JP4253094B2 - 予後判定方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ３（以下「ＧａｌＮＡｃＴ３」という）を用いた腺癌患者の予後判定方法及び予後検査薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌の早期発見のための診断法の確立は、癌の治療成績を向上させるための重要な課題であり、例えば癌化によって変異を受けた細胞表面の糖蛋白又は糖脂質上の糖鎖に対する抗体が、いわゆる癌マーカーとして膵臓癌や卵巣癌の診断に用いられている（ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５等）。
【０００３】
一方、癌の治療法や治療時期を決定する上では、早期診断のみならず、確定診断或いは手術後の予後因子の解析法を確立することも重要である。過去には、手術などにより摘出した腫瘍組織の分化度を評価することにより予後を推定する方法が採られていたが、分化度が独立した予後規定因子であるかどうかは不明であり、また組織学的分化度は判定者の主観に依存し、予後判定が不正確になりがちであった。更に、大腸癌においては高分化腺癌が多く、中分化・低分化腺癌が少ないこともあり組織像自体はあまり考慮されないこと、組織型で診断するには診断の再現性が難しいこと、或いは評価が困難である例が存在し分化度の組織診断が曖昧なものになる等の問題があり、予後を判定することは困難であるとされていた（消化器内視鏡Vol.8 No.7 963-964(1996)、同Vol.8 No.7 969-972(1996)）。
【０００４】
その後、癌患者の予後を判定する方法としては、血管新生に関連する血管透過性因子（ＶＰＦ）を検出することによって予後を判定するもの（特開平６−２８１６４９号公報）、タンパク質チロシンホスファターゼα（ＰＴＰα）を用いた結腸直腸癌の予後判定法（特開平８−５６６９９号公報）、特定の遺伝子の突然変異の状況を観察することより新生物組織の予後を判定するもの（特表平６−５０９７０１号公報、特表平７−５００２４１号公報）等が知られるようになった。 しかし、これまでの予後因子による判定は、術後の経過を随時追跡することを必要としたり、検出が複雑である等の問題があり、実際の臨床の場で即時的に簡便に利用することは困難である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、大腸癌、胃癌等の腺癌患者の予後を簡易に診断するための方法及び診断薬を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、斯かる実情の下、ＧａｌＮＡｃＴ３が、腺組織に特異的に発現していることに着目し、当該組織が癌化して脱分化した場合の組織学的脱分化度とＧａｌＮＡｃＴ３の発現量及び癌患者の生存期間との関連性を検討した結果、ＧａｌＮＡｃＴ３の発現量と癌患者の生存期間には組織学的分化度とは別に独立して有意な相関性が認められ、腺癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ３の発現量を測定することにより患者の予後を判定できること、更に特定の抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体を用いることにより当該ＧａｌＮＡｃＴ３を特異的に測定できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち本発明は、腺癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ３を測定することを特徴とする腺癌患者の予後判定方法を提供するものである。
【０００８】
また本発明は、腺癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ３測定試薬からなる腺癌患者の予後検査薬を提供するものである。
【０００９】
更に本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の予後判定方法は、腺癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ３を測定することを特徴とするものである。
【００１１】
ＧａｌＮＡｃＴ３は、現在までに６種類のアイソザイムの存在が知られているＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃＴ）１〜６の一つであり、細胞表面のムチン型（Ｏ型）糖鎖をもつ糖蛋白質の生合成において、その起点となる蛋白質のセリン又はトレオニン残基にＮ−アセチルガラクトサミンを結合させる反応に関与する酵素である。
【００１２】
