MXPA06008700A - Anticuerpos anti-cd38 humanos y usos para los mismos. - Google Patents

Anticuerpos anti-cd38 humanos y usos para los mismos.

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Abstract

La presente invencion proporciona regiones de union de antigeno recombinante y anticuerpos asi como fragmentos funcionales que contienen tales regiones que unen antigeno, que son especificos para CD38, los cuales juegan un papel integral en diversos trastornos o condiciones. En consecuencia, estos anticuerpos se pueden utilizar para tratar, por ejemplo, canceres hematologicos tales como mieloma multiple. Los anticuerpos de la invencion tambien se puede utilizar en el campo de diagnostico asi como para investigar el papel de CD38 en el progreso de trastornos relacionados con canceres. La invencion tambien proporciona secuencias de acido nucleico que codifican para los anticuerpos anteriores, vectores que contienen los mismos, composiciones farmaceuticas y equipos con instrucciones para uso. La invencion tambien proporciona epitopos novedosos aislados de CD38 y metodos para uso de los mismos.

Description

nematopoyético, los investigadores han observado que la regulación por aumento de CD38 en diversas líneas de células derivadas de B-, T- y tumores mieloides/monocíticos, incluyendo leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B o T (ALL) , leucemia mieloide aguda (AML) , linfoma no hodkiniano (NHL) y mieloma múltiple (MM) . En MM, por ejemplo, se atestigua una fuerte expresión de CD38 en la mayor parte de las muestras de todos los pacientes . No obstante, la sobreexpresión de CD38 en células malignas (cancerosas) proporciona un objetivo terapéutico atractivo para inmunoterapia . Es de atracción especial el hecho de que la mayor parte de las células pluripotenciales pluripotentes primitivas del sistema hematopoyético son CD38 negativas y que el grado de citotoxicidad generado por ADCC o CDC se relaciona bien con los niveles de expresión del objetivo respectivo. Los enfoques actuales de terapias anti-CD38 se pueden dividir en dos grupos: enfoques in vivo y ex vivo. En los enfoques in vivo, los anticuerpos anti-CD38 se administran a un sujeto en necesidad de terapia con el fin de provocar la supresión mediada por anticuerpo de células malignas que sobreexpresan CD38. La supresión se puede obtener por ADCC mediada por anticuerpo o por células efectoras CDC, o bien la utilización de anticuerpos anti-CD38 como porciones objetivo para el transporte de sustancias citotóxicas, por ejemplo saporina, las células objetivo e internalización subsecuente. En el enfoque ex vivo la población de células, por ejemplo células de médula ósea, que comprenden a células malignas que sobreexpresan CD38 se extraen de un individuo en necesidad de tratamiento y se ponen en contacto con anticuerpos anti-CD38. Las células objetivo son destruidas por sustancias citotóxicas, „por ejemplo saporina, como se describe para el enfoque in vivo o se extraen al poner en contacto a la población de células con anticuerpos anti-CD38 inmovilizados y de esta manera se retiran las células objetivo que sobreexpresan CD38 de la mezcla. Posteriormente, la población de células suprimidas se reinserta en el paciente. Los anticuerpos específicos para CD38 se pueden dividir en diferentes grupos, dependiendo de diversas propiedades. La unión de algunos anticuerpos a la molécula CD38 (predominantemente los aminoácidos 220-300) pueden activar actividades dentro de la célula objetivo, tal como liberación de Ca2+, liberación de citocina, eventos de fosforilación y estimulación de crecimiento en base en la especificidad de anticuerpo respectiva (Konopleva et al . , 1998; Ausiello et al., 2000), pero no puede observarse una relación clara entre el sitio de unión de .los diversos anticuerpos conocidos y sus propiedades) (no) agonísticas (Funaro et al., 1990). Se sabe relativamente poco acerca de la eficacia de los anticuerpos anti-CD38 publicados. Lo que se sabe es que todos los anticuerpos conocidos parecen reconocer exclusivamente epítopos (residuos aminoácidos 220 a 300) que se localizan en la parte C terminal de CD38. Hasta ahora no se conocen anticuerpos que sean específicos para epítopos de la parte N terminal de CD38 alejadas del sitio activo en la secuencia de proteína primaria. No obstante, hemos encontrado que OKT10, el cual se encuentra en pruebas clínicas, tiene una afinidad y eficacia relativamente bajas cuando se analizan como construcciones quiméricas que comprenden una parte FC humana. Además, OKT10 es un anticuerpo murino que lo vuelve poco adecuado para administración a humanos. Recientemente se ha descrito un fragmento de anticuerpo scFv anti-CD38 humano (WO 02/06347). No obstante, ese anticuerpo es específico para un epítopo CD38 que se expresa selectivamente. De manera correspondiente, en base en el gran potencial de la terapia con anticuerpo anti-CD38, existe una alta necesidad de anticuerpos anti-CD38 humanos con alta afinidad y con alta eficacia en mediar la destrucción de células malignas que sobreexpresen CD38 por ADCC o CDC. La presente invención satisface estas y otras necesidades al proporcionar anticuerpos anti-CD38 completamente humanos y altamente eficaces los cuales se describen a continuación.
LA INVENCION Un objetivo de la invención es proporcionar anticuerpos humanos y humanizados que puedan mediar eficazmente la destrucción de células que sobreexpresan CD38. Otro objetivo de la invención es proporcionar anticuerpos que sean seguros para administración a humanos. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar métodos para tratar enfermedades o condiciones relacionadas con la regulación por aumento de CD38 mediante la utilización de uno o más anticuerpos de la invención. Estos y otros objetivos de la invención se describen más completamente en la presente. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de anticuerpo funcional que contiene una región que une antígeno, la cual es específica para un epítopo de CD38, en donde el anticuerpo o fragmento funcional del mismo es capaz de mediar la destrucción de una célula objetivo CD38+ (LP-1 (DSMZ: ACC41) y RPMI-8226 (ATCC: CCL-155)) mediante citotoxícidad celular dependiente de anticuerpo ("ADCC") con por lo menos dos a cinco veces mejor eficacia en comparación con el anticuerpo OKT10 quimérico que tiene las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 23 y 24 (bajo las mismas o sustancialmente las mismas condiciones) , cuando se utiliza una célula PBMC humana como una célula efectora, y cuando la proporción de células efectoras respecto a células objetivo está entre aproximadamente 30:1 y aproximadamente 50:1. Tal anticuerpo o fragmento funcional del mismo puede contener una región que une antígeno, la cual contiene una región H-CDR3 que se muestra en la SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 5, 6, 7 u 8; la región que une antigeno puede incluir además una región H-CDR2 mostrada en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 5, 6, 7 u 8; y la región que une antígeno también puede contener una región H-CDR1 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 5, 6, 7 u 8. Tal anticuerpo específico para CD38 de la invención puede contener una región que se una a antígeno que contenga una región L-CDR3 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 13, 14, 15 o 16; la región que une antígeno puede incluir además una región L-CDR1 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 13, 14, 15 ó 16; y la región que une antígeno también puede contener una región L-CDR2 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 13, 14, 15 ó 16. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado o µ? fragmento de anticuerpo funcional que contiene una región que une antígeno que es específica para un epítopo de CD38, en donde el anticuerpo o fragmento funcional del mismo es capaz de mediar la destrucción de una célula CHO transfectada con CD38 por CDC con una eficacia por lo menos dos veces mejor en comparación con OKT10 " quimérico (SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 23 y 24) bajo las mismas o sustancialmente las mismas condiciones que en el párrafo previo . Un anticuerpo que satisfaga estos criterios puede contener una región que una antígeno la cual contenga una región H-CDR3, que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 5, 6 ó 7; la región de unión a antígeno puede incluir además una región H-CDR2 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 5, 6 ó 7 y la región de unión a antígeno también puede contener una región H-CDR1 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS : 5, 6 6 7. Tal anticuerpo específico para CD38 de la invención puede contener una región que une antígeno la cual contiene una región L-CDR3 que se muestra en la SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 13, 14 ó 15; la región que une antígeno puede incluir además una región L-CDR1 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 13, 14 ó 15; y la región que une antígeno también puede contener una región L-CDR2 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 13, 14 ó 15.
Los anticuerpos (y fragmentos funcionales de los mismos) de la invención pueden contener una región que una antigeno que sea específica para un epítopo de CD38, epítopo el cual contiene uno o más residuos aminoácidos de los residuos aminoácidos 43 a 215 de CD38, como se muestran por la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 22. De manera más específica, un epítopo al cual se une una región que se une a antígeno puede contener uno o más residuos aminoácidos que se encuentran en una o más cadenas de aminoácido que se toman de la lista de las cadenas de aminoácidos 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170 y 192-206. Para algunos anticuerpos, el epítopo puede ser lineal mientras que para otros puede ser conformacional (es decir, discontinuo) . Un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que tiene una o más de estas propiedades, puede contener una región de unión a antígeno que contiene una región H-CDR3 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 5, 6, 7 u 8; la región que une antígeno puede incluir además una región H-CDR2 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 5, 6, 7 u 8; y la región que une antígeno también puede contener una región H-CDR1 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 5, 6, 7 u 8. Tal anticuerpo específico para CD38 de la invención puede contener una región que une a antígeno, la cual contiene una región L-CDR3 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 13, 14, 15 ó 16; la región de unión a antígeno puede incluir además una región L-CDR1 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 13, 14, 15 ó 16; y la región que une antígeno también puede contener una región L-CDR2 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 13, 14, 15 ó 16. Las variantes peptídicas de las secuencias que se describen en la presente también están abarcadas por la presente invención. En consecuencia, la invención incluye anticuerpos anti-CD38 que tienen una secuencia de aminoácidos de cadena pesada con: por lo menos 60 por ciento de identidad de secuencia en las regiones CDR con las regiones CDR que se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 5, 6, 7 u 8; o por lo menos 80 por ciento de homología de secuencia en las regiones CDR con las regiones CDR que se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 5, 6, 7 u 8. Se incluyen además los anticuerpos anti-CD38 que tienen una secuencia de aminoácidos de cadena ligera con: por lo menos 60 por ciento de identidad de secuencia en las regiones CDR con las regiones CDR que se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 13, 14, 15 ó 16; o por lo ' menos 80 por ciento de homología de secuencia en las regiones CDR con las regiones CDR que se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 13, 14, 15 ó 16. Un anticuerpo de la invención puede ser una IgG (por ejemplo IgGx) , mientras que un fragmento de anticuerpo puede ser, por ejemplo, un Fab o scFv. En consecuencia, un fragmento de anticuerpo de la invención puede ser, o puede contener una región que une a antígeno que se comporta en una o más maneras, como se describe en la presente. La invención también se relaciona con secuencias aisladas de ácido nucleico, cada una de las cuales puede codificar para una región que une antígeno de un anticuerpo humano o un fragmento funcional del mismo que es específico para un epítopo de CD38. Tal secuencia de ácido nucleico puede codificar para una cadena pesada variable de un anticuerpo e incluye una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 1, 2, 3 ó 4, o una secuencia de ácido nucleico que hibridiza bajo condiciones de rigurosidad alta con la cadena complementaria de la SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 1, 2, 3 ó 4. El ácido nucleico puede codificar para una cadena ligera variable de un anticuerpo aislado o un fragmento funcional del mismo, y puede contener una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 9, 10, 11 ó 12 o una secuencia de ácido nucleico que hibridiza bajo condiciones de rigurosidad alta con una cadena complementaria de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 9, 10, 11 ó 12. Los ácidos nucleicos de la invención son adecuados para producción recombinante . Por lo tanto, la invención también se relaciona con vectores y células hospedadoras que contienen una secuencia de ácido nucleico de la invención. Las composiciones de la invención se pueden utilizar para aplicaciones terapéuticas o profilácticas. Por lo tanto, la invención incluye una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de la invención (o un fragmento de anticuerpo funcional) y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable para el mismo. En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método para tratar un trastorno o condición relacionada con la presencia no deseada de CD38 o células que expresan CD38. Tal método contiene las etapas de administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de la invención, como se describe o contempla en la presente. La invención también se relaciona con epítopos aislados de CD38, ya sea en forma lineal o conformacional y su uso para el aislamiento de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo los cuales comprenden una región de unión a antígeno que es especifica para dicho epítopo. A este respecto, un epítopo lineal puede' contener residuos aminoácidos 192-206, mientras que un ep topo conformacional puede contener uno o más residuos aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de los aminoácidos 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170 y 202-224 de CD38. Se puede utilizar un epítopo de CD38, por ejemplo, para el aislamiento de anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos (cada uno de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo comprenden una región que une antígeno, que es especifica para dicho epitopo) , que comprende las etapas de poner en contacto al epitopo de CD38 con una biblioteca de anticuerpo y aislar uno o varios anticuerpos o uno o varios fragmentos funcionales del mismo. En otra modalidad, la invención proporciona un epítopo aislado de CD38, el cual consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de los aminoácidos 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, 192-206 y 202-224 de CD38. Como se utiliza en la presente, dicho epítopo "consiste esencialmente de" una de las secuencias de aminoácidos inmediatamente precedente más características adicionales, con la condición de que las características adicionales no afecten materialmente las características básicas y novedosas del epítopo. En otra modalidad adicional, la invención proporciona un epítopo aislado de CD38 que consiste de una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de los aminoácidos 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, 192-206 y 202-224 de CD38. La invención también proporciona un equipo que contiene: (i) un epítopo aislado de CD38 que comprende una o más secuencias de aminoácidos tomadas de las listas de 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, 192-206 y 202-224 de CD38; (ii) una biblioteca de anticuerpo; y (iii) instrucciones para utilizar la biblioteca de anticuerpo para aislar uno o más miembros de dicha biblioteca que unen específicamente a dicho epitopo.
