CN110922483B - 抗ccr5抗体及其在治疗肿瘤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及抗CCR5抗体及其在治疗肿瘤中的应用，所述抗体能够以较高的亲和力结合CCR5蛋白，能够抑制肿瘤生长或抑制肿瘤细胞转移，能够减少黑色素瘤中MDSC数量，能够用于预防或治疗黑色素瘤，有着广阔的应用前景。

Description

抗CCR5抗体及其在治疗肿瘤中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体的涉及抗CCR5抗体及其在治疗黑色素瘤中的应用。
背景技术
黑色素瘤起源自胚胎期神经脊，是一种恶性程度极高的肿瘤，全球每年新发皮肤恶性黑色素瘤约 20 余万例，而中国每年新发病例达 2 万余例[1]。黑色素瘤易出现淋巴与血行转移，预后差，发生远处转移后患者5年生存率较低，传统化疗药物对黑色素瘤疗效有限，五年生存率低于10％，且易发生耐药。分子靶向药物对于黑色素瘤具有较强的针对性与有效性，可使患者的生存质量得到改善，与传统化疗对比具有明显优势，在肿瘤的治疗上日益受到人们的关注，掀起了黑色素瘤治疗研究的新热潮。目前免疫检查点抑制剂PD-1/PD-L1和CTIA-4抑制剂[2-4]，经典分子靶向药物BRAF、MEK抑制剂[5-7]都取得了一定的疗效，但免疫治疗存在毒副作用[8-12]。且随着免疫学的发展，不断有新的治疗靶点被发现。有研究表明阻断CC趋化因子受体5(C-C chemokine receptor type 5,CCR5)后能够抑制黑色素瘤的发展[13-16]，因此CCR5可能成为新的黑色素瘤治疗靶点。
趋化因子受体5(C-C chemokine receptor type 5,CCR5)是一个能G蛋白偶联的细胞趋化蛋白受体,具有蛋白偶联受体所特有的特征性7个跨膜区, CCR5主要表达在单核细胞,树突细胞，T细胞，NK细胞等白细胞上[14,17],近来研究认为它是活化Th1细胞的表面标志物。当与其特异性配体CCL3(MIP-1a),CCL4(MIP-1b)和 CCL5(RANTES)结合后,激活G蛋白并最终引起胞内Ca+浓度的升高及蛋白激酶C的活化,活化后的效应表现为炎性反应及对白细胞的趋化性等各种生理功能[18]。CCR5与许多疾病的发生发展有密切关系,是HIV-1感染初期的主要辅助受体之一,为药物治疗HIV-1感染的高度有效的靶点[19],且与类风湿性关节炎,自身免疫性心肌炎,糖尿病等急慢性炎症有着重要的联系[20-22]。有研究显示CCR5的表达与黑色素瘤的发展有关且抑制CCR5表达后能够抑制黑色素瘤的发展[15-16]。最近研究表明阻断CCR5能够抑制黑色素瘤的生长，增加T细胞迁移同时减弱骨髓来源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)的免疫抑制功能和浸润[13]。
到目前为止，有许多CCR5抗体在W02003072766、 W02006103100、 WO2008037419、W00158916、US20040043033、US6528625等专利中提及，但一方面它们对CCR5的结合能力还并不十分理想，另一方面，它们也并没有用来治疗黑色素瘤。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种新的且具有更高CCR5结合能力的抗CCR5抗体，为黑色素瘤的治疗提供一种新可能性。
本发明提供以下技术方案：
一种CCR5抗体，由重链和轻链组成，重链和轻链分别包括可变区和恒定区，其中重链可变区包含3个互补决定区，分别命名为VH-CDR1，VH-CDR2,VH-CDR3；同样地，轻链可变区也包含3个互补决定区，分别命名为VL-CDR1,VL-VDR2,VL-CDR3 。所述CCR5抗体的重链包含如SEQ ID NO:1所示的VH-CDR1氨基酸序列，和如SEQ ID NO:2所示的VH-CDR2氨基酸序列，和如SEQ ID NO:3所示的VH-CDR3氨基酸序列；所述CCR5抗体的轻链包含如SEQ ID NO:4所示的VL-CDR1氨基酸序列，和如SEQ ID NO:5所示的VL-CDR2氨基酸序列，和如SEQ ID NO:6所示的VL-CDR3氨基酸序列。
本发明所述CCR5抗体包含SEQ ID NO :7 所示的重链可变区和SEQ ID NO :8 所示的轻链可变区。
本发明所述CCR5抗体的重链可变区和轻链可变区均包含框架区，所述抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链框架区。所述抗体重链可变区进一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3或其变体的重链框架区。
本发明所述CCR5抗体包含恒定区,并且所述恒定区是人源化的，包含选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和包含选自kappa 或Lambda 亚型的轻链恒定区。
在一些实施方案中, 所述CCR5抗体以54.2±12.9ng/ml的EC50值与CCR5相结合。
在一些实施方案中，所述CCR5抗体能够抑制黑色素瘤生长或抑制黑色素瘤细胞转移。
在一些实施方案中，所述CCR5抗体能够减少黑色素瘤中MDSC细胞数量。
本发明提供一种治疗黑色素瘤的方法，其特征在于：使用本发明所述的抗CCR5抗体。
本发明所述的CCR5抗体可应用于制备治疗转移性肿瘤药物中，优选为治疗黑色素瘤药物。
