CN103608680A - 抗cxcl13抗体和抗cxcr5抗体在恶性肿瘤的治疗或检测中的用途 - Google Patents

Abstract

公开了抗CXCL13和抗CXCR5抗体在个体的治疗或检测中的用途。

Description

抗CXCL13抗体和抗CXCR5抗体在恶性肿瘤的治疗或检测中的用途

本申请要求于2011年9月29日提交的美国专利申请号13/248,904的优先权，其为2011年9月15日提交的专利申请号13/233,769的部分继续申请，而后述申请又为2010年12月14日提交的专利申请12/967,273的部分继续申请。本申请也要求于2011年12月6日提交的美国专利申请号13/312,343的优先权，其为2010年12月14日提交的专利申请12/967,273的部分继续申请。

发明领域

本申请大体涉及恶性肿瘤领域。具体而言，本申请涉及使用抗趋化因子抗体和/或抗趋化因子受体抗体来检测或治疗恶性肿瘤的方法。

发明背景

在美国，恶性肿瘤是死亡的首要原因之一。大多恶性肿瘤仅开始于单个的肿瘤细胞。肿瘤细胞增殖从而形成了局部“肿瘤”。肿瘤仅表示膨胀物（swelling）；其不一定是恶性的。仅在其位置或起源处生长并且不能向远处传播的肿瘤是良性肿瘤，而不是恶性肿瘤。但是，具有传播能力的肿瘤(无论其是否实际传播)被称为恶性肿瘤。恶性肿瘤可以通过血液或淋巴系统传播至局部淋巴结并通过称为转移的过程传播至远处位点。转移的恶性肿瘤更难以治疗，因为它已扩散到很多不同的组织和器官中。已证实，在很多类型的恶性肿瘤中(如乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和前列腺癌)，早期治疗能提高存活率。

趋化因子是小的细胞因子样蛋白的超家族，其具有水解抗性、能促进新血管形成或内皮细胞生长抑制、诱导细胞骨架重排、使淋巴细胞活化或失活以及通过与G蛋白偶联受体的相互作用来介导趋化性。趋化因子可以介导表达其受体的宿主细胞的生长和迁移。

CXCL13是属于CXC趋化因子家族的小细胞因子。正如其名称所示，该趋化因子对同时属于B-1和B-2亚类的B细胞选择性地趋化，并通过与趋化因子受体CXCR5的相互作用来发挥其作用。CXCL13和CXCR5控制淋巴组织的囊泡中B细胞的组织结构。CXCR5在人的肝、脾、淋巴结和肠中高表达。CXCR5在B细胞迁移中发挥重要作用。

在T淋巴细胞中，CXCL13表达可以反映出T细胞的生发中心起源。因此，T细胞淋巴瘤（如血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤）中CXCL13的表达被认为可以反映出肿瘤T细胞的生发中心起源。

发明概述

本发明的一个方面涉及治疗个体中的黑素瘤、肉瘤、胚细胞瘤、癌、淋巴瘤、骨髓瘤或白血病的方法。在一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：对个体给予治疗有效量的抗CXCL13抗体、或抗CXCR5抗体、或它们的组合。在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原(如蛋白质、肽或编码基因)来免疫个体，从而诱导能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗体。在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：对个体给予能在所述个体中表达抗CXCL13抗体、或抗CXCR5抗体、或它们的组合的表达载体。在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：对个体给予有效量的表达载体，该表达载体表达（1）能够抑制CXCL13和/或CXCR5的表达的物质，（2）能够抑制CXCL13和CXCR5之间相互作用的物质，或者（3）能够抑制CXCL13和/或CXCR5生物活性的物质。

本申请的另一方面涉及防止或抑制在个体中具有升高表达的CXCL13和/或CXCR5的恶性肿瘤细胞的迁移或转移的方法。在一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：对个体给予治疗有效量的抗CXCL13抗体、抗CXCR5抗体或它们的组合。在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原(如蛋白质、肽或编码基因)来免疫个体，从而诱导能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗体。在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：对个体给予在所述个体中能表达抗CXCL13抗体、或抗CXCR5抗体、或它们的组合的表达载体。在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：对个体给予有效量的表达载体，该表达载体表达（1）能够抑制CXCL13和/或CXCR5的表达的物质，（2）能够抑制CXCL13和CXCR5之间相互作用的物质，或者（3）能够抑制CXCL13和/或CXCR5生物活性的物质。

本申请的另一方面涉及治疗个体中恶性肿瘤的方法。所述方法包括以下步骤：检测来自所述个体的生物样本中CXCL13和/或CXCR5的表达水平，并且如果在所述生物样本中检测到CXCL13和/或CXCR5的表达水平升高，则对患者给予（1）治疗有效量的抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体，或者（2）在所述个体中能表达抗CXCL13抗体，或抗CXCR5抗体，或它们的组合的表达载体。在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：检测来自所述个体的生物样本中CXCL13和/或CXCR5的表达水平，并且如果在所述生物样本中检测到CXCL13和/或CXCR5的表达水平升高，则用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原来免疫个体，从而引发能抑制CXCL13和/或CXCR5生物活性的抗体应答。在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：检测来自所述个体的生物样本中CXCL13和/或CXCR5的表达水平，并且如果在所述生物样本中检测到CXCL13和/或CXCR5的表达水平升高，则对个体给予有效量的表达载体，该表达载体表达（1）能够抑制CXCL13和/或CXCR5的表达的物质，或者（2）能够抑制CXCL13和CXCR5之间相互作用的物质，或者（3）能够抑制CXCL13和/或CXCR5生物活性的物质。

本申请的另一方面涉及增强化疗效果的方法。所述方法包括对进行恶性肿瘤化疗的个体给予有效量的抗CXCL13抗体、或抗CXCR5抗体、或它们的组合。在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原(如蛋白质、肽或编码基因)来免疫进行恶性肿瘤化疗的个体，从而诱导能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗体。在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：对进行恶性肿瘤化疗的个体给予能表达抗CXCL13抗体、或抗CXCR5抗体、或它们的组合的表达载体。在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：对个体给予有效量的表达载体，该表达载体表达（1）能够抑制CXCL13和/或CXCR5的表达的物质，（2）能够抑制CXCL13和CXCR5之间相互作用的物质，或者（3）能够抑制CXCL13和/或CXCR5生物活性的物质。

本申请的另一方面涉及治疗个体中恶性肿瘤的方法，所述方法通过用有效量的CXCL13和CXCR5免疫原中的一种或多种和有效量的CXCL16和CXCR6免疫原中的一种或多种来免疫个体，其中所述恶性肿瘤是黑素瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、胚细胞瘤或癌。

本申请的另一方面涉及治疗个体中恶性肿瘤的方法，所述方法通过用有效量的CXCL16免疫原和/或CXCR6免疫原来免疫个体，从而诱导能抑制CXCL16和/或CXCR6生物活性的抗体，其中所述恶性肿瘤为黑素瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、胚细胞瘤或癌，其中所述CXCL16免疫原为包括一个或多个选自以下的序列的肽：AAGPEAGENQKQPEKN(SEQ ID NO:87),SQASEGASSDIHTPAQ(SEQ ID NO:88),STLQSTQRPTLPVGSL(SEQ ID NO:89)、SWSVCGGNKDPWVQEL(SEQ ID NO:90)、GPTARTSATVPVLCLL(SEQ ID NO:91)、SGIVAHQKHLLPTSPP(SEQ ID NO:92)、RLRKHL(SEQ ID NO:93)、LQSTQRP(SEQ ID NO:94)、SSDKELTRPNETT(SEQID NO:95)、AGENQKQPEKNA(SEQ ID NO:96)、NEGSVT(SEQ IDNO:97)、ISSDSPPSV(SEQ ID NO:98)、CGGNKDPW(SEQ ID NO:99)、LLPTSPPISQASEGASSDIHT(SEQ ID NO:100)、STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT(SEQ ID NO:101)、SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA(SEQ ID NO:102)、TGSCYCGKR(SEQ ID NO:103)、DSPPSVQ(SEQ ID NO:104)、RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSWSVCGG(SEQ ID NO:105)、WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ(SEQ IDNO:106)、SDIHTPAQMLLSTLQ(SEQ ID NO:107)、RPTLPVGSL(SEQID NO:108)、TAGHSLAAG(SEQ ID NO:109)、GKRISSDSPPSVQ(SEQID NO:110)和KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH(SEQID NO:111)，并且其中所述CXCR6免疫原为包括一个或多个选自以下的序列的肽：HQDFLQFSKV(SEQ ID NO:112)、AGIHEWVFGQVMCK(SEQ ID NO:113)、PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI(SEQ ID NO:114)和YYAMTSFHYTIMVTEA(SEQ ID NO:115)。

本申请的另一方面涉及在个体中检测恶性肿瘤。所述方法包括检测获自个体的生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平；以及将生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平与一种或多种恶性肿瘤标志物的正常表达水平相比较，其中生物样本中所述一种或多种恶性肿瘤标志物的高于正常的表达水平表示个体中存在恶性肿瘤，其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物的正常表达水平为预定值，或者获自与所述生物样本具有相同来源或类型的已知正常非癌性细胞的对照样本，其中所述恶性肿瘤为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤，并且其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物包括CXCL13、或CXCR5、或者CXCL13和CXCR5。

本申请的另一方面涉及评价患恶性肿瘤个体的预后的方法。所述方法包括测定来自个体的生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平，以及将所述生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平与所述一种或多种恶性肿瘤标志物的对照表达水平相比较，其中如果所述生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平高于对照水平，则表示所述个体的预后不良，并且如果所述生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平低于或近似于对照水平，则表示所述个体的预后良好，其中预后不良表明恶性肿瘤为攻击型或侵袭型，其中所述恶性肿瘤为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤，并且其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物包括CXCL13、或CXCR5、或者CXCL13和CXCR5。

本申请的另一方面涉及监测个体中恶性肿瘤治疗过程的方法。所述方法包括在治疗期间或治疗后，测定获自个体的一个或多个生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平，以及将所述一个或多个生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平与所述恶性肿瘤标志物的对照表达水平相比较，其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物的对照水平为个体中所述一种或多种恶性肿瘤标志物的治疗前水平或预设的参考水平，其中如果所述一个或多个生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物近似于或低于对照水平，则认为所述治疗是有效的，所述恶性肿瘤为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤，并且其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物包括CXCL13、或CXCR5、或者CXCL13和CXCR5。

本申请的另一方面涉及用于检测恶性肿瘤或监测恶性肿瘤发展的试剂盒。所述试剂盒包括用于测定生物样本中CXCL13和/或CXCR5表达的试剂；和使用所述试剂的说明，其中所述试剂包括抗CXCL13抗体、抗CXCR5抗体或两者。

附图简述

图1A-B示出了前列腺癌（PCa）细胞系的DOCK2表达。

图2示出了CXCL13-CXCR5相互作用促进LNCaP和PC3细胞侵袭，而不依赖于DOCK2。

图3示出了CXCL13调节Akt和ERK1/2活化。

图4示出了CXCL13通过DOCK2诱导PC3细胞中的JNK活化。

图5示出了CXCL13通过JNK和DOCK2调节PCa细胞增殖。

图6示出了JNK抑制和DOCK2敲低导致并非由于凋亡引起的细胞死亡的PCa细胞增殖降低。

图7示出了CXCL13调节PCa细胞系中的信号转导级联。

图8A-C示出了前列腺癌细胞系的G蛋白的α亚基同种型的表达。

图9A-B示出了前列腺癌细胞系的G蛋白β和γ亚基同种型的表达。

图10A-D示出了经过或不经过CXCL13处理的前列腺癌细胞系中CXCR5和相关G蛋白的表达。

图11A-B描述了通过免疫沉淀确认G_q/11和G_αi2蛋白与CXCR5相关。

图12A-C示出了在CXCL13刺激后与G_α13偶联的CXCR4和CXCR5的鉴定。

图13描述了前列腺癌细胞中CXCR5相互作用的假设模型。

图14描述了CXCL13如何调节参与细胞周期的关键分子。

图15描述了CXCL13如何调节参与细胞迁移的关键分子。

图16描述了CXCL13如何调节参与细胞存活和生长的关键分子。

图17描述了PC3细胞中CXCL13调节的最经典途径。

图18示出了CXCL13介导属于PI3K/Akt和SAPK/JNK信号通路的蛋白的差异磷酸化。

图19是由CXCL13-CXCR5相互作用调节的信号通路的总结图。

图20示出了主要的CXCL13-CXCR5细胞信号转导级联的确认。

图21示出了AKT活化所需的CXCL13-CXCR5信号转导事件。

图22A-B描述了CXCL13介导的CXCR5连接和向胞核的转移。

图23A-B示出了抗CXCL13抗体治疗抑制了前列腺癌的发展和骨转移。

图24A-B示出了对CXCL13的阻断抑制骨中前列腺肿瘤的生长。

图25A-B示出了对CXCL13的阻断消除骨中溶骨性前列腺肿瘤的生长。

图26A-B示出了对CXCL13的阻断抑制了由前列腺癌细胞骨转移引起的骨矿物质密度（BMD）的损失。

图27描述了正常健康对照和肺癌个体的血清中的CXCL13水平。

图28示出了非肿瘤性肺和肺癌组织的CXCR5表达。

图29示出了非肿瘤性乳房和乳腺癌组织的CXCR5表达。

图30描述了相对于非肿瘤性对照，结肠癌组织的CXCR5和CXCL13表达。

图31描述了相对于非肿瘤性对照，卵巢癌组织的CXCR5和CXCL13表达。

发明详述

以下所示的详细描述是为了使本领域技术人员能够实施和使用本发明。出于解释的目的，对具体术语进行阐述以全面理解本发明。然而，本领域技术人员将明了的是这些具体细节在实践本发明时不是必需的。对具体应用的描述仅作为代表性实例而提供。本发明并不意图被局限于所示的实施方式中，而应按照符合本文所公开的原理和特征的最宽的范围。

除非另有定义，本申请中所使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，而且复数形式的术语应包括单数形式。

定义

本文所用的以下术语应当具有以下含义：

本文所用术语“治疗（treat）”、“治疗（treating）”或“治疗（treatment）”指减轻或消除病症和/或其伴随的症状的方法。本文所用术语“预防（prevent）”、“预防（preventing）”或“预防（prevention）”指阻止个体患病症和/或其伴随的症状的方法。在某些实施方式中，术语“预防（prevent）”、“预防（preventing）”或“预防（prevention）”是指降低患病症和/或其伴随的症状的风险的方法。

本文所用术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白（Ig）分子的免疫活性部分，即，包含能特异性结合抗原（与抗原发生免疫反应）的抗原结合位点的分子。术语“抗体”以最宽的含义使用，并具体涵盖了单克隆抗体（包括全长单克隆抗体）、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）和抗体片段，只要它们能表现出所期望的生物活性。“特异性结合”或“发生免疫反应”指抗体与所期望的抗原的一个或多个抗原决定簇反应而不与其他多肽反应（即结合）或与其他多肽结合的亲和力非常低。术语“抗体”也包括抗体片段，其包含全长抗体的一部分，通常为全长抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段，双链抗体，线性抗体，单链抗体(scFv)分子，和由抗体片段形成的多特异性抗体。在本发明的一些实施方式中，使用抗体片段而非完整的抗体是可取的，例如为了提高肿瘤穿透性。该情况中，使用为提高血清半衰期而通过本领域已知的任何方式修饰的抗体片段是可取的。

本文所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性（美国专利号4,816,567;和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984)）。

非人抗体的“人源化”形式为包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白（接受体抗体），其中来自接受体抗体的高变区的残基被来自具有所期望的特异性、亲和力和/或能力的非人物种（供体抗体）的高变区的残基代替，所述非人物种如小鼠、大鼠、兔子或非人类灵长类动物。制造人源化和其他嵌合抗体的方法在本领域中是已知的。

“双特异性抗体”是对至少两种不同的抗原具有结合特异性的抗体。在本发明的情况下，结合特异性之一是针对CXCL16或CXCR6。第二结合靶标是任意其他抗原，并且有利地是细胞表面蛋白或受体或受体亚基。制造双特异性抗体的方法在本领域中是已知的。

“异缀合抗体（heteroconjugate antibody）”的使用也在本发明的范围内。异缀合抗体是由两种共价结合的抗体组成。例如，这样的抗体已被提出用于将免疫系统细胞靶向于不希望的细胞（美国专利号4,676,980）。考虑到可以使用蛋白质合成化学中已知的方法在体外制备所述抗体，包括涉及交联剂的方法。

“异缀合抗体（heteroconjugate antibody）”的使用也在本发明的范围内。异缀合抗体是由两种共价结合的抗体组成。例如，这样的抗体已被提出用于将免疫系统细胞靶向于不希望的细胞（美国专利号4,676,980）。考虑到可以使用蛋白质合成化学中已知的方法在体外制备所述抗体，包括涉及交联剂的方法。

本发明也考虑到使用“免疫缀合物”，其包含与细胞毒性剂（如毒素（例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段）或放射性同位素（即放射性缀合物））缀合的抗体。可以使用的酶促活性毒素和其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯。多种放射性核素可用于制备放射缀合抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。

在药理学方面，本发明上下文中，“治疗有效量”的抗体指在抗体能有效治疗的病症的预防或治疗中的有效量。“病症”是会从抗体治疗中获益的任何疾病状态，包括癌和化学抗性。其包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物偏向于关注的病症的病理状态。

本文所用术语“肿瘤”指由异常细胞生长形成的赘生物或实体病变。肿瘤可以是良性的、恶变前的或恶性的。

“原发性肿瘤”是在个体中最初位点存在的肿瘤，可以与“转移性肿瘤”相区别，转移性肿瘤存在于个体中距原发性肿瘤的远距离部位。

本文所用术语“恶性肿瘤”是指或描述哺乳动物的生理条件，其典型的特征在于不受调控的细胞生长。示例性恶性肿瘤包括：癌、黑素瘤肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞瘤和胚细胞瘤。恶性肿瘤的更多具体实例包括：鳞状细胞癌(例如，鳞状上皮细胞癌)，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌的肺癌，腹膜癌，肝细胞癌，包括胃肠癌的胃癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌（liver cancer），膀胱癌，尿路癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌（hepatic carcinoma），肛门癌，阴茎癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤，脑癌及头颈癌以及相关转移灶。

本文所用术语“癌”指由变异的上皮细胞或具有未知的组织学发生、但具有与上皮细胞有关的特定分子学或组织学特征（如产生细胞角蛋白或细胞间桥）的变异细胞组成的侵袭性恶性肿瘤。本申请的示例性癌包括卵巢癌、阴道癌、子宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、胰岛瘤、腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、口腔癌、脑癌、成神经管细胞瘤、神经外胚层瘤、胶质瘤、垂体癌和骨癌。

本文所用术语“淋巴瘤”指免疫系统的淋巴细胞的恶性肿瘤。淋巴瘤通常以实体瘤存在。示例性淋巴瘤包括：小淋巴细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、原发性巨球蛋白血症（

macroglobulinemia）、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结内边缘区B细胞淋巴瘤（NMZL）、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性淋巴瘤、经典霍奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、赛谢综合征、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增生病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、非特指型外周T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。经典霍奇金淋巴瘤的示例性形式包括：结节性硬化型、混合细胞型、淋巴细胞富集型和淋巴细胞消减型或非消减型。

本文所用术语“肉瘤”为来自由胚胎中胚层发育的多种组织之一中的变异细胞的恶性肿瘤。因此，肉瘤包括骨、软骨、脂肪、肌肉、血管和造血组织的肿瘤。例如，来自骨的骨肉瘤、来自软骨的软骨肉瘤、来自脂肪的脂肪肉瘤和来自平滑肌的平滑肌肉瘤。示例性的肉瘤包括：Askin瘤、葡萄状肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤-PNET、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤。软组织肉瘤的亚类包括：软组织腺泡状肉瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤、皮肤纤维肉瘤硬纤维瘤、促纤维化小圆细胞肿瘤、上皮样肉瘤骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。

本文所用术语“白血病”为血液或骨髓的恶性肿瘤，特征在于白细胞的异常增多。白血病是广义术语，其涵盖了一系列疾病。因此，白血病是更广泛的称为血液肿瘤的疾病种类的一部分。白血病细分为多个大类；第一种分类是白血病的急性和慢性形式。急性白血病的特征在于未成熟的血细胞数量的快速增长。由于这些细胞的积聚使得骨髓不能制造健康的血细胞。慢性白血病的特征在于相对成熟、但仍为异常的白细胞的过度产生。通常通过数月或数年的发展，所述细胞的产生速率大大高于正常细胞，导致血液中有很多的异常白细胞。白血病也可以通过受累的血细胞进行细分。这样的分界将白血病划分为成淋巴细胞或淋巴细胞白血病和骨髓性（myeloid）或骨髓性（myelogenous）白血病。在成淋巴细胞或淋巴细胞白血病中，癌变发生在通常继续形成淋巴细胞的骨髓细胞类型中。在骨髓性（myeloid）或骨髓性（myelogenous）白血病中，癌变发生在通常继续形成红细胞、一些其他类型的白细胞和血小板的骨髓细胞类型中。结合这两种分类提供了总共四种主要类别。在这四种主要分类的每一种中，通常有一些亚类别。还存在分类方案之外的罕见类型。示例性的白血病包括：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞性白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞性白血病、大颗粒淋巴细胞白血病、幼年型粒-单核细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、伯基特白血病和成人T细胞性白血病。