DESCRIPCION BREVE DE LAS FIGURAS La figura la proporciona secuencias de ácido nucleico de diversas regiones pesadas variables de anticuerpo novedoso. La figura Ib proporciona secuencias de aminoácidos de diversas regiones pesadas variables de anticuerpo novedoso. Las regiones CDR HCDR1, HCDR2 y HCDR3 se designan desde la parte N a la C terminal en negrillas. La figura 2a proporciona secuencias de ácido nucleico de diversas regiones ligeras variables de anticuerpo novedoso. La figura 2b proporciona secuencias de aminoácidos de diversas regiones ligeras variables de anticuerpo novedoso. Las regiones CDR, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 se designan desde la parte N a la C terminal en negrillas. La figura 3 proporciona secuencias de aminoácidos de las regiones pesadas variables de diversos secuencias de gen maestro de anticuerpo HuCAL basado en consenso. Las regiones CDR HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 se designan desde la parte N a la C terminal en negrillas. La figura 4 proporciona secuencias de aminoácidos de las regiones ligeras variables de diversos secuencias de gen maestro de anticuerpo HuCAL basado en consenso. Las regiones CDR LCDR1 , LCDR2 y LCDR3 se designan desde la parte N a la C terminal en negrillas. La figura 5 proporciona la secuencia de aminoácidos de CD38 (SWISS-PROT, número de acceso primario P28907) . La figura 6 proporciona las secuencias nucleotídicas de cadenas pesada y ligera de OKT10 quimérico . La figura 7 proporciona una generalidad esquemática de los epítopos de los anticuerpos representativos de la presente invención. La figura 8 proporciona la secuencia de ADN de pMORPHMR_h_IgGl_l pb 601-2100) ¦ (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 32) . El vector se basa en los vectores pcDNA3.1+ (Invitrogen) . La secuencia de aminoácidos de la secuencia VH-stuffer se indica en negrillas mientras que los marcos de lectura finales de la secuencia VH-líder y el gen de la región constante se imprimen sin negrillas. Los sitios de restricción se indican encima de la secuencia. Los sitios de cebado de los cebadores de secuenciado están subrayados . La figura 9 proporciona la secuencia de ADN del vector de expresión de la cadena ligera ? Ig pMORPHMR_h_IgK_l (pb 601-1400) (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 33): El vector se basa en vectores pcDNA3.1+ (Invitrogen) . Las secuencias de aminoácidos de la secuencia VK-stuffer se indica en negrillas, mientras que los marcos de lectura finales de la secuencia ??-líder y del gen de la región constante se imprimen no en negrillas. Los sitios de restricción se indican encima de la secuencia. Los sitios de cebado de los cebadores de secuenciado están subrayados . La figura 10 proporciona la secuencia de ADN del vector de cadena ligera lambda Ig HuCAL pMORPHMR_h_IgX_l (pb 601-1400) (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 34) : La secuencia de aminoácidos de la secuencia ??-stuffer se indica en negrillas, mientras que los marcos de lectura finales de la secuencia VX-líder y del gen de la región constante no se imprimen en negrillas. Los sitios de restricción se indican encima de la secuencia. Los sitios de cebado de los cebadores de secuencia no están subrayados.
La figura 11 proporciona los resultados del ensayo de proliferación: se cultivan durante 3 días PBMC de 6 donadores sanos diferentes (como se indican por los puntos individuales) en presencia de anticuerpos HuCALMR Mab#l (=MOR03077) , Mab#2 (=MOR03079) y Mab#3 (=MOR03080) , el anticuerpo de referencia chOKTlO, un control agonístico (ag) IB4 y un control negativo irrelevante HuCALM IgGl (NC) y una IgG2a murina (Iso) como el control de isotipo coincidente para IB . Se utiliza un marcado estándar con BrdU para medir la actividad de proliferación y su incorporación (como RLU = unidades de iluminación relativa) analizadas vía ELISA basada en quimioluminiscencia. La figura 12 proporciona los resultados del ensayo de liberación de IL-6: Se cultivan durante 24 h PBMC de 4-8 donadores sanos diferentes (como se indica por los puntos individuales) en presencia de anticuerpos HuCALMR Mab#l (=MOR03077) , Mab#2 (=MOR03079) y Mab#3 (=MOR03080) , el anticuerpo de referencia chOKTlO, un control agonístico (ag.) IB4, un control negativo irrelevante HuCALMR (NC) y medio solo (medio) . Se analiza de los sobrenadantes de cultivo el contenido de IL-6 en unidades de iluminación relativa (RLU) por . medio de una prueba de ELISA basada en quimioluminiscencia. La figura 13 proporciona datos acerca de la citotoxicidad hacia células progenitoras CD34+/CD38+: Se incuban PBMC de donadores solos que albergan células progenitoras CD34+/CD38+ autólogas incubadas con HuCALm Mab#l (=MOR03077) , Mab#2 (=MOR03079) y Mab#3 (=MOR03080) , el control positivo (PC = chOKTIO) y un control negativo HuCALMR irrelevante, durante 4 horas, respectivamente. Posteriormente la suspensión de células se mezcla con medio de metilcelulosa condicionado y se incuba durante 2 semanas . Se cuentan las unidades formadoras de colonia (uFc) derivadas de unidades formadoras de descarga eritroide (BFU-E; panel B) y células pluripotenciales granulocitos/eritroides/macrófagos/megacarocitos (CFU-GEMM; panel B) y células pluripotenciales de granulocitos/macrófagos (UFC-G ; panel C) y se normalizan contra el medio control ("ninguno" = medio) . El panel A representa el número total de UFC (UFC total) de todos los progenitores . Se proporcionan los valores medianos de por lo menos 10 donadores de PBMC diferentes. Las barras de error representan el error estándar de la media. La figura 14 proporciona datos acerca de ADCC con diferentes líneas de células: a: Mediciones únicas (excepto para RMPI 8226: promedio de 4 ensayos individuales) : proporción E:T:30:1. b: Namba et al., 1989 c: 5 g/ml utilizado para anticuerpo concentrado (excepto para Raji, con 0.1 g/ml) d: adición de ensayo retinoico para estimulación de destrucción específica de expresión de CD38 [%] = [(destrucción experimental - destrucción media) /(l-destrucción media) ] *100 PC: Control positivo (=chOKT10) MM: Mieloma múltiple. CLL: Leucemia crónica de linfocitos B ALL: Leucemia linfoblástica aguda AML: Leucemia mieloide aguda DSMZ: Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH ATCC: American type culture collection ECACC: Colección Europea de cultivo celular MFI : Media de intensidades de fluorescencia. La figura 15 proporciona datos acerca de ADCC con muestras de MM: a: '2-4 análisis individuales. La figura 16 proporciona los resultados experimentales de las medias de volúmenes de tumor después de tratamiento de xenoinjerto de mieloma humano con MOR03080: grupo 1: vehículo; grupo 2: MOR03080 como hlgGl 1 mg/kg 32-68 días ' cada segundo día, grupo 3: MOR03080 como hlgGl 5 mg/kg 32-68 días cada segundo día; grupo 4: MOR03080 como chIgG2a 5 mg/kg 32-68 días cada segundo día; grupo 5: MOR03080 como hlgGl 1 mg/kg, 14-36 días cada segundo día; grupo 6: no tratado.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se basa en el descubrimiento de anticuerpos novedosos que son específicos o que tienen una alta afinidad por CD38 y que pueden proporcionar un beneficio terapéutico a un sujeto. Los anticuerpos de la invención, los cuales pueden ser humanos o humanizados, se pueden utilizar en muchos contextos, los cuales se describen más completamente en la presente. Un anticuerpo "humano" o un fragmento de anticuerpo humano funcional se define en la presente como aquel que es no quimérico (por ejemplo no "humanizado") y no de una especie no humana (en su totalidad o en parte) . Un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo funcional se puede derivar de un humano o puede ser un anticuerpo humano sintético. Un "anticuerpo humano sintético" se define en la presente como un anticuerpo que tiene una secuencia derivada, en su totalidad o en parte, in silico de secuencias sintéticas que se basan en el análisis de secuencias conocidas del anticuerpo humano. El diseño in silico de una secuencia de anticuerpo humano o un fragmento de la misma se puede obtener, por ejemplo, al analizar una base de datos de un anticuerpo humano o secuencias de fragmento de anticuerpo y diseñar una secuencia polipeptídica utilizando los datos obtenidos a partir de la misma. Otro ejemplo de un anticuerpo humano o un fragmento de anticuerpo funcional es aquel que es codificado por un ácido nucleico aislado de una biblioteca de secuencias de anticuerpo de origen humano (es decir, dicha biblioteca se basa en anticuerpos tomados de una fuente natural humana) . Un "anticuerpo humanizado" o un fragmento de anticuerpo humanizado funcional se define en la presente como aquel que es: (i) derivado de una fuente no humana (por ejemplo un ratón transgénico el cual presenta un sistema inmunológico heterólogo) , anticuerpo el cual se basa en una secuencia de línea germinal humana, o (ii) quimérico, en donde el dominio variable se deriva de un origen no humano y el dominio constante se deriva de un origen humano, o (iii) injertado por CDR, en donde los CDR del dominio variable son de un origen no humano, mientras que uno o más marcos o infraestructura del dominio variable son de origen humano y el dominio constante (en caso de que lo haya) es de origen humano. Como se utiliza en la presente, el anticuerpo "se une específicamente a", es "específico a/para" o "reconoce específicamente" ün antígeno (aquí, CD38) de dicho anticuerpo es capaz de discriminar entre dicho antígeno y uno o más antígenos de referencia, dado que la especificidad de unión no es una propiedad absoluta sino relativa. En su forma más general (y cuando no se menciona una referencia definida) , la "unión específica" se refiere a la capacidad del anticuerpo para discriminar entre el antígeno de interés y un antígeno no relacionado, determinado, por ejemplo, de acuerdo con uno de los siguientes métodos. Tales métodos comprenden, pero no se limitan a transferencia Western, pruebas de ELISA, RIA, ECL, IRMA y exploraciones de péptido. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un ensayo ELISA estándar. La calificación se puede llevar a cabo por desarrollos de color estándar (por ejemplo anticuerpo secundario con peróxido de rábano y tetrametilbencidina con peróxido de hidrógeno) . La reacción en ciertos pozos es marcada por la densidad óptica, por ejemplo, a 450 nm. Un fondo típico (=reacción negativa) es de 0.1 OD; una reacción positiva típica puede ser de 1 OD. Esto significa que la diferencia positiva/negativa puede ser mayor de 10 veces. Típicamente, la determinación de especificidad de unión se realiza mediante la utilización no de un antígeno de referencia único sino por un conjunto de aproximadamente tres a cinco antígenos no relacionados, tales como polvo de leche, BSA, transferrina o similares. No obstante, la "unión específica" también se puede referir a la capacidad de un anticuerpo para discriminar entre el antígeno objetivo y uno o más antígenos relacionados estrechamente, los cuales se utilizan como puntos de referencia, por ejemplo entre CD38 y CD157. Adicionalmente, una "unión específica" se puede relacionar con la capacidad de un anticuerpo para discriminar entre partes diferentes de su antígeno objetivo, por ejemplo dominios diferentes o regiones de CD38, tales como epítopos en la región N terminal o la región C terminal de CD38, o entre uno o más residuos aminoácidos clave o tramos de residuos aminoácidos de CD38. Además, como se utiliza en la presente, una "inmunoglobulina" (Ig) se define por la presente como una proteina que pertenece a las clases IgG, Ig , IgE, IgA o IgD (o cualquier subclase de la misma) e incluye la totalidad de los anticuerpos conocidos convencionalmente y fragmentos funcionales de los mismos. Un "fragmento funcional" de un anticuerpo/inmunoglobulina se define en la presente como un fragmento de un anticuerpo/inmunoglobulina (por ejemplo, una región variable de una IgG) que retiene la región de unión a antígeno. Una "región de unión a antígeno" de un anticuerpo típicamente se encuentra en una o más regiones hipervariables de un anticuerpo, es decir, las regiones CDR-1, -2 o -3; no obstante, las regiones de "infraestructura" variables también se pueden jugar un papel importante en la unión de antígeno, por ejemplo al proporcionar un andamio para los CDR. Preferiblemente, la "región de unión a antígeno" comprende por lo menos los residuos aminoácidos 4 a 103 de la cadena ligera variable {Vis) y 5 a 109 de la cadena pesada variable (VH) , de manera más preferible los residuos aminoácidos 3 a l07 de VL y 4 a 111 de VH y de manera particularmente preferida están las cadenas completas VL y VH (posiciones de aminoácidos 1 a 109 de VL y 1 a 113 de VH; numerando de acuerdo con WO 97/08320) . Una clase preferida de inmunoglobulinas para uso en la presente invención son IgG. Los "fragmentos funcionales" de la invención incluyen el dominio de un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab y scFv. El F(ab')2 o Fab pueden someterse a ingeniería para minimizar o eliminar completamente las interacciones disulfuro intermoleculares que se producen entre los dominios CHi y CL. Un anticuerpo de la invención se puede derivar a partir de una biblioteca de anticuerpo recombinante que se basa en secuencias de aminoácidos que se han diseñado in silico y que son codificadas por ácidos nucleicos que son creados sintéticamente. El diseño in silico de una secuencia de anticuerpo se obtiene, por ejemplo, al analizar una base de datos de secuencias humanas y al diseñar una secuencia polipeptxdica utilizando los datos obtenidos a partir de la misma. Los métodos para el diseño y obtención de secuencias creadas in silico se describen, por ejemplo en Knappik et al., J. Mol. Biol . (2000) 296:57; Krebs et al., J. Immunol . Methods . (2001) 254:67; y Patente de los E.U.A. número 6,300,064 expedida para Knappik et al . , la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
Anticuerpos de la Invención A través de este documento, se hace referencia a lós siguientes anticuerpos representativos de la invención: "anticuerpo números" o "LACS" o "MOR" 3077, 3079, 3080 y 3100. LAC 3077 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable que corresponde a la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 1 (ADN) /SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 5 (proteína) y una región ligera variable que corresponde a la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 9 (ADN) /SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 13 (proteína). LAC 3079 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable que corresponde a la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 2 (ADN) /SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 6 (proteína) y una región ligera variable que corresponde a la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 10 (ADN) /SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 14 (proteína). LAC 3080 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable que corresponde a la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 3 (ADN) /SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 7 (proteína) y una región ligera variable que corresponde a la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 11 (ADN) /SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 15 (proteína). LAC 3100 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable que corresponde a la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 4 (ADN) /SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 8 (proteina) y una región ligera variable que corresponde a la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 12 (ADN) /SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 16 (proteína). En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que tienen una región que unen antígeno la cual se puede unir específicamente o tiene una alta afinidad por una o más regiones de CD38, cuya secuencia de aminoácidos de muestra por la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 22. Se dice que un anticuerpo tiene una "afinidad alta" por un antígeno si la medición de afinidad es de por lo menos 100 nM (afinidad monovalente de fragmento Fab) . Un anticuerpo de la invención o una región de unión a antígeno preferiblemente puede unirse a CD38 con una afinidad de aproximadamente menos de 100 nM, de manera más preferible menos de aproximadamente 60 nM y de manera aún más preferible menor de aproximadamente 30 nM. Se prefiere adicionalmente que los anticuerpos que se unen a CD38 con una afinidad de menos de aproximadamente 10 nM, y de manera más preferible menor de aproximadamente 3 nM. Por ejemplo, la afinidad de un anticuerpo de la invención contra CD38 puede ser de aproximadamente 10.0 nM o 2.4 nM (afinidad monovalente de un fragmento Fab) . La tabla 1 proporciona un resumen de las afinidades de los anticuerpos representativos de la invención, determinados por resonancia de plasmon de superficie (Biacore) y análisis Scatchard FACS : Tabla 1: Afinidades de anticuerpo a: media de por lo menos dos determinaciones de afinidad diferentes b: línea de células RPMI8226 MM utilizada para FACS-Scatchard Con referencia a la tabla 1, se mide la afinidad de los LAC 3077, 3079, 3080 y 3100 por resonancia de plasmon de superficie (Biacore) sobre CD38 recombinante inmovilizado y por un procedimiento de citometria de flujo utilizando la línea de células RMPI8226 humana que expresa CD38. Los estudios Biacore se realizaron sobre antígeno inmovilizado directamente (proteína de fusión CD38-Fc) . El formato Fab de los LAC 3077, 3079, 3080 y 3100 presenta un intervalo de afinidad monovalente entre aproximadamente 2.4 y 56 nM sobre la proteína de fusión CD38-Fc inmovilizada con LAC 3079 que muestra la mayor afinidad, seguido por los Fab 3100, 3080 y 3077. Se utiliza el formato IgGl para la determinación de afinidad basada en célula (FACS Scatchard) . La columna derecha de la tabla 1 indica la fuerza de unión de LACS en este formato. LAC 3080 muestra la unión más fuerte, la cual es ligeramente más fuerte que LACS 3079 y 3077. Otra característica preferida de los anticuerpos preferidos de la invención es su especificidad por un área dentro de la región N terminal de CD38. Por ejemplo, los LAC 3077, 3079, 3080 y 3100 de la invención se pueden encontrar específicamente en la región N terminal de CD38. El tipo de epítopo al cual se une un anticuerpo de la invención puede ser lineal (es decir, una secuencia consecutiva de aminoácidos) o conformacional (es decir, secuencias múltiples de aminoácidos) . Para determinar si el epítopo de un anticuerpo particular es lineal o conformacional , los expertos en la técnica pueden analizar la unión de anticuerpos a péptidos superpuestos (por ejemplo péptidos de tres unidades con una superposición de 11 aminoácidos) que cubran dominios diferentes de CD38. Usando este análisis, los inventores han descubierto que las LAC 3077, 3080 y 3100 reconocen epítopos discontinuos en la región N terminal de CD38 mientras que el epítopo de LAC 3079 se puede describir como lineal (véase la figura 7) . Combinado con el conocimiento que se proporciona en lo siguiente, una persona experta en la técnica sabrá de que manera utilizar uno o más epítopos aislados de CD38 para generar anticuerpos que tienen una región que une antigeno que es específica para dichos epítopos (por ejemplo utilizando péptidos sintéticos de epítopos de CD38 o células que expresan epítopos de CD38) . Un anticuerpo de la invención preferiblemente la reacción cruzada en especie con humanos y por lo menos otra especie, la cual puede ser una especie de roedor o una especie de primate no humano. La especie de primate no humano puede ser un macaco de la india, un babuino o un macaco de java. Las especies de roedores pueden ser ratón, rata o hámster. Un anticuerpo que da reacción cruzada con por lo menos una especie de roedor, por ejemplo, puede proporcionar mayor flexibilidad y beneficios con respecto a anticuerpos conocidos anti-CD38 para propósitos de llevar a cabo estudios in vivo en especies múltiples con el mismo anticuerpo.
