MX2013002268A - Metodos para detectar anticuerpos anti-he4 y metodos de diagnosis y/o de prognosis de condiciones asociadas con celulas que expresan he4. - Google Patents

Abstract

La presente invención caracteriza, inter alia, composiciones y métodos relacionados con la detección de células tumorales que expresan HE4 en un sujeto. Los métodos incluyen la detección de anticuerpos anti-HE4 en una muestra biológica obtenida del sujeto. Los métodos son útiles para la diagnosis y el monitoreo de la eficacia de los tratamientos para cáncer en los cuales HE4 expresa, por ejemplo, el cáncer de ovario.

Description

METODOS PARA DETECTAR ANTICUERPOS ANT1-HE4 Y METODOS DE DIAGNOSIS Y/O PROGNOSIS DE CONDICIONES ASOCIADAS CON CELULAS QUE EXPRESAN HE4 Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación de la Solicitud Provisional de U.S. No. 61/377,387, la cual se presentó el 26 de agosto de 2010. Para el propósito de cualquier solicitud de U.S. que pueda reivindicar el beneficio de la Solicitud Provisional de U.S. No.61/377,387, los contenidos de la solicitud antes presentada se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.

Campo de la Invención La presente invención se refiere a composiciones y métodos para evaluar el riesgo, diagnosis y/o prognosis de sujetos en riesgo de o que sufren de un cáncer asociado con tumores que expresan proteína epididimal humana (HE4) de núcleo de cuatro enlaces de disulfuro y, en particular, a métodos de medición de anticuerpos antí-HE4 para uso como un indicador de la presencia de células que expresan HE4, tales como células de tumor de ovario y/o para determinar el estatus clínico de un paciente que experimenta tratamiento de un cáncer asociado con uno o más tumores que expresan HE4.

Antecedentes de la Invención El carcinoma de ovario (OvC) es la segunda más frecuente y la más letal malignidad ginecológica en el mundo occidental. La mayoría de los casos son diagnosticados en una etapa avanzada y esto se refleja por una diagnosis pobre con la tasa de supervivencia global de cinco años que no excede de 35%. El carcinoma de ovario es desproporcionadamente letal porque los síntomas son vagos y no específicos. Los cánceres de ovario derraman células malignas al fluido que ocurre naturalmente dentro de la cavidad abdominal. Estas células tienen entonces el potencial de flotar en este fluido e implantarse con frecuencia en otras estructuras abdominales (peritoneal) que incluyen el útero, la vejiga urinaria, el intestino y revestimiento de la pared intestinal (omentum). Estas células pueden empezar a formar nuevos crecimientos tumorales aun antes de que se sospeche el cáncer. Más del 60% de los pacientes que presentan esta enfermedad ya tienen la enfermedad en la etapa III o la etapa IV, cuando ya se ha difundido más allá de los ovarios y más de 75% de estos pacientes mueren de la enfermedad, a pesar de las mejorías recientes de la quimioterapia para cáncer de ovario. Sin embargo, si el diagnóstico se hace tempranamente en la enfermedad, se pueden alcanzar tasas de 90% a 98% de supervivencia de cinco años.

Un marcador para cáncer de ovario que se usa en ensayos en suero para cáncer de ovario es CA125 (Bast, R.C., et al., Gynecol. Oncol. 22:115-120 (1985); Einhorn, N., et al., Obstet. Gynecol. 67:414416 (1986); Einhorn, et al., Obstet. Gynecol. 50:14-18 (1992); Jacobs, I.J., et al, Br. Med. J. 575:1355-1358 (1996)). Sin embargo, aunque CA125 se encuentra elevado en la mayoría de todos los cánceres de ovario, se encuentra en solamente la mitad de aquéllos con enfermedad en etapa temprana (Hellstrom, I., et al., Cáncer Research 63:3695-3700 (2003)). Además, CA125 está elevado también en varias condiciones no malignas (Fung, .F., et al., J. Obstet. Gynaecol. Can., 26:1X1-12 (2004); Mas, M.R., et al, Dig. Liver Dis. 52:595-597 (2000); Malkasian, G.D., et al, Am. J. Obstet. Gynecol. i5P:341-346 (1988)), lo que puede conducir a un resultado falso positivo.

Asi, existe una gran necesidad de desarrollar herramientas más efectivas para detectar condiciones malignas en etapa temprana, potencialmente curables, tal como carcinoma de ovario.

Breve Descripción de la Invención De acuerdo con lo precedente, en un aspecto, se proporciona un método para detectar la presencia de células que expresan HE4 en un sujeto humano que comprende determinar la presencia o cantidad de anticuerpos anti-HE4 en una muestra biológica obtenida del sujeto humano, en donde la presencia o cantidad de anticuerpos anti-HE4 en la muestra biológica es indicativa de la presencia de células que expresan HE4 en el sujeto humano. En algunas modalidades, la presencia de células que expresan HE4 en un sujeto humano es indicativa de que el sujeto está padeciendo cáncer de ovario o está en riesgo de desarrollar un tumor de ovario.

En otro aspecto, se proporciona un método para monitorear la eficacia de tratamiento de un paciente humano de cáncer que experimenta tratamiento terapéutico para un tumor que expresa HE4. El método comprende: (a) proporcionar una muestra biológica de un paciente humano que experimenta tratamiento terapéutico para un cáncer asociado con células de tumoir que expresan HE4; (b) determinar la presencia o cantidad de anticuerpos anti-HE4 en la muestra biológica poniendo en contacto la muestra biológica con un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibridiza selectivamente para una secuencia por lo menos 90% idéntica con una secuencia que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:1¡ y (c) comparar la presencia o cantidad determinada de anticuerpos anti-HE4 con un estándar de referencia de anticuerpos, en donde una cantidad de anticuerpo anti-HE4 mayor que el estándar de referencia es indicativa de una respuesta positiva al tratamiento terapéutico para el cáncer.

En otro aspecto, se proporciona un paquete para detectar la presencia de células que expresan HE4 en un sujeto humano, el paquete que comprende reactivos específicos para la detección de la presencia o cantidad de anticuerpos anti-HE4 en una muestra biológica obtenida del sujeto humano e instrucciones impresas para comparación de la presencia o cantidad detectada de anticuerpos anti-HE4 con un estándar de referencia.

Descripción de los Dibujos Los aspectos precedentes y muchas de las ventajas consiguientes de esta invención serán más rápidamente apreciados conforme los mismos se entiendan mejor por referencia a la siguiente descripción detallada cuando se toma en conjunto con los dibujos adjuntos, en donde: La Figura 1 ilustra gráficamente los resultados de un ensayo ELISA que prueba la presencia/cantidad de anticuerpos anti-HE4 de muestras de suero humano obtenido de 10 pacientes con cáncer de ovario y 1 sujeto sano de control; como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 2 representa fragmentos de HE4 expresados como proteínas de fusión con proteína de cubierta pVIII usando los cebos mostrados en la Tabla 1.

Descripción Detallada de la Invención A menos que se defina específicamente en la presente, todos los términos usados en la presente tienen el mismo significado como el que tendrían para alguien experto en la técnica de la presente invención.

Los términos "por ciento de identidad" o "por ciento idéntico", como se aplican a secuencias de polipéptidos, tal como el polipéptido HE4 o una porción del mismo, se definen como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia de proteína candidata que son idénticos con la secuencia de proteína del sujeto (tal como la secuencia de aminoácido expuesta en SEQ ID NO: 2, o una porción de la misma que comprende por lo menos 10 residuos de aminoácidos consecutivos) después de alinear las secuencias candidata y del sujeto para alcanzar el máximo porcentaje de identidad. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de proteína se puede determinar mediante comparación por pares de las dos secuencias usando la interfaz b12seq en el sitio de Web del National Center for Biotechnology Information (NCBI), U.S. National Library of Medicine, 8600 Rockville Pike, Bethesda, Maryland 20894, U.S. A. La interfaz b1 2seq permite la alineación de la secuencia usando la herramienta BLAST descrita por Tatiana, A. , et al , "Blast 2 Sequences— A New Tool for Comparing Protein and N ucleotide Sequences," FEMS M icrobiol . Lett. 174:247-250 ( 1 999). Se usaron los siguientes parámetros de alineación : Matriz = BLOSU M62 ; Castigo de brecha abierta = 1 1 ; Castigo de extensión de brecha = 1 ; Brecha x d ropff = 50; Esperado = 10.0; Tamaño de palabra = 3; y Filtro = desconectado.

Los términos "por ciento de identidad" o "por ciento idéntico", como se aplican a moléculas de ácido nucleico, es el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata de ácido nucleico que son idénticos con una secuencia de molécula de ácido nucleico del sujeto (tal como la secuencia de molécula de ácido nucleico expuesta en SEQ I D NO : 1 , o u na porción de la misma que comprende por lo menos 20 nucleótidos consecutivos) después de alinear las secuencias para alcanzar el porcentaje máximo de identidad y sin considerar ning una sustitución de residuo de ácido nucleico como parte de identidad de secuencia. No se introd ucen brechas en la secuencia candidata de ácido n ucleico con el fin de alcanzar la mejor alineación . La identidad de secuencia de ácido nucleico puede determinarse de la siguiente manera. La secuencia de molécula de polinucleótido del sujeto se usa para buscar una base de datos de secuencia de ácido nucleico , tal como la base de datos Genbank, usando el programa BLASTN versión 2.1 (basado en Altschul, et al . , N ucleic Acids Research 25:3389-3402 (1 997)) . El prog rama se usa en el modo sin brechas. Se usa filtración por default para remover homolog ías de secuencia debido a regiones de baja complejidad como se define en Wootton, J.C., y S. Federhen, Methods in Enzymology 255:554-571 (1996). Se utilizan los parámetros de default de BLASTN.

Como se usa en la presente el término "sujeto humano sano" se refiere a un individuo quién se sabe que no sufre de cáncer, tal conocimiento que se deriva de datos clínicos del individuo incluyendo, pero no limitado a, un ensayo de cáncer diferente al descrito en la presente. El individuo sano de preferencia es también asintomático con respecto a los síntomas iniciales asociados con tumores que expresan HE4 tal como el cáncer de ovario, que incluyen, por ejemplo, presión rectal, inflamación abdominal e hinchazón; y también de preferencia asintomático con respecto a otras enfermedades y condiciones.