本文所用术语“黑素瘤”是黑素细胞的恶性肿瘤。黑素细胞是产生与皮肤颜色有关的暗色素(黑色素)的细胞。它们主要存在于皮肤，但是也在身体的其他部位存在，包括肠和眼。黑素瘤分为以下分型和亚类：恶性雀斑、恶性雀斑样黑素瘤、浅表扩展性黑素瘤、肢端着色斑性黑素瘤、粘膜黑素瘤、结节性黑素瘤、息肉样黑素瘤、结缔组织增生性黑素瘤、无黑色素性黑素瘤、软组织黑素瘤、小痣样细胞黑素瘤、Spitz痣特征黑素瘤和葡萄膜黑素瘤。

本文所用术语“转移”指恶性肿瘤或癌从一个器官或部分扩展到另一个不相邻的器官或部分。

术语“抑制”是相对的术语，如果与给予对照试剂相比，在给予某一试剂后反应或状态在数量上减少或者如果在给予某一试剂后反应或状态减弱，则所述试剂能抑制所述反应或状态。同样地，术语“防止”并不一定意味着试剂能完全消除反应或状态，只要能消除反应或状态的至少一个特征即可。因此，降低或者防止感染或反应（如病理反应）的组合物能但并不一定完全消除所述感染或反应，只要能检测到所述感染或反应减少，例如，在未给予所述试剂时或与给予对照试剂相比时，所述感染或反应减少至少约50%，如至少约70%或约80%，或甚至约90%(即，达到10%或更低)。

术语“CXCL13免疫原”和“CXCR5免疫原”指免疫原性组合物，包括（1）来源于CXCL13或CXCR5的免疫原性肽和/或（2）编码并能够表达来源于CXCL13或CXCR5的免疫原性肽的表达载体。所述来源于CXCL13或CXCR5的免疫原性肽可以与另一部分融合以增强其免疫原性。CXCL13免疫原性肽的实例包括但不限于由选自以下的一个或多个序列组成的肽或者包含选自以下的一个或多个序列的肽：RSSSTLPVPVFKRKIP(SEQ ID NO:45)、PRGNGCPRKEIIVWKK(SEQID NO:46)、LPRGNGCPRKEIIVWK(SEQ ID NO:47)、QILPRGNGCPRKEIIV(SEQ ID NO:48)、ILPRGNGCPRKEIIVW(SEQID NO:49)、RIQILPRGNGCPRKEI(SEQ ID NO:50)、RGNGCPRKEIIVWKKN(SEQ ID NO:51)、KRSSSTLPVPVFKRKI(SEQ ID NO:52)、IQILPRGNGCPRKEII(SEQ ID NO:53)、DRIQILPRGNGCPRKE(SEQ ID NO:54)、RKRSSSTLPVPVFKRK(SEQID NO:55)、RCRCVQESSVFIPRRF(SEQ ID NO:56)、GNGCPRKEIIVWKKNK(SEQ ID NO:57)、CVQESSVFIPRRFIDR(SEQID NO:58)、IDRIQILPRGNGCPRK(SEQ ID NO:59)、LRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:60)、FIDRIQILPRGNGCPR(SEQID NO:61)、RCVQESSVFIPRRFID(SEQ ID NO:62)、CRCVQESSVFIPRRFI(SEQ ID NO:63)、QESSVFIPRRFIDRIQ(SEQ IDNO:64)、RFIDRIQILPRGNGCP(SEQ ID NO:65)、VQESSVFIPRRFIDRI(SEQ ID NO:66)、ESSVFIPRRFIDRIQI(SEQ ID NO:67)、SLRCRCVQESSVFIPR(SEQ ID NO:68)、NGCPRKEIIVWKKNKS(SEQ ID NO:69)、PQAEWIQRMMEVLRKR(SEQ ID NO:70)、RRFIDRIQILPRGNGC(SEQ ID NO:71)、LRKRSSSTLPVPVFKR(SEQID NO:72)、VQESSVFIPRR(SEQ ID NO:73、EWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRK(SEQ ID NO:74)、KKNK(SEQID NO:75)、RKRSSS(SEQ ID NO:76)、RGNGCP(SEQ ID NO:77)、VYYTSLRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:78)、DRIQILP(SEQ IDNO:79)、RKEIIVW(SEQ ID NO:80)和KSIVCVDPQ(SEQ ID NO:81)。CXCR5免疫原性肽的实例包括但不限于由选自以下的一个或多个序列组成的肽或者包含选自以下的一个或多个序列的肽：TSLVENHLCPATE(SEQ ID NO:82)、EGSVGWVLGTFLCKT(SEQ IDNO:83)、LPRCTFS(SEQ ID NO:84)、LARLKAVDNT(SEQ ID NO:85)和MASFKAVFVP(SEQ ID NO:86)。

术语“CXCL16免疫原”和“CXCR6免疫原”指免疫原性组合物，包括（1）来源于CXCL16或CXCR6的免疫原性肽和/或（2）编码并能够表达来源于CXCL16或CXCR6的免疫原性肽的表达载体。所述来源于CXCL16或CXCR6的免疫原性肽可以是融合蛋白形式，从而增强其免疫原性。CXCL16免疫原性肽的实例包括但不限于由选自以下的一个或多个序列组成的肽或者包含选自以下的一个或多个序列的肽：AAGPEAGENQKQPEKN(SEQ ID NO:87)、SQASEGASSDIHTPAQ(SEQ ID NO:88)、STLQSTQRPTLPVGSL(SEQ ID NO:89)、SWSVCGGNKDPWVQEL(SEQ ID NO:90)、GPTARTSATVPVLCLL(SEQ ID NO:91)、SGIVAHQKHLLPTSPP(SEQ ID NO:92)、RLRKHL(SEQ ID NO:93)、LQSTQRP(SEQ ID NO:94)、SSDKELTRPNETT(SEQID NO:95)、AGENQKQPEKNA(SEQ ID NO:96)、NEGSVT(SEQ IDNO:97)、ISSDSPPSV(SEQ ID NO:98)、CGGNKDPW(SEQ ID NO:99)、LLPTSPPISQASEGASSDIHT(SEQ ID NO:100)、STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT(SEQ ID NO:101)、SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA(SEQ ID NO:102)、TGSCYCGKR(SEQ ID NO:103)、DSPPSVQ(SEQ ID NO:104)、RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSWSVCGG(SEQ ID NO:105)、WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ(SEQ IDNO:106)、SDIHTPAQMLLSTLQ(SEQ ID NO:107)、RPTLPVGSL(SEQID NO:108)、TAGHSLAAG(SEQ ID NO:109)、GKRISSDSPPSVQ(SEQID NO:110)、KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH(SEQ IDNO:111)。CXCR6免疫原性肽的实例包括但不限于由选自以下的一个或多个序列组成的肽或者包含选自以下的一个或多个序列的肽：HQDFLQFSKV(SEQ ID NO:112)、AGIHEWVFGQVMCK(SEQ IDNO:113)、PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI(SEQ ID NO:114)和YYAMTSFHYTIMVTEA(SEQ ID NO:115)。

术语“生物样本”指从哺乳动物个体、优选人类个体获得的生物材料样本，包括组织、组织样本、细胞样本、肿瘤样本、粪便样本和生物流体，如血液、血浆、血清、唾液、尿液、脑液或脊髓液、淋巴液和乳头抽吸液。生物样本可以以例如组织活检的形式获得，例如抽吸活组织检查、刷拭活组织检查、表面活组织检查、针吸组织检查、钻取活组织检查、切除活组织检查、切开活组织检查、切取活组织检查和内窥镜活组织检查。在一个实施方式中，所述生物样本为血液、血清或血浆样本。在另一个实施方式中，所述生物样本为唾液样本。在又一个实施方式中，所述生物样本为尿液样本。

生物样本的“分离物”（例如，组织或肿瘤样本的分离物）指已从样本分隔、得到、提取、纯化或分离的材料或组合物（例如生物材料或组合物），并优选基本不含有与所述生物样本有关的不期望的组分和/或杂质或污染物。

“组织样本”包括由个体、优选人类个体的完整组织获得或移除的组织的部分、片、块、片段或小份。

“肿瘤样本”包括肿瘤的部分、片、块、片段或小份，所述肿瘤例如由个体、优选人类个体获得或移除（例如，从个体的组织移除或提取）的肿瘤。肿瘤样本可以从原发性肿瘤或转移性肿瘤获得。

用于治疗目的的术语“哺乳动物”指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、非人类灵长类动物、家畜和农畜，以及动物园动物、体育动物或宠物，如狗、马、猫、牛等。优选地，哺乳动物为人。

术语“升高的水平”指高于相关领域通常所定义或使用的正常或对照水平的水平。例如，组织中免疫染色的升高的水平是被本领域普通技术人员认为高于对照组织中免疫染色水平的免疫染色水平。

本文中范围可以表示为从“约”一个具体值和/或至“约”另一个具体值。当表达了这种范围时，另一实施方式包括从一个具体值和/或至另一具体值。同样地，当值表示为近似值时，通过使用先行词“约”，应当理解的是，所述具体值形成了另一实施方式。应当进一步理解的是，每个范围的端点在与另一端点相关和独立于另一端点中都是重要的。也可以理解的是，本文公开了很多值，除所述值本身以外，本文中的每个值也公开为“约”该具体值的形式。例如，如果公开了值“10”，则也公开了“约10”。也可以理解的是，当公开了某个值时，也公开了“小于或等于”所述值、“大于或等于”所述值以及值之间的可能范围，这是技术人员能合适地理解的。例如，如果公开了值“10”，那么也公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。

通过测定CXCL13和/或CXCR5表达或活性来检测恶性肿瘤的方法

CXCL13，也称为B淋巴细胞趋化因子1（BLC），是CXCR5趋化因子受体的配体。上述趋化因子和受体在恶性肿瘤的转移和侵袭的调节中表现出作用。与正常组织相比，CXCL13和CXCR5在多种癌组织类型中为局部上调，包括卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、骨癌和胰腺癌。在这些恶性肿瘤的患者的血清中CXCL13水平也会升高。另外，可溶性CXCL13趋化因子在体内和体外都可以增强恶性肿瘤细胞的增殖和迁移。

CXCR5(CD185)，也称为伯基特淋巴瘤受体1（BLR1），是G蛋白偶联受体（GPCR）的趋化因子受体家族的成员，其在恶性肿瘤细胞存活中可能具有多种作用，推测为提供与化疗药物的对抗。CXCR5和CXCL13相互作用活化与DOCK结合蛋白ELMO1（吞噬和细胞运动蛋白1）的DOCK2（胞质分裂作用因子2，Dedicator of cytokenesis2)，从而允许DOCK2介导的Rac（Rac相关的C3肉毒杆菌毒素底物蛋白，其是GTP酶的Rho家族的亚类的信号转到G蛋白家族）淋巴细胞中活化。DOCK2与Rac1和Rac2同种型结合，并且DOCK2依赖性Rac活化能调节嗜中性粒细胞NADPH氧化酶并且对嗜中性粒细胞的趋化性很重要。在本申请中，术语“CXCR5”包括CXCR5的转录变体，如CXCR5a(CXCR5转录变体2)和CXCR5b(CXCR5转录变体1)。

本申请的一方面涉及检测个体中恶性肿瘤存在的方法。在一个实施方式中，所述方法包括检测来自个体的生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平；以及将生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平与一种或多种恶性肿瘤标志物的正常表达水平相比较，其中生物样本中所述一种或多种恶性肿瘤标志物高于正常的表达水平表示个体中存在恶性肿瘤，其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物的正常表达水平为预定值，或者获自与所述生物样本具有相同来源或类型的已知的正常非癌性细胞的对照样本，其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物包括CXCL13、或CXCR5、或者CXCL13和CXCR5。

在另一实施方式中，所述一种或多种恶性肿瘤标志物包括（1）CXCL13、或CXCR5、或者CXCL13和CXCR5，以及（2）CXCL16、或CXCR6、或者CXCL16和CXCR6。

在另一实施方式中，所示一种或多种恶性肿瘤标志物包括（1）CXCL13、或CXCR5、或者CXCL13和CXCR5，（2）CXCL16、或CXCR6、或者CXCL16和CXCR6，以及（3）一种或多种其他恶性肿瘤标志物。

在本申请的上下文中，术语“检测”意图包括预测和可能性分析。本申请的方法意图在临床上作出有关治疗方式的决策中使用，包括恶性肿瘤的治疗干预、诊断标准（如疾病分期）、疾病监测和监视。根据本申请，可以提供检查个体疾病状态的中间结果。这种中间结果可以和其他信息联合而协助医生、护士或其他专业人员来诊断个体患有的疾病。可选地，本申请可以用于检测来源于个体的组织中的恶性肿瘤细胞，并向医生提供有用信息从而诊断个体患有的疾病。意图通过本申请的方法进行诊断的个体优选为人，但也可以包括其他哺乳动物，如非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛。

在一些实施方式中，所述恶性肿瘤为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤。在一些其他实施方式中，所述生物样本为血浆样本、唾液样本或尿液样本。

预测患有恶性肿瘤的个体的预后的方法

本申请的用于诊断恶性肿瘤的方法也可以用于评价患恶性肿瘤个体的预后，其通过比较来源于患者的生物样本和参考样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平。在一个实施方式中，所述方法包括测定来自患者的生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平，其中如果所述生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平高于对照值（即对照中的水平），则表示所述个体的预后不良，而如果所述生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平低于或近似于对照中的水平，则表示所述个体的预后良好。预后不良表明恶性肿瘤为攻击型或侵袭型，可能迅速发展和/或可能转移，其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物包括CXCL13、或CXCR5、或者CXCL13和CXCR5。

在另一实施方式中，所述一种或多种恶性肿瘤标志物包括包括（1）CXCL13或CXCR5，或者CXCL13和CXCR5，以及（2）CXCL16、或CXCR6、或者CXCL16和CXCR6。

在另一实施方式中，所示一种或多种恶性肿瘤标志物包括（1）CXCL13、或CXCR5、或者CXCL13和CXCR5，（2）CXCL16、或CXCR6、或者CXCL16和CXCR6，以及（3）一种或多种其他恶性肿瘤标志物。

可选地，可以在一系列疾病阶段中测量生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的水平从而评价患者的预后。与正常对照水平相比，一种或多种恶性肿瘤标志物的水平升高表明预后较不乐观。与正常对照水平相比，一种或多种恶性肿瘤标志物的水平相似表明患者的预后较为乐观。

在一些实施方式中，所述恶性肿瘤为为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤。在一些其他实施方式中，所述生物样本为血浆样本、唾液样本或尿液样本。

监测恶性肿瘤治疗过程的方法

在一些实施方式中，一种或多种恶性肿瘤标志物的水平被用于监测恶性肿瘤的治疗过程。该方法中，由进行恶性肿瘤治疗的个体提供测试生物样本。优选地，在治疗前、治疗中或治疗后的不同时间点从个体获得多个测试生物样本。然后，可以将治疗后的样本中恶性肿瘤标志物的表达水平与治疗前的样本中恶性肿瘤标志物的水平比较，或可选地，与参考样本（即正常对照水平）比较。例如，如果治疗后的标志物水平低于治疗前的标志物水平，可以推断治疗是有效的。同样地，如果治疗后标志物水平与正常对照标志物水平近似或相同，也可以推断治疗是有效的。

“有效”治疗是能使个体中恶性肿瘤标志物的水平降低或恶性肿瘤的尺寸、发展或转移可能性降低的治疗。当实施预防性处理时，“有效”指所述处理能延缓或预防恶性肿瘤的发生或者减轻恶性肿瘤的临床症状。可以使用标准临床程序来评价恶性肿瘤。而且，可以联合使用诊断或治疗恶性肿瘤的任何已知方法来确定治疗的功效。例如，常规通过组织病理学或通过鉴定诸如体重减轻和食欲不振的异常症状来诊断恶性肿瘤。

在一个实施方式中，将生物样本中的恶性肿瘤标志物的水平与参考样本（如正常的对照样本）相关的恶性肿瘤标志物的水平相比较。短语“正常对照水平”指通常在未患有恶性肿瘤群体的生物样本中发现的恶性肿瘤标志物水平。所述参考样本优选与测试样本有类似的性质。例如，如果测试样本包括患者血清，参考样本也应当为血清。可以同时测定来自对照和测试个体的生物样本中恶性肿瘤标志物水平，或者可选地，通过分析事先从对照组收集的样本中恶性肿瘤标志物的水平，可以通过基于获得的结果的统计学方法来确定正常对照水平。

在一些实施方式中，所述恶性肿瘤为为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤。在一些其他实施方式中，所述生物样本为血浆样本、唾液样本或尿液样本。

恶性肿瘤标志物

本文所用术语“恶性肿瘤标志物”指或描述了多肽或多核苷酸，其表达水平（单独或与其他多肽或多核苷酸联合)与恶性肿瘤或恶性肿瘤预后相关。这种相关可以涉及多肽或多核苷酸的表达升高或降低。例如，多肽或多核苷酸的表达可以指示恶性肿瘤，或者多肽或多核苷酸的表达缺乏可以与恶性肿瘤患者的不良预后有关。

可以在转录水平或者翻译水平测定术语“恶性肿瘤标志物的表达水平”，在转录水平下，测定多核苷酸的存在和/或量，在翻译水平下，测定多肽的存在和/或量。可以使用任何合适的方法表征恶性肿瘤标志物表达。

恶性肿瘤标志物的实例包括CXCL13、CXCR5、其他趋化因子和趋化因子受体，如CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1、CX3CL1、RNA结合基序3("RBM3"),癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、嗜铬粒蛋白A、脱氢表雄酮(DHEA)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、促乳素、B7-H3、分离酶多肽（seprase polypeptide）、抗p53、骨桥蛋白、铁蛋白、溶血磷脂酰胆碱、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)、神经正五聚蛋白I(NPTX1)和成纤维细胞生长因子受体1癌基因伴侣(FGFR1OP)蛋白。

在一个实施方式中，上述恶性肿瘤标志物选自黑素瘤标志物组，其包括CXCL13、CXCR5、CCL25、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCL16、CX3CL1、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR6和CX3CR1。黑素瘤组中的标志物可以用于检测黑素瘤或预测患有黑素瘤个体的预后。

在一个实施方式中，上述恶性肿瘤标志物选自癌标志物组，其包括CXCL13、CXCR5、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CXCL16、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR6和CX3CR1。癌组中的标志物可以用于检测癌或预测患有癌个体的预后。

在另一实施方式中，上述恶性肿瘤标志物选自乳腺癌标志物组，其包括CXCL13、CXCR5、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CXCL16、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR6、CX3CR1、RNA结合基序3("RBM3")和癌胚抗原(CEA)。乳腺癌组中的标志物可以用于检测乳腺癌或预测患有乳腺癌个体的预后。

在另一实施方式中，上述恶性肿瘤标志物选自前列腺癌标志物组，其包括CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、PSA、CEA、CGA、DHEA、NSE、PAP、促乳素和B7-H3。乳腺癌组中的标志物可以用于检测前列腺癌或预测患有前列腺癌个体的预后。

在另一实施方式中，上述恶性肿瘤标志物选自结肠直肠癌标志物组，其包括CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、分离酶多肽、抗p53、骨桥蛋白和铁蛋白。结肠直肠癌组中的标志物可以用于检测结肠直肠癌或预测患有结肠直肠癌个体的预后。

在另一实施方式中，上述恶性肿瘤标志物选自卵巢癌标志物组，其包括CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、癌抗原125(CA-125)、HE-4、OVX-1巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和溶血磷脂酰胆碱。卵巢癌组中的标志物可以用于检测卵巢癌或预测患有卵巢癌个体的预后。

在另一实施方式中，上述恶性肿瘤标志物选自肺癌标志物组，其包括CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)、神经正五聚蛋白I(NPTX1)、成纤维细胞生长因子受体1癌基因伴侣(FGFR1OP)蛋白和CEA。肺癌组中的标志物可以用于检测肺癌或预测患有肺癌个体的预后。

在另一实施方式中，上述恶性肿瘤标志物选自胰腺癌标志物组，其包括CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1和CEA。胰腺癌组中的标志物可以用于检测胰腺癌或预测患有胰腺癌个体的预后。