Preferiblemente, un anticuerpo de la invención no solo es capaz de unirse a CD38 sino que también es capaz de mediar la destrucción de una célula que expresa CD38. De manera más específica, un anticuerpo de la invención puede mediar su efecto terapéutico al suprimir células CD38-positivas (por ejemplo malignas o cancerosas) , vía funciones anticuerpo-efector . Estas funciones incluyen citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . La tabla 2 proporciona un resumen de la determinación ' de los valores CE50 de los anticuerpos representativos de la invención tanto en ADCC como en CDC: Tabla 2 : Valores de CE50 de anticuerpos Anticuerpo ADCC CDC (igGl) CE50 [nM] CE50 (nM] LP-1 RPMI8226 Transfectante- CHO MOR03077 0.60a 0.08a 0,8c; 0.94d MOR03079 0.09a 0.04a 0.41c MOR03080 0.17ü 0.05a 3,2°; 2.93d MOR03100 1.00ß 0.28a 10.9°; 13.61e OKT10 5.23a 4.10a 9.30c quimérico a: media de por lo menos 2 determinaciones de CE50 b: determinación única c: media de 2 determinaciones de CE50 d: media de 3 determinaciones de CE50 e: media de 4 determinaciones de CE50 No obstante, la expresión de CD38 únicamente se encuentra en células inmunológicas dentro de la linea mieloide (por ejemplo monocitos, granulocitos) y linfoide (por ejemplo linfocitos B y T activados; células plasmáticas) , pero también en células precursoras respectivas. Dado que es importante que aquellas células no sean afectadas por la destrucción mediada por anticuerpo de células malignas, los anticuerpos de la presente invención no son citotóxicos para las células precursoras. Además de sus actividades catalíticas como ADP cíclico-ribosa ciclasa e hidrolasa, CD38 presenta la capacidad de translucir señales de relevancia biológica (Hoshino et al., 1997; Ausiello et al., 2000). Estas funciones se pueden inducir in vivo, por ejemplo, por interacciones receptor-ligando o por reticulado con anticuerpos agonistas anti-CD38, lo que lleva, por ejemplo, a movilización de calcio, proliferación de linfocitos y liberación de citocinas. Preferiblemente, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos no agonistas.
Variantes Peptídicas Los anticuerpos de la invención no se limitan a las secuencias peptídicas específicas que se proporcionan en la presente. En vez de esto, la invención también está constituida por variantes de estos polipéptidos . Con referencia a la presente descripción y a las tecnologías disponibles comercialmente y las referencias, una persona experta en la técnica será capaz de preparar, probar y utilizar variantes funcionales de los anticuerpos que se describen en la presente y mientras se aprecia que dichas variantes tienen la capacidad de mediar la destrucción de una célula objetivo CD38+ que se encuentra dentro del alcance de la presente invención. Como se utiliza en este contexto, "capacidad para mediar la destrucción de una célula objetivo CD38+" significa una característica funcional adscrita a un anticuerpo anti-CD38 de la invención. La capacidad de mediar la destrucción de una célula objetivo CD38+, por lo tanto incluye la capacidad de mediar la destrucción de una célula objetivo CD38+, por ejemplo por ADCC o CDC, o por construcciones de toxina conjugadas con un anticuerpo de la invención. Una variante puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo que tiene por lo menos una región determinadora de complementariedad (CDR) (hipervariable) alterada o un dominio/posición de infraestructura (FR) (variable) frente a una secuencia peptidica descrita en la presente. Para ilustrar mejor este concepto sigue una descripción breve de la estructura de anticuerpo. Un anticuerpo está constituido de dos cadenas peptídicas, cada una contiene un dominio (cadena ligera) o tres dominios constantes (cadena pesada) y una región variable (VL, VH) , esta última la cual en cada caso está constituida de cuatro regiones FR y tres CDR intercaladas. El sitio de unión a antígeno se forma por uno o más de los CDR pero las regiones FR proporcionan la infraestructura estructural para los CDR, y por lo tanto juegan un papel importante en la unión de antígeno. Al alterar uno o más residuos aminoácidos en la región CDR o FR, una persona experta en la técnica de manera sistemática puede generar secuencias de anticuerpos mutados o diversificados, los cuales pueden ser cribados contra el antígeno, por ejemplo para propiedades nuevas o mejoradas. Las tablas 3a (VH) y 3b (VL) indican las regiones CDR y FR para ciertos anticuerpos de la invención y comparan aminoácidos en una posición dada entre sí y las secuencias de consenso correspondientes o "gen maestro" (como se describe en la patente de E.U.A. No. 6,300,064).
O ?? Tabla 3a: Secuencias VH Aglutinantes CD38 de secuencias VH VH Posición > VH Posición t t LF1 O U1 O Ul Tabla 3b: Secuencias VL Aglutinantes CD38 de secuencias VL VL ¡I I :.,^ ^?¾¾«¾? infraestructura 2 Posición 1 2 VL Intraesti uctura \ ¦'i Infraestructura? * Posición 0 1 SEQIDKQ21 VU3 SEQIDKO » 30O0 i» t T I Q SEQIDNEI IS 3100 L T I Q SU ID NO 22 V l 3 f l T I I Una persona experta en la técnica puede utilizar los datos en las tablas 3a y 3b para diseñar variantes peptídicas que estén dentro del alcance de la presente invención. Se prefiere que las variantes se construyan al cambiar aminoácidos dentro de una o más regiones CD una variante también puede tener una o más regiones de infraestructuras alteradas . Con referencia a una comparación de los anticuerpos novedosos entre si, los residuos candidatos que se pueden cambiar incluyen, por ejemplo, los residuos 4 ó 37 de la parte ligera variable y, por ejemplo, los residuos 13 ó 43 de las cadenas pesadas variables de las LAC 3080 y 3077, dado que estas son posiciones de variación unas frente a otras. Las alteraciones también se pueden realizar en las regiones de infraestructura. Por ejemplo, se puede alterar un dominio FR peptídico en donde existe una desviación en un residuo, en comparación con una secuencia de línea germinal. Con referencia a una comparación de los anticuerpos novedosos con una secuencia correspondiente de consenso o "gen maestro", los residuos candidatos que se pueden cambiar incluyen, por ejemplo, los residuos 27, 50 ó 90 de la cadena ligera variable de LAC3080 en comparación con VLA3 y, por ejemplo, los residuos 33, 52 y 97 · de la cadena pesada variable de LAC 3080 en comparación con VH3. De manera alternativa, una persona experta en la técnica puede realizar el mismo análisis al comparar las secuencias de aminoácidos descritas en la presente con secuencias conocidas de la misma clase de dichos anticuerpos utilizando, por ejemplo, el procedimiento descrito por Knappik et al., 2000 y la patente de E.U.A. número 6,300,064 expedida para Knappik et al. Además, se pueden obtener variantes mediante la utilización de un LAC como punto de inicio para la optimización al diversificar uno o más residuos aminoácidos en el LAC, preferiblemente residuos aminoácidos en uno o más CDR y por cribado de la colección resultante de variantes de anticuerpo en búsqueda de variantes con propiedades mejoradas. Se prefiere particularmente la diversificación de uno o más residuos aminoácidos en CDR-3 de VL, CDR-3 de VH, CDR-1 de VL o CDR-2 de VH. La diversificación se puede realizar al sintetizar una colección de moléculas de ADN utilizando tecnología de mutagénesis de trinucleótidos (TRIM) (Virnekás, B. , Ge, L. , Plückthum, A., Schneider, K.C., Wellnhofer, G. , and Moroney S.E. (1994) Trinucleotide phosphoramidites : ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagénesis. Nucí. Acids Res. 22, 5600) .
Variantes conservadoras de aminoácidos Las variantes polipeptídicas se pueden elaborar para conservar la estructura molecular general de la secuencia peptídica del anticuerpo que se describe en la presente. Dadas las propiedades de los aminoácidos individuales, se reconocerán por los expertos en la técnica ciertas sustituciones razonadas. Las sustituciones de aminoácidos, es decir, las "sustituciones conservadoras" se pueden realizar, por ejemplo, en base en la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad o la naturaleza antipática de los residuos involucrados. Por ejemplo: (a) los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; (b) los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; (c) los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y (d) los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las sustituciones típicamente se pueden realizar dentro de los grupos (a) - (d) . Además, la glicina y prolina pueden ser sustituidas por otras, en base en su capacidad para interrumpir las hélices a. De manera similar, algunos aminoácidos tales como alanina, cisteína, leucina, metionina, ácido glutámico, glutamina, histidina y lisina se encuentran más comúnmente en hélices a, mientras que valina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptófano y treonina se encuentran más comúnmente en láminas ß plegadas. La glicina, serina, ácido aspártico, asparagina y prolina se encuentran en las vueltas. Algunas sustituciones preferidas se pueden realizar entre los siguientes grupos: (i) S y T; (ii) P y G; y (iii) A, V, L e í. Dado el código genético conocido y las técnicas de ADN recombinante y sintético, una persona experta en la técnica puede construir con facilidad cadenas de ADN que codifiquen para las variantes de aminoácidos conservadoras. En un ejemplo particular, el aminoácido en la posición 3 en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 5 , 6 , 7 u 8 se pueden cambiar de Q a E. Como se utiliza en la presente, la "identidad de secuencias" entre dos secuencias polipeptídicas indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias. La "similitud de secuencias" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las secuencias polipeptídicas preferidas de la invención tienen una identidad de secuencia en las regiones CDR de por lo menos 60%, de manera más preferible por lo menos 70% u 80%, de manera aún más preferible por lo menos 90% y de manera mucho más preferible por lo menos 95%. Los anticuerpos preferidos también tienen una similitud de secuencia en las regiones CDR de por lo menos 80%, de manera más preferible 90% y de manera mucho más preferible 95%.
