CN117230018B - 抗Cyclophilin A的单克隆抗体及其在治疗病毒性肺炎中的应用 - Google Patents
抗Cyclophilin A的单克隆抗体及其在治疗病毒性肺炎中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了抗Cyclophilin A的单克隆抗体及其在治疗病毒性肺炎中的应用。本发明提供了分泌anti‑CypA单抗的杂交瘤细胞SQHC14，其保藏号为CGMCC No.45049，还提供了所述杂交瘤细胞SQHC14分泌的anti‑CypA单抗。本发明的实验证明了，本发明提供了1种能分泌抗CypA单抗的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能够分泌单抗SQHC14，此单抗SQHC14可以特异性识别CypA，抑制病毒感染诱导的炎症因子分泌及白细胞迁移。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及抗Cyclophilin A的单克隆抗体及其在治疗病毒性肺炎中的应用。
背景技术
Cyclophilin A（亲环素A，CypA）具有肽基脯氨酰顺/反异构酶活性，是一种在生物界广泛存在、高度保守的蛋白质。CypA与病毒诱导的炎症反应密切相关。A型和B型流感病毒、新冠病毒等常常引发病毒性肺炎，甚至引起细胞因子风暴，这可能导致急性呼吸窘迫综合征。然而，目前的抗病毒疗法还不足以预防或治疗这些并发症。细胞内CypA在病毒感染过程中能够增强细胞内核转录因子-κB (NF-κB) p65的稳定性，并促进p65的磷酸化及其入核过程，从而上调IL-6、IL-1β等促炎细胞因子的表达。此外，当受到病毒刺激时，CypA还能分泌到细胞外。胞外CypA（eCypA）对炎症的发展进程具有重要调控作用。例如，病毒感染后，eCypA的分泌量增加，eCypA与CD147可能以配体-受体的形式发生相互作用，启动下游细胞内ERK等相关信号通路，从而促进炎症因子及趋化因子的分泌，参与调控宿主的炎症反应。
前期获得了一种抗Cyclophilin A的单克隆抗体QH01（CN 113248617 B），对A型流感病毒诱导的小鼠肺炎具有一定的治疗效果。鉴于不同单克隆抗体与CypA的结合位点不同可能导致其抗炎作用的不同，仍然有必要筛选治疗效果更好的靶向CypA的特异性抗体，促进其在病毒性肺炎治疗中的应用。
因此，寻找新的靶向CypA的抗体有望用于治疗病毒性肺炎。
发明内容
本发明的目的是提供抗Cyclophilin A的单克隆抗体及其在治疗病毒性肺炎中的应用。
第一方面，本发明提供了分泌anti-CypA单克隆抗体（简称为CypA单抗或anti-CypA单抗）的杂交瘤细胞株SQHC14，其保藏号为CGMCC No. 45049。
第二方面，本发明提供了由第一方面所述杂交瘤细胞株SQHC14分泌的anti-CypA单克隆抗体。
第三方面，本发明提供了第二方面所述的anti-CypA单克隆抗体在如下至少一种中的应用；
1）制备治疗病毒性肺炎的产品；
2）制备抑制由病毒感染引发的炎症反应和/或白细胞趋化的产品；
上文抑制由病毒感染引发的炎症反应和/或白细胞趋化具体体现在降低细胞中白细胞介素1β（IL-1β）和/或CC趋化因子配体2（CCL2）含量。
3）制备抑制由病毒感染引发的机体炎症反应的产品；
上文机体炎症反应进一步为肺炎，具体体现在肺指数下降，或降低机体中CCL2和IL-1β的含量；
4）制备抑制炎症发生引起的白细胞粘附的产品；
5）制备抑制炎症发生引起的白细胞迁移的产品；
6）制备检测亲环素A的产品。
上文所述应用中，所述病毒为流感病毒或其他诱发肺炎的病毒。
第四方面，本发明提供了一种产品，其包括第二方面所述的anti-CypA单克隆抗体。
上文所述产品具有如下至少一种功能：
1）治疗病毒性肺炎；
2）抑制由病毒感染引发的炎症反应和/或白细胞趋化；
3）抑制由病毒感染引发的机体炎症反应；
4）抑制炎症发生引起的白细胞粘附；
5）抑制炎症发生引起的白细胞迁移；
6）检测亲环素A。
上文中，所述产品为试剂盒。
第五方面，本发明提供了一种检测亲环素A的方法，包括如下步骤：以第二方面所述的anti-CypA单克隆抗体作为抗体，检测待测样品中是否含有亲环素A。
