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x 108个CAR表达细胞、或至少或至少5x 108个CAR表达细胞。
在一些实施方案中，细胞疗法包括给予一定剂量，所述剂量包含如下数量的细胞：从或从约1x 105至或至约5x 108个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，从或从约5x 105至或至约1x 107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)或者从或从约1x 106至或至约1x 107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括给予一定剂量的细胞，所述剂量包含如下数量的细胞：至少或至少约1x 105个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，如至少或至少1x 106、至少或至少约1x 107、至少或至少约1x108个此类细胞。在一些实施方案中，所述数量是关于CD3+或CD8+的总数量，在一些情况下也是关于重组受体表达(例如CAR+)细胞。在一些实施方案中，细胞疗法包含给予一定剂量，所述剂量包含以下数量的细胞：从或从约1x 105至或至约5x 108个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、从或从约5x 105至或至约1x 107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、或从或从约1x 106至或至约1x 107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括给予一定剂量，所述剂量包含以下数量的细胞：从或从约1x 105至或至约5x 108个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、从或从约5x 105至或至约1x 107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、或从或从约1x106至或至约1x 107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，所述剂量的T细胞包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或CD4+和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，例如，在所述受试者是人的情况下，所述剂量(包括在包括CD4+和CD8+ T细胞的剂量中)的CD8+ T细胞包括在1x 106或约1x 106与5x 108或约5x 108个之间的总重组受体(例如，CAR)表达CD8+细胞，例如在为或约5x 106至为或约1x 108个此类细胞的范围内，如1x 107、2.5x 107、5x 107、7.5x 107、1x 108、1.5x 108、或5x 108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，给予患者多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包括给予从或从约1x107至或至约0.75x 108个总重组受体表达CD8+ T细胞、从或从约1x 107至或至约5x 107个总重组受体表达CD8+ T细胞、从或从约1x 107至或至约0.25x 108个总重组受体表达CD8+ T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包括给予为或约1x 107、2.5x107、5x 107、7.5x 107、1x 108、1.5x 108、2.5x 108、或5x 108个总重组受体表达CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，细胞(例如，重组受体表达T细胞)的剂量作为单剂量给予受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长的时间段内仅给予一次。
在过继细胞疗法的情况下，给予给定“剂量”涵盖给予作为单一组合物和/或单次不间断给予(例如，作为单次注射或连续输注)的给定量或数量的细胞，并且还涵盖在指定时间段中(如在不超过3天中)给予在多种单独组合物或输注中提供的作为分割剂量或作为多种组合物的给定量或数量的细胞。因此，在一些情况下，所述剂量是在单一时间点给予或起始的指定数量的细胞的单次或连续给予。然而，在一些情况下，所述剂量是在不超过三天的时间段中以多次注射或输注来给予，如每天一次持续三天或持续两天，或者在单日时间段中多次输注。
因此，在一些方面，所述剂量的细胞以单一药物组合物给予。在一些实施方案中，所述剂量的细胞以共同含有所述剂量的细胞的多个组合物给予。
在一些实施方案中，术语“分割剂量”是指被分割使得在多于一天中给予的剂量。这种类型的给药包括在本发明方法中并且被认为是单剂量。
因此，细胞的所述剂量可以作为分割剂量，例如随时间给予的分割剂量来给予。例如，在一些实施方案中，所述剂量可以在2天中或在3天中给予所述受试者。用于分割给药的示例性方法包括在第一天给予25％的剂量并在第二天给予剩余的75％的剂量。在其他实施方案中，可以在第一天给予33％的剂量，并且在第二天给予剩余的67％。在一些方面，在第一天给予10％的剂量，在第二天给予30％的剂量，并且在第三天给予60％的剂量。在一些实施方案中，所述分割剂量的分布不超过3天。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞可以通过给予多个组合物或溶液(如第一和第二，任选地更多)来给予，每个组合物或溶液含有所述剂量的一些细胞。在一些方面，任选地在某一时间段内，分开地或独立地给予各自含有不同细胞群和/或细胞亚型的多个组合物。例如，细胞的群体或亚型可以分别包括CD8+和CD4+T细胞，和/或分别富含CD8+和富含CD4+的群体，例如，各自单独地包括基因工程化以表达重组受体的细胞的CD4+和/或CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述剂量的给予包括给予第一组合物，所述第一组合物包含CD8+T细胞的剂量或CD4+T细胞的剂量，以及给予第二组合物，所述第二组合物包含CD4+T细胞和CD8+T细胞的剂量中的另一者。
在一些实施方案中，所述组合物或剂量的给予(例如，所述多种细胞组合物的给予)涉及分开给予细胞组合物。在一些方面，所述分开给予同时或按任何顺序依次进行。在一些实施方案中，所述剂量包含第一组合物和第二组合物，并且所述第一组合物和第二组合物的给予相隔0至12小时，相隔0至6小时或相隔0至2小时。在一些实施方案中，第一组合物的给予的起始和第二组合物的给予的起始相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟进行。在一些实施方案中，第一组合物的给予的起始和/或完成和第二组合物的给予的完成和/或起始相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟进行。
在一些实施方案中，第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD4+ T细胞。在一些实施方案中，第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD8+ T细胞。在一些实施方案中，第一组合物是在第二组合物之前给予的。在一些实施方案中，第二组合物(例如，所述剂量的第二组合物)包含CD4+ T细胞。在一些实施方案中，第二组合物(例如，所述剂量的第二组合物)包含CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，细胞的所述剂量或组合物包括限定或目标比率的表达重组受体的CD4+细胞与表达重组受体的CD8+细胞和/或限定或目标比率的CD4+细胞与CD8+细胞，所述比率任选地为大约1:1或者在大约1:3与大约3:1之间，如大约1:1。在一些方面，具有不同细胞群的目标或所需比率(如CD4+:CD8+比率或CAR+CD4+:CAR+CD8+比率，例如，1:1)的组合物或剂量的给予涉及给予含有所述群体中的一种的细胞组合物，然后给予包含所述群体中的另一种的单独细胞组合物，其中所述给予是以或大约以所述目标或所需比率来进行。在一些方面，具有限定比率的细胞的剂量或组合物的给予导致T细胞疗法的扩增、持久性和/或抗肿瘤活性得到改善。
在一些实施方案中，受试者接受细胞的多个剂量，例如两个或更多个剂量或多个连续剂量。在一些实施方案中，将两个剂量给予受试者。在一些实施方案中，受试者接受连续剂量，例如，在第一剂量后大约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天给予第二剂量。在一些实施方案中，在第一剂量后给予多个连续剂量，使得在给予连续剂量后给予另外一个或多个剂量。在一些方面，以另外的剂量给予受试者的细胞数量与第一剂量和/或连续剂量相同或相似。在一些实施方案中，所述另外一个或多个剂量大于先前剂量。
在一些方面，第一和/或连续剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的范围或类型、分期和/或受试者发生毒性结果(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
在一些方面，第一剂量的给予与连续剂量的给予之间的时间为约9至约35天、约14至约28天或15至27天。在一些实施方案中，给予连续剂量是在给予第一剂量后大于约14天且小于约28天的时间点。在一些方面，第一剂量与连续剂量之间的时间为约21天。在一些实施方案中，在给予连续剂量后给予另外一个或多个剂量(例如连续剂量)。在一些方面，在给予先前剂量后至少约14天且小于约28天给予所述另外一个或多个连续剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天(例如，在先前剂量后4、5、6、7、8、9、10、11、12或13天)给予另外的剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天不给予剂量，和/或在先前剂量后超过约28天不给予剂量。
在一些实施方案中，细胞(例如，重组受体表达细胞)的剂量包含两个剂量(例如，双剂量)，包含T细胞的第一剂量和T细胞的连续剂量，其中第一剂量和第二剂量中的一个或两个包括给予T细胞的分割剂量。
在一些实施方案中，所述细胞剂量通常足够大以有效减轻疾病负荷。
在一些实施方案中，所述细胞以所需剂量给予，所述所需剂量在一些方面包括所需剂量或数量的细胞或一种或多种细胞类型和/或所需比率的细胞类型。因此，细胞的所述剂量在一些实施方案中是基于细胞的总数量(或每kg体重的数量)以及单独群体或亚型的所需比率，如CD4+与CD8+的比率。在一些实施方案中，所述细胞剂量基于单独群体中或单独细胞类型的细胞的所需总数量(或每kg体重的数量)。在一些实施方案中，所述剂量基于此类特征的组合，此类特征是例如所需的总细胞数量、所需比率和单独群体中的细胞的所需总数量。
在一些实施方案中，以总细胞的所需剂量(如T细胞的所需剂量)或在所述所需剂量的容忍差异内给予细胞的群体或亚型如CD8+和CD4+T细胞。在一些方面，所需剂量是细胞的所需数量或被给予所述细胞的受试者的每单位体重的细胞的所需数量，例如细胞/kg。在一些方面，所需剂量等于或高于细胞的最小数量或每单位体重的细胞的最小数量。在一些方面，在以所需剂量给予的总细胞中，单独群体或亚型是以等于或接近所需输出比率(如CD4+与CD8+比率)存在，例如，在这个比率的某一容忍差异或误差内。
在一些实施方案中，所述细胞是以细胞的一种或多种单独群体或亚型的所需剂量(如CD4+细胞的所需剂量和/或CD8+细胞的所需剂量)来给予，或在所述所需剂量的容忍差异内给予。在一些方面，所述所需剂量是亚型或群体的细胞的所需数量或被给予所述细胞的受试者的每单位体重的此类细胞的所需数量，例如细胞/kg。在一些方面，所述所需剂量等于或高于群体或亚型的细胞的最小数量或每单位体重的所述群体或亚型的细胞的最小数量。
因此，在一些实施方案中，所述剂量是基于总细胞的所需固定剂量和所需比率，和/或是基于一种或多种(例如，每种)单独亚型或亚群的所需固定剂量。因此，在一些实施方案中，所述剂量是基于T细胞的所需固定或最小剂量和CD4+与CD8+细胞的所需比率，和/或是基于CD4+和/或CD8+细胞的所需固定或最小剂量。
在一些实施方案中，所述细胞是以多种细胞群或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的所需输出比率来给予，或在所述所需输出比率的容忍范围内给予。在一些方面，所述所需比率可以是特定比率或者可以是比率的范围。例如，在一些实施方案中，所需比率(例如，CD4+与CD8+细胞的比率)在为或约1:5与为或约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)，或在为或约1:3与为或约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，如在为或约2:1与为或约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1)，如为或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些方面，所述容忍差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％(包括这些范围之间的任何值)内。
在特定实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指重组受体(例如，CAR)表达细胞的数量。在其他实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指给予的所有细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)的数量或浓度。
在一些方面，所述剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、尺寸或程度)、转移的范围或类型、分期和/或受试者发生毒性结果(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
在一些实施方案中，所述方法还包括给予一个或多个另外的剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞和/或淋巴细胞清除疗法，和/或重复所述方法的一个或多个步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量与初始剂量相同。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量与初始剂量不同，例如，更高，如比初始剂量高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍，或者更低，如例如比初始剂量低2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍。在一些实施方案中，一个或多个另外的剂量的给予是基于以下来确定：受试者对初始治疗或任何先前治疗的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的范围或类型、分期和/或受试者发生毒性结果(例如CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
C.治疗方法
本文提供了治疗方法，所述治疗方法例如包括给予本文所述的任何工程化细胞或含有工程化细胞的组合物，包括一个或多个剂量，例如单位剂量或含有本文所述的一个或多个单位剂量的任何组合物。在一些方面，还提供了将本文所述的任何工程化细胞或含有工程化细胞的组合物或者单位剂量给予至受试者，如患有疾病或障碍的受试者。在一些方面，还提供了本文所述的任何工程化细胞或含有工程化细胞的组合物用于治疗疾病或障碍的用途。在一些方面，还提供了本文所述的任何工程化细胞或含有工程化细胞的组合物或者单位剂量用于制造用于治疗疾病或障碍的药物的用途。在一些方面，还提供了本文所述的任何工程化细胞或含有工程化细胞的组合物或者单位剂量用于在治疗疾病或障碍中使用，或用于给予至患有疾病或障碍的受试者。
表达重组受体，如嵌合抗原受体(CAR)的工程化细胞或包含所述工程化细胞的组合物可用于多种治疗性、诊断性和预防性情形。例如，工程化细胞或包含工程化细胞的组合物可用于治疗受试者的多种疾病和障碍。此类方法和用途包括治疗方法和用途，例如，涉及将工程化细胞或含有所述工程化细胞的组合物给予至患有疾病、病症或障碍(如肿瘤或癌症)的受试者。在一些实施方案中，所述工程化细胞或包含所述工程化细胞的组合物是以有效量给予以实现对疾病或障碍的治疗。用途包括所述工程化细胞或组合物用于此类方法和治疗中，以及用于药物制备中以进行此类治疗方法。在一些实施方案中，通过向患有或怀疑患有疾病或病症的受试者给予所述工程化细胞或包含所述工程化细胞的组合物来进行所述方法。在一些实施方案中，所述方法由此治疗受试者的疾病或病症或障碍。
用于过继细胞疗法的细胞的给予方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如以下文献中：Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat RevClin Oncol.8(10):577-85)。参见例如，Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
所治疗的疾病或病症可以是任何疾病或病症，其中抗原的表达与疾病、病症或障碍的病因相关和/或参与所述病因，例如引起、加重或以其他方式参与这种疾病、病症或障碍。示例性疾病和病症可以包括与恶性肿瘤或细胞转化相关的疾病或病症(例如癌症)、自身免疫性或炎性疾病、或例如由细菌、病毒或其他病原体引起的感染性疾病。上文描述了示例性抗原，其包括与可以治疗的各种疾病和病症相关的抗原。在特定实施方案中，嵌合抗原受体或转基因TCR特异性地结合至与所述疾病或病症相关的抗原。
疾病、病症和障碍包括肿瘤，包括实体瘤、血液恶性肿瘤和黑色素瘤，并且包括局部和转移性肿瘤；感染性疾病，如病毒或其他病原体的感染，例如HIV、HCV、HBV、CMV、HPV和寄生虫病；以及自身免疫性和炎性疾病。在一些实施方案中，疾病、障碍或病症是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、肿疡或其他增殖性疾病或障碍。在一些实施方案中，疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是白血病或淋巴瘤。此类疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤，例如，急性髓样(或髓性)白血病(AML)、慢性髓样(或髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或成淋巴细胞)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、滤泡性淋巴瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，疾病或病症是选自以下的B细胞恶性肿瘤：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，疾病或病症是NHL，并且NHL选自侵袭性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)NOS型(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)，任选地，3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)。
在一些方面，疾病或病症是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些情况下，疾病或病症是NHL(例如或包括作为侵袭性NHL的NHL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)NOS型(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)，任选地3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)。在一些方面，重组受体(如CAR)特异性地结合至与疾病或病症相关的抗原或在与B细胞恶性肿瘤相关的病灶环境的细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30，或其组合。
在一些实施方案中，疾病或病症是骨髓瘤，如多发性骨髓瘤。在一些方面，重组受体(如CAR)特异性地结合至与疾病或病症相关的抗原或在与多发性骨髓瘤相关的病灶环境的细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与多发性骨髓瘤相关的抗原。在一些方面，在多发性骨髓瘤上表达抗原，例如第二或另外抗原，如疾病特有抗原和/或相关抗原，如B细胞成熟抗原(BCMA)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、CD38(环状ADP核糖水解酶)、CD138(多配体聚糖-1、多配体聚糖、SYN-1)、CS-1(CS1、CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)、BAFF-R、TACI和/或FcRH5。其他示例性多发性骨髓瘤抗原包括CD56、TIM-3、CD33、CD123、CD44、CD20、CD40、CD74、CD200、EGFR，β2-微球蛋白、HM1.24、IGF-1R、IL-6R、TRAIL-R1和IIA型激活素受体(ActRIIA)。参见Benson和Byrd,J.Clin.Oncol.(2012)30(16):2013-15；Tao和Anderson,Bone Marrow Research(2011):924058；Chu等人,Leukemia(2013)28(4):917-27；Garfall等人,Discov Med.(2014)17(91):37-46。在一些实施方案中，抗原包括存在于淋巴肿瘤、骨髓瘤、AIDS相关的淋巴瘤和/或移植后淋巴组织增生上的那些抗原，如CD38。针对此类抗原的抗体或抗原结合片段是已知的并且包括例如以下文献中所述的那些：美国专利号8,153,765、8,603477、8,008,450；美国公开号US20120189622或US 20100260748；和/或国际PCT公开号WO 2006099875、WO 2009080829或WO2012092612或WO 2014210064。在一些实施方案中，此类抗体或其抗原结合片段(例如scFv)包含在多特异性抗体、多特异性嵌合受体(如多特异性CAR)和/或多特异性细胞中。
在一些实施方案中，疾病或障碍与G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的表达和/或B细胞成熟抗原(BCMA)的表达相关。
在一些实施方案中，疾病或障碍是B细胞相关障碍。在所提供方法的任何所提供实施方案的一些实施方案中，与BCMA相关的疾病或障碍是自身免疫性疾病或障碍。在所提供方法的任何所提供实施方案的一些实施方案中，所述自身免疫性疾病或障碍是系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、炎性肠病、类风湿性关节炎、ANCA相关性血管炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、查加斯病(Chagas'disease)、格雷夫斯病(Grave's disease)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、结节性多动脉炎、舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)、寻常型天疱疮、硬皮病、多发性硬化症、银屑病、IgA肾病、IgM多发性神经病、血管炎、糖尿病、雷诺综合征(Reynaud's syndrome)、抗磷脂综合征、古德帕斯丘病(Goodpasture's disease)、川崎病、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力或进行性肾小球肾炎。
在一些实施方案中，疾病或障碍是癌症。在一些实施方案中，癌症是表达GPRC5D的癌症。在一些实施方案中，癌症是浆细胞恶性肿瘤，并且所述浆细胞恶性肿瘤是多发性骨髓瘤(MM)或浆细胞瘤。在一些实施方案中，所述癌症是多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，所述癌症是复发性/难治性多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症，如关节炎(例如，类风湿性关节炎(RA))、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘和/或与移植相关的疾病或病症。
在一些实施方案中，与所述疾病或病症相关的抗原包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特有的抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)是通过自体转移来进行，其中从要接受所述细胞疗法的受试者或者从源自这个受试者的样品分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，所述细胞源自需要治疗的受试者(例如，患者)，并且在分离和处理后将所述细胞给予同一受试者。
在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中从将要接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者(例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将所述细胞给予相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类别或超型。
所述细胞可以通过任何合适的方式给予，例如通过推注输注，通过注射(例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜(posteriorjuxtascleral)递送。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内给予以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内给予。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施方案中，给定剂量是通过所述细胞的单次推注给予来给予。在一些实施方案中，给定剂量是例如在不超过3天的时间段内通过所述细胞的多次推注给予来给予，或通过所述细胞的连续输注给予来给予。在一些实施方案中，所述细胞剂量或任何其他疗法(例如，淋巴细胞清除疗法、干预疗法和/或组合疗法)的给予是通过门诊递送进行的。
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可取决于待治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、是针对预防目的还是治疗目的给予细胞、先前疗法、受试者的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的决断。在一些实施方案中，将组合物和细胞以合适的方式一次或经一系列治疗给予受试者。
在一些实施方案中，将细胞作为组合治疗的一部分给予，如与另一种治疗性干预如抗体或工程化细胞或受体或药剂(如细胞毒性剂或治疗剂)同时给予或以任何顺序依次给予。在一些实施方案中，所述细胞是与一种或多种另外的治疗剂或结合另一种治疗性干预同时或以任何顺序依次共给予。在一些情况下，所述细胞是与另一种疗法共给予，其时间足够接近，使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的作用，或反之亦然。在一些实施方案中，将所述细胞在所述一种或多种另外的治疗剂之前给予。在一些实施方案中，将细胞在所述一种或多种另外的治疗剂之后给予。在一些实施方案中，一种或多种另外的药剂包括细胞因子(例如IL-2)以例如增强持久性。在一些实施方案中，所述方法包括给予化学治疗剂。
在一些实施方案中，所述方法包括在所述给予之前给予化学治疗剂(例如，调理性化学治疗剂)例如以减小肿瘤负荷。
在一些方面，用免疫清除(例如，淋巴细胞清除)疗法预调理受试者可以改善过继细胞疗法(ACT)的效果。
因此，在一些实施方案中，所述方法包括在起始细胞疗法之前将预调理剂给予至受试者，所述预调理剂如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可以在起始细胞疗法之前至少2天(如之前至少3、4、5、6或7天)，向受试者给予预调理剂。在一些实施方案中，在起始细胞疗法之前不超过7天(如之前不超过6、5、4、3或2天)，向受试者给予预调理剂。
在一些实施方案中，用环磷酰胺以在或在约20mg/kg与100mg/kg之间，如在或在约40mg/kg与80mg/kg之间的剂量对受试者进行预调理。在一些方面，用或用约60mg/kg的环磷酰胺对受试者进行预调理。在一些实施方案中，环磷酰胺可以按单剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天一次给予环磷酰胺，持续一天或两天。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含环磷酰胺的情况下，以在或在约100mg/m2与500mg/m2之间，如在或在约200mg/m2与400mg/m2之间或250mg/m2与350mg/m2之间(包含端值)的剂量向受试者给予环磷酰胺。在一些情形中，向受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺。在一些实施方案中，环磷酰胺可以按单剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予环磷酰胺，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情形中，在起始细胞疗法之前，每天向受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺，持续3天。
在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含氟达拉滨的情况下，以在或在约1mg/m2与100mg/m2之间，如在或在约10mg/m2与75mg/m2之间、15mg/m2与50mg/m2之间、20mg/m2与40mg/m2之间或24mg/m2与35mg/m2之间(包含端值)的剂量向受试者给予氟达拉滨。在一些情形中，向受试者给予约30mg/m2的氟达拉滨。在一些实施方案中，氟达拉滨可以按单剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予氟达拉滨，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情形中，在起始细胞疗法之前，每天向受试者给予约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂包含药剂的组合，如环磷酰胺和氟达拉滨的组合。因此，药剂的组合可以包括任何剂量或给予时间表(如上述那些剂量或给予时间表)下的环磷酰胺以及任何剂量或给予时间表(如上述那些剂量或给予时间表)下的氟达拉滨。例如，在一些方面，在第一剂量或后续剂量之前，向受试者给予60mg/kg(约2g/m2)的环磷酰胺和3至5个剂量的25mg/m2氟达拉滨。
在一些实施方案中，在给予细胞后，例如通过许多已知方法中的任一种测量工程化细胞群的生物学活性。要评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，其是在体内例如通过成像评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术评估。在某些实施方案中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用任何合适的已知方法来测量，所述方法例如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物学活性。在一些方面，所述生物活性是通过评估临床结果(如肿瘤负荷或负担的减小)来测量。
在某些实施方案中，以任何数量的方式对所述工程化细胞进行进一步修饰，使得其治疗或预防功效增加。例如，可以将所述群体表达的工程化CAR或TCR直接或通过接头间接缀合至靶向部分。将化合物(例如，CAR或TCR)与靶向部分缀合的实践是已知的。参见例如，Wadwa等人,J.Drug Targeting 3:1 1 1(1995)和美国专利5,087,616。
在一些实施方案中，将细胞作为组合治疗的一部分给予，如与另一种治疗性干预如抗体或工程化细胞或受体或药剂(如细胞毒性剂或治疗剂)同时给予或以任何顺序依次给予。在一些实施方案中，所述细胞是与一种或多种另外的治疗剂或结合另一种治疗性干预同时或以任何顺序依次共给予。在一些情况下，所述细胞是与另一种疗法共给予，其时间足够接近，使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的作用，或反之亦然。在一些实施方案中，将所述细胞在所述一种或多种另外的治疗剂之前给予。在一些实施方案中，将细胞在所述一种或多种另外的治疗剂之后给予。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的药剂包括细胞因子(如IL-2)例如以增强持久性。
D.监测或评估使用治疗性T细胞组合物的疗法
1.评估工程化细胞的药代动力学(PK)，例如峰值细胞水平和患者因素
在一些实施方案中，所述方法包括评估T细胞(例如，用于基于T细胞的疗法给予的T细胞)的暴露、数量、浓度、持久性和增殖。在一些实施方案中，所述方法包括评估工程化T细胞(例如用于基于T细胞的疗法给予的T细胞)或其子集(如CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞、CD3+CAR+细胞、CD4+CAR+细胞或CD8+CAR+细胞)的暴露、数量或水平。在一些实施方案中，在本文所提供的方法中，细胞(例如，用于免疫疗法(例如T细胞疗法)给予的细胞)的暴露、或延长的扩增和/或持久性，和/或所述细胞的细胞表型或功能活性的变化可以通过在体外或离体评估T细胞的特征来测量。在一些实施方案中，此类测定可以用于在给予本文所提供的细胞疗法之前或之后确定或确认用于免疫疗法(例如T细胞疗法)的T细胞的功能。
在一些方面，暴露、数量、浓度、持久性和增殖与药代动力学参数有关。在一些情况下，药代动力学可以通过测量诸如以下等参数来评估：最大(峰值)血浆浓度(Cmax)、峰值时间(即出现最大血浆浓度(Cmax)的时间；Tmax)、最小血浆浓度(即治疗剂(例如，CAR+T细胞)的剂量之间的最小血浆浓度；Cmin)、给予后的消除半衰期(T1/2)和曲线下面积(即通过标绘时间与治疗剂CAR+T细胞的血浆浓度产生的曲线下面积；AUC)。给予后血浆中特定治疗剂(例如CAR+T细胞)的浓度可以使用本领域已知的任何适合于评估治疗剂(例如CAR+T细胞)在血液样品中的浓度的方法或本文所述的任何方法来测量。例如，可以使用基于核酸的方法(如定量PCR(qPCR))或基于流式细胞术的方法或其他测定，例如免疫测定、ELISA或基于色谱/质谱的测定。
在一些实施方案中，确定所给予细胞(例如CAR+T细胞组合物)的药代动力学(PK)以评估所给予细胞的可用性，例如生物利用度。在一些实施方案中，所给予细胞的确定的药代动力学参数包括最大(峰值)血浆浓度(Cmax)，例如CD3+CAR+细胞、CD4+CAR+细胞和/或CD8+CAR+T细胞的Cmax；实现Cmax的时间点(Tmax)，例如CD3+CAR+细胞、CD4+CAR+细胞和/或CD8+CAR+T细胞的Tmax；和/或曲线下面积(AUC)，例如CD3+CAR+细胞、CD4+CAR+细胞和/或CD8+CAR+T细胞的AUC0-28。在一些实施方案中，药代动力学参数是峰值CD3+CAR+T细胞浓度(Cmax CD3+CAR+T细胞)或CD8+CAR+T细胞浓度(Cmax CD8+CAR+T细胞)。在一些实施方案中，药代动力学参数是CD3+CAR+T细胞的AUC0-28(AUC0-28 CD3+CAR+T细胞)，或CD8+CAR+T细胞的AUC0-28(AUC0-28 CD8+CAR+T细胞)。
在一些实施方案中，“暴露”可以是指在给予治疗剂后的某一时间段中，治疗剂(例如，CAR+T细胞)在血浆(血液或血清)中的身体暴露。在一些实施方案中，暴露可以陈述为在给予一定剂量的治疗剂(例如CAR+T细胞)后如通过药代动力学分析所确定的治疗剂浓度-时间曲线的曲线下面积(AUC)。在一些情况下，对于细胞疗法中给予的细胞，AUC是以细胞*天/μL或以其相应单位来表示。在一些实施方案中，AUC被测量为患者群体(如样品患者群体)中的平均AUC，例如一名或多名患者的平均AUC。在一些实施方案中，全身暴露是指在某一时间段内的曲线下面积(AUC)，例如，第0天到第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28天或更多天，或第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15周或更多周，或第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、48个月或更多个月。在一些实施方案中，AUC被测量为给予治疗剂(例如CAR+T细胞)后第0天到第28天的AUC(AUC0-28)，包括所有测量数据和从所测量的药代动力学(PK)参数外推的数据，如来自患者群体(如样品患者群体)的平均AUC。在一些实施方案中，为了确定随时间的暴露，例如某一时间段的AUC，例如AUC0-28，使用参数(例如，细胞浓度)随时间的多次测量或评估(例如，每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21或28天或更长时间进行的测量)产生治疗剂浓度-时间曲线。
在一些实施方案中，检测在给予T细胞后且在给予所述疗法之前、期间和/或之后，受试者中表达重组受体的细胞(例如，用于基于T细胞的疗法给予的CAR表达细胞)的存在和/或数量。在一些方面，使用基于核酸的方法(例如定量PCR(qPCR))来评估受试者的血液或血清或器官或组织样品(例如，疾病部位例如肿瘤样品)中表达重组受体的细胞(例如，用于基于T细胞的疗法给予的CAR表达细胞)的量。在一些方面，持久性被定量为每微克的DNA中编码受体(例如，CAR)的DNA或质粒的拷贝，或者定量为每微升的样品(例如，血液或血清)中表达受体的(例如，表达CAR的)细胞的数量，或者每微升的样品中外周血单核细胞(PBMC)或白细胞或T细胞的总数量。在一些实施方案中，用于qPCR或其他基于核酸的方法的引物或探针对结合、识别和/或扩增编码重组受体的核酸和/或质粒和/或载体中的其他组分或元件具有特异性，所述其他组分或元件包括调节元件(例如启动子、转录和/或转录后调节元件)或反应元件，或标记(例如替代标记)。在一些实施方案中，所述引物可以对调节元件(例如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE))具有特异性。在一些例子中，表达重组受体的细胞的存在和/或量表示为每质量DNA的编码CAR的核酸序列(例如，转基因序列)或可操作地连接至CAR编码序列的核酸序列的拷贝(例如，拷贝/μg DNA)；拷贝/μg DNA随时间的曲线的AUC、在治疗后最大或峰值拷贝/μg DNA、或治疗后或开始治疗后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，或第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12周或更长时间时的拷贝/μg DNA。
在一些实施方案中，在给予T细胞(例如，CAR表达T细胞)后，在或至少在4天、14天、15天、27天或28天，在受试者中检测细胞。在一些方面，在给予T细胞(例如，CAR表达T细胞)后，在或至少在2、4或6周，或之后3、6或12、18或24或30或36个月，或1、2、3、4、5年或更长时间，检测所述细胞。
在一些实施方案中，在开始给予基因工程化细胞后至少8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天的时间，评估峰值水平和/或AUC和/或从受试者获得样品。在一些实施方案中，在开始给予所述基因工程化细胞后在或在约11天至22天、12天至18天或14天至16天之间(每个都包含端值)的时间，评估峰值水平和/或AUC和/或从受试者获得样品。
指示扩增和/或持久性的细胞(例如用于T细胞疗法给予的T细胞)的暴露(例如数量或浓度)可以根据以下来陈述：受试者暴露于的细胞的最大数量或浓度、可检测细胞或高于某一数量或百分比的细胞的持续时间、细胞的数量或浓度随时间的曲线下面积(AUC)和/或其组合及其指示物。此类结果可以使用已知方法来评估，如使用qPCR来检测与特定样品(例如血液、血清、血浆或组织，如肿瘤样品)中核酸或DNA的总量相比，编码重组受体的核酸的拷贝数；和/或使用流式细胞术测定，通常使用对受体具有特异性的抗体来检测表达受体的细胞。还可以使用基于细胞的测定来检测功能细胞的数量或百分比或浓度，所述功能细胞如能够结合至和/或中和疾病或病症的细胞或表达由所述受体所识别抗原的细胞，和/或能够诱导针对所述细胞的反应(例如细胞毒性反应)的细胞。
在一些方面，增加的受试者对细胞的暴露包括增加的细胞扩增。在一些实施方案中，在给予T细胞(例如，CAR表达T细胞)后，受体表达细胞(例如，CAR表达细胞)在受试者中扩增。
在一些实施方案中，在给予T细胞(例如，CAR表达T细胞)后至少20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天或60天或更长时间，在给予T细胞(例如，CAR表达T细胞)后至少或至少约2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周或24周或更长时间中，表达受体的细胞在受试者的血清、血浆、血液或组织(例如肿瘤样品)中是可检测的，例如通过指定方法(例如基于qPCR或流式细胞术的检测方法)检测。
在一些方面，在受试者或其体液、血浆、血清、组织或区室中，例如在其血液(例如外周血)或疾病部位(例如肿瘤)中，至少或至少约1x 102、至少或至少约1x 103、至少或至少约1x 104、至少或至少约1x 105、或至少或至少约1x 106、或至少或至少约5x 106、或至少或至少约1x 107、或至少或至少约5x 107、或至少或至少约1x 108个重组受体表达(例如CAR表达)细胞，和/或每微升至少10、25、50、100、200、300、400或500或1000个受体表达细胞(例如每微升至少10个细胞)是可检测的或存在的。在一些实施方案中，在给予T细胞(例如，CAR表达T细胞)后至少或至少约20天、至少或至少约40天、或至少或至少约60天、或至少或至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月、或至少2或3年中，细胞的这种数量或浓度在受试者中是可检测的。此类细胞数量可以如通过基于流式细胞术或基于定量PCR的方法来检测，并使用已知方法外推至总细胞数量。参见例如，Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)；Park等人,Molecular Therapy 15(4):825–833(2007)；Savoldo等人,JCI 121(5):1822-1826(2011)；Davila等人,(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Davila等人,Oncoimmunology 1(9):1577-1583(2012)；Lamers,Blood 2011 117:72-82；Jensen等人,Biol Blood MarrowTransplant 2010年9月；16(9):1245–1256；Brentjens等人,Blood 2011 118(18):4817-4828。
在一些方面，如通过免疫组织化学、PCR和/或流式细胞术所测量，在给予细胞(例如，CAR表达T细胞)后约1周、约2周、约3周、约4周、约5周或至少约6周、或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或至少2或3年，例如在外周血或骨髓或其他区室中，每100个细胞中编码重组受体的核酸的拷贝数(例如载体拷贝数)是至少0.01、至少0.1、至少1或至少10。在一些实施方案中，在给予T细胞(例如，CAR表达T细胞)后约1周、约2周、约3周或至少约4周，或在这种给予后至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或至少2或3年的时间，每微克基因组DNA中表达受体(例如，CAR)的载体的拷贝数是至少100、至少1000、至少5000、或至少10,000、或至少15,000或至少20,000。
在一些方面，在给予细胞后(例如在开始给予T细胞后)至少或至少约3个月、至少或至少约6个月、至少或至少约12个月、至少或至少约1年、至少或至少约2年、至少或至少约3年、或超过3年的时间，在受试者、其血浆、血清、血液、组织和/或其疾病部位(例如肿瘤部位)中，细胞表达的受体(例如CAR)可通过定量PCR(qPCR)或通过流式细胞术检测。在一些实施方案中，测量在给予T细胞(例如，CAR表达T细胞)后，受试者的体液、血浆、血清、血液、组织、器官和/或疾病部位(例如肿瘤部位)中受体(例如CAR)表达细胞的浓度随时间的曲线下面积(AUC)。
还提供了评估反应或持久反应的可能性的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及在来自受试者的生物样品中检测一种或多种炎性标记的峰值水平和/或基因工程化细胞(包含表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞)的峰值水平，其中先前已经向所述受试者给予一定剂量的用于治疗疾病或病症的基因工程化细胞。在一些实施方案中，所述方法涉及单独地比较所述峰值水平与阈值，从而确定受试者将实现针对基因工程化细胞的给予的持久反应的可能性。
在一些实施方案中，如果一种或多种炎性标记的峰值水平低于阈值，则受试者可能实现反应或持久反应，并且如果一种或多种炎性标记的峰值水平高于阈值，则受试者不可能实现持久反应。在一些实施方案中，如果基因工程化细胞的峰值水平在下限阈值与上限阈值之间的治疗范围内，则受试者可能实现持久反应，并且如果基因工程化细胞的峰值水平低于下限阈值或高于上限阈值，则受试者不可能实现持久反应。
在一些情况下，所提供的实施方案涉及评估参数，例如患者和/或疾病或病症的属性、因素、特征和/或生物标记的表达。在一些实施方案中，所评估的参数与药代动力学参数、反应、持久反应和/或毒性的发生相关和/或相关联。在一些实施方案中，所述参数包括患者因素或患者属性。在一些实施方案中，所评估的参数与本文公开的细胞组合物的表型相关联。在一些实施方案中，所评估的参数指示输出组合物是否将具有与无进展存活期和/或持久反应相关联的所需细胞组成(例如，细胞表型的百分比)。在一些实施方案中，所评估的参数可用于预测产生可用于治疗性给予的输出组合物的可能性。在一些实施方案中，具有高疾病负荷的患者，例如具有高SPD(例如，值大于或等于50cm2)或CRP值(例如，值大于或等于20mg/L)的那些患者不太可能产生可用于治疗性给予的输出组合物。在一些实施方案中，具有低疾病负荷的患者，例如具有低SPD(例如，值小于50cm2)或CRP值(例如，值小于20mg/L)的那些患者更有可能产生可用于治疗性给予的输出组合物。在一些实施方案中，所述参数包括疾病或病症的属性、因素、特征。在一些实施方案中，在治疗之前(例如在给予细胞疗法之前)评估参数。在一些实施方案中，在治疗之后(例如在给予细胞疗法的一个或多个剂量之后)评估参数。
在一些实施方案中，所述参数是或包括药代动力学参数，例如最大(峰值)血浆浓度(Cmax)、峰值时间(即出现最大血浆浓度(Cmax)的时间；Tmax)、最小血浆浓度(即治疗剂(例如，CAR+T细胞)的剂量之间的最小血浆浓度；Cmin)、消除半衰期(T1/2)和曲线下面积(即通过标绘时间与治疗剂CAR+T细胞的血浆浓度产生的曲线下面积；AUC；如AUC0-28)。
在一些实施方案中，所述参数是或包括指示患者的状态和/或患者的疾病或病症的一个或多个因素。在一些实施方案中，所述参数指示肿瘤负荷。在一些实施方案中，指示肿瘤负荷的因素是一个或多个肿瘤的体积量度。在一些实施方案中，所述体积量度是一个或多个病灶的量度，例如肿瘤大小、肿瘤直径、肿瘤体积、肿瘤质量、肿瘤负担或体积、肿瘤相关水肿、肿瘤相关坏死和/或转移的数量或范围。在一些实施方案中，肿瘤的体积量度是二维量度。例如，在一些实施方案中，将一个或多个病灶的面积计算为所有可测量肿瘤的最长直径与最长垂直直径的乘积。在一些情况下，肿瘤的体积量度是一维量度。在一些情况下，将可测量病灶的大小评估为最长直径。在一些实施方案中，测量直径积和(SPD)、最长肿瘤直径(LD)、最长肿瘤直径之和(SLD)、坏死、肿瘤体积、坏死体积、坏死-肿瘤比(NTR)、瘤周水肿(PTE)和水肿-肿瘤比(ETR)。
用于测量和评估肿瘤负荷的示例性方法包括描述于例如以下文献中的那些：Carceller等人,Pediatr Blood Cancer.(2016)63(8):1400-1406和Eisenhauer等人,EurJ Cancer.(2009)45(2):228-247。在一些实施方案中，体积是通过确定所有可测量肿瘤的最大垂直直径的乘积之和来测量的直径积和(SPD)。在一些方面，肿瘤或病灶是在一个维度上用最长直径(LD)和/或通过确定所有可测量病灶的最长肿瘤直径之和(SLD)来测量。在一些实施方案中，肿瘤的体积量度是肿瘤坏死的体积定量，例如坏死体积和/或坏死-肿瘤比(NTR)，参见Monsky等人，Anticancer Res.(2012)32(11):4951-4961。在一些方面，肿瘤的体积量度是肿瘤相关水肿的体积定量，如瘤周水肿(PTE)和/或水肿-肿瘤比(ETR)。在一些实施方案中，测量可以使用受试者的成像技术来进行，所述成像技术如计算断层成像(CT)、正电子发射断层成像(PET)和/或磁共振成像(MRI)。
在一些实施方案中，所述体积量度是SPD，并且在一些情况下，毒性(例如CRS或NT)的发生与高于阈值的SPD值相关。在一些实施方案中，所述体积量度是SPD，并且所述阈值为或为约30cm2，为或为约40cm2，为或为约50cm2，为或为约60cm2，或者为或为约70cm2。在一些实施方案中，所述体积量度是SPD并且所述阈值为或为约30cm2，为或为约40cm2，为或为约50cm2，为或为约60cm2，或者为或为约70cm2。
在一些实施方案中，肿瘤的体积量度是在筛选期间(如常规评估或抽血)确定，以证实和/或鉴定受试者的病症或疾病。
在一些方面，所述参数(例如，肿瘤负荷的测量值)与药代动力学参数相关联和/或相关。在一些实施方案中，所述参数(包括药代动力学参数)与反应和/或持久反应和/或发生毒性(例如CRS或神经毒性(NT))的风险相关。
在一些实施方案中，所述参数是或包括至少一种或一组生物标记。在一些实施方案中，生物标记的表达和/或存在与药代动力学参数、反应、持久反应和/或毒性的发生相关和/或相关联。在一些实施方案中，将参数与特定参考值进行比较，所述参考值例如与反应和/或持久反应和/或发生毒性(例如CRS或神经毒性(NT))的风险相关的那些。在一些实施方案中，所述方法还涉及基于对患者因素和/或生物标记的评估向受试者给予能够调节CAR+T细胞扩增、增殖和/或活性的药剂。
在一些方面，实施方案涉及获得生物样品用于检测参数和/或评估参数的存在和/或检测参数。在一些实施方案中，通常在给予细胞疗法或其第一次给予或剂量，或在开始前述任一项后的4小时至12个月内，例如通常在给予细胞疗法或其第一次给予或剂量后，或在开始前述任一项后，在或在约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、21天、28天、30天、60天或90天或多天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周或更多周、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、48个月或更多个月内，获得生物样品。在一些实施方案中，通常在给予细胞疗法之前或在给予细胞疗法或其第一次给予或剂量之后不久，或在开始前述任一项之后，例如通常在给予细胞疗法或其第一次给予或剂量后，或在开始前述任一项后的4小时至3天内，如通常在给予细胞疗法或其第一次给予或剂量之后，或在开始前述任一项之后，在或在约1天、2天或3天内，在受试者中评估或测量参数。在一些实施方案中，评估或测量参数。在一些实施方案中，通常在给予细胞疗法或其第一次给予或剂量，或在开始前述任一项后的4小时至12个月内，例如通常在给予细胞疗法或其第一次给予或剂量后，或在开始前述任一项后，在或在约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、21天、28天、30天、60天或90天或更多天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周或更多周、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、48个月或更多个月内，评估参数。
在一些方面，所述参数(例如，患者因素和/或生物标记)与药代动力学参数相关联和/或相关。在一些实施方案中，所述参数(包括药代动力学参数)与反应和/或持久反应和/或发生毒性(例如CRS或神经毒性(NT))的风险相关。
在一些实施方案中，所述参数是生物标记。在一些实施方案中，所述参数是或包括生物标记的表达和/或表达特定生物标记的细胞的数量、浓度和/或百分比。在一些实施方案中，所述参数包括生物标记或包含多种生物标记的组中的每种生物标记。在一些实施方案中，生物标记是或包含细胞因子和/或其他血清或血液因子，例如本文所述的任一种。在一些实施方案中，生物标记或组中的每种生物标记是细胞因子，在一些情况下，所述细胞因子可以是趋化因子。在一些实施方案中，生物标记或组中的每种生物标记包含可溶性受体。在一些实施方案中，生物标记或组中的每种生物标记包含可溶性血清蛋白。示例性生物标记或生物标记组描述于本文中。
在一些实施方案中，所述参数是或包括血液分析物的水平和/或浓度。在一些实施方案中，所述参数是或包括炎性标记的水平和/或浓度。在一些实施方案中，血液分析物和/或炎性标记是或包括白介素-7(IL-7)、IL-15、巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1α)的水平和/或浓度。在一些实施方案中，血液分析物和/或炎性标记是或包括IL-6、IL-10、IL-16、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、MIP-1α、MIP-1β、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和C-X-C基序趋化因子10(CXCL10)的水平和/或浓度。在一些实施方案中，血液分析物和/或炎性标记是或包括铁蛋白、C反应蛋白(CRP)、D-二聚体(纤维蛋白降解产物)、IL-6、IL-10、IL-15、IL-16、TNF-α、MIP-1α和MIP-1β的水平和/或浓度。在一些实施方案中，血液分析物和/或炎性标记是或包括LDH、铁蛋白、CRP、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-α2、MCP-1和/或MIP-1β的水平和/或浓度。在一些实施方案中，血液分析物和/或炎性标记是或包括CRP、血清淀粉样蛋白A1(SAA-1)、IL-2、IL-6、IL-10、IL-15、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、CXCL10和C-基序趋化因子配体13(CCL13)的水平和/或浓度。在一些实施方案中，血液分析物和/或炎性标记是或包括LDH、铁蛋白、CRP、D-二聚体、SAA-1、IL-6、IL-10、IL-15、IL-16、TNF-α、IFN-γ和/或MIP-1α的水平和/或浓度。
在一些实施方案中，炎性标记是或包括检测和评估的C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、白蛋白、铁蛋白、β2微球蛋白(β2-M)或乳酸脱氢酶(LDH)的水平或存在。在一些实施方案中，使用免疫测定评估炎性标记。例如，可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、表面等离子体共振(SPR)、蛋白质印迹、侧向流测定、免疫组织化学、蛋白质阵列或免疫PCR(iPCR)来检测炎性标记。在一些实施方案中，使用制品包括检测指示肿瘤负荷的炎性标记。在一些情况下，使用流式细胞术测定或评估炎性标记。在一些情况下，试剂是结合炎性标记的可溶性蛋白质。在一些例子中，试剂是结合C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、白蛋白、铁蛋白、β2微球蛋白(β2-M)或乳酸脱氢酶(LDH)的蛋白质。
在一些实施方案中，生物标记(例如炎性标记)是或包括C反应蛋白(CRP)。在一些实施方案中，使用体外酶联免疫吸附测定来评估CRP，以从样品(如血清、血浆或血液)获得人CRP的定量测量值。在一些例子中，使用人酶联免疫吸附测定(ELISA)检测CRP。在一些实施方案中，生物标记(例如，炎性标记)是或包括红细胞沉降率(ESR)。在一些实施方案中，通过测量红细胞在竖直移液管或导管中从血浆分离后已经下降的距离(以毫米/小时计)来评估ESR。在一些实施方案中，生物标记是或包括白蛋白。在一些方面，使用比色测试或体外酶联免疫吸附测定来评估白蛋白。在一些例子中，使用人酶联免疫吸附测定(ELISA)检测白蛋白。在一些实施方案中，生物标记(例如炎性标记)是或包括铁蛋白或β2微球蛋白。在一些实施方案中，铁蛋白或β2微球蛋白是使用免疫测定来评估，或使用ELISA来检测。在一些方面，生物标记(例如炎性标记)是或包括乳酸脱氢酶(LDH)，并且LDH是使用比色测试或体外酶联免疫吸附测定来评估。
在一些实施方案中，所述参数是LDH，并且在一些情况下，毒性(例如CRS或NT)的发生与高于阈值的LDH值相关联。在一些实施方案中，所述炎性标记是LDH，并且所述阈值为或为约300单位/升，为或为约400单位/升，为或为约500单位/升，或者为或为约600单位/升。
在一些实施方案中，所述参数或生物标记是LDH。在一些实施方案中，所述生物标记是LDH，并且所述阈值是500U/L或更高。在一些实施方案中，所述参数或生物标记是SPD。在一些实施方案中，所述参数是SPD，并且所述阈值为或为约50cm2或更高。在一些实施方案中，生物标记或参数是SPD和LDH，并且所述阈值是50cm2或更高的SPD和500U/L或更高的LDH。在一些实施方案中，生物标记或参数与增加的发生CRS或NT的风险相关。在一些实施方案中，高于阈值的参数或标记的测量值(例如，50cm2或更高的SPD和500U/L或更高的LDH)与增加大约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍的发生CRS或NT(如任何等级的CRS或NT)的风险相关。在一些实施方案中，低于阈值的参数或标记的测量值(例如，低于500cm2的SPD和低于500U/L的LDH)与减小约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍的发生CRS或NT(如任何等级的CRS或NT)的风险相关。
2.评估反应、功效和存活
在一些方面，所述方法涉及确定具有特定细胞表型的细胞(例如CCR7+细胞)的剂量与给予此类剂量的细胞的受试者中的反应、功效和/或存活之间的关联性或关系。
在一些方面，受试者(例如患有NHL的受试者)的反应率是基于卢加诺标准(Luganocriteria)。(Cheson等人,(2014)JCO 32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology2:323-338；Cheson,B.D.(2015)Chin Clin Oncol 4(1):5)。在一些方面，反应评估利用任何临床、血液学和/或分子方法。在一些方面，使用卢加诺标准评估的反应涉及视情况使用正电子发射断层成像(PET)-计算机断层成像(CT)和/或CT。PET-CT评价还可包括使用氟脱氧葡萄糖(FDG)用于嗜FDG淋巴瘤。在一些方面，在使用PET-CT评估嗜FDG组织学的反应的情况下，可以使用5分量表。在一些方面，所述5分量表包含以下标准：1，没有高于背景的摄取；2，摄取≤纵隔；3，摄取>纵隔但≤肝脏；4，摄取中度>肝脏；5，摄取显著高于肝脏和/或新病灶；X，新的摄取区域不可能与淋巴瘤有关。
在一些方面，如使用卢加诺标准描述的完全反应(CR)涉及在不同可测量位点的完全代谢反应和完全放射学反应。在一些方面，这些位点包括淋巴结和淋巴外位点，其中当使用PET-CT时，在5分量表上CR被描述为得分为1、2或3，其具有或不具有残余肿块。在一些方面，在脾或骨髓内具有高生理摄取或具有激活的Waldeyer环或结节外位点中(例如，对于化学疗法或骨髓集落刺激因子)，摄取可以大于正常纵隔和/或肝脏。在这种情况下，如果在初始受累位点的摄取不大于周围的正常组织，即使所述组织具有高生理摄取，也可以推断为完全代谢反应。在一些方面，使用CT在淋巴结中评估反应，其中CR被描述为没有患病的淋巴外位点，并且靶淋巴结/淋巴结肿块必须消退至病灶的最长横径(LDi)≤1.5cm。其他评估位点包括骨髓，其中基于PET-CT的评估应指示在骨髓中缺乏嗜FDG疾病的证据，并且基于CT的评估应指示正常形态，其如果不确定则应是IHC阴性。其他位点可以包括对器官肿大的评估，其应消退至正常。在一些方面，评估未测量的病灶和新病灶，它们在CR的情况下应不存在(Cheson等人,(2014)JCO 32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology 2:323–338；Cheson,B.D.(2015)Chin Clin Oncol 4(1):5)。
在一些方面，如使用卢加诺标准描述的部分反应(PR)涉及在不同可测量位点的部分代谢和/或放射学反应。在一些方面，这些位点包括淋巴结和淋巴外位点，其中在使用PET-CT时，PR被描述为得分为4分或5分，具有与基线相比降低的摄取和任何大小的一个或多个残余肿块。在中间时期，此类发现可以指示反应中的疾病。在治疗结束时，此类发现可以指示残余疾病。在一些方面，使用CT评估淋巴结中的反应，其中PR被描述为多达6个可测量的靶结节和结节外位点的SPD减小≥50％。如果病灶太小而无法在CT上测量，则将5mm×5mm指定为默认值；如果病灶不再可见，则所述值为0mm×0mm；对于>5mm×5mm但小于正常的结节，使用实际测量值进行计算。其他评估位点包括骨髓，其中基于PET-CT的评估应指示残余摄取高于正常骨髓中的摄取但与基线相比有所降低(弥漫性摄取与来自所允许化学疗法的反应性变化相容)。在一些方面，如果在结节反应的情况下在骨髓中存在持续的局灶性变化，则应考虑用MRI或活检或间隔扫描进一步评价。在一些方面，其他位点可以包括对器官肿大的评估，其中脾脏的超过正常的长度必须已经消退>50％。在一些方面，评估未测量病灶和新病灶，它们在PR的情况下应不存在/正常，已消退但没有增加。也可以使用基于PET-CT和/或CT的评估来测量无反应/稳定疾病(SD)或进行性疾病(PD)。(Cheson等人,(2014)JCO32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology 2:323-338；Cheson,B.D.(2015)Chin Clin Oncol 4(1):5)。
在一些方面，无进展存活期(PFS)被描述为在疾病(如癌症)治疗期间和之后，受试者带病生存但所述疾病不恶化的时间长度。在一些方面，客观反应(OR)被描述为可测量的反应。在一些方面，客观反应率(ORR)被描述为实现CR或PR的患者的比例。在一些方面，总存活期(OS)被描述为从疾病(如癌症)的诊断日期或治疗开始日期起，被诊断患有所述疾病的受试者仍然存活的时间长度。在一些方面，无事件存活期(EFS)被描述为在癌症治疗结束后，受试者保持没有所述治疗意图预防或延迟的某些并发症或事件的时间长度。这些事件可以包括癌症的复发或某些症状的发作，所述症状如已经扩散到骨骼的癌症引起的骨痛，或死亡。
在一些实施方案中，反应持续时间(DOR)的量度包括从记录到肿瘤反应至疾病进展的时间。在一些实施方案中，用于评估反应的参数可以包括持久反应，例如，从起始治疗起一段时间之后持续存在的反应。在一些实施方案中，持久反应是由在起始治疗后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月的反应率来指示。在一些实施方案中，所述反应可持续超过3个月或超过6个月。
在一些方面，使用RECIST标准确定客观肿瘤反应；在一些方面，在实体瘤中确定。(Eisenhauer等人,European Journal of Cancer 45(2009)228-247。)在一些方面，使用RECIST标准确定对于靶病灶的客观肿瘤反应。在一些方面，如使用RECIST标准确定的完全反应被描述为所有靶病灶的消失，并且任何病理性淋巴结(无论是靶标还是非靶标)必须在短轴上减小至<10mm。在其他方面，如使用RECIST标准确定的部分反应被描述为以基线直径总和为参考，靶病灶的直径总和减小至少30％。在其他方面，进行性疾病(PD)被描述为以研究中的最小总和(如果基线总和在研究中最小，则这个最小总和包括基线总和)作为参考，靶病灶直径总和增加至少20％。除了20％的相对增加外，所述总和还必须显示至少5mm的绝对增加(在一些方面，出现一个或多个新病灶也被视为进展)。在其他方面，稳定疾病(SD)被描述为以研究时的最小直径总和作为参考，既没有足够缩小以符合PR，也没有足够增加以符合PD。
在一些方面，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物的给予通常降低或预防所述受试者中所述疾病或病症的扩展或负荷。例如，在所述疾病或病症是肿瘤的情况下，所述方法通常降低肿瘤大小、体积、转移、骨髓中原始细胞的百分比或可分子检测的癌症，和/或改进预后或存活或与肿瘤负荷相关的其他症状。
疾病负荷可以涵盖所述受试者中或所述受试者的器官、组织或体液(如肿瘤或例如可指示转移的另一位置的器官或组织)中所述疾病的细胞总数量。例如，在某些血液恶性肿瘤的情况下，可以在血液或骨髓中检测和/或定量肿瘤细胞。在一些实施方案中，疾病负荷可以包括肿瘤的质量、转移的数量或范围和/或骨髓中存在的原始细胞的百分比。
在一些实施方案中，受试者患有白血病。疾病负荷的程度可以通过评估血液或骨髓中的残余白血病来确定。
在一些方面，受试者(如患有CLL的受试者)的反应率是基于国际慢性淋巴细胞白血病研讨会(IWCLL)反应标准(Hallek等人,Blood 2008年6月15日；111(12):5446-5456)。在一些方面，这些标准描述如下：完全缓解(CR)，其在一些方面要求依据免疫表型分析不存在外周血克隆淋巴细胞、不存在淋巴结病、不存在肝肿大或脾肿大、不存在全身症状和令人满意的血细胞计数；完全缓解伴随不完全骨髓恢复(CRi)，其在一些方面被描述为上述CR，但没有正常的血细胞计数；部分缓解(PR)，其在一些方面被描述为淋巴细胞计数下降≥50％、淋巴结病减少≥50％或肝或脾减小≥50％，以及外周血细胞计数改善；进展性疾病(PD)，其在一些方面被描述为淋巴细胞计数增加≥50％至>5x 109/L、淋巴结病增加≥50％、肝或脾大小增加≥50％、Richter转化或由于CLL所致的新的血细胞减少；以及稳定疾病，其在一些方面被描述为不符合CR、CRi、PR或PD的标准。
在一些实施方案中，受试者在给予包含组合物的细胞的一个或多个单位剂量(或单位剂量)的细胞疗法后展现持久反应。在一些实施方案中，持久反应是时间长度，通常以月计，在此期间受试者由于治疗而展示部分或完全反应。在一些实施方案中，所述持久反应与总存活期的改善一致。
在一些实施方案中，受试者在给予包含组合物的细胞的一个或多个单位剂量(或单位剂量)的细胞疗法后展现无进展存活(PFS)。在一些实施方案中，通过测量治疗后或开始治疗后(例如，在给予包含组合物的细胞的一个或多个单位剂量(或单位剂量)的细胞疗法后)的疾病未恶化的时间长度来确定无进展存活期(PFS)。在一些实施方案中，当疾病是癌症时，无进展存活是指癌症未能恶化或扩散。在一些实施方案中，无进展存活期与持久反应一致。
在一些实施方案中，如果在给予细胞的所述剂量的1个月内，受试者的淋巴结大小小于或小于约20mm，大小小于或小于约10mm或大小小于或小于约10mm，则所述受试者展现CR或OR。
在一些实施方案中，在所述受试者的骨髓中(或在大于50％、60％、70％、80％、90％或更多的根据所述方法治疗的受试者的骨髓中)没有检测到CLL的指标克隆。在一些实施方案中，通过IgH深度测序评估CLL的指标克隆。在一些实施方案中，在给予所述细胞后为或约或至少或至少约1、2、3、4、5、6、12、18或24个月的时间，没有检测到所述指标克隆。
在一些实施方案中，如果例如如通过光学显微术检测，骨髓中存在大于或等于5％原始细胞，如骨髓中大于或等于10％原始细胞、骨髓中大于或等于20％原始细胞、骨髓中大于或等于30％原始细胞、骨髓中大于或等于40％原始细胞或骨髓中大于或等于50％原始细胞，则受试者展现形态学疾病。在一些实施方案中，如果骨髓中存在少于5％原始细胞，则受试者展现出完全或临床缓解。
在一些实施方案中，受试者可以展现完全缓解，但存在小部分形态学上(通过光学显微镜技术)不可检测的残余白血病细胞。如果受试者展现骨髓中小于5％原始细胞并且展现可分子检测的癌症，则称所述受试者展现最小残余疾病(MRD)。在一些实施方案中，可分子检测的癌症可以使用允许灵敏地检测少量细胞的多种分子技术中的任一种来评估。在一些方面，此类技术包括PCR测定，其可以确定通过染色体易位产生的独特Ig/T细胞受体基因重排或融合转录物。在一些实施方案中，可以使用流式细胞术基于白血病特有的免疫表型来鉴定癌细胞。在一些实施方案中，癌症的分子检测可以检测少至100,000个正常细胞中的1个白血病细胞。在一些实施方案中，如果如通过PCR或流式细胞术检测到100,000个细胞中至少或大于1个白血病细胞，则受试者展现可分子检测的MRD。在一些实施方案中，受试者的疾病负荷是不可分子检测的或MRD-，使得在一些情况下使用PCR或流式细胞术技术无法检测到所述受试者中的白血病细胞。
在一些方面，疾病或病症在给予第一剂量后持续存在，和/或给予第一剂量不足以根除受试者中的疾病或病症。
在一些实施方案中，如与通过可比较方法使用替代性给药方案(如其中所述受试者接受一种或多种替代性治疗剂的方法和/或其中所述受试者不根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物接受细胞剂量和/或淋巴细胞清除剂的方法)会观察到的降低相比，所述方法降低疾病或病症的负荷(例如，肿瘤细胞数、肿瘤大小、患者存活或无事件存活的持续时间)至更大程度和/或持续更长时间段。在一些实施方案中，细胞的替代性剂量被称为参考组合物。在一些实施方案中，所述参考组合物含有未限定数量的特定表型的细胞和/或未处于根据本文提供的实施方案的特定限定比率下的特定表型的细胞。在一些实施方案中，参考组合物是其中包含频率或数量更大的具有效应子或分化表型的T细胞的组合物。在一些实施方案中，检测、评估或测量受试者的疾病或病症的负荷。在一些方面，可以通过检测受试者中或受试者的器官、组织或体液(如血液或血清)中的疾病细胞或疾病相关细胞(例如肿瘤细胞)的总数量来检测疾病负荷。在一些方面，评估受试者的存活、在某一时间段内的存活、存活程度、无事件或无症状存活的存在或持续时间、或无复发存活。在一些实施方案中，评估疾病或病症的任何症状。在一些实施方案中，指定疾病或病症负荷的量度。
在一些实施方案中，如与其他方法(例如，其中所述受试者接受一种或多种替代性治疗剂的方法和/或其中所述受试者不根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物接受细胞剂量(例如接受参考组合物)和/或淋巴细胞清除剂的方法)相比，所述方法改善所述受试者的无事件存活率或总存活率。例如，在一些实施方案中，在所述剂量后6个月时通过所述方法治疗的受试者的无事件存活率或概率大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％。在一些方面，总存活率大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％。在一些实施方案中，用所述方法治疗的受试者展现无事件存活、无复发存活或存活到至少6个月、或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在一些实施方案中，至进展时间得到改善，如至进展时间大于或大于约6个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。
在一些实施方案中，如与其他方法(例如，其中所述受试者接受一种或多种替代性治疗剂的方法和/或其中所述受试者不根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物接受细胞剂量(例如接受参考组合物)和/或淋巴细胞清除剂的方法)相比，在通过所述方法治疗后，复发的概率降低。例如，在一些实施方案中，在第一剂量后6个月时复发的概率小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％。
在一些情况下，确定所给予细胞(例如，过继转移细胞)的药代动力学，以评估利用度，例如，所给予细胞的生物利用度。用于确定过继转移细胞的药代动力学的方法可以包括从已经被给予工程化细胞的受试者中抽取外周血，并确定所述外周血中所述工程化细胞的数量或比率。用于选择和/或分离细胞的方法可以包括使用嵌合抗原受体(CAR)特异性抗体(例如，Brentjens等人,Sci.Transl.Med.2013年3月；5(177):177ra38)蛋白L(Zheng等人,J.Transl.Med.2012年2月；10:29)，直接引入CAR中的特定位点中的表位标签如Strep-标签序列，借此使用Strep-标签的结合试剂直接评估CAR(Liu等人(2016)NatureBiotechnology,34:430；国际专利申请公开号WO 2015095895)以及与CAR多肽特异性地结合的单克隆抗体(参见国际专利申请公开号WO 2014190273)。在一些情况下，外在标记基因可以与工程化细胞疗法结合使用，以允许检测或选择细胞，并且在一些情况下也促进细胞自杀。在一些情况下，截短的表皮生长因子受体(EGFRt)可以与所转导细胞中目的转基因(CAR或TCR)共表达(参见例如，美国专利号8,802,374)。EGFRt可以含有抗体西妥昔单抗
或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以用于鉴定或选择已用EGFRt构建体和另一种重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所述受体的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434)。
在一些实施方案中，可以在给予所述细胞疗法后的时间段确定从患者获得的生物样品(例如，血液)中CAR+T细胞的数量，例如，以确定所述细胞的药代动力学。在一些实施方案中，在所述受试者的血液中或在通过所述方法如此治疗的大多数受试者中可检测的CAR+T细胞(任选地CAR+CD8+T细胞和/或CAR+CD4+T细胞)的数量是大于1个细胞/μL、大于5个细胞/μL或大于10个细胞/μL。
3.评估毒性
在一些方面，所述方法涉及确定具有特定细胞表型的细胞(例如CCR7+细胞)的剂量与给予此类剂量的细胞的受试者中的毒性结果(例如细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性(NT)的发生)之间的关联性或关系。
在一些方面，毒性结果是细胞因子释放综合征(CRS)或严重CRS(sCRS)，或与细胞因子释放综合征(CRS)或严重CRS(sCRS)相关，或指示细胞因子释放综合征(CRS)或严重CRS(sCRS)。在一些情况下，在过继T细胞疗法和向受试者给予其他生物产品后可能发生CRS，例如sCRS。参见Davila等人,Sci Transl Med 6,224ra25(2014)；Brentjens等人,Sci.Transl.Med.5,177ra38(2013)；Grupp等人,N.Engl.J.Med.368,1509–1518(2013)；和Kochenderfer等人,Blood 119,2709–2720(2012)；Xu等人,Cancer Letters343(2014)172-78。