Como se usa en la presente, el término "tumor que expresa HE4"se refiere a cualquier tipo de células de cáncer y/o tumores que se identifican como teniendo una condición neoplástica asociada con una expresión incrementada de HE4, en donde HE4 se refiere a por lo menos uno de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 y homólogos de mamífero de los mismos, o un fragmento de los mismos que comprenden por lo menos diez residuos consecutivos de la proteína (SEQ ID NO:2), o por lo menos 20 nucleótidos consecutivos del cADN (SEQ ID NO:1), en comparación con tejidos normales, incluyendo, pero no limitado a, cáncer de ovario, adenocarcinoma de pulmón (Bingle et al., Respiratory Research 7:61-80 (2006), y tumores de glándula salival.

Como se usa en la presente, el término "cáncer de ovario" se refiere a cualq uier tipo de cáncer de ovario incluyendo, pero no limitado a, cáncer de ovario seroso, cáncer de ovario no invasivo, cáncer de ovario de fenotipo mixto, cáncer de ovario mucinoso, cáncer de ovario endometrioide, cáncer de ovario de célula clara, cáncer de ovario seroso papilar, célu la de Brenner y adenocarcinoma sin diferenciar.

Como se usa en la presente, el término "recurrencia de u n tumor que expresa H E4" se refiere a evidencia cl ín ica de cáncer relacionado con células que expresan H E4, por ejemplo, cáncer de ovario, o células de tumor derivadas del mismo con base en datos clínicos del ind ividuo incluyendo, pero no limitado a, un ensayo de cáncer diferente al descrito en la presente.

Como se usa en la presente , el término "buena prognosis" en el contexto de cáncer asociado con u no o más tumores q ue expresan H E4 (por ejemplo , cáncer de ovario) se refiere a pacientes q uienes es posible que se cu ren de su enfermedad , o que tienen por lo menos un periodo de supervivencia de cinco años libre de tumores después de la diagnosis inicial .

Como se usa en la presente , el término "prognosis pobre" en el contexto de cáncer asociado con u no o más tumores q ue expresan H E4 (por ejemplo, cáncer de ovario) se refiere a pacientes quienes es posible q ue mueran de su enfermedad en un periodo de cinco años después de la diagnosis inicial .

La proteína de núcleo cuatro-disu lfuro epididimal humana ("H E4") (SEQ I D NO :2) está codificada por la secuencia de mARN expuesta como SEQ ID NO:1 (que corresponde a Genbank Accession No. AY212888). El cADN de HE4 fue aislado primero de epididimis humano (Kirchhoff et al., 1991), y el cADN de HE4 se detectó más tarde con alta frecuencia en bibliotecas de cADN construidas a partir de carcinomas de ovario (Wang et al., Gene 229:\0\(1999)). La proteína HE4 pertenece a la familia de proteínas de "núcleo cuatro-disulfuro", la cual comprende un grupo heterogéneo de moléculas poco ácidas y estables al calor de función divergente, aludidas como "péptidos solubles HE4-relacionados" (SHRP) (Kirchhoff, et al., Biol. Reprod. 45:350-357 (1991). Se piensa que la separación conservada de ocho residuos de cisteína núcleo en las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos miembros de la familia de núcleo de cuatro-disulfuro (regiones aa 32-73 y 76-123 de SEQ ID NO:2) dirige el plegado de estas moléculas en una estructura compacta y estable. Muchos miembros de la familia de núcleo de cuatro-disulfuro son inhibidores de proteasa; sin embargo, para algunos miembros de la familia, incluyendo HE4, no se ha identificado aun alguna función.

Como se usa en la presente, el término "proteína HE4" abarca proteína HE4 que ocurre naturalmente que se aisla de una muestra biológica obtenida de un sujeto humano así como también la proteína HE4 aislada de células cultivadas que hacen HE4 (por ejemplo, células cultivadas de carcinoma de ovario), o hecha mediante tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, en sistemas de expresión eucarióticos (por ejemplo, células COS)), en levadura, mamífero o en sistemas de expresión bacterianos.

De acuerdo con lo precedente, los presentes inventores han generado un ensayo reproducible para detectar anticuerpos para proteína H E4 nativa (SEQ I D NO :2) en una m uestra biológica (por ejemplo, plasma o suero) , como se describe en el Ejemplo 2. Como se describe adicionalmente en los Ejemplos 2 a 3, los inventores han usado este ensayo para detectar la presencia de anticuerpos para H E4 en sujetos humanos, y han encontrado que los sujetos identificados clínicamente como sufriendo de cáncer de ovario ten ían u na incidencia de anticuerpos anti-H E4 sig nificativamente mayor en comparación con sujetos femeninos normales sanos.

De acuerdo con lo precedente, en un aspecto, se proporciona u n método para detectar la presencia de células que expresan HE4 en un sujeto h umano. El método comprende determinar la presencia o cantidad de anticuerpos anti-H E4 en una muestra biológica obtenida del sujeto humano, en donde la presencia o cantidad de anticuerpos anti-H E4 en la muestra biológica es indicativa de la presencia de células que expresan H E4 en el sujeto humano. En una modalidad , la presencia o cantidad de anticuerpos anti-HE4 en la muestra biológica se determina poniendo en contacto la muestra biológica con un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida selectivamente para una secuencia por lo menos 80% idéntica , o por lo menos 90% idéntica , o por lo menos 95% idéntica , o por lo menos 98% idéntica, o por lo menos 99% idéntica a una secuencia q ue comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de SEQ I D NO: 1 . En algunas modalidades, la presencia o cantidad de anticuerpo anti-H E4 en la muestra biológica se determina poniendo en contacto la muestra biológica con un polipéptido q ue comprende u na secuencia por lo menos 80% idéntica, o por lo menos 90% idéntica , o por lo menos 95% idéntica , o por lo menos 98% idéntica , o por lo menos 99% idéntica a una secuencia que comprende por lo menos 1 0 aminoácidos contig uos de SEQ I D NO :2. En una modalidad , la presencia o cantidad de anticuerpos anti-H E4 en comparación con u n estándar de referencia (por ejemplo , un control negativo) es indicativa de la presencia de células q ue expresan HE4, tales como célu las de tumor, en el sujeto humano. En otra modalidad , la cantidad de anticuerpos anti-H E4 sobre una cantidad de umbral predeterminada es indicativa de la presencia de células q ue expresan H E4 en un sujeto humano. En algunas modalidades del método, la presencia de células que expresan H E4 en un sujeto humano es indicativa de que el sujeto está sufriendo de o en riesgo de desarrollar cáncer de ovario.

U na amplia variedad de muestras biológicas puede ser usada en los métodos de la invención , incluyendo fluidos biológicos. Ejemplos no limitantes de fluidos biológicos incluyen sang re, plasma, suero, fluido ascítico, orina, saliva, lágrimas, fluido pleu ral , esputo, fluido vaginal (descarga) , y lavados obtenidos d urante un proced imiento médico (por ejemplo, lavados pélvicos u otros obtenidos durante biopsia, endoscopia o cirug ía) .

Los métodos de este aspecto de la invención pueden usarse como una herramienta de diagnóstico para distingu ir entre un sujeto que sufre de una enfermedad o condición asociada con la expresión de H E4 y una enfermedad o condición no asociada con la expresión de H E4. En una modalidad del método , una muestra biológica se obtiene de u n sujeto humano que sufre de por lo menos u n síntoma asociado con cáncer de ovario. Los síntomas asociados con cáncer de ovario son conocidos por aquellos expertos en el campo de la medicina . Ejemplos no limitantes de tale síntomas incluyen hinchazón/inflamación abdominal , dolor o presión abdominal/pélvico, síntomas gastrointestinales (por ejemplo, gases , ind igestión , nausea, o cambios en los movimientos del intestino) , sangrado vaginal o descarga , problemas u rinarios (por ejemplo, urgencia , ardor o espasmos) , fatiga , fiebre, dolor de espalda y dificultad para respirar.

En algu nas modalidades, los métodos de este aspecto de la invención comprenden además realizar por lo menos un ensayo de d iagnóstico adicional para determinar si el sujeto con anticuerpos anti-H E4 tiene un tumor de ovario. En algu nas modalidades, los métodos de este aspecto de la invención comprenden además realizar por lo menos un ensayo de diagnóstico adicional para cáncer de ovario en el sujeto, tal como, por ejemplo , detectar la presencia de CA1 25 en u na muestra biológica , ultrasonido, exploración de CT, exploración de MRI , biopsia , aspirado y los similares.

Como se describe en más detalle en la presente, en algunas modalidades, los métodos de la invención que incluyen la detección de anticuerpos para H E4 nativo pueden usarse y combinarse opcionalmente con un ensayo para detectar antígeno SH RP, con el fin de detectar la presencia de células de tumor q ue expresan H E4, para determinar la presencia o probabilidad de recurrencia de un cáncer asociado con un tumor que expresa HE4, tal como cáncer de ovario, para evaluar el status clínico y/o prognosis de un paciente que sufre de un cáncer asociado con tumores que expresan HE4, y/o para monitorear la eficacia del tratamiento de cáncer en un paciente. La cantidad de antígeno SHRP detectada en la muestra biológica puede compararse con un estándar de referencia tal como un valor de referencia de antígeno, en donde la detección de una cantidad incrementada de antígeno SHRP en la muestra en comparación con el estándar de referencia es indicativa de la presencia de células de tumor que expresan HE4 en el sujeto humano.

En otra modalidad, se proporciona un método para monitorear la eficacia de tratamiento de un paciente de cáncer humano que experimenta tratamiento terapéutico para un tunos que expresa HE4. El método comprende: (a) proporcionar una muestra biológica de un paciente humano bajo tratamiento terapéutico para un cáncer asociado con un tumor que expresa HE4; (b) determinar la presencia o cantidad de anticuerpos anti-HE4 en la muestra biológica poniendo en contacto la muestra biológica con un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida selectivamente con una secuencia por lo menos 90% idéntico con una secuencia que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:1; y (c) comparar la presencia o cantidad determinada de anticuerpos anti-HE4 con un valor de referencia de anticuerpos en donde una cantidad de anticuerpos antí-HE4 mayor que el valor de referencia es Indicativa de una respuesta positiva al tratamiento terapéutico para el cáncer.