本发明的实验证明，本发明提供了1种能分泌抗CypA单抗的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能够分泌单抗（SQHC14），此单抗（SQHC14）可以特异性识别CypA，抑制病毒感染诱导的炎症因子分泌及白细胞迁移。
保藏说明
菌种名称：SQHC14
分类命名：小鼠杂交瘤细胞
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年2月24日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 45049
附图说明
图1为ELISA检测SQHC14单抗的效价。
图2为SQHC14检测细胞和组织中CypA的表达。
图3为SQHC14抑制THP1细胞粘附和迁移。
图4为SQHC14抑制IAV诱导THP1细胞中趋化因子和细胞因子的表达。
图5 为SQHC14治疗IAV诱导的肺炎模型中小鼠的肺指数。
图6 为SQHC14治疗IAV诱导的肺炎模型中小鼠趋化因子和细胞因子的表达。
图7为SQHC14抑制IBV诱导THP1细胞中趋化因子和细胞因子的表达。
图8为SQHC14治疗IBV诱导的肺炎模型中小鼠的肺指数。
图9为SQHC14治疗IBV诱导的肺炎模型中小鼠趋化因子和细胞因子的表达。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
雌性C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物有限责任公司。
实施例中的CypA单抗QH01为CN 113248617 B（授权公告日2021.10.01；申请号202110682376.5）中的QH01，分泌其的杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No.21909。
以下的实施例中的PBS（pH：7.2-7.4）购自北京索莱宝科技有限公司，货号为P1020。
以下的实施例中CypA蛋白购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，货号为CR15。
ELISA方法所用试剂如下：
包被液（pH=9.6）购自北京索莱宝科技有限公司，货号为C1050。
洗涤液（pH：7.2-7.4）购自北京索莱宝科技有限公司，货号为P1031。
封闭液为含（质量体积百分含量，g:ml）2%脱脂奶粉的洗涤液；
显色液为体积百分比1%A液和10%B液混合得到，其中，A液：1%TMB in DMSO；B液：含0.1% CH4N2O·H2O2的柠檬酸缓冲液。
终止液为0.5M硫酸水溶液。
实施例1、anti-CypA单抗的制备
一、分泌anti-CypA单抗的杂交瘤细胞株的获得
1、免疫小鼠
对6只SPF级BALB/c雌性小鼠免疫CypA蛋白，肌肉注射初次免疫，免疫量为20 μg蛋白/只小鼠；随后以相同的方式和剂量进行后续6次加强免疫，每次免疫间隔一周；加强免疫结束一周后用50 μg CypA蛋白腹腔冲击免疫小鼠，完成最终免疫，并在一周之后，对小鼠眼眶取血，测定血清抗体效价。
2、筛选SQHA4
①ELISA检测免疫的6只小鼠的血清效价，筛选效价较高的小鼠进行杂交瘤融合。
②细胞融合实验：取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。融合完细胞用半固体培养基（含HAT）进行筛选培养。
③挑取单克隆：挑10板×93个细胞单克隆，培养于96孔细胞培养板（事先用胸腺细胞铺板，100 μL/孔）。
④单克隆细胞初次筛选：将96孔培养板中的单克隆细胞上清全部弃去，添加200 μL/孔，20%新生牛IMDM培养基（含HT），做第一次筛选。
⑤单克隆细胞二次筛选：用重组CypA蛋白包板，对挑选的克隆采用ELISA方法，做第二次筛选，得到阳性杂交瘤细胞株。
⑥单克隆细胞三次筛选：将二次筛选得到的阳性的细胞株，分别用重组CypA蛋白和“标签蛋白”包板，采用ELISA方法，做第三次筛选，最终得到分泌CypA单抗（SQHC14）的杂交瘤细胞株SQHC14。
分泌SQHC14的杂交瘤细胞株已于2022年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101），保藏号为 CGMCC No. 45049，分类命名为小鼠杂交瘤细胞。
二、腹水制备anti-CypA单抗
将上述获得的分泌SQHC14的杂交瘤细胞株SQHC14。注射BALB/c小鼠腹腔，细胞浓度为1.5×106/鼠。10～14天后收集腹水。