通常，CRS由增大的例如通过T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和/或巨噬细胞介导的全身免疫应答引起。此类细胞可以释放大量炎性介质，如细胞因子和趋化因子。细胞因子可能引发急性炎性反应和/或诱导内皮器官损伤，所述内皮器官损伤可能导致微血管渗漏、心力衰竭或死亡。严重危及生命的CRS可能导致肺浸润和肺损伤、肾衰竭或弥散性血管内凝血。其他严重危及生命的毒性可以包括心脏毒性、呼吸窘迫、神经毒性和/或肝衰竭。在一些方面，发热、特别是高热(≥38.5℃或≥101.3°F)与CRS相关。在一些情况下，CRS的特征或症状与感染类似。在一些实施方案中，在呈现CRS症状的受试者中也考虑感染，并且可以给予通过培养监测和经验性抗生素疗法。与CRS相关的其他症状可能包括心功能障碍、成人呼吸窘迫综合征、肾和/或肝衰竭、凝血障碍、弥散性血管内凝血和毛细血管渗漏综合征。
可以使用抗炎疗法(如抗IL-6疗法，例如，抗IL-6抗体，例如，托珠单抗)或抗生素或如所述的其他药剂治疗CRS。CRS的结果、体征和症状是已知的，并且包括本文所述的那些。在一些实施方案中，在特定剂量方案或给予实现或不实现给定的CRS相关结果、体征或症状的情况下，可以指定特定结果、体征和症状和/或其量或程度。
在给予CAR表达细胞的情况下，CRS通常在输注表达CAR的细胞后6-20天时发生。参见Xu等人,Cancer Letters 343(2014)172-78。在一些情况下，CRS在CAR T细胞输注后少于6天或超过20天时发生。CRS的发生率和时机可能与在输注时的基线细胞因子水平或肿瘤负荷有关。通常，CRS包括干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α和/或白介素(IL)-2的血清水平升高。可在CRS中快速诱导的其他细胞因子是IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10。
与CRS相关的示例性结果包括发热、寒颤、恶寒、低血压、呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑病、ALT/AST升高、肾衰竭、心脏病、缺氧、神经紊乱和死亡。神经系统并发症包括谵妄、癫痫样活动、意识错乱、找词困难、失语和/或变得迟钝。与CRS相关的其他结果包括疲劳、恶心、头痛、癫痫、心动过速、肌痛、皮疹、急性血管渗漏综合征、肝功能损害和肾衰竭。在一些方面，CRS与一种或多种因子(如血清铁蛋白、d-二聚体、氨基转移酶、乳酸脱氢酶和甘油三酯)的增加相关，或与低纤维蛋白原血症或肝脾肿大相关。
在一些实施方案中，与CRS相关的结果包括以下中的一种或多种：持续发热，例如指定温度(例如大于或大于约38摄氏度)的发热持续两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或持续至少连续三天；大于或大于约38摄氏度的发热；细胞因子的升高，如至少两种细胞因子(例如，由以下组成的组中的至少两种：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))与治疗前水平相比例如至少或至少约75倍的最大倍数变化，或此类细胞因子中至少一种的例如至少或至少约250倍的最大倍数变化；和/或至少一种毒性临床体征，如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管作用加压药所测量)；缺氧(例如，血浆氧(PO2)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和癫痫)。在一些实施方案中，可以与CRS同时观察到神经毒性(NT)。
示例性CRS相关结果包括增加的或高的一种或多种因子(包括细胞因子和趋化因子和与CRS相关的其他因子)的血清水平。示例性结果进一步包括一种或多种此类因子的合成或分泌的增加。这种合成或分泌可以由T细胞或与T细胞相互作用的细胞(如先天免疫细胞或B细胞)进行。
在一些实施方案中，CRS相关的血清因子或CRS相关的结果包括炎性细胞因子和/或趋化因子，包括干扰素γ(IFN-γ)、TNF-a、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、sIL-2Ra、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1、肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL-6和IL-10、IL-1β、IL-8、IL-2、MIP-1、Flt-3L、分形趋化因子和/或IL-5。在一些实施方案中，所述因子或结果包括C反应蛋白(CRP)。除了作为CRS的早期且易于测量的风险因子外，CRP也是细胞扩增的标记。在一些实施方案中，被测量为具有高CRP水平(如≥15mg/dL)的受试者患有CRS。在一些实施方案中，被测量为具有高CRP水平的受试者未患CRS。在一些实施方案中，CRS的量度包括CRP和指示CRS的另一因子的量度。
在一些实施方案中，在CAR治疗之前、期间或之后监测一种或多种炎性细胞因子或趋化因子。在一些方面，一种或多种细胞因子或趋化因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、sIL-2Rα、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或巨噬细胞炎性蛋白(MIP)。在一些实施方案中，监测IFN-γ、TNF-α和IL-6。
已经研发似乎与CRS的发作相关的CRS标准，以预测哪些患者更可能有风险患上sCRS(参见Davilla等人Science translational medicine.2014；6(224):224ra25)。因素包括发热、缺氧、低血压、神经系统改变、升高的炎性细胞因子的血清水平，所述炎性细胞因子如一组七种细胞因子(IFNγ、IL-5、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和GM-CSF)，它们的治疗诱导的升高可能与治疗前肿瘤负荷和sCRS症状二者密切相关。关于CRS的诊断和管理的其他指南是已知的(参见例如，Lee等人,Blood.2014；124(2):188-95)。在一些实施方案中，反映CRS等级的标准是下表1中详述的那些标准。
在一些方面，反映CRS等级的标准是下表3中详述的那些。
在一些实施方案中，认为受试者响应于或继发于细胞疗法或其细胞剂量的给予而发生“严重CRS”(“sCRS”)，条件是给予后所述受试者展示以下：(1)至少38摄氏度的发热持续至少三天；(2)细胞因子升高，其包括(a)下组七种细胞因子中至少两种与刚给予后的水平相比至少75倍的最大倍数变化：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5，和/或(b)下组七种细胞因子中的至少一种与刚给予后的水平相比至少250倍的最大倍数变化：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5；以及(c)至少一种毒性临床体征，如低血压(需要至少一种静脉内血管作用加压药)或缺氧(PO2<90％)或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态改变、迟钝和/或癫痫)。在一些实施方案中，严重CRS包括3级或更高级CRS，如表2或表3中所示。
在一些实施方案中，与严重CRS或3级CRS或更高级CRS(如4级或更高级)相关的结果包括以下中的一种或多种：持续发热，例如指定温度(例如大于或大于约38摄氏度)的发热持续两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或持续至少连续三天；大于或大于约38摄氏度的发热；细胞因子的升高，如至少两种细胞因子(例如，由以下组成的组中的至少两种：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))与治疗前水平相比例如至少或至少约75倍的最大倍数变化，或此类细胞因子中至少一种的例如至少或至少约250倍的最大倍数变化；和/或至少一种毒性临床体征，如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管作用加压药所测量)；缺氧(例如，血浆氧(PO2)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和癫痫)。在一些实施方案中，严重CRS包括需要在重症监护病房(ICU)中进行管理或护理的CRS。
在一些实施方案中，CRS(如严重CRS)涵盖以下的组合：(1)持续发热(在至少38摄氏度发热至少三天)和(2)至少或至少约20mg/dL的血清CRP水平。在一些实施方案中，CRS涵盖需要使用两种或更多种血管加压药的低血压或需要机械通气的呼吸衰竭。在一些实施方案中，在第二次或后续给予中增加血管加压药的剂量。
在一些实施方案中，严重CRS或3级CRS涵盖丙氨酸氨基转移酶的增加、天冬氨酸氨基转移酶的增加、恶寒、发热型嗜中性粒细胞减少症、头痛、左心室功能障碍、脑病、脑积水和/或震颤。
可以指定测量或检测各种结果的方法。
在一些方面，毒性结果是神经毒性或与神经毒性相关。在一些实施方案中，与神经毒性的临床风险相关的症状包括意识模糊、谵妄、表达性失语、迟钝、肌阵挛、嗜睡、精神状态改变、惊厥、癫痫样活动、癫痫(任选地如通过脑电图[EEG]证实)、β淀粉样蛋白(Aβ)水平升高、谷氨酸水平升高和氧自由基水平升高。在一些实施方案中，基于严重程度对神经毒性进行分级(例如，使用1-5级量表(参见例如，Guido Cavaletti和Paola Marmiroli NatureReviews Neurology 6,657-666(2010年12月)；美国国家癌症研究所—常见毒性标准第4.03版(NCI-CTCAE v4.03))。
在一些情形中，神经病学症状可能是sCRS的最早症状。在一些实施方案中，观察到神经病学症状在细胞疗法输注后5至7天开始。在一些实施方案中，神经系统变化的持续时间可能在3至19天的范围内。在一些情况下，在sCRS的其他症状消退后，会发生神经系统变化的恢复。在一些实施方案中，用抗IL-6和/或一种或多种类固醇治疗不会促进神经系统变化消退的时间或程度。
在一些实施方案中，认为受试者响应于或继发于细胞疗法或其细胞剂量的给予而发生“严重神经毒性”，条件是在给予后受试者展示以下中的限制自理(例如洗澡、穿衣和脱衣、进食、如厕、服药)的症状：1)外周运动神经病的症状，包括外周运动神经的炎症或退化；2)外周感觉神经病的症状，包括外周感觉神经的炎症或退化、感觉迟钝(如感官知觉失真，导致异常和不适感)、神经痛(如沿神经或神经组的剧烈疼痛感)，和/或感觉异常(如感觉神经元的功能紊乱，导致在没有刺激物的情况下刺痛、麻木、压迫、冷和温的异常皮肤感觉)。在一些实施方案中，严重神经毒性包括3级或更高级神经毒性，如表4中所示。
在一些实施方案中，与其他方法相比，所述方法减轻与CRS或神经毒性相关的症状。在一些方面，与其他方法相比，所提供的方法减轻与CRS相关的症状、结果或因素，包括与严重CRS或3级或更高级的CRS相关的症状、结果或因素。例如，根据本方法治疗的受试者可能缺少可检测的CRS(例如，严重CRS或3级或更高级的CRS)的症状、结果或因素和/或具有减少的所述症状、结果或因素，如所述的(例如表1或表2中所示的)任何症状、结果或因素。在一些实施方案中，与通过其他方法治疗的受试者相比，根据本方法治疗的受试者可能具有减轻的神经毒性症状，如四肢无力或麻木、记忆、视力和/或智力受损、无法控制的强迫性和/或强制性行为、妄想、头痛、认知和行为问题(包括丧失运动控制、认知退化和自主神经系统功能障碍)以及性功能障碍。在一些实施方案中，根据本方法治疗的受试者可具有减轻的与外周运动神经病、外周感觉神经病、感觉迟钝、神经痛或感觉异常相关的症状。
在一些实施方案中，所述方法减轻与神经毒性相关的结果，包括对神经系统和/或脑的损伤，如神经元的死亡。在一些方面，所述方法降低与神经毒性相关的因子(如β淀粉样蛋白(Aβ)、谷氨酸和氧自由基)的水平。
在一些实施方案中，所述毒性结果是剂量限制性毒性(DLT)。在一些实施方案中，所述毒性结果是剂量限制性毒性。在一些实施方案中，所述毒性结果是不存在剂量限制性毒性。在一些实施方案中，剂量限制性毒性(DLT)被定义为任何3级或更高级的毒性，如通过任何已知或公开的用于评估特定毒性的指南所评估，如上述任何指南并且包括国家癌症研究所(NCI)的不良事件通用术语标准(Common Terminology Criteria for AdverseEvents，CTCAE)4.0版。
在一些实施方案中，通过根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物给予一定剂量的T细胞观察到的发生毒性(例如，CRS或神经毒性或严重CRS或神经毒性，例如，3级或更高级的CRS或神经毒性)的低比率、风险或可能性允许在门诊基础上给予所述细胞疗法。在一些实施方案中，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物给予所述细胞疗法(例如，T细胞(例如，CAR+T细胞)的剂量)是在门诊基础上进行，或者不需要使受试者住院，如需要过夜停留的住院。
在一些方面，被根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物给予所述细胞疗法(例如，T细胞(例如，CAR+T细胞)的剂量)的受试者(包括在门诊基础上治疗的受试者)没有在给予所述细胞剂量之前或与其同时被给予用于治疗任何毒性的干预，除非或直到所述受试者展现毒性(如神经毒性或CRS)的体征或症状。本文描述了用于治疗、延迟、减弱或改善毒性的示例性药剂。
在一些实施方案中，如果被给予所述细胞疗法(例如，T细胞(例如，CAR+T细胞)的剂量)的受试者(包括在门诊基础上治疗的受试者)展现发热，则给予所述受试者治疗或指示所述受试者接受或给予治疗，以减轻发热。在一些实施方案中，所述受试者的发热的特征为所述受试者的体温为(或被测量为)等于或高于某一阈值温度或水平。在一些方面，所述阈值温度是与至少低度发热、与至少中度发热和/或与至少高度发热相关的温度。在一些实施方案中，所述阈值温度是特定的温度或范围。例如，所述阈值温度可以是为或约或至少或至少约38、39、40、41或42摄氏度，和/或可以是38或约38摄氏度至39或约39摄氏度的范围、39或约39摄氏度至40或约40摄氏度的范围、40或约40摄氏度至41或约41度的范围、或41或约41摄氏度至42或约42摄氏度的范围。
在一些实施方案中，被设计为减轻发热的治疗包括用退热药治疗。退热药可以包括减轻发热的任何药剂，例如，化合物、组合物或成分，如已知具有退热作用的任何数量的药剂中的一种，如NSAID(如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利)、水杨酸盐(如阿司匹林、水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)、扑热息痛、醋氨酚、安替比林甲胺甲烷、萘丁美酮、非那宗(Phenaxone)、安替比林、退烧药。在一些实施方案中，退热药是醋氨酚。在一些实施方案中，可以多达每四小时以12.5mg/kg的剂量口服或静脉内给予醋氨酚。在一些实施方案中，所述退热药是或包含布洛芬或阿司匹林。
在一些实施方案中，如果所述发热是持续发热，则向所述受试者给予用于治疗毒性的替代性治疗，如下文章节II中所述的任何治疗。对于在门诊基础上治疗的受试者，如果所述受试者已经和/或被确定为患有或患有持续发热，则指示所述受试者返回医院。在一些实施方案中，如果所述受试者展现等于或高于相对阈值温度的发热，并且在指定治疗(如被设计为减轻发热的治疗，如使用退热药(例如，NSAID或水杨酸盐，例如，布洛芬、醋氨酚或阿司匹林)的治疗)后，所述受试者的发热或体温没有下降，或者没有下降指定量或超过指定量(例如，超过1℃，并且通常不会变动约或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃)的情况下，所述受试者患有和/或被确定为或认为患有持续发热。例如，如果所述受试者展现或被确定为展现至少或至少约38或39摄氏度的发热，所述发热即使在用诸如醋氨酚的退热药治疗后，在6小时时间段中、在8小时时间段中、或在12小时时间段中、或在24小时时间段中，没有降低为或约或没有降低超过为或约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃，或降低为或约1％、2％、3％、4％或5％，则认为所述受试者患有持续发热。在一些实施方案中，所述退热药的剂量是通常在这种受试者中有效减轻发热或特定类型的发热的剂量，所述特定类型的发热如与细菌或病毒感染(例如，局部或全身感染)相关的发热。
在一些实施方案中，如果所述受试者展现等于或高于相对阈值温度的发热，并且在所述受试者的发热或体温没有变动约或超过约1℃，并且通常没有变动约或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃的情况下，所述受试者患有和/或被确定为或认为患有持续发热。所述高于或等于某一量的变动的不存在通常是在给定时间段中测量(如在24小时、12小时、8小时、6小时、3小时或1小时时间段中，其可以从首次发热体征或体温首次高于所指示阈值测量)。例如，在一些实施方案中，如果受试者展现至少或至少约或至少或至少约38或39摄氏度的发热，在6小时时间段中、在8小时时间段中、或在12小时时间段中、或在24小时时间段中，所述发热的温度没有变动超过或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃，则认为或确定所述受试者展现持续发热。
在一些实施方案中，所述发热是持续发热；在一些方面，有可能诱导所述毒性的初始疗法(如所述细胞疗法，如T细胞(例如，CAR+T细胞)的剂量)后，在已经确定受试者患有持续发热时，如在这种确定或首次这种确定的1、2、3、4、5、6小时或更短时间内，治疗所述受试者。
在一些实施方案中，在例如，如根据任何前述实施方案所测量，在确定或确认(如首次确定或确认)所述受试者展现出持续发热时或此前不久的时间，给予用于治疗所述毒性的一种或多种干预或药剂(如靶向毒性的疗法)。在一些实施方案中，在这种确认或确定的某一时间段内，如在这种确认或确定的30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时或8小时内，给予所述一种或多种靶向毒性的疗法。
II.产生工程化细胞组合物的方法
所提供的实施方案包括用于生成或产生含有基因工程化细胞的细胞组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法产生含有表达重组受体(如CAR)的细胞的输出细胞组合物，所述输出细胞组合物在一些情况下是治疗性T细胞组合物，如用于根据用于治疗患有疾病或病症的受试者的方法使用。在一些实施方案中，用于产生工程化细胞组合物的过程的一个或多个步骤的特征可以产生富含具有如所述的某些特征或表型的细胞的输出组合物，所述富含如与用于产生工程化细胞组合物的起始材料的细胞中的表型特征相比而富含。在一些实施方案中，工程化或治疗性T细胞组合物(如通过本文提供的方法生成或产生的输出组合物)展现与分化程度较低的T细胞产物相关的或富含幼稚样或中枢记忆T细胞子集的产物和/或更具功能活性的T细胞产物的表型和功能属性，所述表型和功能属性在一些情况下与在给予至受试者时改善的药代动力学特性或反应(如反应和/或无进展存活期的持久性)相关联。还提供了包含表达重组受体的T细胞的治疗性T细胞组合物(例如输出组合物)，其中所述组合物的细胞富含或展现一定百分比的具有如所述的一种或多种表型或功能属性的细胞，所述一种或多种表型或功能属性包括与分化程度较低的T细胞产物相关的或富含幼稚样或中枢记忆T细胞子集的产物和/或更具功能活性的T细胞产物的属性。
在一些实施方案中，所述方法涉及经由如下过程生成或产生细胞组合物(例如治疗性T细胞组合物)，所述过程包括一个或多个处理或进一步处理步骤，如用于细胞的低温保存、分离、分开、选择、激活或刺激、转导、培育、扩增、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制的步骤。在一些实施方案中，生成或产生细胞组合物(例如治疗性T细胞组合物)的方法包括将细胞从受试者分离、制备、处理、在一种或多种刺激条件下培养。在一些实施方案中，所述方法包括按以下顺序进行的处理步骤，其中：首先将细胞(例如原代细胞(例如T细胞))从生物样品(例如，血液样品、单采术样品、白细胞单采术样品)中分离(如选择或分开)；任选地在刺激试剂的存在下刺激所分离的细胞的步骤之后，将所选择的细胞与病毒载体颗粒一起孵育用于转导；培养所转导的细胞，例如以扩增细胞；将所转导的细胞配制在组合物中并将所述组合物引入所提供的容器中。在一些实施方案中，将所述细胞组合物例如作为单位剂量给予至患者。在一些实施方案中，在低温保存之前或之后将包含所产生的工程化细胞的细胞组合物重新引入至同一受试者中。在一些实施方案中，可以在所述步骤中的一个或多个步骤期间，包括在分离、选择、转导和/或培育之前和/或之后，将细胞低温保存，并且随后解冻。
在一些实施方案中，所述一个或多个处理步骤可以包括以下中的一个或多个：(a)洗涤含有细胞的生物样品(例如，全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级的T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物、或白细胞单采术产物)，(b)从样品中分离(例如选择)细胞的所需子集或群体(例如，CD4+和/或CD8+ T细胞)，例如，通过将细胞与用于基于免疫亲和力的分离的选择或免疫亲和试剂一起孵育来进行；c)将分离的细胞(如选择的细胞)与病毒载体颗粒一起孵育；(d)使用如所述的此类方法来培养、培育或扩增细胞，和(e)如在药学上可接受的缓冲液、低温保存介质或其他合适的介质中配制所转导的细胞。在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括(e)通过将细胞暴露于刺激条件来刺激细胞，所述刺激可以在将细胞与病毒载体颗粒一起孵育之前、期间和/或之后进行。在一些实施方案中，还可以在任何上述步骤之前或之后进行洗涤或悬浮步骤的一个或多个另外的步骤，例如用于细胞的稀释、浓缩和/或缓冲液交换。在一些方面，将所得工程化细胞组合物(例如，治疗性T细胞组合物)引入到一个或多个容器中。在一些实施方案中，将所述细胞组合物例如作为单位剂量给予至患者。
在一些方面，所述方法可用于产生具有特定特性、特征(feature)和/或特点(characteristics)(如用于给予的组合物中细胞的细胞表型，例如表面标记的存在和/或表达、和/或表面标记的不存在或缺乏表达)的细胞组合物。在一些方面，所述特定特性、特征和/或特点(例如细胞表型)与疗法中的所需结果，例如所需反应或安全性结果和/或展现与此类所需结果相关的所需药代动力学参数相关。在一些实施方案中，所述方法还包括确定和/或产生单位剂量，如使用本文所述的方法产生的细胞组合物的单位剂量，例如用于给予至受试者。在一些方面，根据本文所述的方法产生的细胞组合物和/或其单位剂量可以用于治疗性应用，例如，用于给予至受试者用于基于细胞的疗法(例如，包括本文所述的任何治疗方法)。在一些方面，本文所述的细胞组合物和/或单位剂量可以实现疗法的特定所需结果或与其相关，例如所需反应或安全性结果和/或展现与此类所需结果相关的所需药代动力学参数。在一些实施方案中，用于产生细胞组合物的方法包括生成或产生用于本文所述的生成或产生细胞组合物的步骤中的输入组合物。在一些方面，所述方法包括生成或产生输入组合物。在一些实施方案中，所述用于产生输入组合物的一种或多种方法是或包括可以包括以下中的一项或多项的处理步骤：(a)洗涤含有细胞的生物样品(例如，全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级的T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物、或白细胞单采术产物)，(b)从样品中分离(例如选择)所需的细胞子集或群体(例如，CD4+和/或CD8+ T细胞)，例如，通过将细胞与用于基于免疫亲和力的分离的选择或免疫亲和试剂一起孵育来进行。在一些实施方案中，经由包括一个或多个处理步骤(如用于分离、分开、选择的步骤)的过程来产生输入组合物。因此，在一些实施方案中，在用于生成或产生细胞组合物的通用过程的第一步骤中产生输入组成物。在一些方面，用于使用所述方法进行工程化的细胞(如输入组合物中的细胞)是本文例如在章节II.A中所述的任何细胞。在一些方面，输入组合物是基于从用于疗法的受试者获得的CD8+和/或CD4+T细胞的目标数量或百分比产生的，所述T细胞表达(例如在细胞的表面上表达)或不表达与某些细胞表型相关的一种或多种标记，包括与分化程度较低的细胞表型相关或指示所述细胞表型的标记和/或与记忆细胞亚型相关或指示记忆细胞亚型的标记。在一些方面，输入组合物含有目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞。在一些实施方案中，输入组合物含有目标数量或百分比(例如，为、至少、或约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的不表达凋亡标记(例如，激活的半胱天冬酶-3、膜联蛋白V)的T细胞(例如，CD4+和CD8+ T细胞)。
在一些方面，例如通过引入包含编码重组受体(例如，嵌合抗原受体；CAR)或其部分的多核苷酸和/或其他分子(如任何多核苷酸或核酸)的一种或多种药剂、或含有本文例如在章节II.C.3中所述的多核苷酸的一种或多种药剂，对输入组合物进行基因工程化。在一些方面，通过引入一种或多种药剂和/或多核苷酸(如本文例如在章节II.C.3中描述的那些)，对输入组合物中的细胞进行工程化。在一些实施方案中，在所述引入之前、期间和/或之后，通过在一种或多种刺激剂的存在下孵育细胞来刺激所述输入组合物，所述刺激导致细胞的激活和/或增殖。在一些实施方案中，可以使用本文例如在章节II.B中所述的任何刺激方法进行刺激。在一些实施方案中，将输入组合物用于生成或产生细胞组合物的任何处理或进一步处理步骤中。
在一些方面，所述方法产生包含基因工程化细胞，例如表达重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))的工程化T细胞的输出组合物。在一些方面，输出组合物含有限定比率、频率和/或数量的表达(例如在细胞的表面上表达)或不表达与某些细胞表型相关的一种或多种标记的工程化细胞，所述一种或多种标记包括与分化程度较低的细胞表型相关或指示所述细胞表型的标记和/或与记忆细胞亚型相关或指示记忆细胞亚型的标记。在一些方面，输出组合物含有限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。在一些实施方案中，输出组合物含有不表达凋亡标记(例如，半胱天冬酶-3、膜联蛋白V)的T细胞。在一些实施方案中，输出组合物含有目标数量或百分比(为、至少、或约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的不表达凋亡标记(例如，半胱天冬酶-3、膜联蛋白V)的T细胞。在一些实施方案中，输出组合物含有目标数量或百分比的刺激后产生细胞因子的T细胞。在一些实施方案中，所述刺激是重组受体(例如，CAR)抗原特异性的。在一些实施方案中，所述刺激不是重组受体(例如，CAR)抗原特异性的，例如，涉及PMA/离子霉素的刺激。在一些实施方案中，产生的细胞因子是或包括IL-2、TNFα和/或IFNg。在一些实施方案中，产生的细胞因子是或包括IL-2和/或TNFα。在一些方面，可以通过本文所述的方法产生例如基于某些特征和/或表型含有限定比率的细胞的所需输出组合物。
在一些实施方案中，所述方法还涉及在产生输入组合物之前，提供或分离表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞，并确定所述T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。在一些实施方案中，所述方法包括确定不表达凋亡标记(例如，半胱天冬酶-3、膜联蛋白V)的T细胞(例如，CD4+和CD8+ T细胞)的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。
在特定实施方案中，基因工程化是或包括转染或转导来自输入组合物的细胞以引入含有核酸(例如编码重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))的多核苷酸)的药剂。在一些实施方案中，产生输出细胞组合物包括以下中的一个或多个步骤：激活或刺激输入组合物的细胞；对来自输入组合物的细胞进行基因工程化、转导或转染；和/或扩增经转染的细胞；从而产生输出细胞组合物，所述细胞组合物具有限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。在一些实施方案中，所述一个或多个步骤产生输出细胞组合物，所述输出细胞组合物含有目标数量或百分比的刺激后产生细胞因子的T细胞。在一些实施方案中，产生的细胞因子是或包括IL-2、TNFα和/或IFNg。在一些实施方案中，产生的细胞因子是或包括IL-2和/或TNFα。
在一些实施方案中，进行所提供的方法，使得用于临床用途(例如过继细胞疗法中)的细胞的制备中的一个、多个或所有步骤是在未将细胞暴露于非无菌条件下和不需要使用无菌室或无菌柜的情况下进行。在这个过程的一些实施方案中，将细胞分离、分开或选择、转导、洗涤、任选地激活或刺激并配制，所述步骤都在封闭系统内进行。在这个过程的一些方面，使细胞从封闭系统中压出并引入一个或多个生物材料容器中。在一些实施方案中，所述方法是以自动化方式进行的。在一些实施方案中，一个或多个步骤是在封闭系统或装置之外进行的。
在一些实施方案中，将封闭系统用于进行用于制造、生成或产生细胞疗法的方法的一个或多个其他处理步骤。在一些实施方案中，一个或多个或所有处理步骤(例如分离、选择和/或富集、处理、与转导和工程化结合的孵育、和配制步骤)是使用集成或自含式系统中的系统、装置或设备和/或以自动化或可编程的方式进行。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，从而允许用户对处理、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、结果评估和/或调整。在一个例子中，所述系统是如国际专利申请公开号WO 2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统。在一个例子中，所述系统是如国际公开号WO 2016/073602中所述的系统。
A.从样品分离或选择细胞
在一些实施方案中，处理步骤包括从生物样品中分离细胞或其组合物，所述生物样品如获自或源自受试者的那些，所述受试者如患有特定疾病或病症或需要细胞疗法或将被给予细胞疗法的受试者。在一些方面，所述受试者是人，如作为需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中分离、处理和/或工程化细胞以用于所述过继细胞疗法)的患者的受试者。因此，在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞，例如原代人细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含CD4+和CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含CD4+或CD8+ T细胞。所述样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品。所述样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品，以及由一个或多个处理步骤(如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)产生的样品。所述生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经处理的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括源自它们的经处理样品。
在一些方面，衍生或分离出细胞的样品是血液或源自血液的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物(在本文中也称为单采术或白细胞单采术样品)。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾脏、胰腺、乳房、骨、前列腺、宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或源自它们的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的情况下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方案中，所述细胞源自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，所述细胞获得自异种来源，例如获得自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。
在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，所述样品含有淋巴细胞(包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞以例如去除血浆级分，并将所述细胞置于适当缓冲液或介质中用于后续处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，洗涤步骤是通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Baxter)根据制造商的说明书完成的。在一些方面，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤之后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将细胞直接重悬于培养基中。
所述细胞通常是真核细胞，如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天免疫或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴样细胞(包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞)。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导的多能干细胞(iPSC)。所述细胞通常是原代细胞，如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些。在一些实施方案中，所述细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，如全T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如依据以下定义的那些：功能、激活状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位、和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体的类型、在特定器官或区室中的存在、标记或细胞因子分泌谱、和/或分化程度。关于待治疗的受试者，所述细胞可以是同种异体的和/或自体的。所述方法包括现成的方法。在一些方面，如对于现成的技术，所述细胞是多能的和/或多潜能的，如干细胞，如诱导的多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞、将其制备、处理、培养和/或工程化，并在低温保存之前或之后将它们重新引入同一受试者体内。
T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)，效应记忆T(TEM)或终末分化的效应记忆T细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关的不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
在一些实施方案中，分离方法包括基于一种或多种特定分子(如表面标记(例如，表面蛋白)、细胞内标记或核酸)在细胞中的表达或存在来分离不同细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记的分离方法。在一些实施方案中，所述分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，所述分离包括基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)在细胞中的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过以下方式来进行：与特异性结合至此类标记的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤，并将已结合所述抗体或结合配偶体的细胞与尚未结合至所述抗体或结合配偶体的那些细胞分离。
在一些实施方案中，所述细胞的分离包括一个或多个制备步骤和/或非基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞洗涤、离心和/或在一种或多种试剂存在下孵育，例如以去除不需要的组分、富集所需组分、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、大小、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，选择步骤的至少一部分包括将细胞与选择试剂一起孵育。例如作为选择方法的一部分的与一种或多种选择试剂一起孵育可以使用一种或多种选择试剂进行，以基于一种或多种特定分子在细胞中或细胞上的表达或存在，选择一种或多种不同的细胞类型，所述分子如表面标记(例如表面蛋白)、细胞内标记或核酸。在一些实施方案中，可以使用任何已知的方法，所述方法使用一种或多种选择试剂用于基于此类标记进行分离。在一些实施方案中，一种或多种选择试剂导致分离，所述分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，所述选择包括与一种或多种试剂一起孵育，用于基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的细胞表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过以下方式来进行：与特异性地结合至此类标记的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并分离已结合所述抗体或结合配偶体的细胞与尚未结合至所述抗体或结合配偶体的那些细胞。在一些实施方案中，所述过程的选择和/或其他方面如国际专利申请公开号WO/2015/164675中所述。
在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的基于亲和力的所需选择试剂混合。基于免疫亲和力的选择可以使用任何系统或方法进行，所述系统或方法使得在分离的细胞与特异性地结合至细胞上的标记的分子(例如，固体表面(例如颗粒)上的抗体或其他结合配偶体)之间产生有利的能量相互作用。在一些实施方案中，方法是使用颗粒诸如珠，例如磁珠进行，所述颗粒包被有对细胞的标记具有特异性的选择剂(例如抗体)。可以将颗粒(例如珠)与细胞在容器(如管或袋)中一起孵育或混合，同时振荡或混合，其中细胞密度与颗粒(例如，珠)的比率是恒定的，以帮助促进能量上有利的相互作用。在其他情况下，所述方法包括选择细胞，其中所述选择的全部或一部分是在离心室的内部空腔中进行，例如在离心旋转下进行。在一些实施方案中，将细胞与选择试剂(例如基于免疫亲和力的选择试剂)一起孵育是在离心室中进行。在某些实施方案中，所述分离或分开是使用国际专利申请公开号WO 2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统、装置或设备进行。在一个例子中，所述系统是如国际公开号WO 2016/073602中所述的系统。
在一些实施方案中，通过在离心室的空腔中进行此类选择步骤或其部分(例如，与抗体包被的颗粒(例如磁珠)一起孵育)，用户能够控制某些参数，如各种溶液的体积、在处理期间溶液的添加及其时间安排，从而可以提供与其他可用方法相比的多种优势。例如，在孵育期间减少空腔中液体体积的能力可以增加选择中使用的颗粒(例如珠试剂)的浓度，并由此增加溶液的化学势，而不影响空腔中的细胞总数量。这又可以增强正在处理的细胞与用于选择的颗粒之间的成对相互作用。在一些实施方案中，例如，在与如本文所述的系统、电路和控制相关联时，在室中进行孵育步骤允许用户实现在孵育期间的一个或多个所需时间对溶液的搅动，这也可以改善相互作用。
在一些实施方案中，选择步骤的至少一部分是在离心室中进行，所述部分包括将细胞与选择试剂一起孵育。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量基于亲和力的所需选择试剂混合，所述量显著少于根据制造商的说明书针对相同数量的细胞和/或相同体积的细胞的选择在管或容器中进行类似选择时通常所用的量。在一些实施方案中，所采用的一种或多种选择试剂的量是根据制造商的说明书用于在基于管或容器的孵育中针对相同数量的细胞和/或相同体积的细胞选择细胞的相同的一种或多种选择试剂的量的不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过50％、不超过60％、不超过70％或不超过80％。
在一些实施方案中，对于细胞的选择，例如基于免疫亲和力的选择，将细胞在室空腔中在组合物中孵育，所述组合物还含有选择缓冲液，所述选择缓冲液含有选择试剂，所述选择试剂例如特异性地结合至希望富集和/或耗尽的细胞上而不是组合物中其他细胞上的表面标记的分子，例如抗体，所述分子任选地偶联到支架，例如聚合物或表面，例如珠，例如磁珠，例如与对CD4和CD8具有特异性的单克隆抗体偶联的磁珠。在一些实施方案中，如所描述的，将选择试剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与在振荡或旋转的管中进行选择时，对相同数量的细胞或相同体积的细胞实现大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的选择试剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和选择试剂添加选择缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如10mL至200mL试剂的孵育的目标体积，例如至少或约至少或约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂在添加至细胞之前预先混合。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂单独添加至细胞。在一些实施方案中，选择孵育是在周期性温和混合条件下进行的，这可有助于促进能量上有利的相互作用，从而允许在实现高选择效率的同时使用较少的总选择试剂。
在一些实施方案中，与选择试剂一起孵育的总持续时间是从5分钟至6小时或从约5分钟至约6小时，如30分钟至3小时，例如至少或约至少30分钟、60分钟、120分钟或180分钟。
在一些实施方案中，所述孵育通常在混合条件下进行，如在旋转存在下进行，通常以相对低的力或速度旋转，如速度低于用于使细胞沉淀的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如，为或约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，如在室或其他容器的样品或壁处的一定RCF下，所述RCF是从80g至100g或从约80g至约100g(例如，为或约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，所述旋转是使用如下重复间隔来进行：以这种低速旋转，之后是停歇时间段，例如旋转和/或停歇1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后停歇大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，这个过程是在集成有所述室的完全封闭的系统内进行的。在一些实施方案中，这个过程(并且在一些方面还有一个或多个另外的步骤，例如洗涤含有细胞的样品，例如单采术样品的预先洗涤步骤)以自动化方式进行，使得将细胞、试剂和其他组分在适当时间吸入和排出所述室并进行离心，以便使用自动化程序在单一封闭系统中完成洗涤和结合步骤。
在一些实施方案中，在孵育和/或混合细胞和一种和/或多种选择试剂后，使所孵育的细胞经历分离，以基于一种或多种特定试剂的存在或不存在来选择细胞。在一些实施方案中，在同一封闭系统中进行分离，其中将细胞与选择试剂一起进行孵育。在一些实施方案中，在与选择试剂一起孵育后，将所孵育的细胞(包括其中已经结合选择试剂的细胞)转移到用于基于免疫亲和力来分离细胞的系统中。在一些实施方案中，用于基于免疫亲和力的分离的系统是或含有磁分离柱。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已结合所述试剂(例如抗体或结合配偶体)的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留尚未结合至试剂(例如，抗体或结合配偶体)的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在无法获得专门鉴定异质性群体中的细胞类型的抗体，使得最好基于除了所需群体以外的细胞表达的标记来进行分离的情况下，阴性选择可以特别有用。
在一些实施方案中，所述过程步骤进一步包括对所孵育的细胞进行阴性和/或阳性选择，如使用可以进行基于亲和力的选择的系统或设备。在一些实施方案中，通过经由阳性选择富集特定细胞群，或经由阴性选择耗尽特定细胞群来进行分离。在一些实施方案中，阳性或阴性选择是通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记+)或以相对较高水平表达(标记高)的一种或多种表面标记特异性地结合。可以进行多轮相同的选择步骤，例如阳性或阴性选择步骤。在某些实施方案中，使阳性或阴性选择的级分经历选择过程，如通过重复阳性或阴性选择步骤。在一些实施方案中，将选择重复两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或超过九次。在某些实施方案中，将相同选择进行多达五次。在某些实施方案中，将相同选择步骤进行三次。
分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群体或表达特定标记的细胞。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样，特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致所有此类细胞的完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经历另一分离步骤，如后续阳性或阴性选择。在一些例子中，单一分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对阴性选择所靶向的标记具有特异性)一起孵育。同样，可以通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，同时对多种细胞类型进行阳性选择。在某些实施方案中，将一个或多个分离步骤重复和/或进行多于一次。在一些实施方案中，使从分离步骤产生的阳性或阴性选择的级分经历相同分离步骤，如通过重复阳性或阴性选择步骤。在一些实施方案中，将单一分离步骤重复和/或进行多于一次，例如以增加阳性选择的细胞的产量、增加阴性选择细胞的纯度和/或从阴性选择的级分中进一步去除阳性选择的细胞。在某些实施方案中，将一个或多个分离步骤进行和/或重复两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或超过十次。在某些实施方案中，将一个或多个选择步骤进行和/或重复一至十次、一至五次或三至五次。在某些实施方案中，将一个或多个选择步骤重复三次。
例如，在一些方面，通过阳性或阴性选择技术来分离T细胞的特定亚群，如对一种或多种表面标记呈阳性或表达高水平的所述表面标记的细胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+ T细胞。在一些实施方案中，通过与特异性地结合至此类标记的一种或多种抗体或结合配偶体一起孵育来选择此类细胞。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体可以如直接或间接缀合至用于实现选择的固体支持物或基质，如磁珠或顺磁珠。例如，可以使用抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如，
M-450 CD3/CD28 T细胞扩增器、和/或
珠)对CD3+、CD28+ T细胞进行阳性选择。
在一些实施方案中，通过在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标记(如CD14)的阴性选择，从PBMC样品分离T细胞。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。可以通过针对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记的阳性或阴性选择，将此类CD4+和CD8+群体进一步分选成亚群。
在一些实施方案中，如通过基于与相应亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，使CD8+ T细胞针对幼稚、中枢记忆、效应子记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如改善给予后的长期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人,(2012)Blood.1:72–82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+ T细胞与CD4+ T细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以例如使用抗CD8和抗CD62L抗体使PBMC富集或耗尽CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分。
在一些实施方案中，对中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，富含TCM细胞的CD8+群体的分离是通过耗尽表达CD4、CD14、CD45RA的细胞以及对表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行的。在一个方面，对中枢记忆T(TCM)细胞的富集是用基于CD4表达选择的阴性细胞级分开始进行的，使所述阴性细胞级分经历基于CD14和CD45RA的表达的阴性选择和基于CD62L的阳性选择。
在一些方面，此类选择是同时进行的，并且在其他方面，是以任一顺序依次进行的。在一些方面，用于制备CD8+ T细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+ T细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分二者被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。在一些实施方案中，对CD4+ T细胞群的选择和对CD8+ T细胞群的选择同时进行。在一些实施方案中，CD4+T细胞群和对CD8+ T细胞群的选择以任一顺序依次进行。在一些实施方案中，用于选择细胞的方法可以包括公开的美国申请号US 20170037369中所述的那些。在一些实施方案中，可以在选择之后将经选择CD4+ T细胞群和经选择CD8+ T细胞群合并。在一些方面，可以将经选择CD4+ T细胞群和经选择CD8+ T细胞群在容器或袋(如生物反应器袋)中合并。在一些实施方案中，如根据所提供的方法，单独处理经选择CD4+ T细胞群和经选择CD8+ T细胞群，由此使经选择CD4+ T细胞群富集CD4+ T细胞并且将其与刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)一起孵育，用编码重组蛋白(例如CAR)的病毒载体转导并且在扩增T细胞的条件下培育；并且使经选择CD8+ T细胞群富集CD8+ T细胞并且将其与刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)一起孵育，用编码重组蛋白(例如CAR，即与用于工程化来自同一供体的CD4+ T细胞相同的重组蛋白)的病毒载体转导，并且在扩增T细胞的条件下培育。
在特定实施方案中，使生物样品，例如PBMC或其他白细胞的样品经历CD4+ T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分二者。在某些实施方案中，CD8+ T细胞选自阴性级分。在一些实施方案中，使生物样品经历CD8+ T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分二者。在某些实施方案中，CD4+ T细胞选自阴性级分。
在特定例子中，使PBMC样品或其他白细胞样品经历CD4+ T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分二者。然后使阴性级分经历基于CD14和CD45RA或CD19的表达的阴性选择，以及基于中枢记忆T细胞特有的标记(如CD62L或CCR7)的阳性选择，其中阳性和阴性选择是以任一顺序来进行。
可以通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群将CD4+ T辅助细胞分选为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+ T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+或CD4+ T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+ T细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+ T细胞是CD62L-和CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+ T细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)结合，以允许分离用于阳性和/或阴性选择的细胞。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分开技术来分开或分离细胞和细胞群(综述于以下文献中：Methods in Molecular Medicine,第58卷:MetastasisResearch Protocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑
Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦)。
在一些方面，将待分离的细胞的样品或组合物与含有选择试剂的小型可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如像Dynalbeads或
珠))一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附接至结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体特异性地结合至需要分离(例如，需要进行阴性或阳性选择)的一种细胞、多种细胞或细胞群上存在的分子(例如，表面标记)。
在一些实施方案中，磁粒或磁珠包含结合至特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)的磁响应材料。存在许多用于磁分离方法的熟知的磁响应材料。合适的磁粒包括在Molday的美国专利4,452,773和欧洲专利说明书EP452342B中所述的那些，所述专利通过引用特此并入。其他例子是并且也可以使用胶体大小的颗粒，如在以下文献中所述的那些：Owen的美国专利号4,795,698；和Liberti等人的美国专利号5,200,084。
孵育通常在如下条件下进行：由此附接至磁粒或磁珠的抗体或结合配偶体或者与此类抗体或结合配偶体特异性地结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果在样品内细胞上存在)特异性地结合。
在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合配偶体、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，磁粒经由对一种或多种标记具有特异性的一抗的包衣而附接至细胞。在某些实施方案中，将所述细胞而不是珠用一抗或结合配偶体标记，然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁粒。在某些实施方案中，链霉亲和素包被的磁粒是与生物素化的一抗或二抗结合使用的。
在一些方面，分离以如下程序实现：其中将样品置于磁场中，并且附接有磁响应颗粒或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引至磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁体吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性与阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并对其进行进一步处理或使其经历进一步的分离步骤。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec，加利福尼亚州奥本)来进行的。磁激活细胞分选(MACS)，例如CliniMACS系统能够对附接有磁化颗粒的细胞进行高纯度选择。在某些实施方案中，MACS以如下模式操作：其中在施加外部磁场之后依次洗脱非靶种类和靶种类。也就是说，附接至磁化颗粒的细胞被保持在适当的位置，而未附接的种类被洗脱。然后，在完成这个第一洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中以防被洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，标记非靶细胞并将其从异质性细胞群耗尽。
在一些实施方案中，使磁响应颗粒保持附接至细胞，随后对所述细胞进行孵育、培养和/或工程化；在一些方面，使所述颗粒保持附接至用于给予患者的细胞。在一些实施方案中，从细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。用于从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体、与可切割接头缀合的可磁化颗粒或抗体等。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在某些实施方案中，使用如下系统、装置或设备进行分离或分开：进行所述方法的分离、细胞制备、分开、处理、孵育、培养和/或配制步骤中的一个或多个。在一些方面，使用所述系统在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如以使错误、用户操作和/或污染最小化。在一个例子中，所述系统是如国际专利申请公开号WO 2009/072003或US20110003380 A1中所述的系统。
在一些实施方案中，所述系统或设备在集成或自含式系统中和/或以自动化或可编程方式进行分离、处理、工程化和配制步骤中的一个或多个(例如，全部)。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，从而允许用户对处理、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、结果评估和/或调整。
在一些方面，使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotic)进行分离和/或其他步骤，例如用于在封闭和无菌系统中在临床规模水平上进行细胞的自动化分离。部件可以包括集成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，集成计算机控制仪器的全部部件并引导所述系统按标准化顺序执行重复程序。在一些方面，磁分离单元包括可移动的永磁体和选择柱的支架。蠕动泵控制整个管组的流速，并且与夹紧阀一起确保缓冲液在整个系统中的受控流动和细胞的持续悬浮。
在一些方面，CliniMACS系统使用在无菌、无热原的溶液中提供的抗体偶联的可磁化颗粒。在一些实施方案中，在用磁粒标记细胞之后，洗涤细胞以去除过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。管组由预装配的无菌管路(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程序后，系统将细胞样品自动施加到分离柱上。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群未被标记并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述方法一起使用的细胞群在去除磁场之后从柱中洗脱，并被收集在细胞收集袋内。
在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有细胞处理联合体，其允许通过离心自动化洗涤和分级细胞。CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机和图像识别软件，其通过辨识源细胞产品的宏观层来确定最佳细胞分级终点。例如，将外周血自动分离为红细胞、白细胞和血浆层。所述CliniMACS Prodigy系统还可以包括集成的细胞培育室，其完成细胞培养方案，例如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可以允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见例如，Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651–660；Terakura等人(2012)Blood.1:72–82,和Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，经由流式细胞术收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群，其中针对多种细胞表面标记染色的细胞携载于流体流中。在一些实施方案中，经由制备规模(FACS)分选来收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群(参见例如，WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人(2008)JBiophoton.1(5):355–376。在两种情况下，可以用多种标记来标记细胞，从而允许以高纯度分离明确限定的T细胞子集。
在一些实施方案中，用一种或多种可检测标记来标记抗体或结合配偶体，以促进用于阳性和/或阴性选择的分离。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记具有特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞携载于流体流中，如通过荧光激活细胞分选(FACS)(包括制备规模(FACS))和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许同时基于多种标记进行阳性和阴性选择。
在一些实施方案中，所述制备方法包括在选择、分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如低温保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括在选择、分离或富集之前或之后冷冻(例如低温保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻和后续解冻步骤去除细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如，在洗涤步骤去除血浆和血小板之后，使所述细胞悬浮于冷冻溶液中。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻介质。然后用介质将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将所述细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。在一些实施方案中，将细胞密封在适合于低温保存的袋(例如，
冷冻袋，Miltenyi Biotec)中。在一些实施方案中，将细胞密封在适合于低温保存的小瓶(例如，
小瓶，Cook Regentec)中。在一些实施方案中，用于冷冻的步骤和/或试剂是或包括本文描述的用于冷冻的任何步骤和/或试剂。
在本文所述的方法的一些实施方案中，在选择、分离、孵育和/或工程化之前低温保存样品(例如，单采术或白细胞单采术产物)以减少、最小化或防止细胞死亡是有益的。用于减少、最小化或防止细胞死亡和保存细胞活力的非限制性低温保护方法描述于下文中。在一些实施方案中，将含有细胞的样品(例如，全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级的T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物、或白细胞单采术产物)低温保存和/或低温保护(例如冷冻)，然后在用于以下的任何步骤之前解冻：分离、选择、激活、刺激、工程化、转导、转染、孵育、培养、收获、配制细胞群，和/或将经配制的细胞群给予至受试者。在特定实施方案中，将单采术产物或白细胞单采术产物低温保存和/或低温保护(例如冷冻)，然后在经历如上所述的细胞选择或分离步骤(例如T细胞选择或分离步骤)之前解冻。在一些实施方案中，在使低温保存和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物经历细胞(例如，T细胞)选择或分离步骤之后，在任何后续步骤期间或之间不进行另外的低温保存和/或低温保护步骤，所述后续步骤如激活、刺激、工程化、转导、转染、孵育、培养、收获、配制细胞群，和/或将经配制的细胞群给予至受试者的步骤。例如，选自解冻的低温保存和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物的T细胞在被解冻用于下游过程，如T细胞激活/刺激或转导之前不再进行低温保存和/或低温保护。在一些实施方案中，在使低温保存和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物经历细胞(例如，T细胞)选择或分离步骤之后，在任何后续步骤期间或之间进行另外的低温保存和/或低温保护步骤，所述后续步骤如激活、刺激、工程化、转导、转染、孵育、培养、收获、配制细胞群，和/或将经配制的细胞群给予至受试者的步骤。例如，选自解冻的低温保存和/或低温保护单采术产物或白细胞单采术产物的T细胞在被解冻用于下游过程，如T细胞激活/刺激或转导之前再次进行低温保存和/或低温保护。
在特定实施方案中，储备低温保存和/或低温保护的单采术产品或白细胞单采术产物(例如，在冷冻样品之前未进行T细胞选择)，这在一些方面可以允许更灵活地进行后续处理步骤。在一方面，在选择之前储备细胞增加了用于下游过程的细胞产量，并且提前储备细胞可能意味着所述细胞更健康并且可以更容易满足制造成功的标准。在一些实施方案中，与未经储备的细胞相比，经储备的细胞在进一步的处理步骤中(如在用于生成或产生细胞组合物的步骤或进一步步骤中)更稳健。在另一方面，一旦解冻，可以对低温保存和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物进行一种或多种不同的选择方法。该方法的优点尤其是增强用于治疗受试者的疾病或病症的细胞疗法的细胞的可用性、功效和/或其他方面，如在样品的供体和/或另一接受者中。
在一些实施方案中，血液样品、单采术样品、或白细胞单采术样品的低温保存在从受试者获得样品的1、2、3、4、5、10、15、20、24、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50小时内进行。在实施方案中，血液样品、单采术样品、或白细胞单采术样品的低温保存在从受试者获得样品的1天、2天、或3天内进行。
在一些实施方案中，洗涤含有细胞的样品(例如血液样品、单采术产物或白细胞单采术产物)，以去除在单采术或白细胞单采术期间添加的一种或多种抗凝剂(如肝素)。在一些实施方案中，使样品(例如血液样品、单采术样品、白细胞单采术样品)经历选择、分离和/或富集，并且将经选择、分离和/或富集的细胞低温保存。在一些实施方案中，经选择、分离和/或富集的细胞是T细胞，如本文所述的任何T细胞。在一些实施方案中，在分离、选择和/或富集之后将经富集T细胞组合物冷冻，例如低温保存和/或低温冷冻。在特定实施方案中，在分离、选择和/或富集之后将经富集CD4+ T细胞的组合物冷冻，例如低温保存和/或低温冷冻。在某些实施方案中，在分离、选择和/或富集之后将经富集CD8+ T细胞的组合物冷冻，例如低温保存和/或低温冷冻。在一些实施方案中，在孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染、培育、扩增、收获和/或配制细胞组合物的任何步骤之前将经富集T细胞冷冻，例如低温保存和/或低温冷冻。在特定实施方案中，在孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染、培育、扩增、收获和/或配制细胞组合物的任何步骤之前，将经富集CD4+ T细胞的组合物冷冻，例如低温保存和/或低温冷冻。在一些实施方案中，在孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染、培育、扩增、收获和/或配制细胞组合物的任何步骤之前，将经富集CD8+ T细胞的组合物冷冻，例如低温保存和/或低温冷冻。在特定实施方案中，将一种或多种低温冷冻的输入组合物例如在或在约-80℃下储存12小时至7天、24小时至120小时或2天至5天。在特定实施方案中，将一种或多种低温冷冻的输入组合物在或在约-80℃下储存少于10天、9天、8天、7天、6天或5天、4天、3天、2天或1天的时间量。在一些实施方案中，将一种或多种低温冷冻的输入组合物在或在约-80℃下储存1天、2天、3天、4天、5天或6天或约1天、2天、3天、4天、5天或6天。
在一些实施方案中，在供体被诊断为患有疾病或病症后的某一时间，收集样品(例如单采术或白细胞单采术样品)并且在细胞选择之前或在没有先前细胞选择的情况下(例如，在没有先前T细胞选择，如通过色谱法进行选择的情况下)进行低温保存和/或低温保护。在一些方面，低温保存的时间也是在供体接受以下中的一种或多种之前：用于所述疾病或病症的任何初始治疗、用于所述疾病或病症的治疗的任何靶向治疗或任何经标记治疗、或除了辐射和/或化学疗法之外的任何治疗。在一些实施方案中，在用于疾病的初始治疗后的第一次疾病复发之后，并且在供体或受试者接受用于所述疾病的后续治疗之前，收集样品。初始和/或后续治疗可以是除细胞疗法之外的疗法。在一些实施方案中，收集的细胞可以用于初始和/或后续治疗之后的细胞疗法中。在一方面，在没有先前细胞选择的情况下，低温保存和/或低温保护的样品可以有助于降低前期费用，如与随机临床试验中的非治疗患者相关的那些，所述患者可以交叉并且以后需要治疗。
在一些实施方案中，在用于所述疾病的二线治疗后第二次疾病复发之后，并且在供体或受试者接受用于所述疾病的后续治疗之前的某一时间，收集样品(例如单采术或白细胞单采术样品)并且在细胞选择之前或在没有先前细胞选择的情况下(例如，在没有先前T细胞选择，如通过色谱法进行选择的情况下)进行低温保存和/或低温保护。在一些实施方案中，例如通过评估某些风险因子，患者被鉴定为可能在二线治疗之后复发。在一些实施方案中，所述风险因子是基于疾病类型和/或遗传学，如双重命中淋巴瘤、原发性难治性癌症、或激活的B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，所述风险因子是基于临床表现，如一线治疗之后的早期复发、或治疗之后的其他不良预后指数(例如，IPI(国际预后指数)>2)。
在一些实施方案中，在供体或受试者被诊断为患有疾病之前的某一时间，收集样品(例如单采术或白细胞单采术样品)并且在细胞选择之前或在没有先前细胞选择的情况下(例如，在没有先前T细胞选择，如通过色谱法进行选择的情况下)进行低温保存和/或低温保护。在一些方面，供体或受试者可能被确定为有风险发生疾病。在一些方面，供体或受试者可以是健康的受试者。在某些情况下，供体或受试者可以选择在未被认为有发生疾病的风险或未被诊断为患有疾病的情况下储备或储存细胞，以防在生命后期需要细胞疗法。在一些实施方案中，可以基于诸如以下等因素认为供体或受试者有发生疾病的风险：基因突变、基因异常、基因破坏、家族病史、蛋白质异常(如关于蛋白质产生和/或处理的缺陷)、以及可能增加发生疾病的风险的生活方式选择。在一些实施方案中，收集细胞以作为预防剂。
通过允许供体在所述供体(以及因此其细胞)尚未经历针对疾病的广泛治疗时和/或在患上疾病或病症或其诊断之前的阶段储存其细胞，与在一轮或在多轮治疗之后收获的细胞相比，此类细胞对于在细胞疗法中的使用可能具有某些优点。例如，与已经历几轮治疗的细胞相比，在一轮或多轮治疗之前收获的细胞可能更健康、可能展现更高水平的某些细胞活性、可能更快速地生长和/或可能更容易接受基因操作。根据本文所述的实施方案的优点的另一例子可以包括便利性。例如，如果接受者以后需要供体的细胞并且当接受者以后需要它们时，通过在需要用于细胞疗法之前收集、任选地处理和储存供体的细胞，所述细胞将容易获得。这可以增加单采术实验室容量，从而为技术人员安排单采术收集过程提供更高灵活性。
在一些实施方案中，可以将低温保存的细胞(例如，选择的细胞或样品(例如，血液样品、单采术样品、白细胞单采术样品)中的细胞)储存少于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天的时间量，或少于1、2、3、4、5、6、7、8周的时间量，或至少1、2、3、4、5、6、7或8周的时间量，或超过8周。在一些实施方案中，可以将低温保存的细胞(例如，选择的细胞或样品(例如，血液样品、单采术样品、白细胞单采术样品)中的细胞)储存超过或约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、12个月或更长的时间量。在储存之后，可以解冻细胞(例如，选择的细胞或样品(例如，血液样品、单采术样品、白细胞单采术样品)中的细胞)并且可以从所述过程中的相同点恢复处理。在一些实施方案中，在进一步处理(例如在刺激条件下孵育)之前，将细胞低温保护并且储存。在特定实施方案中，在例如作为自体细胞疗法给予至受试者之前，将经培育和/或配制的群体细胞低温保护并且储存。
在特定实施方案中，例如在洗涤步骤例如以去除血浆和血小板后冷冻细胞。在一些实施方案中，在与制造和/或生成表达重组受体(例如，CAR)的细胞(例如，CD4+和/或CD8+T细胞)相关的任何步骤之前、之后和/或期间冷冻细胞。在某些实施方案中，此类步骤可以包括与生成工程化细胞相关的任何步骤，所述步骤包括但不限于选择和/或分离细胞子集(例如，CD4+和/或CD8+ T细胞)、刺激和/或扩增细胞(例如T细胞或其子集)、或转染或转导细胞。在一些实施方案中，所述细胞是在选择和/或分离细胞、刺激和/或扩增细胞、或转染或转导细胞之前，从受试者收集的单采术样品的细胞。在特定实施方案中，在完成工程化过程之后，例如在涉及分离、选择、刺激、激活、转导、转染和/或扩增的一个或多个步骤的过程之后冷冻细胞。