在另一实施方式中，上述恶性肿瘤标志物选自胃癌标志物组，其包括CXCL13、CXCR5、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CXCL16、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR6和CX3CR1和CEA。胃癌组中的标志物可以用于检测胃癌或预测患有胃癌个体的预后。

检测方法

可以在转录水平（即mRNA的量）或翻译水平（即蛋白的量）测定恶性肿瘤标志物的表达。在一些实施方式中，通过定量RT-PCR、Northern印迹或本领域技术人员已知的其他方法在mRNA水平测定恶性肿瘤标志物的表达。在其他实施方式中，通过ELISA、Western印迹或使用抗恶性肿瘤标志物抗体（如抗CXCL13和抗CXCR5抗体）的其他类型免疫检测方法来测定恶性肿瘤标志物的表达。

在一些实施方式中，抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体包括能特异性结合CXCL13肽或CXCR5肽的抗体。CXCL13肽的实例包括但不限于由选自以下的一个或多个序列组成或者包含选自以下的一个或多个序列的肽：RSSSTLPVPVFKRKIP(SEQ ID NO:45),PRGNGCPRKEIIVWKK(SEQ ID NO:46),LPRGNGCPRKEIIVWK(SEQ ID NO:47),QILPRGNGCPRKEIIV(SEQ ID NO:48),ILPRGNGCPRKEIIVW(SEQ ID NO:49),RIQILPRGNGCPRKEI(SEQID NO:50),RGNGCPRKEIIVWKKN(SEQ ID NO:51),KRSSSTLPVPVFKRKI(SEQ ID NO:52),IQILPRGNGCPRKEII(SEQID NO:53),DRIQILPRGNGCPRKE(SEQ ID NO:54),RKRSSSTLPVPVFKRK(SEQ ID NO:55),RCRCVQESSVFIPRRF(SEQID NO:56),GNGCPRKEIIVWKKNK(SEQ ID NO:57),CVQESSVFIPRRFIDR(SEQ ID NO:58),IDRIQILPRGNGCPRK(SEQID NO:59),LRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:60),FIDRIQILPRGNGCPR(SEQ ID NO:61),RCVQESSVFIPRRFID(SEQID NO:62),CRCVQESSVFIPRRFI(SEQ ID NO:63),QESSVFIPRRFIDRIQ(SEQ ID NO:64),RFIDRIQILPRGNGCP(SEQ IDNO:65),VQESSVFIPRRFIDRI(SEQ ID NO:66),ESSVFIPRRFIDRIQI(SEQ ID NO:67),SLRCRCVQESSVFIPR(SEQ ID NO:68),NGCPRKEIIVWKKNKS(SEQ ID NO:69),PQAEWIQRMMEVLRKR(SEQ ID NO:70),RRFIDRIQILPRGNGC(SEQ ID NO:71),LRKRSSSTLPVPVFKR(SEQ ID NO:72),VQESSVFIPRR(SEQ IDNO:73,EWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRK(SEQ ID NO:74),KKNK(SEQ ID NO:75),RKRSSS(SEQ ID NO:76),RGNGCP(SEQ IDNO:77),VYYTSLRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:78),DRIQILP(SEQ ID NO:79),RKEIIVW(SEQ ID NO:80)和KSIVCVDPQ(SEQ IDNO:81)。CXCR5肽的实例包括但不限于由选自以下的一个或多个序列组成或者包含选自以下的一个或多个序列的肽：TSLVENHLCPATE(SEQ ID NO:82),EGSVGWVLGTFLCKT(SEQ ID NO:83),LPRCTFS(SEQ ID NO:84),LARLKAVDNT(SEQ ID NO:85)和MASFKAVFVP(SEQ ID NO:86)。

在其他实施方式中，联合使用抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体与抗CXCL16抗体和/或抗CXCR6抗体。抗CXCL16和/或抗CXCR6抗体包括能特异性结合CXCL16肽或CXCR6肽的抗体。CXCL16肽的实例包括但不限于由选自以下的一个或多个序列组成或者包含选自以下的一个或多个序列的肽：AAGPEAGENQKQPEKN(SEQ IDNO:87),SQASEGASSDIHTPAQ(SEQ ID NO:88),STLQSTQRPTLPVGSL(SEQ ID NO:89),SWSVCGGNKDPWVQEL(SEQ ID NO:90),GPTARTSATVPVLCLL(SEQ ID NO:91),SGIVAHQKHLLPTSPP(SEQ ID NO:92),RLRKHL(SEQ ID NO:93),LQSTQRP(SEQ ID NO:94),SSDKELTRPNETT(SEQ ID NO:95),AGENQKQPEKNA(SEQ ID NO:96),NEGSVT(SEQ ID NO:97),ISSDSPPSV(SEQ ID NO:98),CGGNKDPW(SEQ ID NO:99),LLPTSPPISQASEGASSDIHT(SEQ ID NO:100),STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT(SEQ ID NO:101),SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA(SEQ ID NO:102),TGSCYCGKR(SEQ ID NO:103),DSPPSVQ(SEQ ID NO:104),RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSWSVCGG(SEQ ID NO:105),WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ(SEQ IDNO:106),SDIHTPAQMLLSTLQ(SEQ ID NO:107),RPTLPVGSL(SEQID NO:108),TAGHSLAAG(SEQ ID NO:109),GKRISSDSPPSVQ(SEQID NO:110),KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH(SEQ IDNO:111)。CXCR6肽的实例包括但不限于由选自以下的一个或多个序列组成或者包括选自以下的一个或多个序列的肽：HQDFLQFSKV(SEQ ID NO:112),AGIHEWVFGQVMCK(SEQ ID NO:113),PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI(SEQ ID NO:114)和YYAMTSFHYTIMVTEA(SEQ ID NO:115)。

在一个实施方式中，抗体与固体载体缀合。“固体载体”是指本申请的抗体可以粘附或附着的非水性基质。本文包括的固相的实例包括部分或全部地由玻璃（例如可控多孔玻璃）、多糖（例如琼脂糖）、聚丙烯酰胺、硅酮和塑料（如聚苯乙烯、聚丙烯和聚乙烯醇）形成的固相。

酶联免疫吸附测定（ELISA）

在一些实施方式中，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）来检测恶性肿瘤标志物，通常用包被有抗体的测定板或孔进行ELISA。通常使用的ELISA测定利用了夹心免疫测定或竞争性结合免疫测定。

简单地说，夹心免疫测定是使用能结合抗原或配体的不同位点的两种抗体的方法。对抗原具有高度特异性的一抗附着于固体表面。然后加入所述抗原，然后添加称为检测抗体的二抗。所述检测抗体能结合抗原的不同于一抗结合的表位。因此，所述抗原被“夹”在两个抗体之间。抗体对抗原的结合亲和力通常是免疫测定灵敏性的主要决定因素。随着抗原浓度增加，检测抗体的量也增加，导致更高的测量响应。夹心结合测定的标准曲线具有正斜率。为定量结合的程度，可以使用不同的报告物。通常，酶连接于二抗，二抗必须为不同于一抗的物种中产生的（即，如果一抗是兔抗体，二抗则为来自于山羊、鸡等而并非兔子的抗兔抗体）。将酶的底物添加至反应中，形成比色读数作为检测信号。生成的信号与存在于样本中的靶抗原成比例。

用于测定结合事件的连接抗体的报告物决定了检测方式。分光光度酶标仪可以用于比色检测。最近开发了几种类型的报告物，从而提高免疫测定中的灵敏性。例如，已经开发出了化学发光底物，其进一步放大信号并且可以在发光酶标仪上读出。而且，荧光读数正变得非常普及，其中测定的酶学步骤被荧光体标记的抗体代替。然后使用荧光酶标仪测量读数。

竞争性结合测定是基于标记的和未记的配体竞争结合有限数量的抗体结合位点。竞争性抑制测定经常用于测量小的分析物。当针对分析物的配对抗体不存在时，也使用这些测定。在竞争性结合ELISA中仅使用一种抗体。这是因为如果两种抗体都试图与非常小的分子结合时会出现空间位阻。固定量的标记配体（追踪物）和可变量的未记配体与抗体孵育。根据质量作用定律，标记配体的量为标记和未标记配体的总浓度的函数。随着未标记配体的浓度增加，更少的标记配体能够结合抗体并且测量的响应降低。因此，信号越小，样品中未标记的分析物就越多。竞争性结合测定的标准曲线具有负斜率。

微珠

在一些其他实施方式中，使用包被有抗体的微珠检测恶性肿瘤标志物。在一些实施方式中，所述微珠为磁珠。在其他实施方式中，所述微珠的内部用荧光染料编码颜色，并且珠的表面用能够与测试样本中的恶性肿瘤标志物结合的抗恶性肿瘤标志物抗体（例如抗CXCL13抗体或抗CXCR5抗体）标记。相应地，恶性肿瘤标志物既可以直接用荧光标签标记，也可以用与荧光标签缀合的抗标志物抗体间接标记。因此，有两个颜色来源，一个来自于珠而另一个来自于荧光标签。可选地，可以通过不同的尺寸来内部编码所述珠。

通过使用来自两种染料的不同的荧光强度的混合以及不同尺寸的珠，该测定可以测量多达数百种不同的恶性肿瘤标志物。在测定期间，将包含颜色/尺寸编码的珠、荧光标记的抗标志物抗体和样本的混合物组合，并上样到使用精密流控技术而能使珠对准的的仪器中。然后所述珠通过激光，并基于它们的颜色或尺寸进行分类或测量颜色强度，将其处理为每个反应的定量数据。

当用荧光团直接标记样本时，在不移除溶液中未结合的荧光团时，系统仅可以读出和定量珠上的荧光。可以通过区分不同颜色或尺寸的珠是使该测定多元化使用。当样本直接需要未标记的样本时，可实现实时测量。标准的测定步骤包括孵育样本和包被有抗标志物抗体的珠，与生物素或荧光团标记的二抗孵育，并检测荧光信号。荧光信号可以在珠上显示（对于生物素化的二抗，通过添加抗生蛋白链菌素-荧光团偶联物）并通过珠分析仪读数。依据固定在珠表面的抗标志物，基于珠的免疫测定可以是夹心类型或竞争类型的免疫测定。

测试棒

在一些其他实施方式中，可以使用测试棒检测液体生物样本中的恶性肿瘤标志物。所述测试棒通常包含液体不可渗透的外壳和具有一种或多种检测区的液体可渗透的“棒”。在一个实施方式中，每个检测区包含能与生物样本中的恶性肿瘤标志物结合的干燥结合剂。在另一实施方式中，所述干燥结合剂是标记的结合剂。在另一实施方式中，所述测试棒可以进一步包括对照区，从而表明测定试验良好进行（即，试剂存在于测试棒中），以及在运行试验时它们是固定的且沿着流动道运输。所述对照区也表明装置中的试剂能够发生免疫化学相互作用，以确认装置的化学完整性。当考虑到在一定温度范围内、干燥条件下装置的保存和运输时，这一点是重要的。所述对照区通常位于检测区的下游，并且可以例如包括标记的结合试剂的固定的结合试剂。所述标记的结合试剂可以以可动的形式存在于对照区和检测区的上游。标记的结合试剂可以与恶性肿瘤标志物的标记的结合试剂相同或不同。

在一个实施方式中，测试棒包括与一个或多个流动通道保持液体连通并位于所述一个或多个流动通道上游的多孔样本接收器。多孔样本接收器可以对所有测定通用。因此施加于装置的通用样本施加区的液体样本能够沿着一个或多个流通道移动，到达各自的检测区。多孔样本接收器可以设置于外壳内部或至少部分伸出所述外壳，并可以用作例如收集体液。多孔样本接收器也可以用作液体储存器。多孔样本接收部件可以由任何能够迅速吸收液体的吸湿性、多孔或纤维材料制造。材料的多孔性可以是单向的（即，孔或纤维完全或主要平行于所述部件的轴行进）或多向的（全向的，从而使所述部件具有无定形的海绵状结构）。可以使用多孔塑料材料，如聚丙烯、聚乙烯（优选非常高的分子量)、聚偏二氟乙烯、乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate）、丙烯腈和聚四氟乙烯。其他合适的材料包括玻璃纤维。

如果需要，可以在载体材料的远端设置吸收“池”。吸收池可以包括，例如Whatman3MM色层分析纸，并且应提供足够的吸收容量，从而允许任何未结合的标记的结合试剂从检测区洗出。作为这种池的可选方案，具有超出检测区的一定长度的多孔固相材料就足够了。

将结合试剂施加至检测区后，可以处理多孔固相材料的剩余部分，从而封闭任何剩余的结合位点。可以通过例如用蛋白质（例如，牛血清白蛋白或乳蛋白）、或聚乙烯醇或乙醇胺、或者它们的组合来处理而实现封闭。当多孔载体被样本湿润时，为了协助标记的结合试剂自由流动，所述多孔载体可以进一步包括如蔗糖或乳糖的糖和/或如聚乙烯醇（PVA）或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的其他物质。这种材料可以沉积为例如在意图施加标记的结合试剂的区域中中水溶液。这种材料可以被施加于多孔载体作为第一次施加，接着施加标记；可选地，这种材料可以与标记混合并施加至多孔载体或二者的组合。这种材料可以沉积于标记的结合试剂的上游或标记的结合试剂处。

可选地，在制造时可以不封闭多孔载体；而是在所述多孔载体的上游的材料中包括用于封闭多孔载体的工具。在湿润测试条时，封闭多孔载体的工具移动，并且封闭工具流入并经过多孔载体，随着流动过程进行封闭。封闭工具包括如BSA和酪蛋白的蛋白质，以及如PVP、PVA的聚合物，以及糖和如Triton-X100的去垢剂。封闭工具可以存在于大孔载体材料中。

干燥的结合试剂可以设置于包括检测区的多孔载体材料的上游的多孔载体材料上。上游多孔载体材料可以是大孔的。大孔载体材料应当是蛋白低结合或蛋白不结合，或者应当易于通过如BAS或PVA的试剂封闭，从而减少非特异性结合以及大孔体被液体样本湿润后利于标记的试剂的自由移动。可以用表面活性剂或溶剂预处理大孔载体材料，如果必要，使其亲水性更强并促进液体样本的快速吸收。大孔载体的合适材料包括塑料材料，如聚乙烯和聚丙烯，或如纸或玻璃纤维的其他材料。在用可检测颗粒对标记的结合试剂进行标记的情况中，大孔体可以具有大于颗粒标记的最大颗粒尺寸至少10倍的孔径。孔径越大，标记的试剂能越好地释放。作为大孔材料的可选方案，可以将标记的结合试剂设置于位于检测区的上游的无孔基底上，所述无孔基底形成流动通道的一部分。

在另一实施方式中，测试棒可以进一步包括用于接收液体样本的样本接收部件。样本接收部件可以从所述外壳伸出。

外壳可以由液体不可渗透的材料构成。外壳也有利地排除环境光线。如果投射至装置外部的可见光渗透至装置内部少于10%、优选少于5%、并且最优选少于1%，则认为外壳基本排除了环境光线。不透光合成塑料材料，如包含合适的阻光色素的聚碳酸酯、ABS、聚苯乙烯（polystyrene）、聚苯乙烯（polystyrol）、高密度聚乙烯或聚丙烯，是制造外壳时使用的合适选择。可以在外壳外部设置孔，所述孔与位于外壳内部空间中的测定相连通。可选地，所述孔可以用来使多孔样本接收器从外壳延伸至外壳外部的位置。

微阵列

在其他实施方式中，通过蛋白质微阵列检测恶性肿瘤标志物，所述蛋白质微阵列包含在其表面上的固定的恶性肿瘤标志物特异性抗体。所述微阵列可以用于“夹心”测定，其中微阵列上的抗体捕获测试样本中的恶性肿瘤标志物并且通过能特异性结合捕获标志物的标记的二抗检测该捕获标志物。在优选的实施方式中，二抗是生物素化的或酶标记的。随后通过与抗生蛋白链菌素-荧光团缀合物（用于荧光检测）或酶底物（用于比色检测）孵育来实现检测。

通常，微阵列测定包括多个孵育步骤，包括与样本孵育和与多种试剂（例如，一抗、二抗、报告试剂等）孵育。在孵育步骤之间也需要重复的洗涤。在一个实施方式中，以快速测定模式进行微阵列测定，其只需要一或两次孵育。也可以想到的是，可以在单个孵育步骤中形成可检测的免疫复合物（例如捕获的恶性肿瘤标志物/抗标志物抗体/标记复合物），其通过将蛋白质微阵列暴露于样本和所有必需试剂的混合物而实现。在一个实施方式中，一级和二抗是相同的抗体。

在另一实施方式中，蛋白质阵列提供了竞争性免疫测定。简单地说，将包括固定的抗标志物抗体的微阵列与测试样本在标记的恶性肿瘤标志物标准品存在的情况下一起孵育。标记的恶性肿瘤标志物与测试样本中未标记的恶性肿瘤标志物竞争结合固定的抗原特异性抗体。在这样的竞争环境中，测试样本中特异性恶性肿瘤标志物浓度的升高会导致标记的恶性肿瘤标志物标准品与固定的抗体结合降低，由此来自标记的信号强度降低。

微阵列可以以手控、半自动或自动化模式运行。手控模式指手动操作所有测定步骤，包括将试剂和样本递送至微阵列上，样本孵育和微阵列洗涤。半自动模式指手动操作将样本和试剂递送至微阵列上，而自动运行孵育和洗涤步骤。在自动化模式中，三个步骤（样本/试剂递送、孵育和洗涤）可以由计算机或具有键盘的集成的电路板单元来控制。例如，可以用ProteinArray Workstation(PerkinElmer Life Sciences,Boston,Mass.)或Assay1200^TM.Workstation(Zyomyx,Hayward,Calif.)进行微阵列。利用荧光扫描、比色和化学发光的扫描仪可以用于检测微阵列信号并获取微阵列图像。也可以通过其他方式实现基于微阵列的测定的定量，如质谱法和表面等离子体共振。可以通过独立的图像分析软件或用图像采集和分析软件包来分析获取的微阵列图像。例如，可以用基于PMT的荧光扫描仪--ScanArray3000(General Scanning,Watertown,Mass.)或基于CCD的比色扫描仪--VisionSpot(AlliedBiotech,Ijamsville,Md.)来实现抗原微阵列的定量。通常，图像分析会包括用各种软件包进行数据采集和测定报告的准备。为了加速从获取图像到生成测定报告的整个测定过程，包括图像获取、图像分析和生成报告的所有分析步骤都可以通过一种软件包来实现和/或控制。这样的一体化控制系统会以方便用户的方式提供图像分析和测定报告的生成。

可植入的生物传感器

在其他实施方式中，可以使用可植入的生物传感器来检测恶性肿瘤标志物。生物传感器是能产生作为生物相互作用结果的电子信号的电子装置。在一个实施方式中，生物传感器使用抗体、受体、核酸或结合对的其他成员来与恶性肿瘤标志物结合，所述恶性肿瘤标志物通常是所述结合对的另一成员。生物传感器可以和血液样本一起使用来确定恶性肿瘤标志物的存在，而无需自动免疫测定系统通常所需的样本准备和/或分离步骤。

在一个实施方式中，传感器为纳米级别的装置。传感器系统包括连接到纳米线的生物识别元件和能够测定与纳米线相关的性质的检测器。所述生物识别元件是结合对的一个成员（例如，恶性肿瘤标志物的受体或抗恶性肿瘤标志物抗体），其中所测量的恶性肿瘤标志物是所述结合对的另一成员。优选地，纳米线传感器包括其上形成有外表面的半导体纳米线以形成栅电极以及第一末端第二末端，第一末端与导体电接触以形成源电极，第二末端与导体接触中以形成漏电极。在一个实施方式中，传感器为场效应晶体管，包括绝缘材料形成的基底、源电极、漏电极和置于它们之间的半导体纳米线，生物识别元件连接到所述纳米线的表面。当在生物识别元件和其特异性结合伴侣之间发生结合事件时，会引起场效应晶体管的电流-电压特性的可检测的变化。

在另一实施方式中，传感器系统包括传感器阵列。阵列中一个或多个传感器与保护部件相连，保护部件防止相连的传感器与周围环境相互作用。在选定的时间，可以使保护部件失去保护功能，由此使得传感器开始运行，与周围的液体或组织相互作用，使生物识别元件可以与其结合对中的另一成员相互作用（如果该结合对成员存在的话）。

在另一实施方式中，保护部件由传导性材料形成，所述材料能够氧化、具有生物相容性和生物可吸收性，并且在施加电势时可以溶于诸如血液的溶液中。例如，可以在覆盖有传导性材料（如生物相容性金属或可电腐蚀的聚合物）的基底的孔中形成传感器。在另一实施方式中，使用能在预定的时间段内溶解的材料来形成保护部件。

质谱法

在其他实施方式中，使用质谱法（MS）检测恶性肿瘤标志物，如MALDI/TOF(飞行时间)、SELDI/TOF、液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、毛细管电泳-质谱法、核磁共振波谱法或串联质谱法（例如，MS/MS,MS/MS/MS,ESI-MS/MS等)。

