ES2331891T3 - Vairantes de procesamiento de cd38 y usos de las mismas. - Google Patents
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Abstract
Variante de procesamiento de CD38 purificada que comprende el polipéptido de secuencia SEC ID nº 1.
Description
Variantes de procesamiento de CD38 y usos de las
mismas.
La presente invención se refiere de manera
general a los campos de la biología molecular y de la inflamación.
Más específicamente, la presente invención se refiere a la
identificación de nuevas variantes de CD38 y a usos de las
mismas.
Los linfocitos T que portan el receptor CD4
(CD4^{+}), denominados células T CD4^{+}, incrementan la
respuesta inmunológica mediante la secreción de citoquinas que
estimulan una respuesta de células T citotóxicas (células T
ayudantes 1) o una respuesta de anticuerpos (células T ayudantes 2).
Las células T CD4^{+} no expuestas pueden diferenciarse para
formar células Th1 o Th2 tras la formación del complejo péptido
TCR-MHC de clase II, dependiendo de las citoquinas
existentes en el ambiente. De esta manera, las células T CD4^{+}
desempeñan un papel crítico en las respuestas inmunológicas
mediadas por las células T. Los nuevos genes que funcionan en la
activación de las células T podrían proporcionar nuevas dianas
farmacológicas para las enfermedades autoinmunológicas e
inflamatorias. Por consiguiente, se considera importante la
identificación y caracterización de nuevos genes implicados en la
activación de las células T CD4^{+}.
CD38 es un antígeno de superficie celular
multifuncional con actividad en la adhesión celular, la transducción
de señales y la señalización del calcio. CD38 cataliza la
producción de ADP ribosa cíclica (ADPRc) a partir de su sustrato,
NAD^{+} (Takasawa, S. et al., J. Biol. Chem.
268:26052-26054, 1993). La ADPRc actúa como segundo
mensajero que regula la liberación del calcio intracelular. CD38 se
expresa en células hematopoyéticas, incluyendo linfocitos T,
linfocitos B y neutrófilos. Los ratones CD38 -/- muestran una
pérdida completa de actividad de NAD+ glicohidrolasa asociada a
tejidos y muestran deficiencias marcadas en las respuestas de
anticuerpos frente a proteínas antígenos dependientes de células T
(Cockayne et al., Blood 92:1324-1333, 1998).
CD38 controla la quimiotaxis de neutrófilos a quimioatrayentes
bacterianos mediante la producción por parte de las mismas de
ADP-ribosa cíclica, y actúa como un regulador
crítico de la inflamación y de las respuestas inmunológicas innatas
(Partida-Sánchez S. et al., Nat. Med.
7:1209-16, 2002). El ADNc humano de CD38 se clonó
por primera vez en 1990, y codifica 300 aminoácidos (Jackson, D.G.,
Bell, J.I., J. Immun. 144:2811-2815, 1990). Se ha
informado de que el gen CD38 se encuentra presente en una única
copia y que se extiende a lo largo de más de 62 kb. Consiste de 8
exones y 7 intrones, incluyendo un intrón largo que interrumpe la
región codificante 5' (Ferrero, E.; Malavasi, F., J. Immun.
159:3858-3865, 1997). La estructura de la proteína
CD38 no se conoce.
Es conocido que los antígenos de superficie
celular, tales como CD38, presentan diferentes isoformas que son
estructural y funcionalmente diferentes entre sí. Por ejemplo,
CXCR-3 presenta dos isoformas, CXCR3A y
CXCR3-B, que se ha encontrado que presentan
diferentes actividades biológicas y que desencadenan diferentes
rutas de transducción de señales. CXCR3-B muestra
afinidad elevada únicamente para CXCL4, mientras que
CXR3-A, no (Lasagni, L. et al., J. Exp. Med.
197:1537-49, 2003).
La patente US nº 6.607.879 B1 da a conocer un
sistema basado en micromatrices que comprende una "pluralidad"
de sondas de ADNc, sondas que se utilizan como elementos hibridables
para la detección de alteraciones de la expresión de los genes en
muestras biológicas. Se da a conocer que CD38 es un gen de entre
1.507 otros genes, el nivel de expresión de los cuales se cree que
resulta afectado por determinadas enfermedades, incluyendo
inmunopatologías, enfermedad de Crohn, asma, colitis ulcerosa,
síndrome del intestino irritable y artritis reumatoide.
Una isoforma de procesamiento del ADNc de CD38
que únicamente codifica 122 residuos aminoácidos se ha aislado a
partir de una biblioteca de testículo humano (Nata, K. et
al., Gene 186:285-292, 1997).
Lund et al., Immun. Rev.
161:79-93, 1998, describen CD38 como una
glucoproteína transmembranal de tipo II que se expresa
extensivamente sobre células de linaje hematopoyético y no
hematopoyético. También dan a conocer mutantes de CD38 para
análisis funcionales de este receptor. Los autores sugieren que la
señalización a través de CD38 representa un paradigma en la
transducción de señales linfocitarias y se refiere a la comunicación
extracelular y no intracelular.
Los anticuerpos, especialmente los anticuerpos
monoclonales contra CD38 humanizados, se dan a conocer en el
documento US nº 2002/0164788 A1. Dichos anticuerpos se comentan para
el tratamiento del cáncer, por ejemplo del mieloma múltiple y del
linfoma, y de enfermedades autoinmunológicas, por ejemplo la
artritis reumatoide.
El documento WO nº 94117184 A1 da a conocer
anticuerpos contra CD38 y propone que las respuestas fisiológicas
de los linfocitos pueden estar moduladas por dichos anticuerpos que
actúan contra CD38 y por un dominio extracelular soluble de CD38
con una longitud de 259 aminoácidos. También se comenta que podría
utilizarse una fusión de un dominio extracelular soluble de CD38
con, por ejemplo, una proteína "señalizadora", para el cribado
de moduladores farmacológicos de la actividad de CD38. Sin embargo,
este dominio extracelular de CD38 no es idéntico a la variante de
procesamiento relevante para la invención que se comenta en la
presente memoria.
El documento WO nº 00/14116 A1 da a conocer la
idea de que una combinación de los denominados péptidos receptores
de células T y los denominados péptidos marcadores de activación de
las células T puede utilizarse para el tratamiento de enfermedades
autoinmunológicas mediadas por células T, por ejemplo la artritis
reumatoide o la esclerosis múltiple. Dichos péptidos marcadores de
activación de las células T, de longitud comprendida entre 15 y 30
aminoácidos, podrían derivarse a partir de dominios extracelulares
de diferentes receptores, entre ellos CD38. Sin embargo, no existe
ninguna divulgación específica de regiones determinadas de CD38 que
puedan aplicarse eficazmente a dicho fin determinado.
El descubrimiento de una nueva isoforma de CD38
y de polinucleótidos codificantes de la misma satisface una
necesidad de la técnica mediante la provisión de nuevas
composiciones que pueden utilizarse en el tratamiento, prevención y
diagnóstico de enfermedades autoinmunológicas e inmunológicas.
La invención proporciona un polipéptido
purificado denominado en la presente invención CD38JL que es una
variante de procesamiento de CD38 que comprende el polipéptido de
81 aminoácidos de secuencia SEC ID nº 1. Los residuos aminoácidos 1
a 57 de la secuencia SEC ID nº 1 corresponden a residuos aminoácidos
que se encuentran en la secuencia de CD38 y a los que se asocia la
actividad de la ADP-ribosilciclasa.
Asimismo, la invención proporciona un fragmento
de polipéptido purificado de CD38JL que comprende los residuos 58 a
81 de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 1.
Además, la invención proporciona un
polinucleótido aislado y purificado codificante de la variante de
procesamiento CD38 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID
nº 1 o un fragmento de la secuencia SEC ID nº 1 que comprende los
residuos aminoácidos 58 a 81 de la secuencia SEC ID nº 1.
La invención también proporciona un vector de
expresión que contiene por lo menos un polinucleótido codificante
de la variante de procesamiento de CD38 que consiste de la secuencia
de aminoácidos SEC ID nº 1 o de los residuos aminoácidos 58 a 81 de
la secuencia SEC ID nº 1. En otra realización, el vector de
expresión se encuentra contenido en una célula huésped.
Un objetivo de la invención es un método para
tratar la IBD (enfermedad intestinal inflamatoria), que comprende
la etapa de administrar en un paciente que lo necesita una cantidad
terapéuticamente eficaz de polipéptido inhibidor o de antagonista
de la variante de procesamiento CD38JL.
Un objetivo adicional de la invención es un
método para tratar la IBD (enfermedad intestinal inflamatoria) que
comprende la etapa de administrar en un paciente que lo necesita una
cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de la variante de
procesamiento CD38JL.
La presente invención también proporciona una
composición farmacéutica que comprende una variante de procesamiento
purificada de CD38 de secuencia SEC ID nº 1 conjuntamente con un
portador farmacéutico adecuado.
Un objetivo adicional de la invención es un
método para tratar o prevenir la IBD, la soriasis, la artritis
reumatoide o enfermedades autoinmunológicas, comprendiendo dicho
método las etapas de administrar en un paciente que lo necesita una
cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor y/o de un
antagonista de CD38JL.
Otro objetivo de la invención se refiere a un
método para tratar una enfermedad inflamatoria en un ser humano,
que comprende la etapa de administrar en un paciente que necesita
dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente aceptable de un
inhibidor de CD38JL. Dicho tipo de método de tratamiento
probablemente resulta útil en el tratamiento de la IBD, la
soriasis, la artritis reumatoide y las enfermedades
autoinmunológicas.