在一些实施方案中，将细胞悬浮在冷冻溶液(例如，低温保护剂和/或含有低温保护剂的溶液)中。在一些方面，可以使用各种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种，包括含有低温保存或玻璃化介质的冷冻溶液或含有低温保护剂的溶液。合适的低温保护剂包括但不限于二甲亚砜(DMSO)、甘油、二醇、丙二醇(propylene glycol)、乙二醇、丙二醇(propanediol)、聚乙二醇(PEG)、1,2-丙二醇(PROH)或其混合物。在一些例子中，低温保存溶液可以含有一种或多种非细胞渗透性低温保存剂，包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、多糖、单糖、藻酸盐、海藻糖、棉子糖、葡聚糖、人血清白蛋白、Ficoll、脂蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、自体血浆或其混合物。在一些实施方案中，将细胞悬浮于冷冻溶液中，其中低温保护剂的终浓度为按体积计在约1％与约20％之间、在约3％与约9％之间、或在约6％与约9％之间，每个都包含端值。在某些实施方案中，冷冻溶液中低温保护剂的最终浓度为按体积计约3％、约4％、约5％、约5.5％、约6％、约6.5％、约7％、约7.5％、约8％、约8.5％、约9％、约9.5％、或约10％。
在一些实施方案中，例如在特定细胞密度(例如，已知或受控的细胞密度)下冷冻细胞。在某些实施方案中，冷冻过程期间的细胞密度可能影响在冷冻过程期间和/或由于冷冻过程发生的细胞死亡和/或细胞损伤。例如，在特定实施方案中，细胞密度在冷冻过程期间影响与周围事物的平衡，例如渗透平衡。在一些实施方案中，这种平衡是、包括和/或导致脱水。在某些实施方案中，脱水是或包括在与冷冻溶液(例如，DMSO和/或含DMSO溶液)接触、组合和/或一起孵育的情况下发生的细胞脱水。在特定实施方案中，脱水是或包括由于细胞外空间中冰晶的成核和扩大(例如通过降低暴露于细胞的有效液体水浓度)引起的脱水。在一些实施方案中，冷冻细胞时的细胞密度导致比以不同的(例如，更高或更低的)细胞密度冷冻的细胞更慢和/或更不快的脱水。在一些实施方案中，冷冻细胞时的细胞密度导致比在相同或相似的条件下以不同(例如，更高或更低)的细胞密度冷冻的细胞慢约、或至少、或为5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、或100倍的脱水。
在一些实施方案中，低温保护剂是DMSO。在特定实施方案中，将细胞悬浮于冷冻溶液中，其中DMSO的终浓度为按体积计在约1％与约20％之间、在约3％与约9％之间、或在约6％与约9％之间，每个都包含端值。在某些实施方案中，冷冻溶液中DMSO的最终浓度为按体积计约3％、约4％、约5％、约5.5％、约6％、约6.5％、约7％、约7.5％、约8％、约8.5％、约9％、约9.5％、或约10％。
在特定实施方案中，将细胞以如下密度悬浮于冷冻溶液中：在或在约0.1×106个细胞/mL与约5,000×106个细胞/mL之间、在或在约1×106个细胞/mL与约500×106个细胞/mL之间、在或在约5×106个细胞/mL与约150×106个细胞/mL之间、在或在约10×106个细胞/mL与约70×106个细胞/mL之间、或在或在约15×106个细胞/mL与约60×106个细胞/mL之间，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述细胞是活细胞。
在某些实施方案中，将细胞以如下密度悬浮于冷冻溶液中：在或在约1×106个细胞/mL与约1×108个细胞/mL之间、在约1×106个细胞/mL与约2×107个细胞/mL之间、在约1×107个细胞/mL与约5×107个细胞/mL之间、或在约1×107个细胞/mL与5×107个细胞/mL之间，每个都包含端值。在某些实施方案中，将细胞以如下密度悬浮于冷冻溶液中：约1×106个细胞/mL、约2×106个细胞/mL、约5×106个细胞/mL、约1×107个细胞/mL、约1.5×107个细胞/mL、约2×107个细胞/mL、约2.5×107个细胞/mL、约2.5×107个细胞/mL、约2.5×107个细胞/mL、约3×107个细胞/mL、约3.5×107个细胞/mL、约4×107个细胞/mL、约4.5×107个细胞/mL、或约5×107个细胞/mL，每个都包含端值。在某些实施方案中，将细胞以在约1.5×107个细胞/mL与约6×107个细胞/mL之间(包含端值)的密度悬浮于冷冻溶液中。在某些实施方案中，将细胞以至少约1×107个细胞/mL的密度悬浮于冷冻溶液中。在特定实施方案中，将细胞以至少约1.5x 107个细胞/mL的密度悬浮于冷冻溶液中。在一些实施方案中，所述细胞是活细胞。
在一些实施方案中，将细胞冷冻在容器中。在某些实施方案中，所述容器是冷冻容器和/或低温保护容器。适合用于低温冷冻的容器包括但不限于小瓶、袋(例如，塑料袋)和罐。在特定实施方案中，将细胞(例如，相同细胞组合物(如含有CAR表达细胞的细胞组合物)的细胞)冷冻在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或超过10个单独的容器中。例如，在一些实施方案中，将细胞和/或细胞的组合物悬浮在一定体积中(例如在溶液、冷冻溶液和/或低温保护剂中)，并且所述体积大于容器的合适体积，因此将所述体积置于两个或更多个容器中。在一些实施方案中，所述体积为、为约、或小于100mL、50mL、25mL、20mL、15mL、10mL、5mL、或小于5mL，并且将细胞冷冻在两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或超过十个单独的小瓶中。在特定实施方案中，将相同体积的细胞置于每个小瓶中。在一些实施方案中，所述小瓶是相同的小瓶，例如相同构造、型号和/或制造批次的小瓶。在特定实施方案中，所述体积为、为约、或大于10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、120mL、150mL、200mL或超过200mL，并且将细胞冷冻在两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或超过十个单独的袋中。在特定实施方案中，将相同体积的细胞置于每个袋中。在一些实施方案中，所述袋是相同的袋，例如相同构造、型号和/或制造批次的袋。
在一些实施方案中，容器是小瓶。在某些实施方案中，容器是填充体积为、为约或至少0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL、16mL、17mL、18mL、19mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL、或50mL的小瓶。在一些实施方案中，小瓶具有如下的填充体积：在1mL与120mL之间、1mL与20mL之间、1mL与5mL之间、1mL与10mL之间、1mL与40mL之间、或20mL与40mL之间，每个都包含端值。在一些实施方案中，小瓶是冷冻小瓶(freezing vial)、低温保护剂小瓶和/或冷冻小瓶(cryovial)。合适的小瓶是已知的，并且包括但不限于
小瓶(Cook Regentec)，以及在美国专利号US 8,936,905、US 9,565,854和US 8,709,797(通过引用以其整体特此并入)中描述的小瓶。
在特定实施方案中，容器是袋。在某些实施方案中，容器是填充体积为、为约或至少0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL、16mL、17mL、18mL、19mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL、或50mL的袋。在一些实施方案中，袋具有如下的填充体积：在1mL与120mL之间、1mL与20mL之间、1mL与5mL之间、1mL与40mL之间、20mL与40mL之间、1mL与70mL之间、或50mL与70mL之间，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述袋填充有为、约、或小于100mL、75mL、70mL、50mL、25mL、20mL或10mL的体积。合适的袋是已知的，并且包括但不限于
冷冻袋(Miltenyi Biotec)。在某些实施方案中，体积是在室温下的体积。在一些实施方案中，体积是在如下温度的体积：在37℃与4℃之间、在16℃与27℃之间，包含端值；或为、为约、或至少16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、或37℃。在一些实施方案中，体积是在25℃的体积。
在一些实施方案中，将在1mL与20mL之间(包含端值)的体积的介质或溶液(例如，冷冻溶液)中的细胞冷冻在一个或多个小瓶中。在一些实施方案中，所述一个或多个小瓶具有在1mL与5mL之间(包含端值)的填充体积。在某些实施方案中，将在20mL与120mL之间(包含端值)的体积的介质或溶液(例如，冷冻溶液)中的细胞冷冻在一个或多个袋中。在特定实施方案中，所述一个或多个袋具有在20mL与40mL之间(包含端值)的填充体积。在一些实施方案中，将在120mL或更大的体积的介质或溶液(例如，冷冻溶液)中的细胞冷冻在一个或多个袋中。在某些实施方案中，所述一个或多个袋具有在50mL与70mL之间(包含端值)的填充体积。
在某些实施方案中，将细胞冷冻在溶液(例如，冷冻溶液)中，将所述溶液以一定表面积与体积比置于容器(例如，袋或小瓶)中。在特定实施方案中，所述表面积与体积比为从或从约0.1cm-1至100cm-1；1cm-1至50cm-1、1cm-1至20cm-1、1cm-1至10cm-1、2cm-1至10cm-1、3cm-1至7cm-1、或3cm-1至6cm-1，每个都包含端值。在特定实施方案中，所述表面积与体积比在或在约3cm-1至6cm-1之间。在一些实施方案中，所述表面积与体积比为、为约、或为至少3cm-1、4cm-1、5cm-1、6cm-1、或7cm-1。
在一些实施方案中，转移到低温保存介质与一个或多个处理步骤相关，所述处理步骤可以涉及洗涤样品(例如，工程化细胞组合物)，例如以去除介质和/或将细胞替换在适当的低温保存缓冲液或介质中以供随后冷冻。在某些实施方案中，转移至低温保存介质是在封闭和无菌系统中在临床规模水平上完全自动化的。在某些实施方案中，使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotec)进行转移至低温保存介质。
在一些实施方案中，将细胞解冻。在特定实施方案中，将细胞快速解冻，例如，在不使细胞过热或使细胞暴露如37℃以上的高温的情况下尽可能快地解冻。在一些实施方案中，快速解冻减少和/或防止细胞暴露于高浓度的低温保护剂和/或DMSO。在特定实施方案中，解冻发生的速率可能受在其中冷冻和解冻细胞的容器(例如，小瓶和/或袋)的特性的影响。在特定实施方案中，将细胞在如下的温度下解冻：为、为约、或低于37℃、35℃、32℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、或15℃，或在15℃与30℃之间、在23℃与28℃之间、或在24℃与26℃之间，每个都包含端值。在一些实施方案中，在加热块上或在水浴中解冻细胞。在某些实施方案中，不在加热块上或水浴上解冻细胞。在一些实施方案中，在室温下解冻细胞。在一些实施方案中，容器壁的厚度影响细胞解冻的速率，例如在具有厚壁的容器中的细胞解冻速率慢于在具有更薄的壁的容器中。在一些实施方案中，具有低的表面积与体积比的容器具有缓慢和/或不均匀的解冻速率。在一些实施方案中，将低温保存细胞在具有如下的表面积与体积比的容器中快速解冻：为、为约、或至少1cm-1、2cm-1、3cm-1、4cm-1、5cm-1、6cm-1、or 7cm-1、8cm-1、9cm-1、或10cm-1。在特定实施方案中，将细胞在、在约、或在少于120分钟、90分钟、60分钟、45分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、或十分钟内解冻。在一些实施方案中，将细胞解冻持续10分钟与60分钟之间、15分钟与45分钟之间、或15分钟与25分钟之间，每个都包含端值。在特定实施方案中，将细胞在、在约或在少于20分钟内解冻。
在某些实施方案中，在给予之前或在任何后续工程化和/或处理步骤之前，将解冻的细胞静置，例如孵育或培养。在一些实施方案中，在低的和/或不可检测的量的低温保护剂中或在不存在低温保护剂(例如，DMSO)的情况下静置细胞。在特定实施方案中，在洗涤步骤例如以去除低温保护剂和/或DMSO之后或之后立即静置解冻的细胞。在一些实施方案中，静置是或包括在或在约37℃下培养和/或孵育。在一些实施方案中，在不存在与任何处理或工程化步骤一起使用和/或相关的任何试剂(例如刺激试剂、珠试剂或重组细胞因子)的情况下进行静置。在一些实施方案中，将细胞静置为、为约、或至少5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、18小时、或24小时。在某些实施方案中，将细胞静置2小时、约2小时或至少2小时。
在一些实施方案中，在用于处理和/或工程化细胞的所述方法之前、期间或之后将细胞冷冻，例如低温保存。在一些实施方案中，冷冻和后续解冻步骤去除细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。然后通常将所述细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。在一些实施方案中，使用控制速率的冷冻机以约1°/分钟的速率主动和/或有效地冷却细胞。在一些实施方案中，可以用控制速率的冷冻机来冷冻细胞。在一些方面，使用控制速率的冷冻机以程序化冷却曲线(具有多个冷却和/或加热速率的曲线)来冷冻细胞。可以将此类冷冻曲线程序化以控制成核，例如形成冰，例如以减少细胞内冰形成。
在一些实施方案中，在低温保护剂的存在下冷冻的和/或以特定体积或表面积与体积比填充到容器中的冷冻细胞(包括如所描述的任何细胞和组合物，例如特定浓度或细胞密度的细胞组合物)的特征包括：与用替代手段冷冻的细胞相比，改善的、增加的和/或更快的扩增；改善的、增加的和/或增强的细胞存活率和减少的细胞死亡(例如坏死、程序性细胞死亡和/或凋亡)的实例；改善的、增强的和/或增加的活性(例如细胞溶解活性)；和/或减少的解冻之后的衰老或静止的实例。
在特定实施方案中，将细胞以本文提供的细胞密度和/或表面积与体积比冷冻，并且具有如与在相同或相似条件下以不同的细胞密度和/或不同的表面积与体积比冷冻的细胞相比减少的在冷冻、低温冷冻和/或低温保存期间的和/或由于冷冻、低温冷冻和/或低温保存引起的细胞死亡(例如，坏死和/或凋亡)。在特定实施方案中，将细胞以本文提供的细胞密度和/或表面积与体积比冷冻，并且具有减少的、延迟的细胞死亡，例如，在冷冻、低温冷冻和/或低温保存之后48小时内，例如在解冻冷冻细胞之后，例如经由坏死、程序性细胞死亡或凋亡而死亡的细胞的量的减少。在某些实施方案中，如与在相同或相似条件下以不同的细胞密度和/或不同的表面积与体积比冷冻的细胞相比，少至少或约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％的细胞在冷冻和/或低温保存期间死亡和/或由于冷冻和/或低温保存而死亡。在某些实施方案中，少于40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％、0.1％或0.01％的以所提供的细胞密度和/或表面积与体积比冷冻的细胞在冷冻、低温冷冻和/或低温保存期间死亡或由于冷冻、低温冷冻和/或低温保存而死亡。
在一些实施方案中，将细胞以本文提供的细胞密度和/或表面积与体积比冷冻，并且具有如与在相同或相似条件下以不同的细胞密度和/或不同的表面积与体积比冷冻的细胞相比减少的由于冷冻、低温冷冻和/或低温保存所致和/或由于冷冻、低温冷冻和/或低温保存引起的衰老或静止的例子。在特定实施方案中，如与在相同或相似条件下以不同的细胞密度和/或不同的表面积与体积比冷冻的细胞相比，少至少或约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％的细胞是衰老和/或静止的细胞。在某些实施方案中，将细胞以所提供的细胞密度和/或表面积与体积比冷冻，并且少于40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％、0.1％或0.01％的细胞由于冷冻、低温冷冻和/或低温保存而变得衰老和/或静止。
在某些实施方案中，将细胞以本文提供的细胞密度和/或表面积与体积比冷冻，例如低温保存，并且如与在相同或相似条件下以不同的细胞密度和/或表面积与体积比冷冻的细胞相比，在将细胞解冻之后，例如在刺激条件下，例如通过与本文描述的刺激试剂一起孵育，具有改善的、更快的和/或更快速的扩增。在特定实施方案中，如与在相同或相似的条件下以不同的细胞密度和/或不同的表面积与体积比冷冻的细胞相比，细胞以为、为约或为至少5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、或10倍更快的和/或更快速的速率扩增。例如，在一些实施方案中，与在相同或相似的条件下以不同的细胞密度和/或不同的表面积与体积比冷冻的解冻细胞相比，解冻的细胞在为、为约、或至少5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％更少的时间内达到阈值扩增，例如预定的细胞数量、密度或倍数(如2倍扩增)。
在一些实施方案中，将细胞以所述细胞密度冷冻，例如低温保存，并且如与在相同或相似的条件下以不同的细胞密度(例如，更高或更低的密度)冷冻的细胞相比，在将细胞解冻之后具有改善的、增加的和/或更高的细胞溶解活性，例如，如通过用于测量本文所述的细胞溶解活性的任何测定测量的。在特定实施方案中，如与在相同或相似的条件下以不同的密度冷冻的细胞相比，细胞溶解活性增加、增加约、或增加至少5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、或10倍。用于低温储存和处理来自样品(如单采术样品)的细胞的示例性方法和系统可以包括国际公开的申请号WO 2018170188中所述的那些。在一些实施方案中，所述方法和系统涉及在患者需要细胞疗法之前收集单采术，然后使单采术样品经历低温保存以供之后用于用重组受体(例如CAR)工程化细胞(例如T细胞)的过程中。在一些情况下，此类过程可以包括本文所述的那些。在一些实施方案中，从受试者收集单采术样品并且进行低温保存，之后对细胞群进行后续T细胞选择、激活、刺激、工程化、转导、转染、孵育、培养、收获、配制，和/或将经配制的细胞群给予至受试者。在此类例子中，使低温保存的单采术样品解冻，之后使所述样品经历一个或多个选择步骤，如本文所述的任何选择步骤。
在一些实施方案中，使低温保存和/或低温保护的细胞样品(例如单采术或白细胞单采术样品)，如尚未经历先前细胞选择(例如，没有先前T细胞选择，如通过色谱法进行的选择)的细胞样品解冻，之后将其用于制造用于细胞疗法的细胞群(例如，含有CAR+ T细胞的T细胞群)的下游过程。在一些实施方案中，将这种低温保存和/或低温保护的细胞样品(例如单采术或白细胞单采术样品)与本文所提供的用于工程化T细胞疗法(如CAR+ T细胞疗法)的过程结合使用。在特定例子中，在收获/配制步骤之前或期间不进行进一步的低温保存步骤。
1.输入组合物的特征
在一些实施方案中，输入组合物包含从生物样品，例如单采术样品、白细胞单采术样品分离或选择的T细胞。在一些实施方案中，可以根据本文所述的方法中的任一种低温保存输入组合物。在特定实施方案中，输入组合物包含经富集CD3+ T细胞，例如活的CD3+ T细胞的群体。在一些实施方案中，输入组合物中的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％、或100％或约100％的细胞是CD3+ T细胞，例如活的CD3+ T细胞。在一些实施方案中，输入组合物基本上由CD3+ T细胞，例如活的CD3+ T细胞组成。在一些实施方案中，输入组合物富含CD4+细胞和/或富含CD8+细胞。
在某些实施方案中，输入组合物是富含经富集CD4+ T细胞和CD8+ T细胞(例如CD4+ T细胞和CD8+ T细胞)的细胞群。在特定实施方案中，输入组合物是或包括至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％、或100％或约100％的为CD4+或CD8+ T细胞的细胞。在一些实施方案中，输入组合物基本上由CD4+和CD8+ T细胞组成。
在某些实施方案中，输入组合物是经富集CD4+ T细胞的群体。在特定实施方案中，输入组合物中的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％、或100％或约100％的细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，输入组合物基本上由CD4+ T细胞组成。
在某些实施方案中，输入组合物是经富集CD8+ T细胞的群体。在特定实施方案中，输入组合物中的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％、或100％或约100％的细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，输入组合物基本上由CD8+ T细胞组成。
在一些实施方案中，将来自经富集CD4+ T细胞的群体的细胞和来自经富集CD8+ T细胞的群体的细胞混合、合并、和/或汇集，以产生含有CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的输入组合物。在某些实施方案中，将经富集CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的群体汇集、混合、和/或合并，之后刺激细胞，例如如章节II-B中所述的在刺激条件下培养细胞。在某些实施方案中，在从生物样品中分离、富集、和/或选择CD4+和CD8+ T细胞之后将经富集CD4+和CD8+ T细胞的群体汇集、混合、和/或合并。在特定实施方案中，在冷冻(例如低温保存)并解冻经富集CD4+和CD8+ T细胞的群体之后将经富集CD4+和CD8+ T细胞的群体合并、混合、和/或合并。
在某些实施方案中，通过将来自经富集CD4+细胞的群体的细胞与来自经富集CD8+细胞的群体的细胞混合、汇集、和/或合并来产生、生成、或制造输入组合物。在某些实施方案中，所述经富集CD4+ T细胞的群体含有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％CD4+T细胞。在特定实施方案中，所述经富集CD4+ T细胞的群体含有100％CD4+T细胞或含有约100％CD4+ T细胞。在某些实施方案中，所述经富集T细胞的群体包含或含有少于20％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述细胞群基本上由CD4+ T细胞组成。在某些实施方案中，所述经富集CD8+ T细胞的群体含有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％CD8+ T细胞，或者含有或含有约100％CD8+T细胞。在某些实施方案中，所述经富集CD8+ T细胞的群体包含或含有少于20％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述细胞群基本上由CD8+T细胞组成。
在某些实施方案中，将CD4+ T细胞和CD8+ T细胞以如下的CD4+ T细胞与CD8+ T细胞比率汇集、混合、和/或合并：在1:10与10:1之间、在1:5与5:1之间、在4:1与1:4之间、在1:3与3:1之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.25:1与1:1.25、在1.2:1与1:1.2之间、在1.1:1与1:1.1之间、或约1:1或1:1。在特定实施方案中，将活的CD4+ T细胞和活的CD8+T细胞以如下的CD4+ T细胞与CD8+ T细胞比率汇集、混合、和/或合并：在1:10与10:1之间、在1:5与5:1之间、在4:1与1:4之间、在1:3与3:1之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.25:1与1:1.25、在1.2:1与1:1.2之间、在1.1:1与1:1.1之间、或约1:1或1:1。
在特定实施方案中，输入组合物含有不对凋亡标记呈阳性的细胞(例如，T细胞)。在一些实施方案中，凋亡标记是膜联蛋白V和/或激活的半胱天冬酶3。在一些实施方案中，输入组合物中包含的细胞包括或是膜联蛋白V-、膜联蛋白V-/CD3+、膜联蛋白V-/CD4+、膜联蛋白V-/CD8+、膜联蛋白V-/CD3+、激活的半胱天冬酶3-、激活的半胱天冬酶3-/CD3+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+、或其组合。
在一些实施方案中，输入组合物含有目标数量或百分比(例如，不大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％)的不表达凋亡标记(例如，半胱天冬酶-3、膜联蛋白V)的T细胞。在一些实施方案中，输入组合物含有目标数量或百分比的在刺激后产生细胞因子的T细胞。在一些实施方案中，所述刺激不是重组受体(例如，CAR)抗原特异性的，例如，涉及PMA/离子霉素的刺激。在一些实施方案中，产生的细胞因子是或包括IL-2、TNFα和/或IFNg。在一些实施方案中，产生的细胞因子是或包括IL-2和/或TNFα。在一些实施方案中，所述方法涉及提供、产生或生成输入组合物。在一些实施方案中，输入组合物包含目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞。在一些实施方案中，输入组合物含有不表达凋亡标记(例如，半胱天冬酶-3、膜联蛋白V)的T细胞。
在一些方面，可以通过从来自受试者的生物样品提供含有目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞的细胞组合物来产生输入组合物。在一些方面，可以通过从来自受试者的生物样品提供含有目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞的细胞组合物来产生输入组合物。在一些方面，可以在以下步骤之后产生输入组合物：确定表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量、和/或百分比，并且选择特定数量、体积或重量的如下细胞：在与另外的组分混合后，含有目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞。在一些方面，可以通过将含有CD4+T细胞的细胞组合物与含有CD8+T细胞的细胞组合物混合来产生输入组合物。在一些实施方案中，可以在以下步骤之后产生输入组合物：确定表达或不表达CCR7、CD27、CD45RA和/或凋亡标记(例如，半胱天冬酶3、膜联蛋白V)的CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27、CD45RA和/或凋亡标记(例如，半胱天冬酶3、膜联蛋白V)的CD4+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量、和/或百分比，并且选择的特定数量、体积或重量的如下细胞：在与另外组分混合后含有目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27、CD45RA和/或凋亡标记(例如，半胱天冬酶3、膜联蛋白V)的CD8+T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27、CD45RA和/或凋亡标记(例如，半胱天冬酶3、膜联蛋白V)的CD4+T细胞。
在一些实施方案中，输入组合物可以通过以下方式产生：从获自受试者的生物样品中分离、纯化、分开或选择目标数量的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标数量的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞，从而产生输入组合物。在一些实施方案中，输入组合物可以通过以下方式产生：从获自受试者的生物样品中分离、纯化、分开或选择目标数量的表达或不表达CCR7、CD27、CD45RA和/或凋亡标记(例如，半胱天冬酶3、膜联蛋白V)的CD8+T细胞和/或目标数量的表达或不表达CCR7、CD27、CD45RA和/或凋亡标记(例如，半胱天冬酶3、膜联蛋白V)的CD4+T细胞，从而产生输入组合物。在一些方面，可以将所述一种或多种目标数量的细胞合并或混合以产生包含目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞的输入组合物。在一些方面，可以将所述一种或多种目标数量的细胞合并或混合以产生包含目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27、CD45RA和/或凋亡标记(例如，半胱天冬酶3、膜联蛋白V)的CD8+T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27、CD45RA和/或凋亡标记(例如，半胱天冬酶3、膜联蛋白V)的CD4+T细胞的输入组合物。
在一些方面，所述输入组合物包含目标百分比的CD4+/CCR7+、CD4+/CD27+、CD4+/CCR7+/CD27+、CD4+/CCR7+/CD45RA-、CD4+/CCR7+/CD45RA+、CD8+/CCR7+、CD8+/CD27+、CD8+/CCR7+/CD27+、CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或CD8+/CCR7+/CD45RA+细胞。在一些方面，所述输入组合物包含目标百分比的CD4+/CCR7+、CD4+/CD27+、CD4+/CCR7+/CD27+、CD4+/CCR7+/CD45RA-、CD4+/CCR7+/CD45RA+、CD8+/CCR7+、CD8+/CD27+、CD8+/CCR7+/CD27+、CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或CD8+/CCR7+/CD45RA+和凋亡标记阴性(例如膜联蛋白V–或半胱天冬酶3–)细胞。
在一些实施方案中，输入组合物含有CD4+T细胞和CD8+T细胞。在某些实施方案中，输入组合物CD4+和/或CD8+T细胞的一种或多种亚型或群体。在某些实施方案中，所述一种或多种亚型或群体包括表达(例如在细胞的表面上表达)或不表达与某些细胞表型相关的一种或多种标记的细胞，所述一种或多种标记包括与分化程度较低的细胞表型相关或指示分化程度较低的细胞表型的标记和/或与记忆细胞亚型相关或指示记忆细胞亚型的标记。在特定实施方案中，输入组合物含有CD4+T细胞，并且至少一部分的CD4+T细胞表达与分化程度较低的表型相关的标记，如CCR7和/或CD27。在一些实施方案中，输入组合物含有CD8+T细胞，并且至少一部分的CD8+T细胞表达与分化程度较低的表型相关的标记，如CCR7和/或CD27。在特定实施方案中，输入组合物含有和/或具有固定、优选、目标、限定和/或受控百分比或比率的展现特定表型的细胞，例如目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞。
在某些实施方案中，所述方法包括混合或合并细胞或细胞组合物以生成或产生输入组合物的一个或多个步骤。在某些实施方案中，细胞或细胞组合物是已从样品中选择和/或分离的。在一些实施方案中，输入组合物的细胞是已从样品中选择和/或分离的。在一些实施方案中，CD4+T细胞和/或CD4+T细胞的组合物是从样品中选择或分离的。在一些实施方案中，CD8+T细胞和/或CD8+T细胞的组合物是从样品中选择或分离的。在一些实施方案中，样品是生物样品，如血液样品、单采术样品和/或白细胞单采术样品。在某些实施方案中，样品来自受试者，例如人受试者。在特定实施方案中，CD4+T细胞的组合物和CD8+T细胞的组合物是从相同样品中分离和/或选择的。在某些实施方案中，CD4+T细胞的组合物和CD8+T细胞的组合物是从取自或获得自同一受试者的样品中分离和/或选择的。
在一些实施方案中，输入组合物的生成或产生包括评估、表征、和/或鉴定细胞的一个或多个步骤。在特定实施方案中，在CD4+T细胞的组合物中对细胞进行评估、表征、和/或鉴定。在一些实施方案中，在CD8+T细胞的组合物中对细胞进行评估、表征、和/或鉴定。在一些实施方案中，细胞对指示分化程度较低的细胞表型或状态和/或与分化程度较低的细胞表型或状态相关的标记和/或与记忆细胞亚型相关或指示记忆细胞亚型的标记呈阳性。在某些实施方案中，细胞对指示T细胞中分化程度较高的状态和/或与T细胞中分化程度较高的状态相关的标记呈阴性。在特定实施方案中，评估、表征、和/或鉴定来自CD4+和CD8+T细胞组合物的细胞以确定对一种或多种与分化程度较低的细胞表型或状态相关的标记和/或与记忆细胞亚型相关或指示记忆细胞亚型的标记呈阳性和/或对一种或多种与分化程度较高的状态相关的标记呈阴性的细胞的量、水平、部分、和/或百分比。在某些实施方案中，评估、表征、和/或鉴定来自CD4+和CD8+T细胞组合物的细胞以确定展现特定表型的细胞的量、水平、部分、和/或百分比，所述特定表型例如与分化程度较低的细胞表型或状态相关的标记和/或与记忆细胞亚型相关或指示记忆细胞亚型的标记的表达或缺乏表达。
在一些实施方案中，所述方法包括以下的一个或多个步骤：将含有CD4+T细胞的细胞组合物与含有CD8+T细胞的细胞组合物混合或合并，以生成或产生具有目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞的细胞组合物，例如输入组合物。在一些实施方案中，输入组合物的生成或产生包括以下中的一个或多个步骤：(i)从样品，例如生物样品中分离或选择CD4+T细胞的组合物和/或CD8+T细胞的组合物；(ii)在CD4+和/或CD8+T细胞中评估、表征和/或鉴定对一种或多种如下标记呈阳性或阴性的细胞的量、水平、部分、和/或百分比：与分化程度较低的细胞表型或状态相关的标记和/或与记忆细胞亚型或分化程度较高的亚型相关或指示记忆细胞亚型或分化程度较高的亚型的标记，例如CCR7、CD27和/或CD45RA；和/或(iii)在输入组合物中将CD4+T细胞的组合物的细胞与CD8+T细胞的组合物的细胞以目标、限定、固定和/或优选百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的T细胞和/或目标、限定、固定和/或优选百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞混合或合并，所述比率与样品中存在的比率不同。
在一些方面，输入组合物中目标百分比的CD4+/CCR7+、CD4+/CD27+、CD4+/CCR7+/CD27+、CD4+/CCR7+/CD45RA-、CD4+/CCR7+/CD45RA+、CD8+/CCR7+、CD8+/CD27+、CD8+/CCR7+/CD27+、CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或CD8+/CCR7+/CD45RA+细胞包括：所述输入组合物中总细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述输入组合物中总细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是CD4+/CCR7+、CD4+/CD27+、CD4+/CCR7+/CD27+、CD4+/CCR7+/CD45RA-、CD4+/CCR7+/CD45RA+、CD8+/CCR7+、CD8+/CD27+、CD8+/CCR7+/CD27+、CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或CD8+/CCR7+/CD45RA+。
在一些实施方案中，输入组合物中目标百分比的CCR7+、CD27+和/或CCR7+/CD27+细胞是：所述输入组合物中总细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述输入组合物中总细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是CCR7+、CD27+和/或CCR7+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括对输入组合物的细胞进行基因工程化的一个或多个步骤。在一些实施方案中，基因工程化包括以下中的一个或多个步骤：在激活和/或刺激细胞的条件下孵育输入组合物的细胞，将包含核酸分子(例如，重组和/或异源核酸分子)的一种或多种药剂递送至细胞，通过在激活或刺激条件下孵育细胞来扩增细胞，收获细胞，和/或通过冷冻(例如，低温保存)来储存细胞。在一些实施方案中，基因工程化的所述一个或多个步骤产生含有工程化细胞的输出细胞组合物。在某些实施方案中，输出组合物的工程化细胞具有固定、限定和/或目标比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
B.细胞的激活和刺激
在一些实施方案中，所述一个或多个处理步骤包括刺激分离的细胞(如所选择细胞群)的步骤。在一些实施方案中，在基因工程化之前或与基因工程化结合孵育和/或培养细胞。所述孵育可以在基因工程化(如由上文所述的转导方法的实施方案产生的基因工程化)之前或与所述基因工程化结合。在一些实施方案中，例如在转导之前，所述刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。孵育和/或工程化可以在培养器皿中进行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或用于培养或培育细胞的其他容器。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂存在下孵育组合物或细胞。此类条件包括设计用于以下的那些条件：诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露，和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)。
在一些实施方案中，处理步骤包括孵育细胞，如所选择细胞，其中孵育步骤可以包括对细胞的培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂存在下孵育组合物或细胞。此类条件包括设计用于以下的那些条件：诱导群体中的细胞的增殖、激活和/或存活，模拟抗原暴露，和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)。
在一些实施方案中，用于刺激和/或激活的条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和经设计以激活细胞的任何其他药剂))。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够刺激或激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些方面，所述药剂开启或启动T细胞中的TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括适合于递送初级信号，例如以启动ITAM诱导的信号的激活的药剂，如抗体，如对TCR具有特异性的那些，例如抗CD3。在一些实施方案中，刺激条件包括能够刺激共刺激受体的一种或多种药剂(例如配体)，例如抗CD28或抗4-1BB。在一些实施方案中，此类药剂和/或配体可以与固体支持物(如珠)和/或一种或多种细胞因子结合。所述刺激剂包括抗CD3/抗CD28珠(例如，
M-450CD3/CD28 T细胞扩增器和/或
珠)。任选地，扩增方法可以进一步包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)的步骤。在一些实施方案中，所述刺激剂包括IL-2、IL-7和/或IL-15，例如，IL-2浓度为至少约10单位/mL、至少约50单位/mL、至少约100单位/mL或至少约200单位/mL。
在一些实施方案中，所述一种或多种刺激剂能够激活T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞；能够诱导通过TCR复合物的信号；和/或能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的增殖。在一些实施方案中，所述一种或多种刺激剂包含与TCR复合物的成员结合、任选地与CD3特异性地结合的一级药剂。在一些实施方案，所述一种或多种刺激剂进一步包含与T细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂。在一些实施方案中，所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。在一些实施方案中，所述一级和二级药剂包含抗体，任选地其中所述一种或多种刺激剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体一起孵育。在一些实施方案中，所述一种或多种刺激剂存在于固体支持物(任选地珠)的表面上。在一些实施方案中，所述一种或多种刺激剂选自CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7，包含由抗原受体特异性地识别的抗原的疫苗，以及特异性地结合抗原受体的抗独特型抗体或其组合。
所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和经设计以激活细胞的任何其他药剂))。
在实施方案中，通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+ T细胞。例如，可以通过从被感染的受试者分离T细胞并在体外用相同抗原刺激所述细胞，产生针对巨细胞病毒抗原的抗原特异性T细胞系或克隆。
在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，例如以下文献中所述的那些技术：Riddell等人的美国专利号6,040,177；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651–660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常为或约37摄氏度。任选地，孵育可以进一步包括添加非分裂EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐照LCL。在一些方面，LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
在一些实施方案中，在一种或多种刺激条件或刺激剂存在下进行的孵育的至少一部分是在离心室的内部空腔中进行，例如在离心旋转下进行，如国际公开号WO 2016/073602中所述的。在一些实施方案中，在离心室中进行的孵育的至少一部分包括与一种或多种试剂混合以诱导刺激和/或激活。在一些实施方案中，将细胞(如经选择细胞)与刺激条件或刺激剂在离心室中混合。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的一种或多种刺激条件或刺激剂混合，所述量远小于在细胞培养板或其他系统中进行类似刺激时通常使用的量。
在一些实施方案中，将刺激剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与例如在周期性振荡或旋转的管或袋中进行选择而不在离心室中混合时，实现相同数量的细胞或相同体积的细胞的大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的刺激剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和刺激剂中添加孵育缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如约10mL至约200mL，或约20mL至约125mL，如至少或约至少或约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、105mL、110mL、115mL、120mL、125mL、130mL、135mL、140mL、145mL、150mL、160mL、170mL、180mL、190mL或200mL试剂的孵育的目标体积。在一些实施方案中，在添加至细胞之前预先混合孵育缓冲液和刺激剂。在一些实施方案中，将孵育缓冲液和刺激剂单独添加至细胞中。在一些实施方案中，在周期性温和混合条件下进行刺激孵育，这可能有助于促进能量上有利的相互作用，并且从而允许在实现细胞的刺激和激活的同时使用较少的总体刺激剂。
在一些实施方案中，所述孵育通常在混合条件下进行，如在旋转存在下进行，通常以相对低的力或速度旋转，如速度低于用于使细胞沉淀的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如，为或约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，如在室或其他容器的样品或壁处的一定RCF下，所述RCF是从80g至100g或从约80g至约100g(例如，为或约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，所述旋转是使用如下重复间隔来进行：以这种低速旋转，之后是停歇时间段，例如旋转和/或停歇1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后停歇大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，例如与刺激剂一起孵育的总持续时间在或在约1小时与96小时之间、1小时与72小时之间、1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间、18小时与30小时之间或12小时与24小时之间，如至少或约至少或约6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些实施方案中，进一步孵育进行如下时间：在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间，包含端值。
C.基因工程化
在一些实施方案中，处理步骤包括引入编码重组蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，将细胞(例如T细胞)基因工程化以表达重组受体。此类重组蛋白包括重组受体，如章节III中描述的任一种。在一些实施方案中，通过引入编码重组受体的多核苷酸来进行工程化。还提供了编码重组受体的多核苷酸，以及含有此类核酸和/或多核苷酸的载体或构建体。将编码重组受体(如重组受体)的核酸分子引入细胞中可以使用许多已知载体中的任何一种进行。此类载体包括病毒和非病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统，以及基于转座子的系统，如基于PiggyBac或Sleeping Beauty的基因转移系统。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔。
在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入编码转基因受体(如CAR)的核酸的细胞可以从样品(如生物样品，例如，从受试者获得或衍生的生物样品)中分离。在一些实施方案中，分离出所述细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将给予细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要特定治疗性干预(如所分离、处理和/或工程化的细胞所用于的过继细胞疗法)的人。
在某些实施方案中，在例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞之前，对细胞的组合物进行工程化，例如转导或转染。在特定实施方案中，在已经在刺激条件下刺激、激活和/或孵育组合物之后，对细胞的组合物进行工程化。在特定实施方案中，所述组合物是经刺激组合物。在特定实施方案中，所述经刺激组合物先前已进行低温保存和储存，并在工程化之前解冻。
在一些实施方案中，通过如下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将其与诱导反应(如增殖、存活和/或激活，例如如通过细胞因子或激活标记的表达测量的)的刺激物组合，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(如例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体和人免疫缺陷病毒(HIV))将重组核酸转移至细胞中。
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，经由转座将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,纽约.纽约州中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中描述的那些。
在一些实施方案中，细胞(例如，T细胞)可以在扩增期间或之后例如用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)进行转染。例如，这种用于引入所需受体的基因的转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使基因修饰的细胞群摆脱初始刺激物(例如CD3/CD28刺激物)，并随后用第二种类型的刺激物例如经由从头引入的受体进行刺激。所述第二种类型的刺激物可以包括肽/MHC分子形式的抗原刺激物、基因引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66或Barrett等人,ChimericAntigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。
在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些此类情形中，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后将细胞工程化，并且在一些情况下在培养的至少一部分的同时或期间将细胞工程化。
在一些方面，细胞被进一步工程化以促进细胞因子或其他因子的表达。另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括：用于改进治疗功效的那些，如通过促进所转移细胞的活力和/或功能；用于提供用于选择和/或评价细胞(如用于评估体内存活或定位)的遗传标记的基因；用于改进安全性的基因，例如通过使细胞在体内对阴性选择敏感，如以下文献中所述：Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human GeneTherapy3:319-338(1992)；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的公开，所述文献描述了使用通过将显性阳性选择性标记与阴性选择性标记融合而衍生的双功能选择性融合基因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177，第14-17栏。
在一些实施方案中，所述引入通过使组合物的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如，重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，所述接触可以通过离心如旋转接种(例如离心接种)来实现。所述方法包括如国际公开号WO 2016/073602中所述的任何方法。示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于
和
2系统的那些，包括A-200/F和A-200离心室以及用于此类系统的各种试剂盒。示例性室、系统和处理仪器和机柜描述于例如以下文献中：美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和公开的美国专利申请公开号US 2008/0171951，以及公开的国际专利申请公开号WO 00/38762，将其各自的内容通过引用以其整体并入本文。用于此类系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioSafe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2销售的一次性试剂盒。
在一些实施方案中，将系统与其他仪器一起包括和/或置于与其他仪器相关联，所述其他仪器包括用于操作、自动化、控制和/或监测转导步骤以及在系统中进行的一个或多个各种其他处理步骤(例如，可以使用或结合如本文或在国际公开号WO 2016/073602中描述的离心室系统进行的一个或多个处理步骤)的方面的仪器。在一些实施方案中，这种仪器容纳于机柜中。在一些实施方案中，所述仪器包括机柜，所述机柜包括外壳，所述外壳含有控制电路、离心机、罩、电机、泵、传感器、显示器和用户界面。示例性装置描述于美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和US 2008/0171951中。
在一些实施方案中，所述系统包含一系列容器，例如袋、管路、旋塞、夹子、连接器和离心室。在一些实施方案中，容器(如袋)包括一个或多个容器(如袋)，其在同一容器或单独的容器(如同一袋或单独的袋)中含有待转导的细胞和病毒载体颗粒。在一些实施方案中，所述系统进一步包括一个或多个容器(如袋)，所述容器含有介质，如稀释剂和/或洗涤溶液，在所述方法期间将所述介质抽入室和/或其他部件中以稀释、重悬和/或洗涤组分和/或组合物。所述容器可以连接在系统中的一个或多个位置，例如连接在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废液管线和/或输出管线的位置。
在一些实施方案中，所述室与离心机相关联，离心机能够实现所述室的旋转，例如围绕其旋转轴旋转。旋转可以发生在与细胞的转导结合的孵育之前、期间和/或之后和/或在一个或多个其他处理步骤中。因此，在一些实施方案中，各个处理步骤中的一个或多个在旋转下(例如在特定的力下)进行。所述室通常能够竖直或大致竖直地旋转，使得所述室在离心期间竖直放置，并且侧壁和轴是竖直或大致竖直的，且一个或多个端壁是水平或大致水平的。
在一些实施方案中，可以使含有细胞、病毒颗粒和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，如速度低于用于沉淀细胞的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如为或约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转是以从100g至3200g或从约100g至约3200g(例如为或约或至少或至少约100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如，相对离心力)来进行，所述力如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为在如与旋转轴相比在空间的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。所述值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(旋转轴与测量RCF的物体、物质或颗粒之间的距离)。
在一些实施方案中，在基因工程化(例如转导)的至少一部分期间，和/或在基因工程化之后，将细胞转移到容器(如袋，例如生物反应器袋组件)中，以用于培养经基因工程化的细胞，如用于培育或扩增细胞，如上所述。在一些实施方案中，用于培育或扩增细胞的容器是生物反应器袋，如灌注袋。
1.载体和方法
在一些实施方案中，处理步骤包括将编码重组蛋白的核酸分子引入细胞中，并且可以使用许多已知载体中的任何一种进行。在一些实施方案中，载体含有编码重组受体的核酸。在特定实施方案中，载体是病毒载体、非病毒载体。在一些情况下，载体是病毒载体，如逆转录病毒载体，例如慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
在一些情况下，编码重组受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。信号肽的非限制性示例性例子包括，例如，GMCSFRα链信号肽、CD8α信号肽或CD33信号肽。
在一些实施方案中，载体包括病毒载体(例如逆转录病毒或慢病毒)、非病毒载体或转座子，例如Sleeping Beauty转座子系统；源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体；慢病毒载体或逆转录病毒载体，如γ-逆转录病毒载体，源自莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，病毒载体或非病毒DNA含有编码异源重组蛋白的核酸。在一些实施方案中，异源重组分子是或包括重组受体(例如抗原受体)、SB转座子(例如用于基因沉默)、衣壳包封的转座子、同源双链核酸(例如用于基因组重组)或报告基因(例如荧光蛋白，如GFP)或萤光素酶。
2.用于转导的病毒载体颗粒的制备
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如像源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29(11):550-557。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、或脾病灶形成病毒(SFFV)的逆转录病毒载体。在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已描述许多说明性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740、6,207,453、5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下文献中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒含有源自基于逆转录病毒基因组的载体(例如源自基于慢病毒基因组的载体)的基因组。在所提供的病毒载体的一些方面，编码重组受体(如CAR)的异源核酸含于和/或位于载体基因组的5'LTR与3'LTR序列之间。
在一些实施方案中，病毒载体基因组是慢病毒基因组，如HIV-1基因组或SIV基因组。例如，已经通过多次减弱毒力基因生成慢病毒载体，例如，可以使基因env、vif、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是已知的。参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等,(1997)；Dull等人,1998,美国专利号号6,013,516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸、用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中的必需序列。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801UniversityBlvd.，马纳萨斯，维吉尼亚州20110-2209)获得，或使用常用技术从已知来源分离。
慢病毒载体的非限制性例子包括源自慢病毒的那些，例如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、HTLV-2或马感染贫血病毒(E1AV)。例如，已经通过多次减弱HIV毒力基因生成慢病毒载体，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998，美国专利号6,013,516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸、用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中的必需序列。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801University Blvd.，马纳萨斯，维吉尼亚州20110-2209)获得，或使用常用技术从已知来源分离。
病毒载体基因组通常以质粒形式构建，其可以转染到包装细胞系或生产细胞系中。在任何此类例子中，将编码重组蛋白(如重组受体)的核酸插入或定位于病毒载体的区域中，如通常在病毒基因组的非必需区域中。在一些实施方案中，将核酸插入病毒基因组的某些病毒序列的位置中以产生具有复制缺陷的病毒。
可以使用多种已知方法中的任何一种来产生逆转录病毒颗粒，其基因组含有病毒载体基因组的RNA拷贝。在一些实施方案中，至少两种组分参与制备基于病毒的基因传递系统：第一，包装质粒，包括结构蛋白以及生成病毒载体颗粒所必需的酶，第二，病毒载体本身，即，要转移的遗传物质。可以在设计这些组分中的一个或两个时引入生物安全保护措施。
在一些实施方案中，包装质粒可以含有除了包膜蛋白以外的所有逆转录病毒(如HIV-1)蛋白(Naldini等人，1998)。在其他实施方案中，病毒载体可能缺乏另外的病毒基因(例如与毒力有关的那些，例如vpr、vif、vpu和nef)和/或Tat(HIV的主要反式激活因子)。在一些实施方案中，慢病毒载体(例如基于HIV的慢病毒载体)仅包含亲本病毒的三种基因：gag、pol和rev，这减少或消除了野生型病毒通过重组而重构的可能性。
在一些实施方案中，将病毒载体基因组引入包装细胞系中，所述细胞系含有将从病毒载体基因组转录的病毒基因组RNA包装至病毒颗粒中所需的所有组分。可替代地，除了一种或多种目的序列(例如重组核酸)以外，病毒载体基因组可包含一种或多种编码病毒组分的基因。然而，在一些方面，为了防止基因组在靶细胞中复制，将复制所需的内源病毒基因去除，并在包装细胞系中单独提供。
在一些实施方案中，用一种或多种含有生成所述颗粒所需组分的质粒载体转染包装细胞系。在一些实施方案中，用含有病毒载体基因组(包括LTR、顺式作用包装序列和目的序列，即编码抗原受体(例如CAR)的核酸)的质粒；以及编码病毒酶和/或结构组分(例如Gag、pol和/或rev)的一种或多种辅助质粒转染包装细胞系。在一些实施方案中，利用多种载体分离生成逆转录病毒载体颗粒的各种遗传组分。在一些此类实施方案中，向包装细胞提供单独的载体减少了原本可能生成有复制能力的病毒的重组事件的机会。在一些实施方案中，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单一质粒载体。
在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)用VSV-G糖蛋白假型化，其提供宽细胞宿主范围，从而扩展可以转导的细胞类型。在一些实施方案中，用编码非天然包膜糖蛋白的质粒或多核苷酸转染包装细胞系，以例如包括嗜异性，多嗜性或双嗜性包膜，例如辛德毕斯病毒(Sindbis virus)包膜、GALV或VSV-G。
在一些实施方案中，包装细胞系提供将病毒基因组RNA包装至慢病毒载体颗粒中反式需要的组分，包括病毒调节蛋白和结构蛋白。在一些实施方案中，包装细胞系可以是能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体颗粒的任何细胞系。在一些方面，合适的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、293T、HeLA(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCCCCL 34)、BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。
在一些实施方案中，包装细胞系稳定地表达一种或多种病毒蛋白质。例如，在一些方面，可以构建含有gag、pol、rev和/或其他结构基因但不含LTR和包装组分的包装细胞系。在一些实施方案中，可以用编码一种或多种病毒蛋白的核酸分子以及含有编码异源蛋白的核酸分子的病毒载体基因组和/或编码包膜糖蛋白的核酸对包装细胞系进行瞬时转染。
在一些实施方案中，将病毒载体和包装质粒和/或辅助质粒通过转染或感染引入包装细胞系中。包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体颗粒。用于转染或感染的方法是熟知的。非限制性例子包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖和脂质转染方法、电穿孔和显微注射。
在将重组质粒和逆转录病毒LTR和包装序列引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)中时，包装序列可以允许将重组质粒的RNA转录物包装至病毒颗粒中，然后所述病毒颗粒可能会被分泌到培养基中。在一些实施方案中，然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地将其浓缩，并用于基因转移。例如，在一些方面，在将包装质粒和转移载体共转染至包装细胞系后，从培养基回收病毒载体颗粒，并通过本领域技术人员使用的标准方法进行滴定。
在一些实施方案中，可以通过引入质粒以允许产生慢病毒颗粒，而在包装细胞系(如示例性HEK 293T细胞系)中产生逆转录病毒载体，如慢病毒载体。在一些实施方案中，包装细胞被转染和/或含有编码gag和pol的多核苷酸，以及编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码rev蛋白的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码非天然包膜糖蛋白(例如VSV-G)的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些此类实施方案中，在转染细胞(例如HEK 293T细胞)后大约两天，细胞上清液含有可以回收并滴定的重组慢病毒载体。
所回收和/或产生的逆转录病毒载体颗粒可以用于使用如所述的方法转导靶细胞。一旦进入靶细胞中，病毒RNA就被逆转录，进入细胞核中并稳定整合到宿主基因组中。在病毒RNA整合后一天或两天，可以检测到重组蛋白(例如抗原受体，例如CAR)的表达。
3.核酸
在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生出这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，如在自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方案中，细胞包括经由基因工程化引入的一种或多种核酸，从而表达此类核酸的重组或基因工程化产物。
在一些情况下，编码重组受体的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。在一些方面，信号序列可以编码源自天然多肽的信号肽。在其他方面，信号序列可以编码异源或非天然信号肽，例如SEQ ID NO:25所示并且由SEQ ID NO:24所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链的示例性信号肽。在一些情况下，编码重组受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。信号肽的非限制性示例性例子包括例如SEQ ID NO:25中所示并且由SEQ ID NO:24中所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链信号肽，或SEQ ID NO:26中所示的CD8α信号肽。
在一些实施方案中，编码重组受体的多核苷酸含有至少一个启动子，所述启动子可操作连接以控制重组受体的表达。在一些例子中，多核苷酸含有两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制重组受体的表达。
在核酸分子编码两种或更多种不同多肽链(例如重组受体和标记)的某些情况下，每条多肽链可以由单独的核酸分子编码。例如，提供了两种单独的核酸，并且每一种可以单独转移到或引入细胞中以在细胞中表达。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸和编码标记的核酸与相同的启动子可操作地连接，并且任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽(其任选地是T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸分开。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸可操作地连接至两个不同的启动子。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸存在或插入于细胞基因组内的不同位置。在一些实施方案中，例如通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码重组受体的多核苷酸引入含有培养细胞的组合物中。
在一些实施方案中，例如在多核苷酸含有第一和第二核酸序列的那些实施方案中，编码不同多肽链中的每一条的编码序列可以与启动子可操作地连接，所述启动子可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，核酸分子可以含有驱动两条或更多条不同多肽链表达的启动子。在一些实施方案中，此类核酸分子可以是多顺反子的(双顺反子的或三顺反子的，参见例如，美国专利号6,060,273)。在一些实施方案中，可以将转录单位工程化为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单一启动子的信息共表达基因产物(例如编码标记和编码重组受体)。
可替代地，在一些情况下，单一启动子可引导RNA的表达，所述RNA在单一开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如编码标记和编码重组受体)，所述基因通过编码自切割肽(例如，2A序列)或蛋白酶识别位点(例如，弗林蛋白酶(furin))的序列彼此分开。所述ORF由此编码单一多肽，其在翻译期间(在2A的情况下)或在翻译之后被处理成单一蛋白质。在一些情况下，肽(如T2A)可引起核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，导致2A序列末端与下游的下一个肽之间分开(参见例如，de Felipe,Genetic Vaccines andTher.2:13(2004)和de Felipe等人Traffic 5:616-626(2004))。已知各种2A元件。可以用于本文公开的方法和系统中的2A序列的例子包括但不限于来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如SEQ ID NO:21)、马鼻炎A病毒(E2A，例如SEQ ID NO:20)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A，例如SEQ ID NO:6或17)和猪捷申病毒-1(P2A，例如SEQ ID NO:18或19)，如美国专利公开号20070116690中所述。
本文所述的任何重组受体可以由呈任何组合或排列的含有编码重组受体的一种或多种核酸序列的多核苷酸编码。例如，一种、两种、三种或更多种多核苷酸可以编码一种、两种、三种或更多种不同的多肽，例如重组受体。在一些实施方案中，一种载体或构建体含有编码标记的核酸序列，并且单独的载体或构建体含有编码重组受体(例如CAR)的核酸序列。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸与两种不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸存在于编码标记的核酸的下游。
在一些实施方案中，载体骨架含有编码一种或多种标记的核酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种标记是转导标记、替代标记和/或选择标记。
在一些实施方案中，标记是转导标记或替代标记。可以将转导标记或替代标记用于检测已经引入多核苷酸(例如，编码重组受体的多核苷酸)的细胞。在一些实施方案中，转导标记可以指示或确认细胞的修饰。在一些实施方案中，替代标记是制备以在细胞表面上与重组受体(例如CAR)共表达的蛋白质。在特定实施方案中，这种替代标记是已经修饰以具有极少或无活性的表面蛋白。在某些实施方案中，替代标记在编码重组受体的同一多核苷酸上编码。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列与编码标记的核酸序列可操作地连接，任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽(例如2A序列，例如T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸隔开。在一些情况下，外在标记基因可以与工程化细胞结合使用，以允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还促进细胞自杀。
示例性替代标记可以包括截短的细胞表面多肽，例如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(EGFRt，SEQ ID NO:7或16所示的示例性EGFRt序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其经修饰形式。EGFRt可以含有由抗体西妥昔单抗
或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以用于鉴定或选择已经用EGFRt构建体和重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所述受体的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，标记(例如替代标记)包括全部或部分(例如，截短形式)的CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如，截短的非人CD19)或表皮生长因子受体(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，编码所述标记的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列，例如，T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO2014031687所披露的任何一种。例如，标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:7或16中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:7或16至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，标记是或包含荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(如超折叠GFP)、红色荧光蛋白(RFP)(如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，标记是选择标记。在一些实施方案中，选择标记是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其修饰形式。
D.细胞的培育和/或扩增
在一些实施方案中，可以使已使用本文所述方法进行工程化的细胞经历一个或多个培育步骤，例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞。在一些实施方案中，在基因工程化(例如通过转导或转染将重组多肽引入细胞)的步骤之后在促进增殖和/或扩增的条件下培育工程化细胞。在特定实施方案中，在刺激条件下孵育细胞并用重组多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)转导或转染细胞之后培育细胞。在一些实施方案中，所述培育产生富集T细胞的一种或多种培育组合物。在一些实施方案中，此类条件可以经设计以诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活。在特定实施方案中，所述刺激条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和经设计以促进细胞生长、分裂和/或扩增的任何其他药剂))。