Moléculas de ADN de la invención La presente invención también se relaciona con moléculas de ADN que codifican para un anticuerpo de la invención. Estas secuencias incluyen, pero no se limitan a aquellas moléculas de ADN que se indican en las figuras la y 2a. Las moléculas de ADN de la invención no se limitan a las secuencias que se describen en la presente sino que también incluyen variantes de las mismas. Las variantes de ADN dentro de la invención se pueden describir con referencia a sus propiedades físicas en hibridación. Una persona experta en la técnica reconocerá que aquel ADN que se puede utilizar para identificar su complemento y, dado que el ADN es de cadena doble, es equivalente u homólogo utilizando técnicas de hibridación de ácido nucleico. También se reconocerá que' la hibridación puede presentarse con menos de 100% de complementariedad. No obstante, dada la selección de condiciones apropiadas, se pueden utilizar. las técnicas de hibridación para diferenciar entre secuencias de ADN en base en su relación estructural con una sonda particular. Para una guía respecto a dichas condiciones véase, Sambrook et al., 1989 (Sambrook, J. , Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, EUA) y Ausubel et al., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R . , Kingston, R. E . , Moore, D. D., Sedman, J. G . , Smith, J. A., & Struhl, K. eds . (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons) . La similitud estructural entre dos secuencias polipeptídicas se puede expresar como una función de "rigurosidad" de las condiciones bajo las cuales las dos secuencias hibridizarán entre si. Como se utiliza en la presente, el término "rigurosidad" se refiere al grado en que las condiciones no favorecen la hibridación. Las condiciones rigurosas no favorecen fuertemente dicha hibridación y únicamente las moléculas más relacionadas estructuralmente hibridizarán entre si bajo dichas condiciones. Inversamente, las condiciones no rigurosas favorecen la hibridación de moléculas que presentan un menor grado de relación estructural. Por lo tanto, la rigurosidad de hibridación se relaciona directamente con las relaciones estructurales de dos secuencias de ácido nucleico. Las siguientes ecuaciones son útiles para correlacionar hibridación y capacidad de relación (en donde Tm es la temperatura de fusión de una cadena doble de ácido nucleico) : a. Tm = 69.3 + 0.41 (G+C) % La Tm de un ADN doble disminuye en 1°C con cada incremento de 1% en el número de pares de bases malpareadas (Tjp2- (Tm)yl = 18.5 log10u2/pl en donde µ? y µ2 son las fuerzas iónicas de dos soluciones. La rigurosidad de hibridación es una función de muchos factores que incluyen la concentración total de ADN, la fuerza iónica, temperatura, tamaño de sonda y la presencia de agentes los cuales interrumpen la unión de oxígeno. Los factores que promueven la hibridación incluyen concentraciones elevadas de ADN, altas fuerzas iónicas, temperaturas bajas, un tamaño de sonda más grande y la ausencia de agentes que interrumpen la unión de hidrógeno. La hibridación típicamente se realiza en dos fases: la fase de: "unión" y la fase de "lavado". En primer lugar, en la fase de unión la sonda se une al objetivo bajo condiciones que favorecen la hibridación. La rigurosidad habitualmente se controla en esta etapa al alterar la temperatura. Para una rigurosidad alta, la temperatura habitualmente está entre 65 °C y 70 °C a menos que se utilicen sondas oligonucleotídicas cortas (de menos de 20 nucleótidos) . Una solución de hibridación representativa comprende 6X SSC, SDS 0.5%, solución de Denhardt 5X y 100 ]iq de ADN portador no específico. Véase Ausubel et al., sección 2.9, suplemento 27 (1994). Por supuesto, se conocen muchas condiciones de amortiguador diferentes aunque funcionalmente equivalentes. Cuando el grado de relación es menor, se puede seleccionar una temperatura menor. Las temperaturas de unión de baja rigurosidad están entre aproximadamente 25 °C y 40 °C. La rigurosidad media está entre por lo menos aproximadamente 40°C y menos de aproximadamente 65 °C. La rigurosidad elevada es de por lo menos aproximadamente 65°C. En segundo lugar, se elimina el exceso de sonda por lavado. Es en esta fase en que habitualmente se aplican las condiciones más rigurosas. Por lo tanto, en esta etapa de "lavado" es casi tan importante para determinar la relación vía hibridación. Las soluciones de lavado típicamente contienen concentraciones menores de sales. Una solución ejemplar de rigurosidad media contiene 2X SSC y SDS 0.1%. Una solución de lavado de rigurosidad alta contiene el equivalente (en fuerza iónica) de menos de aproximadamente 0.2X SSC ¦ con una solución rigurosa preferida que contiene aproximadamente 0. IX SSC. Las temperaturas asociadas con diversas rigurosidades son las mismas a las presentadas en lo anterior para "unión" . La solución de lavado también se sustituye típicamente numerosas veces durante lavado. Por ejemplo, las condiciones de lavado de alta rigurosidad típicas comprenden el lavado dos veces durante 30 minutos a 55°C y tres veces durante 15 minutos a 60 °C. En consecuencia, la presente invención incluye moléculas de ácido nucleico que hibridizan con las moléculas que se establecen en las figuras la y 2a bajo condiciones de alta rigurosidad de unión y lavado, en donde dichas moléculas de ácido nucleico codifican para un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que tiene propiedades como se describen en la presente. Las moléculas preferidas (desde una perspectiva de ARNm) son aquellas que tienen por lo menos 75% u 80% (preferiblemente por lo menos 85%, de manera más preferible por lo menos 90% y de manera mucho más preferible por lo menos 95%) de homología o identidad de secuencia con una de las moléculas de ADN que se describe en la presente. En un ejemplo particular de una variante de la invención, la posición 7 del ácido nucleico en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 1, 2, 3 ó 4 se puede sustituir de un C a un G, y de esta manera se puede cambiar el codón, de CAA a GAA..
Variantes funcionalmente equivalentes Otra clase adicional de variantes de ADN dentro del alcance de la invención se pueden describir con referencia al producto que codifican (véanse los péptidos que se incluyen en las figuras Ib y 2b) . Estos genes funcionalmente equivalentes están caracterizados por el hecho de que codifican para las mismas secuencias peptídicas que se encuentran en las figuras Ib y 2b debido a la degeneración del código genético. Las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 1 y 31 son un ejemplo de variantes funcionalmente equivalentes, dado que sus secuencias de ácido nucleico son diferentes, aunque codifican para el mismo polipéptido, es decir, la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 5. Se reconoce que las variantes de moléculas de ADN que se proporcionan en la presente se pueden construir de varias maneras diferentes. Por ejemplo, se pueden construir como ADN completamente sintéticos. Los métodos para sintetizar eficazmente oligonucleotidos en un intervalo de 20 a aproximadamente 150 nucleótidos están disponibles ampliamente. Véase Ausubel et al., sección 2.11, suplemento 21 (1993) . Se pueden sintetizar oligonucleotidos que se superponen y se ensamblan de una manera que fue presentada por primeras vez por Khorana et al., J. Mol. Biol . 72:209-217 (1971); véase también Ausubel et al., supra, sección 8.2. Los ADN de síntesis preferiblemente se diseñan con sitios de restricción convenientes sometidos a ingeniería genética en los extremos 5' y 3' del gen para facilitar- la clonación en un vector apropiado. Como se ha indicado, un método para generar variantes es comenzar con uno de los ADN descritos en la presente y después realizar mutagénesis dirigida al sitio. Véase Ausubel, et al., supra, capítulo 8, suplemento 37 (1997) . En un método típico, el ADN objetivo se clona en un vehículo de bacteriófago de ADN de cadena sencilla. El ADN de cadena sencilla se aisla e hibridiza con un oligonucleótido que contiene una o varias alteraciones nucleotídicas deseadas. La cadena complementaria se sintetiza y el fago de cadena doble se introduce en un hospedador. Parte de la progenie resultante contendrá el mutante deseado, lo cual se puede confirmar utilizando secuenciado de ADN. Además están disponibles diversos métodos que incrementan la probabilidad de que la descendencia del fago sea el mutante que se desea. Estos métodos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y están disponibles comercialmente equipos para generar dichos mutantes.
Construcciones de ADN recombinante y expresión La presente invención proporciona además construcciones de ADN recombinantes que comprenden una o más secuencias nucleotídicas de la presente invención. Las construcciones recombinantes de la presente invención se utilizan en relación con un vector, tal como un plásmido o vector viral en el cual se inserta una molécula de ADN que codifica para un anticuerpo de la invención. El gen codificado se puede producir por técnicas descritas en Sambrook et al., 1989 y Ausubel et al., 1989. De manera alternativa, las secuencias de ADN se pueden sintetizar químicamente utilizando, por ejemplo, sintetizadores . Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (1984, Gait, ed. , IRL Press, Oxford) , la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Las construcciones recombinantes de la invención están constituidas con vectores de expresión que son capaces de expresar el ARN o los productos proteínicos de los ADN codificados. El vector puede comprender además secuencias reguladoras que incluyen un promotor unido operablemente a un marco de lectura abierto (ORF) . El vector puede comprender además una secuencia marcadora seleccionable . El inicio específico y las señales secretoras bacterianas también se pueden requerir para una traducción eficaz de las secuencias codificantes del gen objetivo que se ha insertado. La presente invención proporciona además células hospedadoras que contienen por lo menos uno de los ADN de la presente invención. La célula hospedadora puede ser virtualmente cualquier célula para la cual estén disponibles vectores de expresión. Puede ser, por ejemplo, una célula hospedadora eucariótica superior, tal como una célula de mamífero, una célula hospedadora eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, pero preferiblemente es una célula procariótica tal como una célula bacteriana. La introducción de una construcción recombinante en la célula hospedadora se puede llevar a cabo por transfección con fosfato de calcio, DEAE, transfección mediada por dextrano, electroporación o infección por fago.
Expresión Bacteriana Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano se construyen al insertar una secuencia de ADN estructural que codifica para una proteína deseada junto con las señales de inicio de traducción y terminación adecuadas en una fase de lectura operable con un promotor funcional . El vector comprenderá uno o . más marcadores seleccionables fenotípicos y un origen de replicacion para asegurar el mantenimiento del vector y, si es deseable, para proporcionar amplificación dentro del hospedador. Los hospedadores procarióticos adecuados para transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudominas, Streptomyces y Staphylococcus . Los vectores bacterianos pueden estar basados, por ejemplo en bacteriófagos, plásmidos o fagémidos . Estos vectores pueden contener un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles comercialmente que típicamente contienen elementos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017) . Después de la transformación de una cepa hospedadora adecuada y el crecimiento de la cepa hospedadora hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionada se reprime/induce por medios apropiados (por ejemplo desplazamiento de temperatura o inducción química) y las células se cultivan por un período adicional. Las células típicamente se cosechan por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y el extracto crudo resultante se retiene para purificación adicional. En sistemas bacterianos se pueden seleccionar ventajosamente numerosos vectores de expresión dependiendo del uso propuesto para la proteína que se va a expresar. Por ejemplo, cuando se va a producir una cantidad grande de dicha proteína, para la generación de anticuerpos o para el cribado de bibliotecas peptídicas, por ejemplo, puede ser deseable vectores los cuales dirigen la expresión de niveles altos de productos de proteína de fusión que se purifican fácilmente.
Métodos Terapéuticos Los métodos terapéuticos involucran administrar a un sujeto en necesidad de tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo contemplado por la invención. Una cantidad "terapéuticamente eficaz" en la presente se define como la cantidad de un anticuerpo que es de cantidad suficiente para suprimir células CD38- en un área tratada de un sujeto - ya sea como una dosis única o de acuerdo con un régimen de dosis múltiple, solo o en combinación con otros agentes, lo que genera el alivio de una condición adversa, pero dicha cantidad debe ser toxicológicamente tolerable. El sujeto puede ser un humano o un animal no humano (por ejemplo un conejo, rata, ratón, mono u otro primate de orden inferior) . Un anticuerpo de la invención se puede coadministrar con medicamentos conocidos y en algunos casos el anticuerpo en si mismo puede estar modificado. Por ejemplo, un anticuerpo se puede conjugar con una inmunotoxina o un radioisótopo para incrementar potencialmente de manera adicional la eficacia. Los anticuerpos de la invención se' pueden utilizar como una herramienta terapéutica o de diagnóstico en una diversidad de situaciones en donde CD38 se expresa o se encuentra de manera indeseable . Los trastornos y condiciones particularmente adecuados para tratamiento con un anticuerpo de las invenciones son mieloma múltiple (MM) y otras enfermedades hematológicas tales como leucemia linfocítica crónica (CLL) , leucemia mielógena crónica (CML) , leucemia mielógena aguda (AML) y leucemia linfocítica aguda (ALL) . Un anticuerpo de la invención también se puede utilizar para tratar enfermedades inflamatorias tales como artritis reumatoide (RA) o lupus eritematoso sistémico (SLE) . Para tratar cualquiera de los trastornos anteriores, las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la presente invención se pueden formular de una manera convencional utilizando uno o más portadores o excipientes fisiológicamente aceptables. Se puede administrar un anticuerpo de la invención por cualquier medio adecuado el cual puede variar, en base en el tipo de trastorno que va a ser tratado. Las rutas de administración posibles incluyen parenteral (por ejemplo intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal o subcutánea) , intrapulmonar e intranasal y, si se desea, para tratamiento inmunosupresor local, administración intralesional . Además, se puede administrar un anticuerpo de la invención' mediante infusión por pulso, por ejemplo, con dosis cada vez menores del anticuerpo. Preferiblemente, la dosificación se proporciona por inyecciones, de manera más preferible por inyecciones intravenosas o subcutáneas dependiendo, en parte, de si la administración es breve o crónica. La cantidad que se va a administrar dependerá de una diversidad de factores tales como síntomas clínicos, peso del individuo o si se administran otros medicamentos. Una persona experta en la técnica reconocerá que la vía de administración variará en base en el trastorno o condición que se va a tratar . La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido novedoso, de acuerdo con esta invención, dependerá en gran medida de las características particulares del paciente, la vía de administración y la naturaleza del trastorno que va a ser tratado. Se puede encontrar una guía general, por ejemplo, en las publicaciones de la International Conference on Harmonisation y en REMINGTO 1 S PHARMACEUTICAL SCIENCES, capítulos 27 y 28, pp. 484-528 (18th ed. , Alfonso R. Gennaro, Ed. , Easton, Pa. : Mack Pub. Co. , 1990). De manera más específica, la determinación de la cantidad terapéuticamente eficaz dependerá de factores tales como toxicidad y eficacia del medicamento. La toxicidad se puede determinar utilizando métodos bien conocidos en la técnica y que se encuentran en las referencias precedentes. La eficacia se puede determinar utilizando la misma guía junto con los métodos descritos a continuación en los ejemplos.
Métodos de Diagnostico CD38 se expresa en gran cantidad en células ematológicas y en ciertos cánceres; por lo tanto, un anticuerpo anti-CD38 de la invención se puede utilizar con el fin de formar imágenes o visualizar un sitio de acumulación posible de células malignas en un paciente. A este respecto, se puede marcar detectablemente al anticuerpo, mediante el uso de radioisótopos, marcas de afinidad (tales como biotina, avidina, etc.), marcas fluorescentes, átomos paramagnéticos , etc. Los procedimientos para llevar a cabo dicho marcado son bien conocidos en la técnica. La aplicación clínica de anticuerpos en la formación de imágenes de diagnóstico se revisa por Grossman, H. B., Urol . Clin. North Amer. 13:465-474 (1986)), Unger, E. C. et al., Invest . Radiol, 20:693-700 (1985)), y Khaw, B. A. et al., Science 209:295-297 (1980) ) . La detección de los focos de tales anticuerpos marcados detectablemente puede ser indicativo de un sitio de desarrollo de tumor, por ejemplo. En una modalidad, este examen se realiza al extraer muestras de tejido o sangre y al incubar dichas muestras en presencia de anticuerpos marcados detectablemente. En una modalidad preferida, esta técnica se lleva a cabo de una manera no invasiva mediante el uso de formación de imágenes magnéticas, fluorografía, etc. Tal prueba de diagnóstico se puede utilizar, para vigilar el éxito de tratamiento en enfermedades, en donde la presencia o ausencia de células CD38 -positivas es un indicador relevante . La invención también contempla en uso de un anticuerpo anti-CD38, como se describe en la presente para diagnóstico de un ámbito ex vivo .