La invención también proporciona un método para
detectar una secuencia polinucleótida codificante de la variante de
procesamiento de CD38 definida por la secuencia SEC ID nº 1 en una
muestra biológica que contiene ácidos nucleicos, comprendiendo
dicho método las etapas siguientes:
(a) hibridar el complemento del polinucleótido
codificante del polipéptido que comprende la secuencia SEC ID nº 1
o un fragmento de la secuencia SEC ID nº 1 con por lo menos uno de
los ácidos nucleicos de la muestra biológica, formando de esta
manera un complejo de hibridación, y
(b) detectar el complejo de hibridación, en
donde la presencia del complejo de hibridación se correlaciona con
la presencia de un polinucléotido codificante de CD38, en la muestra
biológica.
Otros aspectos, características y ventajas de la
presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción
siguiente de las realizaciones actualmente preferentes de la
invención.
La fig. 1 muestra la secuencia del clon
LJ-2 de ADNc codificante de CD38JL.
La fig. 2 muestra el mapeado cromosómico del
clon LJ-2 de ADNc.
La fig. 3 muestra una alineación de la secuencia
polipeptídica de CD38JL y CD38.
La fig. 4 muestra el perfil de expresión del
ARNm de AI989354 en tejidos humanos normales.
La fig. 5 muestra la expresión del ARNm de
AI989354 en diversos tejidos inflamados frente a la expresión en
tejidos normales.
La fig. 6 muestra el perfil de expresión del
ARNm de AI989354 en células T CD4^{+} estimuladas y no estimuladas
según mediciones realizadas con matrices Affymatrix U95
GeneChip.
La fig. 7 muestra el marco de lectura abierto
más largo predicho para el clon de ADNc LJ-2 (que se
inicia en MET).
La fig. 8 muestra la alineación del marco de
lectura abierto más largo de la variante de procesamiento
LJ-2 de CD38.
\vskip1.000000\baselineskip
Se entiende que la presente invención no se
encuentra limitada a ningún protocolo, herramienta ni reactivo en
particular, tal como se describe, y que estos pueden variar. También
se entiende que la terminología utilizada en la presente invención
presenta el fin de únicamente describir realizaciones particulares y
que no pretende limitar el alcance de la presente invención.
A menos que se indique lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención
pretenden presentar los mismos significados entendidos comúnmente
por un experto ordinario en la materia de la invención.
La utilización de las formas singulares de los
términos, "un" o "una" y "el" o "la" incluyen
las referencias plurales, a menos que el contexto indique
claramente lo contrario.
De acuerdo con la presente invención pueden
utilizarse técnicas convencionales de biología molecular,
microbiología y de ADN recombinante bien conocidas de la técnica, y
que se describen en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 (en lo
sucesivo, "Maniatis"), y por Silhavy, T.J., Bennan, M.L. y
Enquist, L.W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor
Laboratory Cold Press Spring Harbor, N.Y., 1984, y por Ausubel, F.M.
et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado
por Greene Publishing Assoc. Y Wiley-Interscience,
1987. "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J.
Higgins, editores, 1985], "Transcription and Translation"
[B.D. Hames & S.J. Higgins, editores, 1984], "Animal Cell
Culture" [R.I. Freshney, editor, 1986], "Immobilized Cells And
Enzymes" [IRL Press, 1986], B. Perbal, "A Practical Guide To
Molecular Cloning", 1984. Por lo tanto, en el caso de que
aparezcan en la presente memoria, los términos siguientes
presentarán las definiciones proporcionadas posteriormente.
Las secuencias de nucleótidos se presentan en la
presente memoria en forma de cadenas individuales, en la dirección
5' a 3', de izquierda a derecha, utilizando los símbolos de una
letra de los nucleótidos que se utilizan comúnmente en la técnica y
de acuerdo con las recomendaciones de la IUPAC-IUB
Biochemical Nomenclature Commission (Biochemistry
11:1726-1732, 1972).
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "CD38JL" se refiere a las secuencias de
aminoácidos de la variante CD38 sustancialmente purificada e
identificada en la presente memoria, de cualquier especie y
preferentemente de especies de mamífero, incluyendo el ser humano,
de cualquier fuente y natural o sintética.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "polipéptido" se utiliza intercambiablemente con
secuencias de residuos aminoácidos o proteínas y se refiere a
polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Estos términos
también incluyen proteínas que se modifican
post-traduccionalmente mediante reacciones que
incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la glucosilación, la
acetilación, la fosforilación o el procesamiento de las proteínas.
Las modificaciones y cambios, por ejemplo las fusiones con otras
proteínas, o las sustituciones, deleciones o inserciones de
secuencias de aminoácidos, pueden realizarse en la estructura de un
polipéptido manteniendo la molécula su actividad biológica
funcional. Por ejemplo, pueden realizarse determinadas sustituciones
en la secuencia de aminoácidos en un polipéptido o en la secuencia
codificante de ácidos nucleicos subyacente y obtenerse una proteína
que presente propiedades similares.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "ADNc" en el contexto de la presente invención
se refiere a ácidos desoxirribonucleicos producidos mediante
transcripción inversa y típicamente mediante síntesis de la segunda
cadena de ARNm o de otro ARN producido por un gen. En el caso de que
sea bicatenaria, la molécula de ADNc presenta tanto una cadena
codificante o de sentido como una cadena no codificante o
antisentido.
El término "fragmento" en la
presente invención se refiere a moléculas de proteína o de ácido
nucleico que pueden aislarse/purificarse, sintetizarse químicamente
o producirse mediante tecnología de ADN recombinante. Todos estos
métodos son bien conocidos de la técnica. Tal como se ejemplifica
posteriormente en la presente memoria, las secuencias de
nucleótidos y polipéptidos utilizados en la presente invención
pueden modificarse, por ejemplo mediante mutagénesis in
vitro.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "agonista" se refiere a una molécula que, al
encontrarse unida a CD38JL, incrementa o prolonga la duración del
efecto de CD38JL. Un agonista puede incluir proteínas, ácidos
nucleicos, carbohidratos y cualquier otra molécula que puede unirse
y regular el efecto de CD38JL.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "antagonista" se refiere a una molécula que, al
encontrarse unida a CD38JL, reduce la cantidad o la duración del
efecto de la actividad biológica o inmunológica de CD38JL. Entre
los antagonistas pueden incluirse proteínas, ácidos nucleicos,
carbohidratos, anticuerpos o cualquier otra molécula que reduzca el
efecto de CD38JL.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "codificante" se refiere a una propiedad
inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un ácido
nucleico, de servir de molde para la síntesis de otras moléculas
que presentan una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr,
ARNt u otras moléculas de ARN) o de aminoácidos, y las propiedades
biológicas resultantes de las mismas. De esta manera, un gen
codifica una proteína en el caso de que la transcripción y la
traducción del ARNm producido por dicho gen produzcan la proteína
en una célula u otro sistema biológico. Puede hacerse referencia
como codificante de proteína o de otro producto de dicho gen o
ADNc, tanto a la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos
es idéntica a la secuencia del ARNm y que se proporciona
habitualmente en listados de secuencias, como a la cadena no
codificante, utilizada como molde para la transcripción de un gen o
de un ADNc. Un ácido nucleico que codifica una proteína incluye
cualquier ácido nucleico que presente diferentes secuencias de
nucleótidos pero que codifique la misma secuencia de aminoácidos de
la proteína, debido a la degeneración del código genético. Los
ácidos nucleicos y las secuencias de nucleótidos que codifican
proteínas pueden incluir intrones.
Los términos "vectores" o
"constructo de ADN" son conocidos comúnmente de la
técnica y se refieren a cualquier elemento genético, incluyendo,
aunque sin limitarse a ellos, ADN de plásmido, ADN fágico, ADN
vírico y similares, que pueden incorporar las secuencias
oligonucleótidas o las secuencias de la presente invención, y que
sirven de vehículo para el ADN en el que puede clonarse el ADN de
la presente invención. Son numerosos los tipos de vectores que
existen y que son bien conocidos de la técnica.
La expresión "vector de expresión"
define un vector o vehículo tal como se ha descrito anteriormente
pero que se ha diseñado para permitir la expresión de una secuencia
insertada tras la transformación en un huésped. El gen (secuencia
insertada) clonado habitualmente se sitúa bajo la operación de
secuencias de elementos de control, tales como secuencias
promotoras. Dichas secuencias de control de la expresión variarán
dependiendo de si el vector ha sido diseñado para expresar el gen
operablemente ligado en un huésped procariótico o eucariótico o
ambos (vectores lanzadera) y adicionalmente puede contener elementos
transcripcionales, tales como elementos intensificadores,
secuencias de terminación, elementos de especificidad de tejido y/o
sitios de inicio y terminación de la traducción.