质谱法是本领域众所周知的，并用于定量和/或鉴定诸如蛋白质的生物分子。而且，质谱技术已发展为能允许分离蛋白的至少部分从头测序。在一些实施方式中，使用气相离子分光光度计。在其他实施方式中，使用激光解吸/电离质谱来分析样本。调制器激光解吸/电离质谱（"LDI-MS"）可以以两种主要变化形式进行：基质辅助激光解析/电离（"MALDI"）质谱和表面增强的激光解析/电离（"SELDI"）。在MALDI中，将分析物与包含基质的溶液混合，并将一滴液体置于基底表面上。然后将基质液与生物分子共结晶。将基底插入质谱仪中。将激光能量引导至基底表面，在这里激光能量解吸和电离生物分子而不显著将其片段化。在SELDI中，修饰基底表面，从而使其积极地参与到解吸过程中。在一个实施方式中，用能选择性结合目的蛋白的吸附剂和/或捕获试剂对表面进行衍生化。在另一实施方式中，用能量吸收分子对表面进行衍生化，当用激光冲击所述能量吸收分子时，其不会解吸。在另一实施方式中，用能与目的蛋白结合并且包含施加激光时能断开的光分解键的分子对表面进行衍生化。每种这些方法中，衍生剂通常是位于基底表面上施加样本的具体位置。参见，例如美国专利号5,719,060(Hutchens和Yip)和WO98/59361(Hutchens和Yip)。两种方法可以联合，例如通过使用SELDI亲和力表面来捕获分析物并将含有基质的液体加至捕获的分析物中以提供能量吸收材料。

检测恶性肿瘤标志物的存在通常会涉及信号强度的检测。该检测可以反映结合至基底的多肽的量和特性。例如，在一些实施方式中，可以比较来自第一样本和第二样本的波谱的峰值的信号强度（例如，肉眼比较，通过计算机分析等）来测定具体生物分子的相对量。如Biomarker Wizard program（Ciphergen Biosystems,Inc.,Fremont,Calif.）的软件程序可以用来帮助分析质谱。质谱仪及其技术对本领域技术人员而言是众所周知的。

本领域技术人员能理解，质谱的任何组件（例如解吸源、质量分析仪、检测等）和多种样本制剂可以与本文所述或本领域所知的其他合适的组件或制剂联合使用。例如，在一些实施方式中，对照样本可以包含重原子（例如13C），因此允许测试样本与已知对照样本在同一的质谱运行中混合。

在一个优选的实施方式中，使用激光解吸飞行时间（TOF）质谱仪。在激光解吸质谱中，将具有结合的标志物的基底引入入口系统。标志物被来自电离源的激光解吸并电离为气相。通过离子光学组件收集产生的离子，然后收集在时间飞行质谱分析仪中，离子通过短的高压场加速并漂入高真空室。在高真空室的远端，加速的离子在不同的时间碰撞灵敏的检测器表面。由于时间飞行是离子质量的函数，所以离子形成和离子检测器碰撞之间的经历时间可以用于鉴定是否存在特定质荷比的分子。

在一些实施方式中，通过用计算机执行算法来部分地测定存在于第一或第二样本中的一种或多种恶性肿瘤标志物的相对量。所述算法鉴定第一质谱和第二质谱中的至少一个峰值。然后所述算法将质谱中的第一质谱的峰值信号强度和第二质谱的峰值信号强度相比较。相对的信号强度表示存在于第一和第二样本中的恶性肿瘤标志物的量。可以将包含已知量的恶性肿瘤标志物的标准品作为第二样本分析，以更好定量存在于第一样本中的生物分子的量。在一些实施方式中，还可以测定第一和第二样本中的恶性肿瘤标志物的同一性。

标准值、特异性和灵敏性的测定

在本申请中，可以在统计学上测定恶性肿瘤标志物的标准表达水平，如CXCL13的血液浓度。例如，可以测量健康个体中CXCL13的血液浓度以在统计学上确定CXCL13的标准血液浓度。当可以获得统计学上足够的群体时，距平均值的两倍或三倍标准偏差（S.D.）的范围内的值通常用作标准值。因此，对应于平均值+2×S.D.或平均值+3×S.D.的值可以用作标准值。所述标准值的设定理论上分别包括90%和99.7%的健康个体。

可选地，也可以基于恶性肿瘤患者中的实际表达水平（例如，CXCL13的血液浓度）设定标准值。一般来说，这样设定的标准值能将假阳性的百分比减至最小，并在满足可以最大限度地提高检测灵敏性的条件的值的范围中选择。此处，假阳性的百分比是指在健康个体中CXCL13的血液浓度被判断为高于标准值的患者的百分比。相反，在健康个体中，CXCL13的血液浓度被判断为低于标准值的患者的百分比表明特异性。也就是说，假阳性的百分比和特异性的和始终为1。检测灵敏性是指在已测定存在恶性肿瘤的个体人群中，所有恶性肿瘤患者中CXCL13的血液浓度被判断为高于标准值的患者的百分比。

本文所用术语“测试灵敏性”是筛查测试的鉴定真正疾病的能力，其特征在于高灵敏性的测试很少发生假阴性，而且测试独立于疾病的流行性。测试灵敏性计算为真阳性测试/总体受影响的测试患者，表示为百分比。

术语“测试特异性”是没有疾病时为正确阴性的筛查测试，其具有高特异性并很少出现假阳性，并且独立于疾病的流行性。测试特异性计算为真阴性测试/不受影响的测试个体，表示为百分比。

术语“PPV”（阳性预测值）是阳性测试的患有疾病的患者百分比，并因此评价阳性测试的可靠性。计算：

1.PPV=(真阳性)/(真阳性+假阳性)。

术语“NPV”（阴性预测值）指阴性测试的没有疾病的患者，并因此评价阴性测试的可靠性。计算：

2.NPV=(真阴性)/(真阴性和假阴性)。

如上述关系所示，灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值的每个值是评价诊断准确性指标，其根据用于判断CXCL13的血液浓度水平的标准值而变化。

通常设定的标准值能使假阳性比例较低并且灵敏性较高。然而，从上述关系也可以很明显地看出，在假阳性比例和灵敏性之间需要权衡。也就是说，如果标准值降低，检测灵敏性提高。然而，由于假阳性比例也增加，很难满足具有“低假阳性比例”的条件。考虑到该情况，例如，给出以下预测结果的值可以选作本申请的优选标准值：（1）假阳性比例为50%以下的标准值（也就是说，特异性不低于50%的标准值）和（2）灵敏性不低于20%的标准值。

可以使用接收器工作特性（ROC）曲线来设定标准值。ROC曲线是示出垂直轴为检测灵敏性、水平轴为假阳性比例（也就是说“1-特异性”）的图。可以通过绘制灵敏性和假阳性比例的变化（在连续改变用来测定恶性肿瘤标志物（如CXCL13）的血液浓度的高/低程度的标准值之后得到的）来获得ROC曲线。

用于获得ROC曲线的“标准值”是暂时用于统计分析的值。用于获得ROC曲线的“标准值”通常可以在允许涵盖所有可选择的标准值的范围内连续改变。例如，在被分析群体中，标准值可以在最小和最大的测量的血液CXCL13值之间变化。

基于所获得的ROC曲线，本申请中要使用的优选的标准值可以从满足上述条件的范围中选择。可选地，可以基于通过在包括大部分测量的血液CXCL13的范围改变标准值而生成的ROC曲线来选择标准值。

用于检测恶性肿瘤或监测恶性肿瘤进展的试剂盒

本申请的另一方面涉及用于检测恶性肿瘤或监测恶性肿瘤进展的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包括用于测定生物样本中CXCL13和/或CXCR5表达的试剂以及使用所述试剂的说明，其中所述试剂包括抗CXCL13抗体、抗CXCR5抗体或两者。

使用抗CXCL13抗体、抗CXCR5抗体、抗CXCL16抗体和/或抗CXCR6抗体来治疗或预防恶性肿瘤的方法

本发明的一个方面涉及使用抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体治疗或预防恶性肿瘤的方法。所述方法包括对需要这种治疗的个体给予治疗有效量的抗CXCL13抗体、抗CXCR5抗体或它们的组合。在一个实施方式中，所述恶性肿瘤是黑素瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、肉瘤、胚细胞瘤或癌。癌的实例包括但不限于，腺泡细胞癌、囊性腺样癌、腺癌、腺鳞癌、肾上腺皮质腺瘤、肾上腺皮质癌、未分化癌、阿普多瘤（apudoma）、基底细胞癌、类癌、癌肉瘤、明细胞癌、圆柱瘤、囊腺癌、导管癌、胃泌素瘤、巨细胞癌、神经胶质瘤、胰高血糖素瘤、许特莱氏细胞腺癌、胰岛瘤、大细胞癌、小叶癌、成神经管细胞瘤、髓样癌、粘液腺囊腺瘤、粘液表皮样癌、神经外胚层瘤、唾液腺嗜酸性粒细胞瘤、乳头状汗腺腺瘤、乳头瘤、多形性癌、肺母细胞瘤、肉瘤样的瘤、浆液性囊腺瘤、印戒细胞癌、小细胞癌、生长激素抑制素瘤、梭形细胞癌、鳞状细胞癌、胸腺瘤、疣状癌、以及来自于内胚层、外胚层或上皮细胞的位于机体的内或外表面排列器官或组织的癌。这些器官或组织包括但不限于：骨、乳房、中枢神经系统、子宫颈、结肠、子宫内膜、食道、法娄皮欧氏管、胃肠道、肾脏、肺、淋巴、乳腺、口腔、卵巢、胰脏、脑下垂体、前列腺、直肠、生殖道、呼吸道、胃、汗腺、胸腺、甲状腺、子宫、阴道。

在另一实施方式中，个体被诊断患有导致恶性肿瘤细胞中CXCL13和/或CXCR5的表达升高的恶性肿瘤。这种恶性肿瘤的实例包括但不限于，黑素瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、肉瘤、胚细胞瘤和癌。在一个实施方式中，个体被诊断患有脑癌。在另一实施方式中，个体被诊断患有前列腺癌。在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原(如蛋白质、肽或编码基因)来免疫个体，从而诱导能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗体。在另一实施方式中，个体被诊断患有骨癌。在另一实施方式中，个体被诊断患有垂体癌。在又一实施方式中，个体被诊断患有卵巢癌。在另一实施方式中，个体被诊断患有肺癌。在另一实施方式中，个体被诊断患有乳腺癌。在另一实施方式中，个体被诊断患有结肠癌。在另一实施方式中，个体被诊断患有淋巴瘤或骨髓瘤。在另一实施方式中，个体被诊断患有白血病。

在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：用有效量的CXCL16和/或CXCR6免疫原(如蛋白质、肽或编码基因)来免疫个体，从而诱导能抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的抗体。

在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：用有效量的CXCL13和CXCR5免疫原中的一种或多种和有效量的CXCL16和CXCR6中的一种或多种免疫原来免疫个体。

本发明的另一方面涉及通过使用抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体治疗需要治疗的个体来抑制或防止恶性肿瘤转移的方法。在一个实施方式中，抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体抑制或防止恶性肿瘤对组织的侵袭。在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原(如蛋白质、肽或编码基因)来免疫个体，从而诱导能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗体。在一些实施方式中，所述恶性肿瘤为前列腺癌。在其他实施方式中，所述恶性肿瘤为黑素瘤。在一些实施方式中，所述组织为骨。

本发明的另一方面涉及使用抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体来治疗需要治疗的个体从而使已有的肿瘤消退的方法。在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原(如蛋白质、肽或编码基因)来免疫个体，从而诱导能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗体。在具体实施方式中，已有的肿瘤为晚期肿瘤。在一些实施方式中，已有的肿瘤为转移性肿瘤。

本发明的另一方面涉及使用抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体来治疗需要治疗的个体从而防止或抑制骨中肿瘤溶骨性生长的方法。在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原(如蛋白质、肽或编码基因)来免疫个体，从而诱导能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗体。在一些其他实施方式中，所述肿瘤为黑素瘤、淋巴瘤、肉瘤、胚细胞瘤或癌。在一些实施方式中，所述肿瘤为癌。在具体实施方式中，所述肿瘤为前列腺癌。在一些实施方式中，用抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体的治疗防止了肿瘤造成的骨质溶解或骨吸收。

在另一实施方式中，所述方法进一步包括测定来自个体的组织中CXCL13和/或CXCR5的表达水平，并且，如果检测到CXCL13和/或CXCR5的水平升高，则向个体给予治疗有效量的抗CXCL13抗体、抗CXCR5抗体或它们的组合。在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原(如蛋白质、肽或编码基因)来免疫个体，从而诱导能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗体。

本发明优选的抗体为能结合人CXCL13并且优选（部分或全部）阻断CXCL13与受体结合能力的抗体，所述受体包括但不限于CXCR5。本发明另一优选的抗体为能结合人CXCR5并且优选（部分或全部）阻断在其表面表达CXCR5趋化因子受体的细胞（如肿瘤细胞或癌细胞）结合配体能力的抗体，所述配体包括但不限于CXCL13。本发明又一优选的抗体为能结合人CXCR5并优选（部分或全部）阻断可溶CXCR5趋化因子受体结合配体的能力，所述配体包括但不限于CXCL13。

在一个实施方式中，抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体为单克隆抗体。在另一实施方式中，抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体为人源化抗体。在另一实施方式中，抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体为人源化抗体片段。

在本发明的具体实施方式中，在用抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体治疗个体之前、同时或之后，联合使用治疗有效量的至少一种对另一抗原有特异性的其他抗体治疗个体。在一个实施方式中，所述另一抗原为另一种趋化因子或趋化因子受体，如CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CXCL15、CXCL16,CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1或CX3CL1。

在另一实施方式中，另一抗原为与癌有关的趋化因子或趋化因子受体，并选自：CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CXCL16、CCR2、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR6、CXCR7、CX3CL1和CX3CR1。

在另一实施方式中，另一抗原为与黑素瘤有关的趋化因子或趋化因子受体，并选自：CCL25、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR6、CXCR7和CX3CR1。

在另一实施方式中，另一抗原为与淋巴瘤有关的趋化因子或趋化因子受体，并选自CXCL12、CXCR4、CXCR7、CCR2。

在另一实施方式中，另一抗原为与骨髓瘤或白血病有关的趋化因子或趋化因子受体。

在另一实施方式中，所述另一抗原选自表1和/或表2所示的多肽，以及任意上述多肽的片段。

其他示例性抗原包括诸如肾素的分子；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺激素;脂蛋白；a-1-抗胰蛋白酶;胰岛素A链；胰岛素B链；前胰岛素；促卵泡激素；降钙素；促黄体素；高血糖素；凝血因子，如因子VIII、因子IX、组织因子和血友病因子（von Willebrands factor）；抗凝血因子，如蛋白质C；心房钠尿因子；肺表面活性物质；纤溶酶原活化因子，如尿激酶或人尿或或组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β；脑啡肽酶；血清白蛋白，如人血清白蛋白；苗勒管抑制物质（Muellerian-inhibitingsubstance）；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原（prorelaxin）；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（CTLA），如CTLA-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子受体；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子，如骨来源的神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3、4、5或6(NT-3、NT4、NT-5或NT-6)，或如NGF-β的神经生长因子；血小板来源的生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；ErbB受体家族成员，如EGF受体；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9和/或IL-10；过氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；αv/β3整联蛋白，包括其a或b亚基，如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；前列腺特异性抗原(PSA)；肿瘤相关抗原，如癌胚抗原(CEA)、CK2、CA125、TA90、HER2、HER3或HER4受体；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白质C；来自经典、凝集素或旁路补体途径的任何一种蛋白质；以及任意上述多肽的片段。

可以用已知的方法对个体给予抗体，例如作为弹丸注射或一段时间的连续输注的静脉给药，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口腔、局部或吸入途径给药。在一些实施方式中，将抗体直接给药至肿瘤或恶性肿瘤组织，包括在侵袭期间直接给药至瘤床。也可以将抗体置于如海绵或纱布的固体载体上，用于给药抵御靶趋化因子影响组织。

本发明的抗体可以在通常所接受的药学上可接受载体中给药。可接受的载体包括但不限于，盐水，缓冲盐水和葡萄糖盐水。固体载体、脂质体、纳米颗粒、微颗粒、纳米球或微球也可以用作抗体给药的载体。

抗体的合适剂量（“治疗有效量”）取决于例如待治疗的疾病状态，疾病状态的严重程度和过程，抗体给药是预防还是治疗目的，先前的治疗，患者的临床史和对抗体的反应，所用抗体的类型和主治医师的判断。抗体适合对患者一次给药或者在一系列的治疗中给药，并且可以在诊断起的任何时间对患者给药。抗体可以作为唯一的治疗进行给药或与治疗目标疾病状态中有用的其他药物或治疗联合给药。

作为一般的建议，不论一次或多次给药，给药抗体的治疗有效量为约1ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天。在具体实施方式中，抗体的给药范围为约1ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、1ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天、1ng/kg体重/天至约10ng/kg体重/天、10ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、10ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天、100ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、100ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天、1μg/kg体重/天至约10μg/kg体重/天、1μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、10μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、10μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、100μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、1mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天和10mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天。

在另一实施方式中，抗体的给药剂量范围为每次注射1ng至10ng、每次注射10ng至100ng、每次注射100ng至1μg、每次注射1μg至10μg、每次注射10μg至100μg、每次注射100μg至1mg、每次注射1mg至10mg、每次注射10mg至100mg和每次注射100mg至1000mg。抗体可以每天注射，或每2、3、4、5、6或7天或每1、2、3或4周注射。

在另一具体实施方式中，抗体的给药剂量范围为约1ng/kg至约100mg/kg。在又一实施方式中，抗体的给药范围为约1ng/kg至约10ng/kg、约10ng/kg至约100ng/kg、约100ng/kg至约1μg/kg、约1μg/kg至约10μg/kg、约10μg/kg至约100μg/kg、约100μg/kg至约1mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约10mg/kg至约100mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg和约1mg/kg至约15mg/kg。

在其他实施方式中，抗体的给药量为0.0006、0.001、0.003、0.006、0.01、0.03、0.06、0.1、0.3、0.6、1、3、6、10、30、60、100、300、600和1000mg/天，或约0.0006、0.001、0.003、0.006、0.01、0.03、0.06、0.1、0.3、0.6、1、3、6、10、30、60、100、300、600和1000mg/天。正如所期望的，剂量会取决于患者的疾病状态、体型、年龄和疾病状态。

视情况或根据指示，可以通过弹丸注射或连续输注给予单一剂量的抗体，或者可以通过弹丸注射或连续输注给予多剂量的抗体。可以例如每天多次、每日一次、每2、3、4、5、6或7天、每周、每2、3、4、5或6周或每月给予多剂量。然而，也可以使用其他剂量方案。可以通过常规技术容易地监测治疗的过程。

在本发明的具体实施方式中，可以将治疗有效量的抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体作为唯一的治疗剂给予有需要的个体。在一个具体实施方式中，治疗有效量的抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体杀伤肿瘤或恶性肿瘤细胞或促进肿瘤或癌细胞的凋亡。在另一具体实施方式中，治疗有效量的抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体抑制或防止肿瘤或癌的生成。在另一具体实施方式中，治疗有效量的抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体抑制或防止肿瘤或癌细胞从现有的肿瘤或癌迁移或转移。在又一具体实施方式中，治疗有效量的抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体抑制或防止肿瘤或癌对非癌性组织的侵入。

在本发明具体实施方式中，可以将治疗有效量的抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体与一种或多种另外的治疗有效的抗体对有需要的个体联合给药。所述一种或多种另外的治疗有效量的抗体可靶向CXCL13和/或CXCR5上的其他决定簇、其他趋化因子、其他趋化因子受体、其他可溶性或细胞表面配体或受体（包括但不限于，肿瘤或癌特异性抗原、病毒、细菌或寄生虫抗原、恶性肿瘤细胞的产物或凋亡的残余物）。抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体可以在给予一种或多种另外的治疗有效的抗体之前、同时和/或之后进行给药。

在具体实施方式中，治疗有效量的抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体增强一种或多种另外的治疗有效的抗体在杀伤肿瘤或癌细胞中的功效。在更具体的实施方式中，治疗有效量的抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体减少杀伤肿瘤或癌细胞需要的一种或多种另外的治疗有效量的抗体的量。在另一具体实施方式中，治疗有效量的抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体抑制或防止肿瘤或癌细胞从已有的肿瘤或癌迁移或转移，从而增强了一种或多种另外的治疗有效的抗体在杀伤肿瘤或癌细胞中的局部功效。在又一具体实施方式中，治疗有效量的抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体抑制或防止肿瘤或癌细胞对非癌性组织的侵入，从而增强了一种或多种另外的治疗有效的抗体在杀伤肿瘤或癌细胞中的局部功效。

