JP5754792B2 - 大腸癌の予後予測方法 - Google Patents
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本発明の実施における遺伝子発現の比較については、臨床検査、細胞生物学分野で用いられている手法のうちから適宜選択可能であり、本発明を限定するものでは無いが、細胞から抽出したmRNAを逆転写とPCRにより増幅しその発現量を定量的に検出する手法が適しており、より具体的には上述の通り、TaqMan法やSYBR法(Molecular Probes Inc.)が広く用いられており適している。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
All Prep DNA/RNA Mini Kit(Qiagen社製)を用いてDNAとtotal RNAの抽出を行った。2mlチューブへ製品付属のRLT plusバッファーを600μl添加し、βメルカプトエタノール6μlを添加後、凍結検体を加え、径が5mmのステンレススチールビーズ(Qiagen社製)を1個加え、Qiagen Mixer Mill MM300(Qiagen社製)を用いて検体の超音波破砕(30Hz,10分間)を行った。破砕した検体をAll Prep DNAスピンカラム(Qiagen社製)に移し、10000rpm、30秒間遠心した。ろ液は後述のRNA抽出に用いた。遠心後のスピンカラムを室温または4℃において、新しい2mlチューブにセットしてインキュベートした。このスピンカラムは後述のDNA抽出に用いた。
上述のRNAを含むろ液に、70%エタノールを400μl添加し、ピペットでよく混和した後、RNeasyスピンカラムに600μlをアプライし、11000rpm、20秒間遠心した。廃液を捨て、残りのろ液を同じカラムにアプライし、11000rpm、20秒間遠心した。700μlのRW1バッファー(製品付属)をカラムに添加し、15分間インキュベート後、11000rpm、20秒間遠心して液を捨てた。スピンカラムを2mlコレクションチューブに移し、500μlのRPEバッファー(製品付属)を加えて11000rpm、20秒間遠心し、ろ液を捨てた。更に500μlのRPEバッファーを加えて11000rpm、20秒間遠心し、ろ液を捨てた。これらの操作によりRNA試料の洗浄を行った。カラムを新しい1.5mlチューブに移し、50μlのRNaseフリー水を直接カラムのメンブレンに添加し、11000rpm、1分間遠心して全RNA(total RNA)を溶出した。
内因性コントロール:βアクチン(製品番号:4326315E)
ターゲット遺伝子:TWIST1(製品番号:Hs01675818_s1)、及びEZH2(Hs00544830_m1)
10ngのcDNA、1×TaqMan Gene Expression Master Mix(製品付属)、1×TaqMan Probe Mix(900nM each primer、250nM FAM dye−labeled TaqMan MGB probe)に滅菌水を加え、全量を20μlとした。ABI Prism 7900HT sequence detection system(Applied Biosystems,Warrington,UK)を使用して定量PCRを行った。温度条件は、(1)50℃−2分、95℃−10分の後、(2)95℃−15秒、60℃−30秒にて40サイクル行った。全ての反応は二重測定にて行い、またmRNAの発現レベルは検体番号528を標準サンプル(発現量=1)とし、2−ΔΔCT法(ΔΔCt法,Applied Biosystems)にて解析し相対発現量を求めた。上述の通り、本法においては基準となるサンプル(標準サンプル)と比較して、未知サンプルにおける値を測定するため、標準サンプルは任意の検体で良いが、発現量が極端に高くも低くもない検体からNo.528を選択した。
P = 0.0008, Odd比5.042(95%信頼区間 1.934-13.146 Fisherテストによる)
P = 0.0001, Odd比7.155(95%信頼区間 2.646-19.350 Fisherテストによる)
P = 0.0032, Odd比3.869(95%信頼区間 1.581-9.469 Fisherテストによる)
P = 0.0008, Odd比5.562(95%信頼区間 1.966-15.735 Fisherテストによる)
Claims (1)
- 大腸癌罹患者の正常大腸粘膜に由来する細胞におけるHomo sapiens twist homolog 1(Drosophila)遺伝子及び/またはEnhancer of zeste homolog 2(Drosophila)遺伝子の発現上昇を検出する、大腸癌の予後予測方法において、ROC曲線に基づいて求められるカットオフ値よりも高い遺伝子発現レベルのとき、予後不良の可能性有りと判定することを特徴とする、大腸癌の予後予測方法。
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JP2009220502A JP5754792B2 (ja) | 2009-09-25 | 2009-09-25 | 大腸癌の予後予測方法 |
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