JP2001165933A - 予後判定方法 - Google Patents
予後判定方法Info
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- JP2001165933A JP2001165933A JP34742099A JP34742099A JP2001165933A JP 2001165933 A JP2001165933 A JP 2001165933A JP 34742099 A JP34742099 A JP 34742099A JP 34742099 A JP34742099 A JP 34742099A JP 2001165933 A JP2001165933 A JP 2001165933A
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- adenocarcinoma
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 腺癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ３を測定す
ることを特徴とする腺癌患者の予後判定方法、腺癌組織
中のＧａｌＮＡｃＴ３測定試薬からなる腺癌患者の予後
検査薬、及び配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチ
ドに対する抗体。 【効果】 大腸癌、胃癌等の腺癌患者の予後を、経過観
察を行わずに簡易に判定することができ、臨床診断や治
療法の決定において有力な情報を与える。
ることを特徴とする腺癌患者の予後判定方法、腺癌組織
中のＧａｌＮＡｃＴ３測定試薬からなる腺癌患者の予後
検査薬、及び配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチ
ドに対する抗体。 【効果】 大腸癌、胃癌等の腺癌患者の予後を、経過観
察を行わずに簡易に判定することができ、臨床診断や治
療法の決定において有力な情報を与える。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｎ−アセチルガラ
クトサミントランスフェラーゼ３（以下「ＧａｌＮＡｃ
Ｔ３」という）を用いた腺癌患者の予後判定方法及び予
後検査薬に関する。
クトサミントランスフェラーゼ３（以下「ＧａｌＮＡｃ
Ｔ３」という）を用いた腺癌患者の予後判定方法及び予
後検査薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】癌の早期発見のための診断法の確立は、
癌の治療成績を向上させるための重要な課題であり、例
えば癌化によって変異を受けた細胞表面の糖蛋白又は糖
脂質上の糖鎖に対する抗体が、いわゆる癌マーカーとし
て膵臓癌や卵巣癌の診断に用いられている（ＣＡ１９−
９、ＣＡ１２５等）。
癌の治療成績を向上させるための重要な課題であり、例
えば癌化によって変異を受けた細胞表面の糖蛋白又は糖
脂質上の糖鎖に対する抗体が、いわゆる癌マーカーとし
て膵臓癌や卵巣癌の診断に用いられている（ＣＡ１９−
９、ＣＡ１２５等）。
【０００３】一方、癌の治療法や治療時期を決定する上
では、早期診断のみならず、確定診断或いは手術後の予
後因子の解析法を確立することも重要である。過去に
は、手術などにより摘出した腫瘍組織の分化度を評価す
ることにより予後を推定する方法が採られていたが、分
化度が独立した予後規定因子であるかどうかは不明であ
り、また組織学的分化度は判定者の主観に依存し、予後
判定が不正確になりがちであった。更に、大腸癌におい
ては高分化腺癌が多く、中分化・低分化腺癌が少ないこ
ともあり組織像自体はあまり考慮されないこと、組織型
で診断するには診断の再現性が難しいこと、或いは評価
が困難である例が存在し分化度の組織診断が曖昧なもの
になる等の問題があり、予後を判定することは困難であ
るとされていた（消化器内視鏡Vol.8 No.7 963-964(199
6)、同Vol.8 No.7 969-972(1996)）。
では、早期診断のみならず、確定診断或いは手術後の予
後因子の解析法を確立することも重要である。過去に
は、手術などにより摘出した腫瘍組織の分化度を評価す
ることにより予後を推定する方法が採られていたが、分
化度が独立した予後規定因子であるかどうかは不明であ
り、また組織学的分化度は判定者の主観に依存し、予後
判定が不正確になりがちであった。更に、大腸癌におい
ては高分化腺癌が多く、中分化・低分化腺癌が少ないこ
ともあり組織像自体はあまり考慮されないこと、組織型
で診断するには診断の再現性が難しいこと、或いは評価
が困難である例が存在し分化度の組織診断が曖昧なもの
になる等の問題があり、予後を判定することは困難であ
るとされていた（消化器内視鏡Vol.8 No.7 963-964(199
6)、同Vol.8 No.7 969-972(1996)）。