El término "oligonucleótido" tal
como se utiliza en la presente memoria se refiere a dos o más
moléculas de desoxinucleótido adenina (A), guanina (G), timina (T)
y/o citosina (C). El término "oligonucleótido" puede
encontrarse en moléculas de ADN lineal o en fragmentos, virus,
plásmidos, vectores, cromosomas o ADN derivado sintéticamente. Tal
como se utiliza en la presente memoria, las secuencias de ADN se
describen según la convención normal, proporcionando únicamente la
secuencia en la dirección 5' a 3'.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "polinucleótido" de la presente invención
también incluye aquellos polinucleótidos capaces de hibridarse,
bajo condiciones de hibridación restrictivas, a secuencias
contenidas en la secuencia SEC ID nº 2 o en el complemento de la
misma. La expresión "condiciones de hibridación restrictivas"
se utiliza tal como se entiende generalmente en la técnica. Por
ejemplo, el término puede significar una incubación durante la
noche a 42ºC en una solución que comprende formamida al 50%, 5X SSC
(NaCl 750 mM, citrato trisódico 75 mM), fosfato sódico 50 mM (pH
7,6), solución de Denhardt 5X, dextrán sulfato al 10% y 20 mg/ml de
ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, seguido del
lavado de los filtros en 0,1x SSC a aproximadamente 60ºC. Las
condiciones exactas necesarias para la "elevada astringencia"
pueden variar dependiendo de la naturaleza de las muestras de
ácidos nucleicos (es decir, ADN:ADN o ADN:ARN).
También se encuentran contempladas las moléculas
de ácidos nucleicos que se hibridan con los polinucleótidos de la
presente invención bajo condiciones de hibridación de astringencia
más baja. Los cambios de la astringencia de hibridación y la
detección de señales se llevan a cabo principalmente mediante la
manipulación de la concentración de formamida (los porcentajes más
bajos de formamida resultan en una astringencia más baja), las
condiciones salinas o la temperatura. Por ejemplo, entre las
condiciones de astringencia más baja se incluyen una incubación
durante la noche a 37ºC en una solución que comprende 6X SSPE (20X
SSPE=NaCl 3 M, NaH_{2}PO_{4} 0,2 M, EDTA 0,02 M, pH 7,4), SDS
al 0,5%, formamida al 30%, 100 mg/ml de ADN de bloqueo de esperma de
salmón, seguido de lavados a 50ºC con 1XSSPE, SDS al 0,1%. Además,
para conseguir una astringencia todavía más baja, los lavados
realizados tras la hibridación pueden llevarse a cabo a
concentraciones salinas más altas (por ejemplo 5XSSC).
Pueden modificarse las condiciones mediante la
adición o la eliminación de diversos reactivos de bloqueo. Entre
los reactivos de bloqueo pueden incluirse el reactivo de Denhardt,
heparina, BLOTTO, ADN desnaturalizado de esperma de salmón y
producto disponible comercialmente. La inclusión de reactivos de
bloqueo específicos puede requerir la modificación de las
condiciones de hibridación indicadas anteriormente, debido a
problemas con la compatibilidad.
El polinucleótido de la presente invención puede
estar compuesto de cualquier poliribonucleótido o
polidesoxiribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado, o
ARN o ADN modificado. Un polinucleótido también puede contener una
o más bases modificadas o esqueletos de ADN o ARN modificados para
la estabilidad o por otros motivos. Entre las bases
"modificadas" se incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y
bases poco habituales, tales como inosina. Puede llevarse a cabo
una diversidad de modificaciones en el ADN y ARN; de esta manera, el
término "polinucleótido" comprende formas química, enzimática
o metabólicamente modificadas.
Dos secuencias de ADN son "sustancialmente
complementarias" en el caso de que por lo menos
aproximadamente 75% (preferentemente por lo menos aproximadamente
80%, y más preferentemente por lo menos aproximadamente 90% o 95%)
de los nucleótidos sean correspondientes a lo largo de la longitud
definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son
sustancialmente homólogas pueden identificarse comparando las
secuencias utilizando software estándar disponible en bancos de
datos de secuencias o en un experimento de hibridación southern
bajo, por ejemplo, condiciones restrictivas, según se define para el
sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación
apropiadas se encuentra comprendida dentro de los conocimientos del
experto en la materia. Ver, por ejemplo, Maniatis et al.,
supra; DNA Cloning, vols. I y II, supra; Nucleic Acid
Hybridization, supra.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "huésped" pretende incluir no sólo procariotas,
sino también eucariotas, tales como células de levadura, vegetales
y animales. Una molécula o gen de ADN recombinante que codifica una
proteína de la presente invención puede utilizarse para transformar
un huésped utilizando cualquiera de las técnicas comúnmente
conocidas por el experto ordinario en la materia. Entre los
huéspedes procarióticos pueden incluirse E. coli, S.
typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus
subtilis. Entre los huéspedes eucarióticos se incluyen
levaduras, tales como Pichia pastoris, células de mamífero y
células de insecto.
Las expresiones "aminoácido" o
"secuencia de aminoácidos" tal como se utilizan en la
presente memoria se refieren a un oligopéptido, péptido,
polipéptido o secuencia proteica, o un fragmento de cualquiera de
los mismos, y a moléculas naturales o sintéticas. En este contexto,
las expresiones "fragmentos", "fragmentos inmunogénicos"
o "fragmentos antigénicos" se refieren a secuencias de variante
de procesamiento de CD38JL que preferentemente presentan una
longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 15
aminoácidos. En los casos en los que la expresión "secuencia de
aminoácidos" se utiliza en la presente memoria para referirse a
una secuencia de aminoácidos de una molécula de proteína natural,
la expresión "secuencia de aminoácidos" y términos similares
no pretenden limitar la secuencia de aminoácidos a la secuencia de
aminoácidos nativa completa asociada a la molécula de proteína
mencionada.
La expresión "determinante
antigénico" tal como se utiliza en la presente memoria se
refiere al fragmento de una molécula (es decir, un epítopo) que
entra en contacto con un anticuerpo particular. En el caso de que
se utilice una proteína o un fragmento de una proteína para
inmunizar un animal huésped, numerosas regiones de la proteína
podrían inducir la producción de anticuerpos que se unen
específicamente a determinantes antigénicos (regiones o estructuras
tridimensionales dadas en la proteína). Un determinante antigénico
puede competir con el antígeno intacto (es decir, el inmunógeno
utilizado para inducir la respuesta inmunológica) para la unión con
un anticuerpo.
Los términos "complementario" o
"complementariedad", tal como se utilizan en la presente
memoria, se refieren a la unión natural de polinucleótidos mediante
apareamiento de bases bajo condiciones permisivas de concentración
salina y temperatura.
El término "homología o
identidad", tal como se utiliza en la presente memoria, se
refiere a un grado de complementariedad. Pueden existir homología
parcial u homología completa. Se hace referencia a una secuencia
parcialmente complementaria que inhibe la hibridación por lo menos
parcialmente de una secuencia idéntica con un ácido nucleico diana
como "sustancialmente homóloga". La inhibición de la
hibridación de la secuencia completamente complementaria con la
secuencia diana puede examinarse utilizando un ensayo de hibridación
bajo condiciones de astringencia reducida.
Las expresiones "porcentaje de
identidad" o "% de identidad" se refieren al
porcentaje de similitud de secuencia observado en la comparación
entre dos o más secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos. El
porcentaje de identidad puede determinarse electrónicamente, por
ejemplo mediante la utilización del programa MEGALIGN (paquete de
software Lasergene, DNASTAR Inc., Madison, Wis.). El programa
MEGALIGN puede crear alineaciones entre dos o más secuencias de
acuerdo con diferentes métodos, por ejemplo el método Clustal
(Higgins, D.G. y P.M. Sharp, Gene 73:237-244,
1988). El porcentaje de identidad entre secuencias de ácidos
nucleicos también puede calcularse mediante el método Clustal, o
mediante otros métodos conocidos de la técnica, tales como el
método Jotun Hein (ver, por ejemplo, Hein, J., Methods in Enzymology
183:626-645, 1990). La identidad entre secuencias
también puede determinarse mediante otros métodos conocidos de la
técnica, por ejemplo modificando las condiciones de
hibridación.
El término "hibridación" tal como se
utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier procedimiento
por el que se une una cadena de ácidos nucleicos a una cadena
complementaria mediante apareamiento de bases.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "complejo de hibridación" se refiere a un
complejo formado entre dos secuencias de ácidos nucleicos en virtud
de la formación de enlaces de hidrógeno entre bases
complementarias. Puede formarse un complejo de hibridación en
solución (por ejemplo análisis C_{0} t o R_{0} t) o formarse
entre una secuencia de ácidos nucleicos presente en solución y otra
secuencia de ácidos nucleicos inmovilizada sobre un soporte sólido
(por ejemplo papel, membranas, filtros, chips, clavos o portaobjetos
de vidrio, o cualquier otro sustrato apropiado al que se han fijado
células o ácidos nucleicos de las mismas).
El término "micromatriz", tal como
se utiliza en la presente memoria, se refiere a una matriz de
polinucleótidos u oligonucleótidos diferentes distribuidos en un
sustrato, tal como papel, nilón o cualquier otro tipo de membrana,
filtro, chip, portaobjetos de vidrio o cualquier otro soporte sólido
adecuado.
La expresión "sustancialmente
purificado" tal como se utiliza en la presente memoria se
refiere a secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos que se
extraen de su ambiente natural y se aíslan o se separan, y que se
encuentran libres, como mínimo, aproximadamente al 60%,
preferentemente, como mínimo, aproximadamente al 75%, y más
preferentemente, al 90% aproximadamente, separados de otros
componentes celulares o víricos. De esta manera, por ejemplo, una
"proteína purificada" ha sido purificada a un nivel no
observado en la naturaleza.