En otra modalidad , se proporciona un método para determinar la probabilidad de recurrencia de un tumor que expresa H E4 en u n paciente humano bajo tratamiento terapéutico para un cáncer asociado con un tumor que expresa H E4. El método comprende: (a) proporcionar una muestra biológica de un paciente humano bajo tratamiento terapéutico para un cáncer asociado con tumor que expresa H E4; (b) determi nar la presencia o cantidad de anticuerpos anti-H E4 en la muestra biológica poniendo en contacto la muestra biológica con un polipéptido codificado por un polin ucleótido que híbrida selectivamente con una secuencia por lo menos 80% , tal como por lo menos 90% idéntica a una secuencia que comprende por lo menos 20 n ucleótidos contiguos de SEQ I D NO : 1 ; y (c) comparar la presencia o cantidad de anticuerpos anti-H E4 determinada en el paso (b) con un valor de referencia de anticuerpos, en donde una cantidad de anticuerpo anti-H E4 mayor que el valor de referencia de anticuerpo es indicativa de un riesgo menor de recurrencia de tumor que expresa H E4 y en donde una cantidad de anticuerpo anti-H E4 menor que el valor de referencia es indicativa de mayor riesgo de recurrencia de tumor q ue expresa H E4 en el paciente humano.

De acuerdo con una modalidad de los métodos de la invención , un paciente humano bajo tratamiento terapéutico para un cáncer asociado con un tumor que expresa HE4 es evaluado para su estatus clínico y probabilidad de recurrencia de cáncer. Los métodos de acuerdo con esta modalidad pueden practicarse con pacientes previamente diagnosticados y tratados para u n tu mor q ue expresa H E4, tal como cáncer de ovario, adenocarcinoma de pulmón o un tumor de glánd ula salival (por ejemplo, tratado con cirug ía y/o previamente o actualmente bajo tratamiento terapéutico , tal como quimioterapia , terapia con radiación , terapéutica con proteína , incluyendo anticuerpos, terapia de genes , terapia con vacuna de cáncer, trasplante de células madre u otra terapia) . La recurrencia de cáncer de ovario es una recu rrencia clínica como se determina por la presencia de uno o más síntomas clínicos de un cáncer de ovario, tal como, por ejemplo, una metástasis o, alternativamente, como se determina en una prueba bioqu ímica , prueba inmunológica o prueba serológ ica tal como , por ejemplo, una reactividad cruzada en una muestra biológica con un anticuerpo CA1 25 u otra prueba de diagnóstico. De preferencia , la recu rrencia de cáncer de ovario es capaz de ser detectada por lo menos aproximadamente 2 años a partir del tratamiento, más preferiblemente aproximadamente 2 a 3 años a partir del tratamiento y aun más preferiblemente, aproximadamente 4 o 5 o 1 0 años a partir del tratamiento.

Se usa un sistema de 1 a 4 etapas para describir cáncer de ovario, como se expone por el sistema de etapas de la I nternational Federation of Gynecology and Obstetrics ("FIGO") , que usa información obten ida después de cirug ía. Las cirug ías pueden incluir una histerectom ía abdominal total , remoción de uno o varios ovarios y tubos de Falopio, el omentum, y/o lavados pélvicos para citolog ía.

Etapa I - l imitada a uno o ambos ovarios ?? - involucra un ovario; cápsula intacta ; sin tumor en superficie de ovario; células no malignas en ascitos o lavados peritoneales I B - involucra ambos ovarios; cápsula intacta ; sin tumor en superficie de ovario; lavados negativos IC - tumor limitado a ovarios con cualquiera de los sig u ientes: cápsula rota , tumor en superficie de ovario , lavados positivos Etapa II - extensión o im plantes pélvicos HA - extensión o implantes sobre útero o tubo de Falopio; lavados negativos I I B - extensión o implantes sobre otras estructu ras pélvicas; lavados negativos I IC - extensión o implantes pélvicos con lavados peritoneales positivos Etapa III - im plantes peritoneales microscópicos fuera de la pelvis ; o limitados a la pelvis con extensión al intestino delgado u omentum I I IA - metástasis peritoneal microscópica más allá de la pelvis I I I B - metástasis peritoneal microscópica más allá de la pelvis menor que 2 cm de tamaño M IO - metástasis peritoneal más allá de la pelvis >2 cm o metástasis de nodo linfático, nota: las metástasis de nodo linfático para-aórtico se consideran nodos linfáticos regionales Etapa IV - metástasis distante - en el hígado o fuera de la cavidad peritoneal De acuerdo con alg unas modalidades de la invención , se obtiene una muestra biológica de un paciente h umano (previamente diagnosticado y tratado para cáncer de ovario o bajo tratamiento actual para cáncer de ovario) y se ensaya para la presencia o concentración de anticuerpos anti-H E4. Las muestras biológicas para uso en los métodos de la invención incluyen fluidos biológicos. Ejemplos no limitantes de fluidos biológicos incluyen sangre , plasma , suero, fluido ascítico, orina, saliva, lágrimas , fluido pleural , esputo, fluido vaginal (descarga) y lavados obtenidos du rante un procedimiento médico (por ejemplo, lavados pélvicos u otros obten idos durante biopsia , endoscopia o cirugía) . La habilidad para usar u na muestra de fluido biológico para evaluar el estatus cl ínico de un sujeto con respecto a un tumor que expresa HE4 (tal como cáncer de ovario u otros tumores que expresan H E4) , proporciona facilidad relativa en compasión con obtener u na muestra de biopsia de tejido de u n tumor. Además , permite monitorear un paciente du rante y/o post-tratamiento y, de manera importante, permite la detección más temprana de la recu rrencia y/o progresión del cáncer de ovario (u otros tumores que expresan H E4) .

De acuerdo con los métodos de este aspecto de la invención , la concentración anticuerpo anti-H E4 se mide en u na muestra biológica obtenida a partir de un paciente humano. Se puede usar cualquier inmunoensayo para medir la concentración de anticuerpo anti-H E4; por ejemplo, ensayos inmunoabsorbentes vinculados a enzima (ELISA) y radioinmunoensayos (RIA) , manchado western , análisis FACS , y los similares . Más preferiblemente, el ensayo será capaz de generar resultados cuantitativos. La muestra biológica puede diluirse en un búfer adecuado antes del análisis, por ejemplo, la muestra puede diluirse mediante un factor de por lo menos 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:80, 1:100, 1:200 o mayor.

En una modalidad, la presencia o cantidad de anticuerpo anti- HE4 en la muestra biológica se determina poniendo en contacto la muestra biológica con un polipéptido de HE4 codificado por un polinucleótido que híbrida selectivamente con una secuencia por lo menos 80% idéntica (por ejemplo, por lo menos 85% idéntica o por lo menos 90% idéntica o por lo menos 95% idéntica o por lo menos 99% idéntica) con SEQ ID NO:1, o un fragmento del mismo que comprende por lo menos 20 nucleótidos consecutivos (o por lo menos 25 o 30, o por lo menos 40, 60 u 80 nucleótidos consecutivos) de SEQ ID NO:1.

En otra modalidad, la presencia o cantidad de anticuerpo anti-HE4 en la muestra biológica se determina poniendo en contacto la muestra biológica con un polipéptido de HE4 por lo menos 80% idéntica (por ejemplo, por lo menos 85% idéntica o por lo menos 90% idéntica o por lo menos 95% idéntica o por lo menos 99% idéntica) a la proteína soluble humana relacionada con HE4 proporcionada como SEQ ID NO:2, o un fragmento de la misma que comprende por lo menos 10 residuos de aminoácidos consecutivos (o por lo menos 20 o por lo menos 30, tal como por lo menos 50 residuos de aminoácidos consecutivos) de SEQ ID NO:2.

Un fragmento de un polipéptido de HE4 tiene una secuencia de aminoácidos contiene menos aminoácidos que la secuencia de aminoácidos de HE4 de longitud completa como se expone en SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, el fragmento puede incluir el dominio N-terminal, N-WFDC. Como se muestra en la Figura 2, N-WFDC (SEQ ID NO: 5) se extiende desde el aminoácido 31 al aminoácido 75 de SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, el fragmento puede incluir el dominio C-terminal C-WFDC. Como se muestra en la Figura 2, C-WFDC (SEQ ID NO: 6) se extiende desde el aminoácido 76 hasta el aminoácido 124 de SEQ ID NO: 2. Otros fragmentos de ejemplo de HE4 pueden incluir polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos que se extiende desde las posiciones 31 a 52 (SEQ ID NO: 7); posiciones 42 a 63 (SEQ ID NO: 8); posiciones 53 a 75 (SEQ ID NO: 9); posiciones 76 a 100 (SEQ ID NO: 10); posiciones 89 a 112 (SEQ ID NO: 11); posiciones 89 a 112 (SEQ ID NO: 12); o posiciones 101 a 124 (SEQ ID NO: 13) de SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, los fragmentos de HE4 pueden abarcar los dominios N-WFDC y C-WFDC. Los fragmentos de ejemplo incluyan polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos que se extiende desde las posiciones 53 a 100 de SEQ ID NO: 2. Un fragmento que comprende por lo menos 20 nucleótidos consecutivos (o por lo menos 25 o 30, o por lo menos 40, 60, u 80 nucleótidos consecutivos) de SEQ ID NO:1 puede ser, por ejemplo, un fragmento de SEQ ID NO: 1 que codifica SEQ ID NO: 5-13.

Los anticuerpos anti-HE4 de la invención se unen específicamente a un epitope en el polipéptido de HE4. Un epitope se refiere a un determinante antigénico en un objetivo q ue está unido específicamente por el paratope, es deci r, el sitio de un ión de u n anticuerpo. Los determinantes epitópicos consisten usualmente de agrupaciones superficiales qu ímicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares, y típicamente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epitopes tienen generalmente entre aproximadamente 4 a aproximadamente 1 0 aminoácidos contiguos (un epitope continuo) , o alternativamente pueden ser un grupo de aminoácidos no contiguos que definen una estructu ra particu lar (por ejemplo, un epitope conformacional) . Así , un epitope puede consistir de por lo menos 4, por lo menos 6, por lo menos 8 , por lo menos 10 y por lo menos 1 2 de tales aminoácidos. Los métodos para determinar la conformación espacial de los aminoácidos son conocidos en la técnica, e incluyen , por ejemplo, cristalog rafía de rayos x y resonancia magnética nuclear de 2 d imensiones.

La u nión de los anticuerpos anti-HE4 puede ser analizada usando métodos estándar. El método de mapear epitopes era bien conocido en la técnica . El tipo de epitopes, es decir, epitopes dependientes lineales o conformacionales, pueden ser determinados mediante comparación de la reactividad de los anticuerpos a H E4 desnatu ralizado y reducido con la de los anticuerpos contra H E4 que no ha sido desnaturalizado y red ucido. La reactividad de los anticuerpos anti-HE4 contra proteínas de fusión de fago se puede usar para identificar la un ión a fragmentos específicos de H E4. Tales métodos se describen en el Ejemplo 4 y en la PCT US11/25321, la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.