最近、本発明者らは、ＧａｌＮＡｃＴ３が、腺組織に特異的に発現していることを見出し、また癌との関連では、ＧａｌＮＡｃＴ３が分化型腺癌細胞で発現し、低分化型腺癌細胞では発現しないという報告がなされている（Sutherlin et al.,Cancer Res ．57，4744-4748(1997））。しかし、ＧａｌＮＡｃＴ３の臨床的意義は明らかにされておらず、腺癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ３の発現量が癌患者の生存期間と高い相関を示すことは全く予測することができなかったことである。
【００１３】
本発明の予後判定方法において用いられる腺癌組織とは、胃癌、大腸癌、甲状腺癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、すい臓癌等の腺癌が発症した腺組織いい、具体的には、手術や生検等によって摘出された癌組織が用いられる。
【００１４】
本発明の予後判定方法におけるＧａｌＮＡｃＴ３の測定は、摘出された癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ３を特異的に検出できる方法であれば特に限定されず、例えば酵素免疫測定（染色）法、ＥＬＩＳＡ法等の免疫学的手法を挙げることができ、ＧａｌＮＡｃＴ３の有無を肉眼、顕微鏡下、吸光、蛍光等で判定することにより行われる。好ましい測定法としては、簡便性の点から抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体を用いた免疫染色法が挙げられる。
【００１５】
従って、本発明の予後検査薬は、当該ＧａｌＮＡｃＴ３測定試薬、即ち免疫学的測定試薬、好ましくは抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体を含む免疫測定試薬が好ましい。
【００１６】
斯かる抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体としては、ＧａｌＮＡｃＴ３を特異的に認識できるものであれば特に限定されないが、通常はＧａｌＮＡｃＴ３又はそれと同等の抗原性を有するペプチド、例えばＧａｌＮＡｃＴ３タンパク中の特定のアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体が挙げられ、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。
【００１７】
ここで、ＧａｌＮＡｃＴ３中の特定のアミノ酸配列を有するペプチドの選定方法としては、例えば、ＧａｌＮＡｃＴ３のアミノ酸配列から、Ｇｅｎｏｍｅ Ｎｅｔ内のアミノ酸配列より３次元構造を推定するモデリングツールを用いてＧａｌＮＡｃＴ３の立体構造を推定し、その表面に露出しているアミノ酸配列のうち他のＧａｌＮＡｃＴ（例えば、ＧａｌＮＡｃＴ１、ＧａｌＮＡｃＴ２等）のアミノ酸配列と相違する部分を抽出する方法が挙げられる。
【００１８】
斯かる手法により選定された好適なペプチドとして、例えばヒトＧａｌＮＡｃＴ３タンパクの一部分である配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド又は該ペプチドを含有するペプチドが挙げられ、該ペプチドに対する抗体は、高い抗体価を有する新規抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体として有用である。
【００１９】
尚、これらのペプチド類は、ペプチド合成機等を用いて化学合成することにより得ることができる。
【００２０】
抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体の調製は常法に従って行なわれるが、例えば以下の操作によればＧａｌＮＡｃＴ３に対するポリクローナル抗体を得ることができる。即ち、１）ペプチド（例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド）をＥＤＣ等の架橋剤によりアセチル化牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等のキャリアー蛋白と結合し、免疫用コンジュゲートを作成する。２）これを注射直前に完全もしくは不完全フロイントアジュバント中で乳化、懸濁させ、ウサギ、ヤギ、ウマ等の動物の皮下又は腹腔内に２〜３週間毎に数回（好ましくは３〜４回）注射を繰り返すことにより動物を免疫する。３）最終免疫より約５〜７日後、免疫動物から採血し、血清画分を常法に従って調整しポリクローナル抗体を得る。４）さらに、必要に応じてプロティンＧセフアロースカラム等により抗体を精製する。
【００２１】