Una "variante" de CD38JL, tal como
se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia de
aminoácidos que se encuentra alterada en uno o más aminoácidos. La
variante puede presentar cambios "conservativos", en los que
un aminoácido sustituido presenta propiedades estructurales o
químicas similares (por ejemplo sustitución de leucina por
isoleucina). Más raramente, una variante puede presentar cambios
"no conservativos" (por ejemplo la sustitución de glicina por
triptófano). Entre las variaciones menores análogas también pueden
incluirse deleciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. Pueden
encontrarse recomendaciones para determinar qué residuos
aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin
eliminar actividad biológica o inmunológica utilizando programas
informáticos bien conocidos de la técnica, por ejemplo software
DNASTAR.
Utilizando técnicas, incluyendo el análisis del
perfil de expresión, una EST AI989354 que resulta altamente
inducido por las células T CD4^{+} activadas. Esta secuencia EST
se encuentra situada entre los exones conocidos III y IV del gen
CD38 humano. Utilizando EST AI989354 como cebo, se aisló un clon de
ADNc de 1,9 kb (LJ-2) de una biblioteca de ADNc de
linfocitos periféricos humanos. La secuencia polinucleótido para el
clon LJ-2 se muestra en la fig. 1 y en la SEC ID nº
2. La secuencia de ADNc para LJ-1 se situó en el
mapa en el locus del gen CD38 en el cromosoma 4 humano y se
encontró que compartía los exones I y II con CD38 (tal como se
muestra en la fig. 2) y de esta manera codifica una nueva variante
de procesamiento de CD38. La fig. 3 muestra la alineación de los
polipéptidos CD38 y la variante de procesamiento CD38JL. Los
primeros 57 aminoácidos de CD38JL corresponden a los de una parte
de la secuencia de CD38, ya que los residuos aminoácidos restantes
(58 a 81) de CD38JL no se corresponden directamente a los de la
secuencia de CD38.
La fig. 4 muestra la distribución de la
expresión de AI989354 en tejidos normales. Los datos se obtuvieron
de experimentos con Affymetrix U95 GeneChip siguiendo el método
descrito en el manual técnico de análisis de expresión del
Affymetrix Gene Chip®. Se observó expresión incrementada de AI989354
en diversos tejidos, incluyendo el
timo.
timo.
La fig. 5 muestra la distribución de la
expresión de AI989354 en diversos tejidos inflamados frente a
tejidos normales, también obtenidos mediante análisis Affymatrix.
También resultó inducida CD38JL en tejidos derivados de pacientes
con IBD y tanto colitis ulcerosa como enfermedad de Crohn D. La
expresión incrementada en tejidos de este origen sugiere que la
variante de procesamiento podría desempeñar un papel en la
activación de las células T y, por lo tanto, podría proporcionar
una nueva diana farmacológica para la enfermedad autoinmunológica e
inflamatoria. La fig. 6 muestra la expresión de AI989354 en las
células T CD4 según mediciones con matrices Affymatrix U95
GeneChip.
La fig. 7 y la SEC ID nº 1 muestran la
traducción predicha del polipéptido de 81 aminoácidos a partir del
ADNc de CD38 JL-2. La fig. 8 muestra las secuencias
de la traducción de CD38 partiendo de la primera MET a lo largo de
la secuencia del ADNc de CD38JL. Las posiciones de los exones,
incluyendo el límite, se encuentran marcadas; las secuencias
diferentes de CD38 se encuentran subrayadas.
Una realización de la invención comprende un
polipéptido aislado con la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1. La
longitud de CD38JL es de 81 aminoácidos. Tal como se muestra en las
figs. 7 y 8, CD38JL presenta homología respecto a CD38 y, de esta
manera, se denomina "variante de procesamiento de CD38" y
presenta un dominio potencial ADP-ribosilciclasa.
Otro objetivo de la invención son los derivados de la variante de
procesamiento CD38JL. Dichos derivados presentan una identidad
polinucleótida de por lo menos 90% respecto al polinucleótido
codificante del polipéptido que consiste de la secuencia de
aminoácidos SEC ID nº 1. Cualquiera de las variantes polinucleótidas
indicadas anteriormente puede codificar una secuencia de
aminoácidos que contiene por lo menos una característica funcional o
estructural de CD38JL.
El experto en la materia apreciará que puede
producirse una multitud de secuencias polinucleótidas codificantes
de CD38JL, algunas con homología mínima respecto a las secuencias
polinucleótidas de cualquier gen conocido natural, debido a la
degeneración del código genético. De esta manera, la presente
invención también contempla variaciones de la secuencia
polinucleótida que podrían introducirse mediante la selección de
combinaciones basadas en elecciones alternativas de codones. Estas
combinaciones se realizan de acuerdo con el código genético de
tripletes estándar aplicado a la secuencia polinucleótida de CD38JL
natural.
Aunque las secuencias de nucleótidos
codificantes de CD38JL y las variantes de la misma preferentemente
son capaces de hibridarse con la secuencia de nucleótidos de CD38
natural bajo condiciones de astringencia apropiadamente
seleccionadas, puede resultar ventajoso producir secuencias de
nucleótidos codificantes de CD38JL o de derivados de la misma que
presenten un uso de los codones sustancialmente diferente. Los
codones pueden seleccionarse para incrementar la tasa a la que se
produce la expresión del péptido en un huésped procariótico o
eucariótico particular de acuerdo con la frecuencia con la que son
utilizados por el huésped los codones particulares. Entre otros
motivos para alterar sustancialmente la secuencia de nucleótidos
codificante de CD38TL sin alterar las secuencias de aminoácidos
codificantes se incluyen la producción de transcritos de ARN que
presenten propiedades más deseables, tales como una vida media
mayor, que los transcritos producidos a partir de la secuencia
natural.
La invención también permite la producción de
secuencias de ADN que codifican CD38JL y derivados de CD38JL, o
fragmentos de los mismos, enteramente por químicos expertos en
síntesis química. Las secuencias sintéticas pueden insertarse en
vectores de expresión y sistemas de células huésped utilizando
reactivos que son bien conocidos de la técnica. Además, puede
utilizarse química sintética para introducir mutaciones en una
secuencia codificante de CD38JL o cualquier fragmento de la
misma.
La invención también permite producir secuencias
polinucleótidas que son capaces de hibridarse con las secuencias
polinucleótidas reivindicadas y, en particular, a aquéllas mostradas
en SEC ID nº 2, o un fragmento de SEC ID nº 2, bajo diversas
condiciones de astringencia (ver, por ejemplo, Wahl, G.M. y S.L.
Berger, Methods Enzymol. 152:399-407, 1987, y
Kimmel, A.R., Methods Enzymol. 152:507-511,
1987).
Pueden utilizarse secuencias de nucleótidos
codificantes de CD38JL que presenten codones naturales. Por ejemplo,
pueden utilizarse codones preferidos por un huésped procariótico
para incrementar la expresión de proteínas o para producir un
transcrito de ARN que presente propiedades deseables, tales como una
vida media que sea más larga que la de un transcrito generado a
partir de la secuencia natural.
Las secuencias de nucleótidos de la presente
invención pueden alterarse utilizando métodos generalmente conocidos
de la técnica para alterar las secuencias codificantes de CD38JL,
tales como la clonación, el procesamiento y/o la expresión del
producto génico. Pueden utilizarse técnicas de ADN recombinante y
oligonucleótidos sintéticos para alterar las secuencias de
nucleótidos.
Los polinucleótidos codificantes de CD38JL, o
derivados de los mismos, pueden utilizarse con fines terapéuticos.
En un aspecto, el complemento del polinucleótido codificante de
CD38JL puede utilizarse en situaciones en las que resultaría
deseable bloquear la transcripción del ARNm. En particular, pueden
transformarse células con secuencias complementarias a los
polinucleótidos codificantes de CD38JL. De esta manera, pueden
utilizarse moléculas o fragmentos complementarios para modular la
actividad de CD38JL. Este tipo de tecnología ahora es bien conocido
de la técnica, y pueden diseñarse oligonucleótidos de sentido o
antisentido, o ARNsi, oligonucleótidos o fragmentos más grandes
interfirientes del ARN a partir de diversas localizaciones a lo
largo de las regiones codificantes o de control de las secuencias
codificantes de CD38L. Los oligos interfirientes del ARN y los
oligos antisentido podrían diseñarse utilizando la secuencia de la
variante de procesamiento de CD38 para inhibir específicamente la
función de la isoforma de CD38. La interferencia del ARN es un
procedimiento que utiliza el silenciamiento génico
post-transcripcional específico de secuencia o la
anulación génica, proporcionando un ARN bicatenario (ARNds) que
presenta una secuencia homóloga al gen diana. Pueden sintetizarse
ARNs interfirientes pequeños (ARNsi) in vitro o generarse
mediante corte con ribonucleasa III a partir de ARNds más largos y
son mediadores en la degradación de ARNm específico de secuencia.
Pueden diseñarse ARNsi según las técnicas descritas por Tuschl, tal
como se describe a continuación (Elbashir, S.M. et al.,
Nature 411:494-498, 2001). El ARNsi adecuado puede
ser ácido ribonucleótido de doble cadena que comprende una primera
cadena de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a entre 19 y
25 nucleótidos consecutivos de la SEC ID nº 2, y una segunda cadena
que es sustancialmente complementaria a la primera.
La proteína codificada por esta nueva variante
de CD38 podría seleccionarse para la utilización en terapéutica con
proteínas. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales
contra polipéptidos variantes de procesamiento de CD38. Los métodos
para producir anticuerpos monoclonales contra proteínas aisladas y
su administración en células son conocidos de la técnica (Am. J.