在另一实施方式中，抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体是与细胞毒性剂缀合的抗体。在另一实施方式中，抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体与另一种抗恶性肿瘤剂（如化疗剂）共同给药。

本发明的另一方面涉及抑制趋化因子CXCL13与其受体相互作用的方法，包括使细胞与有效量的能与哺乳动物CXCL13或CXCL13的一部分结合的抗体或其功能片段接触。

本发明的另一方面涉及抑制细胞携带的CXCR5与其配体相互作用的方法，包括使细胞与有效量的能与哺乳动物CXCR5或CXCR5的一部分结合的抗体或其功能片段接触。

在另一实施方式中，治疗恶性肿瘤的方法包括对需要这种治疗的个体给予有效量的表达载体，所述表达载体能在恶性肿瘤细胞或恶性细胞中表达抗CXCL13抗体、抗CXCR5抗体或它们的组合。在另一实施方式中，治疗恶性肿瘤的方法包括下步骤：用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原来免疫个体，从而诱导宿主产生能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗体。

表达载体可以是能够将编码抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体的核苷酸递送至靶细胞中并在靶细胞中表达抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体的任何载体。在另一实施方式中，表达载体能够将编码CXCL13和/或CXCR6的核苷酸递送至靶细胞中，从而诱导宿主产生抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体。表达载体的实例包括病毒载体和非病毒载体。

病毒载体包括但不限于，反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和其他大容量病毒载体，如疱疹病毒和牛痘病毒。也包括共同具有这些病毒的特性的任何病毒家族，所述特性使得它们适合用作表达载体。

逆转录病毒载体

逆转录病毒是属于逆转录病毒科的病毒家族的动物病毒，包括任何类型、亚家族、属或嗜性。使用反转录病毒载体进行基因治疗的方法的实例在美国专利号4,868,116和4,980,286；PCT申请WO90/02806和WO89/07136；以及Mulligan,(Science260:926-932(1993))中有描述；将其教导的内容通过引用合并于本申请。

腺病毒载体

重组腺病毒载体已被证实在直接体内递送至气道上皮、肝细胞、血管内皮、CNS实质和许多其他组织位点之后能实现高效的基因转移。重组腺病毒载体通过以下方式实现基因转导：结合特定细胞表面，然后，通过受体介导的胞吞作用将病毒内化，这与野生型或复制缺陷型腺病毒的方式相同。

病毒载体可以是基于腺病毒的载体，其中一个或多个病毒基因被去除，并且这些病毒体在补体细胞系中产生，如人293细胞系。在一个实施方式中，E1基因从腺病毒载体中去除。在另一实施方式中，E1和E3基因都从腺病毒载体中去除。在另一实施方式中，E1和E4基因都从腺病毒载体中去除。在另一实施方式中，所述腺病毒载体为裸腺病毒载体（gutless adenovirus vector）。

腺相关病毒载体

另一类病毒载体是基于腺相关病毒载体（AAV）。该缺陷的细小病毒为优选载体，因为它可以感染很多类型的细胞并且对人不致病。AAV型载体可以运输约4-5kb，已知野生型AAV可稳定地插入染色体19。包含该位点特异性整合性质的载体是优选的。这种类型的载体的特别优选的实施方式为Avigen,San Francisco,CA生产的P4.1C载体，其能够含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因、HSV-tk和/或标记基因，如编码绿色荧光蛋白GFP的基因。

在另一类AAV病毒中，AAV包含一对反向末端重复（ITR），其位于至少一个含有启动子的盒的侧翼，所述启动子指导细胞特异性表达并可操作地连接于异源基因。在此处，异源指任何对AAV或B19细小病毒而言并非天然的核苷酸序列或基因。

通常AAV和B19编码区已被缺失，由此得到安全、无细胞毒性的载体。AAV ITR或其修饰提供感染性和位点特异性整合，但无细胞毒性，并且启动子指导细胞特异性表达。对于AAV载体的相关材料，将美国专利号6,261,834通过引用合并入本文。

大的负载病毒载体

利用大的人疱疹病毒的分子遗传学实验提供了在允许疱疹病毒感染细胞中克隆、增殖并建立大的异源DNA片段的手段（Sun等，Naturegenetics8:33-41,1994;Cotter and Robertson,Curr Opin Mol Ther5:633-644,1999）。这些大的DNA病毒（单纯疱疹病毒(HSV）和EB病毒(EBV))具有将大于150kb的人异源DNA片段递送至特定细胞的潜能。EBV重组子可以在感染的B细胞中以游离DNA的方式维持大段DNA。携带高达330kb的人类基因组插入物的各个克隆表现出遗传稳定性。这些游离体的维持需要特定EBV核蛋白EBNA1，其在EBV感染期间组成型表达。另外，这些载体可以用于转染，可以在体外短暂地生成大量蛋白质。疱疹病毒扩增系统也可以用于包装大于220kb的DNA片段并感染能够稳定以游离体形式维持DNA的细胞。其他有用的系统包括例如复制受限的和宿主受限的非复制牛痘病毒载体。

非病毒载体包括质粒表达载体。质粒载体通常包括环形双链DNA环，另外的DNA片段可以插入其中。

在病毒和非病毒表达载体中，编码抗体的多核苷酸通常被置于用于指导mRNA合成的合适的转录调控序列（启动子和任选的一种或多种增强子）附近并且设定方向。也就是说，目的多核苷酸序列可操作地连接于合适的转录调控序列。启动子的实例包括：病毒启动子，如CMV的立即早期启动子、LTR或SV40启动子、杆状病毒的多面启动子、大肠杆菌（E.coli）lac或trp启动子、噬菌体T7和λPL启动子，以及其他已知能控制真核细胞或它们的病毒中的基因表达的启动子。启动子可以是组织特异性启动子。

表达载体通常还包含用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体任选地包括用于扩增表达的合适序列。另外，表达载体任选地包括一种或多种选择标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型形状，例如，对于真核细胞培养为二氢叶酸还原酶或对新霉素的抗性，或者例如，对于大肠杆菌为对四环素或氨苄青霉素的抗性。

表达载体也可以包括另外的表达元件，例如，为了提高翻译效率。这些信号可以包括，例如ATG起始密码子和相邻序列。在一些情况中，例如，翻译起始密码子和相关序列元件与目的多核苷酸序列（例如天然起始密码子）被同时插入至合适的表达载体。在这种情况下，不需要另外的翻译调控信号。然而，在仅插入多肽编码序列或其一部分的情况下，则要提供外源翻译调控信号，包括ATG起始密码子。将起始密码子置于正确的阅读框内，以确保目的多核苷酸序列的翻译。外源转录元件和起始密码子可以是多种来源的，天然的和合成的均可。如果需要，可以通过包含适于使用的细胞系统的增强子来进一步提高表达效率（Scharf等(1994)Results Probl Cell Differ20:125-62;Bitter等(1987)Methods in Enzymol153:516-544）。

在一个实施方式中，表达载体包含可诱导的或可调节的表达系统。可调节的表达系统的实例简要描述如下：

蜕皮激素系统。蜕皮激素系统是基于果蝇中发现的蜕皮诱导系统，但是为了哺乳动物细胞的诱导型表达做了修饰。所述系统使用果蝇类固醇激素蜕皮激素类似物米乐甾酮A（muristerone A），通过异源二聚体细胞核受体来激活目的基因的表达。已报道的表达水平超出基础水平的200倍，并且对哺乳动物细胞生理没有影响。

孕酮系统。孕酮受体通常被刺激而与特定DNA序列结合并通过与其激素配体相互作用来激活转录。相反地，孕酮拮抗剂米非司酮（RU486）能够阻断激素诱导的核转运和随后的DNA结合。已经产生了孕酮受体的突变体形式，其可以被刺激而通过与RU486的相互作用进行结合。为了生成特异性的可调节的转录因子，孕酮受体的RU486结合结构域已与酵母转录因子GAL4的DNA结合结构域和HSV蛋白质VP16的反式激活结构域融合。在缺少RU486时，嵌合因子是无活性的。然而，添加激素诱导嵌合蛋白的构象变化，并且这种变化实现与GAL4结合位点结合并由包含GAL4结合位点的启动子激活转录。

雷帕霉素系统。如FK506和雷帕霉素的免疫抑制剂通过结合特定细胞蛋白并促进它们的二聚体形成而发挥作用。例如，雷帕霉素与FK506结合蛋白（FKBP）的结合导致了其与另一雷帕霉素结合蛋白FRAP的异二聚体形成（可以通过移除药物而逆转）。通过加入药物使两种蛋白质合在一起的能力加强了对多种生物过程（包括转录）的调节。嵌合的DNA结合结构域已与FKBP融合，这使得融合蛋白能与特定DNA结合序列结合。转录激活结构域也已与FRAP融合。当这两个融合蛋白在相同细胞中共表达时，可以通过添加雷帕霉素、通过异二聚体形成来介导全功能转录因子的形成。然后二聚化的嵌合转录因子可以结合包含合成的DNA结合序列拷贝的合成启动子序列。该系统已被成功整合进腺病毒和AAV载体。已在小鼠和狒狒中实现了长期的可调控基因表达。

利用能抑制CXCL13或CXCR5表达或活性的物质治疗或预防恶性肿瘤的方法

本发明的另一方面涉及通过使用能抑制CXCL13或CXCR5表达或活性的物质来治疗或预防恶性肿瘤的方法。在另一实施方式中，所述方法包括对需要这种治疗的个体给予有效量的表达载体，该表达载体表达（1）能抑制CXCL13和/或CXCR5的表达的物质，或者（2）能抑制CXCL13和CXCR5之间相互作用的物质，或者（3）能抑制CXCL13和/或CXCR5生物活性的物质。在一个实施方式中，CXCL13和CXCR5的生物活性包括CXCL13和CXCR5之间的相互作用。

在另一实施方式中，个体被诊断患有导致恶性肿瘤细胞中CXCL13和/或CXCR5表达升高的恶性肿瘤。这种恶性肿瘤的实例包括但不限于黑素瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病和癌，如卵巢癌、阴道癌、子宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、胰岛瘤、胰高血糖素瘤、腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、口腔癌、脑癌、成神经管细胞瘤、神经外胚层瘤、胶质瘤、垂体癌和骨癌。

在另一实施方式中，所述方法进一步包括测定来自个体的组织中CXCL13和/或CXCR5的表达水平，并且，如果在所述组织中检测到CXCL13和/或CXCR5的水平升高，向个体给予所述物质。

在一个实施方式中，表达载体为病毒载体。在另一实施方式中，表达载体为非载体载体。在另一实施方式中，表达载体能够将编码CXCL13和/或CXCR5的核苷酸递送至靶细胞，从而诱导宿主产生抗CXCL13和/或CXCR5抗体。

在另一实施方式中，所述物质为抗CXCL13抗体、抗CXCR5抗体或它们的组合。

在又一实施方式中，所述物质为功能核酸。功能核酸是具有具体功能的核酸分子，如结合靶分子或催化具体反应。功能核酸分子可以用作靶分子具有的具体活性的抑制剂。功能核酸分子可以与任何的大分子（如DNA、RNA和多肽）相互作用。因此，功能核酸可以与CXCL13或CXCR5的mRNA或基因组DNA相互作用，从而抑制CXCL13或CXCR5蛋白质的表达或CXCL13与CXCR5蛋白质的相互作用，进而抑制活性。通常，功能核酸被设计为能基于靶分子和功能核酸分子之间的序列同源性与其他核酸相互作用。在其他情况下，功能核酸分子和靶分子之间的特异性识别不是基于功能核酸分子和靶分子之间的序列同源性，而是基于允许发生特异性识别的三级结构的形成。功能核酸分子的实例包括siRNA、反义分子、适体、核酶、三链形成分子和外部指导序列。

siRNA参与RNA干扰（RNAi），其包括两步机制：起始步骤和效应步骤。在第一步中，输入的双链(ds)RNA(siRNA)被加工成小片段，如21-23个核苷酸的‘指导序列’。RNA扩增在整个动物中发生。然后，通常，指导RNA可以被并入能够降解RNA的蛋白RNA复合物中，即核酸酶复合物，其被称为RNA诱导的沉默复合物（RISC）。RISC复合物在第二效应步骤中发挥作用，破坏由指导RNA通过碱基配对的相互作用识别的mRNA。RNAi涉及通过任何方式将双链RNA引入细胞，触发引起靶RNA降解的事件。RNAi是转录后基因沉默的形式。除本文所公开的siRNA以外，还公开了在RNAi中发挥作用的RNA发夹。关于制备和使用RNAi分子的描述，参见例如Hammond等,Nature Rev Gen2:110-119(2001);Sharp,Genes Dev15:485-490(2001),Waterhouse等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(23):13959-13964(1998)，通过引用将所有这些文献全部并入本文，并且至少形成关于递送和制备RNAi分子的材料。

RNAi已被证实能在很多类型的细胞中发挥作用，包括哺乳动物细胞。关于在哺乳动物细胞中的作用，优选的是用作RISC复合物中的靶序列的RNA分子较短。例如，长度小于或等于50或40或30或29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、13、11或10个核苷酸。这些RNA分子也可以在相对于待切割的靶RNA的3’或5’端具有悬突。这些悬突的长度可以至少或小于或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个核苷酸。

反义分子被设计为能与靶核酸分子通过典型或非典型碱基配对而相互作用。反义分子和靶分子的相互作用被设计为能通过例如RNAseH介导的RNA-DNA杂合体降解来促进破坏靶分子的破坏。可选地，反义分子被设计为能中断通常发生于靶分子的加工过程，如转录或复制。可以基于靶分子的序列而设计反义分子。存在很多通过寻找靶分子最易接近的区域来优化反义效率的方法。示例性方法是体外选择实验和使用DMS和DEPC的DNA修饰研究。优选地，反义分子结合靶分子的解离常数(kd)小于或等于10-6、10-8、10-10或10-12。帮助设计和使用反义分子的方法和技术的代表性实例可以在以下非限制性美国专利列表中找出：5,135,917、5,994,320、6,046,319和6,057,437。

适体是优选以特定方式与靶分子相互作用的分子。通常，适体是长度为15-50个碱基的小核酸，其折叠成规定的如茎-环或G-四联体的二级或三级结构。适体可以结合趋化因子并阻断其功能（参见例如，Marro等,Biochem Biophys Res Commun.2006Oct13;349:270-6）。适体可以与靶分子以小于10-1²M的kds紧密结合。优选地，适体与靶分子结合的k_d小于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12。适体可以与靶分子以非常高的特异性结合。例如，已分离出能在靶分子和区别仅在于分子上的单个位置的另一分子之间的结合亲和力中具有大于10000倍的差异的适体（美国专利5,543,293）。优选地，适体与靶分子的k_d至少低于与背景结合分子的k_d的10、100、1000、10,000或100,000倍。如何制备和使用适体来结合多种不同的靶分子的代表性实例可以在以下美国专利的非限制性列表中找出：5,476,766、5,861,254、6,030,776和6,051,698。

核酶是能够催化分子内或分子间的化学反应的核酸分子。因此核酶是催化性核酸。优选的是核酶能催化分子间反应。在自然系统中发现很多不同类型的核酶，其催化基于核酶的核酸酶或核酸聚合酶类型的反应，如锤头状核酶（参见，例如美国专利：5,334,711和5,861,288、WO9858058和WO9718312）、发夹结构核酶（参见，例如美国专利：5,631,115和6,022,962）以及四膜虫核酶（参见，例如美国专利5,595,873和5,652,107）。也有很多核酶不存在于自然系统中，它们是从头工程化制备来催化特定反应（参见，例如美国专利：5,580,967和5,910,408）。优选的核酶能切割RNA或DNA底物，并且更优选能切割RNA底物。核酶通常通过识别和结合靶底物并随后切割来切割核酸底物。该识别通常主要基于典型或非典型的碱基对相互作用。该特性使得核酶能更好地成为核酸的靶向特异性切割的候选，因为靶底物的识别是基于靶底物的序列。如何制备和使用核酶来催化多种不同的反应的代表性实例可以在以下美国专利中找出：5,646,042、5,869,253、5,989,906和6,017,756。

三链形成功能核酸分子是可以与双链或单链核酸相互作用的分子。当三链分子与靶区域相互作用时，形成称为三链的结构，其中DNA的三条链形成了依赖于Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对的复合物。三链分子是优选的，因为它们可以以高亲和力和特异性结合靶区域。优选的是三链形成分子结合靶分子的kd小于10-6、10-8、10-10或10-12。如何制备和使用三链形成分子来结合多种不同的靶分子的代表性实例可以在以下美国专利中找出：5,176,996、5,683,874、5,874,566和5,962,426。

外部指导序列（EGS）是能结合靶核酸分子而形成复合物的分子，该复合物由能切割靶分子的RNA酶P识别。EGS可以被设计为能特异性地靶向选择的RNA分子。RNA酶P帮助加工细胞内的RNA转运（tRNA）。通过使用使靶RNA:EGS复合物模拟天然tRNA底物的EGS，细菌RNA酶P可以被动员来切割几乎任何RNA序列（参见，例如Yale的WO92/03566和Forster and Altman,Science238:407-409(1990)）。

相似地，真核EGS/RNA酶P指导的RNA切割可以用来切割真核细胞内所期望的靶标（Yuan等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:8006-8010(1992);Yale的WO93/22434;Yale的WO95/24489;Yuan和Altman,EMBO J14:159-168(1995),和Carrara等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:2627-2631(1995)）。如何制备和使用EGS分子来促进切割多种不同的靶分子的代表性实例可以在以下美国专利的非限制性列表中找出：5,168,053、5,624,824、5,683,873、5,728,521、5,869,248和5,877,162。

防止或抑制具有升高表达的CXCL13和/或CXCR5的恶性肿瘤细胞的迁移或转移的方法

本发明的另一方面涉及防止或抑制个体中具有升高表达的CXCL13和/或CXCR5的恶性肿瘤细胞的迁移或转移的方法。

在一个实施方式中，所述方法包括对个体给予治疗有效量的抗CXCL13抗体、或抗CXCR5抗体、或它们的组合。

在另一实施方式中，所述方法包括以下步骤：对个体给予在所述个体中能表达抗CXCL13抗体、或抗CXCR5抗体、或它们的组合的表达载体。

在另一实施方式中，所述方法包括对个体给予表达载体，该表达载体表达能够抑制CXCL13或CXCR5的表达、或者CXCL13或CXCR5的生物活性、或者CXCL13和CXCR5之间相互作用的物质。在一个实施方式中，所述表达载体能够将编码CXCL13和/或CXCR5的核苷酸递送至靶细胞中，从而诱导宿主产生抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体。

可以使用本领域已知方法来测定CXCL13和/或CXCR5在恶性肿瘤细胞中的表达，如免疫染色或定量PCR。已知过表达CXCL13和/或CXCR5的恶性肿瘤细胞包括但不限于黑素瘤细胞和癌细胞。癌的实例包括但不限于卵巢癌、阴道癌、子宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、胰岛瘤、腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、口腔癌、脑癌、成神经管细胞瘤、神经外胚层瘤、胶质瘤、垂体癌和骨癌。

在一个实施方式中，恶性肿瘤细胞是脑癌细胞。在另一实施方式中，恶性肿瘤细胞是骨癌细胞。在另一实施方式中，恶性肿瘤细胞是垂体癌细胞。在又一实施方式中，恶性肿瘤细胞是卵巢癌细胞。

增强化疗效果的方法

本发明的另一方面涉及增强化疗效果的方法。在一个实施方式中，所述方法包括对进行恶性肿瘤化疗的个体给予有效量的抗CXCL13抗体、或抗CXCR5抗体、或它们的组合。

在另一实施方式中，所述方法包括对进行恶性肿瘤化疗的个体给予有效量的表达抗CXCL13抗体、或抗CXCR5抗体、或它们的组合的表达载体。

在另一实施方式中，所述方法包括对进行恶性肿瘤化疗的个体给予表达载体，该表达载体表达能够抑制CXCL13或CXCR5的表达、或者CXCL13或CXCR5的生物活性、或者CXCL13和CXCR5之间相互作用的物质。在另一实施方式中，所述表达载体能够将编码CXCL13和/或CXCR5的核苷酸递送至靶细胞中，从而诱导宿主产生抗CXCL13抗体和/或抗CXCR5抗体。

在一个实施方式中，所述患者进行黑素瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病或癌的化疗。在另一实施方式中，所述患者进行脑癌的化疗。在另一实施方式中，所述患者进行骨癌的化疗。在另一实施方式中，所述患者进行垂体癌的化疗。在又一实施方式中，所述患者进行卵巢癌的化疗。