在一些实施方案中，将工程化细胞在容器中培养，所述容器可以例如经由补料端口填充细胞培养基和/或细胞以用于培养所添加细胞。所述细胞可以来自需要培养细胞(例如，用于扩增和/或增殖细胞)的任何细胞来源。
在一些方面，培养基是支持细胞(如T细胞)的生长、培育、扩增或增殖的适应性培养基。在一些方面，培养基可以是含有盐、氨基酸、维生素、糖或其任何组合的混合物的液体。在一些实施方案中，培养基进一步含有一种或多种刺激条件或刺激剂，例如在孵育期间刺激细胞的培育、扩增或增殖。在一些实施方案中，刺激条件是或包括如选自IL-2、IL-7或IL-15的一种或多种细胞因子。在一些实施方案中，所述细胞因子是重组细胞因子。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括4-α-螺旋束细胞因子家族的成员。在一些实施方案中，4-α-螺旋束细胞因子家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-15。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-7。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括重组IL-2。
在一些实施方案中，在培养或孵育期间在培养基中的一种或多种细胞因子的浓度独立地是从为或约1IU/mL至1500IU/mL，例如从为或约1IU/mL至100IU/mL、2IU/mL至50IU/mL、5IU/mL至10IU/mL、10IU/mL至500IU/mL、50IU/mL至250IU/mL或100IU/mL至200IU/mL、50IU/mL至1500IU/mL、100IU/mL至1000IU/mL或200IU/mL至600IU/mL。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子的浓度独立地为至少或至少约1IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、500IU/mL、1000IU/mL或1500IU/mL。
在一些方面，在转移工程化细胞和培养基之后，将细胞孵育至少一部分时间。在一些实施方案中，刺激条件通常包括适合于初级免疫细胞如人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常至少约30摄氏度，并且通常为或约37摄氏度。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物在25℃至38℃，如30℃至37℃，例如为或约37℃±2℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将孵育进行一段时间直至培养(例如培育或扩增)产生所需或阈值密度、浓度、数量或剂量的细胞。在一些实施方案中，将孵育进行一段时间直至培养(例如培育或扩增)产生所需或阈值密度、浓度、数量或剂量的活细胞。在一些实施方案中，孵育进行如下时间：大于或大于约或为约或为24小时、48小时、72小时、96小时、5天、6天、7天、8天、9天或更长时间。
在一些实施方案中，在维持细胞培养中目标量的二氧化碳的条件下孵育细胞。在一些方面，这确保了细胞在生长期间的最佳培育、扩增和增殖。在一些方面，二氧化碳(CO2)的量在所述气体的10％与0％(v/v)之间，如在所述气体的8％与2％(v/v)之间，例如，为或约5％(v/v)CO2的量。
在特定实施方案中，所述培育是在封闭系统中进行。在某些实施方案中，所述培育是在无菌条件下在封闭系统中进行。在特定实施方案中，所述培育在与所提供的系统的一个或多个步骤相同的封闭系统中进行。在一些实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物从封闭系统中移取出并且放置于生物反应器中和/或连接至生物反应器以用于培育。适合于所述培育的生物反应器的例子包括但不限于GE Xuri W25、GE Xuri W5、SartoriusBioSTAT RM 20|50、Finesse SmartRocker生物反应器系统和Pall XRS生物反应器系统。在一些实施方案中，在培育步骤的至少一部分期间使用生物反应器灌注和/或混合细胞。
在一些实施方案中，与在没有生物反应器的情况下培育的细胞，例如在静态条件下如在不混合、摇摆、运动和/或灌注的情况下培育的细胞相比，在封闭、连接和/或在生物反应器控制下的同时培育的细胞在培育期间经历更快的扩增。在一些实施方案中，在封闭、连接和/或在生物反应器的控制下的同时培育的细胞在14天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、60小时、48小时、36小时、24小时或12小时内达到或实现阈值扩增、细胞计数和/或密度。在一些实施方案中，与在其中未在封闭、连接和/或在生物反应器的控制下的同时培育细胞的示例性和/或替代性过程中培育的细胞相比，在封闭、连接和/或在生物反应器的控制下的同时培育的细胞达到或实现至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍的阈值扩增、细胞计数和/或密度。
在一些实施方案中，所述混合是或包括摇摆/或运动。在一些实施方案中，使用容器(例如，袋)孵育细胞，所述容器与生物反应器结合使用。在一些情况下，生物反应器可以经历运动或摇摆，这在一些方面可以增加氧气传递。使生物反应器运动可以包括但不限于沿着水平轴线旋转、沿着竖直轴线旋转、沿着生物反应器的倾斜(tilted或inclined)的水平轴线的摇摆运动、或其任何组合。在一些实施方案中，在摇摆的情况下进行孵育的至少一部分。可以调整摇摆速度和摇摆角度以实现所需的搅动。在一些实施方案中，摇摆角度为或为约20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°或1°。在某些实施方案中，摇摆角度在6-16°之间。在其他实施方案中，摇摆角度在7-16°之间。在其他实施方案中，摇摆角度在8-12°之间。在一些实施方案中，摇摆速率为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、1 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40rpm。在一些实施方案中，摇摆速率在4rpm与12rpm之间，例如在4rpm与6rpm之间并包含端值。在摇摆运动下进行细胞培养扩增的至少一部分，如以在5°与10°之间(如6°)的角度，以恒定摇摆速度(如在5RPM与15RPM之间，如6RMP或10RPM的速度)摇摆。
在一些实施方案中，在表面活性剂存在下培育包含细胞，如工程化T细胞(例如工程化CD4+ T细胞或工程化CD8+ T细胞)或具有如本文所述的任何表型的工程化细胞的组合物。在特定实施方案中，培育所述组合物的细胞减少了在培育期间例如由于混合、摇摆、运动和/或灌注而可能发生的剪切应力的量。在特定实施方案中，用表面活性剂培育所述细胞，如工程化T细胞(例如工程化CD4+ T细胞或工程化CD8+ T细胞)的组合物，并且培育期间或在培育完成后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.9％的T细胞存活，例如是有活力的并且/或者未经历坏死、程序性细胞死亡或细胞凋亡。在特定实施方案中，在表面活性剂存在下培育所述细胞，如工程化T细胞(例如工程化CD4+ T细胞或工程化CD8+T细胞)的组合物，并且少于50％、少于40％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的细胞经历细胞死亡，例如程序性细胞死亡、细胞凋亡和/或坏死，如由于剪切或剪切诱导的应力所致的细胞死亡。
在特定实施方案中，在如下量的表面活性剂存在下培育细胞，如工程化T细胞(例如工程化CD4+ T细胞或工程化CD8+ T细胞)的组合物：在0.1μl/ml与10.0μl/ml之间、在0.2μl/ml与2.5μl/ml之间、在0.5μl/ml与5μl/ml之间、在1μl/ml与3μl/ml或在2μl/ml与4μl/ml之间。在一些实施方案中，在如下量的表面活性剂存在下培育细胞，如工程化T细胞(例如工程化CD4+ T细胞或工程化CD8+ T细胞)的组合物：为、为约或至少0.1μl/ml、0.2μl/ml、0.4μl/ml、0.6μl/ml、0.8μl/ml、1μl/ml、1.5μl/ml、2.0μl/ml、2.5μl/ml、5.0μl/ml、10μl/ml、25μl/ml或50μl/ml。在某些实施方案中，在为或为约2μl/ml的表面活性剂存在下培育细胞组合物。
在一些实施方案中，表面活性剂是或包括降低液体和/或固体的表面张力的试剂。例如，表面活性剂包括脂肪醇(例如，甾基醇)、聚氧乙二醇辛基酚醚(例如Triton X-100)或聚氧乙二醇脱水山梨糖醇烷基酯(例如聚山梨醇酯20、40、60)。在某些实施方案中，表面活性剂选自聚山梨醇酯80(PS80)、聚山梨醇酯20(PS20)、泊洛沙姆188(P188)。在示例性实施方案中，化学确定的进料培养基中的表面活性剂的浓度为约0.0025％至约0.25％(v/v)的PS80；约0.0025％至约0.25％(v/v)的PS20；或约0.1％至约5.0％(w/v)的P188。
在一些实施方案中，表面活性剂是或包括添加到其中的阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或非离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于烷基磺酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、月桂酸钾、硬脂酸三乙醇胺、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯硫酸盐、海藻酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠、磷脂酰甘油、磷脂酰肌苷、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸及其盐、羧甲基纤维素钠、胆酸和其他胆汁酸(例如胆酸、脱氧胆酸、甘胆酸、牛磺胆酸、甘氨脱氧胆酸)及其盐(例如脱氧胆酸钠)。
在一些实施方案中，合适的非离子表面活性剂包括：甘油酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(聚山梨醇酯)、聚氧乙烯脂肪酸酯、脱水山梨糖醇酯、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、聚丙二醇、鲸蜡醇、鲸蜡硬脂醇、硬脂基醇、芳基烷基聚醚醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆)、泊洛沙胺(poloxamine)、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、非结晶纤维素、多糖(包括淀粉和淀粉衍生物如羟乙基淀粉(HES))、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。在某些实施方案中，非离子表面活性剂是聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物，并且优选是丙二醇和乙二醇的嵌段共聚物。此类聚合物以商标名泊洛沙姆出售，有时也被称为
F68或
P188。聚氧乙烯脂肪酸酯包括具有短烷基链的那些。这种表面活性剂的一个例子是
HS 15，即聚乙烯-660-羟基硬脂酸酯。
在一些实施方案中，合适的阳离子表面活性剂可以包括但不限于天然磷脂、合成磷脂、季铵化合物、苯扎氯铵、鲸蜡基三甲基溴化铵、壳聚糖、月桂基二甲基苄基氯化铵、酰基肉碱盐酸盐、二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDAB)、二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP)、二肉豆蔻酰基三甲基铵丙烷(DMTAP)、二甲基氨基乙烷氨基甲酰基胆固醇(DC-Chol)、1,2-二酰基甘油-3-(O-烷基)磷酸胆碱、O-烷基磷脂酰胆碱、烷基吡啶鎓卤化物或长链烷基胺，例如像正辛胺和油胺。
两性离子表面活性剂是电中性的，但在同一分子内具有局部正电荷和负电荷。合适的两性离子表面活性剂包括但不限于两性离子磷脂。合适的磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二酰基-甘油-磷酸乙醇胺(如二豆蔻酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基-甘油-磷酸乙醇乙醇胺(DSPE)和二油酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DOPE))。在本发明中可以使用包括阴离子磷脂和两性离子磷脂的磷脂混合物。此类混合物包括但不限于溶血磷脂、卵磷脂或大豆磷脂或其任何组合。磷脂(无论是阴离子的、两性离子的还是磷脂混合物)可以是盐化的或脱盐的、氢化的或部分氢化的，或天然的、半合成的或合成的。
在某些实施方案中，所述表面活性剂是泊洛沙姆，例如泊洛沙姆188。在一些实施方案中，在如下量的泊洛沙姆存在下培育细胞组合物：在0.1μl/ml与10.0μl/ml之间、在0.2μl/ml与2.5μl/ml之间、在0.5μl/ml与5μl/ml之间、在1μl/ml与3μl/ml或在2μl/ml与4μl/ml之间。在一些实施方案中，在如下量的表面活性剂存在下培育细胞组合物：为、为约或至少0.1μl/ml、0.2μl/ml、0.4μl/ml、0.6μl/ml、0.8μl/ml、1μl/ml、1.5μl/ml、2.0μl/ml、2.5μl/ml、5.0μl/ml、10μl/ml、25μl/ml或50μl/ml。在某些实施方案中，在为或为约2μl/ml的泊洛沙姆存在下培育细胞组合物。
在一些方面，CD4+和CD8+细胞被扩增，在一些情况下各自单独扩增或一起扩增，直至它们各自达到阈值量或细胞密度。在特定实施方案中，当细胞实现阈值量、浓度和/或扩增时，如通过收获细胞结束培育。在特定实施方案中，例如关于和/或相对于开始或起始培育时细胞的量或密度，当细胞实现或实现约或至少1.5倍扩增、2倍扩增、2.5倍扩增、3倍扩增、3.5倍扩增、4倍扩增、4.5倍扩增、5倍扩增、6倍扩增、7倍扩增、8倍扩增、9倍扩增、10倍扩增或大于10倍扩增时，结束培育。在一些实施方案中，阈值扩增为例如关于和/或相对于开始或起始培育时细胞的量或密度的4倍扩增。在一些实施方案中，当细胞实现细胞的阈值总量，例如阈值细胞计数时，如通过收获细胞结束培育。在一些实施方案中，当细胞实现阈值总有核细胞(TNC)计数时，结束培育。在一些实施方案中，当细胞实现阈值活细胞量，例如阈值活细胞计数时，结束培育。在一些实施方案中，所述阈值细胞计数为或为约或为至少50x106个细胞、100x 106个细胞、200x 106个细胞、300x 106个细胞、400x 106个细胞、600x106个细胞、800x 106个细胞、1000x 106个细胞、1200x 106个细胞、1400x 106个细胞、1600x 106个细胞、1800x 106个细胞、2000x 106个细胞、2500x 106个细胞、3000x 106个细胞、4000x 106个细胞、5000x 106个细胞、10,000x 106个细胞、12,000x 106个细胞、15,000x 106个细胞或20,000x 106个细胞、或活细胞的任何前述阈值。
在特定实施方案中，当细胞实现阈值细胞计数时，结束培育。在一些实施方案中，在实现阈值细胞计数后在以下时间时、在约以下时间时或在以下时间内结束培育：6小时、12小时、24小时、36小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在特定实施方案中，在实现阈值细胞计数后1天或约1天时结束培育。在某些实施方案中，所述阈值密度为、为约或为至少0.1x 106个细胞/ml、0.5x 106个细胞/ml、1x 106个细胞/ml、1.2x 106个细胞/ml、1.5x 106个细胞/ml、1.6x 106个细胞/ml、1.8x 106个细胞/ml、2.0x 106个细胞/ml、2.5x106个细胞/ml、3.0x 106个细胞/ml、3.5x 106个细胞/ml、4.0x 106个细胞/ml、4.5x 106个细胞/ml、5.0x 106个细胞/ml、6x 106个细胞/ml、8x 106个细胞/ml、或10x 106个细胞/ml、或活细胞的任何前述阈值。在特定实施方案中，当细胞实现阈值密度时，结束培育。在一些实施方案中，在实现所述阈值密度后在以下时间时、在约以下时间时或在以下时间内结束培育：6小时、12小时、24小时、36小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在特定实施方案中，在实现所述阈值密度后1天或约1天时结束培育。
在一些实施方案中，在静态条件下进行孵育的至少一部分。在一些实施方案中，在灌注(例如在培养期间灌注出用过的培养基并灌注入新鲜培养基)的情况下进行孵育的至少一部分。在一些实施方案中，所述方法包括将新鲜培养基灌注到细胞培养物中(如通过补料端口)的步骤。在一些实施方案中，在灌注期间添加的培养基含有所述一种或多种刺激剂，例如，一种或多种重组细胞因子，如IL-2、IL-7和/或IL-15。在一些实施方案中，在灌注期间添加的培养基与在静态孵育期间使用的培养基相同。
在一些实施方案中，在孵育之后，将容器(例如袋)重新连接到进行用于制造、生成或产生细胞疗法的一个或多个其他处理步骤的系统上，例如重新连接到含有离心室的系统上。在一些方面，将培养的细胞从袋转移到室的内部空腔中用于配制培养的细胞。
在一些实施方案中，通过以下方式扩增T细胞：向培养起始组合物中添加饲养细胞(如非分裂外周血单核细胞(PBMC))(例如，使得对于要扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增所述T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线辐照PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞添加至培养基中。
E.组合物和配制品
本文提供的方法能够产生具有特定表型和功能特征的工程化细胞(例如T细胞)的输出组合物。在一些实施方案中，可以将输出组合物配制为例如治疗性或药物组合物或配制品。因此，还提供了包含任何细胞和/或细胞剂量的组合物(例如输出组合物)，如包括用于以给定剂量或其部分给予的细胞数量的单位剂型组合物，包括药物组合物和配制品。药物组合物和配制品通常包含一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，包含用重组抗原受体(例如，CAR或TCR)工程化的细胞的细胞剂量是作为组合物或配制品，如药物组合物或配制品来提供。此类组合物可以根据所提供的方法和/或与所提供的制品或组合物一起使用，例如用于预防或治疗疾病、病症和障碍，或用于检测、诊断和预后方法。在一些实施方案中，还提供了本文所述的任何单位剂量，和/或包含本文所述的细胞的任何单位剂量的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是输出组合物。
在一些实施方案中，包含用重组抗原受体(例如，CAR或TCR)工程化的细胞的细胞剂量是作为组合物或配制品，如药物组合物或配制品来提供。此类组合物可以根据过继细胞疗法方法(包括用于预防或治疗疾病、病症和障碍的方法)使用，或在检测、诊断和预后方法中使用。在一些实施方案中，此类组合物或配制品可以在所提供的生物医学材料器皿中储存、容纳或转移，和/或作为所提供的制品的组分储存、容纳或转移。
在一些情况下，在用于制造、生成或产生细胞疗法和/或工程化细胞的一个或多个步骤(例如在离心室和/或封闭系统中进行)中处理细胞可以包括在培养(例如培育和扩增)之前或之后配制细胞，如配制由所提供的转导处理步骤产生的基因工程化细胞，和/或一个或多个如所述的其他处理步骤。在一些情况下，所述细胞可以以用于剂量给予，如用于单一单位剂量给予或多剂量给予的量配制。在一些实施方案中，与配制细胞相关的所提供的方法包括在封闭系统中处理经转导细胞，如使用上文所述的处理步骤转导和/或扩增的细胞。在一些实施方案中，可以将经配制的细胞转移或引入本文提供的生物医学材料器皿(例如小瓶)中。
在某些实施方案中，配制细胞(如工程化和经培育T细胞)的一种或多种组合物(例如输出组合物)。在特定实施方案中，在已经工程化和/或培育所述一种或多种组合物之后配制细胞(如工程化和经培育T细胞)的一种或多种组合物。
在一些实施方案中，配制通过一个或多个所述处理步骤生成的T细胞(如CD4+和/或CD8+ T细胞)。在一些方面，单独地制造、产生或生成多种组合物，每种组合物含有来自受试者的不同细胞群和/或细胞亚型，如用于任选地在一定时间段内分开地或独立地给予。例如，含有不同细胞群或细胞亚型的工程化细胞的单独配制品可以分别包括CD8+和CD4+ T细胞，和/或分别包括富含CD8+和CD4+的群体，例如，CD4+和/或CD8+ T细胞，其各自单独地包括经基因工程化以表达重组受体的细胞。在一些实施方案中，至少一种组合物经配制具有经基因工程化以表达重组受体的CD4+ T细胞。在一些实施方案中，至少一种组合物经配制具有经基因工程化以表达重组受体的CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述剂量的给予包括给予第一组合物，所述第一组合物包含CD8+ T细胞的剂量或CD4+ T细胞的剂量，以及给予第二组合物，所述第二组合物包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的剂量中的另一者。在一些实施方案中，包含CD8+ T细胞的剂量或CD4+ T细胞的剂量的第一组合物在包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的剂量中的另一者的第二组合物之前给予。在一些实施方案中，所述剂量的给予包括给予包含CD8+ T细胞的剂量和CD4+ T细胞的剂量两者的组合物。
在一些实施方案中，例如，在产生过程结束时或临近产生过程结束，在配制之前，基于所需表型的一种或多种标记的表面表达(如CCR7或CD27表达)富集或分选细胞(如工程化细胞)，例如以确保在给予的治疗性组合物中至少特定百分比(如至少或至少约、或为或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)或数量的细胞(或其子集)对这种标记呈阳性。
在某些实施方案中，所述细胞(如工程化和经培育T细胞)的一种或多种组合物(例如输出组合物)是或包括细胞的两种单独组合物，例如单独的工程化和/或经培育组合物。在特定实施方案中，将细胞的两种单独组合物，例如，从相同生物样品中选择、分离和/或富集，单独工程化和单独培育的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的两种单独组合物单独配制。在某些实施方案中，所述两种单独组合物包括CD4+ T细胞的组合物，如工程化和/或经培育CD4+T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独组合物包括CD8+ T细胞的组合物，如工程化和/或经培育CD8+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，将CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的两种单独组合物(如工程化和经培育CD4+ T细胞和工程化和经培育CD8+ T细胞的单独组合物)单独配制。在一些实施方案中，对细胞的单一组合物进行配制。在某些实施方案中，所述单一组合物是CD4+ T细胞的组合物，如工程化和/或经培育CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述单一组合物是在配制之前已从单独组合物合并的CD4+和CD8+ T细胞的组合物。
在一些实施方案中，将CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物(如工程化和经培育CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物)(例如输出组合物)合并为单一组合物并且对其进行配制。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成配制之后将CD4+和CD8+ T细胞的单独经配制组合物合并为单一组合物。在特定实施方案中，将CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物(如工程化和经培育CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物)单独配制为单独组合物。
在一些实施方案中，可以将细胞配制到容器(如小瓶，如本文提供的生物医学材料器皿中的任何小瓶)中。在一些实施方案中，在已经在培育期间实现阈值细胞计数、密度和/或扩增后在0天与10天之间、在0与5天之间、在2天与7天之间、在0.5天与4天之间或在1天与3天之间配制细胞。在某些实施方案中，在已经在培育期间实现阈值细胞计数、密度和/或扩增后在如下时间或在约如下时间或在如下时间内配制细胞：12小时、18小时、24小时、1天、2天或3天。在一些实施方案中，在已经在培育期间实现阈值细胞计数、密度和/或扩增后1天内或约1天内配制细胞。
在一些实施方案中，将细胞配制于药学上可接受的缓冲液中，所述药学上可接受的缓冲液在一些方面可以包含药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，所述处理包括将介质交换成药学上可接受或给予至受试者所需的介质或配制缓冲液。在一些实施方案中，所述处理步骤可以涉及洗涤经转导和/或扩增的细胞以更换药学上可接受的缓冲液中的所述细胞，所述药学上可接受的缓冲液可以包含一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。此类药物形式(包含药学上可接受的载体或赋形剂)的例子可以是下文结合对于将细胞和组合物给予至受试者可接受的形式所述的任何形式。在一些实施方案中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量(例如治疗有效量或预防有效量)的细胞。
术语“药物配制品”是指这样的制剂，其所采取的形式允许其中所含活性成分的生物活性有效，并且其不含对待给予所述配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或给予方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中。
配制品可以包括水溶液。所述配制品或组合物还可含有可用于用细胞治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种活性成分，优选具有与所述细胞互补的活性的那些成分，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量合适地组合存在。因此，在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包括其他药物活性药剂或药物，如化学治疗剂，例如，天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗(rituximab)、长春碱和/或长春新碱。在一些实施方案中，将所述药剂或细胞以盐(例如，药学上可接受的盐)的形式给予。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自以下的那些：无机酸，如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸；以及有机酸，如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸(例如对甲苯磺酸)。
在一些实施方案中，组合物被提供为无菌液体制剂(例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散液或粘性组合物)，其在一些方面可以被缓冲至选择的pH。液体组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，如掺入与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)的混合物中。组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或颜料，这取决于给予途径和所需的制剂。在一些方面，可以查阅标准文本来制备合适的制剂。
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保对微生物作用的防止。可以通过使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)实现可注射药物形式的延长吸收。
在一些实施方案中，所述配制缓冲液含有低温保存剂。在一些实施方案中，用含有1.0％至30％DMSO溶液，如5％至20％DMSO溶液或5％至10％DMSO溶液的低温保存溶液配制细胞。在一些实施方案中，低温保存溶液为或含有例如含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻介质。在一些实施方案中，低温保存溶液为或含有例如至少或至少约7.5％DMSO。在一些实施方案中，所述处理步骤可以涉及洗涤经转导和/或扩增的细胞以更换低温保存溶液中的细胞。在一些实施方案中，将所述细胞冷冻，例如低温保存或低温保护在介质和/或溶液中，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％的DMSO，或在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间、或在6％与8％之间的DMSO。在特定实施方案中，将所述细胞冷冻，例如低温保存或低温保护在介质和/或溶液中，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％或0.25％的HSA，或在0.1％与5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间或在1％与2％之间的HSA。
在特定实施方案中，对所述经富集T细胞(例如，已经刺激、工程化和/或培育的T细胞)的组合物进行配制，低温保存，然后例如在所提供的生物医学材料器皿中储存一定时间量。在某些实施方案中，将经配制的低温保存细胞储存直到释放细胞以用于输注。在特定实施方案中，将经配制的低温保存细胞储存1天至6个月、1个月至3个月、1天至14天、1天至7天、3天至6天、6个月至12个月、或长于12个月。在一些实施方案中，将细胞低温保存并且储存以下时间量：为、为约、或少于1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在某些实施方案中，在储存之后将细胞解冻并且给予至受试者。在某些实施方案中，将细胞储存5天或约5天。
在一些实施方案中，使用一个或多个处理步骤进行配制，所述一个或多个处理步骤包括洗涤、稀释或浓缩细胞(如经培养或扩增细胞)。在一些实施方案中，所述处理可以包括将细胞稀释或浓缩至所需浓度或数量，如包括用于以给定剂量或其部分给予的细胞数量的单位剂型组合物。在一些实施方案中，所述处理步骤可以包括减少体积从而根据需要增加细胞浓度。在一些实施方案中，所述处理步骤可以包括增加体积从而根据需要减小细胞浓度。在一些实施方案中，所述处理包括将一定体积的配制缓冲液添加至经转导和/或扩增细胞。在一些实施方案中，配制缓冲液的体积为从10mL至1000mL或从约10mL至约1000mL，如至少或约至少或约50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。
在一些实施方案中，在容器(例如袋或离心室)中培养，如刺激、工程化和/或培育细胞。在一些方面，所述容器是第一容器，并且将培养的细胞从第一容器(例如袋或离心室)的第一容器中压出或转移至可操作地连接至第一容器的第二容器(如生物医学材料器皿)。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿被配置用于整合至和或可操作连接至并且/或者被整合至或可操作地连接至用于一个或多个先前处理步骤的第一容器(例如袋或离心室)。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿在输出管线或输出位置处连接至第一容器(例如袋或离心室)。在一些情况下，所述第一容器(例如袋或离心室)在入口管处连接至生物医学材料器皿的小瓶。
在一些实施方案中，用于配制细胞组合物的此类处理步骤是在封闭系统中进行。此类处理步骤的示例可以使用离心室结合与细胞处理系统相关联的一种或多种系统或试剂盒来进行，如由Biosafe SA生产及出售的离心室，包括与
或
细胞处理系统一起使用的那些离心室。示例性系统和方法描述于国际公开号WO 2016/073602中。在一些实施方案中，所述方法包括实现自离心室的内部空腔压出或转移经配制组合物，所述经配制组合物是在如所述的任何以上实施方案中，在配制缓冲液(如药学上可接受的缓冲液)中配制的所得细胞组合物。在一些实施方案中，将经配制组合物压出或转移至作为封闭系统的一部分与离心室可操作地连接的容器(如本文所述的生物医学材料器皿的小瓶)。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿被配置用于整合至和或可操作连接至并且/或者被整合至或可操作地连接至进行一个或多个处理步骤的封闭系统或装置。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿在输出管线或输出位置处连接至系统。在一些情况下，所述封闭系统在入口管处连接至生物医学材料器皿的小瓶。与本文所述的生物医学材料器皿一起使用的示例性封闭系统包括
和
2系统。
在一些实施方案中，所述组合物可以经由多端口输出试剂盒从第一容器(如离心室或细胞处理系统)转移至所提供的生物医学材料器皿，所述试剂盒含有在管线各末端与端口相关联的多路管歧管，所述端口可以连接至一个或多个容器(例如生物医学材料器皿)以供压出经配制组合物。在一些方面，所需数量或多个此类小瓶可以无菌连接至多端口输出中的一个或多个，通常两个或更多个，如至少3、4、5、6、7、8个或更多个端口。例如，在一些实施方案中，一个或多个容器(例如生物医学材料器皿)可以附接至所述端口或少于全部的所述端口。因此，在一些实施方案中，所述系统可以实现将输出组合物压出至生物医学材料器皿的多个小瓶中。
在一些方面，可以将细胞以用于剂量给予(如用于单一单位剂量给予或多剂量给予)的量压出或转移至多个输出容器(例如，生物医学材料器皿的小瓶)中的一个或多个。例如，在一些实施方案中，生物医学材料器皿的小瓶可以各自含有以给定剂量或其部分给予的细胞数量。因此，在一些方面，每个小瓶可以含有用于给予的单一单位剂量，或者可以含有所需剂量的一部分，使得多个小瓶中的多于一个，如两个小瓶或3个小瓶一起构成用于给予的剂量。
因此，本文所述的生物医学材料器皿中的小瓶通常含有待给予的细胞，例如，其一个或多个单位剂量。单位剂量可以是待给予至受试者的细胞的量或数量，或者是待给予的细胞的数量的两倍(或更多)。它可以是将向受试者给予的细胞的最低剂量或最低可能剂量。
在一些实施方案中，每个小瓶单独地包含单位剂量的细胞。因此，在一些实施方案中，每个容器包含相同或大致或基本上相同数量的细胞。在一些实施方案中，每个单位剂量含有至少或约至少1x 106、2x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1x 108、2.5x 108、或5x 10个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，每个单位剂量含有至少或至少约2.5x107、至少或至少约5.0x 107、至少或至少约1.5x 108、至少或至少约3.0x 108、至少或至少约4.5x 108、至少或至少约8.0x 108或至少或至少约1.2x 109个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，每个单位剂量含有不超过或不超过约2.5x 107、不超过或不超过约5.0x 107、不超过或不超过约1.5x 108、不超过或不超过约3.0x 108、不超过或不超过约4.5x 108、不超过或不超过约8.0x 108或不超过或不超过约1.2x 109个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些方面，可以包含在小瓶中的细胞的示例性剂量包括本文例如在章节IV中所述的任何剂量。在一些方面，可以给予至受试者的细胞的示例性剂量包括本文例如在章节IV中所述的任何剂量。
在一些实施方案中，每个容器中的经配制细胞组合物的体积为10mL至100mL，如至少或约至少或约20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL。在一些实施方案中，小瓶中的细胞可以是低温保存的。在一些实施方案中，小瓶可以储存在液氮中，直到进一步使用。
在一些实施方案中，将通过所述方法产生的此类细胞或包含此类细胞的组合物给予至受试者以治疗疾病或病症。在一些实施方案中，所述药物组合物以有效治疗或预防所述疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)含有药剂或细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复给予，根据病症，重复所述治疗直至出现疾病症状的所需抑制为止。然而，其他剂量方案可能是有用的并且可以被确定。所需剂量可以通过单次推注给予组合物、通过多次推注给予组合物、或通过连续输注给予组合物来递送。
所述药剂或细胞可以通过任何合适的方式给予，例如，通过推注输注，通过注射，例如，静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜(posterior juxtascleral)递送。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内给予以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内给予。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施方案中，给定剂量是通过所述细胞或药剂的单次推注给予来给予。在一些实施方案中，给定剂量是通过所述细胞或药剂例如在不超过3天的时间段中多次推注给予来给予，或通过所述细胞或药剂的连续输注给予来给予。
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可取决于要治疗的疾病类型、一种或多种药剂的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、给予所述药剂或细胞用于预防性目的还是治疗性目的、先前疗法、受试者的临床病史和对所述药剂或所述细胞的反应、以及主治医师的决断。在一些实施方案中，将组合物一次或在一系列治疗中合适地给予受试者。
所述细胞或药剂可以使用标准给予技术、配制品和/或装置来给予。提供用于储存和给予组合物的配制品和装置，如注射器和小瓶。关于细胞，给予可以是自体的或异源的。例如，免疫应答性细胞或祖细胞可以从一名受试者获得，并给予同一受试者或不同但相容的受试者。外周血衍生的免疫应答性细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以通过局部注射给予，包括导管给予、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给予。在给予治疗组合物(例如，含有遗传修饰的免疫应答细胞或者治疗或改善神经毒性症状的药剂的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂给予的那些。在一些实施方案中，所述药剂或细胞群是肠胃外给予的。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给予。在一些实施方案中，所述药剂或细胞群是通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送给予受试者的。
在一些实施方案中，组合物被提供为无菌液体制剂(例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散液或粘性组合物)，其在一些方面可以被缓冲至选择的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外地，液体组合物稍微更方便给予，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过以下方式来制备：将所述药剂或细胞掺入溶剂中，如掺入与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)的混合物中。
用于体内给予的配制品通产是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌性。
1.输出组合物的特征
所提供的实施方案包括产生含有基因工程化细胞的细胞组合物(如输出组合物)的方法。在一些方面，可以在基因工程化输入组合物(如本文所述的任一种)后产生输出组合物。在某些实施方案中，本文提供的方法包括用于将来自输入组合物的细胞基因工程化以产生含有如下工程化细胞的输出细胞组合物的一个或多个步骤，所述工程化细胞具有特定特性、特征和/或特点，如细胞表型，例如用于给予的组合物中细胞的表面标记的存在和/或表达、和/或表面标记的不存在或缺乏表达。在一些方面，输出组合物中的细胞包括表达(例如在细胞的表面上表达)或不表达与某些细胞表型相关的一种或多种标记的细胞，所述一种或多种标记包括与分化程度较低的细胞表型相关或指示分化程度较低的细胞表型的标记和/或与记忆细胞亚型相关或指示记忆细胞亚型的标记。在一些方面，输出组合物中的细胞包括响应于如本文所述的刺激产生一种或多种细胞因子的细胞，所述一种或多种细胞因子包括与分化程度较低的细胞表型相关或指示分化程度较低的细胞表型的细胞因子和/或与记忆细胞亚型相关或指示记忆细胞亚型的细胞因子。在一些实施方案中，本文提供的方法产生可用于治疗疾病的输出组合物。在一些实施方案中，所述输出组合物，或由其配制的配制品、治疗性组合物或药物组合物与无进展存活期和/或持久反应相关联。在一些实施方案中，所述输出组合物，或由其配制的配制品、治疗性组合物或药物组合物与具有高和/或低疾病负荷(如本文所述)的患者中的无进展存活期和/或持久反应相关联。
在某些实施方案中，本文所提供的方法包括用于将来自起始和/或输入组合物的细胞基因工程化以产生具有以下的所得和/或输出细胞组合物的一个或多个步骤：限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞，和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
在某些实施方案中，本文提供的方法包括用于将来自起始和/或输入组合物的细胞基因工程化以产生具有一定百分比的产生IL-2、TNF-α、或IFN-γ的细胞(例如CD4+细胞)的所得和/或输出细胞组合物的一个或多个步骤。
在特定实施方案中，输入组合物的含量、构成和/或组成与输出细胞组合物的含量、构成和/或组成相关联，控制输出细胞组合物的含量、构成和/或组成，与输出细胞组合物的含量、构成和/或组成相对应和/或相关。在某些实施方案中，输入组合物中表达一种或多种与某些细胞表型相关的标记(包括与分化程度较低的细胞表型相关或指示分化程度较低的细胞表型的标记和/或与记忆细胞亚型相关或指示记忆细胞亚型的标记)的细胞的量、份额、百分比、数量、每体积的数量、每重量的数量和/或比率与输出细胞组合物的含量、构成和/或组成相关联，控制输出细胞组合物的含量、构成和/或组成，与输出细胞组合物的含量、构成和/或组成相对应和/或相关。在特定实施方案中，输入组合物中表达一种或多种与某些细胞表型相关的标记(包括与分化程度较低的细胞表型相关或指示分化程度较低的细胞表型的标记和/或与记忆细胞亚型相关或指示记忆细胞亚型的标记)的CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的量、份额、数量、每体积的数量、每重量的数量和/或比率与输出细胞组合物的含量、构成和/或组成相关联，控制输出细胞组合物的含量、构成和/或组成，与输出细胞组合物的含量、构成和/或组成相对应和/或相关。在一些方面，输入组合物中细胞的CCR7、CD27和/或CD45RA中一种或多种的表达或表达不存在与例如在基因工程化以表达重组受体之后的输出组合物中细胞的CCR7、CD27和/或CD45RA中一种或多种的表达或表达不存在相关联。因此，在一些方面，输入组合物中表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA中的一种或多种的细胞的数量、频率和/或百分比与输出组合物中表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA中的一种或多种的重组受体表达工程化细胞的数量、频率和/或百分比相关、相关联和/或指示所述重组受体表达工程化细胞的数量、频率和/或百分比。在一些方面，输入组合物的细胞中凋亡标记(例如，激活的半胱天冬酶3或膜联蛋白V)的表达不存在与给予输出组合物(例如，配制品、治疗性组合物、药物组合物，如以如本文所述的一个或多个单位剂量给予)后的无进展存活期和/或持久反应相关联。因此，在一些方面，输入组合物中不表达凋亡标记(例如，激活的半胱天冬酶3或膜联蛋白V)的细胞的数量、频率和/或百分比与可用于治疗疾病的输出组合物相关、相关联。
在一些方面，所述输出组合物包括限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
在一些实施方案中，所述输出组合物包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+、受体+/CD8+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA+细胞与受体+/CD4+/CCR7+、受体+/CD4+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA+细胞；或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+、受体+/CD8+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+、受体+/CD4+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。在一些实施方案中，所述输出组合物包含不表达凋亡标记(例如，半胱天冬酶3、膜联蛋白V)的细胞。
在一些实施方案中，限定比率的受体+/CD8+/CCR7+、受体+/CD8+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA+细胞与受体+/CD4+/CCR7+、受体+/CD4+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA+细胞包括大约1:1或大约在1:3与3:1之间或大约在1:2与2:1之间的受体+/CD8+/CCR7+:受体+/CD4+/CCR7+；受体+/CD8+/CD27+:受体+/CD4+/CD27+；受体+/CD8+/CCR7+/CD27+:受体+/CD4+/CCR7+/CD27+；受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA-:受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA-细胞和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA+:受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA+细胞。在一些实施方案中，限定比率的细胞不包含表达凋亡标记(例如，半胱天冬酶3、膜联蛋白V)的细胞。
在一些实施方案中，限定比率的受体+/CD8+/CCR7+、受体+/CD8+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+、受体+/CD4+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集包括：所述输入组合物中总细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述输出组合物中呈受体+/CD8+/CCR7+、受体+/CD8+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+、受体+/CD4+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA+的总受体表达细胞(受体+细胞)的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每一个都包含端值。在一些实施方案中，限定比率的受体+/CD8+/CCR7+、受体+/CD8+/CD27+和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD27+，和/或受体+/CD4+/CCR7+、受体+/CD4+/CD27+和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+与所述组合物中的另一种细胞子集包括所述输入组合物中总细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述输出组合物中呈受体+/CD8+/CCR7+、受体+/CD8+/CD27+和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD27+，和/或受体+/CD4+/CCR7+、受体+/CD4+/CD27+和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+的总受体表达细胞(受体+细胞)的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每一个都包含端值。
在一些实施方案中，输出组合物包括：所述组合物中工程化细胞(例如，T细胞)的总数量或所述组合物中表达重组受体且对凋亡标记(例如，半胱天冬酶3、膜联蛋白V)呈阴性的工程化细胞(例如，T细胞)的总数量的至少或至少约、或为或约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％。在一些实施方案中，凋亡标记是激活的半胱天冬酶3。在一些实施方案中，凋亡标记是膜联蛋白V。
在一些实施方案中，输出组合物包括能够产生一种或多种细胞因子的细胞(例如T细胞，如工程化T细胞)，所述一种或多种细胞因子是IL-2、IFN-γ、和/或TNF-α。在一些实施方案中，输出组合物包括能够产生IL-2的CD4+/CAR+细胞。在一些实施方案中，输出组合物包括能够产生TNF-α的CD4+/CAR+细胞。在一些实施方案中，输出组合物包括能够产生IL-2、TNF-α、和IFN-γ的CD4+/CAR+细胞。在一些实施方案中，输出组合物包括能够产生IL-2和TNF-α的CD4+/CAR+细胞。在一些实施方案中，输出组合物包括能够产生IL-2和IFN-γ的CD4+/CAR+细胞。在一些实施方案中，输出组合物包括能够产生TNF-α的CD8+/CAR+细胞。在一些实施方案中，输出组合物包括能够产生TNF-α和IFN-γ的CD8+/CAR+细胞。在一些实施方案中，输出组合物包括能够产生选自白介素2(IL-2)和/或TNF-α的细胞因子的CD4+ T细胞(如表达重组受体(例如CAR)的工程化CD4 T细胞)的总数量的至少或至少约、或为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，输出组合物包括因产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的CD4+ T细胞(如表达重组受体(例如CAR)的工程化CD4 T细胞)的总数量的至少或至少约、或为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％或更多。
在特定实施方案中，本文提供的方法产生或生成含有基因工程化细胞的细胞组合物，例如，输出细胞组合物。在某些实施方案中，输出细胞组合物是通过用于基因工程化细胞的一些或所有步骤得到的细胞组合物。在某些实施方案中，输出细胞组合物是从对输入细胞组合物的细胞进行基因工程化的过程得到的。在某些实施方案中，过程包括用于激活、转导或转染、扩增和/或收获细胞(如获得自输入细胞组合物的细胞)的一个或多个步骤。在某些实施方案中，输出细胞组合物含有已基因工程化的细胞。在特定实施方案中，输出细胞组合物的细胞已经经历基因工程化过程的所有步骤。
在一些实施方案中，输出细胞组合物含有细胞，所述细胞包括通过基因工程化引入的一种或多种核酸，从而表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生出这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，如在自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方案中，输出细胞组合物含有已经被基因工程化的细胞。在特定实施方案中，输出细胞组合物含有工程化T细胞。在一些实施方案中，工程化T细胞包括工程化CD4+T细胞和工程化CD8+T细胞。在特定实施方案中，输出细胞组合物含有或包括至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％或约100％的工程化的T细胞。在某些实施方案中，工程化细胞表达重组受体。在特定实施方案中，输出细胞组合物含有或包括至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％或约100％的表达重组受体的T细胞。在一些实施方案中，重组受体是TCR或CAR。在特定实施方案中，重组受体是CAR。
在一些方面，所述方法进一步涉及确定用于给予至患有疾病或病症的受试者的T细胞组合物的一个或多个单位剂量，其中所述单位剂量包含输出组合物的全部或一部分。在一些方面，输出组合物的全部或一部分可以用作用于给予至受试者的单位剂量。在一些方面，所述方法还包括选择输出组合物的全部或一部分，以及任选地与另一种溶液组合以实现用于给予的T细胞组合物的单位剂量。在一些方面，所提供的实施方案涉及确定细胞组合物的一个或多个单位剂量和/或对应于此类单位剂量的体积，使得所述单位剂量可以例如出于治疗目的而包含在本文所述的制品中和/或被给予至受试者。在一些方面，所述单位剂量是基于具有特定表型的生物活性工程化T细胞的数量，和/或，其中剂量是基于具有特定表型的生物活性工程化T细胞的总数量。在一些方面，所述单位剂量可以是本文例如在章节I中所述的任何单位剂量。在一些实施方案中，所述单位剂量包含所述输出组合物的全部或一部分，所述输出组合物包含：限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；或者限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
在一些实施方案中，评估输出组合物以确定输出组合物中包含的细胞的一种或多种表型(例如，表面标记、凋亡标记、细胞因子产生)和此类表型在输出组合物中的百分比。在一些实施方案中，基于具有特定目的表型的细胞的一种或多种百分比来选择用于治疗用途的输出组合物。在一些实施方案中，根据本文所述的百分比和表型中的一种或多种，选择用作治疗剂的输出组合物具有或包括一种或多种百分比的具有特定表型(例如，表面标记、凋亡标记、细胞因子产生)的细胞。在一些实施方案中，如果输出组合物不包含一种或多种目标百分比的一种或多种表型，例如目标百分比的本文所述的特定表型，则输出组合物可以经历选择过程以选择、分离或富集输出组合物，使得达到表型的目标百分比。在一些实施方案中，如果输出组合物不能经历进一步处理以达到本文所述的一种或多种表型的目标百分比，则不将所述输出组合物用作治疗性组合物。
在一些实施方案中，根据已知的或本文所述的低温保存方法中的任一种低温保存输出组合物。
III.表达重组受体的工程化细胞
在一些实施方案中，所提供的方法和制品涉及表达重组受体的工程化细胞，如免疫细胞，如T细胞。在一些方面，所提供的方法涉及给予经基因工程化以表达重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))的工程化T细胞，如CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞，包括给予此类细胞的组合物，其中如本文所述给予一定或限定百分比或数量的具有特定表型(例如CCR7+或CD27)的细胞。在一些方面，工程化细胞的重组受体可以结合和/或靶向与疾病或病症相关的抗原。
A.重组受体
受体包括抗原受体以及含有其一种或多种组分的受体。重组受体可以包括嵌合受体(如含有配体结合结构域或其结合片段和细胞内信号传导结构域或区域的那些)、功能性非TCR抗原受体、嵌合抗原受体(CAR)、和T细胞受体(TCR)(如重组或转基因TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)和任何前述的组分。重组受体(如CAR)通常包括(在一些方面经由接头和/或一个或多个跨膜结构域)与一种或多种细胞内信号传导组分连接的细胞外抗原(或配体)结合结构域。
1.嵌合抗原受体(CAR)
在一些实施方案中，提供了工程化细胞(如T细胞)，其表达对特定抗原(或标记或配体)具有特异性的CAR，所述特定抗原是例如在特定细胞类型的表面上表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性地表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在特定实施方案中，重组受体(如嵌合受体)含有细胞内信号传导区域，所述细胞内信号传导区域包括胞质信号传导结构域或区域(也可互换地称为细胞内信号传导结构域或区域)，例如能够在T细胞中诱导初级激活信号的胞质(细胞内)区域，例如，T细胞受体(TCR)组分的胞质信号传导结构域或区域(例如，CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的胞质信号传导结构域或区域或其功能变体或信号传导部分)；和/或所述细胞内信号传导区域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。
在一些实施方案中，嵌合受体进一步含有与配体(例如抗原)抗原特异性地结合的细胞外配体结合结构域。在一些实施方案中，嵌合受体是CAR，其含有与抗原特异性地结合的细胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，配体(如抗原)是在细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且抗原是处理过的肽抗原，如细胞内蛋白的肽抗原，其与TCR一样在主要组织相容性复合物(MHC)分子的背景下在细胞表面上被识别。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类抗原受体工程化并引入细胞中的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061，美国专利申请公开号US 2002131960、US 2013287748、US 20130149337、美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353、和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP2537416；和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人，Cancer Discov.2013年4月；3(4):388–398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中描述的那些。CAR的例子包括如在任何前述出版物中披露的CAR，所述出版物如WO 2014031687、US8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci Transl Med.20135(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282。
在一些实施方案中，CAR被构建为具有对特定抗原(或标记或配体)的特异性，所述特定抗原是例如在过继疗法靶向的特定细胞类型中表达的抗原(例如，癌症标记)和/或旨在诱导衰减反应的抗原(如在正常或未患病细胞类型上表达的抗原)。因此，CAR通常在其细胞外部分中包括一种或多种抗原结合分子，如一种或多种抗原结合片段、结构域或部分，或者一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，如源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分作为重组受体(如抗原受体)的一部分在细胞上表达。抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含有展现出针对肽-MHC复合物的TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。在一些实施方案中，在一些方面，对TCR样CAR的MHC-肽复合物具有特异性的细胞外抗原结合结构域通过接头和/或一个或多个跨膜结构域与一种或多种细胞内信号传导组分连接。在一些实施方案中，此类分子通常可以模拟或接近通过天然抗原受体(如TCR)的信号，以及任选地通过这种受体与共刺激受体组合的信号。
在一些实施方案中，重组受体(如嵌合受体(例如CAR))包括与抗原(或配体)结合(如特异性地结合)的配体结合结构域。嵌合受体靶向的抗原包括在经由过继细胞疗法靶向的疾病、病症或细胞类型的情况下表达的那些抗原。所述疾病和病症包括增殖性、肿瘤性和恶性疾病和障碍，包括癌症和肿瘤，包括血液癌、免疫系统癌症，如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，如B型白血病、T型白血病和骨髓性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，抗原(或配体)是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原(或配体)在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性地表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在一些实施方案中，CAR含有抗体或抗原结合片段(例如scFv)，其特异性地识别在细胞表面上表达的抗原(如完整抗原)。
在一些实施方案中，所述抗原(或配体)是肿瘤抗原或癌症标记。在一些实施方案中，所述抗原(或配体)是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特有的抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的重链可变(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体(peptibody)、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体(heteroconjugateantibody)、多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段(在本文中也称为“抗原结合片段”)。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
术语“互补决定区”和“CDR”(与“高变区”或“HVR”同义)已知在一些情况下是指抗体可变区内的氨基酸的非连续序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”已知在一些情况下是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，包括以下文献中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,贝塞斯达,马里兰州(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745.”(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A和Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”JMol Biol,2001年6月8号；309(3):657-70(“Aho”编号方案)；以及Martin等人,“Modelingantibody hypervariable loops:a combined algorithm,”PNAS,1989,86(23):9268-9272(“AbM”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可能取决于用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号都是基于最常见的抗体区域序列长度，其中通过插入字母提供插入(例如“30a”)并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。AbM方案是介于Kabat与Chothia定义之间的折衷，其基于Oxford Molecular的AbM抗体建模软件所使用的方案。
下表1列出了分别通过Kabat、Chothia、AbM和Contact方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia两种编号方案列出了残基编号。FR位于CDR之间，例如其中FR-L1位于CDR-L1之前，FR-L2位于CDR-L1与CDR-L2之间，FR-L3位于CDR-L2与CDR-L3之间等。应注意，因为所示的Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入，所以当使用所示的Kabat编号惯例进行编号时，ChothiaCDR-H1环的末端取决于环的长度而在H32与H34之间变化。
表1.根据各种编号方案的CDR边界。
1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes of Health,贝塞斯达,马里兰州
2-Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948
因此，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单独指定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)涵盖如由任何前述方案或其他已知方案所定义的一个(或特定的)互补决定区。例如，在声明特定的CDR(例如，CDR-H3)含有给定VH或VL区氨基酸序列中的相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，这种CDR具有在可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列，如由任何前述方案或其他已知方案所定义的。在一些实施方案中，指定了特定的CDR序列。使用各种编号方案描述了抗体的示例性CDR序列，但应理解，所述抗体可以包含根据任何其他前述编号方案或技术人员已知的其他编号方案所述的CDR。
同样，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区)的FR或单独指定的一个或多个FR(例如，FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4)涵盖如由任何已知方案所定义的一个(或特定的)框架区。在一些情形中，指定了用于鉴定一个或多个特定CDR或FR的方案，如通过Kabat、Chothia、AbM或Contact方法或其他已知方案定义的CDR。在其他情况下，给出了CDR或FR的具体氨基酸序列。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单一VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
包括在CAR中的抗体包括抗体片段。“抗体片段”或“抗原结合片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；重链可变(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和仅含有VH区的单结构域抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施方案中，CAR中的抗原结合结构域是或包含含有可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区的抗体片段。在特定实施方案中，抗体是包含重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区的单链抗体片段(例如scFv)。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是CD19。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD19具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD19的抗体或抗体片段是小鼠来源的抗体，如FMC63和SJ25C1。在一些实施方案中，抗体或抗体片段是人抗体，例如如美国专利公开号US 2016/0152723中所述。
在一些实施方案中，scFv源自FMC63。FMC63通常是指针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987)中。Leucocytetyping III.302)。在一些实施方案中，FMC63抗体包含分别在SEQ ID NO:38和39中所示的CDR-H1和CDR-H2，以及在SEQ ID NO:40或54中所示的CDR-H3，以及在SEQ ID NO:35中所示的CDR-L1、和在SEQ ID NO:36或55中所示的CDR-L2、和在SEQ ID NO:37或34中所示的CDR-L3。在一些实施方案中，FMC63抗体包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:35的CDR-L1序列、SEQ ID NO:36的CDR-L2序列和SEQ ID NO:37的CDR-L3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:38的CDR-H1序列、SEQ ID NO:39的CDR-H2序列和SEQ ID NO:40的CDR-H3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:41中所示的可变重链区和SEQ ID NO:42中所示的可变轻链区。在一些实施方案中，所述可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ ID NO:56中所示。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv由SEQ ID NO:57中所示的核苷酸序列或展现出与SEQ ID NO:57至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:43至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，scFv源自SJ25C1。SJ25C1是针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987)中。Leucocyte typingIII.302)。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含分别在SEQ ID NO:47-49中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，以及分别在SEQ ID NO:44-46中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:44的CDR-L1序列、SEQ ID NO:45的CDR-L2序列和SEQ ID NO:46的CDR-L3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:47的CDR-H1序列、SEQ ID NO:48的CDR-H2序列和SEQ ID NO:49的CDR-H3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:50中所示的可变重链区和SEQ ID NO:51中所示的可变轻链区。在一些实施方案中，所述可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ ID NO:52中所示。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:53至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述抗原是CD20。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD20具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，所述结合CD20的抗体或抗体片段是作为或源自利妥昔单抗的抗体，如是利妥昔单抗scFv。
在一些实施方案中，所述抗原是CD22。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD22具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，所述结合CD22的抗体或抗体片段是作为或源自m971的抗体，如是m971 scFv。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是BCMA。在一些实施方案中，scFv含有源自对BCMA具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，所述结合BCMA的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090327和WO 2016/090320中所示的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是GPRC5D。在一些实施方案中，scFv含有源自对GPRC5D具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，所述结合GPRC5D的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090329和WO 2016/090312中所示的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些实施方案中，CAR含有TCR样抗体，如抗体或抗原结合片段(例如scFv)，其特异性地识别作为MHC-肽复合物存在于细胞表面上的细胞内抗原(如肿瘤相关抗原)。在一些实施方案中，识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体(如抗原受体)的一部分在细胞上表达。抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含有展现出针对肽-MHC复合物的TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。