Gastroenterol. 97:2962-72, 2002). Los anticuerpos
monoclonales dirigidos contra los polipéptidos variantes de
procesamiento de CD38 de la invención pueden administrarse en
células para inhibir la función de la proteína y, por lo tanto, para
tratar enfermedades autoinmunológicas o inflamatorias.
También se encuentra contemplado que pueda
utilizarse la variante de procesamiento de CD38 de la presente
invención en ensayos de cribado y en ensayos de rendimiento
ultraelevado para identificar inhibidores de molécula pequeña de
los polipéptidos variantes de procesamiento de CD38. Un inhibidor de
molécula pequeña podría bloquear la unión de dicha variante de CD38
a su receptor de superficie celular. Es conocido que CD38 se
encuentra implicado en la adhesión y rodamiento linfocitario sobre
células endoteliales a través de la interacción con CD31 [Dianzani,
U., Stockinger, H. Y Malavasi, F., J. Immunol.
160:395-402, 1998]. Por lo tanto, el bloqueo con
inhibidores pequeños in vivo podría afectar a la adhesión
linfocitaria.
Pueden ligarse secuencias naturales, modificadas
o recombinantes de ácidos nucleicos codificantes de CD38JL a una
secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por
ejemplo, pueden cribarse bibliotecas de péptidos para identificar
inhibidores de la actividad de CD38JL. También puede resultar útil
codificar una proteína CD38JL quimérica que puedan reconocer los
anticuerpos disponibles comercialmente. También pueden prepararse
proteínas de fusión para que contengan sitios de corte entre la
secuencia codificante de CD38JL y otra secuencia de proteína
heteróloga, de manera que pueda cortarse CD38JL y purificarse
separadamente del grupo heterólogo.
Pueden sintetizarse secuencias polipeptídicas
codificantes de CD38JL o de un fragmento de la misma, mediante la
utilización de métodos químicos bien conocidos de la técnica (ver,
por ejemplo, Caruthers, M.H. et al., Nucl. Acids. Res. Symp.
Ser. 215-223, 1980, y Horn, T. et al., Nucl.
Acids Res. Symp. Ser. 225-232, 1980). El péptido
sintetizado puede purificarse sustancialmente mediante cromatografía
líquida de alto rendimiento preparativa (ver, por ejemplo, Chiez,
R.M. y F.Z. Regnier, Methods Enzymol. 182:392-421,
1990). La composición de los péptidos formados sintéticos puede
confirmarse mediante análisis de aminoácidos o mediante
secuenciación (ver, por ejemplo, Creighton, T., Proteins,
Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman and Co., New
York, N.Y., 1983).
Además, la secuencia de aminoácidos de CD38JL, o
cualquier parte de la misma, puede alterarse durante la síntesis
directa y/o combinarse con secuencias de otras proteínas, o
cualquier parte de las mismas, produciendo un polipéptido variante.
También se encuentra contemplado que pueda producirse CD38JL no sólo
mediante síntesis directa de péptidos utilizando técnicas de fase
sólida (ver, por ejemplo, Creighton, T.E., Protein: Structures and
Molecular Properties, páginas 55 a 60, W.H. Freeman and Co., New
York, N.Y., 1984). La síntesis de proteínas puede llevarse a cabo
mediante técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis
automatizada puede llevarse a cabo, por ejemplo, utilizando el
sintetizador de péptidos 431A de Applied Biosystems (Perkin Elmer).
Pueden sintetizarse fragmentos de CD38JL separadamente y después
combinarse para producir la molécula de longitud completa.
Puede prepararse CD38JL o sus derivados mediante
la inserción de secuencias de ADNc codificantes en un vector de
expresión con elementos reguladores apropiados necesarios para la
transcripción y la traducción de la secuencia codificante insertada
según métodos conocidos de la técnica. Entre estos métodos se
incluyen las técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas
sintéticas y la recombinación genética in vivo (ver, por
ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., capítulos 4, 8 y
16-17, 1989; y Ausubel, F.M. et al., 1995, y
suplementos periódicos, Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons, New York, N.Y., capítulos 9, 13 y 16).
Pueden producirse fragmentos de CD38JL mediante
producción recombinante utilizando métodos bien conocidos de la
técnica. Se cultivan células huésped transformadas con secuencias de
nucleótidos codificantes de CD38JL bajo condiciones adecuadas para
la expresión y aislamiento de proteína CD38JL a partir del cultivo
celular. También se entiende que los vectores de expresión que
contienen secuencias de ácidos nucleicos codificantes de CD38JL
pueden diseñarse para que contengan secuencias de señal que dirijan
la secreción de CD38JL a través de la membrana celular, o que de
otra manera faciliten la purificación de la proteína. Entre dichos
dominios de purificación se incluyen péptidos quelantes metálicos
que permiten la purificación sobre metal inmovilizado y dominios de
proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina
inmovilizada.
Se encuentra contemplado que puedan resultar
útiles sondas polinucleótidas derivadas de secuencias
polinucleótidas de CD38JL como sondas o herramientas diagnósticas
para condiciones autoinmunológicas e inflamatorias. Por
consiguiente, la invención proporciona polinucleótidos aislados o
purificados tal como se ha definido anteriormente.
Las secuencias polinucleótidas codificantes de
CD38JL pueden utilizarse para el diagnóstico de un trastorno
asociado a la expresión de una variante de procesamiento de CD38JL.
Entre los ejemplos de dichas enfermedades se incluyen IBD, y otras
enfermedades inflamatorias, tales como IBD, soriasis, artritis
reumatoide y enfermedades autoinmunológicas.
En otra realización de la invención, puede
administrarse un vector capaz de expresar CD38JL o un derivado de
la misma según la invención, en un sujeto para tratar o prevenir una
enfermedad inmunológica.
Puede administrarse un agonista que module la
actividad de CD38JL en un sujeto para tratar o prevenir una
enfermedad inmunológica.
Puede administrarse un antagonista que module la
actividad de CD38JL en un sujeto para tratar o prevenir una
enfermedad autoinmunológica. Pueden producirse antagonistas de
CD38JL utilizando métodos conocidos de la técnica. Se cree que un
antagonista resulta más eficaz para la modulación ventajosa de la
función enzimática asociada a CD38JL. Podría funcionar el agonista
o el antagonista basándose en su función.
Puede utilizarse CD38JL purificado para producir
anticuerpos o para cribar bibliotecas de agentes farmacéuticos para
identificar aquellos que se unen específicamente a las posiciones 58
a 81 de una variante de procesamiento de CD38 en la SEC ID nº 1.
Dichos anticuerpos también pueden generarse utilizando métodos
conocidos de la técnica. Entre dichos anticuerpos pueden incluirse,
aunque sin limitarse a ellos, anticuerpos policlonales,
monoclonales, quiméricos y de cadena única, fragmentos Fab y
fragmentos producidos con una biblioteca de expresión de Fab. Los
anticuerpos neutralizadores (es decir, aquellos que inhiben la
formación de dímeros) resultan especialmente preferentes para la
utilización terapéutica.
Pueden inmunizarse diversos huéspedes,
incluyendo cabras, conejos, ratas, ratones, seres humanos y otros,
mediante inyección con CD38JL o con cualquier fragmento u
oligopéptido de la misma que presenta propiedades inmunogénicas y/o
determinantes antigénicos. Dependiendo de la especie huésped, pueden
utilizarse diversos adyuvantes para incrementar la respuesta
inmunológica. Entre dichos adyuvantes se incluyen, aunque sin
limitarse a ellos, solución de Freund, geles minerales tales como
hidróxido de aluminio, y sustancias activas en superficie, tales
como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos,
emulsiones aceitosas, KLH y dinitrofenol.
Preferentemente los oligopéptidos, péptidos o
fragmentos utilizados para inducir anticuerpos contra CD38JL
deberían presentar una secuencia de aminoácidos consistente de por
lo menos aproximadamente 5 aminoácidos y, más preferentemente, de
por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos. También resulta
preferente que dichos oligopéptidos, péptidos o fragmentos resulten
idénticos a una parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína
natural y que contenga la secuencia de aminoácidos entera de una
molécula pequeña natural. Las moléculas quiméricas que comprenden
tramos cortos de CD38JL y otras proteínas también se encuentran
contempladas.
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales
contra CD38JL utilizando métodos conocidos para la producción de
moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en
cultivo. Entre éstas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas,
técnicas de hibridoma, las técnicas del hibridoma de células B
humanas y las técnicas de EBV-hibridoma (ver, por
ejemplo, Kohler, G. et al., Nature
256:495-497, 1975; Kozbor, D. et al., J.
Immunol. Methods 81:31-42, 1985; Cote, R.J. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030, 1983;
y Cole, S.P. et al., Mol. Cell Biol.
62:109-120,
1984).
1984).
También pueden producirse anticuerpos contra
CD38JL mediante la inducción de la producción in vivo en las
células linfocitarias o mediante cribado de bibliotecas de
inmunoglobulinas o de reactivos de unión altamente específicos, tal
como se da a conocer en la literatura (ver, por ejemplo, Orlandi, R.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837,
1989; y Winter, G. et al., Nature
349:293-299, 1991). Pueden identificarse anticuerpos
específicos de CD38JL utilizando diversos inmunoensayos conocidos
de la técnica. Dichos inmunoensayos típicamente incluyen la
medición de la formación de complejo de
antígeno-anticuerpo. Resulta preferente un
inmunoensayo de dos sitios basado en anticuerpos monoclonales
reactivos para dos epítopos de CD38JL no interfirientes, aunque
también puede utilizarse un ensayo de unión competitiva. Pueden
resultar útiles los anticuerpos contra CD38JL como terapéutica en
el tratamiento de condiciones inflamatorias. De esta manera, en una
realización de la invención se proporciona un anticuerpo purificado
que se une específicamente a un polipéptido de secuencia SEC ID nº
1.