使用Protein G-Sepharose4B吸附层析柱纯化腹水中的抗体，得到anti-CypA单抗SQHC14，将抗体收集到0.1 M甘氨酸-盐酸缓冲液中（pH=2.7），随后将抗体置换到PBS中保存并用于后续实验。
采用ELISA方法检测anti-CypA单抗SQHC14的效价，并将其效价与CypA单抗QH01对比。
1. 用包被液稀释CypA蛋白，终浓度为2ug/ml，100ul/孔，4℃，过夜，后用洗涤液洗涤3次；
2. 封闭液封闭，200ul/孔，37℃孵育2h，后用洗涤液洗涤3次；
3. 加入一抗（anti-CypA单抗SQHC14或CypA单抗QH01）或PBS（Blank），首孔10 μg/mL, 再用PBS进行4倍梯度稀释, 8个点, 末孔空白，100 μL/well, 25 ℃孵育1 h，后用洗涤液洗涤3次；
4. 加入PBS稀释10000倍的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗（购自爱博泰克生物技术有限公司，目录号：AS003），100 μL /孔，25 ℃孵育1h，取出后用洗涤液洗涤3次；
5. 加入显色液100 μL /孔，显色时间为10 min左右；
6. 每孔加入50 μL终止液终止；
7. 双波长（450nm，630 nm）测吸光值，记录保存数据；
分析结果如图1所示，anti-CypA单抗SQHC14的半数有效浓度（EC50）为0.02899 μg/mL，QH01的EC50为2.415μg/mL。
实施例2、anti-CypA单抗SQHC14亚型鉴定
用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒（购自proteintech公司，目录号为PK20002）鉴定anti-CypA单抗SQHC14的亚型。步骤参照说明书。
分析结果如表1所示，anti-CypA单抗SQHC14的重链为IgG1，轻链为κ。
实施例3、检测anti-CypA单抗SQHC14对细胞系和小鼠组织中CypA的特异性识别
分别使用含Protease Inhibitor Cocktail（Roche，#5871，用量参照说明书）的Lysis Buffer（150 mM NaCl，20 mM HEPES，1 mM EDTA，1% Triton100，10%甘油）裂解人单核细胞白血病细胞系（THP1，购自ATCC，TIB-202）及6-8周龄雌性C57BL/6小鼠（购自维通利华，以下简称小鼠）肺、脾和淋巴结等组织，收集裂解产物。
向各自裂解产物中加入适量的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，98 ℃加热15 min。以实施例1制备的来自腹水的anti-CypA单抗SQHC14及抗GAPDH抗体（Santa Cruz公司，产品目录号为sc-1616-R）作为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠的单克隆抗体（Jackson，产品目录号为115035003）作为二抗，进行常规SDS-PAGE电泳和Western印迹分析。
anti-CypA单抗SQHC14对细胞和小鼠各组织中CypA的特异性识别结果如图2所示，2A为anti-CypA单抗SQHC14对细胞中CypA的特异性识别结果，2B为anti-CypA单抗SQHC14对小鼠各组织中CypA的特异性识别结果，可以看出，anti-CypA单抗SQHC14能特异性识别细胞系和小鼠不同组织中的CypA蛋白（分子量约18 kDa）。
实施例4、检测anti-CypA单抗SQHC14对THP1细胞粘附及迁移的作用
趋化因子诱导的免疫细胞在肺脏的过度聚集是病毒性肺炎发生的主要因素之一，此聚集过程的关键步骤为白细胞的粘附和迁移。用CCL2诱导THP1细胞的粘附和迁移，模拟肺炎发生时免疫细胞的聚集过程，检测CypA抗体发挥的作用。
在本实验中，将CypA单抗（QH01）与实施例1制备的SQHC14单抗对比，具体设置为空白组（PBS）、趋化因子组（CCL2）、抗体组1（CCL2+SQHC14）和抗体组2（CCL2+QH01）共4组。