用于治疗或预防恶性肿瘤的组合物和试剂盒

本发明的另一方面涉及用于治疗或预防恶性肿瘤的组合物和试剂盒。在一个实施方式中，组合物包括（1）抗CXCL13抗体、抗CXCR5抗体或它们的组合，和（2）药学上可接受载体。在另一实施方式中，组合物包括（1）携带抗CXCL13抗体、抗CXCR5抗体或它们的组合的编码序列的表达载体，和（2）药学上可接受载体。在另一实施方式中，组合物包括（1）携带能抑制CXCL13或CXCR5的表达、或者CXCL13或CXCR5的生物活性、或者CXCL13和CXCR5之间相互作用的物质的编码序列的表达载体，和（2）药学上可接受载体。

本发明的组合物可以包含单一类型的抗体，如单独的抗CXCL13抗体或抗CXCR5抗体，或者两种类型的抗体。对于所治疗的具体适应症，有必要时，组合物还可以包含治疗有效量的上文所述的一种或多种另外的抗原的特异性抗体，优选互补活性不会产生相互不利影响的抗体。例如，当治疗中的癌为卵巢癌时，制备包含抗CXCL13和/或抗CXCR5和一种或多种另外的抗癌决定簇抗体(如单一制剂中的抗CEA、抗CA125和/或抗TA90)的治疗制剂是可取的。在本发明的一些实施方式中，治疗抗体可以与化疗剂或细胞毒性剂联合。在本发明的其他实施方式中，治疗抗体可以与抗炎剂或血栓溶解剂联合。这些试剂适合以对预期目的有效的量进行联合使用。

本文所用的语言“药学上可接受载体”旨在包括与药学给药相容的任何和所有溶剂、增溶剂、填充剂、稳定剂、粘合剂、吸收剂、碱、缓冲剂、润滑剂、控释介质、稀释剂、乳化剂、润湿剂、润滑剂、分散介质、包衣、抗菌或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。用于药学活性物质的介质和试剂的使用在本领域是众所周知的。除非是任何与活性化合物不相容的常规介质或试剂，否则其在组合物中的使用都是要考虑的。补充剂也可以掺入组合物中。在一些实施方式中，药学可接受载体包括血清白蛋白。

本发明的药学组合物被配制为符合其预定的给药途径。给药途径的实例包括肠胃外，例如鞘内、动脉内、静脉内、皮内、皮下、口服、经皮(局部的)和跨粘膜给药。在一些实施方式中，将药学组合物直接给药至肿瘤组织。

肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其他合成试剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧剂，如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四醋酸；缓冲液，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及调节张度的试剂，如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调节pH，如盐酸和氢氧化钠。肠胃外制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量管中。

适合于可注射用途的药学组合物包括无菌水溶液（对于可溶于水的情况）或者用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的分散剂和无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorEL^TM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况中，可注射组合物应当无菌，并且流动的程度应当易于注射。其在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须能抵抗如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）和它们合适的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下通过保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂保持适当的流动性。可以通过多种抗细菌和抗真菌剂来实现防止微生物作用，例如，对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞等。在很多情况中，优选的是在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇（如甘露醇、山梨醇和氯化钠）。通过在组合物中包含延长吸收的试剂（例如单硬脂酸铝和明胶）可以实现可注射组合物的延长吸收。

可以通过以下方式来制备无菌可注射溶液：将所需量的活性化合物（例如神经调节蛋白）和上面列举的一种成分或其组合（根据需要）加入至合适的溶剂中，然后过滤灭菌。一般来说，通过将活性化合物加入至包含碱性分散介质和所需的来自以上列举的其他成分的无菌介质中来制备分散液。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分和任何另外的所期望的来自之前无菌过滤的溶液成分的粉末。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以被封装在胶囊中或压缩成片剂。为了口服治疗给药的目的，活性化合物可以与赋形剂一起合并，并以片剂、锭剂或胶囊形式使用。也可以使用液体载体制备用作漱口水的口服组合物，其中液体载体中的化合物口服施用，并发用于漱口和吐出或吞咽。可以包括药学相容性粘合剂和/或辅助材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊和锭剂等可以包含任何以下成分或具有相似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素、黄芪树胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Stertes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。

对于吸入给药，化合物以来自包含合适的推进剂（例如气体，如二氧化碳）加压容器或分配器或喷洒器的喷雾剂的形式递送。

全身用药也可以通过跨粘膜或经皮的方式。对于跨粘膜或经皮给药，对于要渗透的屏障的合适的渗透剂可以用于制剂中。渗透剂在本领域是公知的，并且包括，例如，用于跨粘膜给药为去垢剂、胆汁盐和梭霉孢酸衍生物。可以通过使用鼻腔喷雾或栓剂来实现跨粘膜给药。对于经皮给药，将药学组合物配制成本领域公知的软膏、油膏、凝胶或霜。

在一些实施方式中，将所述药学组合物配制成用于活性成分的持续释放或受控释放。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类和聚乳酸。制备这种制剂的方法对本领域技术人而言将是显而易见的。材料也可以从例如Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc购买获得。脂质体悬浮液（包括具有针对病毒抗原的单克隆抗体的靶向于感染细胞的脂质体）也可以用作药学可接受载体。这些可以根据本领域已知方法制备这些制剂，例如，如美国专利号4,522,811所描述的。

为了给药的方便性和剂量均匀性，配制单位剂量形式的口服或肠胃外组合物是特别有利的。本文所用单位剂量形式包括适合于待治疗的个体的单位剂量的物理上分离的单元；每个单元包含通过计算能产生所需疗效的预定量的活性化合物和所需的药学载体。活性化合物的特性、要实现的具体疗效以及化合用于个体治疗的活性化合物的领域中固有的局限性影响或决定本发明的单位剂量形式的规格。

可以通过细胞培养或实验动物的标准制药程序来测定化合物的毒性和治疗效果，例如测定LD50（致50%群体死亡的剂量）和ED50（对50%群体治疗有效的剂量）。毒性和治疗效果之间的剂量比为治疗指数，并且可以表示为LD50/ED50。表现出大的治疗指数的化合物是优选的。尽管也可以使用表现出毒副作用的化合物，但是应注意设计递送系统，使这些化合物能靶向于受累组织的位点，从而最小化对未感染的细胞的潜在危害，并由此降低副作用。

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于制定在人类中使用的剂量范围。化合物的剂量优选在包括ED50、但具有很小或没有毒性的循环浓度范围内。依据使用的剂量形式和利用的给药途径，剂量可以在该范围内变化。对于本发明方法中使用的任何化合物，可以从细胞培养测定中初步估计治疗有效的剂量。可以在动物模型中建立剂量来实现包括细胞培养中测定的IC50（即，实现症状的半最大抑制的测试化合物的浓度）的循环血浆浓度范围。这些信息可以用来更准确地确定人类中的有用剂量。在一些实施方式中，单一剂量包含0.01μg-50mg的嵌合神经调节蛋白。药学组合物可以与给药说明一起包括在容器、包或分配器中。

通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为限制性的。将整个申请所引用的全部参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及图和表格通过引用合并入本文。

实施例

实施例1：恶性肿瘤细胞系中DOCK2的表达和CXCL13:CXCR5介导 恶性肿瘤细胞侵袭的体外分析

通过SDS-PAGE呈现来自RWPE-1、LNCaP和PC3细胞的总细胞裂解物（60μg），并使用针对DOCK2的抗体进行免疫印迹（图1A）。GAPDH用作内参。图1B中，按照厂商的说明（Santa Cruz），通过用2μM的DOCK2siRNA双链转染PC3细胞来优化DOCK2沉默调节，并孵育细胞0、24、48和72小时。通过Western印迹分析来测定DOCK2沉默的效率。

尽管已知CXCL13-CXCR5相互作用能介导嗜中性粒细胞的DOCK2依赖性趋化作用，但是还发现CXCL13-CXCR5相互作用也能够促进不依赖于DOCK2的恶性肿瘤细胞转移和侵袭。在图2中，在CXCL13(100ng/ml)、抗人CXCR5抗体(1μg/ml)、DOCK2或对照siRNA的存在下，测试LNCaP和PC3细胞侵入MATRIGEL^TM基质并通过0.8μm的多孔膜迁移的能力。侵入至膜的下表面的细胞被结晶紫染色，并通过显微镜在40倍放大倍数下计数。根据厂商的说明（BDBiosciences）计算细胞侵袭的百分比。误差棒代表3次独立实验的平均值的标准误差。星号（*）表示相对于CXCL13处理的细胞（对照）显著性差异（p<0.05）。

如图3，所示CXCL13也调节Akt和ERK1/2的活化。进行FACE测定来测量LNCaP和PC3细胞系中的活性Akt或ERK1/2和总的Akt或ERK1/2。在CXCL13(100ng/ml)的存在下，用抗人CXCR5抗体、DOCK2siRNA、对照siRNA或JNK抑制剂处理细胞0、5或10分钟。用三个平行样品进行实验，并且结果显示活性（磷酸化的）与总Akt或ERK1/2的比。误差棒代表±3次独立实验的平均值的标准误差。星号（*）表示磷酸化显著性降低（p<0.05）。

图4示出了CXCL13通过PC3细胞中的DOCK2诱导JNK活化。在存在或不存在CXCL13(100ng/ml)的情况下，用DOCK2siRNA和相应的对照处理RWPE-1、LNCaP和PC3细胞。在CXCL13刺激后5分钟收集裂解物，并将样本在SDS-PAGE上呈现。膜上的印迹是针对磷酸化-JNK（46kDa）。GAPDH用作内参。

图5中示出了CXCL13通过JNK和DOCK2调节PCa细胞增殖。在存在或不存在100ng/ml CXCL13、1μg/ml抗CXCR5抗体、DOCK2siRNA和/或10μM JNK抑制剂的情况下，使RWPE-1、LNCaP和PC3细胞在低血清的条件下生长（2%FBS）。进行3天MTT测定以评价细胞增殖。误差棒代表±3次独立实验的平均值的标准误差。星号（*）表示相对于CXCL13处理的细胞的显著改变（p<0.05）。

图6示出了JNK抑制和DOCK2敲低导致非凋亡引起的PCa细胞增殖降低。在存在或不存在100ng/ml CXCL13、1μg/ml抗CXCR5抗体、DOCK2siRNA、10μM JNK抑制剂或1μM渥曼青霉素的情况下，使RWPE-1、LNCaP和PC3细胞在低血清条件下生长（2%FBS）。根据厂商的指导，采用CASPASE-GLO3/7测定（Promega,Madison,WI）测量半胱天冬酶的活性。星号（*）表示相对于无添加的显著改变(p<0.05)。

图7示出了CXCL13调节PCa细胞系中的信号转导级联。CXCL13通过其同源受体CXCR5引起Akt和ERK1/2活化。在LNCaP细胞中，CXCL13也调节JNK活化，这可能是通过与CXCR5偶联得Gαq/11，其介导磷酸酶C（PLC）和蛋白激酶C（PKC）的活化。然而，在PC3细胞中，JNK活化是通过DOCK2介导的。

图8A-C示出了前列腺癌细胞系中的G蛋白α亚基同种型的表达。将来自RWPE-1、LNCaP、C4-2B和PC3细胞的等量蛋白（50μg）通过SDS-Page呈现。通过免疫印迹测定(A)G_αi1、2、3，G_αs；(B)G_α12，G_α13和(C)G_αq/11和G_α16的表达。GAPDH用作内参。

图9示出了前列腺癌细胞系中的G蛋白β和γ亚基同种型的表达。将来自RWPE-1、LNCaP、C4-2B和PC3细胞的等量蛋白（50μg）通过SDS-Page呈现。通过免疫印迹测定G_{α1、2、3、4、5}和G_{α1、2、3、4、5、7、9、 10、1}3的表达。GAPDH用作内参。

图10A-D示出了用或不用CXCL13处理的前列腺癌细胞系中CXCR5和相关G蛋白的表达。（图10A）通过RWPE-1、LNCaP、C4-2B、和PC3细胞裂解物(50μg)的Western印迹分析CXCR5蛋白水平。GAPDH用作内参。用或不用CXCL13处理细胞系并将细胞裂解。对CXCR5进行免疫沉淀（IP）以从总细胞裂解物中拉下相关蛋白。通过SDS-PAGE呈现IP细胞裂解物，并且通过免疫印迹检测G_αi1、G_αi2、G_αi3、G_αs、G_αq/11、G_α12、G_α13(图10B)，G_β1、G_β2、G_β3、G_β4(图10C)和G_γ5、G_γ7、G_γ9、G_γ10(图10D)的表达。

通过免疫沉淀对Gq/11和G_γ5i2蛋白与CXCR5相关的确认示于图11中。用或不用CXCL13处理细胞系并将细胞裂解。由总细胞裂解物对(A)G_αq/11和(B)G_αi2进行免疫沉淀（IP）。通过SDS-PAGE呈现IP细胞裂解物，并且通过免疫印迹检测CXCR5表达。

在CXCL13刺激后与G_α13偶联的CXCR4和CXCR5的鉴定示于图12A-C。用或不用CXCL13处理细胞系，并将细胞裂解。针对G_α13的抗体被用于从总细胞裂解物对G_α13进行免疫沉淀（IP）。通过SDSPAGE呈现IP细胞裂解物，并对CXCR5(图12A)和CXCR4(图12B)进行免疫印迹。(图12C)在CXCL13处理之前或之后，还对CXCR5IP裂解物进行CXCR4表达的Western印迹分析。GAPDH用作内参。

图13描述了前列腺癌细胞中CXCR5相互作用的假设模型。在缺少CXCR5的特异性配体CXCL13的情况下，CXCR5与CXCR4相联，并且在雄激素依赖的LNCaP细胞系中与G_αq/11/G_β3/G_γ9异三聚体偶联，或在激素抵抗性C4-2B和PC3细胞系中与G_αi2/G_β3/G_γ9异三聚体偶联。在CXCL13刺激时，G蛋白从CXCR5离解以活化效应分子。另外，CXCL13活化的CXCR5引起、结合或隔离G_α13蛋白，从而有利于能提高PCa细胞运动性的信号。

表1示出了前列腺癌细胞的抗CXCL13和/或抗CXCR5处理所影响的不同的网络，以及前列腺癌细胞中这些网络的每一个参与的功能。分数表示已知参与各网络的分子数。关注分子（突出显示）是各网络中具有特别作用或重要性的分子。

表1.参与CXCL13处理的转移性前列腺癌的最高得分网络

表2示出了已发现由前列腺癌细胞中CXCL13和CXCR5调节的蛋白。分子的排列是按照细胞中与它们相关的具体生物功能以及它们在细胞中表达升高可以用作标志物的功能或疾病。

表2由CXCL13调节的蛋白以及在PC3细胞中它们的相关生物功能

图14描述了CXCL13如何调节参与细胞周期的关键分子。将磷酸化特异性抗体微阵列分别与CXCL13处理的或未处理的PC3细胞裂解物杂交。计算磷酸化分子和非磷酸化分子比例，并将数据集上传到Ingenuity Pathways Analysis应用。基于分子的连接性通过算法生成网络。结果相对GAPDH水平标准化。颜色代表磷酸化中的倍数改变。灰色表示磷酸化状态没有改变，绿色表示磷酸化降低，粉色表示基线磷酸化，红色表示相对于基线磷酸化升高。

图15描述了CXCL13如何调节参与细胞迁移的关键分子。将磷酸化特异性抗体微阵列分别与CXCL13处理的或未处理的PC3细胞裂解物杂交。计算磷酸化分子和非磷酸化分子比例，并将数据集上传到Ingenuity Pathways Analysis应用。基于分子的连接性通过算法生成网络。结果相对GAPDH水平标准化。颜色代表磷酸化中的倍数改变。灰色表示磷酸化状态没有改变，绿色表示磷酸化降低，粉色表示基线磷酸化，红色表示相对于基线磷酸化升高。

图16描述了CXCL13如何调节参与细胞存活和生长的关键分子。将磷酸化特异性抗体微阵列分别与CXCL13处理的或未处理的PC3细胞裂解物杂交。计算磷酸化分子和非磷酸化分子比例，并将数据集上传到Ingenuity Pathways Analysis应用。基于分子的连接性通过算法生成网络。结果相对GAPDH水平标准化。颜色代表磷酸化中的倍数改变。灰色表示磷酸化状态没有改变，绿色表示磷酸化降低，粉色表示基线磷酸化，红色表示相对于基线磷酸化升高。

采用使用全部数据集和右尾Fisher精确检验计算出的显著性（p值）排在前十位的由CXCL13调节的信号通路示于图17中。

如图18所示，发现CXCL13能介导属于P13K/Akt和SAPK/JNK信号通路的蛋白（有色分子）的差异性磷酸化。这两条经典通路与来自CXCL13处理或未处理的PC3细胞的分析的微阵列数据合并和重叠。灰色表示磷酸化状态没有改变，绿色表示磷酸化降低，粉色表示基线磷酸化，以及红色表示相对于基线磷酸化升高。

图19总结了CXCL13-CXCR5相互作用所调节的信号通路。CXCL13与CXCR5的结合分别导致参与细胞存活、侵袭和生长的PI3K/Akt、Raf/MEK/ERK、整联蛋白/33/Src/FAK和DOCK2/Rac/JNK通路的活化。

主要CXCL13-CXCR5细胞信号转导级联的确认示于图20。LNCaP（蓝色圆圈）或PC3（品红色圆圈）细胞不接受添加（开放圆圈）或接受100ng/ml的CXCL13（闭合圆圈）5或10分钟。在刺激后5或10分钟，采用FACETM测定（Active Motif,Carlsbad,CA）来检测活化的和未活化的（总计）PI3K、ERK、FAK、Src激酶和NFkb蛋白。将来自3次以三平行样品独立进行的实验的活化（磷酸化）蛋白与总蛋白的比例表示为±SEM。

Akt活化所需的CXCL13-CXCR5信号转导事件示于图21中。进行FACE测定来测量LNCaP和PC3细胞系中活化的Akt和总Akt的水平。用（或不用）CXCL13处理细胞5或10分钟，其中添加或不添加CXCR5阻断、百日咳毒素、U-73122、渥曼青霉素、PI-103、TGX221和AS605240、DOCK2siRNA、SU6656以及PF-573228。以三平行样品进行实验，结果显示了p-Akt与总Akt的比例。

图22A-B示出了CXCL13介导的CXCR5连接和向胞核的转移。在用0或100ng/ml的CXCL13处理30和60分钟后，用FITC(绿色)偶联抗CXCR5抗体、Alexa455(橙色)偶联抗CXCL13抗体和作为核染剂的7AAD(红色)对LNCaP(图22A)和PC3(图22B)恶性肿瘤细胞系染色。柱状图表明CXCR5和CXCL13或这些配对和核之间的信号相关性程度。通过参考暗视野和7AAD相似分数，用AmnisImagestream INSPIRE^TM和IDEAS^TM采集和分析软件和系统来确定阳性群体阈值的门。在‘转移的’区域条上方给出的转移的细胞的百分比。

实施例2：抗CXCL13抗体治疗抑制骨中的转移和肿瘤生长

图23A-B中显示了抗CXCL13抗体治疗抑制了前列腺癌的发展和骨转移。用配制于50μl盐水的10⁶个荧光素酶阳性PC3细胞对两组10周龄B6.Cg-Foxn-Nu/J雄性小鼠通过心内注射进行接种。使肿瘤发展30天；之后，在另外的30天，各组每三天接受0.5μg的对照抗体（图23A）或抗CXCL13抗体（图23B）。该代表性图像示出了通过采用Caliper/Xenogen IVIS100成像系统(Caliper,San Diego,CA)的体内成像分析的肿瘤负荷和骨转移的改变。

图24A-B示出了对CXCL13阻断抑制了骨中前列腺肿瘤的生长。对雄性Nu/Nu小鼠胫骨内注射10⁶个荧光素酶阳性的PC3(PC3-luc)细胞，并使肿瘤发展一周。随后，在一周中，每72小时对小鼠腹膜内注射悬浮于100μl的无菌盐水中的475μg/kg的同种型对照抗体或抗CXCL13抗体。采用Caliper/Xenogen In Vivo成像系统100对实验组每周成像，持续四周，并使用Caliper LIVING

(Caliper,SanDiego,CA)软件分析图像。图24A显示了骨中PC3-luc肿瘤生长的代表图像。图24B示出了接种后7、14、21和28天骨中PC3-luc肿瘤的发光（光子/秒/cm²）±SEM。

如图25A-B所示，对CXCL13的阻断也消除了骨中溶骨性前列腺肿瘤的生长。对雄性Nu/Nu小鼠胫骨内注射10⁶个荧光素酶阳性的PC3(PC3-luc)细胞，并使肿瘤发展一周。随后，在一周中，每72小时对小鼠腹膜内注射悬浮于100μl的无菌盐水中的475μg/kg的同种型对照抗体或抗CXCL13抗体。在接种后28天，采用Siemens microCT扫描系统对实验组成像。显示了使用OsiriX成像软件处理的来自每组5只小鼠的低（图25A）和高（图25B）分辨率图。

