CN112611874B - 一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于多肽化学和免疫学技术领域，具体涉及一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒，所述试剂盒以人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白基因胞外区序列编码的重组蛋白为包被抗原；本发明还提供了试剂盒的检测方法，分离得到抗原‑待测抗体‑结合抗原‑MOG酶结合物的复合物，加入显色剂A和显色剂B，再加入终止液，利用酶标仪进行检测，根据吸光度OD值及标准曲线来计算MOG‑Ab的浓度。克服了现有技术的不足，能够快速而特异地检测血清中髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体，反应特异性好，灵敏度高，其操作简单、成本低廉，反应结果稳定可靠、易于观察。

Description

一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于多肽化学和免疫学技术领域，具体涉及一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒及其检测方法。
背景技术
髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)是免疫球蛋白超家族的一员，由218个氨基酸组成，是中枢神经系统髓鞘的组成部分。MOG在神经系统的发育中表达相对较晚，这提示其可能是少突胶质细胞成熟的重要表面标志，在维持髓鞘的完整性、促进细胞间信息交流中发挥重要作用。目前研究表明抗MOG抗体可能是中枢神经系统免疫性脱髓鞘疾病，如急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、多相型播散性脑脊髓炎(MDEM)、视神经炎(ON)、长节段脊髓炎(LETM)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)等的致病抗体。
目前关于MOG-Ab病的确切致病机制尚不清楚，大部分研究认为，识别MOG抗原的特异性B细胞可能存在于外周血，但由于骨髓中缺乏MOG抗原表达，使MOG特异性未成熟B细胞处于无反应状态，同时由于缺乏相应的辅助T细胞(Th细胞)辅助作用，识别MOG的特异性B细胞不能活化，而仅在外周血中增殖。当嗜神经病毒感染机体时，血-脑屏障被破坏，MOG抗原漏入外周，激活CD4+T细胞，对MOG特异性B细胞募集和激活增加，产生大量MOG-IgG；同时促炎T细胞进入中枢，募集MOG特异性B细胞流入中枢，产生相应抗体。在一些体外实验中已证实MOG-IgG可以通过补体和抗体途径介导细胞杀伤作用。而CD4+T细胞在一些细胞因子诱导下分化为Th1、Th17、Th9细胞，分泌TFN-γ、白细胞介素(IL)-12、IL-23、IL-17A等因子，通过趋化因子吸引不同种类免疫细胞，如髓样细胞、巨噬细胞等，诱发炎性级联反应，介导中枢髓鞘脱失。还有研究者在表达识别MOG的特异性T细胞受体的转基因老鼠中可以观察到自发的视神经炎，支持T细胞在MOG-Ab病中起重要作用。
MOG-Ab病患者的血液中MOG-Ab(抗MOG抗体)的量会有所升高，现有的检测方法不能准确的检测出患者血液中MOG-Ab的含量，影响患者的治疗进程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒，克服了现有技术的不足，能够快速而特异地检测血清中髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体，反应特异性好，灵敏度高，其操作简单、成本低廉，反应结果稳定可靠、易于观察。
为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：
一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒，所述试剂盒以人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白基因胞外区序列编码的重组蛋白为包被抗原。
进一步，所述重组蛋白的制备方法为：
(1)蛋白基因与载体连接；
(2)细胞的培养和转染；
(3)纯化及检测。
进一步，所述重组蛋白的氨基酸序列参见SEQIDNo.1。
进一步，所述载体为pc DNA3.4载体。
进一步，所述试剂盒内还包括包被板、校准品、结合抗原、酶结合物、显色剂A、显色剂B和终止液。
进一步，所述包被板上MOG蛋白包被浓度是0.25ug/ml。
进一步，所述校准品来自于人体血清，所述质控品的浓度为150ng/ml，所述校准品的浓度梯度为200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、0ng/ml。
进一步，所述显色剂A为10g/L的过氧化脲素溶液，所述显色剂B为2g/L的TMB·2HCl溶液。