Composiciones Terapéuticas y de Diagnóstico En los anticuerpos de la presente invención se pueden formular de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, en donde se combina un anticuerpo de la invención (que incluye cualquier fragmento funcional del mismo) en una mezcla con un vehículo portador farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados para su formulación se describen, por ejemplo, en REMINGTON'S PHARMACEU ICAL SCIENCES (18th ed. , Alfonso R. Gennaro, Ed. , Easton, PA. : Mack Pub. Co. , 1990). Con el fin de formar una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para administración eficaz, dichas composiciones contendrán una cantidad eficaz de uno o más de los anticuerpos de la presente invención, junto con una cantidad adecuada de vehículo portador. Las preparaciones se pueden formular adecuadamente para proporcionar liberación controlada del compuesto activo. Las preparaciones de liberación controladas se pueden obtener mediante el uso de polímeros para formar complejos o absorber el anticuerpo anti-CD38. El suministro controlado se puede llevar a cabo al seleccionar macromoléculas apropiadas (por ejemplo poliésteres, poliaminoácidos , polivinilo, pirrolidona, acetato de etilenvinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o protamina, sulfato) y la concentración de macromoléculas así como los métodos de incorporación con el fin de controlar la liberación. Otro método posible para controlar la duración de acción de las preparaciones de liberación controlada es incorporar anticuerpo anti-CD38 en partículas de un material polimérico tal como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles , poli (ácido láctico) o copolímeros de etileno y acetato de vinilo. De manera alternativa, en vez de incorporar estos agentes en partículas poliméricas, es posible atrapar estos materiales en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coaservación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli (metilmetacrilato) respectivamente, o en sistemas de suministro de medicamento coloidal, por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsion.es , nanopartículas y nanocápsulas o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) . Los compuestos se pueden formular para administración parenteral por inyección, por ejemplo inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo en ampolletas, o en recipientes de dosis múltiples, con un conservador agregado. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes que mejoren la suspensión, la estabilidad o la dispersión. De manera alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para dilución (constitución) con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso . Si se desea, las composiciones se pueden presentar en un envase o un dispositivo de suministro, el cual puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contengan el ingrediente activo. El envase puede comprender, por ejemplo, una lámina delgada de metal o plástico tal como un envase tipo ampolla. El envase o el dispositivo de suministro se pueden acompañar por instrucciones para administración.
La invención se entiende adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos de trabajo, los cuales están diseñados para ilustrar, y por lo tanto no para limitar la invención.
EJEMPLOS Líneas de Células Se obtienen las siguientes líneas de células de la European Collection of Cell Cultures (ECACC) , la Germán Collection of Microoganisms (DSMZ) o la American Type Culture Collection (ATCC) : la línea de células de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal OKT10 IgGl de ratón CD38 (ECACC, #87021903) , células Jurkat (DSMZ, ACC282) , LP-1 (DSMZ, ACC41) , RPMI8226 (ATCC, CCL-155) , HE 293 (ATCC, CRL-1573), CHO-K1 (ATCC, CRL-61) y Raj i (ATCC, CCL-86) .
Células y condiciones de cultivo Todas las células se cultivan en condiciones estandarizadas a 37°C y C02 5% en un incubador humidificado . Se cultivan tres líneas de células LP-1: RPMI8226, Jurkat y Raji en RPMI1640 (Pan biotech GmbH, #P04-16500) suplementado con FCS 10% (PAN biotech GmbH, #P30-3302) , 50 U/ml de penicilina, 50 ug/ml de estreptomicina (Gibco, #15140-122) y glutamina 2 mM (Gibco, #25030-024) y, en caso de las células Jurkat y Raji, se agregan adicionalmente Hepes 10 mM (Pan biotech GmbH, #P05-01100) y piruvato de sodio 1 mM (Pan biotech GmbH, #P04-43100) . La célula CH0-K1 y HEK293 se hacen crecer en medio DMEM (Gibco, #10938-025) suplementado con glutamina 2 mM y FCS 10%. Se mantienen transfectantes estables de CHO-K1 CD38 en presencia de G418 (PAA GmbH, Pll-012) mientras que para HEK293 es esencial la adición de piruvato de sodio 1 mM. Después de transfección transitoria de HEK293, se sustituye FCS 10% por FCS Ultra bajo en IgG (Invitrogen, #16250-078) . La línea de células OKT10 se cultiva en IDMEM (Gibco, #31980-022) , suplementado con glutamina 2 mM y FCS 20%.
Preparación de suspensiones de células solas a partir de sangre periférica Todas las muestras de sangre se toman después de consentimiento informado. Se aislan las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) por HystopaqueMR-1077 (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, de donadores sanos. De estas suspensiones celulares se eliminan los eritrocitos por incubación en amortiguador de lisis ACK (NH4C1 0.15 M, KHC03 10 ¦ mM, EDTA 0.1 M) durante 5 min a RT o un derivado comercial (Bioscience, #00-4333) . Las células se lavan dos veces con PBS y se procesan' adicionalmente para citometrla de flujo o ADCC (véase a continuación) .
Citometrla de flujo ("FACS") Todas las tinciones se realizan en placas de cultivo de 96 pozos de fondo redondo (Nalge Nunc) con 2 x 105 células por pozo. Las células se incuban con Fab o anticuerpos IgG a las concentraciones indicadas en 50 µ? de amortiguador FACS (PBS, FCS 3%, NaN3 0.02%) durante 40 min a 4°C. Las células se lavan dos veces y después se incuban con anticuerpo de chivo anti-humano conjugado a R-ficoeritrina (PE) o anticuerpo de chivo anti-IgG de ratón (H+L) F(ab')2 (Jackson Immuno Research), diluido 1:200 en amortiguador FACS, durante 30 minutos a 4°C. Las células se lavan, se resuspenden en 0.3 mi en amortiguador FACS. y después se analiza por citometrla de flujo en un equipo FACSCalibur (Becton Dickinson, San Diego, CA) . Para el análisis Scatchard basado en FACS, las células RMPI8226 se tiñen en 12 diluciones diferentes (l:2n) comenzando a 12.5 ug/iril (IgG) de concentración final. Se utilizan por lo menos dos mediciones independientes para cada concentración y los valores KD se extrapolan para la mediana de intensidades de fluorescencia, de acuerdo con Chamow et al., (1994).
Resonancia de plasmon de superficie Las constantes cinéticas de kactivado y ^desacti ado se determinan con diluciones seriadas de la unión Fab respectiva a proteína de fusión CD38-Fc inmovilizada de manera covalente utilizando el instrumento BIAcore 3000 (Biacore, Upsala, Suecia) . Para la inmovilización de antígeno covalente estándar se utiliza la química de acoplamiento de amina EDC-NHS . Para acoplamiento directo de proteína de fusión CD38 Fe, se recubren chips sensores CM5 (Biacore) con -600-700 RU en amortiguador acetato 10 mM, pH 4.5. Para las células de flujo de referencia se utiliza una cantidad respectiva de HSA (albúmina sérica humana) . Las mediciones cinéticas se realizan en PBS (NaCl 136 mM, KCl 2.7 mM, Ma2HP04 10 mM, KH2P04 1.76 mM, pH 7.4) a un caudal de 20 µ?/min utilizando un intervalo de concentración Fab de 1.5-500 nM. El tiempo de inyección para cada concentración es de 1 min, seguido por una fase de disociación de 2 min. Para la generación se utilizan 5 µ? de HCl 10 mM. Todos los sensogramas se acoplan localmente utilizando software de evaluación BIA 3.1 (Biacore).
EJEMPLO 1: Generación de anticuerpo a partir de bibliotecas HuCAL Para la generación de anticuerpos terapéuticos contra CD38, se llevan a cabo selecciones con la biblioteca de presentación de fago MorphoSys HuCAL GOLD. HuCAL G0LDMR es una biblioteca Fab que se basa en el concepto HuCALMR (Knappik et al., 2000; rebs et al., 2001), en la cual la totalidad de seis CDR se diversifican, y el cual utiliza la tecnología CysDisplayMR para enlazar fragmentos Fab a la superficie del fago (Lohning, 2001) .
A. Rescate de fagémido, amplificación y purificación de fago La biblioteca de fagémido HuCAL GOLD"11 se amplifica en medio 2 X TY que contiene 34 pg/ml de cloramfenicol y glucosa 1% (2 x TY-CG) . Después de infección de fago cooperador helper (VCSM13) a una DO600 de 0.5 (30 min a 37°C sin agitación; 30 min a 37°C con agitación a 250 rpm) , las células se sedimentan por centrifugación (4120 g; 5 min; 4°C) , se resuspenden en 2 x TY/34 yg/ml de cloramfenicol/50 yg/ml de kanamicina y se hacen crecer durante la noche a 22 °C. Los fagos son precipitados con PEG del sobrenadante, se resuspenden en PBS/glicerol 20% y se almacenan a -80°C. La amplificación de fago entre dos rondas de paneo se lleva a cabo como sigue: se infectan células TG1 en fase media logarítmica con fagos eluidos y se siembran en placas sobre agar LB suplementado con 1% de glucosa y 34 ]ig/ l de cloramfenicol (LB-CG) . Después de incubación durante la noche a 30°C, se eliminan por raspado las colonias hasta una DO600 de 0.5 y se agrega fago cooperador como se describe en lo anterior.
B. Paneados con HuCAL GOLD™ Para las selecciones se dividen los anticuerpos-fagos HuCAL GOLDMR en tres acumulados que corresponden a genes maestros VH diferentes (acumulado 1: VH1/5XK, acumulado 2: VH3AK, acumulado 3: VH2/4/6 ??) . Estos acumulados se someten individualmente a 3 rondas de paneo de células completas en células CHO-Kl que expresan CD38 seguido por elución con pH y etapa de post-adsorción en células CHO-Kl CD38 negativas para supresión de anticuerpo-fagos irrelevantes. Finalmente, los fagos de anticuerpo remanentes se utilizan para infectar células E. coli TG1. Después de centrifugación, el sedimento bacteriano se resuspende en medio 2 x TY, se siembra en placa sobre placas de agar y se incuba durante la noche a 30°C. Los clones seleccionados después se raspan de las placas, se rescatan los fagos y se amplifican. La segunda y tercera ronda de selecciones se realizan como la inicial. El Fab que codifica para los insertos de los fagos HuCAL GOLDMR seleccionados se subclonan en el vector de expresión pM0RPHMRx9_Fab_FS (Rauchenberger et al., 2003) para facilitar la expresión rápida de Fab soluble. El ADN de los clones seleccionados se digiere con Xbal y EcoRI y de esta manera se recorta el inserto que codifica para Fab (ompA-VLCL y phoA-Fd) , y se clona el vector de corte Xbal/EcoRI pM0RPHMRx9_Fab_FS . El Fab expresado en este vector presenta dos etiquetas C terminales (FLAGMR y Strep-tagMR II) para detección y purificación.
EJEMPLO 2 : Ensayos biológicos Se miden la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y la citotoxicidad dependiente de complemento, de acuerdo con el protocolo publicado en base en el análisis de citometría de flujo (Naundorf et al., 2002) como sigue: ADCC Para mediciones de ADCC, se ajustan las células objetivo (T) a 2.0 x .105 células/ml y se marcan con 100 ng/ml de calceína AM (Molecular Probes, C-3099) en medio RPMI1640 (Pan biotech GmbH) durante 2 minutos a temperatura ambiente. La calceína residual se separa por 3 etapas de lavado en medio RPMI1640. En paralelo, se preparan PBMC como fuente para células efectoras (E) (citolíticas naturales), se ajustan a 1.0 x 107 y se mezclan con las células objetivo marcadas para proporcionar una relación final E:T de 50:1 o menos, dependiendo de las condiciones de ensayo. Las células se lavan una vez y se resuspende la mezcla de células en 200 µ? de medio RPMI1640 que contiene el anticuerpo respectivo a diferentes diluciones. La placa se incuba durante 4 h bajo condiciones estandarizadas a 37°C y C02 5% en un incubador modificado. Antes del análisis por FACS, las células se marcan con yoduro de propidio (PI) y se analizan por citometria de flujo (Becton-Dickinson) . Se cuentan entre 50,000 y 150,000 eventos para cada ensayo. La siguiente ecuación proporciona la actividad citolitica [en %] : EDA x 100 ELA+EDA en donde ED = eventos de células muertas (calceína + células teñidas PI) y ELA = eventos de células vivas (células teñidas con calceína) CDC: Para las mediciones de CDC, se agregan 5.0 x 104 transíectantes CH0- 1 CD38 a una placa de 'pozo de microtitulación (Nunc) junto con una dilución 1:4 de suero humano (Sigma, #S-1764) y el anticuerpo respectivo. Todos los reactivos y células se diluyen en medio RPMI1640 (Pan biotech GmbH) suplementado con FCS 10%. La mezcla de reacción se incuba durante 2 h bajo condiciones estandarizadas a 37°C y C02 5% en un incubador humidificado . Como controles negativos sirven ya sea el complemento inactivado por calor o transfectantes CD38 sin anticuerpo. Las células se marcan con PI y se someten a análisis FACS. Se cuentan un total de 5000 eventos y el número de células muertas a diferentes concentraciones de anticuerpo se utiliza para la determinación de los valores CE50. La siguiente ecuación da lugar e indica la actividad citolítica [en %] : ED x 100 ELC+EDC en donde EDC = eventos de células muertas (células teñidas PI) y ELC = eventos de células vivas (no teñidas) Los valores de toxicidad a partir de un total de 12 diluciones de anticuerpo diferentes (l:'2n) por triplicado se utilizan en ADCC y duplicados en EDC para cada anticuerpo con el fin de obtener valores CE-50 con un software de análisis estándar (PRISM , Graph Pad Software) .