本发明所使用的术语“ 抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子，涵盖全长抗体(例如，IgG1或IgG4抗体)、其各种功能性片段(例如可仅包含抗原结合部分，如Fab、Fab′、F(ab′)2)。抗体的实例包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2片段等。
术语“ 单克隆抗体”，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术(如CDR-grafting)，或其它现有技术进行重组得到。Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“ Fab′片段”含有一条轻链和一条重链的VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区部分，由此可在两个Fab ′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。“ F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条重链的VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区部分，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
本文所用术语“ 超变区”或“ CDR区”或“ 互补决定区”，是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。CDR区序列可以由Kabat、Chothia方法来定义或本领域熟知的任何CDR区序列确定方法而鉴定的可变区内的氨基酸残基。本发明所用的方法可利用或根据这些方法中的任一种所定义的CDR，包括但不限于Kabat定义、Chothia定义中的任一者来定义。具体地，本发明提供的CDR序列根据Kabat 定义。
术语“ 嵌合抗体(Chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入载体中，最后在真核表达系统或原核表达系统中表达嵌合抗体分子。在本发明的一优选实施方案中，所述的CCR5嵌合抗体的抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区。所述CCR5嵌合抗体的抗体重链可变区进一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3或其变体的重链FR区。嵌合抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源的IgG4重链恒定区。所述嵌合抗体抗体还包含选自kappa 或Lambda 亚型的轻链恒定区。
有益效果
本发明的CCR5抗体具有下列性质：1)能够以较高的亲和力结合CCR5蛋白；2) 能够抑制肿瘤生长或抑制肿瘤细胞转移；3)能够减少黑色素瘤中MDSC数量；4)能够用于预防或治疗黑色素瘤。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1是抗CCR5抗体4E8与对照抗体分别对小鼠黑色素瘤生长的影响结果表明抗CCR5抗体4E8能够明显地抑制种植的小鼠黑色素瘤生长。
图2是抗CCR5抗体4E8对肿瘤中T/B细胞的影响，结果表明抗CCR5抗体4E8能够明显地降低MDSC的含量，同时提高T淋巴细胞和NK细胞的含量。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1.抗CCR5抗体制备
用DMEM培养基培养稳定表达CCR5的CHO细胞，将107个CHO-CCR5+细胞与弗氏完全佐剂一起注射到雌性Balb/c小鼠腹膜内，进行初次免疫，随后每4周再以107个CHO-CCR5+细胞注射到上述雌性Balb/c小鼠腹膜内，继续免疫。最后在与骨髓瘤细胞融合前3天进行末次免疫，末次免疫以107个CHO-CCR5+细胞静脉内免疫。取免疫后的Balb/c小鼠脾细胞，将其与骨髓瘤Sp2/0细胞株融合，将融合后的细胞用含有10%血清的Iscove培养基（0.1mM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤和16μM胸苷）稀释，稀释至适宜浓度后，加入96孔板内进行培养。10天后，取细胞上清，高通量ELISA法检测上清中与CCR5 表现出阳性反应的原代培养物。再将此孔内的杂交瘤细胞进行稀释进行亚克隆，同样以ELISA方法进行筛选，最终获得阳性杂交瘤细胞株4E8。
实施例2.嵌合抗体4E8的构建
将培养的杂交瘤细胞株4E8用TRNzol-A+裂解后，置入离心管，每ml TRNzol-A+加入200μl氯仿，漩涡振荡15秒，放置3分钟。13000 rpm 4°C离心10分钟，Trizol-A+ 细胞溶液分为三层：上层无色水相、中层和下层黄色有机相，将溶有RNA的水相转移至离心管中，向水相中加入等体积异丙醇，混匀，室温静置25分钟。13000 rpm 4°C离心10分钟，弃去废液得到沉于底部的RNA沉淀。用75%乙醇洗涤RNA沉淀两次后，用PEDC水溶解RNA，-80℃保存。按照5' RACE 试剂盒的步骤反转录出包含抗体的重链可变区和轻链可变区的cDNA，再利用PCR扩增出含有抗体重链可变区和轻链可变区的DNA产物，利用琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化含有抗体重链可变区和轻链可变区的目的片断。将其克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆测序，对测序结果进行分析。