1.本发明还保护了一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)将待测血液样品与重组蛋白的包被抗原混合，样品中的待测抗体与包被抗原特异性结合为包被抗原-待测抗体复合物；
(2)洗涤去除未结合待测抗体的成分，从而分离包被抗原-待测抗体复合物，再加入结合抗原，该结合抗原与包被抗原-待测抗原复合物中的待测抗体特异性结合，形成包被抗原-待测抗体-结合抗原；
(3)洗涤去除未结合的成分，从而分离包被抗原-待测抗体-结合抗原，加入MOG酶结合物，最终形成抗原-待测抗体-结合抗原-MOG酶结合物的复合物；
(4)加入显色剂A和显色剂B，再加入终止液，利用酶标仪进行检测，根据吸光度OD值及标准曲线来计算MOG-Ab的浓度。
本发明与现有技术相比较，具有以下有益效果：
本发明所述一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒，可以有效地检测血液样本中的MOG抗体的含量，检测准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好，试剂盒可以有效保存一年以上。
附图说明
图1为重组蛋白的分子量和纯度分析结果图。
图2为一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒检测方法中标准曲线图。
图3为一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒检测方法中线性曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒，所述试剂盒采用双抗原夹心法检测所述人MOG抗体，所述试剂盒的组成如下：
预包被板：48/96孔
MOG-Ab校准品：5个，5×1ml(浓度分别为0ug/ml、0.5ug/ml、1ug/ml、2ug/ml，5ug/ml、10ug/ml)
MOG-Ab质控品：1个，来源于人血清，质控范围为7±1.05ug/ml
MOG-Ab结合抗原：1个，生物素标记的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)结合抗原，
1×5.0ml
MOG酶结合物：链霉素标记的辣根过氧化物酶，2个，2×5.0ml
显色剂A：主要成分为过氧化脲素，1个，1×5.0ml
显色剂B：主要成份为3,3,5,5,－四甲基联苯胺盐酸盐(TMB·2HCl)，1个，1×5.0ml
浓缩洗涤液(25×)：浓缩的磷酸缓冲液，使用前按1：24稀释，1×20.0ml
终止液：2mol/L硫酸溶液，1×5.0ml
在该试剂盒中，所述的“包被抗原”是指(即包被于固相的酶标板上的抗原)，其能够与待测抗体特异性结合。用于包被于酶标板上的MOG蛋白的制备技术如下：
MOG蛋白基因与pc DNA3.4载体连接方法及所需仪器和试剂如下：
实验仪器：旋涡混合器、微量移液取样器、移液器吸头、1.5ml微量离心管、双面离心管架、台式离心机、干式恒温气浴
所用试剂如下：pc DNA3.4载体、T4噬菌体DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液(10X)、无菌dd water
MOG蛋白基因与pc DNA3.4载体连接方法：
1、将干式恒温仪温度设定在13--15℃；
2、取4个灭菌的200ul微量离心管，分别依次加入如下试剂：4--6ul MOG蛋白基因、1--1.5ul pc DNA3.4载体、0.5--0.8ul T4噬菌体DNA连接酶、1.5--2ul T4 DNA连接酶缓冲液(10X)、3.6--4ul dd water
3、将上述混合液轻轻震荡后再进行离心30s--60s、然后置于13--15℃干式恒温仪中保温过夜(12-15h)后，获得载体和目的基因的连接产物。
细胞培养和转染：
1、细胞培养：取6cm细胞培养皿，向每孔中加入2ml含1--2×105个HD293F细胞培养液后将细胞培养皿置于37℃，5％CO2培养箱内的摇床上培养72h左右；
2、在转染前一天，将培养好的HD 293F细胞以一定的密度(40％--60％)接种至摇瓶中；
3、转染液制备
在离心管中制备以下两夜
A：用不含血清培养基稀释1--10ug载体和目的基因的连接产物，终量100ul，
B：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100ul。
轻轻混匀A、B液(1:1)，室温中置15min，稍后会出现微浊现象。
4、转染：把A、B复合物缓缓加入HD 293F细胞中，摇匀，置37℃温箱中18--24h，吸除无血清转染液，换入正常培养基并在37℃培养箱中继续培养，在转染后的第6天收集细胞培养上清液用于纯化。
纯化及检测方法如下：
1、将细胞培养上清液用离心机以1000r/min进行离心10min；
2、利用蠕动泵将细胞上清液以4ml/min的流速上样到亲和预装柱上捕获蛋白；
3、上样结束后，先用平衡缓冲液充分平衡柱子，然后用洗脱缓冲液进行洗脱并合并洗脱组分，将蛋白置换到终缓冲液中；