提及“主要组织相容性复合物”(MHC)是指含有多态性肽结合位点或结合沟的蛋白质，通常是糖蛋白，在一些情况下，所述蛋白质可以与多肽的肽抗原(包括由细胞机器处理的肽抗原)复合。在一些情况下，MHC分子可以在细胞表面上展示或表达，包括作为与肽的复合物，即MHC-肽复合物，用于呈递具有T细胞上的抗原受体(如TCR或TCR样抗体)可识别的构象的抗原。通常，MHC I类分子是异二聚体，其具有跨膜α链，在一些情况下具有三个α结构域和非共价缔合的β2微球蛋白。通常，MHC II类分子由两个跨膜糖蛋白α和β构成，两者通常都跨越膜。MHC分子可以包括MHC的有效部分，其含有抗原结合位点或用于结合肽的位点以及由适当抗原受体识别所必需的序列。在一些实施方案中，MHC I类分子将源自胞质溶胶的肽递送至细胞表面，在此处MHC-肽复合物被T细胞(如通常是CD8+T细胞，但是在一些情况下是CD4+T细胞)识别。在一些实施方案中，MHC II类分子将源自囊泡系统的肽递送至细胞表面，在此处所述肽通常由CD4+T细胞识别。通常，MHC分子由一组连锁基因座编码，其在小鼠中统称为H-2并且在人中统称为人白细胞抗原(HLA)。因此，通常人MHC也可以称为人白细胞抗原(HLA)。
术语“MHC-肽复合物”或“肽-MHC复合物”或其变体是指肽抗原与MHC分子的复合物或缔合物，例如通常通过所述肽在MHC分子的结合沟或裂缝中的非共价相互作用来形成。在一些实施方案中，MHC-肽复合物存在或展示于细胞表面上。在一些实施方案中，MHC-肽复合物可以由抗原受体(如TCR、TCR样CAR或其抗原结合部分)特异性地识别。
在一些实施方案中，多肽的肽(如肽抗原或表位)可以与MHC分子缔合，例如用于由抗原受体识别。通常，肽源自或基于较长生物分子(如多肽或蛋白质)的片段。在一些实施方案中，肽的长度通常为约8至约24个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度为从或从约9至22个氨基酸，用于在MHC II类复合物中识别。在一些实施方案中，肽的长度为从或从约8至13个氨基酸，用于在MHC I类复合物中识别。在一些实施方案中，在识别MHC分子(如MHC-肽复合物)背景下的肽后，抗原受体(如TCR或TCR样CAR)产生或触发激活信号至T细胞，从而诱导T细胞应答，如T细胞增殖、细胞因子产生、细胞毒性T细胞应答或其他应答。
在一些实施方案中，TCR样抗体或抗原结合部分是已知的或可通过已知方法产生(参见例如，美国公开申请号US 2002/0150914；US 2003/0223994；US 2004/0191260；US2006/0034850；US 2007/00992530；US 20090226474；US 20090304679；和国际PCT公开号WO03/068201)。
在一些实施方案中，与MHC-肽复合物特异性地结合的抗体或其抗原结合部分可以通过用有效量的含有特定MHC-肽复合物的免疫原对宿主进行免疫来产生。在一些情况下，MHC-肽复合物的肽是能够与MHC结合的抗原的表位，所述抗原是例如肿瘤抗原，例如通用肿瘤抗原、骨髓瘤抗原或如下文所述的其他抗原。在一些实施方案中，然后向宿主给予有效量的免疫原以用于引发免疫应答，其中免疫原保持其三维形式持续足以引发针对所述肽在MHC分子的结合沟中的三维呈现的免疫应答的时间段。然后测定从宿主中收集的血清以确定是否产生了识别MHC分子结合沟中的肽的三维呈现的所需抗体。在一些实施方案中，可以评估所产生的抗体以确认所述抗体可以区分所述MHC-肽复合物与单独的MHC分子、单独的目的肽以及MHC与无关肽的复合物。然后可以分离所需抗体。
在一些实施方案中，与MHC-肽复合物特异性地结合的抗体或其抗原结合部分可以通过采用抗体文库展示方法(如噬菌体抗体文库)来产生。在一些实施方案中，可以产生突变型Fab、scFv或其他抗体形式的噬菌体展示文库，例如，其中所述文库的成员在一个或多个CDR的一个或多个残基处发生突变。参见例如，美国公开申请号US 20020150914、US2014/0294841；和Cohen CJ.等人(2003)J Mol.Recogn.16:324-332。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性地结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性地识别全长抗体的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别是选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方案中，抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。
所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和单结构域VH单一抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单一VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方案中，CAR包含特异性地结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原例如癌症标记或待靶向的细胞或疾病(例如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，例如本文所述或已知的任何靶抗原。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段，如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区或链的那些，和/或可能并非通过酶消化天然存在的完整抗体产生的片段。在一些实施方案中，抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是这样的抗体，其中全部或基本上全部CDR氨基酸残基源自非人CDR并且全部或基本上全部FR氨基酸残基源自人FR。人源化抗体任选地可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指所述非人抗体的变体，其已经经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，衍生出CDR残基的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
因此，在一些实施方案中，嵌合抗原受体(包括TCR样CAR)包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些实施方案中，所述抗体或片段包括scFv。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导区域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
在一些实施方案中，重组受体(如CAR，如其抗体部分)进一步包括间隔子，所述间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或经修饰形式，如铰链区(例如，IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，重组受体进一步包含间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的。在一些方面，恒定区的所述部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况相比，间隔子的长度可以提供在抗原结合后增加的细胞应答性。在一些例子中，间隔子的长度是为或约12个氨基酸或者长度不超过12个氨基酸。示例性间隔子包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸，约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸(并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施方案中，间隔子区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔子包括仅IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153；Hudecek等人(2015)Cancer Immunol Res.3(2):125–135或国际专利申请公开号WO2014031687。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:1中所示的序列，并且由SEQ IDNO:2中所示的序列编码。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:3中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:4中所示的序列。
在一些方面，间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子：(a)包含全部或部分免疫球蛋白铰链或其修饰形式或由其组成，或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28胞外区或CD8胞外区，(b)包含全部或部分免疫球蛋白铰链(任选地IgG4铰链)或其修饰形式或由其组成，和/或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28胞外区或CD8胞外区，或(c)长度为或约12个氨基酸和/或包含全部或部分免疫球蛋白铰链(任选地IgG4铰链)或其修饰形式或由其组成；或(d)由以下组成或包含以下：SEQ ID NO:1、3-5、27-34或58中所示的氨基酸序列或前述任一项的具有与前述任一项的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，或(e)包含式X1PPX2P(其中X1是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸并且X2是半胱氨酸或苏氨酸)或由其组成。
在一些实施方案中，所述恒定区或部分是IgD的。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:5中所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有展现与SEQ ID NO:1、3、4和5中的任一序列至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
抗原识别结构域通常与一种或多种细胞内信号传导组分(如通过抗原受体复合物(如TCR复合物)(在CAR的情况下)模拟激活和/或通过另一种细胞表面受体模拟信号的信号传导组分)连接。因此，在一些实施方案中，抗原结合组分(例如，抗体)与一个或多个跨膜和细胞内信号传导区域连接。在一些实施方案中，跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一个实施方案中，使用天然与受体(例如，CAR)中的一个结构域缔合的跨膜结构域。在一些情形中，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然来源或源自合成来源。在来源是天然的情况下，结构域在一些方面源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下的那些(即，包含以下的至少一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域来实现。
细胞内信号传导区域包括模拟或接近通过天然抗原受体的信号、通过这种受体与共刺激受体组合的信号和/或仅通过共刺激受体的信号的那些。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度在2与10个氨基酸之间的接头(如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)，并且在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。
受体(例如，CAR)通常包括至少一种或多种细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，ROR1结合抗体与一个或多个细胞信号传导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如，CAR)进一步包括一种或多种另外的分子(如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR包括CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在连接CAR后，CAR的胞质结构域或细胞内信号传导区域激活免疫细胞(例如，工程化以表达CAR的T细胞)的正常效应子功能或应答中的至少一种。例如，在一些情况下，CAR诱导T细胞的功能，如细胞溶解活性或T辅助活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导区域的截短部分(例如，如果其转导效应子功能信号的话)代替完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域(例如，包含一个或多个细胞内结构域)包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景下与这种受体协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要通过TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于产生次级或共刺激信号的组分也被包括在CAR中。在其他实施方案中，CAR不包括用于产生共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于产生次级或共刺激信号的组分。
在一些方面，将T细胞激活描述为由两个类别的胞质信号传导序列来介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些序列(初级胞质信号传导序列)以及以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。
在一些方面，CAR包括调节所述TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括源自TCR或CD3ζ、FcRγ或FcRβ的那些。在一些实施方案中，CAR中的一种或多种胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。
在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体(如CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS)的信号传导区域和/或跨膜部分。在一些方面，同一CAR包括信号传导区域和共刺激组分两者。
在一些实施方案中，信号传导区域包括于一种CAR内，而共刺激组分是由识别另一种抗原的另一种CAR提供。在一些实施方案中，CAR包括在同一细胞上表达的激活或刺激CAR和共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。
在某些实施方案中，细胞内信号传导区域包含连接至CD3(例如，CD3-ζ)细胞内结构域的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含与CD3ζ细胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR涵盖在胞质部分中的一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如，初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合后仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是在一些方面包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv或单结构域VH抗体，并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括设置在细胞外结构域与细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域，如在跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，受体进一步包括含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分(如Ig铰链，例如IgG4铰链)的间隔子，如仅铰链间隔子。
在一些实施方案中，受体(例如CAR)的跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域或其变体，例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域，或者是包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:8至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域；在一些实施方案中，含有重组受体的部分的跨膜结构域包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:9的至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如其41个氨基酸的结构域，和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的这种结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包含SEQ ID NO:10或11中所示的氨基酸序列，或展现与SEQ ID NO:10或11至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内区域包含4-1BB的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，例如人4-1BB(登录号Q07011.1)的42个氨基酸的胞质结构域或其功能变体或部分，例如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:12至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含人CD3链、任选地CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的亚型3的112个AA的胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含SEQ ID NO:13、14或15中所示的氨基酸序列或展现与SEQID NO:13、14或15至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如SEQ ID NO:1中所示的仅铰链间隔子。在其他实施方案中，间隔子是与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:3中所示。在一些实施方案中，间隔子是仅与CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:4中所示。在一些实施方案中，所述间隔子是或包含富含甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。
2.T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，提供了工程化细胞(如T细胞)，其表达识别靶多肽(如肿瘤、病毒或自身免疫蛋白的抗原)的肽表位或T细胞表位的T细胞受体(TCR)或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，“T细胞受体”或“TCR”是含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRα和TCRβ)的分子或其抗原结合部分，并且所述分子或其抗原结合部分能够与结合至MHC分子的肽特异性地结合。在一些实施方案中，TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR在结构上大体相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖学位置或功能。TCR可以在细胞的表面上发现或以可溶形式发现。通常，在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上发现TCR，在此处它通常负责识别结合至主要组织相容性复合物(MHC)分子的抗原。
除非另有说明，否则术语“TCR”应当理解为涵盖完整的TCR以及其抗原结合部分或抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR是完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的TCR。在一些实施方案中，TCR是这样的抗原结合部分，其少于全长TCR但与在MHC分子中结合的特定肽结合，如与MHC-肽复合物结合。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但是仍能够结合完整TCR所结合的肽表位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域(如TCR的可变α链和可变β链)，足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。通常，TCR的可变链含有参与对肽、MHC和/或MHC-肽复合物的识别的互补决定区。
在一些实施方案中，TCR的可变结构域含有超变环或互补决定区(CDR)，其通常是抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开，与CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之间展示较低可变性(参见例如，Jores等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者在给定TCR可变区上的三个CDR之间对于抗原识别和/或对于与肽-MHC复合物的经处理肽部分的相互作用最重要。在一些情况下，所述α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些情况下，所述β链的CDR1可以与所述肽的C末端部分相互作用。在一些情况下，CDR2对与MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或识别具有最大贡献或者是主要的负责CDR。在一些实施方案中，所述β-链的可变区可以含有另外的高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合而非抗原识别(Kotb(1995)ClinicalMicrobiology Reviews,8:411-426)。
在一些实施方案中，TCR还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见例如，Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,第3版,Current Biology Publications,第4:33页,1997)。在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C末端的短胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。
在一些实施方案中，TCR链含有一个或多个恒定结构域。例如，给定TCR链(例如，α链或β链)的细胞外部分可以含有与细胞膜相邻的两个免疫球蛋白样结构域，如可变结构域(例如，Vα或Vβ；通常为基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,“Sequences ofProteins of Immunological Interest”,US Dept.Health and Human Services,PublicHealth Service National Institutes of Health,1991,第5版)和恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Cα，通常为基于Kabat编号的链的位置117至259；或β链恒定结构域或Cβ，通常为基于Kabat的链的位置117至295)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，所述可变结构域各自含有CDR。TCR的恒定结构域可以含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可以在α链和β链中的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。
在一些实施方案中，TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，TCR链含有胞质尾。在一些情况下，所述结构允许TCR与其他分子(像CD3)及其亚基缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中并与CD3信号传导设备或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链)的细胞内尾含有TCR复合物的信号传导能力中所涉及的一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或者任选地γ和δ)的异二聚体，或者它可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有如通过一个或多个二硫键连接的两条单独链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体。
在一些实施方案中，TCR可以从一个或多个已知的TCR序列(如Vα、Vβ链的序列)产生，所述一个或多个已知的TCR序列的基本上全长的编码序列是容易获得的。用于从细胞来源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞中分离的编码TCR的核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过公众可获得的TCR DNA序列的合成获得。
在一些实施方案中，TCR是从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞(例如细胞毒性T细胞))、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，TCR是胸腺选择的TCR。在一些实施方案中，TCR是新表位限制性TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是经培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分或其抗原结合片段可以根据对所述TCR序列的知识以合成方式产生。
在一些实施方案中，TCR是从通过针对靶多肽抗原或其靶T细胞表位筛选候选TCR文库而鉴定或选择的TCR产生的。TCR文库可以通过扩增来自T细胞的Vα和Vβ库来产生，所述T细胞是从受试者中分离的，包括存在于PBMC、脾或其他淋巴器官中的细胞。在一些情况下，T细胞可以从肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增。在一些实施方案中，TCR文库可以从CD4+或CD8+细胞产生。在一些实施方案中，TCR可以从正常或健康受试者的T细胞来源扩增，即正常TCR文库。在一些实施方案中，TCR可以从患病受试者的T细胞来源扩增，即患病TCR文库。在一些实施方案中，使用简并引物扩增Vα和Vβ的基因库，如在从人获得的样品(如T细胞)中通过RT-PCR扩增。在一些实施方案中，scTv文库可以从天然Vα和Vβ文库组装，其中经扩增的产物被克隆或组装以通过接头隔开。根据受试者和细胞的来源，所述文库可以是HLA等位基因特异性的。可替代地，在一些实施方案中，TCR文库可以通过亲本或支架TCR分子的诱变或多样化产生。在一些方面，使TCR经历例如α或β链的定向进化，如通过诱变来进行。在一些方面，TCR的CDR内的特定残基被改变。在一些实施方案中，可以通过亲和力成熟来修饰经选择的TCR。在一些实施方案中，可以如通过筛选以评估针对肽的CTL活性来选择抗原特异性T细胞。在一些方面，可以选择例如存在于抗原特异性T细胞上的TCR，如通过结合活性，例如对抗原的特定亲和力或亲合力来选择。
在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体包括重组T细胞受体(TCR)和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。在一些实施方案中，从患者鉴定、分离靶抗原(例如，癌抗原)的高亲和力T细胞克隆，并将其引入细胞中。在一些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠中产生针对靶抗原的TCR克隆。参见例如，肿瘤抗原(参见例如，Parkhurst等人(2009)Clin Cancer Res.15:169-180和Cohen等人(2005)J Immunol.175:5799-5808。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶抗原的TCR(参见例如，Varela-Rohena等人(2008)Nat Med.14:1390-1395和Li(2005)NatBiotechnol.23:349-354。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分是已修饰或工程化的TCR或其抗原结合部分。在一些实施方案中，使用定向进化方法来产生具有改变的特性(如对特定MHC-肽复合物具有较高亲和力)的TCR。在一些实施方案中，定向进化通过展示方法实现，所述展示方法包括但不限于酵母展示(Holler等人(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)ProcNatl Acad Sci U S A,97,5387-92)；噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)或T细胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示方法涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作模板以用于产生经诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基被突变，并且选择具有所需改变的特性(如对所需靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。
在一些实施方案中，用于产生或生成目的TCR的靶多肽的肽是已知的或可以由熟练技术人员容易地鉴定。在一些实施方案中，适用于产生TCR或抗原结合部分的肽可以基于目的靶多肽(如下文所述的靶多肽)中HLA限制性基序的存在来确定。在一些实施方案中，使用可用的计算机预测模型来鉴定肽。在一些实施方案中，对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(Singh和Raghava(2001)Bioinformatics 17(12):1236-1237)和SYFPEITHI(参见Schuler等人(2007)Immunoinformatics Methods in MolecularBiology,409(1):75-93 2007)。在一些实施方案中，MHC限制性表位是HLA-A0201，其在所有高加索人的大约39％-46％中表达，并且因此代表用于制备TCR或其他MHC-肽结合分子的MHC抗原的合适选择。
使用计算机预测模型的HLA-A0201结合基序以及蛋白酶体和免疫蛋白酶体的切割位点是已知的。对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(更详细地描述于Singh和Raghava,ProPred:prediction of HLA-DR binding sites.BIOINFORMATICS17(12):1236-1237 2001中)和SYFPEITHI(参见Schuler等人SYFPEITHI,Database forSearching and T-Cell Epitope Prediction.，Immunoinformatics Methods inMolecular Biology,第409(1)卷:75-93 2007)。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白或其突变形式，其中一种或多种特性(如结合特征)已发生改变。在一些实施方案中，TCR可以源自多个动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。TCR可以是细胞结合的或呈可溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，TCR呈在细胞表面上表达的细胞结合形式。
在一些实施方案中，TCR是全长TCR。在一些实施方案中，TCR是抗原结合部分。在一些实施方案中，TCR是二聚体TCR(dTCR)。在一些实施方案中，TCR是单链TCR(sc-TCR)。在一些实施方案中，dTCR或scTCR具有如WO 03/020763、WO 04/033685、WO 2011/044186中所述的结构。
在一些实施方案中，TCR含有对应于跨膜序列的序列。在一些实施方案中，TCR确实含有对应于胞质序列的序列。在一些实施方案中，TCR能够形成与CD3的TCR复合物。在一些实施方案中，任何TCR(包括dTCR或scTCR)可以与信号传导结构域连接，从而在T细胞表面上产生活性TCR。在一些实施方案中，TCR在细胞表面上表达。
在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽(其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)和第二多肽(其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)，所述第一和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，所述键可以对应于天然二聚体αβTCR中存在的天然链间二硫键。在一些实施方案中，链间二硫键不存在于天然TCR中。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键两者。在一些实施方案中，TCR含有跨膜序列以锚定至膜。
在一些实施方案中，dTCR含有TCRα链，所述TCRα链含有可变α结构域、恒定α结构域和附接至恒定α结构域C末端的第一二聚化基序；以及TCRβ链，所述TCRβ链包含可变β结构域、恒定β结构域和附接至恒定β结构域C末端的第一二聚化基序，其中所述第一和第二二聚化基序易于相互作用以在第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将TCRα链与TCRβ链连接在一起。
在一些实施方案中，TCR是scTCR。通常，可以使用已知的方法产生scTCR，参见例如，Soo Hoo,W.F.等人PNAS(USA)89,4759(1992)；Wülfing,C.和Plückthun,A.,J.Mol.Biol.242,655(1994)；Kurucz,I.等人PNAS(USA)90 3830(1993)；国际公开PCT号WO96/13593、WO 96/18105、WO 99/60120、WO 99/18129、WO 03/020763、WO 2011/044186；和Schlueter,C.J.等人J.Mol.Biol.256,859(1996)。在一些实施方案中，scTCR含有引入的非天然链间二硫键以促进TCR链的缔合(参见例如，国际公开PCT号WO 03/020763)。在一些实施方案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中与其C末端融合的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如，国际公开的PCT号WO 99/60120)。在一些实施方案中，scTCR含有通过肽接头与TCRβ可变结构域共价连接的TCRα可变结构域(参见例如，国际公开PCT号WO 99/18129)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成)、第二区段(其由与对应于TCRβ链恒定结构域细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成)和接头序列(其将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与α链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的α链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列β链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的β链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与β链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的TCRβ链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列α链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的α链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR的连接第一和第二TCR区段的接头可以是能够在保持TCR结合特异性的同时形成单条多肽链的任何接头。在一些实施方案中，接头序列可以例如具有式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸并且AA代表氨基酸序列，其中氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，第一和第二区段配对，使得其可变区序列针对这种结合取向。因此，在一些情况下，接头具有足够的长度以跨越第一区段的C末端与第二区段的N末端之间的距离，或反之亦然，但是不能太长而阻断或减少scTCR与靶配体的结合。在一些实施方案中，接头可以含有从或从约10至45个氨基酸，如10至30个氨基酸或26至41个氨基酸残基，例如29、30、31或32个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头具有式-PGGG-(SGGGG)5-P-，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸，并且S是丝氨酸(SEQ ID NO:22)。在一些实施方案中，所述接头具有序列GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQ ID NO:23)。
在一些实施方案中，scTCR含有共价二硫键，其将α链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基连接至β链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基。在一些实施方案中，天然TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入scTCR多肽的第一和第二区段的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键两者。
在dTCR或scTCR含有引入的链间二硫键的一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸被取代为另一种残基，如丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，引入的二硫键可以通过使第一和第二区段上的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成。TCR的示例性非天然二硫键描述于已公开的国际PCT号WO 2006/000830中。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段展现出对靶抗原的亲和力，其平衡结合常数在或在约10-5与10-12M之间以及其中的所有单独值和范围。在一些实施方案中，靶抗原是MHC-肽复合物或配体。
在一些实施方案中，编码TCR(如α和β链)的一种或多种核酸可以通过PCR、克隆或其他合适的手段扩增，并且克隆到一种或多种合适的表达载体中。表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
在一些实施方案中，载体可以是以下系列的载体：pUC系列(Fermentas LifeSciences)、pBluescript系列(Stratagene，加利福尼亚州拉霍亚)、pET系列(Novagen，威斯康星州麦迪逊)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉)或pEX系列(Clontech，加利福尼亚州帕罗奥图)。在一些情况下，也可以使用噬菌体载体，如λG10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在一些实施方案中，可以使用植物表达载体，并且包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在一些实施方案中，动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。在一些实施方案中，使用病毒载体，如逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，重组表达载体可以使用标准的重组DNA技术来制备。在一些实施方案中，载体可以含有调节序列(如转录和翻译起始和终止密码子)，其对引入载体的宿主(例如，细菌、真菌，植物或动物)的类型具有特异性，酌情并考虑所述载体是基于DNA还是基于RNA。在一些实施方案中，载体可以含有非天然启动子，其与编码TCR或抗原结合部分(或其他MHC-肽结合分子)的核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，所述启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。还设想了其他已知的启动子。
在一些实施方案中，在获得T细胞克隆后，将TCRα和β链分离并克隆到基因表达载体中。在一些实施方案中，TCRα和β基因经由小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽连接，使得两条链共表达。在一些实施方案中，TCR的遗传转移是通过逆转录病毒或慢病毒载体或通过转座子完成(参见例如，Baum等人(2006)Molecular Therapy:The Journal of the AmericanSociety of Gene Therapy.13:1050-1063；Frecha等人(2010)Molecular Therapy:TheJournal of the American Society of Gene Therapy.18:1748-1757；和Hackett等人(2010)Molecular Therapy:The Journal of the American Society of GeneTherapy.18:674-683。
在一些实施方案中，为了产生编码TCR的载体，将α和β链从表达目的TCR的T细胞克隆中分离的总cDNA进行PCR扩增，并且将其克隆到表达载体中。在一些实施方案中，将α和β链克隆到同一载体中。在一些实施方案中，将α和β链克隆到不同的载体中。在一些实施方案中，将所产生的α和β链掺入逆转录病毒(例如，慢病毒)载体中。
3.嵌合自身抗体受体(CAAR)
在一些实施方案中，重组受体是嵌合自身抗体受体(CAAR)。在一些实施方案中，CAAR对自身抗体具有特异性。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞(如工程化以表达CAAR的T细胞)可以用于特异性地结合并杀伤表达自身抗体的细胞，但不杀伤表达正常抗体的细胞。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以用于治疗与自身抗原的表达相关的自身免疫性疾病，如自身免疫性疾病。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以靶向最终产生自身抗体并在其细胞表面上展示自身抗体的B细胞，将这些B细胞标记为用于治疗干预的疾病特异性靶标。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以用于通过使用抗原特异性嵌合自身抗体受体靶向引起疾病的B细胞，有效靶向和杀死自身免疫性疾病中的致病性B细胞。在一些实施方案中，重组受体是CAAR，如美国专利申请公开号US 2017/0051035中所述的任一种。
在一些实施方案中，CAAR包含自身抗体结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导区域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含次级或共刺激信号传导区域(次级细胞内信号传导区域)。
在一些实施方案中，自身抗体结合结构域包含自身抗原或其片段。自身抗原的选择可以取决于所靶向的自身抗体的类型。例如，可以因为自身抗原识别与特定疾病状态(例如自身免疫性疾病，如自身抗体介导的自身免疫性疾病)相关的靶细胞(如B细胞)上的自身抗体而选择所述自身抗原。在一些实施方案中，自身免疫性疾病包括寻常型天疱疮(PV)。示例性自身抗原包括桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)和Dsg3。
4.多靶向
在一些实施方案中，所述细胞和方法包括多靶向策略，如在细胞上表达两种或更多种基因工程化受体，每种受体识别相同或不同的抗原，并且通常各自包括不同的细胞内信号传导组分。此类多靶向策略描述于例如以下文献中：国际专利申请公开号WO2014055668A1(描述激活和共刺激CAR的组合，例如，靶向单独存在于脱靶(例如正常细胞)上，但仅一起存在于待治疗疾病或病症的细胞上的两种不同抗原)和Fedorov等人，Sci.Transl.Medicine，5(215)(2013年12月)(描述表达激活和抑制性CAR的细胞，例如其中激活CAR结合至同时在正常或非患病细胞和待治疗疾病或病症的细胞上表达的一种抗原，并且抑制性CAR结合至仅在正常细胞或不希望治疗的细胞上表达的另一种抗原的那些细胞)。
例如，在一些实施方案中，细胞包括表达第一基因工程化抗原受体(例如，CAR或TCR)的受体，其通常在与由第一受体识别的抗原(例如，第一抗原)特异性地结合后能够诱导激活或刺激信号至所述细胞。在一些实施方案中，细胞进一步包括第二基因工程化抗原受体(例如，CAR或TCR)，例如嵌合共刺激受体，所述受体通常在与由第二受体识别的第二抗原特异性地结合后能够诱导共刺激信号至免疫细胞。在一些实施方案中，第一抗原与第二抗原是相同的。在一些实施方案中，第一抗原与第二抗原是不同的。
在一些实施方案中，第一和/或第二基因工程化抗原受体(例如CAR或TCR)能够诱导激活或刺激信号至所述细胞。在一些实施方案中，受体包括含有ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，由第一受体诱导的激活涉及信号转导或细胞中蛋白质表达的变化，从而导致免疫应答(如ITAM磷酸化)的起始和/或ITAM介导的信号转导级联的起始、免疫突触的形成和/或所结合受体(例如CD4或CD8等)附近的分子的聚簇、一种或多种转录因子(如NF-κB和/或AP-1)的激活和/或对诸如细胞因子等因子的基因表达的诱导、增殖和/或存活。
在一些实施方案中，第一和/或第二受体包括共刺激受体的细胞内信号传导结构域，所述共刺激受体例如CD28、CD137(4-1BB)、OX40和/或ICOS。在一些实施方案中，所述第一和第二受体包括不同的共刺激受体的细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，第一受体含有CD28共刺激信号传导区域，并且第二受体含有4-1BB共刺激信号传导区域，或反之亦然。
在一些实施方案中，第一和/或第二受体包括含有ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导结构域和共刺激受体的细胞内信号传导结构域两者。
在一些实施方案中，第一受体含有包含ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导结构域，并且第二受体含有共刺激受体的细胞内信号传导结构域。与在相同细胞中诱导的激活或刺激信号组合的共刺激信号是导致免疫应答的共刺激信号，所述免疫应答例如为稳健且持续的免疫应答，例如增加的基因表达，细胞因子和其他因子的分泌，以及T细胞介导的效应子功能(如细胞杀伤)。
在一些实施方案中，仅第一受体的连接和仅第二受体的连接都不会诱导稳健的免疫应答。在一些方面，如果仅连接一种受体，则细胞变得耐受抗原或对抗原无反应，或被抑制，和/或不被诱导增殖或分泌因子或实现效应子功能。然而，在一些此类实施方案中，在连接所述多种受体时，如在遇到表达第一和第二抗原的细胞时，实现所需反应，如完全免疫激活或刺激，例如如通过一种或多种细胞因子的分泌、增殖、持久性和/或实施免疫效应子功能(如对靶细胞的细胞毒性杀伤)所指示。
在一些实施方案中，两种受体分别将激活和抑制信号诱导至细胞，使得一种受体与其抗原的结合激活细胞或诱导反应，但是第二抑制性受体与其抗原的结合诱导了抑制或减弱该反应的信号。例子是激活CAR与抑制性CAR或iCAR的组合。例如，可以使用这种策略，其中激活CAR结合在疾病或病症中表达但也在正常细胞上表达的抗原，并且抑制性受体结合在正常细胞上表达但不在疾病或病症的细胞上表达的单独抗原。
在一些实施方案中，表达重组受体的细胞进一步包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013))，如识别除了与疾病或病症相关和/或为所述疾病或病症特有的抗原以外的抗原的CAR，由此通过抑制性CAR与其配体的结合减小或抑制通过靶向疾病的CAR递送的激活信号，例如以减小脱靶效应。
在一些实施方案中，两种受体分别将激活和抑制信号诱导至细胞，使得一种受体与其抗原的连接激活细胞或诱导应答，但是第二抑制性受体与其抗原的连接诱导抑制或减弱该应答的信号。例子是激活CAR与抑制性CAR(iCAR)的组合。例如，可以使用这种策略以降低在下述情况下的脱靶效应的可能性，在所述情况中激活CAR结合在疾病或病症中表达但也在正常细胞上表达的抗原，并且抑制性受体结合至在正常细胞上表达但不在疾病或病症的细胞上表达的单独抗原。
在一些方面，嵌合受体是或包括抑制性CAR(例如，iCAR)，并且包括减弱或抑制免疫应答(例如细胞中ITAM和/或共刺激促进的应答)的细胞内组分。此类细胞内信号传导组分的示例是在免疫检查点分子(包括PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、EP2/4腺苷受体(包括A2AR))上发现的那些组分。在一些方面，工程化细胞包括抑制性CAR，所述抑制性CAR包含这样的抑制性分子的信号传导结构域或源自这样的抑制性分子的信号传导结构域，使得其起到减弱细胞的应答(例如，由激活和/或共刺激性CAR诱导的应答)的作用。
在一些实施方案中，所述多靶向策略用于以下情况：其中与特定疾病或病症相关的抗原在未患病细胞上表达和/或在工程化细胞本身上表达，所述表达为瞬时表达(例如，在与基因工程化相关的刺激后)或永久表达。在此类情况下，因为需要连接两种分开且单独特异性的抗原受体，可以改善特异性、选择性和/或功效。
在一些实施方案中，所述多种抗原(例如，第一和第二抗原)在所靶向的细胞、组织或者疾病或病症上(如在癌细胞上)表达。在一些方面，细胞、组织、疾病或病症是多发性骨髓瘤或多发性骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，所述多种抗原中的一种或多种通常也在不需要用细胞疗法靶向的细胞(如正常或未患病细胞或组织)和/或工程化细胞本身上表达。在此类实施方案中，因为需要连接多种受体以实现细胞应答，实现特异性和/或功效。
IV.制品和试剂盒
还提供了制品，如试剂盒和装置，用于根据所提供用于过继细胞疗法的方法将细胞给予至受试者，以及用于储存和给予细胞和组合物。
制品包括一个或多个容器(通常多个容器)、包装材料、以及在一个或多个容器和/或包装上或与一个或多个容器和/或包装相关的标签或包装说明书(通常包括用于将细胞给予受试者的说明书)。
在一些实施方案中，提供了制品和/或试剂盒，其包括包含治疗有效量的本文所述的任何工程化细胞的组合物，以及向受试者给药以治疗疾病或病症的说明书。在一些实施方案中，所述说明书可以指定本文所提供方法的一些或所有要素。在一些实施方案中，所述说明书指定给予用于细胞疗法的细胞的具体指导，例如，用于给予的剂量、时间安排、受试者的选择和/或鉴定以及用于给予的条件。在一些实施方案中，所述说明书可以作为伴随用于给予的组合物的标签或包装说明书而包含在内。在一些实施方案中，所述说明书指定确定待给予的组合物的剂量，例如其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积
容器通常含有待给予的细胞，例如，其一个或多个单位剂量。制品通常包括多个容器，每个容器含有单一单位剂量的细胞。单位剂量可以是待以第一剂量给予受试者的细胞的量或数量，或者是待以第一剂量或任何一个或多个连续剂量给予的细胞的数量的两倍(或更多)。它可以是结合给予方法将向受试者给予的细胞的最低剂量或最低可能剂量。在一些实施方案中，单位剂量是根据本文的方法，将以单剂量给予患有特定疾病或病症的任何受试者或任何受试者的最小细胞数量或细胞数量，或参考单位或目标参考单位或在目标范围内的参考单位的最小数量。
在一些实施方案中，单位剂量中的细胞数量是期望以一定剂量给予至特定受试者(如已经衍生出细胞的受试者)的细胞的数量或重组受体表达细胞或CAR表达细胞的数量、或某一表型的此类细胞(例如表达或不表达选自CD4、CD8、CCR7、CD27、CD45RA、膜联蛋白V、或激活的半胱天冬酶3的一种或多种标记的细胞)的数量、百分比、比率、频率和/或比例。在一些实施方案中，单位剂量中的细胞数量是期望以一定剂量给予至特定受试者(如已经衍生出细胞的受试者)的细胞的数量或重组受体表达细胞或CAR表达细胞的数量、或某一表型的此类细胞(例如CCR7+、CD27+、CD45RA+、CD45RA–、CD4+、CD8+、凋亡标记阴性(例如膜联蛋白V–或半胱天冬酶3–)细胞，或对前述中的任何一种或多种呈阳性或阴性的细胞)的数量、百分比、比率、频率和/或比例。
在一些实施方案中，单位剂量中的细胞数量是期望以一定剂量给予至特定受试者(如已经衍生出细胞的受试者)的细胞的数量或重组受体表达细胞或CAR表达细胞的数量、或某一表型的此类细胞(例如CCR7+/CD4+、CCR7+/CD8+、CD27+/CD4+、CD27+/CD8+、CD45RA+/CD4+、CD45RA+/CD8+、CCR7–/CD4+、CCR7–/CD8+、CD27–/CD4+、CD27–/CD8+、CD45RA–/CD4+、CD45RA–/CD8+、CCR7+/CD27+/CD4+、CCR7+/CD27+/CD8+、CCR7+/CD45RA–/CD4+、CCR7+/CD45RA–/CD8+、CCR7–/CD45RA–/CD4+、CCR7–/CD45RA–/CD8+、CCR7–/CD27–/CD4+、CCR7–/CD27–/CD8+；和凋亡标记阴性(例如膜联蛋白V–或半胱天冬酶3–)细胞)的数量、百分比、比率和/或比例。在一些实施方案中，细胞的限定数量包括期望以一定剂量给予至特定受试者(如已经衍生出细胞的受试者)的细胞的数量或重组受体表达细胞或CAR表达细胞的数量、或某一表型的此类细胞(例如CCR7+/CD4+、CCR7+/CD8+、CD27+/CD4+、CD27+/CD8+、CD45RA+/CD4+、CD45RA+/CD8+、CCR7–/CD4+、CCR7–/CD8+、CD27–/CD4+、CD27–/CD8+、CD45RA–/CD4+、CD45RA–/CD8+、CCR7+/CD27+/CD4+、CCR7+/CD27+/CD8+、CCR7+/CD45RA–/CD4+、CCR7+/CD45RA–/CD8+、CCR7–/CD45RA–/CD4+、CCR7–/CD45RA–/CD8+、CCR7–/CD27–/CD4+、CCR7–/CD27–/CD8+；和凋亡标记阴性(例如膜联蛋白V–或半胱天冬酶3–)细胞、和/或其任何子集)的数量、百分比、比率和/或比例。在一些实施方案中，细胞已经源自要通过如本文提供的方法治疗或对其有需要的受试者。
在一些实施方案中，所述说明书指定细胞组合物中的细胞或一种或多种细胞类型的剂量或数量和/或细胞或细胞类型的频率、比率和/或百分比，所述细胞或细胞类型例如单独群体、表型或亚型，如具有以下表型的那些：膜联蛋白V–/CCR7+/CAR+；膜联蛋白V–/CCR7+/CAR+/CD4+；膜联蛋白V–/CCR7+/CAR+/CD8+；膜联蛋白V–/CD27+/CAR+；膜联蛋白V–/CD27+/CAR+/CD4+；膜联蛋白V–/CD27+/CAR+/CD8+；膜联蛋白V–/CCR7+/CD27+/CAR+；膜联蛋白V–/CCR7+/CD27+/CAR+/CD4+；膜联蛋白V–/CCR7+/CD27+/CAR+/CD8+；膜联蛋白V–/CCR7+/CD45RA–/CAR+；膜联蛋白V–/CCR7+/CD45RA–/CAR+/CD4+；膜联蛋白V–/CCR7+/CD45RA–/CAR+/CD8+；膜联蛋白V–/CCR7–/CD45RA–/CAR+；膜联蛋白V–/CCR7–/CD45RA–/CAR+/CD4+；膜联蛋白V–/CCR7–/CD45RA–/CAR+/CD8+；膜联蛋白V–/CCR7–/CD27–/CAR+、膜联蛋白V–/CCR7–/CD27–/CAR+/CD4+；膜联蛋白V–/CCR7–/CD27–/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CAR+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CAR+/CD4+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3–/CD27+/CAR+；激活的半胱天冬酶3–/CD27+/CAR+/CD4+；激活的半胱天冬酶3–/CD27+/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CD27+/CAR+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CD27+/CAR+/CD4+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CD27+/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CD45RA–/CAR+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CD45RA–/CAR+/CD4+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7+/CD45RA–/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7–/CD45RA–/CAR+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7–/CD45RA–/CAR+/CD4+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7–/CD45RA–/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7–/CD27–/CAR+；激活的半胱天冬酶3–/CCR7–/CD27–/CAR+/CD4+；和/或激活的半胱天冬酶3–/CCR7–/CD27–/CAR+/CD8+；或其组合。
在一些实施方案中，所述制品含有细胞的单位剂量，所述单位剂量含有限定数量、比率或百分比的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的工程化CD8+T细胞和/或限定数量的表达CCR7的工程化CD4+T细胞；和/或限定比率的表达CCR7的CD8+T细胞和/或表达CCR7的CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述制品含有用于向患有疾病或病症的受试者给予治疗性组合物，任选地其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积的说明书，和/或用于评估本文所述的任一种表型的说明书和/或用于确定用于给予的剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积的说明书。限定数量、比率或百分比的具有特定表型的CAR+表达细胞的示例性单位剂量包括如在整个本公开中所述的任一种。
在一些实施方案中，每个容器单独地包含细胞的单位剂量，例如包括相同或基本上相同数量的细胞或相同或基本上相同数量的重组受体表达细胞或CAR表达细胞、或相同或基本上相同数量的某一表型的此类细胞(例如CCR7+/CD4+、CCR7+/CD8+、CD27+/CD4+、CD27+/CD8+、CD45RA+/CD4+、CD45RA+/CD8+、CCR7–/CD4+、CCR7–/CD8+、CD27–/CD4+、CD27–/CD8+、CD45RA–/CD4+、CD45RA–/CD8+、CCR7+/CD27+/CD4+、CCR7+/CD27+/CD8+、CCR7+/CD45RA–/CD4+、CCR7+/CD45RA–/CD8+、CCR7–/CD45RA–/CD4+、CCR7–/CD45RA–/CD8+、CCR7–/CD27–/CD4+、CCR7–/CD27–/CD8+；和凋亡标记阴性(例如膜联蛋白V–或半胱天冬酶3–)细胞)。在一些实施方案中，每个容器单独地包含细胞的单位剂量，例如包括相同或基本上相同的数量的目标参考单位或在目标范围内的数量的参考单位。
在一些实施方案中，所述制品或试剂盒包含含有表达重组受体的多种CD4+T细胞的容器(任选地小瓶)，和含有表达重组受体的多种CD8+T细胞的容器(任选地小瓶)。在一些实施方案中，所述制品或试剂盒包含含有表达重组受体的多种CD4+T细胞的容器(任选地小瓶)，并且在同一容器中进一步包含表达重组受体的多种CD8+T细胞。在一些实施方案中，低温保护剂与所述细胞一起被包括。在一些方面，所述容器是袋。
合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和柔性袋(如输液袋)。在特定实施方案中，容器是袋，例如柔性袋，如适合用于将细胞输注到受试者的那些，例如柔性塑料或PVC袋、和/或IV溶液袋。在一些实施方案中，袋是可密封的和/或能够灭菌的，以便提供细胞和组合物的无菌溶液和递送。在一些实施方案中，容器(例如，袋)具有如下容量：为或约或至少或至少约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL或1000mL容量，例如在为或约10mL与为或约100mL之间或在为或约10mL与为或约500mL之间的容量。在一些实施方案中，容器(例如，袋)是稳定的材料和/或由稳定的材料制成，和/或在各种温度中的一个或多个温度下(如在冷的温度(例如低于或低于约或为或约-20℃、-80℃、-120℃、135℃和/或在适合于低温保存的温度)和/或其他温度(如适合于解冻细胞的温度和体温(如为或约37℃))中)提供细胞的稳定储存和/或维持，例如以允许在即将治疗之前例如在受试者的位置或治疗的位置(例如，在床边)解冻。
容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)形成。在一些实施方案中，容器具有一个或多个端口，例如无菌接入端口，例如用于将管路或插管与一个或多个管连接，例如用于静脉内或其他输注和/或用于连接用于转移至其他容器(如细胞培养和/或储存袋或其他容器)和从其他容器转移的目的。示例性容器包括输液袋、静脉内溶液袋、小瓶，包括具有可被注射用针刺穿的塞子的那些。
制品还可以包括具有一条或多条识别信息和/或使用说明书的包装说明书或标签。在一些实施方案中，信息或说明书指示内容物可以或应当用于治疗特定病症或疾病，和/或提供用于所述治疗的说明书。标签或包装说明书可以指示制品的内容物将用于治疗疾病或病症。在一些实施方案中，标签或包装说明书提供了例如根据所提供的方法的任何实施方案，通过涉及给予第一剂量和一个或多个连续剂量的细胞的方法，治疗受试者(例如，已衍生出细胞的受试者)的说明书。在一些实施方案中，说明书指定以第一剂量给予一个单位剂量(例如，制品中单一独立容器的内容物)，然后在指定的时间点或在指定的时间窗口内和/或在检测到受试者中一种或多种因子或结果的存在或不存在或量或程度之后给予一个或多个连续剂量。
在一些实施方案中，说明书指定向受试者给予一个或多个单位剂量。在一些实施方案中，说明书指定给予使用本文提供的方法确定的剂量。在一些实施方案中，说明书指定基于对细胞表面标记表达的评估确定和/或计算适当剂量的方法。
在一些实施方案中，标签或包装说明书或包装包含指示衍生出细胞和/或待给予细胞的受试者的具体身份的标识符。在自体转移的情况下，衍生出细胞的受试者的身份与待给予细胞的受试者的身份相同。因此，识别信息可以指定将细胞给予特定患者，如最初衍生出细胞的患者。这样的信息能以条形码或其他编码标识符的形式存在于包装材料和/或标签中，或者可以指示受试者的名称和/或其他识别特征。
在一些实施方案中，制品包括一个或多个(通常多个)容器，所述容器含有包含细胞(例如，其单独的单位剂型)的组合物，并且进一步包括在其中含有包括其他药剂的组合物的一个或多个另外的容器，所述其他药剂是如细胞毒性剂或其他治疗剂，例如其与细胞组合(例如，同时或以任何顺序依次)给予。可替代地或另外地，制品还可以包括另一个或相同容器，其包含药学上可接受的缓冲液。它还可以包括其他材料，如其他缓冲液、稀释剂、过滤器、管路、针和/或注射器。
术语“包装插页”用于指代通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于此类治疗产品的适应症、用法、剂量、给予、组合疗法、禁忌症和/或使用警告的信息。
在一些实施方案中，所述制品和/或试剂盒进一步包括用于测定生物样品(例如，来自作为给予候选者或已给予所述疗法的受试者的生物样品)的一种或多种试剂，以及任选的所述试剂或测定的使用说明书。在一些实施方案中，所述制品和/或试剂盒含有用于测量特定表型标记(例如CD4、CD8、CCR7、CD27、和/或CD45RA)和指示凋亡的特定标记(如膜联蛋白V和/或半胱天冬酶3切割)的水平的试剂，和测量说明书。在一些实施方案中，所述生物样品是或获得自血液、血浆或血清样品。在一些实施方案中，所述试剂可以在给予所述细胞疗法之前或给予细胞疗法之后用于诊断目的，以鉴定受试者和/或评估治疗结果和/或毒性。例如，在一些实施方案中，所述制品和/或试剂盒进一步含有用于测量与毒性相关的特定细胞表面标记或其他标记的水平的试剂，以及测量说明书。在一些实施方案中，所述试剂包括用于进行体外测定以测量细胞表面标记或其他标记的组分，所述体外测定如免疫测定、基于适体的测定、组织学或细胞学测定或mRNA表达水平测定。在一些实施方案中，所述体外测定选自酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)、免疫染色、流式细胞术测定、表面等离子体共振(SPR)、化学发光测定、侧流免疫测定、抑制测定和亲合力测定。在一些方面，所述试剂是特异性地结合细胞表面标记或其他标记的结合试剂。在一些情况下，所述结合试剂是抗体或其抗原结合片段、适体或核酸探针。在一些实施方案中，所述试剂包括用于检测标记，如CD4、CD8、CCR7、CD27、CD45RA、膜联蛋白V、或激活的半胱天冬酶3的表达或存在的试剂。
V.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或用辞旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不一定应当被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，单数形式“一种/一个”(“a”)、“一种/一个”(“an”)和“所述”(“the”)包括复数指示物。例如，“一种/一个”(“a”)或“一种/一个”(“an”)意指“至少一种/至少一个”或“一种或多种/一个或多个”。应理解，本文所述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。
在整个本公开文本中，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对所要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，应当将范围的描述视为已明确公开所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，该范围的上限与下限之间的每个中间值以及该所陈述范围中的任何其他所陈述值或中间值涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何明确排除的限值。在所陈述范围包括所述限值中的一个或两个的情况下，排除那些所包括限值中的任何一个或两个的范围也被包括在所要求保护的主题内。无论范围的广度如何，这都适用。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文提及“约”某一值或参数时包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，叙述核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开序列中的核苷酸或氨基酸位置(例如序列表中所述)是指，在使用标准比对算法(例如GAP算法)与所公开序列比对以使同一性最大化之后，所鉴定的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，本领域技术人员可以例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导来鉴定相应残基。通常，为了鉴定对应位置，比对氨基酸序列使得获得最高阶匹配(参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,纽约,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,纽约,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,新泽西州,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,M StocktonPress,纽约,1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播其所连接的另一核酸分子的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。所述载体包括病毒载体，如逆转录病毒(例如，γ逆转录病毒和慢病毒)载体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲代细胞不完全相同，而是可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变型后代。
如本文所用，细胞或细胞群针对特定标记呈“阳性”的陈述是指，特定标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中的可检测存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的存在，例如通过用与所述标记特异性地结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平是可检测的，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平基本上相似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平。
如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阴性”的陈述是指，特定标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中不存在基本上可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的不存在，例如通过用与所述标记特异性地结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平没有检测到，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知对所述标记呈阴性的细胞的水平相比是基本上相似的。
如本文所用，在关于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”定义为，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分之后，候选序列(例如，主题抗体或片段)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以按本领域熟知的多种方式来实现，例如使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
氨基酸取代可以包括用另一种氨基酸替代多肽中的一个氨基酸。所述取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。可以将氨基酸取代引入目的结合分子(例如抗体)、和针对所需的活性(例如保留/改进的抗原结合、降低的免疫原性或改进的ADCC或CDC)筛选的产物中。
通常可以根据以下常见的侧链特性将氨基酸进行分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
在一些实施方案中，保守取代可能涉及将这些类别之一的成员交换为同一类别的另一个成员。在一些实施方案中，非保守氨基酸取代可能涉及将这些类别之一的成员交换为另一个类别。
如本文所用的，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。
VI.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种包含表达重组受体的T细胞的治疗性组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。
2.根据实施方案1所述的治疗性组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约50％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。
3.根据实施方案1所述的治疗性组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约60％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。
4.根据实施方案1所述的治疗性组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约70％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。
5.根据实施方案1所述的治疗性组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约80％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的治疗性组合物，其中：