Pueden utilizarse anticuerpos que se unen
específicamente a CD38JL para el diagnóstico de trastornos
caracterizados por la expresión de CD38 o de CD38JL, o en ensayos
para el seguimiento de pacientes bajo tratamiento con polipéptidos
agonistas, antagonistas o inhibidores de CD38JL. Pueden prepararse
anticuerpos útiles con fines diagnósticos utilizando métodos
descritos en la presente invención. Entre los ensayos diagnósticos
de CD38JL se incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y un
marcaje para detectar CD38JL en muestras (tejidos, células, fluidos)
procedentes del cuerpo humano. Seguidamente los anticuerpos se
modifican opcionalmente o se marcan mediante unión covalente o no
covalente de una molécula informadora.
Es conocida de la técnica una diversidad de
protocolos para detectar la presencia de proteínas tales como
CD38JL, incluyendo ELISAs, RIAs y FACS. Estos métodos pueden
utilizarse para diagnosticar niveles anormales de expresión de
CD38JL. Los valores normales o estándares de CD38JL se establecen
mediante combinación de fluidos corporales o extractos celulares
obtenidos de sujetos mamíferos normales, preferentemente de seres
humanos, con anticuerpos contra CD38JL bajo condiciones adecuadas
para la formación de complejos. El nivel de formación de complejo
estándar puede medirse mediante diversos métodos, preferentemente
por medios fotométricos. Los niveles de CD38JL que se expresan en
muestras de tejido del sujeto seguidamente se comparan con los
valores estándares. Se calcula la desviación entre los valores
estándar y los del sujeto y se utiliza para establecer los
parámetros de diagnóstico de una enfermedad.
Los polinucleótidos codificantes de CD38JL
pueden utilizarse con fines diagnósticos. Entre los tipos de
polinucleótidos que pueden utilizarse se incluyen secuencias
oligonucleótidas, moléculas de ARN y de ADN, y PNAs. Los
polinucleótidos pueden utilizarse para detectar y cuantificar la
expresión génica en muestras de tejidos en los que podría
correlacionarse la expresión de CD38JL con una enfermedad. El ensayo
diagnóstico puede utilizarse para determinar la ausencia, presencia
y expresión en exceso de CD38JL y para realizar el seguimiento de la
regulación de los niveles de CD38JL durante la intervención
terapéutica.
Pueden utilizarse sondas de PCR dirigidas contra
una secuencia específica de CD38JL para identificar secuencias de
ácidos nucleicos que codifican CD38JL. La especificidad de la sonda,
por ejemplo si se ha construido a partir de una región altamente
específica, y la astringencia de la hibridación o de la
amplificación (máxima, elevada, intermedia o baja), determinarán si
la sonda identifica únicamente secuencias naturales codificantes de
CD38JL, alelos o secuencias relacionadas.
También pueden utilizarse sondas de ácidos
nucleicos para la detección de secuencias relacionadas, y
preferentemente contienen por lo menos aproximadamente 60% de los
nucleótidos de cualquiera de las secuencias codificantes de CD38JL.
Las sondas de hibridación de la invención pueden ser ADN o ARN y
pueden derivarse a partir de la secuencia SEC ID nº 2.
Las secuencias polinucleótidas codificantes de
CD38JL pueden utilizarse para el diagnóstico de un trastorno
asociado a la expresión de CD38JL.
Los métodos para detectar y medir la expresión
de proteínas tales como CD38UL con anticuerpos policlonales o
monoclonales específicos para la proteína, son conocidos de la
técnica (ver, por ejemplo, Hampton, R. Et al., Serological
Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, Minn., sección
IV, 1990; y Maddox, D.E. et al., J. Exp. Med.
158:1211-1216, 1983). Entre las técnicas preferentes
se incluyen los ensayos de inmunosorción ligada a enzima (ELISAs),
la separación celular activada por fluorescencia (FACS) y el
radioinmunoensayo (RIA). Puede utilizarse un inmunoensayo de dos
sitios basado en anticuerpos monoclonales reactivos con dos epítopos
no interfirientes sobre CD38JL, así como un ensayo de unión
competitiva.
Existen varios marcajes y técnicas de
conjugación que pueden utilizarse en diversos ensayos de ácidos
nucleicos y de aminoácidos y que son conocidos de la técnica. Entre
los medios para producir una hibridación marcada o sondas de PCR
para detectar secuencias relacionadas con polinucleótidos
codificantes de CD38JL se incluyen, aunque sin limitarse a ellos,
el marcaje de extremos y la amplificación por PCR utilizando un
nucleótido marcado. Alternativamente, pueden construirse sondas de
ARNm que contengan las secuencias codificantes de CD38JL y
derivados de las mismas, utilizando métodos conocidos de la técnica.
Dichos vectores son conocidos de la técnica, se encuentran
disponibles comercialmente, y pueden utilizarse para sintetizar
sondas de ARN in vitro mediante adición de una ARN
polimerasa apropiada. Entre las moléculas informadoras o marcajes
que pueden utilizarse para detectar las moléculas de interés se
incluyen, aunque sin limitarse a ellas, radionucleidos, agentes
cromogénicos, fluorescentes y
quimioluminiscentes.
quimioluminiscentes.
La invención también proporciona métodos para
modular la función de CD38JL en un paciente, que comprende
administrar en el paciente un compuesto según la invención. En el
caso de que el propósito de la modulación de la función de CD38JL
en un paciente sea el tratamiento de un estado o condición de
enfermedad, la administración preferentemente comprende una
cantidad terapéutica o farmacéuticamente eficaz de un compuesto
farmacéuticamente aceptable según la invención.
En el caso de que el propósito de la modulación
de la función de CD38JL en un paciente sea el diagnóstico u otro
propósito (por ejemplo determinar la adecuación del paciente a la
terapia o la sensibilidad a diversas dosis subterapéuticas de los
compuestos según la invención), la administración preferentemente
comprenderá una cantidad eficaz de un compuesto según la invención,
es decir, la cantidad necesaria para obtener el efecto o grado de
modulación deseado.
Los compuestos de la invención típicamente
pueden administrarse en la forma de una composición farmacéutica.
Dichas composiciones pueden prepararse utilizando procedimientos
bien conocidos de la técnica farmacéutica y comprenden por lo menos
un compuesto de la invención. Los compuestos de la invención también
pueden administrarse solos o en combinación con adyuvantes que
incrementen la estabilidad de los compuestos de la invención,
faciliten la administración de composiciones farmacéuticas que
contienen los mismos en determinadas realizaciones, proporcionen
una disolución o dispersión incrementada, incrementen la actividad
inhibidora, proporcionen terapia adyuvante, y similares. Los
compuestos según la invención pueden utilizarse solos o
conjuntamente con otras sustancias activas según la invención,
opcionalmente también conjuntamente con otras sustancias
farmacológicamente activas. En general, los compuestos de la
presente invención se administran en una cantidad terapéutica o
farmacéuticamente activa, aunque pueden administrarse en cantidades
más bajas con fines diagnósticos u otros fines.
La administración de los compuestos de la
invención, en forma pura o en una composición farmacéutica
apropiada, puede llevarse a cabo utilizando cualquiera de los modos
aceptados de administración de composiciones farmacéuticas. De esta
manera, la administración puede ser, por ejemplo, por vía oral,
bucal (por ejemplo sublingual), nasal, parenteral, tópica,
transdérmica, vaginal o rectal, en forma de sólido, semisólido,
polvos liofilizados, o formas de dosificación líquida tales como,
por ejemplo, tabletas, supositorios, píldoras, cápsulas de gelatina
blanda elástica o dura, polvos, soluciones, suspensiones o
aerosoles, o similares, preferentemente en formas de dosificación
unitaria adecuadas para la administración simple de dosis exactas.
Las composiciones farmacéuticas generalmente incluirán un portador
o excipiente farmacéutico convencional y un compuesto de la
invención a modo de agente o agentes activos y, además, puede
incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos,
potadores, adyuvantes, diluyentes, vehículos o combinaciones de los
mismos. Dichos excipientes, portadores o aditivos farmacéuticamente
aceptables, así como los métodos para preparar las composiciones
farmacéuticas para diversos modos de administración son bien
conocidos por el experto en la materia. Puede obtenerse una
revisión del estado de la técnica en, por ejemplo, Remington: The
Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, A. Gennaro (editor),
Lippincott Williams & Wilkins, 2000; Handbook of Pharmaceutical
Additives, Michael e Irene Ash (editores), Gower, 1995; Handbook of
Pharmaceutical Excipientes, A.H. Kibbe (editor), American
Pharmaceutical Ass'n, 2000; H.C. Ansel y N.G. Popovish,
Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5a edición,
Lea y Febiger, 1990; cada una de las cuales se incorpora como
referencia en la presente memoria en su totalidad para mejor
descripción del estado de la técnica.