斯かる方法により、正常腺組織及び腺癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ３の発現量を測定したところ、胃、大腸等の正常腺上皮細胞においては生涯活動期にあることから、ＧａｌＮＡｃＴ３が多く発現され（図２参照）、一方、癌組織においてはＧａｌＮＡｃＴ３が発現している場合（図３参照）と、その発現が消失している場合（図４参照）があった。そこで本発明においては、後記試験例に示すように、腺癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ３発現量と組織学的分化度及び生存期間と比較したところ、組織学的分化度に関係なく、患者の生存期間と有意に相関し、ＧａｌＮＡｃＴ３を発現している場合には生存期間が長く、発現していない場合には生存期間が短いことが示された（図５参照）。即ち、本発明の予後判定法によれば、例えば手術時に摘出された腺癌組織についてＧａｌＮＡｃＴ３量を測定し、解析することにより、その後の経過観察を行うことなく腺癌患者の予後を判定することができる。
【００２２】
本発明の予後検査薬の好ましい態様は、抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体、特に配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体を含むものであるが、当該抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体は、標識された抗体でもよい。ここで標識抗体としては、放射性同位元素、酵素、蛍光色素、色素等が挙げられる。また、抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体以外に第二抗体を含んでいてもよく、これは抗体作製時に用いた動物の免疫グロブリンに対する抗体が好ましく、例えば、ウサギを使用した場合は抗ウサギ抗体、ヤギを使用した場合は抗ヤギ抗体が好ましい。
【００２３】
【実施例】
実施例１ ポリクローナル抗体の製造
（１）アセチル化ＢＳＡの調製
ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）２００mgに２０mlの５０％酢酸ナトリウム溶液を徐々に加え、４℃に静置し溶解後、無水酢酸３４０μｌを滴下、攪拌せずに４℃終夜静置して拡散させた。精製水２Ｌ×２回に透析して酢酸を除去後、５０mMリン酸緩衝液（ＰＢ）pH８．０（５００ml）に透析してバッファー置換した。透析内容物を回収してＢＩＯ−ＲＡＤ社プロテインアッセイキットによりタンパク質濃度を測定、蛍光試薬によりアミノ基残存量を定量しアセチル化を確認した。
【００２４】
（２）ペプチドの導入
公知のＧａｌＮＡｃＴ３のアミノ酸配列から、Ｇｅｎｏｍｅ Ｎｅｔ内のアミノ酸配列より３次元構造を推定するモデリングツールを用いてＧａｌＮＡｃＴ３の立体構造を推定し、その表面に露出しているアミノ酸配列のうち、ＧａｌＮＡｃＴ１及びＧａｌＮＡｃＴ２のアミノ酸配列と相違する部分を抽出することにより選定されたアミノ酸配列のＮ末端にＬｙｓを付加した配列番号１のペプチドをペプチド合成機（Rainin社製）により作製し、それを少量とり５０mM ＰＢ，pH８．０への溶解性が高いことを確認ののち、アセチル化ＢＳＡへの導入を行った。
【００２５】
アセチル化ＢＳＡ溶液（ＢＳＡ量：１０mg（１．５×１０^-7mole））にモル比でペプチドの５０倍となるように架橋剤であるＥＤＣ ７０．９mg（３．７×１０^-4mol ）粉末を加え、溶解させた。次に約０．２mlの５０mM ＰＢ，pH８．０に溶解した上記ペプチド（モル比でアセチル化ＢＳＡの５０倍量）を加えVortex後、４℃終夜静置した。反応終了後あらかじめＰＢＳ（−）にて平衡化したＰＤ−１０に２mlの反応液をアプライし、０．５ml／tubeずつ分画した。回収したフラクションのタンパク質濃度、アミノ基残存量を定量し、上記ペプチドが導入されたことを確認した（アセチル化ＢＳＡ１分子当たり１６．６分子のペプチド）。
【００２６】
上記で得られたペプチド−ＢＳＡ結合物は、完全フロイントアジュバントと混和後、ウサギ（ＳＰＥ，日本白色，雄９週齢）の背部皮下に初回免疫した。その後、２週間隔で３回追加免疫を行った。免疫前及び各免役後約１週間で採血、抗体価の推移を下記ＥＬＩＳＡ法で検定した。
【００２７】
（３）抗体価測定方法
マイクロタイタープレートのwellに５，２．５，１．０，０．５，０．１μｇ／mlの濃度に調製した各ペプチド５０μｌを固相化した。１％ゼラチン−ＰＢＳ（−）でブロッキング後、１０倍〜１０００００倍希釈（０．１％アセチル化ＢＳＡで希釈）した抗血清を５０μｌずつ添加し３７℃、１時間反応させた。ウエルを０．０５％Tween ２０含有ＰＢＳ（−）にて洗浄後、３０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体５０μｌを加え、室温１時間静置した。ウエルを洗浄したのち基質溶液（O-Phenylenediamine）１００μｌを加えて室温５分間反応させた。高い反応値が得られる抗原濃度と抗血清の希釈率の条件をキャリブレーションカーブ（図１）より求めた。これより、抗原濃度は０．５μｇ／ml、抗血清の希釈率は１０００〜１００万倍と決定した。４回の免疫により約１０万倍以上の抗体価が認められたため、全血の採血を行ない血清画分を得た。
