JP5145549B2

JP5145549B2 - 腫瘍マーカー

Info

Publication number: JP5145549B2
Application number: JP2006218276A
Authority: JP
Inventors: 桂一小泉; 荘三北條; 幸一常山; 一博塚田; 育夫済木
Original assignee: Toyama University
Current assignee: Toyama University
Priority date: 2006-08-10
Filing date: 2006-08-10
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2026-08-10
Also published as: JP2008035836A

Description

本発明は、ケモカインＣＸＣＬ１６の発現量を指標としてがんの予後の状況を判検査する方法に関する。

ケモカインは、細胞遊走を誘導する分子群であり、Ｎ末端保存されている2つのシステインの位置から、ＣＸＣ、ＣＣなど４グループに分類されている。
ケモカインとがんに係るものとして、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＣＲ７／ＣＣＬ２１などががんの転移に関与していることが報告されている（非特許文献１）。
ＣＸＣＬ１６は、スカベンジャー受容体活性とリンパ球遊走活性を有する特異的な膜結合型ケモカインである。このＣＸＣＬ１６の発現とがんとの関係について、ＣＸＣＬ１６はヒト直腸がんに浸潤している免疫細胞に発現しているが、がん組織では発現が低下することが報告されている。（非特許文献２）
腫瘍マーカーには糖タンパク質、ホルモン、酵素など多くの種類があり、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、Ｓｐａｎ−１、Ｄｕｐａｎ−２などが臨床応用されている。しかし、例えば、大腸がんのマーカーとして汎用されるＣＥＡやＣＡ１９−９などは、肝炎や膵炎といった消化器系の炎症でも高値を示すなどするため、さらなるがんマーカーの探索が行われている。
また、一つの腫瘍マーカーだけでがんの有無や悪性度を判定することは実際上不可能であり、他種のマーカーとの併用およびレントゲン、ＣＴ、ＭＲＩ等による診断との組み合わせが重要となる。
すなわち、がん特異性およびがんの悪性度、転移性、大きさ、予後に相関する新規の腫瘍マーカーが多数開発されればされるほど、がんの診断は正確性を増すといえる。

医学のあゆみ、別冊(4月)、141-144（2006） Int. J. Mol. Med, 14(1), 65-69(2004)

本発明の目的は、新規な腫瘍マーカー、特にがんマーカーを提供することであり、ケモカインＣＸＣＬ１６（以下、ＣＸＣＬ１６）の発現量を指標としてがんの予後の状況を検査する方法を提供する。

本発明者らは、大腸がん組織標本におけるＣＸＣＬ１６発現と予後に対する検討を行い、ＣＸＣＬ１６が腫瘍マーカー、特にがんマーカーとして有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。以下、知見を列挙する。
（１）５種類のヒト大腸がん培養細胞におけるＣＸＣＬ１６発現を逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応法(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction：RT-PCR)および酵素免疫測定法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay:ELISA）で検索した結果、全てにおいてＣＸＣＬ１６が発現している。
（２）外科的切除症例の大腸がん組織におけるＣＸＣＬ１６ｍＲＮＡの発現は、非がん粘膜に対して大腸がんに強く発現している。
（３）ＣＸＣＬ１６の発現と周囲浸潤細胞に関して免疫組織染色により検討を行った結果、ＣＸＣＬ１６の発現は、５８例中４３例（７４％）に認めた。しかし、非がん粘膜においてはＣＸＣＬ１６の発現を確認できたのはわずかに２例であり、大腸がん特異的に発現していると考えられた。
（４）前がん病変のアデノーマにおいてもＣＸＣＬ１６が発現している。
（５）ＣＸＣＬ１６陽性群と陰性群とに分け、がん周囲の浸潤ＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ細胞をカウントしたところ、陽性群において有意な増加を認めた。最終的に両群間の予後を比較するとＣＸＣＬ１６陽性群は予後良好であった。
（６）ヒト肺がん、乳がんの細胞株においてもＣＸＣＬ１６は高発現していることが確認した。

