CN108893449B

CN108893449B - 杂交瘤细胞、抗人亲环素蛋白a的单克隆抗体及其应用

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Publication number: CN108893449B
Application number: CN201810579025.XA
Authority: CN
Inventors: 陈志南; 张征; 杨向民; 边惠洁; 吴佼; 朱平; 张阳
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2018-06-07
Filing date: 2018-06-07
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2038-06-07
Also published as: CN108893449A

Abstract

本发明公开了杂交瘤细胞、抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体及其应用。本发明用传统的细胞杂交瘤制备技术，获得稳定分泌抗人亲环素蛋白A(Cyclophilin A，CypA)蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞的保藏编号为CCTCC NO：C201126，所分泌的抗体可以特异性的识别人体多种组织中表达的CypA蛋白分子，为癌症和炎症的诊断及治疗提供了新的有效工具。

Description

杂交瘤细胞、抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种与人亲环素蛋白A(Cyclophilin A，CypA)蛋白特异性结合的单克隆抗体和产生该抗体的杂交瘤细胞株，以及该抗体轻、重链可变区基因和相应基因所编码的氨基酸序列。所述抗体用于，如检测和定量细胞和组织中CypA的表达水平，及在制备用于诊断或治疗肿瘤和炎症方面药物中的应用。

背景技术

Cyclophilin A又称亲环素蛋白A(以下简称为CypA)，是亲环素蛋白家族中的主要成员，分子量约18kDa。CypA是免疫抑制药物环孢菌素(Cyclosporine A，CsA)在细胞内的主要受体，二者形成的复合物可以通过抑制钙调神经素的磷酸酶活性，进而阻止活化T细胞核因子(NF-ATs)向核内的移位以及下游相关基因的转录。CypA还具有肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-prolyl cis-tranisomerase，PPIase)活性，可以催化蛋白折叠和构象变化时肽基脯氨酰键的顺反异构化。CypA的顺反异构酶活性影响了细胞内蛋白质的转运、线粒体功能的维持、mRNA前体的加工、多蛋白复合体结构完整性的维持等多种重要的细胞生理过程。

癌症是困扰全球人类健康的主要疾病之一，目前癌症的诊断和治疗仍然缺乏有效的技术手段。近年来，随着蛋白质组学在肿瘤研究中的应用，极大的推动了人们在蛋白分子水平对肿瘤的发生和进展的认识。通过2D电泳、质谱等研究手段，人们筛选到大量与肿瘤的发生和进展关系密切的新的蛋白标志物，为肿瘤的诊断和治疗提供了更多的选择。CypA与肿瘤的关系最早是由Michael J.Campa等在2003年时，使用“基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)”技术，比较正常肺组织和非小细胞肺癌组织样本中蛋白质的表达差异时，发现CypA在肺癌组织中表达显著升高达7倍之多。紧随其后，又有多名研究者先后报道了CypA在胰腺癌、食管癌、结直肠癌乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、黑色素瘤等多种癌组织中，相对于正常组织表达增高的现象。已有文献报道CypA在非小细胞肺癌和子宫内膜癌组织中的表达升高与癌组织的分级和病人预后间存在显著相关性。CypA在癌组织细胞中的表达增高可增加肿瘤细胞对低氧和化疗药物诱导的细胞凋亡效应的抵抗能力，这种作用与CypA的肽基脯氨酰顺反异构酶活性紧密相关。CypA的肽基脯氨酰顺反异构酶活性可调节肿瘤细胞内多种具有重要功能的蛋白质构象成熟，并参与调节了与肿瘤的增殖和转移相关的蛋白磷酸化信号通路的活化。这些结果都提示了CypA在癌的发生和进展过程中可能具有重要的作用，并有可能成为一个重要的癌症诊断标志物和预后的判断指标。目前尚无针对CypA蛋白的单克隆抗体或多肽作为癌症诊断或治疗的药物报道。