EJEMPLO 3: Generación de transfectantes CD38 estables y proteínas de fusión CD38 Fe Con el fin de generar proteína CD38 para paneo y cribado necesitan establecerse dos sistemas de expresión diferentes. La primera estrategia incluye la generación de la proteína de fusión CD38-Fc, la cual se purifica de sobrenadantes después de transfección transitoria de células HEK293. La segunda estrategia involucra la generación de una línea de células CHO-K1 estable para una expresión en superficie elevada de CD38 para ser utilizada para selección de anticuerpo-fagos por medio de paneo de célula completa. Como una etapa inicial se utilizan células Jurkat (DSMZ ACC282) para la generación de ADNc (Invitrogen) seguido por amplificación de la totalidad de la secuencia codificante para CD38 utilizando cebadores complementarios a los primeros 7 y los últimos 9 codones de CD38, respectivamente (cebador MTE001 y MTE002rev; tabla 4) . El análisis de secuencia del inserto CD38 confirmó la secuencia de aminoácidos publicada por Jackson et al. (1990) excepto para la posición 49, la cual mostró una glutamina en vez de una tirosina, como se describe por Nata et al. (1997). Para la introducción de sitios de endonucleasa de restricción y clonación en derivados diferentes del vector de expresión pcDNA3.1 (Stratagene) , el producto PCR purificado sirve como una plantilla para la reamplificación del gen completo (cebadores MTE006 y TE007rev, tabla 4) o una parte (cebadores MTE004 y TE009rev, tabla 4) del mismo. En este último caso, se amplifica y clona el marco un fragmento que codifica para el dominio extracelular (aminoácidos 45 a 300) entre la secuencia líder VK humana y una secuencia Fc-? 1 humana. Este vector sirve como vector de expresión para la generación de la proteína de fusión soluble CD38-FC. Se utiliza otro derivado de pcDNA3.1 sin una secuencia líder para la inserción del gen de longitud completa para CD38. En este caso un codón de detención frente a la región codificante Fe y la secuencia líder perdida da lugar a la expresión de superficie de CD38. Las células HEK293 se transfectan transitoriamente con el Fc-vector de proteína de fusión para generación de CD38 soluble Fc-proteína de fusión y, en caso de un derivado de longitud completa, se transfectan células CH0-K1 para la generación de una línea de células que expresan de manera estable CD38.
Tabla 4: * que se dirige a un codón de detención (TGA) en la orientación directa.
EJEMPLO 4: Clonación, expresión y purificación de HuCAL IgGl: Con el fin de expresar IgG de longitud completa, se subclonan los fragmentos de dominio variable de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) a partir de los vectores de expresión Fab · dentro de los vectores apropiados (véanse las figuras 8 a 10) . Se utilizan los pares de endonucleasa de restricción Blpl/Mfel (inserto-preparación) y Blpü/EcoRI (vector-preparación) para subclonación del fragmento de dominio VH dentro de pMORPHMR_hIgGl . Se utilizan los pares de enzima EcoRV/Hpal (?-inserto) y EcoRV/BsiWI (K-inserto) para subclonación del fragmento de dominio VL dentro de los vectores respectivos p ORPHMR_hIgK_l o pMORPHMR_h_IgX_l . Las construcciones de IgG resultantes se expresan en células HEK293 (ATCC CRL-1573) por transfección transitoria utilizando técnica de coprecipitación con fosfato de calcio -ADN, estándar. Se purifican las IgG de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad via una columna de proteína A Sepharose . Un procesamiento adicional corriente abajo incluye un intercambio de amortiguador por filtración en gel y filtración estéril de IgG purificada. El control de calidad mostró una pureza de >90% por SDS-PAGE reductor y >90% de IgG monomérica se determina por cromatografía analítica de exclusión de tamaño. Se determina el contenido de endotoxina del material por un ensayo basado en LAL cinético (Cambrex European Endotoxina Testing Service, Bélgica) .
EJEMPLO 5 : Generación y producción de OKT10 quimérico (chOKTIO; SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS : 23 y 24) Para la construcción de chOKTIO, se amplifican las regiones de ratón VH y VL por PCR utilizando ADNc preparado de una línea de células de hibridoma OKT10 murino (ECACC #87021903) . Se utiliza un conjunto de cebadores como se ha publicado (Dattamajumdar et al., 1996; Zhou et al., 1994) . Los productos de PCR se utilizan para Topo-clonación (Invitrogen; vector pCRII) y las colonias solas se someten a análisis de secuencia (cebador inverso M13) el cual muestra dos secuencias diferentes de cadena ligera K y una secuencia de cadena pesada. De acuerdo con las alineaciones de secuencia (base de datos de secuencia EMBL-nucleótido) y la literatura (Krebber et al, 1997) una de las secuencias K pertenece al repertorio intrínseco del asociado de fusión de célula tumoral X63Ag8.653 y por lo tanto no pertenece al anticuerpo OKT10. Por lo tanto, únicamente se utiliza una secuencia K nueva y el fragmento VH único, para clonación adicional. Ambos fragmentos se reamplifican para la adición de sitios de endonucleasa de restricción seguidos por clonación dentro de los vectores de expresión de IgGl pMORPHMR respectivos . Las secuencias para la cadena pesada (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23) y la cadena ligera (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 24) se proporciona en la figura 6. Se transfectan transitoriamente células HEK293 y el sobrenadante se analiza en FACS para el anticuerpo quimérico OKT10 que se une a la linea de células Raji que sobreexpresan CD38 (ATCC) .
EJEMPLO 6: Mapeo del epítopo 1. Materiales y Métodos: Anticuerpos : Las siguientes IgG anti-CD38 se envían mapeos de epítopo : * OKT10 quimérica que consiste de Fe humano y regiones variables de ratón.
Secuencia CD38: La secuencia de aminoácidos (aa) (posición 44-300) se basa en CD38 humano que se toma de la secuencia publicada bajo SWISS-PROT, número de acceso primario P28907. En la posición 49, se ha utilizado el aminoácido Q (en vez de T) para el diseño del péptido.
Análisis PepSpot: Los peptidos de antígeno se sintetizan sobre una membrana de celulosa de una manera paulatina lo que resulta en una distribución definida (arreglo peptídico) y se unen covalentemente a la membrana de celulosa. Se realizan ensayos de unión directamente sobre el arreglo peptídico. En general, un arreglo peptídico de antígeno se incuba con amortiguador bloqueador durante varias horas para reducir la unión no específica de los anticuerpos. La incubación con el anticuerpo primario (que une antígeno peptídico) en amortiguador bloqueador se produce seguido de la incubación con anticuerpo secundario marcado con peroxidasa (POD) , el cual une selectivamente al anticuerpo primario. Un lavado corto en amortiguador T (Tween) -TBS directamente después de la incubación del arreglo del péptido de antígeno con el anticuerpo secundario seguido por el primer experimento de quimioluminiscencia se realiza para obtener una primera generalización respecto a cuáles péptidos antigénicos se unen al anticuerpo primario. Siguen varias etapas de lavado con amortiguador (amortiguador T-TBS y TBS) para reducir la unión de falso positivo (unión de anticuerpo no específica a la membrana de celulosa misma) . Después de estas etapas de lavado se realiza el análisis de quimioluminiscencia final. Los datos se analizan con un sistema de formación de imagen que muestra la intensidad de señal (unidades de iluminación Boehringer, BLU) como mediciones únicas para cada péptido. Con el fin de evaluar la unión no específica de los anticuerpos secundarios (anti-IgG human) , estos anticuerpos incuban con el arreglo peptídico en presencia de anticuerpos primarios como la primera etapa. Si el anticuerpo primario no muestra ninguna unión a los péptidos, se puede marcar directamente con POD, lo que incrementa la sensibilidad del sistema (realizada para MOR3077) . En este caso se realiza química de acoplamiento convencional vía grupos amino libres. El antígeno se explora con péptidos de 13 unidades (con superposición de 11 aminoácidos) . Esto resulta en arreglos de 123 péptidos. Los ensayos de unión se realizan directamente sobre el arreglo. Los anticuerpos unidos a péptidos MOR03077, MOR03079, MOR03080, OR03100 y OKT10 quimérico se detectan utilizando anticuerpo secundario marcado con peroxidasa (anticuerpo de chivo anti-IgG humana, conjugado con peroxidasa, específico de cadena ?, anticuerpo aislado por afinidad; Sigma-Aldrich, A6029) . Los mapeos se realizan con un sustrato de quimiolumniniscencia en combinación con un sistema de formación' de imagen. Adicionalmente se realiza un etiquetado POD directo de MOR03077 con el fin de incrementar la sensibilidad del sistema. 2. Resumen y Conclusiones : La totalidad de los anticuerpos mostraron perfiles diferentes en el análisis PepSpot . En la figura 7 se proporciona un resumen esquemático, el cual ilustra las diferentes secuencias de aminoácidos de CD38 que se reconocen. El epítopo para MO 03079 y O T10 quimérico se pueden considerar claramente como lineales. El epítopo para MOR03079 ' se puede postular dentro de los aminoácidos 192-206 (VSRRFAEAACDVVHV) de CD38 mientras que para OKT10 quimérico se reconoce predominantemente una secuencia entre los aminoácidos 284 y 298 (FLQCVKNPEDSSCTS) . Estos últimos resultados confirman los datos publicados para OKT10 murina de origen (Hoshino et al., 1977), la cual postula su epítopo entre los aminoácidos 280-298. Aún asi, para una definición más precisa del epítopo y una determinación de los aminoácidos clave (los sitios de interacción antígeno-anticuerpo principales) se puede considerar un acortamiento de los péptidos VSRRFAEAACDVVHV y FLQCVKNPEDSSCTS y una exploración con alanina de ambos. Los epítopos para MOR03080 y MOR03100 se pueden considerar claramente como discontinuos dado que se reconocen varios péptidos que cubren diferentes sitios de los sitios de proteína. Estos péptidos comprenden los aminoácidos 82-94 y los aminoácidos 158-170 para MOR03080 y los aminoácidos 82-94, 142-154, 158-170, 188-200 y 280-296 para MOR03100. No obstante, se pueden postular ciertas superposiciones entre ambos epítopos dado que dos sitios diferentes se encuentran dentro de las posiciones de aminoácidos 82-94 (CQSVWDAFKGAFI ; péptido #20) y 158-170 (TWCGEFNTSKINY; péptido #58) que son reconocidos por ambos anticuerpos . Se puede considerar al epítopo para MORO3077 como claramente diferente de estos últimos dos y se puede describir como un epítopo discontinuo muítisegmentado . El epítopo incluye los aminoácidos 44-66, 110-122, 148-164, 186-200 y 202-224.
EJEMPLO 7: Ensayo de liberación/proliferación de IL-6 1. Materiales y Métodos: Se han realizado ensayos de proliferación y liberación de IL-6 de acuerdo con Ausiello et al. (2000) con las siguientes modificaciones: se purifica PBMC de donadores sanos diferentes (después de obtener consentimiento informado) por medio de centrifugación de gradiente de densidad utilizando el sistema de separación de células Histopaque de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Sigma) y se cultivan bajo condiciones estándar (C02 5%, 37°C) en medio RPMI1640, suplementado con FCS 10% y glutamina ("RPMI1640 completo") . Para ambos ensayos se utilizan los siguientes anticuerpos: anticuerpos monoclonales (Mab) HuCAL1^ anti-CD38 IgGs MOR03077 , ' MOR03079 y MOR03080, un anticuerpo monoclonal agonístico murino IgG2a (IB4; Malavasi et al.,. 1984), un anticuerpo irrelevante HuCAL IgGl, un control de isotipo pareado (IgG2a murino : anticuerpo específico a hapteno anti-trinitrofenol ; cat.#: 555571, clon G155-178; Becton Dickinson) o un control de medio. Para el ensayo de liberación de IL-6, se incuban 1.0 x 10s PBMC en 0.5 mi de medio RPMI1640 completo durante 24 h en un tubo de cultivo de 15 mi (Falcon) en presencia de 20 g/ml de anticuerpos. Los sobrenadantes de cultivo celular se cosechan y analizan para liberación de IL-6 utilizando el equipo Quantikine de acuerdo con el protocolo del fabricante (R&D systems) . Para el ensayo de proliferación se incuban 2.0 x 105 PBMC durante 3 días en una placa de fondo plano de 96 pozos (Nunc) en presencia de 20 g/ml de anticuerpos. Cada ensayo se lleva a cabo por duplicado. Después de 4 días se agrega BrdU a cada pozo y las células se incuban durante 24 h adicionales a 37°C antes de fijación de células y desnaturalización de ADN, de acuerdo con el protocolo del proveedor (Roche) . Se mide la incorporación de BrdU por medio de un anticuerpo acoplado a peroxidasa, anti-BrdU, en un ámbito basado en quimioluminiscencia . 2. Resumen y Conclusiones: Ensayo de Proliferación: Además de sus actividades catalíticas como ADP cíclico-ribosa ciclasa e hidrolasa, CD38 muestra la capacidad de transducir señales de relevancia biológica (Hoshino et a., 1997; Ausiello et al., 2000) . Estas funciones se pueden inducir in vivo, por ejemplo mediante interacciones receptor-ligando o por reticulado con anticuerpos anti-CD38. Estos eventos de señalización generan, por ejemplo, movilización de calcio, proliferación de linfocitos y liberación de citocinas. No obstante, esta señalización no sólo depende del epitopo antigénico sino también puede variar de donador a donador (Ausiello et al . , 2000) . En vista de los anticuerpos no agonistas de inmunoterapia los cuales son preferibles sobre anticuerpos agonistas. Por lo tanto, los anticuerpos HuCALm anti-CD38 ( ab MOR03077, MOR03079, MOR03080) se caracterizan adicionalmente en un ensayo de proliferación y un ensayo de liberación de IL-6 (factor de crecimiento importante para ) en comparación con el anticuerpo de referencia chOKTIO y el anticuerpo monoclonal agonista anti-CD38, IB4. Como se demuestra en la figura 11 y la figura 12, los anticuerpos HuCAL anti-CD38 Mab#l, 2 y 3 así como el anticuerpo de referencia chOKTIO y los controles negativos correspondientes muestran una inducción o proliferación nulas o muy débiles y no hay liberación de IL-6, en comparación con el anticuerpo agonista IB4.
EJEMPLO 8: Ensayo clonogénico 1. Materiales y Métodos: Se aislan PBMC que albergan células precursoras CD34+/CD38+ autólogas, de individuos sanos (después de obtener consentimiento informado) por centrifugación con gradiente de densidad utilizando el sistema de separación de células Histopague de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Sigma) y se incuban con diferentes anticuerpos HuCALMR IgGl anti-CD38 (Mab MOR03077, MOR03079 y MOR03080) y el control positivo ' (PC) chOKTIO a 10 ug/ml . El medio y el HuCALMR IgG21 irrelevante sirven como control de fondo. Cada ensayo ADCC consiste de 4.0 x 105 PBMC las cuales se incuban durante 4 h a' 37°C en medio RPMI1640 suplementado con FCS 10%. Para el ensayo clonogénico se inoculan 2.50 mi de metilcelulosa "completa" (CellSystems) con 2.5 x 105 células del ensayo ADCC y se incuban para desarrollo de colonias durante por lo menos 14 días en un ambiente controlado (37°C; C02 5%) . Las colonias se analizan por dos operadores independientes y se agrupan en BFU-E + CFU-GEMM (unidades formadoras de descarga eritroide y células pluripotenciales de granulocitos/eritroides/macrófagos/-megacariocitos) y CFU-GM . (células pluripotenciales de granulocitos/macrófagos) . 2. Resumen y Conclusiones: Dado que la expresión de CD38 no sólo se encuentra en células inmunológicas dentro de las líneas mieloide (por ejemplo monocitos, granulocitos) y linfoide (por ejemplo linfocitos B y T activados; células plasmáticas) sino también en células precursoras respectivas (CD34+/CD38+) , es importante que estas células no estén afectadas por la destrucción mediada por anticuerpo. Por lo tanto, se aplica un ensayo clonogénico con el fin de analizar aquellos efectos sobre los progenitores de CD34+/CD38+. Los PB C de donadores sanos se incuban con anticuerpos HuCALMR anti-CD38 (Mab#l, Mab#2 y Mab#3) o varios controles (anticuerpo HuCALMR irrelevante, medio y anticuerpo de referencia chOKTIO como control positivo) de acuerdo con un protocolo ADCC estándar, seguido por incubación adicional en metilcelulosa acondicionada para desarrollo de colonias. Como se muestra en la figura 13, no se muestra una reducción significativa de unidades formadoras de colonia para todos los anticuerpos HuCAL™1 anti-CD38, en comparación con un anticuerpo irrelevante o el anticuerpo de referencia.