Específicamente los anticuerpos de unión son pueden ser anticuerpos que 1) exhiben un nivel de umbral de actividad de unión; y/o 2) no reaccionan en cruz significativamente con moléculas de polipéptido relacionadas conocidas. La afinidad de unión de un anticuerpo puede determinarse rápidamente por alguien de pericia ordinaria en la técnica, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad, Sci. 51:660-672, 1949).

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-HE4 pueden unirse a sus epitopes o señuelos de mimetismo objetivos en por lo menos 1.5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces o más para HE4 que a otras proteínas predichas para tener alguna homología con HE4.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-HE4 se unen con alta afinidad de 10" M o menos, 10"7M o menos, 10"9M o menos o con afinidad subnanomolar (0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 nM o aun menos). En algunas modalidades, la afinidad de unión de los anticuerpos es de por lo menos 1 x 106 Ka, por lo menos 5 x 106 Ka, por lo menos 1 x 107 Ka, por lo menos 2 x 107 Ka, por lo menos 1 x 10a Ka, o mayor. Los anticuerpos de pueden describir o especificar también en términos de su afinidad de unión a HE4. En algunas modalidades, las afinidades de unión incluyen aquéllas con una Kd menor que 5 x 10~2 M, 10"2 M, 5 x 10"3 M, 10"3 M, 5 x 10-3M, 10"4 M, 5 x 10"5 M, 10 s M, 5 x 1 O"6 M, 10"6 M, 5 x 10"7 , 1 O"7 M, 5 x 1 O"8 M, 10"8 M, 5 x 10-9 M, 5 x 10"10 M, 1CT10 M, 5 x 10"11 M, 10"11 M, 5 x 10"12 M, 10'12 , 5 x 10"13 M, 10"13 M, 5 x 10"14 M, 10"14 M, 5 x 10"15 M o 10"15 M o menos.

En una modalidad, la presencia o cantidad de anticuerpos anti-HE4 se mide en la muestra biológica mediante el uso de un ensayo ELISA. Los formatos de ELISA estándar de fase sólida son particularmente útiles en la determinación de la concentración de una proteína o anticuerpo a partir de una variedad de muestras biológicas, tal como suero. En una forma, tal ensayo involucra inmovilizar un polipéptido de HE4 o fragmento del mismo sobre una matriz sólida, tal como, por ejemplo, un micropozo o varilla de medición de poliestireno o policarbonato, una membrana o un suporte de vidrio (por ejemplo, un portaobjetos). Por ejemplo, puede utilizarse un pozo recubierto con HE4 de una placa de ELISA. La muestra biológica se pone en contacto con el pozo recubierto con HE4 y el anticuerpo anti-HE4 en la muestra se une y se captura. Después de unir y lavar para remover complejos inmunes no específicamente unidos, se detecta el complejo anticuerpo-antígeno. La detección se puede llevar a cabo con cualquier método adecuado, tal como la adición de un segundo anticuerpo ligado a una etiqueta.

De acuerdo con varias modalidades de los métodos de este aspecto de la invención, se puede obtener un valor de referencia de anticuerpo anti-HE4 a partir de un grupo de control de sujetos aparentemente sanos, por ejemplo, como se describe en los EJEMPLOS 2 y 3. En algunas modalidades, el valor de referencia de anticuerpo se determina en u n ensayo de ELISA usando suero obtenido de sujetos sanos, diluido a por lo menos 1 :20. En una modalidad , el valor de referencia de anticuerpo se determina usando suero obtenido de pacientes d iag nosticados con y/o previamente tratados para un cáncer que comprende células de tumor que expresan HE4. Un ensayo de ELI SA de ejemplo para detectar niveles de anticuerpo anti-HE4 en muestras de sangre se describe en el EJ EM PLO 2.

De acuerdo con las aplicaciones de prognosis de la invención , en una modalidad el nivel de anticuerpo anti-H E4 en una muestra biológica obtenida de un paciente de cáncer de ovario se compara entonces con el valor de referencia de anticuerpos. Si la concentración de anticuerpos en el paciente probado es mayor que el valor de referencia , tal como por lo menos 1 .5 veces, más preferiblemente por lo menos dos veces o mayor, con un valor P de menos de 0.05, y el paciente ha sufrido previamente tratamiento para cáncer de ovario, entonces el paciente tiene u na probabilidad reducida de recurrencia de cáncer de ovario. Si la concentración de anticuerpos en u n paciente de cáncer de ovario es menor que el valor de referencia , tal como por lo menos 1 .5 veces o dos veces o menor, con un valor P de menos de 0.05 , y el paciente ha sufrido previamente tratamiento para cáncer de ovario, entonces el paciente tiene u na probabilidad incrementada de recu rrencia de cáncer de ovario. En otra modalidad , la presencia de anticuerpo anti-H E4 se determina por comparación con una muestra de control de anticuerpo negativo y opcionalmente también con u na muestra de control de anticuerpo positivo.

En otro aspecto, la invención proporciona u n método para evaluar la prognosis de un paciente humano de cáncer que sufre de un tumor que expresa H E4. El método comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de anticuerpos anti-H E4 en una muestra biológica de un paciente h umano que sufre de un tumor que expresa H E4 poniendo en contacto la muestra biológica con un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida selectivamente para u na secuencia que es por lo menos 80% idéntica , tal como por lo menos 90% idéntica a una secuencia que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de SEQ I D NO: 1 ; (b) determinar la presencia o cantidad de péptidos solubles relacionados con H E4 (SH RP) cod ificados por un polinucleótido q ue híbrida selectivamente para una secuencia por lo menos 80% , tal como por lo menos 90% idéntica a u na secuencia que comprende por lo menos 20 nucleótidos contig uos de SEQ I D NO: 1 en u na muestra biológica del paciente humano probado en el paso (a) ; y (c) comparar la cantidad de anticuerpos anti-H E4 determinada en el paso (a) con un n ivel de referencia de anticuerpos, y comparar la cantidad de SH RP determinada en el paso (b) con un nivel de referencia de antígeno, en donde la detección de S H RP en la muestra en u na menor cantidad que el n ivel de referencia de antígeno, en combinación con la detección of anticuerpos anti-H E4 en la muestra en una mayor cantidad que el nivel de referencia de anticuerpos, es indicativa de una buena prognosis para el paciente .

De acuerdo con este aspecto de la invención , el método comprende el paso de determinar la presencia y/o cantidad de SH RP en una muestra biológica obtenida de un paciente que sufre de un tumor que expresa H E4, tal como un paciente de cáncer de ovario. Como se describe antes, SHRP es una proteína soluble que se ha encontrado en la circulación de pacientes tanto sanos como con cáncer. La presencia o cantidad de SH RP puede determinarse usando cualquier ensayo capaz de detectar y/o medir la cantidad de polipéptido SH RP .

En una modalidad , la concentración de un polipéptido SHRP codificado por un polinucleótido que híbrida selectivamente para u na secuencia por lo menos 80% idéntica (por ejemplo, por lo menos 85% idéntica , o por lo menos 90% idéntica , o por lo menos 95% idéntica, o por lo menos 99% idéntica) para SEQ ID NO: 1 , o un fragmento del mismo q ue comprende por lo menos 20 nucleótidos consecutivos (o por lo menos 25 o 30, o por lo menos 40, 60 u 80 n ucleótidos consecutivos) de SEQ I D NO : 1 , se mide en la muestra biológica.

En otra modalidad , la cantidad de un polipéptido SH RP por lo menos 80% idéntico (por ejemplo, por lo menos 85% idéntico, o por lo menos 90% idéntico, o por lo menos 95% idéntico, o por lo menos 99% idéntico) a la proteína soluble humana relacionada con H E4 provista como SEQ I D NO:2 , o un fragmento de la misma que comprende por lo menos 1 0 residuos de aminoácidos consecutivos (o por lo menos 20 o por lo menos 30, tal como por lo menos 50 resid uos de aminoácidos consecutivos) de S EQ I D NO : 2 se mide en la muestra biológica.

La concentración y/o cantidad relativa , o detección de proteína soluble relacionada con H E4 (SH RP) presente en u na muestra de fluido biológico puede determinarse usando cualq uier método conveniente para medir SH RP incluyendo, pero no limitado a , ELI SA, radioinmunoensayo, ensayo de quimioluminiscencia, teñido con inmunofluorescencia y los similares que incluyen un anticuerpo que se une específicamente a SHRP. Otros métodos de detección de proteína se pueden usar también para med ir SH RP , incluyendo espectroscopia de masa , manchado western , FACS y los similares. M uestras biológicas adecuadas incluyen un fluido biológico seleccionado del grupo que consiste de sangre, plasma, suero, flu ido ascítico y orina.

Se pueden preparar rápidamente anticuerpos específicos, incluyendo anticuerpos monoclonales dirigidos contra SH RP y sus variantes, usando técnicas convencionales, y se pueden usar en tales métodos. Por ejemplo, se puede usar un ensayo de ELISA de doble determinante ("emparedado") usando dos MAbs 2 H5 y 3D8 (q ue reconocen dos diferentes epitopes en el mismo antígeno) para detectar SH RP en sueros, como se describe en Hellstrom , I . , et al . , Cáncer Research (53:3695-3700 (2003) . Se puede usar otro ensayo de ELISA para detectar una o más variantes de H E4 usando los anticuerpos antes descritos , u otros anticuerpos contra H E4.

Los anticuerpos específicos, incluyendo anticuerpos monoclonales dirigidos contra SH RP y variantes de los mismos, pueden preparase fácilmente usando técnicas convencionales, y pueden usarse en tales métodos. Por ejemplo, se puede usar un ensayo de ELISA de doble determinante ("emparedado") usando dos MAbs 2H 5 y 3D8 (que reconocen dos diferentes epitopes en el mismo antígeno) para detectar SH RP en sueros, como se describe en Hellstrom , I . , et al . , Cáncer Research (53:3695-3700 (2003) . Otro ensayo de ELISA puede usarse para detectar una o más variantes de H E4 usando anticuerpos antes descritos, u otros anticuerpos contra H E4.