Tal como esperaría el experto en la materia, se
seleccionan las formas de los compuestos de la invención utilizados
en una formulación farmacéutica particular (por ejemplo sales) que
presentan las características físicas adecuadas (por ejemplo
solubilidad en agua) y necesarias para que la formulación resulte
eficaz.
Entre las composiciones farmacéuticas adecuadas
para la administración bucal (sublingual) se incluyen pastillas que
comprende un compuesto de la presente invención en una base
saborizada, habitualmente sacarosa, y acacia o tragacanto, y
pastillas que comprenden el compuesto en una base inerte, tal como
gelatina y glicerina o sacarosa y acacia.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
la administración parenteral pueden comprender preparaciones
acuosas estériles de un compuesto de la presente invención. Estas
preparaciones preferentemente se administran intravenosamente,
aunque la administración también puede llevarse a cabo por medio de
una inyección subcutánea, intramuscular o intradérmica. Las
formulaciones farmacéuticas inyectables comúnmente se basan en
solución salina estéril inyectable, solución salina tamponada con
fosfato, suspensiones oleaginosas u otros portadores inyectables
conocidos de la técnica y generalmente se preparan en forma estéril
e isotónica respecto a la sangre. Por lo tanto, las formulaciones
farmacéuticas inyectables pueden proporcionarse en forma de una
solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente
parenteralmente aceptable no tóxico, incluyendo
1,3-butanodiol, agua, solución de Ringer, solución
isotónica de cloruro sódico, aceites fijados, tales como
monoglicéridos o diglicéridos sintéticos, ácidos grasos tales como
ácido oleico y similares. Dichas formulaciones farmacéuticas
inyectables se formulan según la técnica conocida utilizando agentes
dispersantes o coagulantes adecuados y agentes de suspensión. Las
composiciones inyectables generalmente contienen entre 0,1% y 5% p/p
de un compuesto de la invención.
Entre las formas de dosificación sólidas para la
administración oral de los compuestos pueden incluirse cápsulas,
tabletas, píldoras, polvos y gránulos. Para dicha administración
oral, se forma una composición farmacéuticamente aceptable que
contiene uno o más compuestos de la invención mediante la
incorporación de cualquiera de los excipientes utilizados
normalmente, tales como, por ejemplo, grados farmacéuticos de
manitol, lactosa, almidón, almidón pregelatinizado, estearato de
magnesio, sacarina sódica, talco, derivados de éter de celulosa,
glucosa, gelatina, sacarosa, citrato, galato de propilo y
similares. Entre dichas formulaciones farmacéuticas sólidas pueden
incluirse formulaciones, tal como son bien conocidas de la técnica,
para proporcionar la administración prolongada o sostenida del
fármaco en el tracto gastrointestinal mediante cualquier mecanismo,
incluyendo, aunque sin limitación, la liberación sensible al pH a
partir de la forma de dosificación basada en la modificación del pH
en el intestino delgado, la erosión lenta de una tableta o cápsula,
la retención en el estómago basada en las propiedades físicas de la
formulación, la bioadhesión de la forma de dosificación al
revestimiento mucosal del tracto intestinal, o la liberación
enzimática del fármaco activo respecto de la forma de
dosificación.
Entre las formas de dosificación líquida para la
administración oral de los compuestos pueden incluirse emulsiones,
microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires,
conteniendo opcionalmente adyuvantes farmacéuticos en un portador,
tales como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa,
glicerol, etanol y similares. Dichas composiciones también pueden
contener adyuvantes adicionales, tales como agentes humectantes,
emulsionantes, de suspensión, edulcorantes, saborizantes y
perfumantes.
Entre las formas de dosificación tópica de los
compuestos se incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles,
polvos, soluciones, pulverizaciones, inhalantes, pomadas oculares,
gotas para ojos u oídos, vendas impregnadas y aerosoles, y pueden
contener aditivos convencionales apropiados, tales como
conservantes, solventes para asistir a la penetración del fármaco,
y emolientes en pomadas y cremas. La aplicación tópica puede ser de
una o más veces al día dependiendo de las consideraciones médicas
habituales. Además, los compuestos preferentes de la presente
invención pueden administrarse en forma intranasal mediante
utilización tópica de vehículos intranasales adecuados. Las
formulaciones también pueden contener portadores convencionales
compatibles, tales como bases de cremas o pomadas y etanol o
alcohol oleílico para las lociones. Dichos portadores pueden
encontrarse presentes en porcentajes de entre aproximadamente 1% y
aproximadamente 98% de la formulación, más habitualmente forman
hasta aproximadamente 80% de la formulación.
También resulta posible la administración
transdérmica. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la
administración transdérmica pueden presentarse en forma de parches
discretos adaptados para permanecer en contacto íntimo con la
epidermis del receptor durante un periodo de tiempo prolongado. Para
la administración en forma de un sistema de administración
transdérmica, la administración de dosis evidentemente será continua
y no intermitente durante la totalidad del régimen de dosificación.
Dichos parches convenientemente contienen un compuesto de la
invención en una solución acuosa opcionalmente tamponada, disuelto
y/o dispersado en un adhesivo, o dispersado en un polímero. Una
concentración adecuada del compuesto activo es de entre
aproximadamente 1% y 35%, preferentemente de entre aproximadamente
3% y 15%.
Par la administración mediante inhalación, los
compuestos de la invención convenientemente se administran en forma
de una pulverización de aerosol desde un dispositivo de bomba de
pulverización que no requiere un gas propelente o a partir de un
paquete presurizado o de un nebulizador utilizando un propelente
adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano,
diclorotetrafluoroetano, tetrafluoroetano, heptafluoropropano,
dióxido de carbono u otro gas adecuado. En cualquier caso, la unidad
de dosificación de pulverización de aerosol puede determinarse
proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida de
manera que se utilice el inhalador de dosis medida (MDI) para
administrar los compuestos de la invención de una manera
reproducible y controlada. Dichos dispositivos inhaladores,
nebulizadores o atomizadores son conocidos de la técnica anterior,
por ejemplo a partir de las publicaciones de patente internacional
PCT nº WO 97/12687 (particularmente la figura 6 de la misma, que es
la base del nebulizador comercial RESPIMAT®), nº WO 94/07607, nº WO
97/12683 y nº WO 97/20590, a las que se hace referencia en
la presente invención y cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad.
la presente invención y cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad.
La administración rectal puede llevarse a cabo
utilizando supositorios de dosis unitaria en los que el compuesto
se mezcla con sólidos solubles o insolubles en agua que presentan
baja temperatura de fusión, tales como grasas, manteca de cacao,
gelatina glicerinada, aceites vegetales hidrogenados, mezclas de
polietilenglicoles de diversos pesos moleculares, o ésteres de
ácidos graso de polietilenglicoles o similares. El compuesto activo
habitualmente es un compo-
nente menor, con frecuencia de entre aproximadamente 0,05% y 10% en peso, siendo el resto el componente base.
nente menor, con frecuencia de entre aproximadamente 0,05% y 10% en peso, siendo el resto el componente base.
En la totalidad de las composiciones
farmacéuticas anteriormente indicadas, los compuestos de la
invención pueden formularse con un portador o excipiente aceptable.
Los portadores o excipientes utilizados deben ser, evidentemente,
aceptables, en el sentido de que son compatibles con los demás
ingredientes de la composición, y no deben ser perjudiciales para
el paciente. El portador o excipiente puede ser un sólido o un
líquido, o ambos, y preferentemente se formula con el compuesto de
la invención en forma de una composición de dosis unitaria, por
ejemplo una tableta, que puede contener entre 0,05% y 95% en peso
del compuesto activo. Entre dichos portadores o excipientes pueden
incluirse rellenos inertes o diluyentes, ligantes, lubricantes,
agentes desintegrantes, retardantes de solución, aceleradores de
resorción, agentes de absorción y agentes colorantes. Entre los
ligantes adecuados se incluyen almidón, gelatina, azúcares
naturales, tales como glucosa o \beta-lactosa,
edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como
acacia, tragacanto o alginato sódico, carboximetilcelulosa,
polietilenglicol, ceras y similares. Entre los lubricantes se
incluyen oleato sódico, estearato sódico, estearato de magnesio,
benzoato sódico, acetato sódico, cloruro sódico y similares. Entre
los desintegrantes se incluyen almidón, metilcelulosa, ágar,
bentonita, goma xantano y similares.
Generalmente, una dosis diaria terapéuticamente
efectiva se encuentra comprendida entre aproximadamente 0,001 mg y
aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal al día de un compuesto de
la invención; preferentemente de entre aproximadamente 0,1 mg y
aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal al día, y más
preferentemente, de entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente
1,5 mg/kg de peso corporal al día. Por ejemplo, para la
administración a una persona de 70 kg, el intervalo de dosis se
encontraría comprendido entre aproximadamente 0,07 mg y
aproximadamente 1.050 mg al día de un compuesto de la invención,
preferentemente entre aproximadamente 7,0 mg y aproximadamente 700
mg al día, y más preferentemente entre aproximadamente 7,0 mg y
aproximadamente 105 mg al día. Puede resultar necesario algún grado
de optimización de la dosis rutinaria para determinar un nivel y
patrón de dosificación óptimos.