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD8+T细胞或由其组成；
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD4+T细胞或由其组成；
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD8+和CD4+T细胞或由其组成；
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含至少或至少约30％、50％、95％、96％、97％、98％、或99％或100％CD8+T细胞或由其组成；
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含至少或至少约30％、50％、95％、96％、97％、98％、或99％或100％CD4+T细胞或由其组成；和/或
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含大约1:1或大约在1:3与3:1之间或大约在1:2与2:1之间的CD4+:CD8+T细胞或由其组成。
7.一种包含表达重组受体的T细胞的治疗性组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性，任选地其中：
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD8+T细胞或由其组成；
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD4+T细胞或由其组成；
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD8+和CD4+T细胞或由其组成；
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含至少或至少约30％、50％、95％、96％、97％、98％、或99％或100％CD8+T细胞或由其组成；
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含至少或至少约30％、50％、95％、96％、97％、98％、或99％或100％CD4+T细胞或由其组成；和/或
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含大约1:1或大约在1:3与3:1之间或大约在1:2与2:1之间的CD4+:CD8+T细胞或由其组成。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的治疗性组合物，所述组合物中总数量的T细胞、或所述组合物中总数量的表达所述重组受体的T细胞对CCR7呈表面阳性。
9.根据实施方案1-7中任一项所述的治疗性组合物，所述组合物中总数量的T细胞、或所述组合物中总数量的表达所述重组受体的T细胞对CD27呈表面阳性。
10.根据实施方案1-7中任一项所述的治疗性组合物，所述组合物中总数量的T细胞、或所述组合物中总数量的表达所述重组受体的T细胞对CCR7和CD27呈表面阳性。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含细胞的一个或多个单位剂量。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的组合物，
其中所述单位剂量或组合物包含在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值，和/或
其中所述单位剂量或组合物包含不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的组合物，其中所述组合物或单位剂量包含至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的组合物，其中所述组合物或单位剂量包含在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+，每个都包含端值。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的组合物，其中所述组合物或单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述组合物或单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+；或者所述组合物或单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、或所述组合物或单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的组合物，其中细胞或组合物的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
17.根据实施方案16所述的组合物，其中所述限定数量或比率是进一步基于CD27和/或CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。
18.根据实施方案16或实施方案17所述的组合物，其中所述限定数量的细胞进一步表达或不表达CD27和/或CD45RA，任选地其中所述限定数量的细胞进一步为CD27+或CD45RA-细胞。
19.根据实施方案1-15中任一项所述的组合物，其中细胞或组合物的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
20.根据实施方案19所述的组合物，其中所述限定数量或比率是进一步基于CCR7和/或CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。
21.根据实施方案19或实施方案20所述的组合物，其中所述限定数量的细胞进一步表达或不表达CCR7和/或CD45RA，任选地其中所述限定数量的细胞进一步为CCR7+或CD45RA-细胞。
22.根据实施方案1-21中任一项所述的组合物，其中细胞或组合物的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞。
23.根据实施方案1-21中任一项所述的组合物，其中细胞或组合物的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的组合物，其中所述单位剂量或组合物中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量或组合物中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–。
25.根据实施方案1-24中任一项所述的组合物，其中表达所述重组受体的细胞的所述单位剂量或数量包含在1x 105或约1x 105与5x 108或约5x 108之间、在1x 105或约1x105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD3+细胞(受体+/CD3+细胞)或总CD3+细胞，每个都包含端值。
26.根据实施方案1-24中任一项所述的组合物，其中表达所述重组受体的细胞的所述单位剂量或数量包含不超过约5x 108、不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD3+细胞或总CD3+细胞。
27.根据实施方案1-26中任一项所述的组合物，其中CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是活的或有活力的此类细胞的总数量。
28.根据实施方案1-27中任一项所述的组合物，其中CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是不表达凋亡标记的此类细胞的总数量和/或是凋亡标记阴性(–)的此类细胞的总数量，其中所述凋亡标记为膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。29.根据实施方案1-28中任一项所述的组合物，其中所述重组受体是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的组合物，其中所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
31.根据实施方案30所述的组合物，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
32.根据实施方案30或实施方案31所述的组合物，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
33.根据实施方案30-32中任一项所述的组合物，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特有的抗原、或与通用标签相关的抗原，和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
34.根据实施方案1-33中任一项所述的组合物，其中所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
35.根据实施方案1-34中任一项所述的组合物，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
36.根据实施方案1-35中任一项所述的组合物，其中所述重组受体包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域。
37.根据实施方案36所述的组合物，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。
38.根据实施方案37所述的组合物，其中所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
39.根据实施方案37或实施方案38所述的组合物，其中所述片段包含scFv。
40.根据实施方案1-39中任一项所述的组合物，其中所述重组受体包含细胞内信号传导区域。
41.根据实施方案40所述的组合物，其中所述细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。
42.根据实施方案41所述的组合物，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
43.根据实施方案42所述的组合物，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链、任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
44.根据实施方案40-43中任一项所述的组合物，其中所述重组受体进一步包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
45.根据实施方案40-44中任一项所述的组合物，其中所述细胞内信号传导区域进一步包含共刺激信号传导结构域。
46.根据实施方案45所述的组合物，其中所述共刺激信号传导结构域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
47.根据实施方案45或实施方案46所述的组合物，其中所述共刺激信号传导结构域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
48.根据实施方案45-47中任一项所述的组合物，其中所述共刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
49.根据实施方案1-48中任一项所述的组合物，其中所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。
50.根据实施方案1-49中任一项所述的组合物，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。
51.根据实施方案1-50中任一项所述的组合物，其中所述T细胞对于所述受试者是同种异体的。
52.一种制品，所述制品包含含有根据实施方案1-51中任一项所述的组合物的容器，和用于向患有疾病或病症的受试者给予所述治疗性组合物，任选地其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积的说明书。
53.一种制品，所述制品包含：
容器，所述容器包含存在于一种或多种治疗性组合物中的细胞的一个或多个单位剂量，所述单位剂量包含表达(任选地被工程化以表达)重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞，其中细胞的单位剂量包含限定数量的表达(任选地表面表达)7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；以及
用于向患有疾病或病症的受试者给予所述治疗性组合物，任选地其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积的说明书。
54.一种制品，所述制品包含：
容器，所述容器包含存在于一种或多种治疗性组合物中的细胞的一个或多个单位剂量，所述单位剂量包含表达(任选地被工程化以表达)重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞，其中细胞的单位剂量包含限定数量的表达(任选地表面表达)分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；以及
用于向患有疾病或病症的受试者给予所述治疗性组合物，任选地其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积的说明书。
55.根据实施方案53或实施方案54所述的制品，其中细胞的所述单位剂量包含根据实施方案1-51中任一项所述的组合物。
56.根据实施方案53-55中任一项所述的制品，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+细胞；和/或其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+细胞。
57.根据实施方案53-55中任一项所述的制品，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CD27+细胞；和/或其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CD27+细胞。
58.根据实施方案52-57中任一项所述的制品或组合物，
其中所述单位剂量包含在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值，和/或
其中所述单位剂量包含不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞。
59.根据实施方案52-58中任一项所述的制品，其中所述单位剂量包含至少约3x106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+。
60.根据实施方案52-59中任一项所述的制品，其中所述单位剂量包含在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+，每个都包含端值。
61.根据实施方案52-60中任一项所述的制品，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+；或者所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+。
62.根据实施方案51-56和58-61中任一项所述的制品，其中细胞或组合物的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
63.根据实施方案62所述的制品，其中所述限定数量或比率是进一步基于CD27和/或CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。
64.根据实施方案62或实施方案63所述的制品，其中所述限定数量的细胞进一步表达或不表达CD27和/或CD45RA，任选地其中所述限定数量的细胞进一步为CD27+或CD45RA-细胞。
65.根据实施方案51-55和57-61中任一项所述的制品，其中细胞或组合物的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
66.根据实施方案65所述的制品，其中所述限定数量或比率是进一步基于CCR7和/或CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。
67.根据实施方案65或实施方案66所述的制品，其中所述限定数量的细胞进一步表达或不表达CCR7和/或CD45RA，任选地其中所述限定数量的细胞进一步为CCR7+或CD45RA-细胞。
68.根据实施方案51-67中任一项所述的制品，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞。
69.根据实施方案51-67中任一项所述的制品，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞。
70.根据实施方案51-69中任一项所述的制品，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–。
71.一种制品，所述制品包含：
容器，所述容器包含存在于一种或多种治疗性组合物中的细胞的一个或多个单位剂量，所述单位剂量包含表达，任选地被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞，其中细胞的单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；以及
用于向患有疾病或病症的受试者给予所述治疗性组合物，任选地其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积的说明书。
72.根据实施方案63、64和66-71中任一项所述的制品，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+/CD27+细胞。
73.根据实施方案63、64和66-71中任一项所述的制品，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
74.根据实施方案63、64和66-73中任一项所述的制品，其中所述单位剂量包含在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。
75.根据实施方案63、64和66-74中任一项所述的制品，其中所述单位剂量包含不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
76.根据实施方案63、64和66-75中任一项所述的制品，其中所述单位剂量包含至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
77.根据实施方案63、64和66-76中任一项所述的制品，其中所述单位剂量包含在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。
78.根据实施方案63、64和66-77中任一项所述的制品，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+。
79.根据实施方案63、64和66-78中任一项所述的制品，其中细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
80.根据实施方案79所述的制品，其中所述限定数量或比率是进一步基于CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。
81.根据实施方案79或实施方案80所述的制品，其中所述限定数量的细胞进一步表达或不表达CD45RA，任选地其中所述限定数量的细胞进一步为CD45RA-细胞。
82.根据实施方案52、53、55、56、58-64和66-81中任一项所述的制品，其中在任选地根据相同方法产生的多种制品或单位剂量之间，所述单位剂量中表达CCR7的细胞(CCR7+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
83.根据实施方案52-82中任一项所述的制品，其中表达所述重组受体的细胞的所述单位剂量或数量包含在1x 105或约1x 105与5x 108或约5x 108之间、在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD3+细胞(受体+/CD3+细胞)或总CD3+细胞，每个都包含端值。
84.根据实施方案52-83中任一项所述的制品或组合物，其中表达所述重组受体的细胞的所述单位剂量或数量包含不超过约5x 108、不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD3+细胞或总CD3+细胞。
85.根据实施方案52-84中任一项所述的制品，其中CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是活的或有活力的此类细胞的总数量。
86.根据实施方案52-85中任一项所述的制品，其中CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是不表达凋亡标记的此类细胞的总数量和/或是凋亡标记阴性(–)的此类细胞的总数量，其中所述凋亡标记为膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。
87.根据实施方案52-86中任一项所述的制品，其中所述说明书指定给予包含在多种单独组合物中的多个单位剂量。
88.根据实施方案87所述的制品，其中所述多种单独组合物包括含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的一种的第一组合物以及含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的另一种的第二组合物。
89.根据实施方案88所述的制品，其中所述第一组合物包含所述CD8+T细胞。
90.根据实施方案88所述的制品，其中所述第一组合物包含所述CD4+T细胞。
91.根据实施方案88-90中任一项所述的制品，其中所述说明书指定间隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟，或同时地给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积以及所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
92.根据实施方案88-91中任一项所述的制品，其中所述说明书指定在给予所述含有CD4+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
93.根据实施方案88-92中任一项所述的制品，其中所述说明书指定在给予所述含有CD8+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
94.根据实施方案52-93中任一项所述的制品，其中所述重组受体是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。
95.根据实施方案1-94中任一项所述的制品或组合物，其中所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
96.根据实施方案95所述的制品或组合物，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
97.根据实施方案95或实施方案96所述的制品或组合物，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
98.根据实施方案95-97中任一项所述的制品或组合物，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFRvIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特有的抗原、或与通用标签相关的抗原，和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
99.根据实施方案1-98中任一项所述的制品或组合物，其中所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
100.根据实施方案1-99中任一项所述的制品或组合物，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
101.根据实施方案1-100中任一项所述的制品或组合物，其中所述重组受体包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域。
102.根据实施方案101所述的制品或组合物，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。
103.根据实施方案102所述的制品或组合物，其中所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
104.根据实施方案102或实施方案103所述的制品或组合物，其中所述片段包含scFv。
105.根据实施方案1-104中任一项所述的制品或组合物，其中所述重组受体包含细胞内信号传导区域。
106.根据实施方案105所述的制品或组合物，其中所述细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。
107.根据实施方案106所述的制品或组合物，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
108.根据实施方案107所述的制品或组合物，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链、任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
109.根据实施方案1-108中任一项所述的制品或组合物，其中所述重组受体进一步包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
110.根据实施方案1-109中任一项所述的制品或组合物，其中所述细胞内信号传导区域进一步包含共刺激信号传导结构域。
111.根据实施方案110所述的制品或组合物，其中所述共刺激信号传导结构域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
112.根据实施方案110或实施方案111所述的制品或组合物，其中所述共刺激信号传导结构域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
113.根据实施方案110-112中任一项所述的制品或组合物，其中所述共刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
114.根据实施方案1-113中任一项所述的制品或组合物，其中所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。
115.根据实施方案1-114中任一项所述的制品或组合物，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。
116.根据实施方案1-114中任一项所述的制品或组合物，其中所述T细胞对于所述受试者是同种异体的。
117.一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者给予根据实施方案1或实施方案7所述的治疗性组合物或包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物的一个或多个单位剂量和/或对应于此类单位剂量的体积，任选地其中：
细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；和/或
在根据所述方法治疗的一组受试者之间，所述单位剂量中表达CCR7的细胞(CCR7+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
118.根据实施方案117所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+细胞。
119.根据实施方案117所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+细胞。
120.一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者给予根据实施方案1或实施方案7所述的治疗性组合物、或包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物的一个或多个单位剂量和/或对应于此类单位剂量的体积，任选地其中：
细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；和/或
在根据所述方法治疗的一组受试者之间，所述单位剂量中表达CD27的细胞(CD27+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
121.根据实施方案120所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CD27+细胞。
122.根据实施方案120所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CD27+细胞。
123.根据实施方案117-122中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在1x105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值。
124.根据实施方案117-123中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞。
125.根据实施方案117-124中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+。
126.根据实施方案117-125中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在3x106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+，每个都包含端值。
127.根据实施方案117-126中任一项所述的方法，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+；或者所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+。
128.根据实施方案117-119和123-127中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
129.根据实施方案117-119和123-128中任一项所述的方法，其中所述限定数量或比率是进一步基于CD27和/或CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。
130.根据实施方案120-127中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
131.根据实施方案120-127和130中任一项所述的方法，其中所述限定数量或比率是进一步基于CCR7和/或CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。
132.根据实施方案131所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞。
133.根据实施方案129、131或132中任一项所述的方法，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–。
134.根据实施方案131所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞。
135.根据实施方案129、131或132中任一项所述的方法，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD4+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–。
136.一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者给予根据实施方案1或实施方案7所述的组合物的一个或多个单位剂量。
137.根据实施方案136所述的方法，其中：
细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；并且
在根据所述方法治疗的一组受试者之间，所述单位剂量中表达CCR7的细胞(CCR7+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
138.一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者给予包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物和/或对应于此类单位剂量的体积，其中：
细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；并且
在根据所述方法治疗的一组受试者之间，所述单位剂量中表达CCR7的细胞(CCR7+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
139.根据实施方案129和131-138中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+/CD27+细胞。
140.根据实施方案129和131-138中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
141.根据实施方案129和131-140中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。
142.根据实施方案129和131-141中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
143.根据实施方案129和131-142中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞；和/或至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
144.根据实施方案129和131-143中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。
145.根据实施方案129和131-144中任一项所述的方法，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+。
146.根据实施方案129和131-145中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
147.根据实施方案129和131-146中任一项所述的方法，其中所述限定数量或比率是进一步基于CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。
148.根据实施方案129或实施方案131-147中任一项所述的方法，其中所述限定数量的细胞进一步表达或不表达CD45RA，任选地其中所述限定数量的细胞进一步为CD45RA-细胞。
149.根据实施方案117-148中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在1x105或约1x 105与5x 108或约5x 108之间、在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD3+细胞(受体+/CD3+细胞)或总CD3+细胞，每个都包含端值。
150.根据实施方案117-149中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含不超过约5x 108、不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x106、或不超过约5x 105个总受体+/CD3+细胞或总CD3+细胞。
151.根据实施方案117-150中任一项所述的方法，其中CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是活的或有活力的此类细胞的总数量。
152.根据实施方案117-151中任一项所述的方法，其中CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是不表达凋亡标记的此类细胞的总数量和/或是凋亡标记阴性(–)的此类细胞的总数量，其中所述凋亡标记为膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。
153.根据实施方案117-152中任一项所述的方法，所述方法包括给予包含在多种单独组合物中的多个单位剂量。
154.根据实施方案117-153中任一项所述的方法，其中所述多种单独组合物包括含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的一种的第一组合物以及含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的另一种的第二组合物。
155.根据实施方案154所述的方法，其中所述第一组合物包含所述CD8+T细胞。
156.根据实施方案154所述的方法，其中所述第一组合物包含所述CD4+T细胞。
157.根据实施方案154-156中任一项所述的方法，所述方法包括间隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟，或同时地给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积以及所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
158.根据实施方案154-157中任一项所述的方法，所述方法包括在给予所述含有CD4+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
159.根据实施方案154-158中任一项所述的方法，所述方法包括在给予所述含有CD8+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
160.根据实施方案117-159中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。
161.根据实施方案117-160中任一项所述的方法，其中所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
162.根据实施方案161所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
163.根据实施方案161或实施方案162所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
164.根据实施方案161-163中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特有的抗原、或与通用标签相关的抗原，和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
165.根据实施方案117-164中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
166.根据实施方案117-165中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
167.根据实施方案117-166中任一项所述的方法，其中所述重组受体包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域。
168.根据实施方案167所述的方法，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。
169.根据实施方案168所述的方法，其中所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
170.根据实施方案168或实施方案169所述的方法，其中所述片段包含scFv。
171.根据实施方案117-161中任一项所述的方法，其中所述重组受体包含细胞内信号传导区域。
172.根据实施方案171所述的方法，其中所述细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。
173.根据实施方案172所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
174.根据实施方案173所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链、任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
175.根据实施方案117-174中任一项所述的方法，其中所述重组受体进一步包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
176.根据实施方案117-175中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导区域进一步包含共刺激信号传导结构域。
177.根据实施方案176所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
178.根据实施方案176或实施方案177所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
179.根据实施方案176-178中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
180.根据实施方案117-179中任一项的方法，其中所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。
181.根据实施方案117-180中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。
182.根据实施方案117-180中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是同种异体的。
183.一种确定用于治疗受试者的工程化T细胞的单位剂量的方法，所述方法包括：
(a)在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达所述重组受体和CCR7(受体+/CCR7+)的T细胞的数量、百分比或比率；
(b)基于所述受体+/CCR7+细胞的数量、百分比或比率，确定用于给予至患有疾病或病症的受试者的细胞的一个或多个单位剂量，其中所述单位剂量包含限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
184.一种确定用于治疗受试者的工程化T细胞的单位剂量的方法，所述方法包括：
(a)在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达所述重组受体和CD27(受体+/CD27+)的T细胞的数量、百分比或比率；以及
(b)基于所述受体+/CD27+细胞的数量、百分比或比率，确定用于给予至患有疾病或病症的受试者的细胞的一个或多个单位剂量，其中所述单位剂量包含限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
185.一种产生包含T细胞组合物的单位剂量的组合物的方法，所述方法包括：
(a)在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达所述重组受体和CCR7和/或CD27(受体+/CCR7+和/或受体+/CD27+)的T细胞的数量、百分比或比率；以及
(b)向容器填充所述组合物的全部或一部分和任选的另一种溶液以实现所述T细胞组合物的单位剂量，其中所述单位剂量包含限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集，或限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
186.一种产生包含T细胞组合物的单位剂量的治疗性组合物的方法，所述方法包括向容器填充T细胞组合物的全部或一部分以实现所述T细胞组合物的单位剂量，所述T细胞组合物包含含有特异性地结合与疾病或病症相关的抗原的重组受体的T细胞，其中所述单位剂量包含限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
187.一种产生包含T细胞组合物的单位剂量的治疗性组合物的方法，所述方法包括向容器填充T细胞组合物的全部或一部分以实现所述T细胞组合物的单位剂量，所述T细胞组合物包含含有特异性地结合与疾病或病症相关的抗原的重组受体的T细胞，其中所述单位剂量包含限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
188.根据实施方案184-187中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+细胞。
189.根据实施方案184-188中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+细胞。
190.根据实施方案184-189中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在1x105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值。
191.根据实施方案184-180中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞。
192.根据实施方案184-191中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+。
193.根据实施方案184-192中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在3x106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+，每个都包含端值。
194.根据实施方案184-193中任一项所述的方法，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+；或者所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+。
195.根据实施方案184-194中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
196.根据实施方案184-195中任一项所述的方法，其中所述单位剂量进一步包含限定数量的包含表达或不表达CD27和/或CD45的细胞的细胞，任选地其中所述单位剂量进一步包含限定数量的包含CD27+或CD45RA-细胞的细胞。
197.根据实施方案184-196中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在所述治疗性组合物中评估表达或不表达CD27和/或CD45RA的T细胞的数量、百分比或比率，任选地为CD27+或CD45RA-的T细胞的数量、百分比或比率。
198.根据实施方案196或实施方案197所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞。
199.根据实施方案196或实施方案197所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞。
200.根据实施方案196-199中任一项所述的方法，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–。
201.一种确定用于治疗受试者的工程化T细胞的单位剂量的方法，所述方法包括：
(a)在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达所述重组受体和CCR7和CD27(受体+/CCR7+/CD27+)的T细胞的数量、百分比或比率；
(b)基于所述受体+/CCR7+/CD27+细胞的数量、百分比或比率，确定用于给予至患有疾病或病症的受试者的细胞的一个或多个单位剂量，其中所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
202.一种产生包含T细胞组合物的单位剂量的组合物的方法，所述方法包括：
(a)在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达所述重组受体和CCR7和CD27(受体+/CCR7+/CD27+)的T细胞的数量、百分比或比率；以及
(b)向容器填充所述组合物的全部或一部分和任选的另一种溶液以实现所述T细胞组合物的单位剂量，其中所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
203.一种产生包含T细胞组合物的单位剂量的治疗性组合物的方法，所述方法包括向容器填充T细胞组合物的全部或一部分以实现所述T细胞组合物的单位剂量，所述T细胞组合物包含含有特异性结合与疾病或病症相关的抗原的重组受体的T细胞，其中所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
204.根据实施方案201-203中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+/CD27+细胞。
205.根据实施方案201-203中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
206.根据实施方案201-205中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在1x105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。
207.根据实施方案201-206中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x 106、或不超过约5x 105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
208.根据实施方案201-207中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
209.根据实施方案201-208中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在3x106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 1077之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。
210.根据实施方案201-209中任一项所述的方法，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+。
211.根据实施方案201-210中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
212.根据实施方案201-211中任一项所述的方法，其中所述单位剂量进一步包含限定数量的包含表达或不表达CD45的细胞的细胞，任选地其中所述单位剂量进一步包含限定数量的包含CD45RA-细胞的细胞。
213.根据实施方案201-212中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在所述治疗性组合物中评估表达或不表达CD45RA的T细胞的数量、百分比或比率，任选地为CD45RA-的T细胞的数量、百分比或比率。
214.一种用于产生包含基因工程化细胞的细胞组合物的方法，所述方法包括：
i)从来自受试者的生物样品提供包含目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞的输入组合物；
ii)向所述输入组合物中引入编码重组受体的多核苷酸；以及
iii)在所述引入之前、期间和/或之后刺激所述输入组合物中的所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，所述刺激导致所述细胞的激活和/或增殖；
其中所述方法产生输出组合物，所述输出组合物包含限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞，和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
215.一种用于产生包含基因工程化细胞的细胞组合物的方法，所述方法包括向输入组合物中引入编码重组受体的多核苷酸，其中所述输入组合物包含从来自受试者的生物样品提供的目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞，并且在所述引入之前、期间和/或之后通过在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞来刺激所述输入组合物，所述刺激导致所述细胞的激活和/或增殖；并且其中所述方法产生输出组合物，所述输出组合物包含限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞，和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
216.一种用于产生包含基因工程化细胞的细胞组合物的方法，所述方法包括：
i)从获自受试者的生物样品中分离目标数量的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标数量的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞，从而产生输入组合物；
ii)向所述输入组合物中引入编码重组受体的多核苷酸；以及
iii)在所述引入之前、期间和/或之后刺激所述输入组合物中的所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，所述刺激导致所述细胞的激活和/或增殖；
其中所述方法产生输出组合物，所述输出组合物包含限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞，和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
217.一种用于产生包含基因工程化细胞的细胞组合物的方法，所述方法包括向输入组合物中引入编码重组受体的多核苷酸，其中所述输入组合物通过从获自受试者的生物样品中分离目标数量的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标数量的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞而产生，并且在所述引入之前、期间和/或之后通过在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞来刺激所述输入组合物，所述刺激导致所述细胞的激活和/或增殖；并且其中所述方法产生输出组合物，所述输出组合物包含限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞，和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
218.根据实施方案214-217中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞。
219.根据实施方案214-217中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含目标百分比的CD4+/CCR7+、CD4+/CD27+、CD4+/CCR7+/CD27+、CD4+/CCR7+/CD45RA-、CD4+/CCR7+/CD45RA+、CD8+/CCR7+、CD8+/CD27+、CD8+/CCR7+/CD27+、CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或CD8+/CCR7+/CD45RA+细胞。
220.根据实施方案214-219中任一项所述的方法，其中所述输出组合物包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+、受体+/CD8+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA+细胞与受体+/CD4+/CCR7+、受体+/CD4+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA+细胞；或
限定比率的受体+/CD8+/CCR7+、受体+/CD8+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+、受体+/CD4+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
221.根据实施方案214-219中任一项所述的方法，所述方法进一步包括确定用于给予至患有疾病或病症的受试者的T细胞组合物的一个或多个单位剂量，其中所述单位剂量包含所述输出组合物的全部或一部分，所述输出组合物包含：
限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；
限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；或
限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
222.根据实施方案221所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+细胞、CD4+/CCR7+细胞、CD8+/CD27+细胞、CD4+/CD27+细胞、CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
223.根据实施方案221或实施方案222所述的方法，其中所述单位剂量包含在1x105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 106或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的(每个都包含端值)总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、总受体+/CD4+/CD27+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
224.根据实施方案221-223中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞；和/或至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+；和/或至少约3x 106、4x106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或至少约3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、或1x 107个总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
225.根据实施方案221-224中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在3x106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞；和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+，和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x 107或约1x 107之间的总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或在3x 106或约3x 106与2.5x 107或约2.5x 107之间、在4x 106或约4x 106与2x 107或约2x 107之间、或在5x 106或约5x 106与1x107或约1x 107之间的总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。
226.根据实施方案221-225中任一项所述的方法，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+；和/或所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+；和/或所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+。
227.根据实施方案221-226中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间；和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间；和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
228.根据实施方案221-227中任一项所述的方法，其中所述单位剂量进一步包含限定数量的包含表达或不表达CD45的细胞的细胞，任选地其中所述单位剂量进一步包含限定数量的包含CD45RA-细胞的细胞。
229.根据实施方案228所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞。
230.根据实施方案221-229中任一项所述的方法，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％(每个都包含端值)是受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–。
231.根据实施方案214-230中任一项所述的方法，其中在所述提供或分离之前，所述方法包括确定表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。
232.根据实施方案214-231中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂能够激活T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞；能够诱导通过TCR复合物的信号；和/或能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的增殖。
233.根据实施方案214-232中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂包含与TCR复合物的成员结合、任选地与CD3特异性结合的一级药剂。
234.根据实施方案233所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂进一步包含与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂。
235.根据实施方案234所述的方法，其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
236.根据实施方案234或实施方案235所述的方法，其中所述一级和二级药剂包含抗体，任选地其中所述一种或多种刺激剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体一起孵育。
237.根据实施方案214-236中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂存在于固体支持物、任选地珠的表面上。
238.根据实施方案214-237中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂选自CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7，包含由抗原受体特异性地识别的抗原的疫苗，以及特异性地结合抗原受体的抗独特型抗体或其组合。
239.根据实施方案183-238中任一项所述的方法，其中所述治疗性组合物是根据实施方案1所述的组合物。
240.根据实施方案183-239中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向患有疾病或病症的受试者给予所述治疗性组合物，任选地其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
241.根据实施方案183-240中任一项所述的方法，其中在根据所述方法治疗的一组受试者之间，所述单位剂量中表达CCR7的细胞(CCR7+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
242.根据实施方案183-241中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在1x105或约1x 105与5x 108或约5x 108之间、在1x 105或约1x 105与1x 108或约1x 108之间、在5x 105或约5x 105与1x 107或约1x 107之间、或在1x 1066或约1x 106与1x 107或约1x 107之间的表达所述重组受体的总CD3+细胞(受体+/CD3+细胞)或总CD3+细胞，每个都包含端值。
243.根据实施方案183-242中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含不超过约5x 108、不超过约1x 108、不超过约5x 107、不超过约1x 107、不超过约5x 106、不超过约1x106、或不超过约5x 105个总受体+/CD3+细胞或总CD3+细胞。
244.根据实施方案183-243中任一项所述的方法，其中CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是活的或有活力的此类细胞的总数量。
245.根据实施方案183-244中任一项所述的方法，其中CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是不表达凋亡标记的此类细胞的总数量和/或是凋亡标记阴性(–)的此类细胞的总数量，其中所述凋亡标记为膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。
246.根据实施方案240-245中任一项所述的方法，所述方法包括给予包含在多种单独组合物中的多个单位剂量。
247.根据实施方案246所述的方法，其中所述多种单独组合物包括含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的一种的第一组合物以及含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的另一种的第二组合物。
248.根据实施方案247所述的方法，其中所述第一组合物包含所述CD8+T细胞。
249.根据实施方案247所述的方法，其中所述第一组合物包含所述CD4+T细胞。
250.根据实施方案247-249中任一项所述的方法，所述方法包括间隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟，或同时地给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积以及所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
251.根据实施方案247-250中任一项所述的方法，所述方法包括在给予所述含有CD4+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
252.根据实施方案247-250中任一项所述的方法，所述方法包括在给予所述含有CD8+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
253.根据实施方案183-252中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。
254.根据实施方案183-253中任一项所述的方法，其中所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
255.根据实施方案254所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
256.根据实施方案254或实施方案255所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
257.根据实施方案254-256中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特有的抗原、或与通用标签相关的抗原，和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
258.根据实施方案183-257中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
259.根据实施方案183-258中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
260.根据实施方案183-259中任一项所述的方法，其中所述重组受体包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域。
261.根据实施方案260所述的方法，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。
262.根据实施方案261所述的方法，其中所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
263.根据实施方案261或实施方案262所述的方法，其中所述片段包含scFv。
264.根据实施方案183-263中任一项所述的方法，其中所述重组受体包含细胞内信号传导区域。
265.根据实施方案264所述的方法，其中所述细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。
266.根据实施方案265所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
267.根据实施方案266所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链、任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
268.根据实施方案183-267中任一项所述的方法，其中所述重组受体进一步包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
269.根据实施方案183-268中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导区域进一步包含共刺激信号传导结构域。
270.根据实施方案269所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
271.根据实施方案259或实施方案270所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
272.根据实施方案269-271中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
273.根据实施方案183-272中任一项所述的方法，其中所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。
274.根据实施方案183-273中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。
275.根据实施方案183-274中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是同种异体的。
276.一种输出组合物，所述输出组合物通过根据实施方案183-275中任一项所述的方法产生。
277.一种单位剂量，所述单位剂量通过根据实施方案201-213和221-276中任一项所述的方法确定或产生。
278.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案277所述的单位剂量。
279.根据实施方案278所述的药物组合物，其进一步包含药物载体。
280.一种治疗方法，所述方法包括向哺乳动物受试者给予根据实施方案276所述的输出组合物、根据实施方案277所述的单位剂量或根据实施方案278或实施方案279所述的药物组合物的全部或一部分。
281.根据实施方案276所述的输出组合物、根据实施方案277所述的单位剂量或根据实施方案278或实施方案279所述的药物组合物的全部或一部分用于治疗癌症的用途。
282.根据实施方案276所述的输出组合物、根据实施方案277所述的单位剂量或根据实施方案278或实施方案279所述的药物组合物的全部或一部分在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
283.根据实施方案276所述的输出组合物、根据实施方案277所述的单位剂量或根据实施方案278或实施方案279所述的药物组合物，用于在治疗癌症中使用。
VII.实施例
以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1对抗CD19
CAR表达T细胞的细胞属性和表型以及药代动力学(PK)参数、反
应和毒性的评估
评估被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的细胞表型与在给予至受试者后细胞的药代动力学(PK)参数、反应和毒性结果之间的关系。
A.治疗性T细胞组合物的属性
产生了含有表达对CD19具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)的自体T细胞的示例性治疗性T细胞组合物。所述抗CD19 CAR含有源自鼠类抗体的抗CD19 scFv(源自FMC63的可变区，VL-接头-VH取向)、免疫球蛋白来源的间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。所述病毒载体进一步含有编码截短的受体的序列，所述截短的受体用作CAR表达的替代标记；所述序列通过T2A核糖体跳跃序列与所述CAR序列隔开。使用流式细胞术和体外测定评估所产生的用于在患有下文所述的复发性和难治性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的受试者中给予的治疗性T细胞组合物的大于一百种的表型、功能和细胞健康状况相关属性。针对各种属性，在工程化之前和之后评估细胞。
所评估的示例性属性示于表E1中。使用流式细胞术检查通常与记忆表型组合物和细胞健康状况表型相关的表型属性。使用体外抗原特异性生物测定评估T细胞功能性。对已经经历了代表性次数的冻融循环的治疗性T细胞组合物进行表征和释放测试。