尽管CypA主要是一种胞浆蛋白，但是在某些炎性条件刺激下，也可以被多种炎性细胞分泌释放到细胞的胞外。目前已知CypA蛋白在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、动脉粥样硬化等多种炎性疾病的组织中表达增高。这些异常表达的CypA蛋白是由炎症部位的单核巨噬细胞、T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞等分泌表达的。类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮病人的血清或滑液中CypA蛋白的表达含量，与其病情的严重程度密切相关。表达在炎症部位中的CypA，可通过诱导嗜酸粒细胞、单核细胞、CD4⁺T淋巴细胞、中性粒细胞等炎细胞向炎症部位的趋化，这些趋化而来的炎细胞会进一步加速炎症进展。而在类风湿性关节炎中，CypA还可以进一步刺激趋化到炎性组织内的单核/巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶，加速受损关节局部组织的破坏，因此CypA还影响了类风湿性关节炎的疾病进展过程。目前，已有针对CypA的小分子化合物用于临床治疗炎性相关疾病。抗免疫排斥药物环孢菌素A可与炎性细胞内表达的CypA蛋白结合，二者结合后可阻断转录因子“活化T细胞核因子(NF-ATc)”的活化，进而抑制在T淋巴细胞活化过程中起关键作用的细胞因子的表达，阻断了T细胞活化和增殖过程，发挥抗免疫排斥的作用。近年来，已有研究者尝试应用针对CypA分子的受体——CD147分子的拮抗肽和单克隆抗体，抑制CypA对炎性细胞的趋化作用进而减缓类风湿性关节炎的进展过程，目前这些研究已在动物模型上取得了一定疗效。但是，目前尚未见直接针对CypA的单克隆抗体或多肽的药物用于类风湿性关节炎或其他炎症相关疾病治疗的报道。

综上所述，CypA是近年来受到重视的一个新的广泛性肿瘤标志物，同时CypA还在炎性疾病的进展中起到关键的作用，目前国内外尚未见针对CypA蛋白的单克隆抗体诊断和治疗药物。制备特异性识别CypA蛋白的单克隆抗体，一方面可以利用抗体特异性识别抗原的特点，用于临床病理组织样本的筛选，对CypA表达异常的疾病具有辅助诊断意义；另一方面，CypA单抗还可以阻断CypA蛋白与其受体分子的结合，从而抑制CypA蛋白在疾病中的病理作用。另外，利用抗体特异性识别抗原的特点，将细菌毒素、放射性元素、寡核苷酸分子等与CypA单抗交联，CypA单抗可以携带这些毒性分子至CypA异常表达患病部位，对患病组织进行靶向杀伤作用，这也是目前抗体治疗应用最为广泛的领域。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种杂交瘤细胞，其保藏号为CCTCC NO：C201126，可分泌鼠抗人CypA分子特异性单克隆抗体。

本发明的第二个目的在于提供抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体，所述抗体由所提供的杂交瘤细胞分泌获得。

本发明的第三个目的在于提供所述抗体的应用，检测和定量细胞和组织中CypA的表达水平，及在制备用于诊断或治疗肿瘤和炎症方面药物中的应用。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案包括：

一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞的保藏编号为CCTCC NO：C201126。

可选的，所述的杂交瘤细胞能分泌抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体；该抗体特异性识别CypA蛋白。

可选的，所述的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体的轻链可变区的基因序列选自以下一种的序列：SEQ ID NO:1所示序列；与SEQ ID NO.1具有90％以上同源性的序列；

所述的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体的重链可变区的基因序列选自以下一种的序列：SEQ ID NO:3所示序列；与SEQ ID NO.3具有90％以上同源性的序列。

可选的，所述的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列选自以下一种的序列：SEQ ID NO:2所示序列；与SEQ ID NO.2具有90％以上同源性的序列；

所述的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列选自以下一种的序列：SEQ ID NO:4所示序列；与SEQ ID NO.4具有90％以上同源性的序列。

一种抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体，所述的抗体由保藏编号为CCTCC NO：C201126的杂交瘤细胞分泌得到，该抗体特异性识别CypA蛋白。

一种抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体，所述的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体的轻链可变区的基因序列选自以下一种的序列：SEQ ID NO:1所示序列；与SEQ ID NO.1具有90％以上同源性的序列；