【００２８】
以上のようにして得られた抗血清を用いて、下記試験例１に示すとおり正常粘膜組織の免疫染色を行った。結果、ＧａｌＮＡｃＴ３を多く発現している腺細胞の染色が確認された（図２参照）。
従って、得られた抗血清はＧａｌＮＡｃＴ３の測定においても１０００〜１００万倍希釈の範囲で好ましくは２０００〜１０万倍希釈の範囲で使用可能と考えられる。
【００２９】
試験例１
（１）ＧａｌＮＡｃＴ３発現量の判定
摘出された１０６例の大腸癌について、パラフィン包埋切片でのＧａｌＮＡｃＴ３発現量を免疫染色法で判定した。すなわち、実施例１で得られた抗血清を５０００倍希釈したものを第一抗体として用い、その後第二抗体としてアルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて検体を免疫染色することにより判定した。
【００３０】
図２に正常粘膜組織での染色例を、図３及び４に癌部での染色例を示す。
図２に示すように、正常粘膜組織では、全例においてＧａｌＮＡｃＴ３が細胞質に顆粒状に発現していた。一方、大腸癌１０６例中６７例（６３．２％）では、細胞質に顆粒状、若しくはびまん性にＧａｌＮＡｃＴ３が発現していたが、残りの３９例（３６．８％）は、図４に示すようにＧａｌＮＡｃＴ３の発現を認めなかった。
【００３１】
（２）ＧａｌＮＡｃＴ３の発現と大腸癌の予後規定因子の相関性
ＧａｌＮＡｃＴ３の発現と生存期間の比較を全症例及び組織型別に症例を分類し解析した。判定は、腫瘍組織細胞数の５０％以上が染色された場合を陽性、５０％未満を陰性とした。
【００３２】
結果を図５〜７に示す。全症例及び高分化型癌の症例において、ＧａｌＮＡｃＴ３陰性症例では５年、１０年生存率が有意に低かった。
尚、組織型及びステージとは統計学的相関関係は認められなかった。
【００３３】
【発明の効果】
本発明の予後判定方法を用いることにより、大腸癌、胃癌等の腺癌患者の予後を、経過観察を行わずに簡易に判定することができ、臨床診断や治療法の決定において有力な情報を与える。
【００３４】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】抗ペプチド抗血清測定条件検討のための検量曲線を示す図である。
【図２】抗ＧａｌＮＡｃＴ３ポリクローナル抗体による正常大腸粘膜の染色結果を示す図である。
【図３】抗ＧａｌＮＡｃＴ３ポリクローナル抗体による大腸癌の染色結果を示す図である。（陽性例）
【図４】抗ＧａｌＮＡｃＴ３ポリクローナル抗体による大腸癌の染色結果を示す図である。（陰性例）
【図５】抗ＧａｌＮＡｃＴ３ポリクローナル抗体による大腸癌（全症例）の染色結果と各症例での生存期間を比較した図である。図中のＰ値はログランク有意差検定法により求められた有意差を示す。
【図６】抗ＧａｌＮＡｃＴ３ポリクローナル抗体による大腸癌（高分化型）の染色結果と各症例での生存期間を比較した図である。図中のＰ値はログランク有意差検定法により求められた有意差を示す。
【図７】抗ＧａｌＮＡｃＴ３ポリクローナル抗体による大腸癌（中分化型）の染色結果と各症例での生存期間を比較した図である。図中のＰ値はログランク有意差検定法により求められた有意差を示す。

Claims (9)

1. 腺癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ３を測定することを特徴とする腺癌患者の予後判定方法。
2. 抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体を用いてＧａｌＮＡｃＴ３を測定するものである請求項１記載の腺癌患者の予後判定方法。
3. 抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体である請求項２記載の腺癌患者の予後判定方法。
4. 腺癌が、大腸癌又は胃癌である請求項１〜３のいずれか１項記載の腺癌患者の予後判定方法。
5. 腺癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ３測定試薬からなる腺癌患者の予後検査薬。
6. ＧａｌＮＡｃＴ３測定試薬が、抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体を含むものである請求項５記載の腺癌患者の予後検査薬。
7. 抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体である請求項６記載の腺癌患者の予後検査薬。
8. 腺癌が、大腸癌又は胃癌である請求項５〜７のいずれか１項記載の腺癌患者の予後検査薬。
9. 配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体。

Images