Los portadores y excipientes farmacéuticamente
aceptables comprenden la totalidad de los aditivos anteriormente
indicados y similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se purificaron células T CD4^{+} humanas a
partir de sangre periférica obtenida de donantes y se estimularon
con anticuerpo anti-CD3 + anticuerpo
anti-CD28 o anticuerpo anti-CD3 +
ICAM durante 24 horas o durante 72 horas. Las células no
estimuladas se utilizaron como controles. Se extrajo el ARN total de
dichas células y se cuantificó mediante análisis utilizando chips
génicos Affymetrix U95. Los presentes inventores llevaron a cabo el
análisis del perfil de expresión e identificaron que
EST(AI989354) se expresaba a nivel elevado de inducción
durante las activaciones de las células T (con
anti-CD3+anti-CD28 o con
anti-CD3+ICAM) (fig. 6). Los datos se confirmaron
con las muestras de células T procedentes de tres donantes
diferentes (fig. 1).
\global\parskip0.970000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
También se obtuvo el perfil de expresión del gen
AI989354 en tejidos normales mediante experimentos con chips
génicos Affymetrix U95. Se utilizaron muestras de ARN de múltiples
donantes para cada grupo de tejidos normales. AI89354 se expresaba
a nivel elevado en los timocitos normales (fig. 4), sugiriendo que
presenta una función importante en las células T y en los sistemas
inmunológicos. La expresión de AI989354 en la totalidad de los
demás tejidos normales sometidos a ensayos era relativamente baja
(fig. 4). La expresión selectiva en el timo sugiere que este gen
presenta importantes funciones inmunológicas y que podría ser una
buena diana debido a que su modulación por inhibidores,
antagonistas o agonistas presentaría menos efectos secundarios
debido al nivel reducido de expresión en otros tejidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se aisló el clon de plásmido
LJ-2 a partir de paneles de la biblioteca de ADNc de
leucocitos sanguíneos periféricos (PBLs) humanos en el cribado de
biblioteca de ADNc "Longest-Clone" (Origen
Technologies Inc., Rockville, MD). Los fragmentos de ADNc humanos
se insertaron en un vector, pCMV6-XL4, de 4,7 kb de
longitud, para construir la biblioteca de ADNc. Se distribuyeron en
la "superplaca" de 96 pocillos aproximadamente 6 millones de
clones seleccionados por tamaño, derivados a partir de doce paneles
de biblioteca de tejidos humanos consistentes de cerebro fetal y
adulto, corazón, riñón, hígado, pulmón, músculo, leucocitos
sanguíneos periféricos, placenta, intestino delgado, bazo y
testículo. Cada pocillo de la superplaca contenía 40.000 clones.
Para el cribado de la biblioteca, se diseñaron tres cebadores de
PCR a partir de las secuencias de AI989354:
| SEC ID nº 3: | P1R (cebador inverso) | GAGGTGTTGAGTCTTTCTGGGCA |
| SEC ID nº 4: | P2F (cebador directo), | ATAGCCTGCTTCCGAATTCTTGG |
| SEC ID nº 5: | P3F (cebador directo), | CCCATGCTCCCTAATTCCCTTC |
| SEC ID nº 6: | VP3F (vector de cebador directo), | GACAGAGCTCGTTTAGTGAACC |
| SEC ID nº 7: | VP6R (vector de cebador inverso), | TAGAAGGACACCTAGTCAGAC |
Se cribó la superplaca mediante PCR utilizando
la pareja de cebadores P3F/P1R. Los pocillos positivos seguidamente
se cribaron nuevamente utilizando una pareja de cebadores VP3F/P1R
para identificar el pocillo con el clon más largo. Este pocillo
correspondería a una "placa madre", que contendría 5.000 clones
por pocillo. La placa madre también se cribó utilizando los
cebadores VP3F/P1R para identificar el pocillo con el clon más
largo. La subplaca de 96 pocillos apropiada, derivada del pocillo
seleccionado de la placa madre y que contenía 50 clones por
pocillo, se cribó mediante PCR utilizando los cebadores P3F/P1R. Las
células de la subplaca positiva seguidamente se sembraron en placa
y se recolectaron 96 colonias individuales y se cribaron mediante
PCR para identificar el clon final utilizando las parejas de
cebadores P3F/P1R, VP3F/P1R, P2F/VP6R y P3F/VP6R. Se amplificaron
los productos de PCR a partir de un clon, LJ-2, con
P3F/P1R (\sim436 pb), VP3F/P1R (\sim1,7 kb), P2F/VP6R (\sim590
pb) y P3F/VP6R (\sim620 pb), respectivamente. La secuencia de
LJ-2 que contenía la secuencia de AI989354 se obtuvo
mediante secuenciación del inserto de clon
LJ-2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
También se obtuvo la expresión de ARNm del gen
AI989354 en varios tejidos inflamados y normales de control
mediante experimentos con chips génicos Affymetrix U95. Se indujo la
expresión de AI989354 en tejidos de colon inflamado procedente de
pacientes con enfermedad intestinal inflamatoria (comparando tejidos
de colon de 6 pacientes con enfermedad de Crohn y 7 pacientes con
colitis ulcerosa frente a 39 colones normales) (fig. 5). También se
indujo el gen en recto inflamado y en bazo inflamado comparando con
controles normales (fig. 5). La expresión inducida de AI989354 en
dichos tejidos inflamados sugiere que AI989354 podría mediar en las
respuestas inflamatorias en dichos tejidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se llevó a cabo una búsqueda de la secuencia SEC
ID nº 1 en la base de datos InterPro utilizando el programa
INTERPRO con el fin de obtener familias de proteínas, dominios o
sitios que presentasen un grado elevado de similitud con la
secuencia SEC ID nº 1. Esta búsqueda reveló dos familias de
proteínas: la familia PFO2267 y la familia SSF56629. La familia
PFO2267 codifica un polipéptido que presenta una
ADP-ribosil-ciclasa CD38/157. El
valor E de PFO2667 era de 5,9x10^{-5}. La familia SSF56629 también
presentaba una región ADP-ribosilciclasa. Para
SSF56629 el valor E era de 9x10^{-23}.
\global\parskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 1
SEC ID nº 2
SEC ID nº 3
GAGGTGTTGAGTCTTTCTGGGCA
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 4
ATAGCCTGCTTCCGAATTCTTGG
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 5
CCCATGCTCCCTAATTCCCTTC
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 6
GACAGAGCTCGTTTAGTGAACC
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 7
TAGAAGGACACCTAGTCAGAC
Claims (13)
1. Variante de procesamiento de CD38 purificada
que comprende el polipéptido de secuencia SEC ID nº 1.
2. Variante de procesamiento de CD38 purificada
que comprende los residuos aminoácidos 58 a 81 de la secuencia SEC
ID nº 1.
3. Polinucleótido aislado y purificado
codificante de la variante de procesamiento de CD38 que comprende la
secuencia de aminoácidos de la secuencia SEC ID nº 1 o un fragmento
de la secuencia SEC ID nº 1 que comprende los aminoácidos 58 a
81.
4. Polinucleótido aislado y purificado según la
reivindicación 3 que comprende las bases 603 a 845 de la secuencia
SEC ID nº 2 o las bases 774 a 845 de la secuencia SEC ID nº 2.
5. Polinucleótido aislado y purificado que es
complementario al polinucleótido codificante de la variante de
procesamiento de CD38 que consiste de la secuencia de aminoácidos de
la secuencia SEC ID nº 1 o de un fragmento de la secuencia SEC ID
nº 1 que comprende los residuos aminoácidos 58 a 81 de la secuencia
SEC ID nº 1.
6. Vector de expresión que contiene por lo menos
un polinucleótido codificante de la variante de procesamiento de
CD389 que consiste de la secuencia de aminoácidos de la secuencia
SEC ID nº 1 o de los residuos aminoácidos 58 a 81 de la secuencia
SEC ID nº 1.
7. Vector de expresión según la reivindicación 6
contenido en una célula huésped.
8. Composición farmacéutica que comprende una
variante de procesamiento de CD38 purificada que presenta la
secuencia SEC ID nº 1 según la reivindicación 1, conjuntamente con
un portador farmacéutico aceptable.
9. Método para detectar una secuencia
polinucleótido codificante de una variante de procesamiento de CD38
tal como se define en la secuencia SEC ID nº 1 en una muestra
biológica que contiene ácidos nucleicos, comprendiendo dicho método
las etapas siguientes:
(a) hibridar el complemento del polinucleótido
codificante del polipéptido que comprende la secuencia SEC ID nº 1
o un fragmento de la misma con por lo menos uno de los ácidos
nucleicos de la muestra biológica, formando de esta manera un
complejo de hibridación, y
(b) detectar el complejo de hibridación, en el
que la presencia del complejo de hibridación se correlaciona con la
presencia de un polinucleótido codificante de la variante de
procesamiento de CD38 en la muestra biológica.
10. Anticuerpo purificado que se une
específicamente a las posiciones 58 a 81 de una variante de
procesamiento de CD38 que presenta la secuencia SEC ID nº 1.
11. Utilización de la variante de procesamiento
de CD38 que presenta la secuencia SEC ID nº 1 en un ensayo de
cribado y/o en un ensayo de rendimiento ultraelevado para
identificar inhibidores de molécula pequeña de dicho
polipéptido.
12. Utilización de la variante de procesamiento
de CD38 que presenta la secuencia SEC ID nº 1 para cribar
bibliotecas de agentes farmacéuticos con el fin de identificar
aquellos que se unen específicamente a dicho polipéptido.
13. Utilización de la variante de procesamiento
de CD38 que presenta la secuencia SEC ID nº 1 para producir
anticuerpos que se unen específicamente a dicho polipéptido.
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