4、纯化得到的蛋白用进行SDS-PAGE和Western blot进行分子量和纯度分析，对其结果见图1，在现有技术的基础上，SDS-PAGE方法的一些参数进行了调整，具体调整步骤如下：
所述试剂：
还原上样缓冲液：300mM Tris-HCL。10％SDS，30％Glycerol，
0.5％bromophenol blue，250mM MDTT，PH6.8
非还原上样缓冲液：300mM Tris-HCL。10％SDS，30％Glycerol，
0.5％bromophenol blue，PH6.8
Gel：4％--20％gradient SDS-PAGE gel(GenScriptCat.No.M42012)
(1)调整蛋白质浓度约为0.5mg/ml，分别向蛋白质样品中加入还原性和非还原性上样缓冲液，并用MixPlus震荡混匀；
(2)还原性样品用金属洗浴100℃加热5--10min；
(3)将蛋白质样品(还原与非还原)10000rpm离心1min，吸取上清上样；
(4)将预制凝胶(GenScriptCat.No.M42012)固定在电泳仪上，槽内加满MOPS缓冲液；
(5)向胶孔中加入10ul蛋白样品；
(6)设置电泳仪参数为电压140V、时间60min，当溴酚蓝到达胶底部时停止运行，取出凝胶。
5、蛋白浓度利用紫外可见光分光光度计在波长为280nm处进行测定。
泳道M1：蛋白Marker，金瑞斯，产品号.NO.3452
泳道M2：蛋白Marker，金瑞斯，产品号.NO.M00521
泳道1：还原条件
泳道2：非还原条件
泳道P：多标签(金瑞斯，产品号.M0101)作为阳性对照
抗体：Mouse-anti-His mAb(金瑞斯，产品号.A00186)
通过上述SDS-PAGE和Western blot检测，最终获得的MOG蛋白浓度是0.37mg/ml。
本发明的通过大量的实验摸索，对本发明的试剂盒中各个成分进行了优化，从而使其能够针对人MOG-Ab获得符合临床检测要求的结果，即准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好。
进行大量的理论研究和实验摸索，最终确认最优的MOG蛋白包被浓度是0.25ug/ml。采用包被缓冲液(PBS)按一定的比例将原液由0.37mg/ml稀释至0.25ug/ml，
优选地，在本发明的试剂盒中，作为所述包被抗原蛋白的浓度为0.25ug/ml～0.50ug/ml，更优选为0.25ug/ml～0.40ug/ml，最优选的为0.3ug/ml。
优选地，在本发明的试剂盒中，所述结合抗原的浓度为0.30ug/ml～0.60ug/ml，更优选为0.40ug/ml～0.60ug/ml，最优选为0.50ug/ml。
优选地，在本发明的试剂盒中，所述MOG-Ab酶结合物的比例1:10万～1:40万，更优选为1:15万～1:30万，最优选为1:20万。
优选地，在本发明的试剂盒中，显色剂A的主要成分为柠檬酸23g，过氧化脲8g，Tween 20 6ml，蒸馏水溶至800ml。
优选地，在本发明的试剂盒中，显色剂B的主要成分为柠檬酸80g，EDTA-2Na 1.0g，TMB.2HCL 1.8g，蒸馏水溶至600ml。
优选地，在本发明的试剂盒中，终止液为2mol/l的硫酸溶液。
优选地，本发明的试剂盒中还包含校准品，校准品的浓度梯度优选为0ug/ml、0.5ug/ml、1ug/ml、2ug/ml，5ug/ml、10ug/ml，校准品来源于人血清。
在一个具体的实施方案中，本发明的试剂盒在使用时，将待测血液(优选为血清或血浆)样品与重组蛋白的包被抗原混合，样品中的待测抗体(MOG-Ab)与包被抗原特异性结合为包被抗原-待测抗体复合物；洗涤去除未结合待测抗体的成分，从而分离包被抗原-待测抗体复合物；加入结合抗原，该结合抗原与包被抗原-待测抗原复合物中的待测抗体特异性结合，形成包被抗原-待测抗体-结合抗原；洗涤去除未结合的成分，从而分离包被抗原-待测抗体-结合抗原；最后加入MOG酶结合物，最终形成抗原-待测抗体-结合抗原-MOG酶结合物的复合物，然后加入显色剂A和显色剂B，最后再加入终止液，利用酶标仪进行检测，根据吸光度OD值及标准曲线来计算MOG-Ab的浓度。
校准曲线测试
校准曲线测试方法如下：在预包被的各孔中分别加入校准品50ul/孔，均为双孔，再在相应孔中加入结合抗原，用封口膜将条板封好，在37℃孵育30min，用洗涤液洗涤5次，并拍干。在各孔内加入100ul的MOG酶结合物，用封口膜将条板封好，在37℃孵育30min。取出反应板，甩出板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡。再在每孔加入显色剂A、B各50ul，轻拍混匀，置于37℃温育15min，之后每孔加入终止液50ul。用酶标仪(450nm/630nm双波长测定)测定各孔OD值。结果如下表1和图1所示；
表1：校准品浓度和对应的平均吸光度(OD)
标准品浓度ug/ml 10 5 2 1 0.5 0
平均OD值 4.1524 2.4851 1.2149 0.6736 0.3207 0.0015
以校准品浓度和吸光度绘制标准曲线，标准曲线的R＝0.9933
产品性能指标指标