可选的，所述的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体的轻链可变区基因序列包括轻链可变区CDR1、轻链可变区CDR2和轻链可变区CDR3，轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体的重链可变区基因序列包括CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

一种免疫测定CypA的试剂盒，该试剂盒中的抗体为任一所述的杂交瘤细胞分泌得到的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体或任一所述的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体。

任一所述的杂交瘤细胞分泌得到的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体或任一所述的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体用于制备诊断或治疗CypA刺激基质金属蛋白酶分泌引起的癌症和/或炎症药物的应用。

本发明的优点是：

(1)获得了特异性识别人源CypA蛋白的单克隆抗体，可应用于CypA蛋白的检测以及CypA蛋白的功能研究；

(2)获得了稳定分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为该抗体的大规模生产奠定基础；

(3)鉴定了该抗体轻链和重链的可变区基因序列以及氨基酸序列，经本领域公认的数据库检索后证明所获得基因和氨基酸序列为第一次报道。

因此，本发明所获得的特异性识别人CypA蛋白的单克隆抗体，对于癌症以及炎症疾病的诊断和治疗，都具有重要的创新意义和临床应用价值。

附图说明

图1为实施例2的抗CypA鼠单抗免疫球蛋白亚型的鉴定结果图，其中，a：抗CypA鼠单抗Ig亚类；b：抗CypA鼠单抗轻链亚类；

图2为实施例4的免疫荧光法检测体外培养细胞中CypA蛋白的表达结果图；

图3为实施例5免疫组化法检测抗CypA单抗识别人组织样本中的CypA蛋白，A：正常肝组织；B：肝癌组织(图中标尺长度为100μm)；

图4为实施例6的明胶酶谱法检测CypA刺激基质金属蛋白酶(MMPs)分泌的生物学活性结果照片；其中，CSA为环孢素A，即Cyclosporin A。

具体实施方式

本发明利用传统的杂交瘤制备技术，获得稳定分泌抗人CypA分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由此获得能特异识别结合人CypA分子抗原的单克隆抗体，进一步通过分子生物学手段获得编码所述抗体的轻、重链可变区基因，同时对获得的基因进行了分析和鉴定。

根据本发明的第一个方面，本发明涉及的一种可分泌鼠抗人CypA分子特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CCTCC NO：C201126，保藏日2011-04-21。该杂交瘤细胞系可用于制备或生产本发明所涉及的单克隆抗体，具体但不局限于，可采用现有的杂交瘤培养基培养该细胞系，收获培养基上清，并对上清中存在的本发明涉及的单克隆抗体应用本领域公知的各种纯化方法进行纯化、回收。根据本领域内公认的知识，任何不涉及本发明所涉及的抗体基因序列以及氨基酸序列，而只是对该杂交瘤细胞系进行基因工程改造或培养方式的改变，仍不能排除在本发明所涉及的保护范围之外。

根据本发明的第二个方面，本发明所涉及的鼠抗人CypA单克隆抗体，所述抗体由由保藏号为：CCTCC NO：C201126的杂交瘤细胞株分泌产生，所述的单克隆抗体可与人体多种组织细胞中表达的CypA蛋白特异性结合。

本发明进一步涉及所述抗CypA单克隆抗体的重链和轻链可变区基因。本发明所述的抗CypA单克隆抗体的重链和轻链可变区基因经过序列测定和在NCBI中BLAST比较分析后，确认该抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；重链可变区基因核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。对于本发明成功克隆的抗体轻、重链可变区基因，分别应用因特网上专业性的已知抗体基因序列数据库(IMGT)和(NCBI)进行胚系基因来源分析和同源性比较,结果表明所获得的基因序列来自于小鼠胚系基因，并且和现有已报道的各种抗体基因序列均不完全一致。所得重链可变区基因与轻链可变区基因可编码正确的小鼠抗体可变区。