ＣＸＣＬ１６は、大腸がんをはじめ、ヒト肺がん、乳がん等に高発現し、また、体液中で測定されることから、その発現量を指標とすることで、がんの発症の有無、進行の程度または予後の状況を判定するための新規なマーカーとして使用できる
特に、大腸がんにおけるがん部と非がん粘膜部位での発現の差を指標に見出されたＣＸＣＬ１６は、免疫染色においても、おいてもＣＸＣＬ１６は高発現がん部に限局した染色性を示し、その発現とリンパ球浸潤との相関性が認められ、その強発現群が予後良好であり、予後マーカーとしての有用性が高い。

以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
・抗ＣＸＣＬ１６抗体の作製
抗ＣＸＣＬ１６抗体は、ＣＸＣＬ１６の検出・測定に使用可能な限りにおいて、特にその構造・種類等は限定されるものではない。抗ＣＸＣＬ１６抗体は、ＣＸＣＬ１６の精製タンパク質、その組換えタンパク質（融合タンパク質等）、またはそのフラグメント（合成ペプチド等）などを免疫原（抗原）として用いることにより、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。公知の方法としては、Harlowらの「Antibodies : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988)」、岩崎らの「単クローン抗体ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ講談社(1991)」、「タンパク質実験ハンドブック羊土社2003年8月15日発行」などの文献に記載の方法が例示されるが、特にこれらの方法に限定されるものではなく、これらの方法の改変法を含めた公知の抗体作製法の中から使用目的などに応じて適切な方法を選択すればよい。

ポリクローナル抗体を作製する場合は、例えば、抗原で動物を免疫した後、その動物の血液から血清を得て、抗体価検定を行い、最終的に抗血清からポリクローナル抗体を調製または精製すればよい。免疫に使用する動物としては、ウサギ、マウス、ラット等が例示されるが、その他の実験動物を用いてもよく、特に限定されるものではない。

上記抗原には、ヒト、マウス等のＣＸＣＬ１６の精製タンパク質、その組換えタンパク質（融合タンパク質等）、その抗原決定基（エピトープ）を含むフラグメント（合成ペプチド等）、その他のＣＸＣＬ１６タンパク質の誘導体や変異体、それらのアナログ、またはそれらを発現する細胞などを使用することができる。

モノクローナル抗体を作製する場合は、例えば、上記抗原でマウスを免疫した後、そのマウス脾臓リンパ球とマウス由来のミエローマ細胞とを融合させて得られた抗体産生ハイブリドーマにより、モノクローナル抗体を精製すればよい。この場合も、免疫に使用する動物としては、マウスのほか、ラット、ウサギその他の実験動物を用いてもよく、特に限定されるものではない。

ハイブリドーマの生産方法は、従来公知の方法、例えば、ハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497(1975)）、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, Immunology Today 4, 72(1983)）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., 77-96(1985)）、等が利用できるが、特に限定されるものではない。
また、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて作製してもよい（Griffiths, A.D. and Duncan, A.R., Curr. Opin. Biotechnol., 9, 102-108(1998)他）。

・ＣＸＣＬ１６の検出方法
抗ＣＸＣＬ１６抗体を使用したＣＸＣＬ１６の検出方法としては、ウエスタンブロット法（イムノブロット法）、ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などを挙げることができる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いて血液など体液中のＣＸＣＬ１６を定量化することができる。

また、その他の公知の蛋白検出法によりＣＸＣＬ１６の検出・測定を行ってもよく、抗体をペルオキシダーゼ等の酵素により標識して目的のＣＸＣＬ１６を検出するＥＬＩＳＡ法のほか、抗体を蛍光分子や放射性同位元素などにより標識してＣＸＣＬ１６を検出してもよく、例えば、二次抗体に蛍光標識したものを使用する蛍光免疫染色法などを使用できる。

検体（被検物）には、体液（血液、滑液、リンパ液、その他、尿、汗、消化液、およびこれらの成分を含む）のほかに、がん組織などの組織を検体に用いてＣＸＣＬ１６の検出・測定を行うことも可能であるが、この場合は、免疫組織化学法などを用いることにより、組織切片におけるＣＸＣＬ１６を検出できる。

また、組織を検体に用いる場合は、ＣＸＣＬ１６蛋白を直接検出する方法のほかに、ＣＸＣＬ１６のｍＲＮＡを検出・測定することにより、ＣＸＣＬ１６蛋白の発現の有無を間接的に検出してもよい。ｍＲＮＡの検出には、核酸プローブを使用したインサイチュ・ハイブリダイゼーション(in situ hybridization)法などが使用できる。