EJEMPLO 9: Ensayos ADCC con diferentes líneas de células y células de mieloma múltiple primarias 1. Materiales y Métodos: Aislamiento y ADCC de muestras de pacientes con · MM: se obtienen aspirados de médula ósea de pacientes con mieloma múltiple (después de obtener consentimiento informado) . Se purifican las células malignas vía protocolo estándar utilizando esferas magnéticas anti-CD138 (Milteny Biotec) después de centrifugación en gradiente de densidad (Sigma) . Se lleva a cabo un ensayo ADCC como se describe en lo anterior. 2. Resumen y Conclusiones: Se utilizan varias líneas de células derivadas de diferentes cánceres en ADCC con el fin de mostrar el efecto citotóxico de los anticuerpos HuCALMR anti-CD38 sobre un espectro más amplio de líneas de células que incluyen diferentes orígenes y niveles de expresión de. CD38. Como se muestra en la figura 14, todas las células son destruidas en ADCC a concentraciones de anticuerpo constante (5 g/ml) y proporciones E:T a 30:1. También se mostró citotoxidad vía ADCC para varias muestras de mieloma múltiple de pacientes. Todos los anticuerpos HuCALMR anti-CD38 fueron capaces de realizar destrucción dependiente de la dosis de células MM y los valores CE50 varían entre 0.006 y 0.249 nM (figura 15) .
EJEMPLO 10: Análisis de reactividad cruzada por FACS e inmunoistoquímica (IHC) 1. Materiales y Métodos: IHC con amígdalas: para IHC, los Mab HuCALMR anti-CD38 y un anticuerpo control negativo irrelevante se convierten en el formato dHLX bivalente (Plückthun & Pack, 1997) . Se cortan secciones congeladas de 5 µt? de nodulos linfoides derivados de macaco de java (Macaca fascicularis) , macaco de la India (Macaca mulata) y humanos (recuperados de los archivos del Institute of Pathology of the University of Graz/austria) se cortan con criostato Leica CM3050. Los cortes se secan al aire durante 30 minutos a 1 hora y se fijan en metanol enfriado con hielo durante 10 minutos y se lavan con PBS . Para la detección del formato dHLX, se utiliza anticuerpo anti-His de ratón (Dianova) combinado con el equipo Envision (DAKO) . Para la detección de los anticuerpos de ratón anti-CD38 (por ejemplo referencia a OKT10 monoclonal de ratón) , el equipo Envison se utiliza únicamente. Análisis FACS de los linfocitos: las muestras de sangre tratadas con EDTA se obtienen de humanos sanos (después de obtener su consentimiento informado) , a partir de macaco de la India y macaco de java y se someten a centrifugación en gradiente de densidad utilizando el sistema de separación de células Histopaque, de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Sigma) . Para las células del análisis FACS de la fase límite, se incuban con -anticuerpos primarios (HuCAL anti-CD38 y ab control negativo como IgG2a murino o formato Fab, el anticuerpo murino de control positivo OKT10 y el control de isotipo coincidente) seguido por incubación con el indicador anti-M2 (Sigma; únicamente para el formato Fab) y un conjugado anti-ratón marcado con ficoeritrina (PE) (Jackson Research) . El análisis FACS se realiza en la población de linfocitos de compuerta. 2. Resumen y Conclusiones: Se analizan HuCALME anti-CD38 para reactividad cruzada entre especies de CD38. Mientras todos los Mab anti-CD38 fueron capaces de detectar CD38 humano en linfocitos en FACS e IHC, únicamente MOR03080 junto con el control positivo OKT10 mostraron una reactividad adicional con CD38 de macaco de java y macaco de la India (véase la tabla 5: análisis de reactividad cruzada). Tabla 5 Linfocitos (FACS) y nodulos linfáticos (IHC) de : Anticuerpo Humano Macaco de java Macaco de la India Mab#l ++ - - Mab#2 ++ - - Mab#3 ++ ++ ++ PC ++ ++ ++. NC - - - ++: tinción positiva fuerte; - sin tinción; NC: control negativo; PC_ control positivo (= cMAb de referencia) EJEMPLO 11: Tratamiento de xenoinj ertos de mieloma humano en ratones (utilizando la línea celular RPMI8226) con MOR03080 1. Establecimiento del modelo subcutáneo en ratón: Se establece como sigue un modelo subcutáneo en ratón para la línea de célula de tumor derivado de mieloma humano RPMI8226 en ratones C.B-17-SCID hembra, por Aurigon Life Science GmbH (Tutzing, Alemania); en el día -1, 0 y 1, se aplican intravenosamente anticuerpos policlonales anti-asialo GM1 (ASGM) (WAKO-Chemicals) , los cuales suprimen células NK xenorreactivas en ratones SCID, con el fin de- desactivar cualquier inmunorreactividad específica residual en ratones C.B-17-SCID. En el día 0, se inoculan subcutáneamente 5 x 106 o 1 x 107 células tumorales RPMI8226 en 50 µ? de PBS, en el flanco derecho de los ratones deshidratados con ASGM (como se describe en lo anterior) o no tratado (cada grupo consiste de 5 cinco ratones) . ' El desarrollo de tumores similar en la totalidad de los cuatro grupos inoculados sin que se encuentre diferencia significativa para el tratamiento con o sin anticuerpos anti-asialo GM1 o por inoculación de números de células diferentes . El tumor parece ser de crecimiento lento con tendencia al estancamiento u oscilación en el' tamaño, durante ciertos días. Dos tumores oscilaron en tamaño durante todo el período de investigación, y un tumor incluso presentó recidiva y desapareció totalmente de un volumen pico de 321 mm3. El estudio de tratamiento con este modelo de tumor puede incluir un número elevado de animales inoculados por tumor por grupo. 2. Tratamiento con MOR03080: 2.1 Objetivo del estudio Este estudio se realiza por Aurigon Life Science GmbH (Tutzing, Alemania) , para comparar la eficacia antitumoral de anticuerpos aplicados intraperitonealmente (HuCALMR anti-CD38) en comparación con tratamiento con vehículo (PBS) . Se prueba el anticuerpo humano hMOR03080 (isotipo IgGl) en diferentes cantidades y protocolos de tratamiento. Además se prueba el anticuerpo quimérico chMOR03080 (isotipo IgG2a: un anticuerpo quimérico que comprende las regiones variables de MOR03080 y las regiones constantes murinas construidas de una manera similar a la descrita en el ejemplo 5 para OKT10 quimérico (VH/VL murino y regiones constantes humanas) ) . La línea de células de cáncer RPMI8226 ha sido seleccionada como un modelo y se inoculó subcutáneamente en ratones SCID hembra, como se describe en lo anterior. Los criterios de valoración en el estudio fueron el peso corporal (b.w.), el volumen' de tumor y los signos clínicos. 2.2 Anticuerpos y vehículo Los anticuerpos se proporcionan listos para usarse por Aurigon a concentraciones de 2.13 mg/ml (MOR03080 hlgGl) y 1.73 mg/ml (MOR03080 chIgG2a) , y se almacenan a -80°C hasta su aplicación. Los anticuerpos se recaíientan y diluyen con PBS hasta la concentración final respectiva. Se proporcionan vehículo (PBS) listo para utilizarse a Aurigon y se almacena a 4°C hasta su aplicación. 2.3 Especificación de animales Especie : ratón Cepa: Fox chase C.B-17-scid (C-B-Igh. Ib/lcrTac) Número y sexo: 75 hembras Proveedor: Taconic M&B, Bomholtvej 10, DK-8680 Ry Estado de salud: SPF Peso solicitado: aproximadamente 18 g Aclimatación: 9 días 2.4 Línea de células tumorales Las células tumorales (línea de células RPMI8226) se hacen crecer y transportar a Auriton Life Science GmbH, en donde las células se dividen y se hacen crecer por otro ciclo. Aurigon preparó las células para inyección en el día de inoculación. El medio de cultivo utilizado para propagación de células es RPMI1640 suplementado con FCS 5%, L-Glutamina 2 mM y PenStrep. Las células no mostraron velocidad de crecimiento o comportamiento inesperados . Para inoculación, las células tumorales se suspenden en PBS y se ajustan a una concentración final de 1 x 107 células/50 µ? en PBS. La suspensión de células tumorales se mezcla perfectamente antes de ser inyectadas, 2.5 Procedimiento Experimental En el día 0, se inoculan subcutáneamente 1 x 107 células tumorales RPMI8226 en el flanco dorsal derecho de 75 ratones SCID. Se genera un primer grupo con 15 animales seleccionados aleatoriamente (grupo 5) directamente después de la inoculación. Este grupo se trata con 1 mg/kg b.w. de hIgGl-MOR03080 cada segundo día entre los días 14 y 36. A partir de todos los otros 60 animales se generan 4 grupos con 10 animales en cada grupo en el día 31 (volumen de tumor de aproximadamente 92 mm3) . Los grupos 1-4 se generan con medias comparables en los tamaños de tumor y desviaciones estándar. Se selecciona un grupo adicional de 5 animales (grupo 6) que muestra volúmenes de tumor relativamente pequeños (volumen de tumor de aproximadamente 50 mm3) para comparación con un grupo 5 pretratado (todos los ratones excepto 3 muestran volúmenes de tumor de menos de 10 mm3, uno con aproximadamente 22 mm3, uno con -aproximadamente 44 mm3 y uno con aproximadamente 119 mm3) . Los grupos 1 a 4 fueron tratados cada segundo día, desde el día 32 al día 68 ya sea con PBS (vehículo; grupo 1) , 1 mg/kg b.w. de hIgGl-MOR03080 (grupo 2) o 5 mg/kg b.w. de hIgGl-MOR03080 (grupo 3), o con 5 mg/kg b.w. de chIgG2a-MOR03080 (grupo 4) . El grupo 6 no recibió tratamiento alguno (véase tabla 6) . Los volúmenes de tumor, el peso corporal y los signos clínicos se midieron dos veces a la semana hasta el final del estudio.
Tabla 6 Grupo No. de Tipo de Sustancia Protocolo Dosis de Volumen de animales aplicación tratamiento aplicación [mg/kg] [pg/kl] 1 10 i.p. vehículo Cada segundo día 10 (PBS) entre el día 32 y el día 68 2 10 i.p. lgG1 humana Cada segundo día 1 10 MOR03080 entre el día 32 y el día 68 3 10 i.p. lgG1 humana Cada segundo día 5 10 MOR03080 entre el día 32 y el día 68 4 10 i.p. lgG2a Cada segundo día 5 10 quimérico entre el día 32 y el MOR03080 día 68 5 15 i.p. lgG1 humana Cada segundo día 1 10 MOR03080 entre el día14 y el día 36 6 5 ~ — — — — 2.6 Resultados Observaciones clínicas de mortalidad No se observaron hallazgos clínicos o mortalidad relacionados con tumor específico o sustancia . En el grupo 3 (hlgGl 5 mg/kg) cuatro animales murieron durante la toma de muestra de sangre (uno en el día 3, uno en el día 34; dos en el día 52) . En el grupo 4 (muIgG2a 1 mg/kg) un solo animal murió durante la muestra de toma de sangre (día 34) . Todos los demás animales que murieron durante el estudio se mataron debido al tamaño del tumor.
Desarrollo del peso corporal No se observó interferencia relacionada con el medicamento y con el desarrollo del peso, en comparación con el grupo 1 (vehículo) . El peso corporal es alterado de manera notable por la toma de muestra de sangre en los grupos 3 (hlgGl 5 mg/kg) y 4 (muIgG2a 5 mg/kg) . Pese a tales interrupciones, la ganancia de peso medio de todos los grupos es continua.
Desarrollo de tumor (véase la figura 16) En el grupo 1 (vehículo) se encontró el crecimiento de tumor a la velocidad esperada con un progreso lento. Dado que esta línea de células tiene valores de desviación estándar pronunciados para el tumor más grande y el más pequeño, estos se han excluido del análisis estadístico posterior. El crecimiento de tumor de los animales en el grupo 1 es comparable con el crecimiento del tumor en el grupo 6 (no tratado) , aunque este grupo comenzó con un volumen medio de tumor menor en el día 31. El tratamiento probablemente tenga una ligera influencia sobre la velocidad de crecimiento del tumor. En el grupo 1, dos ratones tuvieron que ser matados antes del día 83 debido al tamaño del tumor, y además uno antes del día 87, de manera que el valor medio del volumen de tumor ya no es representativo después del día 80. En el grupo 6, un ratón tuvo que ser matado antes del día 80 debido al tamaño del tumor, dos ratones antes del día 83 y uno adicional antes del día 87, de manera que el valor medio del volumen de tumor ya no es representativo después del día 76. En el grupo 2, tratado con 1 mg/kg b.w. de hlgGl, se tuvo que excluir un animal del análisis adicional debido a que el tumor creció en tejido muscular y esto habitualmente aumenta la velocidad de crecimiento del tumor. En comparación con el grupo 1 control (vehículo) , el tamaño medio del tumor comenzó a diferir significativamente a partir del día 45 hasta el final del estudio. No se observó crecimiento de tumor incrementado después del fin del tratamiento (día 68) . Los animales del grupo 3 (5 mg/kg b.w. hlgGl) mostraron una disminución notable en el crecimiento del tumor en comparación con el grupo 1 (vehículo) , lo que demostró presentar significancia estadística con el día 38 hasta el día 83. El volumen de tumor medio comenzó a regresar fuertemente aproximadamente dos semanas después del tratamiento. Uno de los 10 tumores desapareció en el día 45 y no volvió a crecer hasta 19 días después de finalización del tratamiento. horas después del final del tratamiento. El mejor desempeño de todos los grupos de tratamiento comenzó con 92 mm3 de volumen de tumor y se encontró en el grupo 4 (5 mg/kg b.w. muIgG2a) en donde el volumen medio de tumor mostró una regresión clara y los tumores incluso desaparecieron en cuatro animales al final del período de observación. La diferencia del volumen de tumor medio del grupo 1 (vehículo) es ligeramente significativo, comenzando desde el día 38 hasta el final del estudio. El tratamiento temprano con 1 mg/kg b.w. hlgGl entre los días 14 y 36 (grupo 5) mostró un efecto temprano así como de larga duración en el desarrollo del tumor. Se excluyó un animal del análisis posterior dado que el tumor creció en el tejido muscular. En el día 31, sólo cinco animales presentaban tumores mensurables en el sitio de inoculación, en comparación con el resto de los animales inoculados, en donde sólo 2 de los 60 no respondieron a la inoculación del tumor. El progreso del tumor se retrasó en aproximadamente 31 días (comparación del día 52 del grupo control 1 con el día 83 del grupo 5) . Aproximadamente 50% de los animales no mostraron tumores en el sitio de inoculación al final del estudio. 2.7 Conclusión No se observaron hallazgos clínicos relacionados con el tumor o la sustancia, específicos, o la mortalidad, en la comparación con el grupo 1 (control) . No se observó interferencia relacionada con el medicamento y el desarrollo de peso. El crecimiento de tumor de las células tumorales RP I8226 después del tratamiento se redujo en el orden de eficiencia: hlgGl 1 mg/kg, 14-36 días cada segundo día (grupo 5) > muIgG2a 5 mg/kg 32-68 días cada segundo día (grupo 4) > hlgGl 5 mg/kg 32-68 días cada segundo día (grupo 3) · > hlgGl 1 mg/kg 32-68 días cada segundo día (grupo 2) . En los grupos 2 a 4, la media de los volúmenes de tumor nuevamente se incrementó después del final del tratamiento en grados diversos .