De acuerdo con varias modalidades de los métodos de este aspecto de la invención , un valor de antígeno SHRP de referencia puede ser obtenido a partir de u n grupo de control de sujetos aparentemente sanos; por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3. En algunas modalidades, el valor de antígeno de referencia se determina en un ensayo de ELI SA usando suero obtenido de sujetos sanos. Por ejemplo, en u na muestra de suero, el suero puede ser diluido hasta 1 : 1 00 y medirse en u n ensayo de ELI SA, donde un control negativo obtenido de un sujeto sano da un valor de absorbancia de <0.2 y u n control positivo obtenido de un paciente de cáncer de ovario da u n valor de absorbancia de >0.2. Ver Hellstrom , I . , et al . , Cáncer Research 63:3695-3700 (2003). Los valores de absorbancia pueden determinarse por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se usa comúnmente la absorbancia de la light a 450 nanómetros, aludida con frecuencia como la densidad óptica (OD) . En u na modalidad , el valor de antígeno de referencia se determina usando suero obtenido de pacientes diag nosticados con y/o previamente tratados para un cáncer que comprende células de tumor que expresan H E4.

En algunas modalidades, los métodos de la invención comprenden además el paso de determinar niveles de otro marcador de cáncer de ovario, tal como q uinasa vinculada a integ rin (I N K) , CA1 25 , TADG-1 2 , kallikrein 1 0, prostasin , osteopontin , creatina quinase beta , serotransferina , lipocalin asociada a neutrofil-gelatinasa (NGAL) , C D 163 o Gc-globulina en una muestra biológica obten ida del sujeto. El segundo marcador puede ser detectado al n ivel de ADN , ARN o proteína usando métodos convencionales conocidos en la técnica.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de monitoreo de la eficacia del tratamiento de un paciente humano diagnosticado con u n tumor que expresa HE4. El método comprende: (a) determinar u na primera concentración de anticuerpos H E4-mesotelina en una primera muestra biológica tomada de un paciente humano diag nosticado con un tumor que expresa H E4 antes de la iniciación del tratamiento para cáncer; (b) determinar una segunda concentración de anticuerpos anti-H E4 en una seg unda muestra biológica del paciente h umano tomada después del inicio del tratamiento para cáncer; y (c) comparar la primera u la segunda concentraciones de anticuerpos anti-H E4, en donde un incremento en la segunda concentración de anticuerpos anti-H E4 en comparación con la primera concentración de anticuerpos anti-H E4 med ida en la primera muestra biológica indica una respuesta positiva al tratamiento para cáncer.

De acuerdo con el método de este aspecto de la invención , una primera muestra biológica se toma de un paciente de cáncer antes del inicio del tratamiento, y una segu nda muestra biológica se toma del paciente por lo menos una vez después del inicio del tratamiento. En algunas modalidades, varias muestras biológicas tratadas del sujeto (por ejemplo, un sujeto en una prueba precl ínica) se toman en intervalos periódicos de tiempo después del inicio del tratamiento.

Como se usa en la presente, el término "tratamiento" se refiere a intervención q uirúrg ica o a la administración de u no o más agentes inhibidores de cáncer para el alivio de síntomas asociados con cáncer, o detención de la progresión ad icional o empeoramiento de los síntomas. Por ejemplo , el tratamiento exitoso puede incluir una remoción de u n tumor, tal como un tumor que expresa H E4; un alivio de síntomas o detención de la prog resión de la enfermedad , como se mide por una red ucción en el régimen de crecimiento de u n tumor; un alto en el crecimiento de un tumor; una reducción en tamaño del tumor; remisión parcial o completa del cáncer; o supervivencia incrementada o beneficio cl ínico . Por ejemplo, el tratamiento de u n sujeto q ue sufre de un tumor que expresa HE4 puede incluir uno o más de los siguientes: cirug ía para remover uno o más tumores y/o administración de un agente terapéutico, tal como quimioterapia , terapia de radiación , terapéutica de proteína (por ejemplo, anticuerpos, terapia de gen , terapia de vacu na de cáncer, trasplante de célula madre u otra terapia) .

Por ejemplo, con respecto al tratamiento para cáncer de ovario, la cirug ía es u n tratamiento preferido . El tipo de cirug ía depende de cuánto está difundido el cáncer cuando se diag nosticó (la etapa del cáncer) , así como también el tipo y el grado del cáncer. El cirujano puede remover uno (ooforectomía u nilateral) o ambos ovarios (ooforectom ía bilateral) , los tubos de Falopio (salpingectom ía), y el útero (histerectomía) . Para algunos tumores muy recientes (etapa 1 , enfermedad de bajo g rado o bajo riesgo) , solamente será removido el ovario involucrado y el tubo de Falopio (llamada "salpingo-ooforectom ía unilateral" o "USO"), especialmente en mujeres jóvenes quienes desean conservar su fertilidad . En etapas avanzadas de la enfermedad , se remueve tanto tumor como sea posible (cirug ía de reducción de masa tumoral o citorreductora) . En casos donde este tipo de cirug ía es exitoso, la prognosis es mejorada en comparación con pacientes donde grandes masas de tumor (más de 1 cm de diámetro) se dejan atrás . La quimioterapia se usa típicamente después de la cirug ía para tratar cualquier enfermedad resid ual . Los q uimioagentes terapéuticos, tal como un derivado de platino (por ejemplo, taxane) pueden administrarse sistémicamente, o pueden administrarse intra-peritonealmente vía infusión directa a la cavidad abdominal . Otros ejemplos de agentes terapéuticos para uso en el tratamiento de cáncer de ovario incluyen , pero no están limitados a , terapéutica de proteína (por ejemplo , anticuerpos), terapia de genes, terapia de vacuna de cáncer y trasplantes de células madre. Los métodos de este aspecto de la invención se pueden usar también para medi r la eficacia de agentes terapéuticos candidatos para el tratamiento de cáncer de ovario.

Los métodos de este aspecto de la invención pueden usarse también para determinar el estatus cl ínico de un paciente después de experimentar un tratamiento, tal como cirug ía para remover u n tumor.

De acuerdo con esta modalidad , el nivel de anticuerpo anti-H E4 en una muestra biológica obtenida de un paciente de cáncer que ha sido tratado para un tu mor que expresa H E4 se compara entonces con el valor de referencia de anticuerpo. Si la concentración de anticuerpos en el paciente probado es mayor que el valor de referencia , tal como por lo menos 1 .5 veces, más preferiblemente por lo menos dos veces o mayor, con un valor P de menos de 0.05, entonces el estatus clínico del paciente se espera q ue sea mejorado con el tratamiento (es decir, el paciente tiene una probabilidad reducida de recurrencia de cáncer de ovario). Si la concentración de anticuerpos en el paciente tratado de cáncer es menor q ue el valor de referencia, tal como por lo menos 1 .5 veces o dos veces o menor, con un valor P de menos de 0.05, entonces el estatus clín ico del paciente no se espera que sea mejorado con el tratamiento (es decir, el paciente tiene una probabilidad incrementada de recu rrencia de cáncer de ovario) .

En otro aspecto, se proporciona u n paq uete para detectar la presencia de células que expresan H E4 en un sujeto humano. El paquete comprende reactivos específicos para la detección de anticuerpos anti-H E4 en u na muestra biológica obten ida de un sujeto humano e instrucciones impresas para comparación de la presencia detectada o cantidad de anticuerpos anti-H E4 con una referencia estándar. Los métodos para detección de anticuerpos anti-H E4 descritos en la presente pueden realizarse usando los paquetes de la invención . En una modalidad , el paquete comprende u n reactivo de detección para detectar anticuerpos anti-H E4 q ue comprende u n polipéptido HE4 codificado por un polinucleótido que híbrida selectivamente para una secuencia que es por lo menos 80% idéntica, o por lo menos 90% idéntica, o por lo menos 95% idéntica, o por lo menos 98% idéntica, o por lo menos 99% idéntica a una secuencia que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:1. En algunas modalidades, el paquete comprende un reactivo de detección para detectar anticuerpos anti-HE4 que comprenden un polipéptido HE4 que es por lo menos 80% idéntico, o por lo menos 90% idéntico, o por lo menos 95% idéntico, o por lo menos 98% idéntico, o por lo menos 99% idéntico a una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 10 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:2. En algunas modalidades, el paquete comprende un polipéptido HE4, o fragmento del mismo, que es inmovilizado sobre una matriz sólida, tal como, por ejemplo, un micropozo o varilla de medición de poliestireno o policarbonato, una membrana, o un suporte de vidrio (por ejemplo, un portaobjetos de vidrio). Por ejemplo, se puede utilizar un pozo recubierto con HE4 de una placa de ELISA, en donde la muestra biológica se pone en contacto con el pozo recubierto con HE4 y el anticuerpo anti-HE4 en la muestra de une y se captura.

En algunas modalidades, el paquete comprende además un estándar de referencia seleccionado del grupo que consiste de un umbral numérico específico, una muestra de control negativo para evaluación concurrente, o información estadística que correlaciona la cantidad de anticuerpos anti-HE4 detectados con la probabilidad de la presencia células de cáncer que expresan HE4 en el sujeto. En algunas modalidades, el estándar de referencia es una muestra de control negativo , y en donde la muestra de control negativo se incluye en el paq uete.

En modalidades preferidas, los métodos y paquetes de la invención son capaces de usar en una ubicación de punto-de-cuidado, tal como u na cl ínica méd ica (por ejemplo, el consu ltorio del doctor) u hospital , con el fin de obtener rápidamente los resultados de las pruebas. Prueba de punto-de-cuidado (POCT) se refiere a cualqu ier hospital o cl ínica médica (consultorio del doctor) empleado que realiza cualquier tipo de pruebas de laboratorio fuera del laboratorio central . El POCT ha revolucionado el contin uum del proceso de cuidado del paciente por la provisión de resultados de laboratorio eficientemente al lado de la cama del paciente para varias pruebas tales como prueba de H IV, varilla de medición de orina , etc. Por ejemplo, se han desarrollado pruebas rápidas para detectar anticuerpos H IV que demuestran sensibilidades y especificidades comparables con aquéllas de los inmunoensayos de enzima sin la necesidad de equipo sofisticado de laboratorio y técnicos altamente entrenados. El POCT se puede usar con especímenes de sangre entera sin procesar o fluido oral . Ver Branson , B. M . , J . Lab. Medicine 27(7/8) :288-295 (2003). Los ensayos de POCT pueden estar en cualquier formato de ensayo que permita las pruebas rápidas, tales como aglutinación de partículas , inmunoconcentración e inmunocromatografía .

Por ejemplo, los ensayos POCT de aglutinación de partículas para detectar anticuerpos anti-H E4 pueden ser llevados a cabo mezclando un espécimen de un paciente q ue contiene anticuerpos anti-H E4 con partículas de látex recubiertas con polipéptido de H E4 (antígeno) , y si el anticuerpo anti-H E4 está presente, ocurre el entrelazado dentro de 10 a 60 minutos y resultados en aglutinación , con resultados interpretados visualmente.