然后以测序正确的pGEM-T-Vh为模板，利用引物扩增出VH链可变区基因，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆并送去测序，将测序正确的克隆记作pGEM-T-VH。同理以测序正确的pGEM-T-Vl为模板，利用引物扩增出VL链可变区基因，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆并送去测序，将测序正确的克隆记作pGEM-T-VL。用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞，用上述步骤提取人总RNA，根据文献[23-24]报道的序列分别设计引物扩增出人IgG4抗体的重链和轻链恒定区基因。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，送公司测序验证，最终获得了含有IgG4重链恒定区的克隆pGEM-T-CH以及含有IgG4轻链恒定区的克隆pGEM-T-CL。将上述pGEM-T-VH质粒酶切后与同酶切的pGEM-T-CH质粒连接，挑选正确克隆酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，用T4 DNA连接酶与同酶切的质粒pcDNA3.1(+)质粒进行连接，构建成重链真核表达载体pcDNA3.1(+)-H。同理将上述pGEM-T-VL质粒酶切后与同酶切的pGEM-T-CL质粒连接，挑选正确克隆酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，用T4 DNA连接酶与同酶切的质粒pcDNA3.1/ZEO (+)质粒进行连接，构建成轻链真核表达载体pcDNA3.1/ZEO (+)-L。
实施例3.抗CCR5抗体与CCR5结合能力测定
将实施例2中获得的抗体轻重链质粒转染CHO-K1细胞筛选高表达克隆，并用无血清培养基扩大培养，用Protein A 亲和柱分离纯化嵌合抗体4E8。将纯化抗体用PBS进行透析，获得纯度较高的CCR5嵌合抗体4E8。同时通过CN101175771A专利获得抗CCR5抗体-抗体B（其轻重链序列参见该专利说明书第20页第16行）的序列且通过上述中的方法获得抗体B，将其作为对照抗体。通过ELISA 实验评估上述获得的CCR5嵌合抗体4E8与对照抗体-抗体B与CCR5蛋白在50%有效浓度时(EC50)的结合亲和力。将稳定表达CCR5的CHO细胞传至96孔板中，细胞培养箱中过夜培养。弃去培养基并加入90ul新鲜培养基。将上述抗体用培养基稀释成1000ng/ml，250ng/ml，62.5ng/ml，15.63ng/ml，3.91ng/ml，0.98ng/ml的浓度梯度，4℃孵育2h，吸出培养基，加入戊二醛室温孵育10min，用PBS洗涤3次后加入100ul抗人IgG抗体，室温孵育2h。用PBS洗涤3次后加入50μl显色液，室温避光孵育15min，加入终止液终止显色反应，用酶标仪检测样品在450nm波长处的吸光度值，并用620nm波长处的吸光度值校正。处理数据，最终确定各样品EC50值，结果见下表。
表一 抗CCR5抗体与CCR5结合能力测定
名称 EC50（ng/ml）
4E8 54.2±12.9
对照-抗体B 94.3±24.7
实施例4.抗CCR5抗体4E8抑制黑色素瘤生长。
构建黑色素瘤小鼠模型，取6周大小的C57BL/6N小鼠，随机分成2组，每组6只。用DMEM培养基培养B16小鼠黑色素瘤细胞，待细胞长满后，用胰酶将细胞消化下来后离心去上清，再用PBS洗两次。将B16细胞用PBS重悬后使其浓度达到2×106/ml，每只模型小鼠皮下注射0.5ml B16细胞。其中实验组小鼠自种植B16细胞后，腹腔注射200μg抗CCR5抗体4E8，同时阴性对照组小鼠注射相同剂量的IgG（不具有结合CCR5的能力），阳性对照组小鼠注射相同剂量的抗CCR5抗体-抗体B。此后每3天测量一次肿瘤大小，以检测肿瘤生长情况，共检测3周。肿瘤大小通过以下公式计算：肿瘤大小=长×宽×高×π/6。结果如图1所示，注射抗CCR5抗体4E8的实验组小鼠肿瘤生长速度明显低于注射IgG或注射抗体B的小鼠且自第18天开始肿瘤大小出现明显差距。表明本发明的抗CCR5抗体4E8相比对照组IgG或抗体B能够更好的抑制黑色素瘤的生长。
实施例5.抗CCR5抗体4E8能够减少黑色素瘤中MDSC数量
取6周大小的C57BL/6N小鼠，随机分成2组，每组6只。用DMEM培养基培养B16小鼠黑色素瘤细胞，待细胞长满后，用胰酶将细胞消化下来后离心去上清，再用PBS洗两次。将B16细胞用PBS重悬后使其浓度达到2×106/ml，每只小鼠皮下注射0.5ml B16细胞。其中实验组小鼠自种植B16细胞后，腹腔注射200μg本发明所述抗CCR5抗体4E8，同时阴性对照组小鼠注射相同剂量的IgG（不具有结合CCR5的能力），阳性对照组小鼠注射相同剂量的抗CCR5抗体-抗体B。3周后，取相同质量的小鼠肿瘤组织，剪成小块后，放入含有胶原蛋白酶D(2mg/ml)，Dnase I (50μg/ml)的1640培养基中消化。消化好后，将肿瘤细胞悬液用荧光标记的CD11b抗体、Gr-1抗体、CD3抗体以及CD45抗体染色，经过流式细胞仪的分选，统计出CD11b+ Gr-1+的MDSC细胞数量，CD3+的T淋巴细胞数量和CD45+的NK细胞数量。结果如图2所示，注射本发明所述抗CCR5抗体4E8的小鼠肿瘤组织中MDSC细胞数量明显低于对照组中注射IgG，同样低于注射抗体B的小鼠，而CD3+的T淋巴细胞数量和CD45+的NK细胞数量明显高于对照组中注射IgG，同样高于注射抗体B的小鼠。表明注射本发明抗CCR5抗体4E8后，相对于对照抗体更能够降低MDSC的含量，同时提高T淋巴细胞和NK细胞的含量。肿瘤病人及肿瘤模型中，以MDSC细胞数量的增长为特点，而注射抗CCR5抗体4E8后MDSC细胞数量降低，表明本发明所述抗CCR5抗体4E8有利于抑制黑色素瘤的生长。