本发明第三个方面还涉及所述抗体的基因及其编码的多肽在制备用于诊断和治疗癌症及炎症药物中的应用。由于CypA具有肽基脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性和分子伴侣效应。在细胞内，它具有蛋白折叠、运输、细胞内信号传导和调节其他蛋白转录活性等作用。在细胞外，CypA作为一种氧化应激诱导分泌因子，可刺激血管平滑肌细胞迁移、增殖，增加内皮细胞黏附、分子表达和介导炎性反应，并参与免疫抑制和胆固醇的代谢，促进动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的发生发展，与冠状动脉粥样性心脏病(Coronary heartdisease,CHD)的形成关系密切。研究显示CypA作为一种趋化因子，对单核细胞具有趋化作用。

CypA可以和单核细胞膜上的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellularmatrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)受体集合，激活EMMPRIN细胞外信号调节激酶(EMMPRIN-ERK)-细胞核因子kB(nuclear factor kappa B,NF-kB)通路，诱导单核细胞分泌基质金属蛋白酶-9(MMP-9)，而EMMPRIN-ERK在细胞的生长和分化中具有重要作用。因此，细胞和组织中CypA的表达水平可用于诊断或治疗肿瘤和炎症药物开发中的应用。

此外，也有报道显示病毒HIV-1衣壳蛋白(capsid protein,CA)与促进感染的病毒因子和限制感染的宿主因子相互作用。宿主蛋白亲环素A CypA结合到HIV-1衣壳蛋白上，增强宿主限制因子阻断HIV-1感染的作用。来自美国范德堡大学医学中心的

Christopher Aiken博士和同事们在非洲绿猴细胞系中研究了CypA如何增强宿主限制因子TRIM5α的作用。研究人员观察到HIV-1DNA在细胞核中的堆积发生CypA依赖性的下降，这提示着CypA促进TRIM5α抑制HIV-1的细胞核输入，CypA与病毒HIV-1的入侵也有一定的作用。

因此，根据本发明的第一个方面，本发明所涉及的单克隆抗体可特异性识别人体表达的CypA蛋白，根据本领域内公认的知识，可以推知该抗体的基因序列以及基因所编码的氨基酸序列，可以用于特异性识别CypA蛋白或阻断CypA蛋白功能的诊断和治疗肿瘤、炎症等相关疾病药物的开发；也很容易推知，本发明所涉及的抗体基因和氨基酸序列与其他基因、氨基酸或其他药物成分制成复方或者联合应用，也可以达到上述肿瘤和炎症等疾病的诊断以及治疗药物的开发目的。

参考下述具体的实施例可以进一步深入理解本发明，所述实施例仅用于说明本发明，无意于对本发明的范围作出任何限制。显然，可以对本发明做出多种改动或变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动或变化同样在本申请要求的保护范围之内。

实施例1制备鼠抗人Cyclophilin A蛋白单克隆抗体

1.1采用高纯度重组人CypA蛋白作为免疫原与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂完全混合后在皮下注射免疫BALB/c鼠，接种是每2星期到4星期进行一次，加强免疫3～4次，至免疫动物中所接种抗原的抗体效价充分增加至1:50000。用ELISA法测定免疫小鼠尾血血清中抗体滴度。融合前4天末次加强免疫。

1.2根据常用的方法，如“单克隆抗体制备技术”中所述的方法，取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0融合，融合剂采用50％PEG。

1.3以HAT选择性培养基选择性培养融合细胞，杀死未融合的骨髓瘤细胞。同时用间接ELISA筛选抗CypA蛋白抗体表达阳性的杂交瘤细胞，对阳性杂交瘤细胞连续通过有限稀释方法进行克隆，得到产生单克隆抗体的单个杂交瘤克隆。送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：C201126。

1.4将获得的杂交瘤细胞注射BALB/c鼠腹腔，细胞浓度为1.5×10⁶/鼠。10～14天后收集含有高浓度的单克隆抗体的腹水以提供纯化靶单克隆抗体的原材料。

1.5使用蛋白A－Sepharose4B吸附层析柱纯化腹水中的抗体。

得到的抗体即为抗人CypA单克隆抗体，该抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；重链可变区基因核苷酸序列如SEQID NO：3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