En otro ejemplo de un formato de ensayo de POCT para detectar anticuerpos anti-H E4, se puede usar un dispositivo de inmunoconcentración (flujo a través) el cual emplea tecnolog ía de captu ra de fase sólida , que involucra la inmovilización de polipéptidos H E4 (antígeno) en una membrana porosa . El espécimen del paciente fluye a través de la membrana y es absorbido a un coj ín absorbente. Si están presentes anticuerpos anti-H E4 en el espécimen , se forma visiblemente un punto o una l ínea en la membrana cuando se desarrolla con u n reactivo de señal (por ejemplo , un conjugado coloidal de oro o selenio) . Se puede inclu ir también u n control de procedimiento en la membrana .

En todavía otro ejemplo de un formato de ensayo de POCT para detectar anticuerpos anti-H E4 , se pueden usar tiras inmunocromatog ráficas (flujo lateral flow) q ue incorporan tanto antígeno (H E4) y reactivo de señal en una tira de nitrocelulosa. El espécimen del paciente sa aplica a un coj ín absorbente, o el espécimen puede ser diluido en un frasco de búfer en el cual se inserta el dispositivo de prueba. El espécimen migra a través de la tira y se combina con el reactivo de señal. U na reacción positiva resulta en una l ínea visual en la membrana donde el antígeno de HE4 ha sido aplicado. Se puede aplicar una línea de control procedural a la tira más allá de la linea de antígeno HE4.

Los siguientes ejemplos ilustran meramente el mejor modo ahora contemplado para practicar la invención, pero no deben interpretarse como limitantes de la invención.

Ejemplo 1 Este Ejemplo describe la producción y purificación de Proteína 4 Epididimis Humana recombinante (HE4) en Células de Ovario de Hámster Chino (CHO).

Métodos: Construcción efe plásmido HE4-CIHDpa La proteína HE4 recombinante (SEQ ID NO:2) se generó como sigue.

Un fragmento de cADN que codifica la Proteína 4 Epididimis Humana (HE4) (SEQ ID NO:2) se amplificó por reacción en cadena de polimerasa de alta fidelidad usando los siguientes cebadores: El cebador de sentido hacia adelante: 5'-AAAAACCGGTATGCCTGCTTGTCGCCTAGG-3\ (SEQ ID NO:3) fue diseñado para introducir un sitio de reconocimiento de enzima de restricción Age I en el extremo 5' del gen apropiado para clonación.

El cebador de sentido inverso: 5'-AAAACCTGCAGGTCAGAAATTGGGAGTGACAC-3', (SEQ ID NO: 4), fue diseñado para introducir un sitio de reconocimiento de enzima de restricción Sbf I en el extremo 3' del gen apropiado para clonación.

El fragmento de ADN amplificado que contiene el cADN de HE4 fue digerido con Age I y Sbf /, y clonado en el vector de expresión de mamífero CIHDpa (remplazando el fragmento IFN-? con el HE4). El vector CIHDpa, proporcionado por Dr. Say Kong Ng de la National University of Singapore, utiliza secuencias de desestabilización en un marcador de selección para productividad mejorada de proteína recombinante en células CHO-DB44, como se describe en Ng et al., Metab Eng 9:304 (2007)), incorporado en la presente por referencia. Brevemente descrito, el vector de expresión CIHDpa contiene un promotor de citomegalovirus (CMV) estándar corriente arriba del sitio de inserción de cADN. Un promotor de timidina quinasa de virus simplex herpes (HSV-th) se posiciona corriente arriba de un gen de dihidrofolato reductasa (dhfr), que sirve como un marcador selectivo para transfectantes exitosos (es decir, células deficientes en dhfr requieren suplemnetos de hipoxantina y timidina para sobrevivir). Inmediatamente corriente abajo del marcador dhfr hay una región de ornitina decarboxilasa de murino PEST (MODC PEST) y una serie de elementos ricos en AU (ARE), que se expresan como componentes de fusión en el extremo carboxi terminal de la proteína dhfr. El péptido MODC PEST sirve como una señal de degradación que conduce a instabilidad de la proteína marcadora. La región de ARE sirve para desestabilizar el mARN que codifica la proteína marcadora. Con el marcador dhfr desestabilizado en los niveles de la transcripción y traslación, solamente células transfectadas que tienen producción altamente eficiente de las proteínas codificadas en plásmido sobrevivirán , conduciendo así a productividad mejorada de la proteína H E4 recombinante después de la selección .

El vector de expresión resu ltante q ue contiene H E4, designado "HE4-CI HDpa", fue confirmado mediante análisis de enzima de restricción , y el cADN de H E4 insertado fue confirmado también mediante secuenciado del inserto de cADN completo .

Transfección de plásmido HE4-CIHDpa en Células de Ovario de Hámster Chino (CHO) Se cultivaron células de Ovario de Hámster Chino (CH O-DG44) deficientes en Dihidrofolato reductasa (DH FR-) en medio de CHO libre de suero (Hyclone, Logan , Utah ; SH 30333) a 37°C , 5% C02. 0.5 millón o 1 millón de células de CHO-DG44 se sembraron en cada pozo de una placa de 24 pozos con 500 µ? de medio libre de suero por pozo y se incubaron d urante una noche en las condiciones antes descrita . 1 pg o 5 pg de plásmido H E4-CI H Dpa libre de endo-toxina se combinaron con 2 µ? de Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) en 1 00 µ? de medio Opti-MEM libre de suero. Después de incubar durante 20 minutos, se ag regaron los complejos DNA-Lipofectamine™ en cada pozo conteniendo células CHO-DG44. Las célu las se transfirieron después a hipoxantina y timidina ("HT") . El medio de HyQ PF-CHO suplementado con HT y permitido que se recuperara durante 2 d ías antes de transferirse a medio HyQ PF-C HO sin el suplemento HT para seleccionar transfectantes. Después de 28 d ías en el medio selectivo, crecieron y se recuperaron 1 millón de células transfectadas con 1 pg de plásmido con u na viabilidad celular >95% .

Producción y Purificación de proteína HE4 mediante células de CHO transfectadas La producción de proteína HE4 en sobrenadantes de cultivo de células de CHO transfectadas con plásmido HE4-CIHDpa fue evaluado usando un paquete comercialmente disponible, comercializado por Fujirebio Diagnostics, Inc., que se basa en un ensayo de ELISA de doble determinante (Emparedado), como se describe en Hellstrom I., et al., Cáncer Research 55:3695-3700 (2003), incorporado en la presente por referencia.

Como se describe en Hellstrom et al. (2003), un Ab 3D8 monoclonal (específico para un epitope en HE4) se aplicó durante una noche sobre los pozos de una placa de ensayo, después de lo cual se agregaron 100 µ? de sobrenadante de cultivo de CHO transfectado con plásmido HE4-CIHDpa a las células y se incubaron durante 1 hora. La placa de ensayo se incubó entonces con un segundo Ab, 2H5 monoclonal biotinizado (específico para un epitope HE4 diferente) durante 1 hora.

Se agregó TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina), un sustrato cromogénico para Peroxidasa (KPL, Gaithersburg, MD) y se permitió incubar durante 15 minutos. Se hicieron lecturas de densidad óptica (OD) a 450 nm. El OD450 de sobrenadante de CHO fue de 3.1, en comparación con 0.078 para medio solo, indicando que la proteína HE4 fue altamente expresada por células de CHO y secretadas al medio de cultivo.

Purificación de proteína HE4 recombinante mediante cromatografía de afinidad La proteína HE4 recombinante se purificó a partir de células de CHO de alta producción transfectadas con plásmido HE4-CIHDpa por cromatografía de afinidad como sigue.

Abs 3D8 y 2H5 monoclonales Anti-HE4 se acoplaron a Sepharose 4B activada con éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 6-aminohexanoico (Sigma, St. Louis, Missouri; #A9019). Brevemente descrito, 0.5 g de polvo se hincharon en HCI 1 mM durante 15 minutos. Las cuentas se drenaron y resuspendieron en 3 mg de Ab monoclonal anti-HE4 en 1 mi de solución de NaCI 0.5 M/NaHC03 0.1 M (pH 8.3). la columna se almacenó a 4°C durante una noche. Al día siguiente, la resina se bloqueó con Tris-HCI 1 M durante 2 horas. El Ab monoclonal anti-HE4 se removió lavando la resina con salina con búfer de fosfato (PBS). Se recolectó sobrenadante de cultivos a gran escala de de células de CHO transfectadas con plásmido HE4-CIHDpa y el pH se ajustó con NaHC03 hasta pH 8.0. El sobrenadante de células ajustado se aplicó a la columna, y la proteína HE4 unida se eluyó con glicina-HCI 0.1 M (pH 2.7) y se neutralizó con 200 µ? de Tris-HCI 2M. La proteína HE4 eluida se concentró con tubo filtro de centrífuga 10 kD (Millipore, Billerica, MA). La proteína recombinante HE4 purificada en columna se ensayó mediante ELISA Emparedado, que se realizó como se describe antes. Los resultados del Ensayo de ELISA se muestran a continuación en la TABLA 1.

TABLA 1: Presencia of proteína HE4 como se determina por Emparedado ELISA La proteína HE4 recombinante humana purificada en columna obtenida de células de CHO se obtuvo como se describe antes y se agrupó para usar en el desarrollo de un ensayo ELISA para detectar anticuerpo anti-HE4 en muestras de pacientes, como se describe en el EJEMPLO 2. La proteína HE4 recombinante humana se probó también en ensayos de ELISA para unir a anticuerpos anti-HE4 de ratón, y se determinó que los anticuerpos anti-HE4 de ratón reconocieron proteína HE4 humana tanto nativa como recombinante (datos no mostrados).

Conclusión: Estos resultados demuestran la clonación, expresión y purificación exitosa de la proteína HE4 recombinante humana a partir de células de CHO.

Ejemplo 2 Este Ejemplo describe el desarrollo exitoso de un Ensayo ELISA capaz de detectar anticuerpos anti-HE4 humanos que ocurren naturalmente en suero humano.