1、外观
试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏；标签应清晰，准确、牢固。
2、准确度
将已知浓度的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体加入到血液基质中，回收率应在(85％～115％)范围内。具体操作方法如下将浓度为10ug/ml的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)样品A0加入到低浓度样品B0中，所加入样品A0与样品B0之间的体积比例为1：10，根据公式(1)计算结果，其结果如下表2所示。
Figure GDA0003676874710000091
式中：R—回收率；V—加入样品A0体积；V0－样品B0的体积；C－样品B0加入样品A0后的检测浓度；C0—样品B0的检测浓度；CS—样品A0的浓度。
表2准确度表格
Figure GDA0003676874710000092
根据表中的数值可知，所测得回收率在85％～115％之间，满足要求。
3、线性
将浓度为15ng/mL的高值样本按倍比稀释为5个浓度，将每一浓度样本重复检测3次，计算其浓度的平均值，将结果平均值和稀释比例进行直线拟合，并计算线性相关系数r，结果应不低于0.9950，其检测结果如表3所示，线性曲线如图2所示。
表3线性表格
Figure GDA0003676874710000093
Figure GDA0003676874710000101
理论值与测得值的相关性：r＝0.9995
根据上述表格数据，可知产品改项性能符合要求。
3、重复性
对2个浓度水平的参考品：0.5ng/ml，10ug/ml各重复检测10次，再利用校准曲线计算10次测量浓度结果的平均值
Figure GDA0003676874710000102
和标准差SD，按公式(2)得出变异系数CV，结果均应符合CV≤15％，其测量及计算结果如表4所示。
Figure GDA0003676874710000103
式中：CV－变异系数；SD—10次测量结果的标准差；
Figure GDA0003676874710000104
次测量结果的平均值。
表4重复性测定
Figure GDA0003676874710000105
根据上述表格数据，可知产品改项性能符合要求。
4、稳定性检测
取三批试剂盒各20盒，其批号分别为20190111、20190314、20190315，在2℃～8℃避光贮存，在有效期一年内，每隔一个季度对产品的外观、准确度、线性、重复性进行检测。
4.1外观检测
在保质期一年内，每隔一个季度对三批样品进行外观检测，试剂盒各组分齐全、完整、液体无渗漏，标签清晰、准确、牢固。
4.2准确度检测
按照准确度的测定方法，测定每批样品的平均回收率，测定数值如表5所示：其中R1指代每批样品的第一季度的平均回收率，R2指代每批样品的第二季度的平均回收率，R3指代每批样品的第三季度的平均回收率，R4指代每批样品的第四季度的平均回收率。
表5准确度表格
Figure GDA0003676874710000111
根据表中的数值可知，在保质期一年内，所测得样品回收率在85％～115％之间，样品合格。
4.3线性检测
按照线性的测定方法，测定每批样品每个季度的各个样本的浓度平均值，并计算其线性R值，所出数值如表6所示：
表6线性表格
Figure GDA0003676874710000112
Figure GDA0003676874710000121
Figure GDA0003676874710000131
根据上述的表格数值，产品在保质期内，线性系数R值均大于0.9980，符合标准。
4.4重复性
根据上述重复性的测定方法，测定每批样品每个季度的平均浓度值，其中测定值后的序号的意义如下：“1”指在保质期内第一季度的样品平均浓度值，“2”指在保质期内第二季度的样品平均浓度值，“3”指在保质期内第三季度的样品平均浓度值，“4”指在保质期内第四季度的样品平均浓度值，所出数值如表7、表8、表9所示：
表7 20190111批样品重复性表格
Figure GDA0003676874710000141
表8 20190314批样品重复性表格
Figure GDA0003676874710000142
Figure GDA0003676874710000151
表9 20190315批样品重复性表格
Figure GDA0003676874710000152
根据上述重复性测定数值可知，产品在一定保质期内其性能依然符合要求，产品符合要求。
通过对产品的外观、准确度、线性、重复性及稳定性进行的检测，可知产品的各项性能均符合要求，因此该试剂盒的质量合格。
试剂盒的操作步骤
在预包被的各孔中分别加入待检血清50ul/孔，均为双孔，再在相应孔中加入结合抗原，用封口膜将条板封好，在37℃孵育30min，用洗涤液洗涤5次，并拍干。在各孔内加入100ul的MOG酶结合物，用封口膜将条板封好，在37℃孵育30min。取出反应板，甩出板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡。再在每孔加入显色剂A、B各50ul，轻拍混匀，置于37℃温育15min，之后每孔加入终止液50ul。用酶标仪(450nm/630nm双波长测定)测定各孔OD值。