实施例2抗CypA鼠单克隆抗体Ig亚型的鉴定

按市售鼠单抗亚型鉴定试剂盒(PIERCE)说明书进行实施例1得到的抗CypA鼠单克隆抗体的免疫球蛋白亚型鉴定，采用收集的细胞分泌抗体上清按照步骤进行鉴定。实验结果如附图1所示：所获得的免疫球蛋白为IgG1亚型，轻链为κ链。

实施例3抗CypA鼠单克隆抗体重链、轻链可变区基因的鉴定

提取杂交瘤细胞总RNA，使用市售逆转录酶cDNA合成试剂盒，再以获得的cDNA为模板，使用针对小鼠轻链和重链可变区基因的通用引物进行PCR扩增。所使用的小鼠免疫球蛋白基因轻链可变区上游端引物为：

LL1：5’-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’；

LL2：5’-GGGGATATCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG-3’；

LL3：5’-GGGGATATCCACCATGGAG(AT)CACA(GT)(AT)CTCGGGTCTTT(GA)TA-3’；

LL5：5’-GGATATCCACCATG(GT)CCCC(AT)(AG)CTCAG(CT)TC(CT)CT(TG)GT-3’；

MVK：5’-GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3’；

小鼠免疫球蛋白基因轻链可变区下游端引物为：

1121-151：5'-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’。

小鼠免疫球蛋白基因重链可变区上游端引物为：

VHL1：5’-GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT-3’；

VHL2：5’-GGGGATATCCACCATG(AG)ACTTCGGG(TC)TGAGCT(TG)GGTTTT-3’；

VHL3：5’-GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3’；

VHL4：5’-GGGGATATCCACCATGAT(AG)GTGTT(AG)AGTCTT(CT)TGT(AG)CCTG-3’；

VH1bach：5'-AGGT(GC)(AC)A(GA)CT(GT)CTCGAGTC(AT)GG-3’；

ProMVH：5'-GAC(AT)GATGGGG(CG)TGT(CT)GTGCTAGCTG(CA)(AG)GAGAC(GTA)GTGT-3’；

小鼠免疫球蛋白基因重链可变区下游端引物：

1121-152：5'-AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT-3’。

PCR扩增条件为：94℃5min，94℃1min，52℃1min，72℃2min，35个循环后，72℃10min。获得的PCR阳性扩增产物进行序列测定。最后将所获得的序列提交IMGT国际免疫球蛋白基因数据库(网址：http://imgt.cines.fr/)和NCBI抗体基因序列数据库(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)，进行轻、重链可变区基因胚系基因来源分析和同源性比较。分析结果如下：

(1)抗CypA鼠单抗轻链可变区的胚系基因来源:

V-GENE:Musmus IGKV6-15*01F

J-GENE:Musmus IGKJ5*01F

通过FR-IMGT和CDR-IMGT分析显示：

CDR1：CAGAATGTGGGTAATAAA

CDR2：TCGGCATCC

CDR3：CAGCAATATAACAGCTATCCGGTCACG

NCBI中同源性比较结果显示：

Query ID lcl|11943

Query Length：1128letters

Database:All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no EST,STS,GSS,environmental samples or phase 0,1or 2HTGS sequences)

Number of sequences：2,655,401；

Number of letters：29,494,641,191

emb|FN422002.1|Mus musculus mRNA for aberrant immunoglobulin kappachain(IgK gene),hybridoma cell line SP2/0

Length＝934

Score＝1310bits(709),Expect＝0.0

Identities＝711/712(99％),Gaps＝0/712(0％)

Strand＝Plus/Plus

(2)抗CypA鼠单抗重链可变区的胚系基因来源:

V-GENE：Musmus IGHV1S53*02F,or Musmus IGHV1S53*03F

J-GENE：Musmus IGHJ2*01F

D-GENE：Musmus IGHD2-4*01F

通过FR-IMGT和CDR-IMGT分析显示：

CDR1：GGCTACACCTTCACTGACCATGCT

CDR2：TTTTCTCCCGGAAATGGTGATATT

CDR3：AAAAGAAGGGGGGACATCTACTTTGATTACAGAGGGGACTAC

NCBI中同源性比较结果显示：

Query ID：lcl|22161

Query Length：1101letters

Number of sequences：2,655,401；

Number of letters：29,494,641,191

GENE ID:636126 LOC636126|similar to Ig heavy chain V region VH558A1/A4

precursor[Mus musculus]