・本発明の利用態様
前述のように、本発明は、ＣＸＣＬ１６を検出することにより、がんの検査・診断に利用できる。
ＣＸＣＬ１６を用いてがん診断、特に血液によるがんの存在診断が実現すれば、治療後再発の超早期診断の新戦略となる。従って、病院の臨床検査部門、外部の臨床検査機関、医薬品および医学系研究所などにおいて、本発明は、腫瘍の検査・診断、手術後の再発・転移の確認などに利用できる。

本発明の「がんの検査・診断方法」において、検査・診断対象となるがんの種類は、メラノーマ（黒色腫）、肺がん、扁平上皮がん（皮膚がん、子宮頚部がん、頭頚部がん、食道がん等）、血液性悪性腫瘍、消化器がん（大腸がん、膵がん、肝がん、胃がん等）、神経芽細胞腫、脳腫瘍、乳がん、精巣がん、前立腺がん、卵巣がんなどを挙げることができる。

本発明を制がん剤のスクリーニング方法に応用することも可能である。制がん剤のスクリーニング方法に応用する場合は、制がん剤の候補物質をがん細胞またはがん組織に投与し、その後、本発明の方法によりＣＸＣＬ１６を検出等することで候補物質の抗がん作用を評価する。特に、ヒトがん細胞を移植した免疫不全マウス等のがんモデル動物を用いた実験において、当該動物を採血しＣＸＣＬ１６を検出するかさらにその発現量を測定することで、簡易迅速に候補物質の抗がん作用を評価できる。このように、本発明の検査・診断法は、ヒト（患者）に対して実施する場合のほか、実験動物に使用する場合も含まれる。

以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
実施例１
［ヒト大腸がん組織・大腸がん細胞株でのＣＸＣＬ１６の発現（遺伝子レベル）］
ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ；ＵＳＡ）およびＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ；ＵＳＡ）を用いて、ヒト大腸がん組織、ヒト正常大腸粘膜組織およびヒト大腸がん細胞株（Ｃｏｌｏ２０５、ＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ４８０、Ｔ８４）から全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８Ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＵＳＡ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＵＳＡ）を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製した。ＰＣＲにはＴａＫａＲａＥｘＴａｑＴＭ（ＴａＫａＲａ；日本）、ヒト・グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プライマーおよびヒトケモカインＣＸＣＬ１６プライマーを用い、ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ;ＵＳＡ）により変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（６０℃、６０秒）、伸長（７２℃、９０秒）をプライマー特異的に行った。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により分離、エチジウムブロマイド染色により検出した。アガロースゲルの濃度は１.５％、泳動バッファーにはＴＡＥｂｕｆｆｅｒ（２Ｍ−Ｔｒｉｓ、２Ｍ酢酸、０.０５Ｍ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）を用いた。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲには、ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ；日本）および７３００ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ＵＳＡ）を用いた。その結果、遺伝子レベルでのＣＸＣＬ１６の発現が確認された。（図１）

実施例２
［ヒト大腸がん組織・大腸がん細胞株でのＣＸＣＬ１６の発現（タンパク質レベル）］
４種類のヒト大腸がん培養細胞株（Ｃｏｌｏ２０５，ＬＳ１７４Ｔ，ＳＷ４８０およびＴ８４）について、各細胞の培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ）法（ＨｕｍａｎＣＸＣＬ１６ＥＫＩＳＡＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＫｉｔ９００−Ｋ２３０，ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）によりＣＸＣＬ１６の発現量を測定した。その結果、Ｃｏｌｏ２０５；２３２ｐｇ／ｍｌ、ＳＷ４８０：３００ｐｇ／ｍｌ、ＬＳ１７４Ｔ：１０８４ｐｇ／ｍｌ、Ｔ８４：１１９３ｐｇ／ｍｌであった。