在粘附实验中，分别用1640培养基（PBS组），含有20 n g/mL CCL2（购自MCE公司，目录号为HY-P700034AF）的1640培养基（趋化因子组），含有50 nM SQHC14+20 n g/mL CCL2的1640培养基（抗体组1），含有50 nM QH01+20 n g/mL CCL2的1640培养基（抗体组2）重悬THP1细胞，加入到包被有5 mg/mL 的ICAM1的96孔板中，在细胞培养箱孵育后收集未贴壁的细胞，剩余贴壁的细胞用细胞刮刀收集后计数；用贴壁细胞与总细胞（未贴壁细胞+贴壁细胞）的比值确定细胞的相对粘附情况。
在迁移实验中，分别用1640培养基（PBS组），含有20 n g/mL CCL2（购自MCE公司，目录号为HY-P700034AF）的1640培养基（趋化因子组），含有50 nM SQHC14+20 n g/mL CCL2的1640培养基（抗体组1），含有50 nM QH01+20 n g/mL CCL2的1640培养基（抗体组2）重悬THP1细胞，加入到铺有2×105人血管内皮细胞（购自ATCC,CRL-1730）的transwell上室中，在细胞培养箱孵育后分别收集transwell上室和下室中的细胞并计数；用下室细胞数与总细胞（上室细胞+下室细胞）的比值确定细胞的相对迁移情况。
实验结果如图3所示，A为粘附实验结果，B为迁移实验结果，可以看出，SQHC14明显抑制CCL2诱导的THP1细胞对ICAM1的粘附和跨内皮细胞迁移（P＜0.01），此外，QH01对CCL2诱导THP1细胞的粘附和跨内皮细胞迁移作用较弱（P＞0.05）。上述结果表明，SQHC14可以抑制炎症发生时白细胞的粘附和/或迁移，抑制炎症反应。
实施例5、检测SQHC14对A型流感病毒（IAV）感染THP1细胞后趋化因子和细胞因子分泌的作用
CC趋化因子配体2（CCL2）和白细胞介素1β（IL-1β）分别对病毒感染引起的炎症反应及白细胞趋化至关重要。
在本实验中，将CypA单抗（QH01）与SQHC14对比。具体分组为空白组（PBS）、感染组（IAV）、抗体组1（IAV+SQHC14）和抗体组2（IAV+QH01）共4组。
具体如下：
IAV(H1N1-WSN毒株)由本实验室拯救并繁殖，该毒株记载在如下文献中，Zheng etal., 2019, Cell Reports 27, 1875–1885，在文献中的名称为Influenza virus A/WSN/33 (H1N1)。
PBS组：PBS处理2 h，细胞悬浮在1640培养基培养12 h；
感染组：IAV感染THP1细胞（感染量106PFU,MOI值为1.0）2 h，细胞悬浮在1640培养基培养12 h；
抗体组1（IAV+SQHC14）：IAV感染THP1细胞（感染量106PFU,MOI值为1.0）2 h，后更换为含50 nM SQHC14的1640培养基继续培养12 h；
抗体组2（IAV+QH01）：IAV感染THP1细胞（感染量106PFU,MOI值为1.0）2 h，后更换为含50 nM QH01的1640培养基继续培养12 h；
收集上述各组细胞上清用于后续ELISA检测。
利用人CCL2（杭州联科生物技术有限公司，目录号为70-EK187）和IL-1β（杭州联科生物技术有限公司，目录号为70-EK101）ELISA试剂盒检测CypA单抗对IAV感染THP1细胞上清中CCL2和IL-1β分泌的作用。步骤参照说明书。
结果如图4所示，A为CCL2含量检测结果，B为IL-1β含量检测结果，可以看出，抗体组1的CCL2和IL-1β的含量相比于感染组明显下降（P＜0.01），尽管抗体组2的CCL2和IL-1β的含量相比于感染组同样下降明显且具有统计学意义（P＜0.05），但是抗体组2的下降趋势显著小于抗体组1，并且二者之间有统计学差异（P＜0.05）。
因此，对于IAV感染THP1细胞，SQHC14对CCL2和IL-1β的表达抑制作用比QH01更强，表明其能够抑制病毒感染引起的炎症反应及白细胞趋化。
实施例6、anti-CypA单抗SQHC14对IAV诱导小鼠肺炎的治疗效果
一、小鼠分组和IAV诱导小鼠肺炎模型的构建
（1）小鼠分组
取7-8周龄C57BL/6小鼠随机分组，具体分组为空白组（PBS，购自大连美仑生物，MA0008）、感染组（IAV）、抗体组1（IAV+SQHC14）和抗体组2（IAV+QH01）共4组，每组6只（体重19±3g）。
（2）构建小鼠病毒性肺炎的治疗模型
C57BL/6小鼠按200 μL/10g体重腹腔注射阿弗丁麻醉，小鼠麻醉后，进行如下各组操作：
空白组（PBS）：每只小鼠经鼻腔滴注50 μL PBS；再在抗体组对应注射抗体的相同时间注射100 μL PBS。