Length＝381

Score＝494 bits(267),Expect＝1e-136

Identities＝306/325(94％),Gaps＝2/325(0％)

Strand＝Plus/Plus

综合上述结果所示，所获得的抗CypA鼠单抗可变区基因序列的来自小鼠胚系基因，可变区基因序列与已报道的小鼠抗体基因均不完全一致，属于一种新的有功能的针对人CypA蛋白的抗体基因。

实施例4用抗CypA单克隆抗体检测培养细胞中CypA蛋白水平表达

采用免疫荧光技术检测培养细胞中CypA蛋白水平表达，简要步骤如下：实验前一天将体外培养的人肝癌细胞系Huh-7和乳腺癌细胞MADB-106铺有小盖玻片的6孔板中，37℃，5％CO₂培养过夜。第二天用4％多聚甲醛固定10分钟；PBS漂洗5min×3次；0.2％-0.5％Triton X-100(PBS配制)对细胞透化处理10min；PBS漂洗5min×3次；正常羊血清(1：50PBS配制)室温封闭30min；用单克隆抗体(1：200稀释，腹水)室温孵育1h；PBS洗液洗涤后，加入FITC标记的羊抗小鼠二抗，室温孵育30min；PBS洗液洗涤后，加入0.5μg/ml DAPI(PBS配制)染色10min；PBS洗液洗涤除去多余的DAPI后，封片，于荧光显微镜下进行观察。免疫荧光检测结果说明(如附图2所示)，所制备的抗CypA单克隆抗体可以结合培养细胞中的CypA蛋白，表明所制备的抗体具有特异的抗原结合活性。

实施例5用抗CypA鼠单克隆抗体检测人体组织中的CypA蛋白的表达

采用常规免疫组化染色操作。简要步骤如下：将石蜡包埋的正常人肝和肝癌组织标本切片后60℃烤片过夜，常规脱蜡水化。3％H₂O₂处理去除内源性过氧化物酶。正常山羊血清封闭后用鼠单抗(6.5μg/ml)室温孵育切片2h；PBST洗液洗涤后依次用生物素标记羊抗鼠IgG和HRP标记链霉卵白素孵育，最后进行DAB显色。实验结果如附图3所示：抗CypA鼠单克隆抗体染色为阳性，说明该抗体可以检测到人体组织中的CypA蛋白的表达，抗CypA鼠单抗可以特异性的与肝组织细胞的胞浆和胞核中表达的CypA蛋白结合，进一步也说明所制备的抗CypA单克隆抗体对CypA蛋白的结合具有抗原结合活性。

实施例6抗CypA鼠单克隆抗体中和CypA刺激基质金属蛋白酶(MMPs)分泌的生物学活性

用明胶酶谱法检测CypA刺激基质金属蛋白酶(MMPs)分泌的生物学活性。简要实验步骤如下：

1).取对数生长期的HL-60细胞，用无血清DMEM培养基冲洗3次，计数。取5×10⁵/孔个细胞重悬于100μl DMEM培养基中，种于96孔板中。实验分组，加入抗CypA鼠单克隆抗体；另几孔中分别加入CSA作为阳性对照、PBS作为空白对照和小鼠IgG作为无关对照。37℃、5％CO₂恒温培养24小时。

2).收取细胞培养上清，4℃、2000rpm离心10min，取相同体积培养上清与5×上样缓冲液混合。

3).25μl/上样，4℃、100V进行SDS-PAGE电泳，至溴酚兰跑至分离胶的底部。

4).电泳结束后，将凝胶置于洗脱液(2.5％Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7.6)中振荡洗脱2次，每次1h。然后用漂洗液(除不含Triton X-100外其余同洗脱液)漂洗2次，每次20分钟。将凝胶置于孵育液(50mmol/L Tris-HCl,5mmol/CaCl2,1μmol/L ZnCl2,0.02％Brij-35，pH7.6)中37℃孵育42h。