结果判定
选取1000例病人，其中男性及女性病患者各500例，选取1000例健康者，其中男性及女性病健康者各500例，按上述方式进行血清MOG-Ab检测，并利用统计学分析方法对所检测结果进行处理。
结果表明，男性及女性病患者血清中MOG-Ab的浓度并无明显统计学差异(P＞0.05)，男性及女性健康者血清中MOG-Ab的浓度并无明显统计学差异(P＞0.05)，由此可以说明试剂盒对于男性和女性患者的检测具有同样的效果。
1000例病患和1000例健康者血清中MOG-Ab的浓度有显著统计学差异(P＜0.01)，由此可知该试剂盒能用于检测人血清中的MOG-Ab的含量来辅助诊断病人是否患有断中枢神经系统免疫性脱髓鞘疾病。
以下附表10记录了部分男性病人和部分女性病人血清中MOG-Ab的含量。
附表11记录了部分男性健康者和部分女性健康者血清中MOG-Ab的含量。
表10 100例病人血清中MOG-Ab浓度的记录
Figure GDA0003676874710000171
表11 100例健康者血清中MOG-Ab浓度的记录
Figure GDA0003676874710000181
Figure GDA0003676874710000191
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽恩禾生物技术有限公司
<120> 一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒及其检测方法
<130> 2020.12
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gccgccacca tgggctggag ctgcatcatc ctgttcctgg tcgccaccgc caccggcgtg 60
cacagcggcc agttcagagt gatcggacct agacacccca tcagagccct ggttggtgat 120
gaggtggaac tcccctgcag aatcagcccc ggcaagaacg ccacaggcat ggaggtggga 180
tggtaccggc ctccatttag cagagtggtg cacctgtaca gaaatggcaa agatcaggac 240
ggcgaccaag ctcctgagta ccgcggcaga acagagctgc tgaaggacgc catcggcgag 300
ggcaaggtga ccctgagaat cagaaacgtg cggttcagcg acgagggagg cttcacctgt 360
tttttccggg accactctta tcaggaggaa gccgctatgg aactgaaggt ggaagatcct 420
ttctactggg tgtcccctgg ccaccaccac catcaccac 459

Claims (6)

1.一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒，其特征在于：所述试剂盒以人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白基因胞外区序列编码的重组蛋白为包被抗原；
所述重组蛋白的制备方法为：
蛋白基因与载体连接；
细胞的培养和转染；
纯化及检测；
所述重组蛋白的DNA序列参见SEQIDNo.1。
2.根据权利要求1所述的一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒，其特征在于：所述载体为pc DNA3.4载体。
3.根据权利要求1所述的一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内还包括包被板、校准品、结合抗原、酶结合物、显色剂A、显色剂B和终止液。
4.根据权利要求3所述的一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒，其特征在于：所述包被板上MOG蛋白包被浓度是0.25ug/ml。
5.根据权利要求3所述的一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒，其特征在于：所述校准品来自于人体血清，所述校准品的浓度梯度为200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、0ng/ml。
6.根据权利要求3所述的一种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体试剂盒，其特征在于：所述显色剂A为10g/L的过氧化脲素溶液，所述显色剂B为2g/L的TMB·2HCl溶液。
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