Métodos: Desarrollo de un Ensayo ELISA Para Detectar Anticuerpos Anti-HE4: Se desarrolló un ensayo ELISA para detectar/medir la cantidad de anticuerpos anti-HE4 en suero cpmp sigue, 0.6 pg/mL de proteína HE4 recombinante humana purificada (producida como se describe en el Ejemplo 1), se recubrieron durante una noche sobre los pozos de una placa de ensayo de ELISA. Los pozos de igualación se dejaron sin recubrir como controles para antecedentes. Después de bloquear durante 2 horas con 3% BSA/PBS, sueros o plasma humanos en diluciones de 1:20 y 1:40 (obtenidos como se describe más adelante) se agregaron a todos los pozos en la placa de ensayo ELISA. Todas las diluciones de muestras y reactivos se realizaron en 3% BS A/PBS.

Después de incubar con anticuerpo IgG anti-humano de ratón HRP-conjugated y sustrato TMB, la placa de ensayo se escaneó con un lector de placas Dynatech MR 5000 a 450 nm. El control de antecedente (pegajosidad debida a la naturaleza innata de IgG para pegarse no específicamente a los pozos de control de la placa de ensayo ELISA) se midió como OD450 en los pozos de control paralelo (a los cuales no se ha unido antígeno), y los valores de control antecedentes se substrajeron de la lectura en los pozos recubiertos para dar el nivel final de IgG.

Muestras de Plasma Obtenidas de Pacientes con cáncer de ovario Se realizó un estudio piloto en el cual las muestras de plasma se obtuvieron de diez pacientes con cáncer de ovario, la mayoría de los cuales tenía enfermedad avanzada (etapa lll-IV), y un sujeto femenino sano, y probados en el ensayo ELISA anti-HE4 con el fin de probar la presencia de anticuerpos anti-HE4 que ocurren naturalmente. Las muestras de plasma humano se agregaron a cada pozo de la placa de ELISA a diluciones 1:20 y 1:40 y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pozos se lavaron con PBS-Tween 20 y después se agregó anticuerpo IgG anti-humano de ratón HRP-conjugated diluido 1:1000 (Invitrogen, Carlsbad, California) a cada pozo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar la placa otra vez con PBS-Tween 20, se agregó SureBlue™ TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL) a cada pozo y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente, después de lo cual se terminó la interacción agregando solución de alto de TMB (KPL). La densidad óptica (OD) a 450 nanómetros se midió con un lector de placas DynaTech MR 5000 (DynaTech Laboratories, Inc.).

Resultados: Los resultados de la prueba del ensayo ELISA para la presencia/cantidad de anticuerpos anti-HE4 de las muestras suero humano se presentan en la Figura 1. Como se muestra en la Figura 1, uno de los diez pacientes con carcinoma de ovario (sujeto He213) tuvo una OD450 >1.0 para ambas diluciones, indicando así la presencia de anticuerpos anti-HE4. Se hace notar que el plasma del paciente He213 (con plasma que fue positivo para anti-HE4 abs), se encontró que es negativo para la presencia de antígeno HE4 usado el ensayo para detectar la presencia de antígeno HE4 como se describe en la Patente de U.S. No. 7,270,960, incorporada en la presente por referencia (datos no mostrados). Sin embargo, se mostró que células cultivadas de tumor derivadas del tumor del paciente He213 expresan el antígeno HE4 (datos no mostrados).

Conclusión: Los resultados descritos en este ejemplo demuestran el desarrollo exitoso de un ensayo ELISA capaz de detectar anticuerpos anti-HE4 que ocurren naturalmente en suero humano. Los resultados demuestran también la presencia de anticuerpos anti-HE4 en un sujeto con cáncer de ovario. Con base en nuestros estudios previos sobre anticuerpos del mesothelian, (ver Hellstrom I. et al., Cáncer Epidemiol Biomarkers Prev. 77(6): 1520-1526 (2008)), se espera que la presencia de, o un incremento en el título de anticuerpos para HE4 identificado en pacientes con cáncer de ovario que están, o que han estado bajo tratamiento (vía cirugía, quimioterapia, radiación y/o inmunoterapia), ya sea solo o en combinación con un hallazgo de una cantidad disminuida de antigeno HE4 (en comparación con la cantidad de base al inicio del tratamiento), o antígeno HE4 no circulante, indicará que la terapia de cáncer ha sido efectiva para dañar el tumor. Se espera además que una disminución en el título de anticuerpos anti-HE4, o anticuerpos anti-HE4 no detectables para HE4 en pacientes con cáncer de ovario bajo tratamiento, ya sea solo o en combinación con cantidad incrementada de antígeno HE4 circulante (en comparación con la cantidad de línea de base al inicio del tratamiento), indicará que la terapia de cáncer ha sido inefectiva para dañar el tumor, y/o indicativa de un relapso.

Ejemplo 3 Este Ejemplo describe un estudio en el cual el ensayo ELISA desarrollado para detectar la presencia/cantidad de anticuerpos de H E4 (descrito en el Ejemplo 2) se usó para titu lar la cantidad de anticuerpo anti-H E4 presente en suero de 3 pacientes con carcinoma de ovario y 20 sujetos femeninos sanos de control .

Métodos : M uestras de Suero Obtenidas de Pacientes con Cáncer de Ovario Como se muestra en la TABLA 2 a contin uación , se obtuvieron muestras de suero de tres pacientes con carcinoma de ovario de etapa temprana (l/l l ) y 20 sujetos femeninos humanos sanos en el Fred Hutchinson Cáncer Research Center (Seattle, Washington) , 4 de los cuales se muestran en la Tabla 2 a continuación . Los sueros fueron extra ídos de los sujetos y ensayados usando los métodos como se describe en el Ejemplo 2.

Resultados: Los sueros obtenidos como se describe antes se ensayaron en diluciones de 1 : 20 y 1 :40 usando el método de ELI SA descrito en el Ejemplo 2. Los resultado se resumen en la TABLE 2 a continuación .

TABLA 2: Resultados del análisis anticuerpo HE4 de suero de tres pacientes de cáncer de ovario y 4 controles sanos usando el ensayo ELISA para detectar/medir anticuerpos HE4.

Como se As resume en la TABLA 2, las tres muestras de suero de pacientes con carcinoma de ovario y tres de las 24 muestras de suero de sujetos femeninos sanos tuvieron una OD450 >0.5 para la dilución de 1:20. Como se muestra en la TABLÉ 2, los tres pacientes con cáncer de ovario tuvieron anticuerpos anti-HE4 en su suero, como se indica por una OD450 >0.5 a la dilución de 1:20. Estos resultados son consistentes con los resultados descritos en el Ejemplo 2, y demuestran además el desarrollo exitoso de un ensayo ELISA capaz de detectar anticuerpos anti-HE4 que ocurren naturalmente en suero humano. Los resultados demuestran también la presencia de anticuerpos anti-HE4 en sujetos con cáncer de ovario tanto en la etapa temprana como en la avanzada.

Ejemplo 4 Reactividad con fragmentos de HE4 desplegados como proteínas de fusión de fago La especificidad de epitope de los anticuerpos Anti-HE4 humanos se determinó mediante pruebas de la reactividad de muestras humanas que exhibieron reactividad anti-HE4 hacia fragmentos de HE4 expresada como proteínas de fusión con proteína de cubierta de fago pVIII en un ELISA de fago.

Clonación de fragmentos de HE4 en f88-4 cADN, preparado a partir de mARN aislado de células OvCar-3, sirvieron como plantilla para amplificación de PCR de las partes del gen que codifican los dominios de HE4 para clonar en el vector de despliegue de fago f88-4. Pares de cebador de PCR, enlistados en la Tabla 3, se construyeron para amplificación de las regiones de codificación indicadas en la Figura x. En los extremos 5' fueron sitios de restricción para Hindlll y PstI insertados para clonación en fusión con el péptido de señal pVIII y la proteína de cubierta madura pVIII. Tabla 3. Cebadores de PCR usados para amplificación de fragmentos de HE4 Cebador Secuencia 5' a 3' WAP W1F1 TGCTAAGCTTTGCC GAGAAGACTGGCGTGTGCCC N-WAP W1F2 TGCTAAGCTTTGCC AGCGAATGCGCCGACAACC N-WAP W1F3 TGCTAAGCTTTGCC GACCAGAACTGCACGCAAG N-WAP W1R1 CCTTCTGCAGG ATCATTGGGCAGAGAGCAG N-WAP W1R2 CCTTCTGCAGG GTCCGAGACGCACTCTTGC N-WAP W1R3 CCTTCTGCAGG GCTGCAGCACTTGAGGTTG N-WAP W2F1 TGCTAAGCTTTGCC AAGGAGGGTTCCTGCCCCCA C-WAP W2F2 TGCTAAGCTTTGCC AGCCAGTGTCCTGGCCAG C-WAP W2F3 TGCTAAGCTTTGCC CAGCTCGGCCTCTGTCGGGAC C-WAP W2R1 CCTTCTGCAGG GAAATTGGGAGTGACACAGGA C-WAP W2R2 CCTTCTGCAGG GTCCACCTGGCACTGGTCC C-WAP W2R3 CCTTCTGCAGG ATTGCGGCAGCATTTCATCTG C-WAP Los fragmentos de HE4 se amplificaron por separado de 0.5 µ? de cADN en una mezcla de reacción conteniendo 1 µ? de cada cebador adelante e inverso, Tris-HCI 75 mM (pH 8.8 a 25°C), (NH4)2S0420 mM, Tween 20 0.1% (v/v), MgCI2 2 mM, Taq-polimerasa 0.02 u/µ? (Abgene, Surrey, UK) y 0.1 mM de cada deoxinucleótido en un volumen final de 25 µ? con el siguiente ciclo de temperatura repetido 30 veces: incubaciones de 30 segundos a 95°C, 50°C y 72°C.

Los productos de PCR y f88-4, digeridos con Hindlll y Pstl, se ligaron conjuntamente y se transfectaron en E. coli JM109 donde después se seleccionaron clones en placas LB con tetraciclina. Dos clones de cada constructo fueron amplificados en E. coli JM109 y se preparó ADN de doble hebra para secuenciado de ADN. El secuenciado de ADN se realizó usando el paquete de secuenciado en ciclo Big dye terminator v1.1 y un cebador f88-4 de vector especpifico. Las reacciones de secuenciado se enviaron a CyberGene AB (Huddinge, Sweden) para análisis. Los datos brutos de la secuencia se analizaron usando software gratis Chromas versión 1.45 (Technelysium Pty Ltd., Australia). El secuenciado de nucleótidos verificó la inserción en marco con el péptido líder y la proteína de recubrimiento de fago maduro pVIII. Los insertos de HE4 demostraron identidad con las secuencias fragmentos HE4 esperadas (número de acceso AY212888). Las posiciones de los fragmentos de HE4 expresados como proteínas de fusión con proteína pVIII de cubierta usando los cebadores mostrados en la Tabla 1 se muestran en la Figura 2. Los números de aminoácidos se refieren a posiciones en la secuencia de aminoácidos de HE4 expuesta en SEQ ID NO: 2.