5).孵育结束后经染色液(0.05％Coomassic亮蓝、30％甲醇、10％乙酸)染色3h，及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30％、20％、10％,乙酸浓度分别为10％、10％、5％)分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2(72KD)和MMP-9(92KD)为位于蓝色背景上的透亮带。用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。

实验结果如附图4所示：抗CypA单克隆抗体能降低并中和CypA刺激基质金属蛋白酶(MMPs)分泌的生物学活性，减少MMP-9对明胶的分解能力。上述结果进一步说明所制备的抗CypA单克隆抗体具有生物学活性，可以抑制基质金属蛋白酶(MMPs)分泌，因此对肿瘤细胞的侵袭、炎性细胞的浸润等具有抑制活性，从而达到抑制肿瘤细胞的侵袭、转移或抑制炎性细胞进一步的趋化，从而达到降低相关炎-癌细胞的生物学活性功能。

核苷酸序列表电子文件

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>杂交瘤细胞、抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体及其应用

<160> 23

<210> 1

<211> 360

<212> DNA

<213> 小鼠

<220> 抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体重链可变区核苷酸序列

<400> 1

cag gtt cag ctg cag cag tct gac gct gag ttg gtg aaa cct ggg gct tcagtg aag ata tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc act gac cat gct att cac tggctg aaa cag agg cct gaa cag ggc ctg gaa tgg att gga tat ttt tct ccc gga aatggt gat att aag tac aat gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act gca gac aaatcc tcc agc act gcc tac atg cag ctc aac agc ctg aca tct gag gat tct gca ctgtat ttc tgt aaa aga agg ggg gac atc tac ttt gat tac aga ggg gac tac tgg ggccaa ggc acc act ctc aca gtc tcc

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠

<220> 抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体重链可变区氨基酸序列

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala SerVal Lys Ile Ser Cys Lys 23

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Ala Ile His Trp Leu Lys Gln ArgPro Glu Gln Gly Leu Glu 46

Trp Ile Gly Tyr Phe Ser Pro Gly Asn Gly Asp Ile Lys Tyr Asn Glu LysPhe Lys Gly Lys Ala Thr 69

Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser LeuThr Ser Glu Asp Ser Ala 92

Leu Tyr Phe Cys Lys Arg Arg Gly Asp Ile Tyr Phe Asp Tyr Arg Gly AspTyr Trp Gly Gln Gly Thr 115

Thr Leu Thr Val Ser 120

<210> 3

<211> 406

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体轻链可变区核苷酸序列

<400> 3

gac att gtg ctg aca cag tct cct gct tcc tta gct gta tct ctg ggg cagagg gcc acc atc tca tac agg gcc agc aaa agt gtc agt aca tct ggc tat agt tatatg cac tgg aac caa cag aaa cca gga cag cca ccc aga ctc ctc atc tat ctt gtatcc aac cta gaa tct ggg gtc cct gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gacttc acc ctc aac atc cat cct gtg gag gag gag gat gct gca acc tat tac tgt cagcac att agg gag ctt aca cgt tcg gag ggg gga cca agc tgg aaa

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列

<400> 4

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly GlnArg Ala Thr Ile Ser Tyr 23

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp AsnGln Gln Lys Pro Gly Gln 46

Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val ProAla Arg Phe Ser Gly Ser 69

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu AspAla Ala Thr Tyr Tyr Cys 92

Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys 108

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>小鼠免疫球蛋白基因轻链可变区上游端引物LL1

<400> 5

5’-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>小鼠免疫球蛋白基因轻链可变区上游端引物LL2

<400> 6

5’-GGGGATATCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG-3’

<210> 7

<211> 52

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>小鼠免疫球蛋白基因轻链可变区上游端引物LL3

<400> 7

5’-GGGGATATCCACCATGGAG(AT)CACA(GT)(AT)CTCGGGTCTTT(GA)TA-3’

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>小鼠免疫球蛋白基因轻链可变区上游端引物LL5

<400> 8

5’-GGATATCCACCATG(GT)CCCC(AT)(AG)CTCAG(CT)TC(CT)CT(TG)GT-3’