图26A-B证实了对CXCL13的阻断抑制了由前列腺癌骨转移引起的骨矿物质密度（BMD）的损失。对雄性Nu/Nu小鼠胫骨内注射10⁶个荧光素酶阳性的PC3(PC3-luc)细胞并使肿瘤发展一周。随后，在一周中，每72小时对小鼠腹膜内注射悬浮于100μl的无菌盐水中的475μg/kg的同种型对照抗体或抗CXCL13抗体。在接种后28天，采用Siemens microCT扫描系统对实验组成像。图26A显示了矿物质密度的代表图。图26B示出了使用MicroView软件版本2.1.1(GeneralElectric Medical)定量的每个个体的股骨骨干BMD(mg/cm3)扫描。星号（*）表示同种型对照抗体或抗CXCL13抗体处理的组之间的统计学显著差异（p<0.0001）。

实施例3：多种肿瘤中CXCL13和CXCR5表达的检测

图27示出了正常健康对照和肺癌个体的血清中的CXCL13水平。进行能够检测>5pg/mL CXCL13的ELISA测定来定量来自正常健康供体（n=9）或诊断患有鳞状细胞癌（SSC;n=17）或腺癌(Adeno Ca;n=14)的患者的血清中的CXCL13水平。实心圆表示个体血清CXCL13水平，线示出了每组的中值浓度。星号（*）表示正常健康供体（即对照）或肺癌患者血清样本之间显著差异（p<0.01）。

非肿瘤性肺组织和肺癌组织的CXCR5表达示于图28。用同种型对照抗体或抗CXCR5抗体对来自非肿瘤性（NN;n=8）、鳞状细胞癌（SCC;n=24）和腺癌（AdenoCa;n=54）的肺组织进行染色。用AperioScanScope CS系统40倍物镜获取每张切片的数字图像。显示了代表性的实例，并使用图像分析Aperio ImageScope v.6.25软件定量CXCR5的免疫强度。星号（*）表示非肿瘤性组织和肺癌组织之间的显著差异（p<0.01）。

图29图示了非肿瘤性乳房组织和乳腺癌组织的CXCR5表达。用同种型对照抗体或抗CXCR5抗体对来自非肿瘤性（NN;n=8）和腺癌（AdenoCa;n=16）的乳房组织进行染色。褐色（DAB）显示CXCR5染色。用Aperio ScanScope CS系统40倍物镜获取每张切片的数字图像。显示了代表性的实例，并使用图像分析Aperio ImageScope v.6.25软件定量CXCR5的免疫强度。星号（*）表示非肿瘤性组织和癌组织之间的显著差异（p<0.01）。

如图30所示，相对于非肿瘤性对照，结肠癌组织的CXCR5和CXCL13表达也升高。用同种型对照抗体、抗CXCR5抗体或抗CXCL13抗体对来自非肿瘤性（NN;n=8）和腺癌（AdenoCa;n=16）的结肠组织进行染色。褐色（DAB）和品红色染色分别表示CXCR5和CXCL13阳性。用Aperio ScanScope CS系统40倍物镜捕获数字图像。显示了代表性的实例，还显示了用Aperio ImageScope v.6.25软件定量的结肠癌和非肿瘤对照组织中CXCR5和CXCL13的免疫强度比例。星号（*）表示非肿瘤性组织和癌组织之间的显著差异（p<0.01）。

如图31所示，发现卵巢癌组织的CXCR5和CXCL13表达显著高于非肿瘤性对照。用同种型对照抗体、抗CXCR5抗体或抗CXCL13抗体对来自非肿瘤性（NN;n=8）和腺癌（AdenoCa;n=16）的卵巢组织进行染色。褐色（DAB）和品红色染色分别表示CXCR5和CXCL13阳性。用Aperio ScanScope CS系统40倍物镜捕获数字图像。显示了代表性的实例，还显示了用Aperio ImageScope v.6.25软件定量的卵巢癌和非肿瘤对照组织中CXCR5和CXCL13的免疫强度比例。星号（*）表示非肿瘤性组织和癌组织之间的显著差异（p<0.01）。

实施例4：用实时PCR分析检测趋化因子的表达水平

引物设计

从NIH-NCBI基因数据库获得CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1或CX3CL1的信使RNA序列。使用BeaconJ2.0计算机程序设计引物。使用计算机程序Primer PremierJ和MIT Primer3进行引物的热动力学分析。将所得的引物组与整个人基因组比较，以确认特异性。

实时PCR分析

在包含10%胎牛血清并补充有非必需氨基酸、L-谷氨酸和丙酮酸钠的RMPI-1640（完全培养基）中培养癌细胞系（ATCC,Rockville,MD）。由临床分离物（Clinomics Biosciences,Frederick,MD and UABTissue Procurement,Birmingham,和）获得原发性肿瘤和正常配对匹配的组织。按照厂商说明，使用TriReagent(Molecular Research Center,Cincinnati,OH)从106细胞分离信使RNA（mRNA）。通过用10U/Fl的无RNA酶的DNA酶（Invitrogen,San Diego,CA）在37°C下处理15分钟，从这些样本中除去可能的基因组DNA污染。然后沉淀RNA并将其重新悬浮于RNA Secure(Ambion,Austin,TX)中。根据厂商说明，通过使用Taqman7反转录试剂（Applied Biosystems,Foster City,CA）将约2μg的总RNA反转录来生成cDNA。随后按照厂商说明，使用SYBR7Green PCR预混试剂(Applied Biosystems)，用CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1或CX3CL1的特异性人cDNA引物从cDNA扩增。通过使用BioRad Icycler和软件(Hercules,CA)的实时PCR分析来评价这些靶标的mRNA的拷贝水平。

使用CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1或CX3CL1的特异性引物组获得的RT-PCR产物不与其它基因靶标发生交叉反应，这是由于排除了能与宿主序列退火的引物（NIH-NCBI Genebank）。引物产生了不同大小的扩增子产物，反映出CXCR5a相比于CXCR5b，以及CCL25、CCL25-1相比于CCL25-2的多态性。所以，腺瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤和/或骨髓瘤细胞系和肿瘤组织的RT-PCR分析表明恶性肿瘤细胞对趋化因子和趋化因子受体的差异表达。

实施例5：抗趋化因子抗体和抗趋化因子受体抗体在体外和体内抑制 肿瘤细胞生长

抗血清制备

合成来自CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1和CX3CL1的15个氨基酸的肽（Sigma Genosys,The Woodlands,TX），并将它们与鸡卵溶菌酶（Pierce,Rockford,IL）缀合，以产生随后用于抗血清制备物的免疫或单克隆抗体生成的抗原。通过发色鲎阿米巴样细胞溶解物测定（Cape Cod,Inc.,Falmouth,MS）定量趋化因子肽缀合物的内毒素水平，结果为<5EU/mg。将100μg抗原用作免疫原，与完全弗氏佐剂Ribi佐剂系统(RAS)一起以1.0ml的终体积用于第一次免疫。将该混合物以100ml等份皮下给药至兔子背部的两个部位以及以400ml肌内给药至每个后腿肌肉中。三至四周后，兔子接受100μg的抗原以及不完全弗氏佐剂的3次后续免疫。当抗CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1和CX3CL1抗体滴定度达到1:1,000,000时，收集抗血清。随后，将正常或抗血清热灭火并以1:50稀释在PBS中。

单克隆抗体制备

合成来自CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1和CX3CL1的15个氨基酸的肽（Sigma Genosys），并将它们与鸡卵溶菌酶（Pierce）缀合，以产生随后用于抗血清制备物的免疫或单克隆抗体生成的“抗原”。通过发色鲎阿米巴样细胞溶解物测定（Cape Cod,Inc.,Falmouth,MS）定量趋化因子肽缀合物的内毒素水平，结果为<5EU/mg。将100μg抗原用作免疫原，与完全弗氏佐剂Ribi佐剂系统(RAS)一起以200μl的终体积用于第一次免疫。将该混合物以100μl等份皮下给药至大鼠、小鼠或免疫球蛋白人源化的小鼠背部的两个部位。两周后，动物接受100μg的抗原以及不完全弗氏佐剂的3次后续免疫。收集血清，并且当抗CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CL1抗体滴定度达到1:2,000,000时，处死宿主并分离脾细胞用于杂交瘤生成。简要地说，将来自免疫的宿主的脾或淋巴结的B细胞与永生化骨髓瘤细胞系（例如YB2/0）融合。接着，在选择性培养条件（即补充HAT的培养基）和杂交瘤克隆的有限稀释法后，分离到杂交瘤。采用ELISA选择产生具有所期望的特异性的抗体的细胞。用常用的分子生物学技术使来自正常大鼠或小鼠的杂交瘤人源化。在克隆高亲和力和高增殖性的杂交瘤后，从腹水或培养物上清分离抗体，将其调节至1:2,000,000的滴定度，并以1:50稀释在PBS中。抗血清或单克隆抗体治疗

缺少T、B和NK细胞的免疫缺陷型NIH-III裸小鼠（8-12周龄，Charles River Laboratory,Wilmington,MA）皮下接受1×10⁶个癌细胞用于建立肿瘤。相应地，将新分离的或液氮冷冻的1g肿瘤组织通过手术植入肠脂肪组织用于生成肿瘤。当异种移植瘤生长达到5mm大小时，NIH-III小鼠每三天接受200μl的腹膜内注射抗血清或单克隆抗体，并且监测肿瘤的生长的发展或消退。

数据分析

使用SigmaStat2000(Chicago,IL)软件分析和确认数据的统计学显著性。随后通过学生氏t检验，使用双因素不配对检验分析数据。该分析中，将处理的样本与未处理的对照相比较。将显著性水平设为p<0.05。

体外生长研究

在存在或不存在CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CL1的特异性抗体的情况下，使腺瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤和/或骨髓瘤细胞系在完全培养基中生长。CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7或CXCL8的抗体抑制表达CXCR1和/或CXCR2的恶性肿瘤细胞系的生长。同样地，CXCR4或CXCL12的抗体抑制表达CXCR4的恶性肿瘤细胞系的生长。CXCR5a、CXCR5b或CXCL13的抗体抑制表达CXCR5a或CXCR5a的恶性肿瘤细胞系的生长。CXCR6或CXCL16的抗体抑制表达CXCR6的恶性肿瘤细胞系的增殖。CCR9、CCL25、CCL25-1或CCL25-2的抗体抑制表达CCR9的恶性肿瘤细胞系的生长。CX3CR1或CXC3L1的抗体抑制表达CX3CR1的恶性肿瘤细胞系的增殖。有趣的是，针对可溶性配体CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2或CX3CL1的抗体在生长抑制方面比针对膜受体的抗体更有效。

体外血管生成研究

在血管生成的体外测定（BD-Biocoat,Hercules,CA）中，在存在或不存在CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CL1的特异性抗体的情况下，按照厂商的说明使微血管内皮细胞(Cell Systems,Kirkland,WA)生长并形成微血管静脉。针对CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR6或CXCL16的抗体抑制血管生成。体内生长研究

将恶性肿瘤细胞系或原发性肿瘤组织过继转移至NIH-III小鼠中，并形成目标异种移植肿瘤。针对CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CLl的抗体差异地影响肿瘤大小的发展和消退。在一些情况中，针对CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR6或CXCL16的抗体有效导致肿瘤生长的消退和发展阻碍。针对CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CL1的抗体有效抑制肿瘤大小的发展。

本文所用趋化因子的蛋白质序列在NIH-NCBI GenBank中记录为：(1)CXCR1(登录号NP000625),SEQ ID NO:1,(2)CXCR2(登录号NP001548),SEQ ID NO:2,(3)CXCL1(登录号NP001502),SEQ IDNO:3,(4)CXCL2(登录号NP002080),SEQ ID NO:4,(5)CXCL3(登录号NP002081),SEQ ID NO:5,(6)CXCL5(登录号NP002985),SEQ IDNO:6,(7)CXCL6(登录号NP002984),SEQ ID NO:7,(8)CXCL7(登录号NP002695).SEQ ID NO:8,(9)CXCL8(IL-8,登录号NP000575),SEQ ID NO:9,(10)CXCR4(登录号NP003458),SEQ ID NO:10,(11)CXCL12(登录号NP000600),SEQ ID NO:11,(12)CXCR5A(登录号NP116743),SEQ ID NO:12,(13)CXCR5B(登录号NP001707),SEQ IDNO:13,(14)CXCL13(登录号NP006410),SEQ ID NO:14,(15)CXCR6(登录号NP006555),SEQ ID NO:15,(16)CXCL16(登录号NP071342),SEQ ID NO:16,(17)CCL16(登录号NP004581),SEQ ID NO:17,(18)CCL25(登录号NP-005615.2),SEQ ID NO:18,(19)CCL25-1(登录号NP005615),SEQ ID NO:19,(20)CCL25-2(登录号NP683686),SEQ IDNO:20,(21)CX3CR1(登录号NP001328),SEQ ID NO:21和(22)CX3CL1(登录号NP002987),SEQ ID NO:22。

cDNA序列是已知的，并且能在NIH-NCBI GenBank的以下登录号中查到：(23)CXCR1(登录号NM000634),SEQ ID NO:23,(24)CXCR2(登录号NM001557),SEQ ID NO:24,(25)CXCL1(登录号NM001511),SEQ ID NO:25,(26)CXCL2(登录号NM002089),SEQ IDNO:26,(27)CXCL3(登录号NM002090),SEQ ID NO:27,(28)CXCL5(登录号NM002994),SEQ ID NO:28,(29)CXCL6(登录号NM002993),SEQ ID NO:29,(30)CXCL7(登录号NM002704),SEQ ID NO:30,(31)CXCL8(IL-8,登录号NM000584),SEQ ID NO:31,(32)CXCR4(登录号NM003467),SEQ ID NO:32,(33)CXCL12(登录号NM000609),SEQ ID NO:33,(34)CXCR5A(登录号NM032966),SEQ ID NO:34,(35)CXCR5B(登录号NM001716),SEQ ID NO:35,(36)CXCL13(登录号NM006419),SEQ ID NO:36,(37)CXCR6(登录号NM006564),SEQ IDNO:37,(38)CXCL16(登录号NM022059),SEQ ID NO:38,(39)CCL16(登录号NM004590),SEQ ID NO:39,(40)CCL25(登录号NM_005624.3),SEQ ID NO:40,(41)CCL25-1(登录号NM005624),SEQ ID NO:41,(42)CCL25-2(登录号NM148888),SEQ ID NO:42,(43)CX3CR1(登录号NM001337),SEQ ID NO:43和(44)CX3CL1(登录号NM002996),SEQ ID NO:44。

如下表所示，任何肿瘤表达的大多数的具体趋化因子可以不同。本申请的方法可以依据患者自身肿瘤过表达的趋化因子而为具体患者制定。可以使用本申请的方法鉴定在肿瘤中过表达的具体趋化因子，并给予针对过表达的趋化因子的抗体。对于恶性肿瘤患者治疗的个性化是新颖的，而且也是本申请特别有价值的方面。

下页中的表格表示所研究的具体肿瘤中过表达的不同量的具体趋化因子。

表3趋化因子、趋化因子受体和恶性肿瘤相关（依赖于疾病的分期）

实施例6：CXCR5-CXCL13诱导参与PCa化疗抗性的抗凋亡和/或存 活信号

在存在或不存在CXCL13以及存在或不存在阿霉素(1μM/2μM/4μM)、依托泊苷(20μM/40μM)、雌莫司汀(4μM/10μM)或多西他赛(10nM/20nM/40nM)的情况下，使LNCaP(激素响应型，野生型p53表达)、PC3(激素抵抗性,无p53)和DU145(激素抵抗性,p53突变)细胞系生长4、8、12和24小时。通过实时PCR和Western印迹来评价细胞存活、促凋亡和抗凋亡信号（Akt、Src、CamKII、FAK、FKHR、FOXO、CREB、NF-κB、Myc、Fos、Jun Apaf1、Bax、Bcl2、BclXL、BaK、Bad、Bik、Bim、TP53、半胱天冬酶-3、-6、-8、-9、存活素、玻璃体结合蛋白、β-连环蛋白）和负责药物抗性或代谢的分子（Twist-1、Snail-1、谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)、p53、拓扑异构酶I、IIα、IIβ和ABC药物转运蛋白）的表达和活化。简要地说，在处理细胞后，使用实时PCR测试基因表达的改变。还通过磷酸化特异性抗体（即Western印迹分析）来测试信号分子的活化。为了进一步确认活化的信号分子的作用，在CXCL13处理后，使用化学抑制剂或siRNA抑制候选分子的表达或活性，并且通过实时PCR和Western印迹分析来分析靶基因。随后，通过Vybrant凋亡测定（Molecular probes）试剂盒来评价处理的细胞对化疗药物的响应。

RNA分离和实时PCR

通过TRIZOL^TM(Invitrogen)方法分离总RNA，并通过UV分光光度测定法定量。通过电泳分析RNA的质量。根据厂商所述，使用ISCRIPT^TM cDNA合成试剂盒(BioRad)来完成cDNA的合成。根据厂商所述，使用IQ^TM SYBR green supermix(BioRad)进行实时PCR，并设计针对FAK、FKHR、FOXO、Apaf1、Bax、Bcl2、BclXL、BaK、Bad、Bid、XIAP、Bik、Bim、TP53、细胞色素C、半胱天冬酶-3、-6、-8、-9、存活素、层粘连蛋白、CamKII、玻璃体结合蛋白、β-连环蛋白、钙粘蛋白、Twist-1、Snail-1、CREB、NF-κB、Myc、Fos、Jun、β-肌动蛋白和GAPDH的特异性引物。通过ΔΔCt法计算结果，以定量与未处理的组相比mRNA的倍数改变。

Western印迹

收获细胞，并将其在裂解缓冲液中重悬以提取总蛋白。裂解缓冲液含有50mM Tris-HCl pH7.4、150mM NaCl、1%Triton X-100、1%脱氧胆酸盐、0.1%SDS、5mM EDTA，补充有蛋白酶抑制剂、1mM苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulphonylfluoride）、1mM苄脒、10μg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂、50μg/mL亮肽酶素、1μg/mL胃酶抑素和20μg/mL抑酞酶。将细胞裂解物在冰上保存30分钟，4°C离心（14000g）20分钟，并且将上清液用于基因的Western印迹分析，从而表明mRNA水平的显著调节。同样地，将磷酸化特异性抗体用于测试Akt1/2/3、mTOR、FAK、FKHR、FOXO和GSK-3β磷酸化水平的改变。而且，使用特异性抗体评价切割之后的半胱天冬酶和PARP的活化。使用Image J图像分析软件（NIH），将通过ECL增强型试剂（Pharmecia）在X射线胶片上的蛋白条带的化学发光检测后获得的结果对于β-肌动蛋白和/或GAPDH标准化。

细胞色素C释放的检测

收集细胞，将细胞在PBS中洗涤，并且重悬于包含220mM甘露醇、68mM蔗糖、50mM PIPES-KOH pH7.4、50mM KCl、5mM EGTA、2mM MgCl₂、1mM DTT和蛋白酶抑制剂的提取缓冲液中。在冰上孵育30分钟后，使用玻璃特氟隆匀浆器将细胞匀化，并使匀浆在14,000g下离心15分钟。将细胞溶质提取物用于使用抗细胞色素C单克隆抗体（PharMingen）的Western印迹分析。

siRNA转染、化学抑制剂和凋亡检测

采用LipofectAMINE2000(Invitrogen)，用基因特异性siRNA和非特异性对照siRNA(Dharmacon)转染前列腺癌细胞系。通过western印迹确定最佳的基因敲低时间和siRNA浓度，并在存在或不存在CXCL16、对照抗体和/或抗CXCR6抗体的情况下，进一步评价药物处理后的细胞存活。按照下述评价活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的改变检测：如厂商（Molecular probe）所述，使用FACScan流式细胞测定器和CellQuest^TM软件(BD Pharmingen)，通过Vybrant凋亡测试细胞存活。使用实时PCR和Western印迹测试基因敲低后下游基因表达的改变。

用CXCL16处理的细胞表现出细胞存活和药物转运蛋白的增强表达，在激素响应型和非响应型细胞中表现出表达模式的差异。抗CXCL16抗体有效逆转CXCL16在PCa细胞中的作用。在无CXCL16处理（或CXCR6阻断）的情况下，阿霉素、雌莫司汀、依托泊苷和多西他赛诱导了PCa细胞的凋亡。

实施例7：CXCR5-CXCL13诱导ABC药物转运蛋白中的改变

如上文所述，在存在或不存在CXCL13、对照抗体和/或抗CXCR5抗体以及在存在或不存在阿霉素、雌莫司汀、依托泊苷或多西他赛的情况下，使LNCaP、PC3和DU145细胞生长4、8、12和16小时。如上文所述，在处理之后，使用针对ABC和Twist-1cDNA的特异性引物，通过实时PCR来定量ABC转运蛋白和Twist-1mRNA表达的改变。通过Western印迹分析来进一步测试表现出mRNA表达显著改变的基因。通过染色质免疫沉淀(ChIP)测定来评价来自处理细胞的核提取物，从而确定由CXCL13诱导的转录因子是否结合ABC转运蛋白和Twist-1的启动子区。