感染组：每只小鼠经鼻腔滴注50 μL含2000 PFU IAV-WSN的PBS，IAV-WSN由本实验室拯救并繁殖，该毒株记载在如下文献中，Zheng et al., 2019, Cell Reports 27,1875–1885，在文献中的名称为Influenza virus A/WSN/33 (H1N1)；再在抗体组对应注射抗体的相同时间注射100 μL PBS。
抗体组1：每只小鼠经鼻腔滴注50 μL含2000 PFU IAV-WSN的PBS，在每只小鼠于IAV感染后24 h腹腔注射实施例1制备的SQHC14单抗（10 mg/kg体重，溶于100 μL PBS）。
抗体组2：每只小鼠经鼻腔滴注50 μL含2000 PFU IAV-WSN的PBS，在每只小鼠于IAV感染后24 h腹腔注射QH01单抗（10 mg/kg体重，溶于100 μL PBS）。
上述各组在治疗后第7天（以注射抗体当天记作第0天）进行肺指数和肺组织细胞因子表达水平的检测。
二、肺指数检测
乙醚麻醉各组小鼠，称重。将小鼠的血液采集干净，小鼠呈仰卧位固定。打开胸腔，剔除掉食道和心脏，分离出肺组织并称重。小鼠肺称重计算肺指数=小鼠肺重÷小鼠体重。肺指数是判断肺部炎症严重程度非常重要的指标，炎症会导致肺指数增高。
结果如图5所示，抗体组1小鼠的肺指数相比于感染组明显下降（P＜0.01），抗体组2小鼠的肺指数相比于感染组也有下降趋势（P＜0.05），但没有抗体组1的下降趋势明显。抗体组1小鼠的肺指数相比于抗体组2差异显著（P＜0.05）。因此，在IAV诱导的肺炎模型中，SQHC14表现出优于QH01的治疗效果。
三、肺组织趋化因子和细胞因子表达水平的检测
（1）取支气管肺泡灌洗涤液（BALF）
将各组小鼠脱颈处死；心脏采血收集鼠全血，注射器头固定小鼠四肢；打开胸腔，使用眼科剪（弯）垂直在气管最粗处（喉结处附近）剪开小口后眼科剪（弯）再垂直于切口剪出T字切口，将剪好的注射器卸下注射器头，将注射器头小心插入气管，并用线绑定两次固定注射器头，注射器吸1 mL PBS后用止血钳夹住注射器头卡槽处，将注射器安上，缓慢推入肺中，5-10 s后再缓慢吸出（1 mL能回收约0.8 mL），再用止血钳夹住注射器头旋转褪下注射器，将肺泡灌洗涤液缓慢小心的注入EP管中；重复灌洗，既得支气管肺泡灌洗涤液。
（2）酶联免疫吸附法（ELISA）检测趋化因子和细胞因子
小鼠CCL2和IL-1β对病毒感染引起的炎症反应及单核细胞向组织浸润至关重要。利用小鼠CCL2（杭州联科生物技术有限公司，目录号为70-EK287）和IL-1β（杭州联科生物技术有限公司，目录号为70-EK201B）的ELISA试剂盒检测小鼠BALF中CCL2和IL-1β的含量。步骤参照说明书。
结果如图6所示，A为CCL2含量检测结果，B为IL-1β含量检测结果，抗体组1（图中记作治疗组1）小鼠BALF中CCL2和IL-1β的含量相比于感染组明显下降（P＜0.01），尽管抗体组2 （图中记作治疗组2）BALF中CCL2和IL-1β的含量相比于感染组也有下降趋势（P＜0.05），但是抗体组2的下降趋势明显小于抗体组1。与抗体组2相比，抗体组1的CCL2和IL-1β的含量更低，具有统计学差异（P＜0.05）。
因此，在IAV诱导的肺炎模型中，SQHC14表现出优于QH01的治疗效果。
实施例7、检测SQHC14对B型流感病毒（IBV）感染THP1细胞后趋化因子和细胞因子分泌的作用
在本实验中，将CypA单抗（QH01）与实施例1获得的SQHC14单抗对比。具体分组为空白组（PBS）、感染组（IBV）、抗体组1（IBV+SQHC14）和抗体组2（IBV+QH01）共4组。
具体如下：
IBV，该毒株记载在如下文献中，Zheng et al., 2019, Cell Reports 27, 1875–1885，在文献中的名称为Influenza virus B/Guangxi/JZ1352/2018。
PBS组：PBS处理2 h，细胞悬浮在1640培养基培养12 h；
感染组：IBV感染THP1细胞（感染量106PFU,MOI值为1.0）2 h，细胞悬浮在1640培养基培养12 h；
抗体组1（IBV+SQHC14）：IBV感染THP1细胞（感染量106PFU,MOI值为1.0）2 h，后更换为含50 nM SQHC14的1640培养基继续培养12 h；