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>小鼠免疫球蛋白基因轻链可变区上游端引物MVK

<400> 9

5’-GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3’

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 小鼠

<220> 小鼠免疫球蛋白基因轻链可变区下游端引物1121-151

<400> 10

5'-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’

<210> 11

<211> 54

<212> DNA

<213> 小鼠

<220> 小鼠免疫球蛋白基因重链可变区上游端引物VHL1

<400> 11

5’-GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT- 3’

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 小鼠

<220> 小鼠免疫球蛋白基因重链可变区上游端引物VHL2

<400> 12

5’-GGGGATATCCACCATG(AG)ACTTCGGG(TC)TGAGCT(TG)GGTTTT-3’

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 小鼠

<220> 小鼠免疫球蛋白基因重链可变区上游端引物VHL3

<400> 13

5’-GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3’

<210> 14

<211> 52

<212> DNA

<213> 小鼠

<220> 小鼠免疫球蛋白基因重链可变区上游端引物VHL4

<400> 14

5’-GGGGATATCCACCATGAT(AG)GTGTT(AG)AGTCTT(CT)TGT(AG)CCTG-3’

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 小鼠

<220> 小鼠免疫球蛋白基因重链可变区上游端引物VH1 bach

<400> 15

5'-AGGT（GC）(AC)A(GA)CT(GT)CTCGAGTC(AT)GG-3’

<210> 16

<211> 57

<212> DNA

<213> 小鼠

<220> 小鼠免疫球蛋白基因重链可变区上游端引物ProMVH

<400> 16

5'-GAC(AT)GATGGGG(CG)TGT(CT)GTGCTAGCTG(CA)(AG)GAGAC(GTA) GTGT-3’

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>小鼠免疫球蛋白基因重链可变区下游端引物1121-152

<400> 17

5'-AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT-3’

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>抗CypA鼠单抗轻链可变区CDR1

<400> 18

AAA AGT GTC AGT ACA TCT GGC TAT AGT TAT

<210> 19

<211> 9

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>抗CypA鼠单抗轻链可变区CDR2

<400> 19

CTT GTA TCC

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>抗CypA鼠单抗轻链可变区CDR3

<400> 20

CAG CAC ATT AGG GAG CTT

<210> 21

<211> 15

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>抗CypA鼠单抗重链可变区 CDR1

<400> 21

GACCATGCTATTCAC

<210> 22

<211> 51

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>抗CypA鼠单抗重链可变区 CDR2

<400> 22

TATTTTTCTCCCGGAAATGGTGATATTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGC

<210> 23

<211> 42

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>抗CypA鼠单抗重链可变区 CDR3

<400> 23

AAAAGAAGGGGGGACATCTACTTTGATTACAGAGGGGACTAC

Claims

1.一种杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞的保藏编号为CCTCC NO：C201126。

2.一种抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体，其特征在于，所述的抗体由保藏编号为CCTCCNO：C201126的杂交瘤细胞分泌得到，该抗体特异性识别CypA蛋白。

3.一种抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体，其特征在于，所述的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

4.根据权利要求3所述的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体，其特征在于，所述的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体的轻链可变区基因序列包括轻链可变区CDR1、轻链可变区CDR2和轻链可变区CDR3，轻链可变区CDR1的基因序列如SEQ ID NO:18所示，轻链可变区CDR2的基因序列如SEQ ID NO:19所示，轻链可变区CDR3的基因序列如SEQ ID NO:20所示；

所述的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体的重链可变区基因序列包括CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区CDR1的基因序列如SEQ ID NO:21所示，重链可变区CDR2的基因序列如SEQ IDNO:22所示，重链可变区CDR3的基因序列如SEQ ID NO:23所示。

5.一种免疫测定CypA的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中的抗体为权利要求2-4任一所述的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体。

6.权利要求2-4任一所述的抗人亲环素蛋白A的单克隆抗体用于制备诊断或治疗CypA刺激基质金属蛋白酶分泌引起的癌症和/或炎症药物的应用。