为了产生用于给予的细胞组合物，通过白细胞单采术从受试者分离自体细胞。使白细胞单采术样品经历用于产生CAR表达细胞的过程。所述过程涉及使用自动化洗涤来洗涤细胞和基于免疫亲和力的选择来纯化CD4+和CD8+T细胞，从而得到分别富含CD8+(其中中值99％(内部四分位数间距(IQR)98％-100％)的细胞为CD8+)和CD4+(其中中值99％(IQR99％-100％)的细胞为CD4+)细胞的两种组合物。
使富含CD4+和CD8+的组合物的细胞单独经历用编码具有4-1BB共刺激结构域的抗CD19 CAR的载体进行的慢病毒转导。然后将所转导群体在用于细胞扩增的刺激试剂的存在下单独孵育。在给予之前，将所扩增的CD8+和CD4+细胞单独配制并低温保存，并且储存。为了使批次和/或源自不同患者的细胞组合物(如具有不同患者属性的那些)之间指示细胞健康状况的参数的差异降至最低，在批次之间使细胞保持恒定体积。细胞产物展现出活细胞浓度的窄范围(基于对一组受试者的细胞组合物的评估，CD8+：中值31x 106个细胞/mL，IQR28-40x 106个细胞/mL，N＝38；CD4+：中值35x 106个细胞/mL，IQR 31-40x 106，N＝36)。
在给予地点，将细胞组合物解冻并根据对应于适当剂量中CD8+CAR+和CD4+CAR+细胞数量的每种组合物的目标体积分开给予(如对于DL1，含有5x 107个总CAR表达T细胞(CAR表达CD4+细胞和CAR表达CD8+细胞各自为2.5x 107个)，或对于DL2，含有1x 108个总CAR表达T细胞(CAR表达CD4+细胞和CAR表达CD8+细胞各自为5x 107个))。
评估指示用于给予的组合物中的CAR表达T细胞的健康状况的参数，如通过测量解冻后活力、细胞表面膜联蛋白V表达和活性细胞内半胱天冬酶3的水平。膜联蛋白V表达细胞的中值百分比为11％(IQR为9％-18％；N＝33)的CD8+CAR+T细胞和10％(IQR为8％-17％；N＝31)的CD4+CAR+T细胞。观察到半胱天冬酶3表达与膜联蛋白V表达相似。
精确控制用于给予的组合物中CAR+CD4+和CAR+CD8+T细胞的量。观察到实际给予示例性受试者组的细胞数量在给定剂量中细胞的目标数量的8％内或更少：
·2.4-2.7x 107(目标±8％)个CD4+CAR+T细胞和2.4-2.7x 107(目标±8％)个CD8+CAR+T细胞，用于以DL1给予细胞的受试者(n＝48)
·4.6-5.1x 107(目标±8％)个CD4+CAR+T细胞或4.6-5.1x 107(目标±8％)个CD8+CAR+T细胞，用于以DL2给予细胞的受试者(n＝20)。
发现所给予剂量的范围在不同示例性受试者组中具有低变化性：
·在DL1下48-52×106个CD3+CAR+T细胞(n＝34)
·在DL2下96-101×106个CD3+CAR+T细胞(n＝29)
·在DL1下24-27x 106个CD4+CAR+或CD8+CAR+T细胞(n＝34)
·在DL2下46-51x 106个CD4+CAR+或CD8+CAR+T细胞(n＝29)。
如图1A中所示，观察到给予至受试者的CAR表达T细胞组合物展现高T细胞纯度和批次之间的低差异。鉴于例如过程和产物控制，观察到含有CAR T细胞的治疗性细胞组合物的细胞特异性T细胞功能具有低批次间变化性。
体外抗原特异性细胞因子积累和细胞内细胞因子染色(ICS)显示，对于多种细胞因子(IL-2、TNF-α和IFN-γ)的细胞因子产生，批次之间具有相似的低差异。在示例性ICS实验中，将来自组合物的细胞用CD19刺激，针对细胞因子(包括TNF-α)和表面蛋白(包括作为记忆表型标记的7型C-C趋化因子受体(CCR7))染色，并通过流式细胞术进行分析。确定了在用于给予的组合物中对细胞因子或表面蛋白呈阳性的细胞的数量。图1B显示用于以DL1和DL2给予的CAR T细胞组合物中存在的CD4+CAR+和CD8+CAR+细胞、CD4+CAR+TNF-α+和CD8+CAR+TNF-α+细胞、CD4+CAR+CCR7+和CD8+CAR+CCR7+细胞的数量。图1C显示根据不同标度描绘受控剂量组合物中CD4+CAR+细胞、CD8+CAR+细胞、CD4+CAR+CCR7+细胞和CD8+CAR+CCR7+细胞的数量的另一图。这些结果汇总于表E2中。结果显示CD4+CAR+和CD8+CAR+细胞、CD4+CAR+TNF-α+和CD8+CAR+TNF-α+细胞、CD4+CAR+CCR7+和CD8+CAR+CCR7+细胞的数量的低变化性。例如，观察到对TNF-α产生呈阳性的细胞数量的窄范围(n＝61)。
指示在用CD19刺激后CAR+细胞的肿瘤坏死因子α(TNFα)产生的参数在不同批次之间显示出窄范围，其中对于CD4+CAR+T细胞(N＝59)相对标准差(RSD)为37％，且对于CD8+CAR+T细胞(N＝61)相对标准差(RSD)为51％。
所述结果与以下观察结果一致：细胞组合物的制造和控制过程的至少三个方面促进组合物之间的低变化性和一致的细胞健康状况：给予的CD4+和CD8+细胞的精确、一致的平剂量；对CD4+和CD8+T细胞培养条件的控制和优化，从而导致表型(例如，CCR7)和体外功能(例如，抗原刺激后的IL-2、TNF-α和IFN-γ产生)的组合物批次之间的低变化性；以及组合物的一致配制和体积。所述结果还显示：对用于在受试者中给予的治疗性组合物中CD4+和CD8+CAR+T细胞的数量的紧密控制允许鉴定工程化细胞组合物中细胞的属性(参见图1C)和与药代动力学(PK)和临床结果(如反应和毒性)的潜在关联性。
B.抗CD19 CAR+T细胞组合物的给予
在临床研究中，将上述治疗性CAR+T细胞组合物给予患有复发性或难治性(R/R)侵袭性非霍奇金淋巴瘤(NHL)的受试者。具体地，向患有R/R NHL的成年人类受试者群组给予抗CD19 CAR表达T细胞组合物，所述R/R NHL包括从头的或从惰性淋巴瘤转化的(NOS)弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、高级别B细胞淋巴瘤(包括双/三命中)、从慢性淋巴细胞白血病(CLL)或边缘区淋巴瘤(MZL)转化的DLBCL、原发性纵膈大b细胞淋巴瘤(PMBCL)和3b级滤泡性淋巴瘤(FLG3B)。单独评估完整群组内核心子集(不包括患有较差体能状态(ECOG 2)、从边缘区淋巴瘤(MZL)和/或慢性淋巴细胞白血病(CLL，里希特氏)转化的DLBCL的那些受试者，并且不包括患有原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(PMBCL)和3b级滤泡性淋巴瘤(FLG3B)的那些受试者(核心群组))的受试者的结果。核心群组包括如下受试者：患有DLBCL、NOS和转化的滤泡性淋巴瘤(tFL)或高级B细胞淋巴瘤(双/三命中)或高级B细胞淋巴瘤(具有MYC和BCL2和/或BCL6重排以及DLBCL组织学(双/三命中))且东部肿瘤协作组体能状态(ECOG PS)为0或1。这个实施例中呈现的在此时间点的分析是基于对完整群组中已经给予所述抗CD19CAR表达细胞的总计91名受试者(88名(65名来自核心群组)针对反应进行评估，且91名(67名来自核心群组)针对安全性进行评估)的评估。
所述抗CD19 CAR含有源自鼠类抗体的抗CD19 scFv(源自FMC63的可变区，VL-接头-VH取向)、免疫球蛋白来源的间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。所述病毒载体进一步含有编码截短的受体的序列，所述截短的受体用作CAR表达的替代标记；所述序列通过T2A核糖体跳跃序列与所述CAR序列隔开。
在静脉内给予之前，将含有抗CD19 CAR表达细胞的低温保存的细胞组合物解冻。治疗性T细胞剂量是作为限定细胞组合物来给予的，通过给予以大约1:1的目标比率分开给予的经配制CD4+CAR+细胞群和经配制CD8+CAR+群体来进行。向受试者给予CAR表达T细胞的单剂量或双剂量(每个单剂量分别通过表达CAR的CD4+T细胞和表达CAR的CD8+T细胞的单独输注来给予)，如下：含有5x 107个总CAR表达T细胞的剂量水平1(DL1)的单剂量；或含有1x108个总CAR表达T细胞的剂量水平2(DL2)的单剂量。在一些情况下，向受试者给予DL1的双剂量，其中每个剂量相隔大约十四(14)天给予，在第1天和第14天给予，包括由于给药错误无意间通过双剂量时间表接受了两个DL2剂量的一名受试者。用于以DL1和DL2给予组合物的T细胞子集的剂量水平和目标数量示于表E3中。在核心群组中，向34名受试者给予DL1，并且向27名受试者给予DL2。
C.治疗后的安全性和反应结果
表E4显示了在两个剂量水平下完整群组和核心群组的总体反应和安全性结果。客观反应率(ORR)为74％，包括52％的显示完全反应(CR)的受试者。任何等级的细胞因子释放综合征(CRS)的发生率为35％，有1％严重CRS；并且任何等级的神经毒性(NT)的发生率为19％，有1％严重NT。
a四名以DL1D(剂量水平1，双剂量时间表)治疗的患者具有类似结果。
b包括具有PD、死亡或28天重分期扫描事件的患者。一名患者未能进行重分期扫描。
c包括所有在数据快照日期前28天已接受至少一个剂量的合规CAR表达细胞产物或者死亡的受试者。
D.药代动力学评估
在DLBCL群组中具有可评估PK的86名受试者中，在给予前(治疗前或淋巴细胞清除化学疗法(LDC)前)的时间点和治疗后的各个时间点(以给予当天为第1天)的外周血和骨髓中的CAR+T细胞数量，其是通过流式细胞术(使用对用作替代标记的截短受体具有特异性的抗体)以及定量聚合酶链式反应(qPCR)(使用对存在于编码嵌合抗原受体(CAR)的载体中的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)具有特异性的引物)来评估。评估标绘在第0天与第28天之间所指示CAR+细胞群的每微升数量的曲线下面积(AUC0-28；CAR+细胞*天/μL血液)、CAR+细胞的最大或峰值血液浓度(Cmax；CAR+细胞/μL血液)以及至Cmax的时间(Tmax；天)。
描绘在不同所指示时间点所检测的每微升血液的CAR T细胞数量(如通过qPCR或流式细胞术所评估)的示例性图示出在图2中。如图2中所示，通过基于流式细胞术的测定和基于qPCR的测定二者观察来自受试者的样品中CAR表达细胞的水平。
实施例2抗CD19
CAR表达T细胞的细胞属性与药代动力学(PK)参数、反应和毒性之
间的关联性
评价被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所评估细胞属性与在给予至受试者后细胞的药代动力学(PK)参数、反应和毒性结果(如实施例1中所确定的)之间的关系。
A.药代动力学/CAR+T细胞暴露与给予的治疗性细胞组合物的细胞表型属性之间的关系
评估给予的治疗性组合物中CAR+T细胞的某些表型属性与药代动力学(PK)或CAR+T细胞暴露和细胞因子产生的相关参数之间的关系。
具体地，由于由源自不同受试者的细胞工程化、且被配制用于给予至不同受试者的治疗性细胞组合物之间的低变化性，可以检测与药代动力学参数(例如，AUC)、临床反应结果和毒性结果(例如，CRS或NT)相关的表型(例如，CCR7+表达和细胞因子产生)。
通过流式细胞术评估细胞表面标记的细胞表面表达水平或表达的不存在，所述细胞表面标记可以指示某些T细胞亚型，如记忆细胞亚型，包括7型C-C趋化因子受体(CCR7)、CD27和CD45RA。还评估了CD3、CD4、CD8、CD28和/或用作替代标记的截短受体的表面表达水平；评估激活的半胱天冬酶3的存在以作为凋亡细胞的量度。在用CD19(对于表达的CAR具有特异性的抗原)刺激后，在CD8细胞中评估细胞因子产生(pg/mL)。标记的表达和细胞因子产生与标绘在给予后第0天与第28天之间在受试者血液中检测的CAR+T细胞(或其子集)的数量的曲线下面积(AUC0-28；给药当天作为第0天)和给予后CAR+细胞的最大或峰值血液浓度(Cmax)相关联。使用基于单变量、多变量和机器学习的分析评估相关性。
在给予的治疗性细胞组合物中的活性半胱天冬酶-3阴性(非凋亡)细胞中，观察到在给予的组合物中，在CD4或CD8 CAR+T细胞之间，CCR7+细胞、CD27+细胞、CCR7+CD27+细胞、或CD45RA-CCR7+细胞与CD4或CD8 Cmax和AUC0-28正相关。观察到CD45RA-CCR7-细胞的总百分比或数量与CD4或CD8 Cmax和AUC0-28负相关。观察到CCR7-CD27-细胞的总百分比或数量与CD4 Cmax和AUC0-28负相关。观察到用CD19刺激后的体外IL-2产生水平与CD8Cmax和AUC0-28相关联。
图3A显示评估CCR7+细胞百分比(在CD4+CAR+和CD8+CAR+细胞群之间)分别与CD4+CAR+细胞和CD8+CAR+细胞的药代动力学参数(如通过给予细胞疗法的受试者的血液中CD4+CAR+细胞的AUC0-28或CD8+CAR+细胞的AUC0-28所指示)的研究的结果。每个点表示单独患者，其中单独点的明暗处理指示患者是接受剂量水平1(DL1)还是剂量水平2(DL2)。在图3B中，这种分析是使用针对观察到展现高(在此评估中，通过大于或等于50cm2的直径积和(SPD)值指示的)或低(小于50cm2的SPD值)治疗前肿瘤负荷(在治疗前淋巴细胞清除化学疗法时评估的)的受试者单独指示的结果显示的。在给予的剂量中，观察到CD4+CAR+细胞中的CCR7+细胞的百分比与CD4+AUC0-28正相关，并且在给予的剂量中，观察到CD8+CAR+细胞中的CCR7+细胞的百分比与CD8+AUC0-28正相关。另外，观察到由源自“高”治疗前疾病负荷组中的受试者的细胞产生的治疗性工程化细胞组合物在CD8+和CD4+组合物中通常展现较高百分比的CCR7+细胞。图3C显示在给予细胞疗法的受试者的血液中分别评估CCR7+CD4+CAR+和CCR7+CD8+CAR+细胞的总数量与CD4+细胞的AUC0-28和CD8+CAR+细胞的AUC0-28之间的关系的结果。
在进一步评估CD4+CAR+T细胞的属性与CD4+或CD8+CAR+T细胞的AUC0-28和Cmax之间的关系中，观察到为CCR7+或CCR7+CD27+的CD4+CAR+T细胞的百分比与CD4+CAR+T细胞(图3A、图3D至图3F)和CD8+CAR+T细胞(图3G至图3J)的PK参数(AUC0-28和Cmax)相关联。所述结果与以下观察结果一致：CD4+CAR+T辅助细胞可以支持CD8+CAR+T细胞的扩增。
所述结果与以下观察结果一致：治疗性细胞组合物中表达某些表型标记(如指示T细胞亚型如记忆区室亚型的那些，例如CCR7和/或CD27)的细胞的表现与药代动力学参数(如指示在给予限定的细胞组合物的受试者中对CAR+T细胞的暴露程度的那些，如AUC0-28和/或Cmax)正相关。在一些方面，CAR+T细胞组合物中的CD45RA-CCR7-或CCR7-CD27-细胞与药代动力学参数负相关。
B.药代动力学/CAR+T细胞暴露、临床反应、毒性与给予的治疗性细胞组合物的细胞表型属性之间的关系
评估治疗性组合物中CAR+T细胞的某些表型属性与药代动力学(PK)或CAR+T细胞暴露、细胞因子产生、临床反应结果和毒性结果的相关参数之间的关系。在由示例性受试者组产生且给予至所述受试者的治疗性组合物的分析中，具有升高的表达指示记忆T细胞亚型的标记的细胞频率的组合物展现与体外CD19刺激后的细胞因子产生的强相关性。
如上所述确定各种标记的细胞表面表达水平、激活的半胱天冬酶的存在、用CD19刺激后CD4+和CD8+细胞的细胞因子产生、给予后的药代动力学(PK)参数(AUC0-28和Cmax)。从上文所述的核心群组中已经被给予特定CAR+T细胞组合物的可评价受试者确定，标记的表达和细胞因子产生与AUC0-28、Cmax、以及临床反应结果(包括无进展存活期和持久反应)和毒性结果(细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性(NT))相关联。使用基于单变量、多变量和机器学习的分析评估相关性。生成了热图，所述热图指示细胞的各种属性的名义p值和与毒性、反应或药代动力学(PK)参数的关联性。
所述结果显示某些功能谱、安全性事件和持久反应与表达指示分化程度较低的T细胞状态的标记(例如CCR7+CD27+)的细胞的频率之间的关联性。具体地，具有高频率的CCR7+(一种指示中枢记忆T细胞亚型的标记)细胞的组合物展现增加的IL-2产生(Spearmanρ＝0.55，P<0.0001)。如图4A至图4B中所示，含有增加的分化程度较低的CCR7+CD27+CAR+T细胞频率的CD4+CAR表达T细胞组合物分泌降低的IFNγ(图4A)和增加的IL-2(图4B)。相比之下，具有高的表达与效应物分化的T细胞亚型相关的标记的细胞频率的组合物展现增加的IFNγ产生(ρ＝0.51，P<0.0001)和IL-13产生(ρ＝0.45，P<0.0001)。如图5A至图5B中所示，含有增加的分化程度较低的CCR7+CD27+CAR+T细胞频率的CD8+CAR表达T细胞组合物产生低水平的与Th2相关的一些细胞因子，如IL-5(图5A)和IL-13(图5B)。
组合物中的记忆表型与功能之间的相关性被转换为所观察到的中枢记忆子集组合物与CAR+细胞的峰值体内扩增(ρ＝0.42，P＝0.002)和无进展存活期(PFS)(卡普兰-迈耶存活期估计，P＝0.0164)之间的正相关性。图6A至图6D显示给予CAR+T细胞组合物的受试者的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线，所述受试者分为给予含有在CD4+CAR+T细胞中(图6A关于无进展存活期，图6C关于反应持续时间)和在CD8+CAR+T细胞中(图6B关于无进展存活期，图6D关于反应持续时间)频率高于或低于某个阈值水平的CCR7+CD27+CAR+T细胞的组合物的组。观察到组合物中较高的CCR7+CD27+记忆细胞与较长的无进展存活期相关联。
此外，含有增加的中枢记忆亚群频率的CD4+CAR+T细胞组合物展示与受试者在给予治疗性组合物后是否接着发生毒性的关系，所述毒性即细胞因子释放综合征(CRS，1级或更高级，P＝0.0069；图7A)或严重神经毒性(NT，3级或更高级，P＝0.0014，图7C)。具有降低的IFNγ产生的CD4+CAR+T细胞组合物与CRS(1级或更高级，P＝0.0186；图7B)或严重NT(3级或更高级，P＝0.0055，图7D)相关。
所述结果显示工程化细胞组合物属性与所给予细胞的PK、安全性和反应结果之间的关系。观察到具有高的CCR7+细胞频率的组合物在给予后具有增加的峰值CAR+细胞扩增和持久性，这与分化程度较低的CAR+T细胞有助于药代动力学参数和无进展存活期的观察结果一致。所述结果与以下观察结果一致：与分化程度较低的T细胞相关的表型和功能属性和谱展现与增加的NT或CRS可能性以及改善的反应持久性的关系
C.多参数表型分析
基于t分布的随机邻域嵌入(tSNE)进行了示例性的多参数表型分析，以使用流式细胞术鉴定不同的细胞亚型群体。tSNE分析涉及非线性降维以表示二维空间中的结果，包括将多种细胞属性折叠到二维绘图上，并在二维绘图上鉴定6种不同的细胞亚型(参见图8A)。鉴定了绘图中主要存在的两个属性。如图所示，在CD4+和CD8+CAR+T细胞中鉴定了表达CCR7和CD27的记忆T细胞子集(在图8A上绘制的形状的边界内，在图8B中显示CCR7和CD27表达的流式细胞术绘图)。如上文在图4A至图4B和图5A至图5B中所示，所鉴定的细胞展现不同的功能谱。
D.结论
给予至受试者的CAR+T细胞组合物展现低变化性、是纯的且含有精确剂量，从而允许鉴定各种细胞属性与临床结果(如反应和毒性)之间的关系。表达与记忆表型相关的标记的细胞群展现特定的功能谱(例如，细胞因子产生)，其中CCR7+CD27+CD4+CAR T细胞产生降低的IFNγ和增加的IL-2，而CCR7+CD27+CD8+CAR T细胞产生降低的IL-5和IL-13。基于表型(如CCR7+CD27+表达)和功能谱(如细胞因子产生)，观察到所给予的含有处于分化程度较低状态的CAR+T细胞的细胞组合物与药代动力学参数、安全性事件和增加的持久反应相关。
此外，本文提供的实施方案包括涉及提供在治疗性细胞组合物(如从一系列不同患者中的起始群体产生的那些，如含有抗CD19 CAR+细胞的那些)的批次之间的低变化性的方法和组合物的那些实施方案。所提供的实施方案包括基于根据疾病负荷对患者进行分层和/或鉴定可能与给予后的一种或多种结果相关的某些T细胞表型或表型属性的能力(例如，其可能部分是由于这种低程度的变化性)的那些实施方案，所述一个或多个结果如抗CD19CAR+细胞的药代动力学参数，例如，指示患者在给予治疗后对CAR-T细胞的暴露的因子，包括最大暴露水平或随时间的暴露，如通过AUC测量的。
在一些实施方案中，此类参数包括指示一种或多种T细胞区室的亚型的一种或多种标记，如与指示记忆亚型的标记有关的属性，包括中枢记忆T细胞表型，如CCR7+或CD27+表达和/或CCR7+和/或CD27+细胞的百分比。在一些方面，此类结果支持基于此类标记和/或属性中的一种或多种的表达进行的给药，如通过给予细胞组合物，包括表达重组受体(例如CAR)的细胞组合物，其中至少一定百分比的细胞对一种或多种此类标记(例如CCR7和/或CD27)呈阳性，和/或通过给予一定剂量，在所述剂量中指示特定数量或百分比的表达此类标记(例如CCR7和/或CD27)的细胞用于跨多名受试者或适应症的给予。此类实施方案包括其中给药是基于呈CCR7+的重组受体(例如CAR)表达细胞的限定数量或固定剂量的那些实施方案。在一些方面，此类方法可以限制或减小给予治疗性组合物的受试者之间的剂量间变化性。在一些方面，此类方法允许靶向和/或控制特定的药代动力学属性，如患者体内CAR+T细胞水平或暴露的程度，例如随时间变化或在峰值时。在一些方面，此类参数的目标是在可接受的治疗窗或范围内，如对于给予的治疗性T细胞组合物观察到的至少与特定反应或功效结果的期望概率相关并且低于一种或多种不利影响或毒性结果的某一概率或风险的治疗窗或范围。
实施例3鉴定与持久反应相关的CAR+T细胞组合物的分子标签
除了评估各种功能属性外，还进行了基因组表征研究(如转录组学和表观基因组分析)，以鉴定CAR+T细胞组合物中与临床反应(例如CAR+T细胞给予后的持久临床反应)相关的分子标签。
使如上文在实施例1中所述产生的含有CAR+T细胞的工程化细胞组合物经历对大约100种表型和功能属性的分析、通过高通量RNA测序(RNA-seq)对大约20,000个转录物的表达的评估以及通过使用测序测定转座酶可及染色质(ATAC-seq)对大约100,000个调节区域处的染色质可及性的评估。通过偏最小二乘判别分析(PLS-DA)来分析属性，以鉴定在给予CAR+T细胞组合物后6个月时展现完全反应(CR)的受试者与展现进行性疾病(PD)或部分反应(PR)的受试者之间有区别的变量。如图9A至图9C中所示，可以在已被给予工程化细胞组合物的受试者中使用对表型和功能属性的评估以及转录组学和表观基因组学分析鉴定工程化CAR+T细胞组合物中与持久临床反应(例如，6个月时的CR)相关的分子标签。结果与以下观察结果一致：可以基于工程化细胞组合物的基因组表征鉴定与功效和安全性相关联的分子标签。
实施例4在工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)之前和之后T细胞组合物中记忆细胞
亚型属性之间的关联性
在工程化之前来自受试者的T细胞组合物、和表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化治疗性细胞组合物中，评估了各种细胞属性，包括指示记忆亚型的标记(如CCR7、CD27和/或CD45RA)的表达。评估两种群体中属性之间的关联性。
从来自多名受试者的人外周血单核细胞(PBMC)的白细胞单采术中通过基于免疫亲和力的富集选择CD4+和CD8+T细胞。评估此类所选择的T细胞的组合物(在基因工程化之前，命名为“工程化前组合物”)的各种属性，包括指示某些T细胞亚型(如记忆细胞亚型)的细胞表面标记(包括7型C-C趋化因子受体(CCR7)、CD27和CD45RA)的表达，以及CD3、CD4、CD8、CD28和/或用作替代标记的截短受体的表面表达，并且评估激活的半胱天冬酶3的存在作为凋亡细胞的量度。通过在细胞因子的存在下与抗CD3和抗CD28抗体包被的珠一起孵育进行激活之后，然后如上文在实施例1.A中所述用编码抗CD19 CAR的慢病毒载体转导，使所选择的T细胞经受基因工程化以表达抗CD19 CAR。扩增并低温保存所得的细胞组合物(在基因工程化之后，命名为“工程化细胞组合物”)，并且如上所述评估细胞属性。确定了针对工程化前组合物与工程化细胞组合物中的细胞属性之间的成对相关性的Spearman等级次序相关系数。
图10A至图10B显示工程化前组合物中CD4+CCR7+CD27+细胞的频率与工程化细胞组合物中CD4+CAR+CCR7+CD27+细胞的频率之间的相关性(图10A；Spearman等级次序相关系数：0.591)，以及工程化前组合物中CD8+CCR7+CD27+细胞的频率与工程化细胞组合物中CD8+CAR+CCR7+CD27+细胞的频率之间的相关性(图10B；Spearman等级次序相关系数：0.357)的示例性结果。所述结果显示，在一些情况下，用于给予的工程化细胞组合物中指示记忆细胞亚型的一种或多种标记(例如，CCR7和/或CD27)的表达与工程化前细胞组合物中所述标记的表达相关。所述结果与以下发现一致：含有特定数量或百分比的表达指示记忆细胞亚型的一种或多种标记(例如CCR7和/或CD27)的细胞的工程化细胞组合物可以基于工程化前组合物中表达一种或多种标记的细胞的数量或百分比产生。
实施例5：评估含有CAR+ T细胞的工程化T细胞组合物中的幼稚样标记。
含有表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的原代T细胞的工程化组合物是通过两个平行过程产生的，所述过程在用病毒载体转导之前利用刺激试剂来激活T细胞，所述刺激试剂由聚苯乙烯包被的顺磁珠构成且附着有抗CD3和抗CD28抗体。在两个过程中，通过慢病毒转导对细胞进行工程化，以表达相同的抗BCMA CAR。所述CAR含有对BCMA具有特异性的scFv抗原结合结构域、CD28跨膜区域、4-1BB共刺激信号传导区域和CD3-ζ来源的细胞内信号传导结构域。所述过程的持续时间和细胞扩增的条件不同。评估了所产生的T细胞组合物的细胞表面标记。
在两个过程中，从来自人供体的白细胞单采术样品的分离的PBMC选择CD4+和CD8+细胞的单独组合物，然后将选择的细胞组合物低温保存。随后将CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物解冻，并且以1:1的活CD4+ T细胞与活CD8+ T细胞的比率混合。通过在抗CD3/抗CD28抗体缀合的珠的存在下在无血清培养基中以1:1的珠与细胞比率将细胞孵育18-30个小时，刺激混合输入细胞组合物的大约300x 106个T细胞(150x 106个CD4+ T细胞和150x 106个CD8+ T细胞)。培养基还含有重组IL-2、IL-7和IL-15。刺激后，将细胞洗涤并重悬于含有添加剂以及重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中。
在一个过程(示例性非扩增过程)中，然后通过旋转接种，用编码抗BCMA CAR的慢病毒载体转导来自经刺激的细胞组合物的细胞。旋转接种后，将细胞洗涤并重悬于含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中。将重悬的组合物的细胞在孵育器中于约37.0℃下孵育。在刺激开始后约96小时，在磁场的存在下将细胞冲洗两次以去除抗CD3/抗CD28抗体缀合的顺磁珠，并且在含有10％DMSO的溶液中配制。将经配制的细胞组合物转移到袋或小瓶中，并且在大约-80℃下储存。
在另一个过程(示例性扩增过程)中，孵育后，将来自经刺激的细胞组合物的大约100x 106个活细胞在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中浓缩。通过以大约1600g旋转接种60分钟，如上所述用编码相同的抗BCMA CAR的慢病毒载体转导细胞。旋转接种后，将细胞重悬于含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中，并且在约37℃下孵育约18至30小时。然后，通过转移到生物反应器(例如摇摆运动生物反应器)中的约500mL示例性无血清培养基中来培育细胞以进行扩增，所述无血清培养基含有两倍于在孵育和转导步骤期间所用的浓度的IL-2、IL-7和IL-15。当达到设定的活细胞密度时，开始灌注，其中在持续混合下通过半连续灌注更换培养基。第二天在生物反应器中培育细胞，直至达到约3x106个细胞/ml的阈值细胞密度为止，这通常发生在涉及6-7天扩增的过程中。通过暴露于磁场将抗CD3和抗CD28抗体缀合的顺磁珠从细胞组合物中去除。然后如上所述将细胞收集，并且配制和低温保护。
用识别包括CD4、CD8、CCR7和CD27在内的表面标记的试剂对使用示例性扩增和非扩增过程产生的T细胞组合物进行染色，并且通过流式细胞术进行评估。对CCR7和CD27染色两者呈表面阳性的CD4+CAR+和CD8+CAR+T细胞的百分比示出在图11A中。图11B和图11C分别描绘了与在与抗CD3/抗CD28抗体缀合的珠刺激试剂一起孵育之前的输入组合物中CCR7+CD27+细胞的百分比相比，在所产生的T细胞组合物中，CD4+CAR+ T细胞和CD8+CAR+ T细胞中的CCR7+CD27+细胞的百分比。如图所示，与示例性扩增过程相比，在由示例性非扩增过程产生的T细胞组合物中观察到更大百分比的CCR7+CD27+。这些结果与由示例性非扩增过程产生的工程化细胞组合物一致，所述工程化细胞组合物具有比通过示例性扩增过程产生的细胞组合物更大部分的具有幼稚样、分化程度较低的表型的细胞。
对在制造过程期间的不同日期(包括在激活、转导或在起始培育后的不同时间(inoc+2、inoc+4或inoc+5))来自代表性供体的通过示例性扩增过程产生的细胞的进一步分析证明，细胞的扩增与分化程度更高的表型相关，如通过降低的CCR7+CD27+细胞百分比所确定的(图11D)。
实施例6：使用测序和分析方法评估T细胞克隆性
在基因工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)之前和之后，使用T细胞受体(TCR)对的单细胞测序评估了T细胞组合物的T细胞克隆丰度。
通过用于纯化CD4+和CD8+T细胞的基于免疫亲和力的选择，通过白细胞单采术从受试者分离自体T细胞，从而得到分别富含CD8+和CD4+ T细胞的两种组合物。将富集CD4+和CD8+组合物的细胞用抗CD3/抗CD28顺磁珠激活，然后使其单独经历用编码抗CD19 CAR的载体的慢病毒转导。抗CD19CAR含有源自鼠抗体的抗CD19 scFv(源自FMC63的可变区)、免疫球蛋白来源的间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区域和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。然后将所转导群体在用于细胞扩增的刺激试剂的存在下单独孵育。将含有CAR表达T细胞的经扩增的CD8+和CD4+组合物单独配制并低温保存，并且储存起来。
评估了通过上述过程工程化(CMAT)前分离的CD4+和CD8+ T细胞组合物以及工程化后CD4+和CD8+治疗性CAR+ T细胞组合物的T细胞克隆性。为了评估T细胞克隆性，大体上如WO 2016044227、WO 2016176322和WO2012048340中所述，使细胞经历单细胞αβ配对的TCR测序。基于TCR基因的条码化的单细胞测序，确定了细胞群中已鉴定克隆的T细胞克隆性和多样性。在一些情况下，将香农指数用作过滤克隆的阈值(“香农调整的克隆性”)，它在消除样品噪声的同时保留了样品间关系。参见，Chaara等人(2018)Front Immunol 9:1038)。
图12显示在应用香农指数之后每个样品的克隆性。如图12所示，在基因工程化之前和之后，T细胞组合物中CD4和CD8细胞的克隆性有所不同，其中与开始用于工程化细胞的过程之前组合物中的T细胞相比，工程化CAR+ T细胞组合物展现出降低的克隆性。
通过流式细胞术，针对指示凋亡的因子的表达(如用膜联蛋白V(膜联蛋白V-)进行表面染色或半胱天冬酶3切割(指示非凋亡细胞))，以及针对各种表面标记(包括CD45RA、CCR7、CD27、CD4和CD8)的表达，分选基因工程化后的CD4+和CD8+治疗性CAR+ T细胞组合物。细胞的表型与细胞的克隆性程度相关。观察到在CD4+和CD8+治疗性CAR+T细胞组合物两者中，呈CCR7-/CD27-的凋亡标记阴性细胞的存在与组合物中细胞的克隆性高度正相关。同样，呈CCR7+或CCR7+/CD27+的凋亡标记阴性细胞的存在与CD4+和CD8+治疗性CAR+T细胞组合物中的每一种中细胞的克隆性负相关。这些结果与如下观察结果是一致的，即细胞的克隆性可能与分化程度较低的幼稚样细胞逆相关，如通过CCR7和/或CD27阳性所确定的。
实施例7对细胞表型和功能属性与反应之间的关系的评估
如实施例1中所述，产生了含有表达对CD19具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)的自体T细胞的示例性治疗性T细胞组合物并且将其给予至患者。使用流式细胞术评估了起始样品、经富集CD4+或CD8+输入T细胞组合物以及所产生的表达抗CD19 CAR的治疗性T细胞组合物的多种属性，包括各种表型、功能和细胞健康状况相关属性。
经由单变量分析来分析所产生的CAR+ T细胞组合物的属性与反应结果的关系，如通过比较给予治疗性T细胞组合物的受试者的无进展存活期(PFS)所评估的。鉴定的最重要的可变属性包括CD4+CAR+ T细胞在高尔基体抑制剂的存在下响应于PMA/离子霉素以非CAR抗原特异性方式(如在基于流动的方法细胞内细胞因子染色(ICS)测定中)产生IL-2和TNF-α细胞因子的能力。具体地，图13A和图13B分别显示在治疗性组合物的CD4+/CAR+T细胞中，具有“高”或“低”百分比的产生IL-2和TNFα产生的细胞的患者的PFS曲线(Cox比例风险(顶部)和最佳分割(底部))，如使用最大选择秩统计量确定的。如图13A和图13B中所示，与给予含有较低百分比的CD4+/CAR+IL-2或TNFα产生的治疗性T细胞组合物的受试者相比，给予含有较高水平的此类细胞的治疗性T细胞组合物的组显示出改善的存活期。
在给予CAR+治疗性T细胞组合物之前，如实施例2中所述，通过监测积和(SPD)的基线血清水平来评估受试者的肿瘤负荷。还确定了C反应蛋白(CRP)的基线血清水平。在基本上如实施例1中所述向受试者给予CAR表达T细胞组合物后，在给予后6个月时确定每名受试者的临床结果并将其与疾病负荷相关联。图14描绘了与在6个月时展现完全反应(CR)(三角形)或反应丧失/无反应(圆圈)的受试者中的SPD或CRP水平相关联的临床结果。如图14中所示，与具有高疾病负荷(如通过较高基线SPD和CRP值指示的)的患者相比，具有较低疾病负荷的患者(如通过低基线SDP(小于50cm2)和低CRP值(在基线样品中小于20mg/L)指示的)在6个月时丧失反应的风险较低。对于具有高疾病负荷的患者，具有增加的产生IL-2表达的CD4+CAR+ T细胞频率的治疗性T细胞组合物与在6个月时的维持反应相关联(图15)。对于TNF-α观察到相似的结果。这些数据与以下观察结果一致：CD4+CAR表达T细胞的某些功能属性(如产生IL-2和TNFα的能力)与维持的临床反应正相关，特别是在具有高疾病负荷或阈值附近的基线SPD或CRP水平的受试者中。
通过流式细胞术针对凋亡标记(例如，激活的半胱天冬酶3)评估针对CD4+或CD8+选择和富集(在用抗CD19 CAR进行工程化之前)的输入组合物的细胞健康状况。评估细胞健康状况与反应之间的关系。如图16中所示，在多种经富集T细胞输入组合物中，输入组合物中对凋亡标记(例如，激活的半胱天冬酶3)呈阳性的细胞的示例性三分位数截止值证明了用于产生治疗性T细胞的起始T细胞材料中凋亡细胞百分比与PFS概率之间的关系。所述结果与以下一致：起始材料中凋亡标记+细胞百分比与改善的无进展存活期(PFS)之间的逆相关性。
图17显示使用基本上描述于实施例1中的过程的经富集输入T细胞组合物中对凋亡标记(例如激活的半胱天冬酶3)呈阳性的细胞的百分比，所述百分比随起始单采术样品的年龄(即在单采术与其在富集T细胞之前的进一步处理之间的时间长度(例如，以小时计)上变化的样品)而变化。这些数据支持单采术年龄与对凋亡标记呈阳性的细胞的存在之间的正相关性。
经富集CD8+或CD4+ T细胞起始材料中对凋亡标记(例如激活的半胱天冬酶3)呈阳性的细胞的存在与经转导材料或过程或产物特征的各种其他参数或属性之间的相关性汇总在表E5中。这些数据进一步支持了以下发现：起始T细胞材料凋亡概况与治疗性组合物质量相关联。
以上结果支持如下模型，其中与过程和/或所产生的CAR+治疗性T细胞组合物的特征相关的某些相关性变量可以预测或指示受试者可能展现持久性PFS的可能性。使用条件推理树来递归地划分存活曲线，其中递归地进行划分，直到没有显著的进一步分割(如使用排列来推断多重性调整的p值(Bonferroni校正)确定的)为止，开发与PFS的持久性相关联的变量的决策树。所述模型推断出反应持久性的改善可能性，其中变量包括起始T细胞材料(例如，经富集CD8+ T细胞)中凋亡标记+/CD3+/CAR+细胞的低水平、用于产生治疗性T细胞组合物的过程期间细胞倍增数的相对低数量、以及在非抗原依赖性刺激(例如，在细胞内细胞因子测定中响应于PMA/离子霉素)后，在治疗性T细胞组合物的细胞中对细胞因子(例如IL-2或TNF)呈阴性的CAR+CD4+细胞的相对低百分比。
本发明的范围意图不限于具体公开的实施方案，所述实施方案的提供例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对组合物和方法的各种修改将变得清楚。此类变化可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践，并且意图落入本公开文本的范围内。
序列
序列表
<110> 朱诺治疗学股份有限公司
R·P·拉森
C·G·拉姆斯堡
C·L·萨瑟兰
K·H·戴夫
N·K·耶
R·K·尤斯特
小罗纳德·J·豪斯
T·德弗里斯
<120> 用于细胞疗法的表型标记和相关方法
<130> 73504-20145.40
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> US 62/596,775
<151> 2017-12-08
<150> US 62/643,165
<151> 2018-03-14
<150> US 62/657,716
<151> 2018-04-13
<150> US 62/716,967
<151> 2018-08-09
<160> 59
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子(IgG4铰链) (aa)
<400> 1
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子(IgG4铰链) (nt)
<400> 2
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH3间隔子
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
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85 90 95
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Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3间隔子
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
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<213> 人工序列
<220>
<223> IgD-铰链-Fc
<400> 5
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Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
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Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 6
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 7
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD28 (登录号P10747的氨基酸153-179)
<400> 8
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 9
<211> 66
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD28 (登录号P10747的氨基酸114-179)
<400> 9
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD28 (P10747的氨基酸180-220)
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 (LL至GG)
<400> 11
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 4-1BB (Q07011.1的氨基酸214-255)
<400> 12
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 16
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 17
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 18
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 19
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 20
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 21
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (5)...(9)
<223> SGGGG重复5次
<400> 22
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 23
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 24
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFRα链信号序列
<400> 24
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 25
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFRα链信号序列
<400> 25
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8α链信号肽
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 27
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 28
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 29
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
20 25 30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
35 40 45
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 30
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 31
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 32
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 33
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 34
Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 35
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 36
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 37
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 38
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 39
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 40
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 41
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 43
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 44
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 45
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 46
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 47
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 48
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 49
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 50
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 51
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 53
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-CDR3
<400> 54
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-CDR2
<400> 55
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-CDR3
<400> 56
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 57
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFv的序列
<400> 57
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(1)
<223> Xaa是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸
<220>
<221> 变体
<222> (4)...(4)
<223> Xaa是半胱氨酸或苏氨酸
<400> 58
Xaa Pro Pro Xaa Pro
1 5
<210> 59
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 59
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
Claims (316)
1.一种包含表达重组受体的T细胞的治疗性组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。
2.根据权利要求1所述的治疗性组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约50％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。
3.根据权利要求1所述的治疗性组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约60％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。
4.根据权利要求1所述的治疗性组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约70％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。
5.根据权利要求1所述的治疗性组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约80％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的治疗性组合物，其中：
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD8+T细胞或由其组成；
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD4+T细胞或由其组成；
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD8+和CD4+T细胞或由其组成；
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含至少或至少约30％、50％、95％、96％、97％、98％、或99％或100％CD8+T细胞或由其组成；
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含至少或至少约30％、50％、95％、96％、97％、98％、或99％或100％CD4+T细胞或由其组成；和/或
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含大约1:1或大约在1:3与3:1之间或大约在1:2与2:1之间的CD4+:CD8+T细胞或由其组成。
7.一种包含表达重组受体的T细胞的治疗性组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性，任选地其中：
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD8+T细胞或由其组成；
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD4+T细胞或由其组成；
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含CD8+和CD4+T细胞或由其组成；
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含至少或至少约30％、50％、95％、96％、97％、98％、或99％或100％CD8+T细胞或由其组成；
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含至少或至少约30％、50％、95％、96％、97％、98％、或99％或100％CD4+T细胞或由其组成；和/或
所述组合物中和/或表达所述重组受体的所述T细胞包含大约1:1或大约在1:3与3:1之间或大约在1:2与2:1之间的CD4+:CD8+T细胞或由其组成。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的治疗性组合物，其中所述组合物中总数量的T细胞、或所述组合物中总数量的表达所述重组受体的T细胞对CCR7呈表面阳性。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的治疗性组合物，其中所述组合物中总数量的T细胞、或所述组合物中总数量的表达所述重组受体的T细胞对CD27呈表面阳性。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的治疗性组合物，其中所述组合物中总数量的T细胞、或所述组合物中总数量的表达所述重组受体的T细胞对CCR7和CD27呈表面阳性。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的治疗性组合物，其中所述组合物包含细胞的一个或多个单位剂量。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的治疗性组合物，
其中所述单位剂量或组合物包含在1x105或约1x105与1x108或约1x108之间、在5x105或约5x105与1x107或约1x107之间、或在1x106或约1x106与1x107或约1x107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值；和/或
其中所述单位剂量或组合物包含不超过约1x108、不超过约5x107、不超过约1x107、不超过约5x106、不超过约1x106、或不超过约5x105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的治疗性组合物，其中所述组合物或单位剂量包含至少约3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞；和/或至少约3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的治疗性组合物，其中所述单位剂量或组合物包含在3x106或约3x106与2.5x107或约2.5x107之间、在4x106或约4x106与2x107或约2x107之间、或在5x106或约5x106与1x107或约1x107之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或在3x106或约3x106与2.5x107或约2.5x107之间、在4x106或约4x106与2x107或约2x107之间、或在5x106或约5x106与1x107或约1x107之间的总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+，每个都包含端值。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的治疗性组合物，其中所述单位剂量或组合物中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量或组合物中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每个都包含端值，是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+；或者所述单位剂量或组合物中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量或组合物中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每个都包含端值，是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的治疗性组合物，其中所述单位剂量或组合物包含限定数量的受体+/CD8+/CCR7+细胞和受体+/CD4+/CCR7+细胞或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
17.根据权利要求16所述的治疗性组合物，其中细胞的所述限定数量或比率进一步是CD27+或CD45RA-细胞的数量或比率。
18.根据权利要求1-15中任一项所述的治疗性组合物，其中所述单位剂量或组合物包含限定数量的受体+/CD8+/CD27+细胞和受体+/CD4+/CD27+细胞或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
19.根据权利要求18所述的治疗性组合物，其中细胞的所述限定数量或比率进一步是CCR7+或CD45RA-细胞的数量或比率。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的治疗性组合物，其中所述单位剂量或组合物包含限定数量的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞；和/或所述单位剂量或组合物包含限定数量的受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的治疗性组合物，其中所述单位剂量或组合物中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量或组合物中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每个都包含端值，是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的治疗性组合物，其中表达所述重组受体的细胞的所述单位剂量或数量包含在1x105或约1x105与5x108或约5x108之间、在1x105或约1x105与1x108或约1x108之间、在5x105或约5x105与1x107或约1x107之间、或在1x106或约1x106与1x107或约1x107之间的表达所述重组受体的总CD3+细胞(受体+/CD3+细胞)或总CD3+细胞，每个都包含端值；和/或表达所述重组受体的细胞的所述单位剂量或数量包含不超过约5x108、不超过约1x108、不超过约5x107、不超过约1x107、不超过约5x106、不超过约1x106、或不超过约5x105个总受体+/CD3+细胞或总CD3+细胞。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的治疗性组合物，其中CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是活的或有活力的此类细胞的总数量。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的治疗性组合物，其中CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是不表达凋亡标记的此类细胞的总数量和/或是凋亡标记阴性(–)的此类细胞的总数量，其中所述凋亡标记为膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。
25.根据权利要求1-29中任一项所述的治疗性组合物，其中所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
26.根据权利要求25所述的治疗性组合物，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
27.根据权利要求25或权利要求26中任一项所述的治疗性组合物，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的治疗性组合物，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的治疗性组合物，其中所述重组受体包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域和含有细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区域，并且进一步包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
30.根据权利要求28所述的治疗性组合物，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。
31.根据权利要求30所述的治疗性组合物，其中所述片段包含scFv。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的治疗性组合物，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链、任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
33.根据权利要求29-32中任一项所述的治疗性组合物，其中所述细胞内信号传导区域进一步包含共刺激信号传导结构域。
34.根据权利要求33所述的治疗性组合物，其中所述共刺激信号传导结构域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的治疗性组合物，其中所述共刺激信号传导结构域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
36.根据权利要求33-35中任一项所述的治疗性组合物，其中所述共刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的治疗性组合物，其中所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的治疗性组合物，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。
39.根据权利要求1-37中任一项所述的治疗性组合物，其中所述T细胞对于所述受试者是同种异体的。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的治疗性细胞组合物，其中所述受试者患有癌症，任选地其中所述癌症是白血病或淋巴瘤。
41.根据权利要求40所述的治疗性细胞组合物，其中所述受试者是在获得所述细胞时被鉴定为或已知具有高肿瘤负荷的受试者。
42.根据权利要求41所述的治疗性细胞组合物，其中：
如果所述受试者中肿瘤的尺寸积和(SPD)高于或高于约30cm2、40cm2、50cm2、60cm2或70cm2，则所述受试者具有高肿瘤负荷；和/或
如果来自所述受试者的生物样品、任选地血清样品中的C反应蛋白(CRP)高于或高于约5毫克/升、10毫克/升、15毫克/升、20毫克/升、25毫克/升、30毫克/升、40毫克/升或50毫克/升，则所述受试者具有高肿瘤负荷。
43.根据权利要求42所述的治疗性细胞组合物，其中如果所述受试者中肿瘤的SPD高于或高于约50cm2，则所述受试者具有高肿瘤负荷。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的治疗性细胞组合物，其中如果所述生物样品中的CRP高于或高于约20毫克/升，则所述受试者具有高肿瘤负荷。
45.一种制品，所述制品包含含有根据权利要求1-44中任一项所述的组合物的容器，和用于向患有疾病或病症的受试者给予所述治疗性组合物，任选地其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积的说明书。
46.一种制品，所述制品包含：
容器，所述容器包含存在于一种或多种治疗性组合物中的细胞的一个或多个单位剂量，所述单位剂量包含表达(任选地被工程化以表达)重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞，其中细胞的单位剂量包含限定数量的表达(任选地表面表达)7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；以及
用于向患有疾病或病症的受试者给予所述治疗性组合物，任选地其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积的说明书。
47.一种制品，所述制品包含：
容器，所述容器包含存在于一种或多种治疗性组合物中的细胞的一个或多个单位剂量，所述单位剂量包含表达(任选地被工程化以表达)重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞，其中细胞的单位剂量包含限定数量的表达(任选地表面表达)分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；以及
用于向患有疾病或病症的受试者给予所述治疗性组合物，任选地其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积的说明书。
48.根据权利要求46或权利要求47所述的制品，其中细胞的所述单位剂量包含根据权利要求1-44中任一项所述的组合物。
49.一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者给予根据权利要求1或权利要求7所述的治疗性组合物、或包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物的一个或多个单位剂量和/或对应于此类单位剂量的体积，任选地其中：
细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；和/或
在根据所述方法治疗的一组受试者之间，所述单位剂量中表达CCR7的细胞(CCR7+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
50.根据权利要求49所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+细胞；和/或细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+细胞。
51.一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者给予根据权利要求1或权利要求7所述的治疗性组合物、或包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物的一个或多个单位剂量和/或对应于此类单位剂量的体积，任选地其中：
细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；和/或
在根据所述方法治疗的一组受试者之间，所述单位剂量中表达CD27的细胞(CD27+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
52.根据权利要求51所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CD27+细胞；和/或细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CD27+细胞。
53.根据权利要求49-52中任一项所述的方法，其中：
所述单位剂量包含在1x105或约1x105与1x108或约1x108之间、在5x105或约5x105与1x107或约1x107之间、或在1x106或约1x106与1x107或约1x107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值；
所述单位剂量包含不超过约1x108、不超过约5x107、不超过约1x107、不超过约5x106、不超过约1x106、或不超过约5x105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞；和/或
所述单位剂量包含至少约3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或至少约3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+。
54.根据权利要求49-53中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在3x106或约3x106与2.5x107或约2.5x107之间、在4x106或约4x106与2x107或约2x107之间、或在5x106或约5x106与1x107或约1x107之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或在3x106或约3x106与2.5x107或约2.5x107之间、在4x106或约4x106与2x107或约2x107之间、或在5x106或约5x106与1x107或约1x107之间的总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+，每个都包含端值。
55.根据权利要求49-54中任一项所述的方法，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每个都包含端值，是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+；或者所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每个都包含端值，是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+。
56.根据权利要求49、50和53-55中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD8+/CCR7+细胞和受体+/CD4+/CCR7+细胞或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
57.根据权利要求51-55中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD8+/CD27+细胞和受体+/CD4+/CD27+细胞或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
58.根据权利要求56或权利要求57所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞；和/或细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每个都包含端值，是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–；和/或所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每个都包含端值，是受体+/CD4+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–。
60.一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者给予根据权利要求1或权利要求7所述的组合物的一个或多个单位剂量。
61.根据权利要求60所述的方法，其中：
细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；并且
在根据所述方法治疗的一组受试者之间，所述单位剂量中表达CCR7的细胞(CCR7+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
62.一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者给予包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物和/或对应于此类单位剂量的体积，其中：
细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；并且
在根据所述方法治疗的一组受试者之间，所述单位剂量中表达CCR7的细胞(CCR7+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
63.根据权利要求58-62中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+/CD27+细胞；和/或细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
64.根据权利要求58-63中任一项所述的方法，其中：
所述单位剂量包含在1x105或约1x105与1x108或约1x108之间、在5x105或约5x105与1x107或约1x107之间、或在1x106或约1x106与1x107或约1x107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值；
所述单位剂量包含不超过约1x108、不超过约5x107、不超过约1x107、不超过约5x106、不超过约1x106、或不超过约5x105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞；和/或
所述单位剂量包含至少约3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞；和/或至少约3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
65.根据权利要求58-64中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在3x106或约3x106与2.5x107或约2.5x107之间、在4x106或约4x106与2x107或约2x107之间、或在5x106或约5x106与1x107或约1x107之间的总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或在3x106或约3x106与2.5x107或约2.5x107之间、在4x106或约4x106与2x107或约2x107之间、或在5x106或约5x106与1x107或约1x107之间的总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。
66.根据权利要求58-65中任一项所述的方法，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每个都包含端值，是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+。
67.根据权利要求58-66中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
68.根据权利要求49-67中任一项所述的方法，其中所述限定数量的细胞进一步表达或不表达CD45RA，任选地其中所述限定数量的细胞进一步为CD45RA-细胞。
69.根据权利要求49-68中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在1x105或约1x105与5x108或约5x108之间、在1x105或约1x105与1x108或约1x108之间、在5x105或约5x105与1x107或约1x107之间、或在1x106或约1x106与1x107或约1x107之间的表达所述重组受体的总CD3+细胞(受体+/CD3+细胞)或总CD3+细胞，每个都包含端值。
70.根据权利要求49-69中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含不超过约5x108、不超过约1x108、不超过约5x107、不超过约1x107、不超过约5x106、不超过约1x106、或不超过约5x105个总受体+/CD3+细胞或总CD3+细胞。
71.根据权利要求70所述的方法，其中CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是活的或有活力的此类细胞的总数量。
72.根据权利要求49-71中任一项所述的方法，其中CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是不表达凋亡标记的此类细胞的总数量和/或是凋亡标记阴性(–)的此类细胞的总数量，其中所述凋亡标记为膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。
73.根据权利要求49-72中任一项所述的方法，所述方法包括给予包含在多种单独组合物中的多个单位剂量。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述多种单独组合物包括含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的一种的第一组合物以及含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的另一种的第二组合物。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述第一组合物包含所述CD8+T细胞。
76.根据权利要求74所述的方法，其中所述第一组合物包含所述CD4+T细胞。