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Claims (84)

REIVINDICACIONES
1. Anticuerpo aislado humano o humanizado o fragmento funcional del mismo, que comprende una región que une antígeno que es específica para un epítopo de CD38 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 22) , en donde dicho anticuerpo o . fragmento funcional del mismo es capaz de mediar la destrucción de una célula objetivo (CD38+ por ADCC con una eficacia por lo menos cinco veces mejor en comparación con OKT10 quimérico (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 23 y 24) bajo las mismas condiciones o sustancialmente las mismas, cuando se utiliza una célula PBMC humana como una célula efectora, en donde dicha célula objetivo CD38+ se selecciona del grupo que consiste de LP-1 (DSMZ: ACC41) y RPMI-8226 (ATCC: CCL-155) , y en donde la proporción de células efectoras respecto a célula objetivo está entre aproximadamente30 : 1 y aproximadamente 50:1.
2. Región aislada de un anticuerpo, que une antigeno, o fragmento funcional de la misma, como se describe en la reivindicación 1.
3. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 2, la cual comprende una región H-CDR3 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5, 6, 7 u 8.
4. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 3 , que comprende además una región H-CDR2 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5, 6, 7 u 8.
5. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 4, que comprende además una región H-CDR1 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5, 6, 7 u 8.
6. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 5, la cual comprende una cadena pesada variable que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5, 6, 7 u 8.
7. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 2, la cual comprende una región L-CDR3 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13, 14, 15 ó 16.
8. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 7, que comprende además una región L-CDR1 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13, 14, 15 ó 16.
9. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 8, que comprende además una región L-CDR2 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13, 14, 15 ó 16.
10. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 9 , la cual comprende una cadena ligera variable que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13, 14, 15 ó 16.
11. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 2, la cual comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se selecciona del grupo que consiste de: (i) las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5, 6, 7 u 8; y (ii) una secuencia que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia en las regiones CDR con las regiones CDR que se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5, 6, 7 u 8.
12. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 2 , la cual comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se selecciona del grupo que consiste de: (i) SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13, 14, 15 ó 16; y (ii) una secuencia que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia en las regiones CDR con las regiones CDR que se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13, 14, 15 ó 16.
13. Anticuerpo aislado como se describe en la reivindicación 1, el cual es una IgG.
14. Anticuerpo aislado como se describe en la reivindicación 13 , el cual es una IgGl .
15. Anticuerpo aislado humano o humanizado o fragmento funcional del mismo, que comprende una región que une antígeno que es específica para un epítopo de CD38 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 22), en donde el anticuerpo o fragmento funcional del mismo es capaz de mediar la destrucción de una célula CHO transfectada con CD38 por CDC con una eficacia por lo menos dos veces mejor en comparación con OKT10 quimérico (SECUENCIAS DE IDENTIFICACÓN NÚMEROS: 23 y 24) bajo las mismas condiciones o sustancialmente las mismas.
16. Región aislada de un anticuerpo, que une antígeno, o un fragmento funcional de la misma, como se describe en la reivindicación 15.
17. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 16, la cual comprende una región H-CDR3 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5, 6 ó 7.
18. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 17 , que comprende además una región H-CDR2 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5, 6 ó 7.
19. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 18, que comprende además una región H-CDR1 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5, 6 ó 7.
20. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 19, la cual comprende una cadena pesada variable que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5, 6 ó 7.
21. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 16, que comprende una región L-CDR3 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÍJMEROS: 13, 14 ó 15.
22. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 21, que comprende además una región L-CDR1 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13, 14, ó 15.
23. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 22, que comprende además una región L-CDR2 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13, 14 ó 15.
24. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 23, la cual comprende una cadena ligera variable que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13, 14 ó 15.
25. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 16, la cual comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se selecciona del grupo que consiste de: (i) las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5, 6 ó 7; y (ii) una secuencia que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia en las regiones CDR con las regiones CDR que se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NUMEROS: 5, 6 ó 7.
26. Región aislada que une antígeno, como se describe en la reivindicación 16, la cual comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se selecciona del grupo que consiste de: (i) SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13, 14 ó 15; y (ii) una secuencia que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia en las regiones CDR con las regiones CDR que se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS : 13, 14 ó 15.
27. Anticuerpo aislado como se describe en la reivindicación 15, el cual es una IgG.
28. Anticuerpo aislado como se describe en la reivindicación 27, el cual es una IgGl .
29. Anticuerpo aislado humano o humanizado o fragmento funcional del mismo, que comprende una región que une antígeno que es específica para un epítopo de CD38, en donde el epítopo comprende uno o más residuos aminoácidos de los residuos aminoácidos 1 a 215 de CD38 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 22) .
30. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en. la reivindicación 29, en donde el epítopo comprende uno o más residuos aminoácidos comprendidos en una o más secuencias de aminoácidos que se toman de la lista de secuencias de aminoácidos 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170 y 192-206 de CD38.
31. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 29, en donde el epítopo es un epítopo lineal.
32. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 31, en donde la región que une antígeno comprende una región H-CDR3 que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6.
33. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 32, en donde la región que une antígeno comprende además una región H-CDR2 que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6.
34. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 33, en donde la región que une antígeno comprende una región H-CDR1 que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6.
35. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 31, el cual comprende una cadena pesada variable- que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6.
36. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 31, en donde la región que une antígeno comprende una región L-CDR3 que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 14.
37. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 36, en donde la región que une antígeno comprende además una región L-CDR1 que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 14.
38. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 37, en donde la región que une antígeno comprende además una región L-CDR2 que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 14.
39. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 31, en cual comprende una cadena ligera variable que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 14.
40. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 31, el cual comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se selecciona del grupo que consiste de: (i) SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6; y (ii) una secuencia que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia en las regiones CDR con las regiones CDR que se muestran en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 6.
41. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 31,' el cual comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se selecciona del grupo que consiste de: (i) SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 14; y (ii) una secuencia que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia en las regiones CDR con las regiones CDR que se muestran en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 14.
42. Fragmento funcional aislado, como se describe en la reivindicación 31, el cual es un fragmento de anticuerpo Fab o scFv.
43. Anticuerpo aislado, como se describe en la reivindicación 31, el cual es una IgG.
44. Anticuerpo aislado, como se describe en la reivindicación 43, el cual es una IgGl .
45. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 29, en donde el epítopo es un epítopo conformacional .
46. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 45, en donde la región que une antígeno comprende una región H-CDR3 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5, 7 u 8.
47. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 46, en donde la región que une antígeno comprende además una región H-CDR2 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5, 7 u 8.
48. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 47, en donde la región que une antígeno comprende además una región H-CDR1 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS : 5, 7 u 8.
49. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 45, el cual comprende una cadena pesada variable que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NUMEROS: 5, 7 u 8.
50. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se ' describe en la reivindicación 45, en donde la región que une antígeno comprende una región L-CDR3 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13, 15 ó 16.
51. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 50, en donde la región que une antígeno comprende además una región L-CDR1' que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13, 15 ó 16.
52. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 51, en donde la región que une antígeno comprende además una región L-CDR2 que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13, 15 ó 16.
53. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 45, el- cual comprende una cadena ligera variable que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13, 15 ó 16.
54. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 45, el cual comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se selecciona del grupo que consiste de: (i) las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5, 7 u 8; y (ii) una secuencia que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia en las regiones CDR con las regiones CDR que se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5, 7 u 8.
55. Anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, como se describe en la reivindicación 45, el cual comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se selecciona del grupo que consiste de: (i) las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13, 15 ó 16; y (ii) una secuencia que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia en las regiones CDR con las regiones CDR que se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 13, 15 ó 16.
56. Fragmento funcional aislado, como se describe en la reivindicación 45, el cual es un fragmento de anticuerpo Fab o scFv.
57. Anticuerpo aislado, como se describe en la reivindicación 45, el cual es una IgG.
58. Anticuerpo aislado, como se describe en la reivindicación 57, el cual es una IgGl.
59. Cadena pesada variable de un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que es codificado por: (i) una secuencia de ácido nucleico que comprende las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NUMEROS: 1, 2, 3 ó 4, o (ii) secuencias de ácido nucleico que hibridizan bajo condiciones de alta rigurosidad con la cadena complementaria de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS : 1, 2, 3 ó 4, en donde el anticuerpo o fragmento funcional del mismo es específico para un epítopo de CD38.
60. Cadena ligera variable de un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que es codificada por: (i) una secuencia de ácido nucleico que comprende las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 9, 10, 11 ó 12 o (ii) secuencias de ácido nucleico que hibridizan bajo condiciones de alta rigurosidad para la cadena complementaria de las SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 9, 10, 11 ó 12, en donde el anticuerpo o fragmento funcional del mismo es especifico para un epítopo de CD38.
61. Secuencia aislada de ácido nucleico que codifica para una región que une antígeno de un anticuerpo humano o fragmento- funcional del mismo que es específico para un epítopo de CD38.
62. Secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena pesada variable de un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, el cual comprende: (i) una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS : 1, 2, 3 y 4, o (ii) una secuencia de ácido nucleico que hibridiza bajo condiciones de alta rigurosidad con la cadena complementaria de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1, 2, 3 ó 4, en donde el anticuerpo o fragmento funcional del mismo es específico para un epítopo de CD38.
63. Secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena ligera variable de un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, la cual comprende (i) una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 9, 10, 11 y 12 o (ii) una secuencia de ácido nucleico que hibridiza bajo condiciones de alta rigurosidad con la cadena complementaria de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 9, 10, 11 ó 12, en donde el anticuerpo o fragmento funcional del mismo es específico para un epítopo de CD38.
64. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 61-63.
65. Célula aislada que comprende un vector como se describe en la reivindicación 64.
66. Célula aislada como se describe en la reivindicación 65, en donde la célula es bacteriana.
67. Célula aislada como se describe en la reivindicación 65, en donde la célula es de mamífero.
68. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento funcional como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1, 15 y 29 y un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente para el mismo.
69. Método para tratar un trastorno o condición relacionado con la presencia no deseada de células CD38+, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica como se describe en la reivindicación 68.
70. Método como se describe en la reivindicación 69, en donde el trastorno o condición es una enfermedad hematológica .
71. Método como se describe en la reivindicación 70, que se toma de la lista de mieloma múltiple, leucemia linfocitica crónica, leucemia mielógena crónica, leucemia mielógena aguda y leucemia linfocitica aguda.
72. Método como se describe en la reivindicación 69, en donde el trastorno o condición es una enfermedad inflamatoria.
73. Método como se describe en la reivindicación 72, tomado de la lista de artritis reumatoide y- lupus eritematoso sistémico.
74. Método para dirigirse a células CD38+ en un sujeto o una muestra de células, que comprende la etapa de permitir que las células CD38+ se pongan en contacto con un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1, 15 y 29.
75. Método de utilización de un epítopo de CD38 para aislar un anticuerpo humano o humanizado o un fragmento funcional del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende una región que une antígeno que es específica para dicho epítopo, y en donde el método comprende las etapas de: a) poner en contacto el epítopo de CD38 con un biblioteca de anticuerpo; y b) aislar el anticuerpo o fragmento funcional del mismo; en donde el epítopo es un epítopo lineal.
76. Método como se describe en la reivindicación 75, en donde el epítopo lineal comprende lós residuos aminoácidos 192-206.
77. Método de utilización de un epítopo de CD38 para aislar un anticuerpo humano o humanizado o un fragmento funcional del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende una región que une antígeno que es específica para el epítopo y en donde el método comprende las etapas de: a) poner en contacto el epítopo con CD38 con una biblioteca de anticuerpo; y b) aislar el anticuerpo o fragmento funcional del mismo, en donde el epítopo es un epítopo conformacional .
78. Método como se describe en la reivindicación 77, en donde el epítopo conformacional comprende una o más secuencias de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de los aminoácidos 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, 192-206 y 202-224 de CD38.
79. Epítopo aislado de CD38 que consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de los aminoácidos 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, 192-206 y 202-224 de CD38.
80. Epítopo aislado de CD38 que consiste de una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de los aminoácidos 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, 192-206 y 202-224 de CD38.
81. Equipo que comprende un epítopo aislado de CD38 que comprende uno o más cadenas de aminoácidos tomados de la lista de 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, 192-206 y 202-224 y una biblioteca de anticuerpo e instrucciones para uso.
82. Anticuerpo humano como se . describe en cualquiera de las reivindicaciones 1, 15 ó 29, en donde el anticuerpo humano es un anticuerpo humano sintético.
83. Región aislada que une antígeno, como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 11, 12, 25 y 26, en donde la identidad de secuencias de por lo menos 80%.
84. Anticuerpo aislado o fragmento "funcional del mismo, como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 40, 41, 54 y 55, en donde la identidad de secuencia es de por lo menos 80%.
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