ELISA de fago Clones de fago de secuencia verificda se ampliaron, purificaron, concentraron con PEG/NaCI y se diluyeron en PBS para uso como antígeno de recubrimiento en el ensayo ELISA de fago directo, o alternativamente en 1% BSA en PBS como antígeno en el ELISA de fago de emparedado.

En el ELISA de fago directo los fagos fragmentos de HE4 se diluyeron en búfer de carbonato pH 9.2 y se recubrieron en pozos de microtítulo. La unión de ab's anti-HE4 huimano se determinó después de dilución del suero del paciente en PBS-1%BSA e incubación en pacas recubiertas con fago de HE4. La unión hlg se determinó mediante incubación con Ab Anti hlg HRP.

En el ELISA de fago de HE4 de emparedado las muestras del paciente se diluyeron con PBS-1%BSA y se incubaron en placas de microtítulo recubiertas con IgG anti-Human para adsorción del hlgG. Las placas recubiertas se incubaron con partículas de fago p VI 11 de HE4 diferentes en un volumen de 100 µ?/???? se agregaron. Después de dos horas de incubación, los pozos se lavaron y se agregó un anticuerpo anti-M13 de conejo (establecido en-casa). Después de incubación y lavado, se agregó un anticuerpo anti conejo de cerdo etiquetado HRP (Dako). Después del lavado final se agregó sustrato TMB y la placa se midió a 620 nm después de 5 minutos de incubación, se usó fago wt M-13 como control negativo en ambos ensayo de ELISA.

Aunque se ha ilustrado y descrito la modalidad preferida de la invención, se apreciará que se pueden hacer varios cambios en la presente sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención.

Listado de Secuencias SEQ ID NO:1: cADN de HE4 (humano).486bp, CDS: 38-418 GenBank: AY2 12888.1 Homo sapiens proteína HE4 (WFDC2 ) mARN, Cds completos TGAGAGAAAGCGGCCGCACCCCGCCCGGCATAGCACCATGCCTGCTT GTCGCCTAGGCCCGCTAGCCGCCGCCCTCCTCCTCAGCCTGCTGCTG TTCGGCTTCACCCTAGTCTCAGGCACAGGAGCAGAGAAGACTGGCGT GTGCCCCGAGCTCCAGGCTGACCAGAACTGCACGCAAGAGTGCGTCT CGGACAGCGAATGCGCCGACAACCTCAAGTGCTGCAGCGCGGGCTGT GCCACCTCTGCTCTCTGCCCAATGATAAGGAGGGTTCCTGCCCCCAGG TGAACATTAACTTTCCCCAGCTCGGCCTCTGTCGGGACCAGTGCCAGG TGGACAGCCAGTGTCCTGGCCAGATGAAATGCTGCCGCAATGGCTGT GGGAAGGTGTCCTGTGTCACTCCCAATTTCTGAGCTCCGGCCACCACC AGGCTGAGCAGTGAAGATAGAAAGTTTCTGCCTGGCCCTGCAGCGTGT TACAGCCCACC SEQ ID NO:2: proteína HE4 (humana) (124aa) GenBank: AA052683.1 proteína HE4 [Homo sapiens] MPACRLGPLAAALLLSLLLFGFTLVSGTGAEKTGVCPELQADQNCTQECV SDSECADNLKCCSAGCATFCSLPNDKEGSCPQVNINFPQLGLCRDQCQV DSQCPGQMKCCRNGCGKVSCVTPNF SEQ ID NO:3: (cebador hacia adelante) 5'-AAAAACCGGTATGCCTGCTTGTCGCCTAGG-3 SEQ ID NO:4 (cebador inverso) 5*-AAAACCTGCAGGTCAGAAATTGGGAGTGACAC-3'

Claims (24)

REIVI N DICACIONES

1 . U n método para detectar la presencia de células que expresan H E4 en un sujeto humano qie comprende determinar la presencia o cantidad de anticuerpos anti-H E4 en una muestra biológica obtenida del sujeto humano, en donde la presencia o cantidad de anticuerpos anti-H E4 en la muestra biológica es ind icativa de la presencia de células q ue expresan H E4 en el sujeto humano.

2. El método de la reivind icación 1 , en donde la presencia o cantidad de anticuerpos anti-H E4 en la muestra biológica se determina poniendo en contacto la muestra biológica con u n polipéptido codificado por u n polinucleótido que híbrida selectivamente con una secuencia por lo menos 90% idéntica a una secuencia que comprende por lo menos 20 n ucleótidos contiguos de SEQ I D NO : 1 .

3. El método de la reivindicación 1 , que comprende además comparar la cantidad determinada de anticuerpos anti-H E4 con u n estándar de referencia, en donde una cantidad de anticuerpo anti-H E4 detectada que es mayor que el estándar de referencia es indicativa de la presencia de células que expresan H E4 en el sujeto humano .

4. El método de la reivindicación 1 , que comprende además realizar por lo menos un ensayo de diagnóstico adicional para determinar si el sujeto con anticuerpos anti-H E4 tiene cáncer de ovario.

5. El método de la reivindicación 1 , en donde la unión del polipéptido a un anticuerpo anti-HE4 comprende detectar una señal seleccionada del grupo que consiste de un radionúclido, un fluoróforo, un evento de unión entre una molécula de avidin y una molécula de biotina , un evento de unión entre u na molécula de estreptavidin y una molécula de biotina, y u n producto de una reacción de enzima.

6. El método de la reivindicación 2, en donde la cantidad de anticuerpos anti-H E4 en la m uestra biológica se determina usando un ensayo de ELI SA.

7. El método de la reivindicación 3, en donde la presencia de células q ue expresan H E4 en un sujeto humano es indicativa de que el sujeto está padeciendo , o está en riesgo de, desarrollar cáncer de ovario.

8. El método de la reivindicación 1 , en donde la muestra biológica es un fluido biológico seleccionado del g rupo que consiste de sangre, plasma, suero , fluido ascítico , orina , saliva, lágrimas, fluido pleu ral, esputo, fluido vaginal y lavados obtenidos durante u n procedimiento médico.

9. El método de la reivindicación 1 en donde el sujeto humano está bajo tratamiento terapéutico para un cáncer asociado con células de tumor que expresan H E4.

10. U n método para monitorear la eficacia del tratamiento de un paciente h umano con cáncer bajo tratamiento terapéutico para un tumor que expresa H E4, el método que comprende: (a) proporcionar una muestra biológica de u n paciente humano bajo tratamiento terapéutico para u n cáncer asociado con células de tumor que expresan H E4; (b) determinar la presencia o cantidad de anticuerpos anti-H E4 en la muestra biológ ica pon iendo en contacto la muestra biológica con un polipéptido cod ificado por u n polinucleótido que híbrida selectivamente con una secuencia por lo menos 90% idéntica a una secuencia q ue comprende por lo menos 20 n ucleótidos contiguos de SEQ I D NOT; y (c) comparar la presencia o cantidad determinada de anticuerpos anti-HE4 con un estándar de anticuerpos de referencia, en donde una cantidad de anticuerpo anti-HE4 mayor q ue el estándar de referencia es indicativa de una respuesta positiva al tratamiento terapéutico para el cáncer.

1 1 . El método de la reivindicación 1 0, en donde el estándar de referencia se determina a partir de u na muestra biológica obtenida de sujetos sa nos de control.

12. El método de la reivindicación 1 0, en donde el estándar de referencia se determina a partir de una muestra biológ ica obtenida del paciente antes del tratamiento para cáncer.

13. El método de la reivindicación 1 0, en donde el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia por lo menos 95% idéntica a una secuencia que comprende por lo menos 1 0 aminoácidos contiguos de S EQ I D NO:2.

14. El método de la reivindicación 1 0, en donde la muestra biológica es un fluido biológico seleccionado del g ru po que consiste de sang re, plasma, suero, fluido ascítico , orina , saliva , lágrimas, fluido pleu ral, esputo, fluido vaginal y lavados obtenidos durante u n procedimiento méd ico.

15. El método de la reivindicación 10, en donde la cantidad de anticuerpos anti-H E4 se determina usando un ensayo ETI SA.

16. El método de la reivind icación 1 o 1 0, que comprende además determinar la presencia o cantidad de péptidos solubles relacionados con H E4 (SH RP) en la muestra biológica , en donde la presencia o cantidad de anticuerpos anti-HE4 en la muestra biológica en combinación con la presencia o cantidad de péptidos solubles relacionados con H E4 es indicativa de la presencia de células que expresan H E4 en el sujeto h umano.

17. El método de la reivindicación 1 o 10, en donde la muestra biológica es suero.

18. El método de la reivindicación 1 0, en donde el tratamiento incluye la administración de por lo menos u no de un agente quimioterapéutico, tratamiento con rad iación , terapia de anticuerpo, terapia de vacuna de cáncer, terapia de genes o trasplante de células madre.

19. El método de la reivindicación 10, en donde el tratamiento incluye cirug ía para remover por lo menos una porción de un tumor que expresa H E4.

20. U n paquete para detectar la presencia de células q ue expresan H E4 en un sujeto humano, el paquete que comprende reactivos específicos para la detección de la presencia o cantidad de anticuerpos anti-H E4 en una muestra biológica obtenida de un sujeto humano e i nstrucciones impresas para comparación de la presencia o cantidad detectada de anticuerpos anti-HE4 con un estándar de referencia.

21 . El paquete de la reivindicación 20, en donde el estándar de referencia se selecciona del grupo que consiste de un umbral numérico específico, u na muestra de control negativo para evaluación concu rrente e información estad ística que correlaciona la cantidad de anticuerpos anti-H E4 detectados con la probabilidad de la presencia de células que expresan H E4 en el sujeto.

22. El paq uete de la reivindicación 20, en donde los reactivos específicos para la detección de anticuerpos anti-H E4 comprenden un polipéptido codificado por un polin ucleótido que h ibrida selectivamente con u na secuencia que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de SEQ I D NO : 1 .

23. El paquete de la reivindicación 20, en donde los reactivos específicos para la detección de anticuerpos anti-H E4 comprenden u n polipéptido que comprende una secuencia por lo menos 95% idéntica a una secuencia que comprende por lo menos 1 0 aminoácidos contig uos de SEQ I D NO :2.

24. El paq uete de la reivindicación 20, en donde el polipéptido está unido a un soporte sólido.