実施例３
[ケモカインとしての機能性の確認]
大腸がん培養細胞株から産生されるＣＸＣＬ１６がケモカインとしての機能性を有しているかを調べるため、遊走活性試験 (chemotaxis assay)を行った。ＣＸＣＬ１６の受容体であるＣＸＣＲ６の発現細胞の遊走細胞数を計測することにより遊走活性能を評価した。ＬＳ１７４Ｔ細胞の培養上清を用い、遊走したＣＸＣＲ６発現細胞数を測定した。この培養上清は、対象の培養液と比較し、およそ１.５倍の遊走活性を示した。また、ＣＸＣＬ１６中和抗体を添加することにより、この遊走活性は認められなくなった。以上より、大腸がん細胞株が産生するＣＸＣＬ１６は、ケモカイン活性を有することを確認した。

実施例４
[がん組織と非がん組織でのＣＸＣＬ１６ｍＲＮＡの発現］
外科的に切除された大腸がん手術標本３例から、大腸がん組織および非がん部大腸粘膜（正常大腸粘膜）のＲＮＡを抽出し、それぞれにおけるＣＸＣＬ１６の発現を調べた。実施例１と同様のRT-PCR法を用いた。その結果CXCL16 mRNAは、がん組織において正常組織より強く発現していることが確認された（図２）。

実施例５
[外科的切除標本を用いた免疫組織染色法による大腸がんにおけるＣＸＣＬ１６の発現］
外科的切除標本(1998年〜2001年)を用い免疫組織染色法により大腸がんにおけるＣＸＣＬ１６の発現を検討した。大腸がん組織におけるＣＸＣＬ１６の発現は、５８例中４３例（７４％）に認められた。また周囲の正常粘膜細胞でＣＸＣＬ１６の発現が確認できたのはわずか２例であった。

実施例６
外科的切除標本(1998年〜2001年)中に腺腫病変を数例認めた。それらを免疫組織染色したところ、がん組織と同様にＣＸＣＬ１６の発現が確認できた。なお、大腸腺腫は大腸がんの前がん病変である。

実施例７
[がん周囲の浸潤ＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ細胞]
免疫組織染色法にて大腸がん症例をＣＸＣＬ１６陽性群４３例とＣＸＣＬ１６陰性群１５例とに分けがん組織周囲浸潤細胞で検討を行った。ＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋細胞を免疫組織染色にて判別し、光学顕微鏡にてがん組織と正常組織境界又はがん先進部におけるそれぞれの浸潤細胞数を用手的に計測した。１症例につき２００倍視野で５視野計測し、その平均を浸潤細胞数とした。
ＣＤ４^＋細胞は、ＣＸＣＬ１６陽性群７１.９、陰性群４４.２、ＣＤ８^＋細胞は、陽性群５８.２陰性群２９.３と両細胞ともに、陽性群は浸潤細胞数が増加していた。

実施例８
[統計学的検討]
ＣＸＣＬ１６発現陽性群４３例と発現陰性群１５例に分け、年齢、性別および病理学的因子（腫瘍局在、組織型、壁深達度、静脈浸潤、リンパ管浸潤、リンパ節転移、肝転移およびＤｕｋｅｓ分類）に関し統計学的検討を行ったが、何れの因子に関しても両群間に有意差は認なかった。しかしながら、それぞれの予後を検討すると、ＣＸＣＬ１６陽性群は有意に予後良好な結果であった。（Ｌｏｇ−ｌａｎｋｔｅｓｔｐ＝０.０４１）（図３）。

実施例９
[乳がん細胞株および肺がん細胞株での検討]
肺がん細胞３種（Ａ５４９、Ｌｕ９９、ＳＢＣ５）、乳がん細胞５種（ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３、ＺＲ−７５−１）を用い、実施例１と同様に、ＲＴ−ＰＣＲ法でＣＸＣＬ１６の発現を調べた。その結果、いずれのがん細胞株においても、ＣＸＣＬ１６が発現していた。

以上のように、本発明は、（１）血清診断による腫瘍の検出確率の向上、（２）手術後の再発・転移の追跡確認、（３）制がん剤の開発などに利用することができ、産業上の有用性を有するものである。

大腸がん細胞株でのＣＸＣＬ１６ｍＲＮＡの発現がん組織と非がん組織でのＣＸＣＬ１６ｍＲＮＡの発現ＣＸＣＬ１６陽性群と陰性群の予後

Claims

ケモカインＣＸＣＬ１６の発現量を指標とする大腸がんの予後の状況を検査する方法。
抗ケモカインＣＸＣＬ１６抗体を用いてケモカインＣＸＣＬ１６を検出する請求項１の検査する方法。