77.根据权利要求49-76中任一项所述的方法，所述方法包括间隔不超过48小时给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积以及所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
78.根据权利要求77所述的方法，其中间隔不超过36小时、间隔不超过24小时、间隔不超过12小时、间隔不超过6小时、间隔不超过4小时、间隔不超过2小时、间隔不超过1小时或间隔不超过30分钟给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积以及所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
79.根据权利要求77或权利要求78所述的方法，其中间隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟，或同时地给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积以及所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
80.根据权利要求73-79中任一项所述的方法，所述方法包括在给予所述含有CD4+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
81.根据权利要求73-79中任一项所述的方法，所述方法包括在给予所述含有CD8+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
82.一种确定用于治疗受试者的工程化T细胞的单位剂量的方法，所述方法包括：
(a)在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达所述重组受体和CCR7(受体+/CCR7+)的T细胞的数量、百分比或比率；
(b)基于所述受体+/CCR7+细胞的数量、百分比或比率，确定用于给予至患有疾病或病症的受试者的细胞的一个或多个单位剂量，其中所述单位剂量包含限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
83.一种确定用于治疗受试者的工程化T细胞的单位剂量的方法，所述方法包括：
(a)在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达所述重组受体和CD27(受体+/CD27+)的T细胞的数量、百分比或比率；以及
(b)基于所述受体+/CD27+细胞的数量、百分比或比率，确定用于给予至患有疾病或病症的受试者的细胞的一个或多个单位剂量，其中所述单位剂量包含限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
84.一种产生包含T细胞组合物的单位剂量的组合物的方法，所述方法包括：
(a)在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达所述重组受体和CCR7和/或CD27(受体+/CCR7+和/或受体+/CD27+)的T细胞的数量、百分比或比率；以及
(b)向容器填充所述组合物的全部或一部分和任选的另一种溶液以实现所述T细胞组合物的单位剂量，其中所述单位剂量包含限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集，或限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
85.一种产生包含T细胞组合物的单位剂量的治疗性组合物的方法，所述方法包括向容器填充T细胞组合物的全部或一部分以实现所述T细胞组合物的单位剂量，所述T细胞组合物包含含有特异性地结合与疾病或病症相关的抗原的重组受体的T细胞，其中所述单位剂量包含限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
86.一种产生包含T细胞组合物的单位剂量的治疗性组合物的方法，所述方法包括向容器填充T细胞组合物的全部或一部分以实现所述T细胞组合物的单位剂量，所述T细胞组合物包含含有特异性地结合与疾病或病症相关的抗原的重组受体的T细胞，其中所述单位剂量包含限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
87.根据权利要求83-86中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+细胞和/或细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+细胞。
88.根据权利要求82-87中任一项所述的方法，其中：
所述单位剂量包含在1x105或约1x105与1x108或约1x108之间、在5x105或约5x105与1x107或约1x107之间、或在1x106或约1x106与1x107或约1x107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值；
所述单位剂量包含不超过约1x108、不超过约5x107、不超过约1x107、不超过约5x106、不超过约1x106、或不超过约5x105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞；和/或
所述单位剂量包含至少约3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或至少约3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+。
89.根据权利要求82-88中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在3x106或约3x106与2.5x107或约2.5x107之间、在4x106或约4x106与2x107或约2x107之间、或在5x106或约5x106与1x107或约1x107之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或在3x106或约3x106与2.5x107或约2.5x107之间、在4x106或约4x106与2x107或约2x107之间、或在5x106或约5x106与1x107或约1x107之间的总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+，每个都包含端值。
90.根据权利要求82-89中任一项所述的方法，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每个都包含端值，是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+；或者所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每个都包含端值，是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+。
91.根据权利要求82-90中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
92.根据权利要求82-91中任一项所述的方法，其中所述单位剂量进一步包含限定数量的包含表达或不表达CD27和/或CD45的细胞的细胞，任选地其中所述单位剂量进一步包含限定数量的包含CD27+或CD45RA-细胞的细胞。
93.根据权利要求82-92中任一项所述的方法，其进一步包括在所述治疗性组合物中评估表达或不表达CD27和/或CD45RA的T细胞的数量、百分比或比率，任选地为CD27+或CD45RA-的T细胞的数量、百分比或比率。
94.根据权利要求92或权利要求93所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞。
95.根据权利要求92-95中任一项所述的方法，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每个都包含端值，是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–。
96.一种确定用于治疗受试者的工程化T细胞的单位剂量的方法，所述方法包括：
(a)在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达所述重组受体和CCR7和CD27(受体+/CCR7+/CD27+)的T细胞的数量、百分比或比率；
(b)基于所述受体+/CCR7+/CD27+细胞的数量、百分比或比率，确定用于给予至患有疾病或病症的受试者的细胞的一个或多个单位剂量，其中所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
97.一种产生包含T细胞组合物的单位剂量的组合物的方法，所述方法包括：
(a)在包含被工程化以表达重组受体的多种CD8+和/或CD4+T细胞的治疗性组合物中评估表达所述重组受体和CCR7和CD27(受体+/CCR7+/CD27+)的T细胞的数量、百分比或比率；以及
(b)向容器填充所述组合物的全部或一部分和任选的另一种溶液以实现所述T细胞组合物的单位剂量，其中所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
98.一种产生包含T细胞组合物的单位剂量的治疗性组合物的方法，所述方法包括向容器填充T细胞组合物的全部或一部分以实现所述T细胞组合物的单位剂量，所述T细胞组合物包含含有特异性结合与疾病或病症相关的抗原的重组受体的T细胞，其中所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
99.根据权利要求96-98中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
100.根据权利要求96-99中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在1x105或约1x105与1x108或约1x108之间、在5x105或约5x105与1x107或约1x107之间、或在1x106或约1x106与1x107或约1x107之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值；所述单位剂量包含不超过约1x108、不超过约5x107、不超过约1x107、不超过约5x106、不超过约1x106、或不超过约5x105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞；和/或所述单位剂量包含至少约3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞个/或至少约3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
101.根据权利要求96-100中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在3x106或约3x106与2.5x107或约2.5x107之间、在4x106或约4x106与2x107或约2x107之间、或在5x106或约5x106与1x107或约1x107之间的总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或在3x106或约3x106与2.5x107或约2.5x107之间、在4x106或约4x106与2x107或约2x107之间、或在5x106或约5x106与1x107或约1x107之间的总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。
102.根据权利要求96-103中任一项所述的方法，其中所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每个都包含端值，是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+。
103.根据权利要求96-102中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
104.根据权利要求96-103中任一项所述的方法，其中所述单位剂量进一步包含限定数量的包含表达或不表达CD45的细胞的细胞，任选地其中所述单位剂量还包含限定数量的包含CD45RA-细胞的细胞。
105.根据权利要求96-104中任一项所述的方法，其进一步包括在所述治疗性组合物中评估表达或不表达CD45RA的T细胞的数量、百分比或比率，任选地为CD45RA-的T细胞的数量、百分比或比率。
106.一种用于产生包含基因工程化细胞的细胞组合物的方法，所述方法包括：
i)从来自受试者的生物样品提供包含目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞的输入组合物；
ii)向所述输入组合物中引入编码重组受体的多核苷酸；以及
iii)在所述引入之前、期间和/或之后刺激所述输入组合物中的所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，所述刺激导致所述细胞的激活和/或增殖；
其中所述方法产生输出组合物，所述输出组合物包含限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞，和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
107.一种用于产生包含基因工程化细胞的细胞组合物的方法，所述方法包括向输入组合物中引入编码重组受体的多核苷酸，其中所述输入组合物包含从来自受试者的生物样品提供的目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞，并且在所述引入之前、期间和/或之后通过在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞来刺激所述输入组合物，所述刺激导致所述细胞的激活和/或增殖；并且其中所述方法产生输出组合物，所述输出组合物包含限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞，和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
108.一种用于产生包含基因工程化细胞的细胞组合物的方法，所述方法包括：
i)从获自受试者的生物样品中分离目标数量的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标数量的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞，从而产生输入组合物；
ii)向所述输入组合物中引入编码重组受体的多核苷酸；以及
iii)在所述引入之前、期间和/或之后刺激所述输入组合物中的所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，所述刺激导致所述细胞的激活和/或增殖；
其中所述方法产生输出组合物，所述输出组合物包含限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞，和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
109.一种用于产生包含基因工程化细胞的细胞组合物的方法，所述方法包括向输入组合物中引入编码重组受体的多核苷酸，其中所述输入组合物通过从获自受试者的生物样品中分离目标数量的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标数量的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞而产生，并且在所述引入之前、期间和/或之后通过在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞来刺激所述输入组合物，所述刺激导致所述细胞的激活和/或增殖；并且其中所述方法产生输出组合物，所述输出组合物包含限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的重组受体表达(受体+)CD8+T细胞与表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞，和/或限定比率的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的受体+/CD4+T细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
110.根据权利要求106-109中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或目标百分比的表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞。
111.根据权利要求106-110中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含目标百分比的CD4+/CCR7+、CD4+/CD27+、CD4+/CCR7+/CD27+、CD4+/CCR7+/CD45RA-、CD4+/CCR7+/CD45RA+、CD8+/CCR7+、CD8+/CD27+、CD8+/CCR7+/CD27+、CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或CD8+/CCR7+/CD45RA+细胞。
112.根据权利要求106-111中任一项所述的方法，其中所述输出组合物包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+、受体+/CD8+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA+细胞与受体+/CD4+/CCR7+、受体+/CD4+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA+细胞；或
限定比率的受体+/CD8+/CCR7+、受体+/CD8+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+、受体+/CD4+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+、受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA-和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
113.根据权利要求106-112中任一项所述的方法，其进一步包括确定用于给予至患有疾病或病症的受试者的T细胞组合物的一个或多个单位剂量，其中所述单位剂量包含所述输出组合物的全部或一部分，所述输出组合物包含：
限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；
限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集；或
限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。
114.根据权利要求113所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+细胞、CD4+/CCR7+细胞、CD8+/CD27+细胞、CD4+/CD27+细胞、CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
115.根据权利要求113或权利要求114所述的方法，其中所述单位剂量包含在1x105或约1x105与1x108或约1x108之间、在5x105或约5x105与1x107或约1x107之间、或在1x106或约1x106与1x107或约1x107之间的，每个都包含端值，总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、总受体+/CD4+/CD27+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
116.根据权利要求113-115中任一项所述的方法，其中：
所述单位剂量包含至少约3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞；和/或至少约3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+；和/或至少约3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或至少约3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞；和/或
所述单位剂量包含在3x106或约3x106与2.5x107或约2.5x107之间、在4x106或约4x106与2x107或约2x107之间、或在5x106或约5x106与1x107或约1x107之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞或总受体+/CD8+/CD27+细胞；和/或在3x106或约3x106与2.5x107或约2.5x107之间、在4x106或约4x106与2x107或约2x107之间、或在5x106或约5x106与1x107或约1x107之间的总受体+/CD4+/CCR7+细胞或总受体+/CD4+/CD27+，和/或在3x106或约3x106与2.5x107或约2.5x107之间、在4x106或约4x106与2x107或约2x107之间、或在5x106或约5x106与1x107或约1x107之间的总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或在3x106或约3x106与2.5x107或约2.5x107之间、在4x106或约4x106与2x107或约2x107之间、或在5x106或约5x106与1x107或约1x107之间的总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。
117.根据权利要求113-116中任一项所述的方法，其中：
所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每个都包含端值，是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+；
所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每个都包含端值，是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+；和/或
所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每个都包含端值，是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+。
118.根据权利要求113-117中任一项所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间；和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间；和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
119.根据权利要求113-118中任一项所述的方法，其中所述单位剂量进一步包含限定数量的包含表达或不表达CD45的细胞的细胞，任选地其中所述单位剂量还包含限定数量的包含CD45RA-细胞的细胞。
120.根据权利要求110所述的方法，其中细胞的所述单位剂量包含限定数量的受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞。
121.根据权利要求113-120中任一项所述的方法，其中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的约15％至90％、约20％至80％、约30％至70％、或约40％至60％，每个都包含端值，是受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–或受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–。
122.根据权利要求106-121中任一项所述的方法，其中在所述提供或分离之前，所述方法包括确定表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD8+T细胞和/或表达或不表达CCR7、CD27和/或CD45RA的CD4+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。
123.根据权利要求106-122中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂能够激活T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞；能够诱导通过TCR复合物的信号；和/或能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的增殖。
124.根据权利要求106-123中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂包含与TCR复合物的成员结合的一级药剂，任选地与CD3特异性地结合的一级药剂。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂进一步包含与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1BB)、OX40或ICOS。
127.根据权利要求125或权利要求126所述的方法，其中所述一级和二级药剂包含抗体，任选地其中所述一种或多种刺激剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体一起孵育。
128.根据权利要求106-127中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂存在于固体支持物的表面上，所述固体支持物任选地为珠。
129.根据权利要求106-128中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂选自CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7，包含由所述抗原受体特异性地识别的抗原的疫苗，以及特异性地结合所述抗原受体的抗独特型抗体或其组合。
130.根据权利要求82-129中任一项所述的方法，其中所述治疗性组合物是根据权利要求1或权利要求7所述的组合物。
131.根据权利要求82-130中任一项所述的方法，其进一步包括向患有疾病或病症的受试者给予所述治疗性组合物，任选地其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
132.根据权利要求82-131中任一项所述的方法，其中在根据所述方法治疗的一组受试者之间，所述单位剂量中表达CCR7的细胞(CCR7+细胞)的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。
133.根据权利要求82-132中任一项所述的方法，其中所述单位剂量包含在1x105或约1x105与5x108或约5x108之间、在1x105或约1x105与1x108或约1x108之间、在5x105或约5x105与1x107或约1x107之间、或在1x106或约1x106与1x107或约1x107之间的表达所述重组受体的总CD3+细胞(受体+/CD3+细胞)或总CD3+细胞，每个都包含端值；和/或所述单位剂量包含不超过约5x108、不超过约1x108、不超过约5x107、不超过约1x107、不超过约5x106、不超过约1x106、或不超过约5x105个总受体+/CD3+细胞或总CD3+细胞。
134.根据权利要求82-133中任一项所述的方法，其中CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是活的或有活力的此类细胞的总数量。
135.根据权利要求82-134中任一项所述的方法，其中CD3+细胞的总数量、受体+/CD3+细胞的总数量、受体+/CD8+细胞的总数量、受体+/CD4+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数量、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数量、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数量是不表达凋亡标记的此类细胞的总数量和/或是凋亡标记阴性(–)的此类细胞的总数量，其中所述凋亡标记为膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。
136.根据权利要求131-135中任一项所述的方法，所述方法包括给予包含在多种单独组合物中的多个单位剂量。
137.根据权利要求136所述的方法，其中所述多种单独组合物包括含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的一种的第一组合物以及含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的另一种的第二组合物。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述第一组合物包含所述CD8+T细胞。
139.根据权利要求137所述的方法，其中所述第一组合物包含所述CD4+T细胞。
140.根据权利要求131-139中任一项所述的方法，所述方法包括间隔不超过48小时给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积以及所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
141.根据权利要求140所述的方法，其中间隔不超过36小时、间隔不超过24小时、间隔不超过12小时、间隔不超过6小时、间隔不超过4小时、间隔不超过2小时、间隔不超过1小时或间隔不超过30分钟给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积以及所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
142.根据权利要求140或权利要求141所述的方法，其中间隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟，或同时地给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积以及所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
143.根据权利要求136-142中任一项所述的方法，所述方法包括在给予所述含有CD4+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
144.根据权利要求136-142中任一项所述的方法，所述方法包括在给予所述含有CD8+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
145.根据权利要求49-144中任一项所述的方法，其中所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
146.根据权利要求145所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
147.根据权利要求145或权利要求146所述的方法，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
148.根据权利要求49-147中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
149.根据权利要求48-148中任一项所述的方法，其中所述重组受体包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域和含有细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区域，并且进一步包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
150.根据权利要求149所述的方法，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。
151.根据权利要求150所述的方法，其中所述片段包含scFv。
152.根据权利要求149-151中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链、任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
153.根据权利要求149-152中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导区域进一步包含共刺激信号传导结构域。
154.根据权利要求153所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
155.根据权利要求153或权利要求154所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
156.根据权利要求153-155中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
157.根据权利要求49-156中任一项所述的方法，其中所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。
158.根据权利要求49-157中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。
159.根据权利要求49-157中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是同种异体的。
160.根据权利要求157-179中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症，任选地其中所述癌症是白血病或淋巴瘤。
161.根据权利要求160所述的方法，其中所述受试者是在获得所述细胞时被鉴定为或已知具有高肿瘤负荷的受试者。
162.根据权利要求161所述的方法，其中：
如果所述受试者中肿瘤的尺寸积和(SPD)高于或高于约30cm2、40cm2、50cm2、60cm2或70cm2，则所述受试者具有高肿瘤负荷；和/或
如果来自所述受试者的生物样品、任选地血清样品中的C反应蛋白(CRP)高于或高于约5毫克/升、10毫克/升、15毫克/升、20毫克/升、25毫克/升、30毫克/升、40毫克/升或50毫克/升，则所述受试者具有高肿瘤负荷。
163.根据权利要求162所述的方法，其中如果所述受试者中肿瘤的SPD高于或高于约50cm2，则所述受试者具有高肿瘤负荷。
164.根据权利要求162或权利要求163所述的方法，其中如果所述生物样品中的CRP高于或高于约20毫克/升，则所述受试者具有高肿瘤负荷。
165.一种输出组合物，所述输出组合物通过根据权利要求106-164中任一项所述的方法产生。
166.一种单位剂量，所述单位剂量通过根据权利要求82-164中任一项所述的方法确定或产生。
167.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求166所述的单位剂量。
168.根据权利要求167所述的药物组合物，其进一步包含药物载体。
169.一种治疗方法，所述方法包括向哺乳动物受试者给予根据权利要求165所述的输出组合物、根据权利要求166所述的单位剂量或根据权利要求167或权利要求168所述的药物组合物的全部或一部分。
170.根据权利要求165所述的输出组合物、根据权利要求166所述的单位剂量或根据权利要求167或权利要求168所述的药物组合物的全部或一部分用于治疗癌症的用途。
171.根据权利要求165所述的输出组合物、根据权利要求166所述的单位剂量或根据权利要求167或权利要求168所述的药物组合物的全部或一部分在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
172.根据权利要求165所述的输出组合物、根据权利要求166所述的单位剂量或根据权利要求167或权利要求168所述的药物组合物，用于在治疗癌症中使用。
173.一种治疗性细胞组合物，所述治疗性细胞组合物包含表达结合至抗原的重组受体的T细胞，其中在用刺激剂刺激后：
所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％能够产生选自白介素2(IL-2)和/或TNF-α的细胞因子；和/或
所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的。
174.根据权利要求173所述的治疗性细胞组合物，其中所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％能够产生选自白介素2(IL-2)和/或TNF-α的细胞因子。
175.根据权利要求173-174中任一项所述的治疗性细胞组合物，其中所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的。
176.根据权利要求173-175中任一项所述的治疗性细胞组合物，其中所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因产生所述细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α而是多功能的。
177.根据权利要求173-176中任一项所述的治疗性细胞组合物，其中所述刺激剂是非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂。
178.根据权利要求177所述的治疗性细胞组合物，其中所述非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂是多克隆刺激剂。
179.根据权利要求173-178中任一项所述的治疗性细胞组合物，其中所述非特异性或非抗原依赖性刺激剂包括PMA/离子霉素、抗CD3/抗CD28、植物凝集素(PHA)或伴刀豆球蛋白A(ConA)。
180.根据权利要求177-179中任一项所述的治疗性细胞组合物，其中所述非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂包括PMA/离子霉素。
181.根据权利要求173-176中任一项所述的治疗性细胞组合物，其中所述刺激剂特异性地结合所述重组受体，任选地其中所述刺激剂是抗原特异性刺激试剂和/或包含由所述重组受体特异性识别的抗原或其部分。
182.根据权利要求173-181中任一项所述的治疗性细胞组合物，其中在细胞内细胞因子测定中测量细胞因子的产生。
183.根据权利要求173-182中任一项所述的治疗性细胞组合物，其中所述组合物包含所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性，任选地进一步对CD45RA的表面表达呈阴性。
184.根据权利要求173-183中任一项所述的治疗性细胞组合物，其中所述T细胞是从受试者获得的原代细胞。
185.根据权利要求184所述的治疗性细胞组合物，其中所述受试者患有癌症，任选地其中所述癌症是白血病或淋巴瘤。
186.根据权利要求185所述的治疗性细胞组合物，其中所述受试者是在获得所述细胞时被鉴定为或已知具有高肿瘤负荷的受试者。
187.根据权利要求186所述的治疗性细胞组合物，其中：
如果所述受试者中肿瘤的尺寸积和(SPD)高于或高于约30cm2、40cm2、50cm2、60cm2或70cm2，则所述受试者具有高肿瘤负荷；和/或
如果来自所述受试者的生物样品、任选地血清样品中的C反应蛋白(CRP)高于或高于约5毫克/升、10毫克/升、15毫克/升、20毫克/升、25毫克/升、30毫克/升、40毫克/升或50毫克/升，则所述受试者具有高肿瘤负荷。
188.根据权利要求187所述的治疗性细胞组合物，其中如果所述受试者中肿瘤的SPD高于或高于约50cm2，则所述受试者具有高肿瘤负荷。
189.根据权利要求187或权利要求188所述的治疗性细胞组合物，其中如果所述生物样品中的CRP高于或高于约20毫克/升，则所述受试者具有高肿瘤负荷。
190.根据权利要求173-189中任一项所述的治疗性细胞组合物，其中所述治疗性细胞组合物富含CD4+T细胞和/或所述工程化组合物中所述总重组受体+细胞的至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约97％，或所述组合物中所述总细胞的约60％至99％、约75％至99％、约85％至99％、或约90％至99％，每个都包含端值，为CD4+。
191.根据权利要求173-189中任一项所述的治疗性细胞组合物，其中所述治疗性细胞组合物富含CD3+T细胞、富含CD4+和CD8+T细胞和/或所述工程化组合物中所述总重组受体+细胞的至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约97％，或所述组合物中所述总细胞的约60％至99％、约75％至99％、约85％至99％、或约90％至99％，每个都包含端值，为CD3+或CD4+和CD8+。
192.根据权利要求191所述的治疗性细胞组合物，其中所述治疗性细胞组合物以如下的CD4+与CD8+T细胞的比率含有CD4+和CD8+T细胞：在大约1:3与大约3:1之间，任选地在大约1:2与2:1之间。
193.根据权利要求173-192中任一项所述的治疗性组合物，其中所述重组受体是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。
194.根据权利要求173-193中任一项所述的治疗性组合物，其中所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
195.根据权利要求194所述的治疗性组合物，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
196.根据权利要求194或权利要求195所述的治疗性组合物，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
197.根据权利要求194-196中任一项所述的治疗性组合物，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFRvIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
198.根据权利要求173-197中任一项所述的治疗性组合物，其中所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
199.根据权利要求173-198中任一项所述的治疗性组合物，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
200.根据权利要求173-199中任一项所述的治疗性组合物，其中所述重组受体包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域和含有细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区域。
201.根据权利要求200所述的治疗性组合物，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。
202.根据权利要求201所述的治疗性组合物，其中所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
203.根据权利要求201或权利要求202所述的治疗性组合物，其中所述片段包含scFv。
204.根据权利要求200-203中任一项所述的治疗性组合物，其中所述细胞内信号传导结构域是或包括初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域、和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
205.根据权利要求200-204中任一项所述的治疗性组合物，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链、任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
206.根据权利要求200-205中任一项所述的治疗性组合物，其中所述重组受体进一步包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
207.根据权利要求200-206中任一项所述的治疗性组合物，其中所述细胞内信号传导区域进一步包含共刺激信号传导结构域。
208.根据权利要求207所述的治疗性组合物，其中所述共刺激信号传导结构域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
209.根据权利要求207或权利要求208所述的治疗性组合物，其中所述共刺激信号传导结构域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
210.根据权利要求207-209中任一项所述的治疗性组合物，其中所述共刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
211.根据权利要求173-210中任一项所述的治疗性组合物，其中所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。
212.根据权利要求173-211中任一项所述的治疗性组合物，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。
213.一种制品，所述制品包含含有根据权利要求173-212中任一项所述的治疗性细胞组合物的容器，和用于向患有疾病或病症的受试者给予所述治疗性细胞组合物，任选地其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积的说明书。
214.根据权利要求213所述的制品，其中所述说明书指定给予包含在多种单独组合物中的多个单位剂量。
215.根据权利要求214所述的制品，其中所述多种单独组合物包括：包含含有CD8+T细胞和CD4+T细胞中的一种的所述治疗性细胞组合物的第一组合物和含有所述CD8+T细胞和所述CD4+T细胞中的另一种的第二组合物，所述第二组合物包含表达所述重组受体或对所述抗原或对由所述疾病或病症表达的细胞具有特异性的重组受体的细胞，任选地其中所述第二组合物是根据权利要求1-40中任一项所述的组合物。
216.根据权利要求215所述的制品，其中所述说明书指定在不超过48小时间隔内、在不超过36小时间隔内、在不超过24小时间隔内、在不超过12小时间隔内、在不超过6小时间隔内、在不超过2小时间隔内、在不超过1小时间隔内，或同时地给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积以及所述含有CD4+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
217.根据权利要求215或权利要求216所述的制品，其中所述说明书指定在给予所述含有CD4+细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积之前给予所述含有CD8+T细胞的组合物或其一个或多个单位剂量和/或对应于这一个或多个单位剂量的体积。
218.一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者给予根据权利要求173-212中任一项所述的治疗性细胞组合物的一个或多个单位剂量。
219.根据权利要求218所述的方法，其中所述治疗性组合物是包含CD8+T细胞和CD4+T细胞中的一种的第一治疗性细胞组合物，并且所述一个或多个单位剂量进一步包含含有所述CD8+T细胞和CD4+T细胞中的另一种的第二治疗性细胞组合物，所述第二组合物包含表达所述重组受体或对所述抗原或对由所述疾病或病症表达的细胞具有特异性的重组受体的细胞，任选地其中所述第二组合物是根据权利要求173-212中任一项所述的组合物。
220.根据权利要求47所述的方法，其中所述第二治疗性细胞组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约、或为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性，任选地进一步对CD45RA的表面表达呈阴性。
221.根据权利要求219或权利要求220所述的方法，其中所述第二治疗性细胞组合物富含CD8+T细胞和/或所述工程化组合物中所述总重组受体+细胞的至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约97％，或所述组合物中所述总细胞的约60％至99％、约75％至99％、约85％至99％、或约90％至99％，每个都包含端值，为CD8+。
222.根据权利要求221所述的方法，其中所述第一治疗性组合物和第二治疗性组合物在彼此的48小时或约48小时内、36小时或约36小时内、24小时或约24小时内、12小时或约12小时内、6小时或约6小时内、2小时或约2小时内或1小时或约1小时内给予。
223.根据权利要求221或权利要求222所述的方法，其中包含所述CD8+T细胞的所述第二治疗性细胞组合物在包含CD4+T细胞的所述第一组合物之前给予。
224.根据权利要求218-223中任一项所述的方法，其中细胞的所述一个或多个单位剂量包含限定比率的CD4+与CD8+T细胞，所述比率为或为大约1:3和大约3:1，任选地为或为大约1:2和大约2:1，任选地为或为约1:1。
225.一种用于治疗受试者的方法，所述方法包括：
(A)测定包含表达重组受体的T细胞的工程化细胞组合物中的指示所述组合物中工程化细胞的功能或表型的因子，所述因子选自(i)对CCR7和/或CD27呈表面阳性，并且任选地对CD45RA呈表面阴性的表达所述重组受体的T细胞的百分比；和/或(ii)在用刺激剂刺激后能够产生IL-2、TNF-α和/或IFN-γ的表达所述重组受体的CD4+T细胞的百分比；以及
(B)向患有疾病或病症的受试者给予疗法，所述给予选自：
(1)如果指示所述工程化T细胞组合物的细胞的功能或表型的因子等于或高于阈值，则向所述受试者给予包含表达重组受体的T细胞的工程化细胞组合物的细胞的一个或多个单位剂量；或
(2)如果指示所述工程化T细胞组合物的细胞的所述功能或表型的所述因子低于所述因子的阈值，则给予选自以下的疗法：(a)所述工程化细胞组合物的细胞的一个或多个单位剂量和能够增加所述工程化细胞组合物的T细胞在所述受试者中的扩增、增殖或功效的药剂，(b)增加剂量的所述工程化细胞组合物的细胞，任选地与给予至患有相同疾病或病症但展现所述阈值或更大的所述因子的类似处境受试者的所述一个或多个单位剂量相比为增加的；或(c)除了一个或多个单位剂量的所述工程化细胞组合物以外的用于治疗所述疾病或病症的替代性治疗性治疗，其中所述因子的所述阈值选自
(i)所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性；和/或
(ii)所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％在用刺激剂刺激后能够产生白介素2(IL-2)或TNF-α；和/或
(iii)所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因在用刺激剂刺激后产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的。
226.一种用于治疗受试者的方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者给予疗法，所述给予选自：
(1)如果指示包含表达重组受体的T细胞的工程化细胞组合物的细胞的功能或表型的因子等于或高于阈值，则向所述受试者给予所述工程化T细胞组合物的细胞的一个或多个单位剂量；或
(2)如果指示所述工程化T细胞组合物的细胞的所述功能或表型的所述因子低于所述因子的阈值，则给予选自以下的疗法：(a)所述工程化细胞组合物的细胞的一个或多个单位剂量和能够增加所述工程化细胞组合物的T细胞在所述受试者中的扩增、增殖或功效的药剂，(b)增加剂量的所述工程化细胞组合物的细胞，任选地与给予至患有相同疾病或病症但展现所述阈值或更大的所述因子的类似处境受试者的所述一个或多个单位剂量相比为增加的；或(c)除了一定剂量的所述工程化细胞组合物以外的用于治疗所述疾病或病症的替代性治疗性治疗，
其中所述因子的所述阈值选自
(i)所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性；和/或
(ii)所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％在用刺激剂刺激后能够产生白介素2(IL-2)或TNF-α；和/或
(iii)所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因在用刺激剂刺激后产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的。
227.根据权利要求218-226中任一项所述的方法，其中所述细胞组合物的细胞对于所述受试者是自体的。
228.根据权利要求218-227中任一项所述的方法，其中在给予所述一个或多个单位剂量后，至少35％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％、或至少75％的根据所述方法治疗的所述受试者实现持续至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少9个月或至少12个月的无进展存活期。
229.根据权利要求218-228中任一项所述的方法，其中在给予所述一个或多个单位剂量后，至少35％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％、或至少75％的根据所述方法治疗的所述受试者未出现疾病进展且持续至少或至少约3个月、至少或至少约4个月、至少或至少约5个月、至少或至少约6个月、至少或至少约9个月或至少或至少约12个月。
230.根据权利要求218-229中任一项所述的方法，其中根据所述方法治疗的受试者实现生物样品，任选地血液或血清样品中的细胞组合物的细胞的药代动力学特性的改善，所述药代动力学特性是与一组具有相同疾病或病症且被给予相似剂量的包含表达所述重组受体的T细胞但其中所述指示细胞功能或表型的因子低于所述阈值的自体细胞组合物的类似处境受试者相比，平均而言有所改善。
231.根据权利要求230所述的方法，其中所述药代动力学特性是所述生物样品中细胞的随时间总暴露(AUC)或峰值数量。
232.一种预测对治疗性T细胞组合物的反应可能性的方法，所述方法包括：
(a)测定包含表达重组受体的T细胞的工程化细胞组合物中的指示所述组合物中工程化细胞的功能或表型的因子，所述因子选自(i)对CCR7和/或CD27呈表面阳性，并且任选地对CD45RA呈表面阴性的表达所述重组受体的T细胞的百分比；和/或(ii)在用刺激剂刺激后能够产生IL-2、TNF-α和/或IFN-γ的表达所述重组受体的CD4+T细胞的百分比；以及
(b)在给予含有一定剂量的所述工程化细胞的细胞疗法后确定反应可能性，其中如果所述因子等于或高于阈值，则将所述受试者鉴定为在给予所述疗法后可能实现持久反应或无进展存活期，任选地持续至少3个月；或者如果所述因子低于阈值，则将所述受试者鉴定为不可能对所述疗法展现持久反应或无进展存活期，
其中所述因子的所述阈值选自：
(i)所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性；和/或
(ii)所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％在用刺激剂刺激后能够产生白介素2(IL-2)或TNF-α；和/或
(iii)所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因在用刺激剂刺激后产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的。
233.根据权利要求232所述的方法，其中所述细胞组合物的细胞对于所述受试者是自体的。
234.根据权利要求232或权利要求233所述的方法，其中如果将所述受试者鉴定为可能对所述疗法实现持久反应或无进展存活期，则向所述受试者给予所述工程化T细胞组合物的细胞的一个或多个单位剂量。
235.根据权利要求218-231、233和234中任一项所述的方法，其中所述一个或多个单位剂量包含在1x105或约1x105与5x108或约5x108之间、在1x105或约1x105与1x108或约1x108之间、在5x105或约5x105与1x107或约1x107之间、或在1x106或约1x106与1x107或约1x107之间的表达所述重组受体的总T细胞(受体+/T细胞)或总T细胞，每个都包含端值。
236.根据权利要求218-231和233-235中任一项所述的方法，其中所述一个或多个单位剂量包含不超过约5x108、不超过约1x108、不超过约5x107、不超过约1x107、不超过约5x106、不超过约1x106、或不超过约5x105个总受体+/T细胞或总T细胞。
237.根据权利要求225-236中任一项所述的方法，其中所述因子的所述阈值为：所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性；和/或
238.根据权利要求225-237中任一项所述的方法，其中所述因子的所述阈值为：所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％能够产生选自白介素2(IL-2)和/或TNF-α的细胞因子。
239.根据权利要求225-238中任一项所述的方法，其中所述因子的所述阈值为：所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的。
240.根据权利要求225-239中任一项所述的方法，其中所述因子的所述阈值为：所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的为或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因产生所述细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α而是多功能的。
241.根据权利要求232-240中任一项所述的方法，其中如果将所述受试者鉴定为不可能实现持久反应或无进展存活期，则向所述受试者给予选自以下的疗法：(a)一定剂量的所述工程化细胞组合物的细胞和能够增加所述工程化细胞组合物的T细胞在所述受试者中的扩增、增殖或功效的药剂，(b)增加剂量的所述工程化细胞组合物的细胞，任选地与给予至患有相同疾病或病症但展现实现对所述细胞疗法的无进展存活期或持久反应的可能性的类似处境受试者的剂量相比为增加的；或(c)除了一定剂量的所述工程化细胞组合物以外的用于治疗所述疾病或病症的替代性治疗性治疗。
242.根据权利要求225-231和241中任一项所述的方法，其中所述方法包括给予包含一定剂量的所述工程化细胞组合物的细胞和能够增加所述工程化细胞组合物的T细胞在所述受试者中的扩增、增殖或功效的药剂的疗法，其中所述药剂是对所述CAR具有特异性的抗独特型抗体或其抗原结合片段、免疫检查点抑制剂、代谢途径调节剂、腺苷受体拮抗剂、激酶抑制剂、抗TGFβ抗体或抗TGFβR抗体或细胞因子。
243.根据权利要求242所述的方法，其中在给予所述治疗性T细胞组合物之前、同时或之后给予所述药剂。
244.根据权利要求218-242中任一项所述的方法，其中所述受试者是在所述测定时和/或在所述给予之前被鉴定为或已知具有高肿瘤负荷的受试者。
245.根据权利要求244所述的方法，其中：
如果所述受试者中肿瘤的尺寸积和(SPD)高于或高于约30cm2、40cm2、50cm2、60cm2或70cm2，则所述受试者具有高肿瘤负荷；和/或
如果来自所述受试者的生物样品、任选地血清样品中的C反应蛋白(CRP)高于或高于约5毫克/升、10毫克/升、15毫克/升、20毫克/升、25毫克/升、30毫克/升、40毫克/升或50毫克/升，则所述受试者具有高肿瘤负荷。
246.根据权利要求245所述的方法，其中如果所述受试者中肿瘤的SPD高于或高于约50cm2，则所述受试者具有高肿瘤负荷。
247.根据权利要求245或权利要求246所述的方法，其中如果所述生物样品中的CRP高于或高于约20毫克/升，则所述受试者具有高肿瘤负荷。
248.根据权利要求225-247中任一项所述的方法，其中所述刺激剂是非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂。
249.根据权利要求248所述的方法，其中所述非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂是多克隆刺激剂。
250.根据权利要求248或权利要求249中任一项所述的方法，其中所述非特异性或非抗原依赖性刺激剂包括PMA/离子霉素、抗CD3/抗CD28、植物凝集素(PHA)或伴刀豆球蛋白A(ConA)。
251.根据权利要求248-250中任一项所述的方法，其中所述非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂包括PMA/离子霉素。
252.根据权利要求225-247中任一项所述的方法，其中所述刺激剂特异性地结合所述重组受体，任选地其中所述刺激剂是抗原特异性刺激试剂和/或包含由所述重组受体特异性识别的抗原或其部分。
253.根据权利要求225-252中任一项所述的方法，其中在细胞内细胞因子测定中测量细胞因子的产生。
254.根据权利要求218-253中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。
255.根据权利要求218-254中任一项所述的方法，其中所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
256.根据权利要求255所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
257.根据权利要求255或权利要求256所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
258.根据权利要求255-257中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
259.根据权利要求218-258中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
260.根据权利要求218-259中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
261.根据权利要求218-260中任一项所述的方法，其中所述重组受体包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域和含有细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区域。
262.根据权利要求261所述的方法，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。
263.根据权利要求262所述的方法，其中所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
264.根据权利要求262或权利要求263所述的方法，其中所述片段包含scFv。
265.根据权利要求261-264中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包括初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域、和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
266.根据权利要求265所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链、任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
267.根据权利要求261-266中任一项所述的方法，其中所述重组受体进一步包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
268.根据权利要求261-267中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导区域进一步包含共刺激信号传导结构域。
269.根据权利要求268所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
270.根据权利要求268或权利要求269所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
271.根据权利要求269或权利要求270所述的方法，其中所述共刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
272.根据权利要求218-271中任一项所述的方法，其中所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。
273.根据权利要求218-272中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。
274.一种产生治疗性T细胞组合物的方法，所述方法包括：
(a)在刺激条件下孵育输入组合物，从而产生经刺激组合物，其中所述输入组合物含有限定数量的不表达凋亡标记(凋亡标记阴性(–))的T细胞；以及
(b)将重组受体引入到来自所述经刺激组合物的细胞中，从而产生工程化细胞组合物，其中所述引入包括使所述经刺激组合物的所述细胞与包含编码所述重组受体的多核苷酸的药剂接触。
275.根据权利要求274所述的方法，其中所述凋亡标记阴性T细胞是或包含凋亡标记阴性CD3+细胞、凋亡标记阴性CD8+细胞、凋亡标记阴性CD4+细胞、或凋亡标记阴性CD8+细胞和凋亡标记阴性CD4+细胞。
276.根据权利要求274或权利要求275所述的方法，其中所述凋亡标记是膜联蛋白V。
277.根据权利要求274或权利要求275所述的方法，其中所述凋亡标记是激活的半胱天冬酶3。
278.根据权利要求274-276中任一项所述的方法，其中所述限定数量的T细胞包含至少50x106个所述凋亡标记阴性T细胞，任选地凋亡标记阴性CD4+和/或凋亡标记阴性CD8+T细胞。
279.根据权利要求274-278中任一项所述的方法，其中所述限定数量的T细胞包含至少100x106个所述凋亡标记阴性T细胞，任选地凋亡标记阴性CD4+和/或凋亡标记阴性CD8+T细胞。
280.根据权利要求274-279中任一项所述的方法，其中所述限定数量的T细胞包含在100x106或约100x106与500x106或约500x106之间的凋亡标记阴性T细胞，任选地凋亡标记阴性CD4+和/或凋亡标记阴性CD8+T细胞。
281.根据权利要求274-280中任一项所述的方法，其中所述限定数量的T细胞包含为或约300x106个凋亡标记阴性T细胞，任选地凋亡标记阴性CD4+和/或凋亡标记阴性CD8+T细胞。
282.根据权利要求274-281中任一项所述的方法，其中以占所述输入组合物中的所述总T细胞的百分比计，凋亡标记阴性T细胞的百分比大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约90％、或大于或大于约95％。
283.根据权利要求274-282中任一项所述的方法，其中，在所述孵育之前，获得包含所述限定数量的凋亡标记阴性T细胞的输入组合物。
284.根据权利要求274-283中任一项所述的方法，其中，在所述孵育之前，从生物样品中分离、选择或富集凋亡标记阴性T细胞，任选地凋亡标记阴性CD4+和/或凋亡标记阴性CD8+T细胞。
285.一种产生治疗性T细胞组合物的方法，所述方法包括：
(a)从生物样品中分离、选择或富集不表达凋亡标记(凋亡标记阴性(–))的T细胞群，任选地凋亡标记阴性CD4+和/或凋亡标记阴性CD8+T细胞，从而获得输入组合物；
(b)在刺激条件下孵育所述输入组合物，从而产生经刺激组合物；以及
(c)将重组受体引入到来自所述经刺激组合物的细胞中，从而产生工程化细胞组合物，其中所述引入包括使所述经刺激组合物的所述细胞与包含编码所述重组受体的多核苷酸的药剂接触。
286.根据权利要求284或权利要求285所述的方法，其中所述生物样品包括从受试者获得的原代T细胞。
287.根据权利要求286所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
288.根据权利要求284-287中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
289.根据权利要求284-288中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含单采术产物或白细胞单采术产物。
290.根据权利要求284-289中任一项所述的方法，其中：在从受试者获得所述生物样品之后不超过36小时从所述生物样品中分离、选择或富集所述T细胞。
291.根据权利要求284-289中任一项所述的方法，其中在从所述受试者获得所述生物样品之后不超过36小时将所述生物样品在冷冻保护剂的存在下低温冷冻并且在分离、选择或富集所述细胞之前解冻，任选地其中在即将分离、选择或富集所述细胞之前或在此之前不超过6小时、不超过4小时、不超过2小时或不超过1小时内将所述经低温冷冻的样品解冻。
292.根据权利要求274-291中任一项所述的方法，其中所述孵育是在一种或多种细胞因子的存在下，任选地在无血清培养基中进行。
293.根据权利要求292所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7、和/或重组IL-15。
294.根据权利要求293所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子包含：在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-2；在100IU/mL与1,000IU/mL之间的重组IL-7；和/或在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-15。
295.根据权利要求274-294中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性地结合、任选地与CD3特异性地结合的一级药剂，任选地其中所述一级药剂是抗体或其抗原结合片段。
296.根据权利要求295所述的方法，其中所述刺激试剂进一步包含与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS，任选地其中所述二级药剂是抗体或其抗原结合片段。
297.根据权利要求274-296中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。
298.根据权利要求295-297中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和/或二级药剂存在于固体支持物的表面上。
299.根据权利要求298所述的方法，其中所述固体支持物是或包含珠。
300.根据权利要求295-299中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和二级药剂固定或可逆地结合在包含多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的低聚物颗粒试剂的表面上。
301.根据权利要求274-300中任一项所述的方法，其中将所述输入组合物在刺激条件下孵育12小时至36小时，包含端值，任选地为或约24小时。
302.根据权利要求274-301中任一项所述的方法，其中所述接触是通过病毒转导，任选地用逆转录病毒载体、任选地慢病毒载体来进行。
303.根据权利要求274-302中任一项所述的方法，其进一步包括在促进所述工程化细胞的增殖和/或扩增的条件下培育所述工程化组合物，从而产生包含所述工程化T细胞的输出组合物。
304.根据权利要求303所述的方法，其中所述培育是在一种或多种细胞因子的存在下，任选地在无血清培养基中进行。
305.根据权利要求304所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7、和/或重组IL-15。
306.根据权利要求304或305所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子包含：在50IU/mL与400IU/mL之间的重组IL-2；在100IU/mL与2,000IU/mL之间的重组IL-7；和/或在50IU/mL与400IU/mL之间的重组IL-15。
307.根据权利要求274-306中任一项所述的方法，其中：
所述输入组合物以2:1与1:2之间的CD4+与CD8+T细胞比率包含CD4+T细胞和CD8+T细胞；或
所述输入组合物以2:1与1:2之间的CD4+与CD8+T细胞比率包含凋亡标记阴性CD4+T细胞和凋亡标记阴性CD8+T细胞。
308.根据权利要求307所述的方法，其中将所述CD4+T细胞和CD8+T细胞从相同生物样品或来自所述生物样品的样品中单独地选择、分离或富集，并且在所述孵育之前合并。
309.根据权利要求274-308中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
310.根据权利要求303-309中任一项所述的方法，其中所述输出组合物包含：
所述组合物中T细胞的总数量、或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少或至少约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性；和/或
所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的至少或至少约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％在用刺激剂刺激后能够产生白介素2(IL-2)或TNF-α；和/或
所述组合物中表达所述重组受体的CD4+T细胞的总数量的至少或至少约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多因在用刺激剂刺激后产生选自干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和TNF-α的两种或更多种细胞因子而是多功能的。
311.根据权利要求310所述的方法，其中所述刺激剂是非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂。
312.根据权利要求311所述的方法，其中所述非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂是多克隆刺激剂。
313.根据权利要求311或权利要求312所述的方法，其中所述非特异性或非抗原依赖性刺激剂包括PMA/离子霉素、抗CD3/抗CD28、植物凝集素(PHA)或伴刀豆球蛋白A(ConA)。
314.根据权利要求311-313中任一项所述的方法，其中所述非特异性或非抗原依赖性T细胞刺激剂包括PMA/离子霉素。
315.根据权利要求310所述的方法，其中所述刺激剂特异性地结合所述重组受体，任选地其中所述刺激剂是抗原特异性刺激试剂和/或包含由所述重组受体特异性识别的抗原或其部分。
316.根据权利要求310-315中任一项所述的方法，其中在细胞内细胞因子测定中测量细胞因子的产生。
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