抗体组2（IBV+QH01）：IBV感染THP1细胞（感染量106PFU,MOI值为1.0）2 h，后更换为含50 nM QH01的1640培养基继续培养12 h；
收集上述各组细胞上清用于后续ELISA检测。
利用人CCL2（杭州联科生物技术有限公司，目录号为70-EK187）和IL-1β（杭州联科生物技术有限公司，目录号为70-EK101）ELISA试剂盒检测CypA单抗对IBV感染THP1细胞上清中CCL2和IL-1β分泌的作用。步骤参照说明书。
结果如图7所示，A为CCL2含量检测结果，B为IL-1β含量检测结果，抗体组1的CCL2和IL-1β的含量相比于感染组明显下降（P＜0.01），抗体组2的CCL2和IL-1β的含量相比于感染组同样下降明显且具有统计学意义（P＜0.05），但是抗体组2的下降趋势明显小于抗体组1，并且二者之间有统计学差异（P＜0.05）。
因此，对于IBV感染THP1细胞，SQHC14对CCL2和IL-1β的抑制作用比QH01更强。
实施例8、SQHC14对IBV诱导小鼠肺炎的治疗效果
一、小鼠分组和IBV诱导小鼠肺炎模型的构建
（1）小鼠分组
取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分组。具体分组为空白组（PBS）、感染组（IAV）、抗体组1（IAV+SQHC14）和抗体组2（IAV+QH01）共4组，每组6只（体重19±3g）。
（2）构建小鼠病毒性肺炎的治疗模型
C57BL/6小鼠按200 μL/10g体重腹腔注射阿弗丁麻醉，小鼠麻醉后，进行如下各组操作：
空白组（PBS）：每只小鼠经鼻腔滴注50 μL PBS；再在抗体组对应注射抗体的相同时间注射100 μL PBS。
感染组：每只小鼠经鼻腔滴注50 μL含2000 PFU IBV的PBS，该毒株记载在如下文献中，Zheng et al., 2019, Cell Reports 27, 1875–1885，在文献中的名称为Influenzavirus B/Guangxi/JZ1352/2018）由中国疫病预防控制中心王大燕教授提供；再在抗体组对应注射抗体的相同时间注射100 μL PBS。
抗体组1：每只小鼠经鼻腔滴注50 μL含2000 PFU IBV的PBS，在每只小鼠于IBV感染后24 h腹腔注射实施例1制备的SQHC14单抗（10 mg/kg体重，溶于100 μL PBS）。
抗体组2：每只小鼠经鼻腔滴注50 μL含2000 PFU IBV的PBS，在每只小鼠于IBV感染后24 h腹腔注射QH01单抗（10 mg/kg体重，溶于100 μL PBS）。
上述各组在治疗后第7天（以注射抗体当天记作第0天）进行肺指数和肺组织细胞因子表达水平的检测。
二、肺指数检测
方法同实施例6。
结果如图8所示，抗体组1小鼠的肺指数相比于感染组明显下降（P＜0.01），抗体组2小鼠的肺指数相比于感染组也有下降（P＜0.05），但没有抗体组1的下降趋势明显。抗体组1小鼠的肺指数相比于抗体组2差异显著（P＜0.05）。
因此，在IBV诱导的肺炎模型中，SQHC14表现出优于QH01的治疗效果。
三、肺组织趋化因子和细胞因子表达水平的检测
方法同实施例6。
结果如图9所示，A为CCL2含量检测结果，B为IL-1β含量检测结果，抗体组1（图中记作治疗组1）小鼠BALF中CCL2和IL-1β的含量相比于感染组明显下降（P＜0.01），尽管抗体组2 BALF中CCL2和IL-1β的含量相比于感染组也有下降趋势（P＜0.05），但是抗体组2（图中记作治疗组2）的下降趋势明显小于抗体组1。与抗体组2相比，抗体组1的CCL2和IL-1β的含量更低，具有统计学差异（P＜0.05）。因此，在IBV诱导的肺炎模型中，SQHC14表现出优于QH01的治疗效果。
Claims (3)
1.分泌anti-CypA单克隆抗体的杂交瘤细胞株SQHC14，其保藏号为CGMCC No. 45049。
2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株SQHC14分泌的anti-CypA单克隆抗体在制备治疗病毒性肺炎的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述产品为药品。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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