染色质免疫沉淀(ChIP)

实施例6的结果提供了关于受调节的基因以及可以调节由CXCR5-CXCL13相互作用活化的转录因子的基因的信息。基于这些结果，选择靶转录因子和基因。针对这些基因的含有转录因子结合位点的启动子区域设计特异性PCR引物。将PCR引物用于扩增与转录因子一起沉淀的DNA。在20mM丁酸盐的存在下，通过胰蛋白酶消化来收获细胞。将50,000个细胞重悬于500μl PBS/丁酸盐中。在室温下，用1%甲醛使蛋白质和DNA交联8分钟，并用125mM甘氨酸终止交联5分钟。在4°C下，将细胞以470g在慢减速设置下的甩平式转头中离心10分钟，并在0.5ml冰冷PBS/丁酸盐中涡旋洗涤两次，之后离心。通过加入裂解缓冲液（50mM Tris–HCl pH8,10mM EDTA、1%SDS、蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)、1mM PMSF、20mM丁酸盐）来裂解细胞，涡旋并随后离心。已知该步骤能产生500bp的染色质片段。将超声处理的裂解物以8倍稀释在含蛋白酶抑制剂混合物、1mM PMSF和20mM丁酸盐的RIPA缓冲液(RIPA ChIP缓冲液)中。将RIPA ChIP缓冲液(330μl)加至沉淀，并通过涡旋混合。通过使用针对具体转录因子的抗体来完成ChIP物质的免疫沉淀和洗涤。将染色质等分至容纳抗体-珠复合物的管中。将输入的样本置于管中，用于苯酚-氯仿异戊醇分离。将免疫沉淀的物质洗涤三次，并转移至新管中同时在TE中。在1%SDS中的DNA洗脱、交联逆转和蛋白激酶K消化在单个步骤中于68°C下实施2小时。用苯酚-氯仿异戊醇提取DNA，并且在丙烯酰胺载体（Sigma-Aldrich）的存在下进行乙醇沉淀，并溶于TE中。通过实时PCR分析来自3-4次独立的ChIP的免疫沉淀的DNA。实时PCR数据表示为在三次独立重复的ChIP测定中沉淀的（抗体结合）DNA与输入DNA的百分比（±SD）。

通过CXCR5-CXCL13信号转导的转录因子（如CREB、Fos、Jun和NFkB）的磷酸化和活化导致ABC转运蛋白和Twist-1的表达升高。如果负调控元件存在于相同的启动子中，则会观察到基因表达的下降。由于激素依赖性和激素抵抗性PCa细胞在这些细胞内信号分子的表达中具有差异，因此它们在激素依赖性和抵抗性条件下调节的基因中表现出不同。在存在CXCL13和不存在CXCL13处理的药物处理中，基因表达中的调节表现出了差异。

实施例8：CXCL13定向治疗的体内评价

雄性裸鼠皮下接种表达荧光素酶的、雄激素响应型细胞（LNCaP-Luc）和非响应型细胞（PC3-Luc）。使用体内成像系统，非侵入性地测量肿瘤发展。建立可测量到的肿瘤后，将小鼠分成治疗组（A、B、C、D和E）和对照组（F、G、H、I、J和K）。“A”组每隔一天接受CXCL13中和抗体（12.5mg/kg/天），对照（F组）接受同种型对照抗体（12.5mg/kg/天）。“B”、“C”、“D”和“E”组接受CXCL13中和抗体（12.5mg/kg/天），并分别接受腹膜内注射阿霉素（第1-3天为5mg/kg/天，然后在第15-17天给药）、静脉注射依托泊苷（10mg/kg/天；第1、5、9、14、19和24天）、静脉注射雌莫司汀（4mg/kg/天，第1-5天和第26-31天）或腹膜内注射多西他赛（8mg/kg/天，一周两次，持续4周）。这些处理组的对照（分别为“G”、“H”、“I”和“J”）接受使用相近的浓度和注射程序给予这些药物以及同种型对照抗体（12.5mg/kg/天）。“K”组接受PBS并作为安慰剂组。通过非侵入式体内成像来评价处理和对照中的肿瘤的发展和消退。切除来自处理组和未处理组的肿瘤，并通过免疫组织化学评价细胞存活和耐药蛋白的改变。

统计（显著性）和样本大小

样本大小（或效力）计算与初步研究的设计以及确定预期实验的要求相关。为了解释我们的结果，显著性检验和统计学分析也很重要。常规α值（即p=0.01）用来评价该研究的统计学显著性。预期实验每组需要最少10只小鼠。数据表示为平均值±SEM，对于正态分布样本，使用双尾配对（或未配对）学生氏t-检验进行比较，或对于非正态分布样本，使用未配对曼-惠特尼U检验（Mann Whitney U test）作为非参数检验进行比较。使用SYSTAT(Systat software Inc.)统计学程序分析结果。单因素和双因素方差ANOVA分析被用于分别评价组和亚组。因此，如果p值<0.05，则认为结果具有统计学显著性。

动物

对六至八周龄的雄性裸鼠皮下注射PCa细胞。简要地说，将5×10⁶个表达荧光素酶的PC3细胞重悬于100μl的无菌PBS中，并将其注射至异氟烷麻醉下的裸鼠的侧腹中。将表达荧光素酶的LNCaP细胞（5×10⁶个细胞）和50%Matrigel(Becton Dickinson)混合，并注射至异氟烷麻醉下的裸鼠的侧腹中。

体内肿瘤生长分析

成像前15分钟，通过使用25x5/8”号注射针腹膜内注射使荷瘤裸鼠接受150mg/kg D-荧光素(Xenogen)。使用IVIS100体内成像系统对小鼠成像，并且将结果表示为光子/sec/cm²/sr。通过使用测径器测量并通过公式(长径)×(短径)²×0.5计算肿瘤体积。

细胞存活、凋亡和抗药基因表达分析

处理程序完成后，切除所有组的肿瘤。将肿瘤在4%PFA中固定，并包埋于石蜡中。将石蜡切片（厚度7μm）固定在载玻片上，脱蜡并再水合（二甲苯处理5分钟；无水乙醇、95%乙醇和70%乙醇各处理1分钟）。将再水合切片用于针对药物转运蛋白、PI3K、Akt、FAK、FKHR、FOXO、Apaf1、Bax、Bcl2、BclXL、BaK、Bad、Bid、XIAP、Bik、Bim、TP53、Cytochrome C、Caspase-3、-6、-8、-9、survivin、lamin、CamKII、vitronectin、β-Catenin、cadherins、Twist-1、CREB、NF-κB、Myc、Fos、Jun、CXCR5和CXCL13的基于过氧化物酶的免疫组织化学染色。染色后，通过Aperio scanscope(Aperio)系统扫描和分析载玻片。

CXCL13中和导致响应于药物的细胞存活下降，因此肿瘤体积减小。然而，该响应在由激素敏感性（LNCaP）和激素抵抗性（PC3细胞）形成的肿瘤中也不同。而且，化疗药物在具有功能性CXCR5-CXCL13枢纽的肿瘤中具有较低效力，该枢纽可以增强已知能将这些药物转运出细胞的ABC蛋白的表达。

以上说明的目的在于教导本领域普通技术人员如何实践本发明，并非意在详尽本发明中在阅读说明书后对本领域技术人员显而易见的所有那些修改和变形。然而，所有这种显而易见的修改和变形都意图包括在由所附权利要求限定的本发明的范围内。权利要求意图涵盖能有效满足预定目标的按照任何顺序的组分和步骤，除非上下文特别表明相反。将说明书中所有引用的参考通过引用方式将它们全部合并于本文。

Claims (38)

1.检测个体中恶性肿瘤的存在的方法，包括：

检测获自所述个体的生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平；以及

将所述生物样本中所述一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平与所述一种或多种恶性肿瘤标志物的正常表达水平相比较，

其中所述生物样本中所述一种或多种恶性肿瘤标志物的高于正常的表达水平表示所述个体中存在恶性肿瘤，

其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物的所述正常表达水平为预定值，或者获自与所述生物样本具有相同来源或类型的已知的正常非癌性细胞的对照样本，以及

其中所述恶性肿瘤为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤，以及

其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物包括CXCL13、或CXCR5、或CXCL13和CXCR5。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物进一步包括CXCL16、或CXCR6、或CXCL16和CXCR6。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物进一步包括选自以下的一种或多种恶性肿瘤标志物：CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CXCL15、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1、CX3CL1、RNA结合基序3("RBM3")、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、嗜铬粒蛋白A(CGA)、脱氢表雄酮(DHEA)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、促乳素、B7-H3、分离酶多肽、抗p53、骨桥蛋白、铁蛋白、溶血磷脂酰胆碱、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)、神经正五聚蛋白I(NPTX1)和成纤维细胞生长因子受体1癌基因伴侣(FGFR1OP)蛋白。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述恶性肿瘤为黑素瘤，并且其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物进一步包括CXCL16、或CXCR6、或者CXCL16和CXCR6。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物进一步包括选自以下的一种或多种恶性肿瘤标志物：CCL25、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CX3CL1、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4和CX3CR1。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述恶性肿瘤为癌，并且其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物进一步包括CXCL16、或CXCR6、或者CXCL16和CXCR6。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物进一步包括选自以下的一种或多种恶性肿瘤标志物：CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4和CX3CR1。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述癌为乳腺癌，并且其中一种或多种恶性肿瘤标志物进一步包括选自以下的一种或多种恶性肿瘤标志物：CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、RNA结合基序3("RBM3")和癌胚抗原(CEA)。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述癌为前列腺癌，并且其中一种或多种恶性肿瘤标志物进一步包括选自以下的一种或多种恶性肿瘤标志物：CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、PSA、CEA、CGA、DHEA、NSE、PAP、促乳素和B7-H3。

10.根据权利要求6所述的方法，其中所述癌为结肠直肠癌，并且其中一种或多种恶性肿瘤标志物进一步包括选自以下的一种或多种恶性肿瘤标志物：CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、分离酶多肽、抗p53、骨桥蛋白和铁蛋白。

11.根据权利要求6所述的方法，其中所述癌为卵巢癌，并且其中一种或多种恶性肿瘤标志物进一步包括选自以下的一种或多种恶性肿瘤标志物：CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、癌抗原125(CA-125)、HE-4、OVX-1巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和溶血磷脂酰胆碱。

12.根据权利要求6所述的方法，其中所述癌为肺癌，并且其中一种或多种恶性肿瘤标志物进一步包括选自以下的一种或多种恶性肿瘤标志物：CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)、神经正五聚蛋白I(NPTX1)、成纤维细胞生长因子受体1癌基因伴侣(FGFR1OP)蛋白和CEA。

13.根据权利要求6所述的方法，其中所述癌为胰腺癌或胃癌，并且其中一种或多种恶性肿瘤标志物进一步包括选自以下的一种或多种的恶性肿瘤标志物：CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1和CEA。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样本为血浆样本、唾液样本或尿液样本。

15.评价患恶性肿瘤个体的预后的方法，包括：

测定来自所述个体的生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平，以及

将所述生物样本中所述一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平与所述一种或多种恶性肿瘤标志物的对照表达水平相比较，

其中如果所述生物样本中所述一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平高于所述对照水平，则表示所述个体的预后不良，

其中如果所述生物样本中所述一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平低于或近似于所述对照水平，则表示所述个体的预后良好，

其中预后不良表明所述恶性肿瘤为攻击型或侵袭型，其中所述恶性肿瘤为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤，以及

其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物包括CXCL13、或CXCR5、或者CXCL13和CXCR5。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物进一步包括CXCL16、或CXCR6、或者CXCL16和CXCR6。

17.监测个体中恶性肿瘤治疗过程的方法，包括：

在所述治疗期间或所述治疗之后，测定来自所述个体的一个或多个生物样本中一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平，以及

将所述一个或多个生物样本中所述一种或多种恶性肿瘤标志物的表达水平与所述一种或多种恶性肿瘤标志物的对照表达水平相比较，

其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物的所述对照水平为所述个体中所述一种或多种恶性肿瘤标志物的治疗前水平或预定的参考水平，

其中如果所述一个或多个生物样本中的所述一种或多种恶性肿瘤标志物接近于或低于所述对照水平，则认为所述治疗有效，

其中所述恶性肿瘤为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤，以及

其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物包括CXCL13、或CXCR5、或者CXCL13和CXCR5。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述一种或多种恶性肿瘤标志物进一步包括CXCL16、或CXCR6、或者CXCL16和CXCR6。

19.用于检测恶性肿瘤或监测恶性肿瘤发展的试剂盒，包括：

用于测定生物样本中CXCL13和/或CXCR5表达的试剂；以及使用所述试剂的说明，

其中所述试剂包括抗CXCL13抗体、抗CXCR5抗体或两者，并且其中所述恶性肿瘤为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤。

20.根据权利要求19所述的试剂盒，进一步包括：

用于测定生物样本中CXCL16和/或CXCR6表达的试剂；以及使用所述试剂的说明，

其中所述试剂包括抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体或两者。

21.治疗个体中恶性肿瘤的方法，包括：

给予所述个体治疗有效量的抗CXCL13抗体、或抗CXCR5抗体、或它们的组合，

其中所述恶性肿瘤为黑素瘤、癌、肉瘤、胚细胞瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴瘤，并且其中所述抗CXCL13抗体、或所述抗CXCR5抗体、或抗CXCL13抗体和抗CXCR5抗体的组合的给药剂量范围为1ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述恶性肿瘤为黑素瘤、淋巴瘤或癌，其中所述癌选自卵巢癌、阴道癌、子宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、胰岛瘤、腺瘤、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、口腔癌、脑癌、成神经管细胞瘤、神经外胚层瘤、胶质瘤、垂体癌和骨癌。

23.根据权利要求21所述的方法，其中将所述抗CXCL13抗体、或抗CXCR5抗体或它们的组合直接给药到癌组织中，或与化疗剂联合给药。

24.根据权利要求21所述的方法，其中所述恶性肿瘤为癌，并且其中所述抗CXCL13抗体、或抗CXCR5抗体或它们的组合与一种或多种能特异性结合选自以下的一种或多种趋化因子或趋化因子受体的抗体联合给药：CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CXCL16、CCR2、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR6、CX3CL1和CX3CR1。

25.根据权利要求21所述的方法，其中所述恶性肿瘤为黑素瘤，并且其中所述抗CXCL13抗体、或抗CXCR5抗体或它们的组合与一种或多种能特异性结合选自以下的一种或多种趋化因子或趋化因子受体的抗体联合给药：CCL25、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCL16、CX3CL1、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR6、CXCR7和CX3CR1。

26.根据权利要求21所述的方法，其中所述恶性肿瘤为淋巴瘤，并且其中所述抗CXCL13抗体、或抗CXCR5抗体或它们的组合与一种或多种能特异性结合选自以下的一种或多种趋化因子或趋化因子受体的抗体联合给药：CXCL12和CXCR4。

27.根据权利要求21所述的方法，包括：

测定来自所述个体的组织中CXCL13和/或CXCR5的表达水平，以及如果检测到CXCL13和/或CXCR5的表达水平升高，对所述个体给予治疗有效量的所述抗CXCL13抗体、所述抗CXCR5抗体或它们的组合。

28.根据权利要求21所述的方法，其中所述个体被诊断患有导致恶性肿瘤细胞中CXCL13和/或CXCR5表达升高的恶性肿瘤。

29.根据权利要求21所述的方法，其中所述抗CXCL13抗体、或所述抗CXCR5抗体、或所述抗CXCL13抗体和抗CXCR5抗体的组合的给药剂量范围为：1ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天、10ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、100ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天、1μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、10μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天或100μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天。

30.防止或抑制个体中具有升高表达的CXCL13和/或CXCR5的恶性肿瘤细胞的迁移或转移的方法，包括：

对所述个体给予治疗有效量的抗CXCL13抗体、或抗CXCR5抗体、或它们的组合，

其中所述抗CXCL13抗体、或所述抗CXCR5抗体、或抗CXCL13抗体和抗CXCR5抗体的组合的给药剂量范围为：1ng/kg b体重/天至约100mg/kg体重/天，并且其中所述恶性肿瘤细胞为黑素瘤细胞、癌细胞、骨髓瘤细胞、白血病细胞或淋巴瘤细胞。

31.增强化疗效果的方法，包括：

对进行恶性肿瘤化疗的个体给予有效量的抗CXCL13抗体、或抗CXCR5抗体、或它们的组合，并且其中所述个体进行黑素瘤、癌、骨髓瘤、白血病或淋巴瘤的化疗。

32.治疗个体恶性肿瘤的方法，包括：

用有效量的CXCL13免疫原和/或CXCR5免疫原免疫个体，从而诱导能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗体，

其中所述恶性肿瘤为黑素瘤、癌、肉瘤、胚细胞瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴瘤。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述CXCL13免疫原为包括选自以下的一个或多个序列的肽：RSSSTLPVPVFKRKIP、PRGNGCPRKEIIVWKK、LPRGNGCPRKEIIVWK、QILPRGNGCPRKEIIV、ILPRGNGCPRKEIIVW、RIQILPRGNGCPRKEI、RGNGCPRKEIIVWKKN、KRSSSTLPVPVFKRKI、IQILPRGNGCPRKEII、DRIQILPRGNGCPRKE、RKRSSSTLPVPVFKRK、RCRCVQESSVFIPRRF、GNGCPRKEIIVWKKNK、CVQESSVFIPRRFIDR、IDRIQILPRGNGCPRK、LRCRCVQESSVFIPRR、FIDRIQILPRGNGCPR、RCVQESSVFIPRRFID、CRCVQESSVFIPRRFI、QESSVFIPRRFIDRIQ、RFIDRIQILPRGNGCP、VQESSVFIPRRFIDRI、ESSVFIPRRFIDRIQI、SLRCRCVQESSVFIPR、NGCPRKEIIVWKKNKS、PQAEWIQRMMEVLRKR、RRFIDRIQILPRGNGC、LRKRSSSTLPVPVFKR、VQESSVFIPRR、EWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRK、KKNK、RKRSSS、RGNGCP、VYYTSLRCRCVQESSVFIPRR、DRIQILP、RKEIIVW和KSIVCVDPQ，并且其中所述CXCR5免疫原为包括选自以下的一个或多个序列的肽：TSLVENHLCPATE、EGSVGWVLGTFLCKT、LPRCTFS、LARLKAVDNT和MASFKAVFVP。

34.防止或抑制个体中具有升高表达的CXCL13和/或CXCR5的恶性肿瘤细胞的迁移或转移的方法，包括：

用有效量的CXCL13免疫原和/或CXCR5免疫原来免疫个体，从而诱导能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗体，

其中所述恶性肿瘤为黑素瘤、癌、肉瘤、胚细胞瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴瘤。

35.治疗个体恶性肿瘤的方法，包括：

检测来自所述个体的生物样本中CXCL13和/或CXCR5的表达水平，以及

如果在所述生物样本中检测到CXCL13和/或CXCR5的表达水平升高，则用有效量的CXCL13免疫原和/或CXCR5免疫原来免疫个体，从而诱导能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗体。

36.增强化疗效果的方法，包括：

对进行恶性肿瘤化疗的个体给予有效量的CXCL13免疫原和/或CXCR5免疫原从而诱导能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗体。

37.治疗个体恶性肿瘤的方法，包括：

用有效量的CXCL16免疫原和/或CXCR6免疫原来免疫个体，从而诱导能抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的抗体，

其中所述恶性肿瘤为黑素瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、胚细胞瘤或癌，

其中所述CXCL16免疫原为包括选自以下的一个或多个的序列的肽：AAGPEAGENQKQPEKN、SQASEGASSDIHTPAQ、STLQSTQRPTLPVGSL、SWSVCGGNKDPWVQEL、GPTARTSATVPVLCLL、SGIVAHQKHLLPTSPP、RLRKHL、LQSTQRP、SSDKELTRPNETT、AGENQKQPEKNA、NEGSVT、ISSDSPPSV、CGGNKDPW、LLPTSPPISQASEGASSDIHT、STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT、SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA、TGSCYCGKR、DSPPSVQ、RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSWSVCGG、WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ、SDIHTPAQMLLSTLQ、RPTLPVGSL、TAGHSLAAG、GKRISSDSPPSVQ、KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH，以及

其中所述CXCR6免疫原为包括选自以下的一个或多个的序列的肽：HQDFLQFSKV、AGIHEWVFGQVMCK、PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI和YYAMTSFHYTIMVTEA。

38.治疗个体恶性肿瘤的方法，包括：

用有效量的CXCL13和CXCR5免疫原中的一种或多种和有效量的CXCL16和CXCR6免疫原中的一种或多种来免疫个体，

其中所述恶性肿瘤为黑素瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、胚细胞瘤或癌。

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