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序列表
<110> 北京岳昊科技发展有限公司
<120> 抗CCR5抗体及其在治疗肿瘤中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1
Ala Ala Ser Met Gln
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Gln Ser Pro Trp Ala Cys Gly Pro Thr Ser Thr Ala Ala Glu Ala Cys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
Ser Thr Cys Ala Gln Gly Ala Ala Tyr
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Gly Ala Gln Pro Glu Ala Ala Thr Cys Lys Ile
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 5
Asn Ser Gln Lys Gly Leu Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Trp Ala Asn Ser Leu Pro Gln Gly Thr
1 5
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ala Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Met Ala Gln Ser Thr Ala Ala
20 25 30
Ser Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ala
35 40 45
Gly Gln Ser Pro Trp Ala Cys Gly Pro Thr Ser Thr Ala Ala Glu Ala
50 55 60
Cys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Arg Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Cys Ala Gln Gly Ala Ala Tyr Trp Gly Ala Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Gly Ala Gln Pro Glu Ala Ala Thr Cys
20 25 30
Lys Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ser Gln Lys Gly Leu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Trp Ala Asn Ser Leu Pro Gln Gly
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

Claims (9)

1.一种抗CCR5抗体，由重链和轻链组成，重链和轻链分别包括可变区和恒定区，其中重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的VH-CDR1氨基酸序列，和如SEQ ID NO:2所示的VH-CDR2氨基酸序列，和如SEQ ID NO:3所示的VH-CDR3氨基酸序列；轻链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的VL-CDR1氨基酸序列，和如SEQ ID NO:5所示的VL-CDR2氨基酸序列，和如SEQ ID NO:6所示的VL-CDR3氨基酸序列。
2.根据权利要求1 所述的抗CCR5抗体，其特征在于：所述重链可变区序列的为序列表SEQ ID No :7的氨基酸序列；所述轻链可变区序列的为序列表SEQ ID No :8的氨基酸序列。
3.根据权利要求1-2任一项所述的抗CCR5抗体，其特征在于：所述抗体为全长抗体或其各种功能性片段。
4.根据权利要求1 -2任一项所述的抗CCR5抗体，其特征在于：所述抗体还包含选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和包含选自kappa 或Lambda 亚型的轻链恒定区。
5.根据权利要求4所述的抗CCR5抗体，其特征在于：所述抗体重链恒定区为IgG4。
6.原核或真核细胞系中复制的表达载体，其特征在于：其编码权利要求1-2任一项所示的抗体。
7.权利要求1-5任一项的抗CCR5抗体在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。
8.权利要求1-5任一项的抗CCR5抗体在制备用于检测黑色素瘤的制剂中的用途。
9.权利要求1-5任一项的抗CCR5抗体在制备用于检测CCR5蛋白的制剂中的用途。
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