【０００４】その後、癌患者の予後を判定する方法とし
ては、血管新生に関連する血管透過性因子（ＶＰＦ）を
検出することによって予後を判定するもの（特開平６−
２８１６４９号公報）、タンパク質チロシンホスファタ
ーゼα（ＰＴＰα）を用いた結腸直腸癌の予後判定法
（特開平８−５６６９９号公報）、特定の遺伝子の突然
変異の状況を観察することより新生物組織の予後を判定
するもの（特表平６−５０９７０１号公報、特表平７−
５００２４１号公報）等が知られるようになった。 し
かし、これまでの予後因子による判定は、術後の経過を
随時追跡することを必要としたり、検出が複雑である等
の問題があり、実際の臨床の場で即時的に簡便に利用す
ることは困難である。
ては、血管新生に関連する血管透過性因子（ＶＰＦ）を
検出することによって予後を判定するもの（特開平６−
２８１６４９号公報）、タンパク質チロシンホスファタ
ーゼα（ＰＴＰα）を用いた結腸直腸癌の予後判定法
（特開平８−５６６９９号公報）、特定の遺伝子の突然
変異の状況を観察することより新生物組織の予後を判定
するもの（特表平６−５０９７０１号公報、特表平７−
５００２４１号公報）等が知られるようになった。 し
かし、これまでの予後因子による判定は、術後の経過を
随時追跡することを必要としたり、検出が複雑である等
の問題があり、実際の臨床の場で即時的に簡便に利用す
ることは困難である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、大腸癌、胃
癌等の腺癌患者の予後を簡易に診断するための方法及び
診断薬を提供することにある。
癌等の腺癌患者の予後を簡易に診断するための方法及び
診断薬を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、斯かる実情
の下、ＧａｌＮＡｃＴ３が、腺組織に特異的に発現して
いることに着目し、当該組織が癌化して脱分化した場合
の組織学的脱分化度とＧａｌＮＡｃＴ３の発現量及び癌
患者の生存期間との関連性を検討した結果、ＧａｌＮＡ
ｃＴ３の発現量と癌患者の生存期間には組織学的分化度
とは別に独立して有意な相関性が認められ、腺癌組織中
のＧａｌＮＡｃＴ３の発現量を測定することにより患者
の予後を判定できること、更に特定の抗ＧａｌＮＡｃＴ
３抗体を用いることにより当該ＧａｌＮＡｃＴ３を特異
的に測定できることを見出し、本発明を完成した。
の下、ＧａｌＮＡｃＴ３が、腺組織に特異的に発現して
いることに着目し、当該組織が癌化して脱分化した場合
の組織学的脱分化度とＧａｌＮＡｃＴ３の発現量及び癌
患者の生存期間との関連性を検討した結果、ＧａｌＮＡ
ｃＴ３の発現量と癌患者の生存期間には組織学的分化度
とは別に独立して有意な相関性が認められ、腺癌組織中
のＧａｌＮＡｃＴ３の発現量を測定することにより患者
の予後を判定できること、更に特定の抗ＧａｌＮＡｃＴ
３抗体を用いることにより当該ＧａｌＮＡｃＴ３を特異
的に測定できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】即ち本発明は、腺癌組織中のＧａｌＮＡｃ
Ｔ３を測定することを特徴とする腺癌患者の予後判定方
法を提供するものである。
Ｔ３を測定することを特徴とする腺癌患者の予後判定方
法を提供するものである。
【０００８】また本発明は、腺癌組織中のＧａｌＮＡｃ
Ｔ３測定試薬からなる腺癌患者の予後検査薬を提供する
ものである。
Ｔ３測定試薬からなる腺癌患者の予後検査薬を提供する
ものである。
【０００９】更に本発明は、配列番号１のアミノ酸配列
を有するペプチドに対する抗体を提供するものである。
を有するペプチドに対する抗体を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の予後判定方法は、腺癌組
織中のＧａｌＮＡｃＴ３を測定することを特徴とするも
のである。
織中のＧａｌＮＡｃＴ３を測定することを特徴とするも
のである。
【００１１】ＧａｌＮＡｃＴ３は、現在までに６種類の
アイソザイムの存在が知られているＮ−アセチルガラク
トサミントランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃＴ）１〜６
の一つであり、細胞表面のムチン型（Ｏ型）糖鎖をもつ
糖蛋白質の生合成において、その起点となる蛋白質のセ
リン又はトレオニン残基にＮ−アセチルガラクトサミン
を結合させる反応に関与する酵素である。
アイソザイムの存在が知られているＮ−アセチルガラク
トサミントランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃＴ）１〜６
の一つであり、細胞表面のムチン型（Ｏ型）糖鎖をもつ
糖蛋白質の生合成において、その起点となる蛋白質のセ
リン又はトレオニン残基にＮ−アセチルガラクトサミン
を結合させる反応に関与する酵素である。
【００１２】最近、本発明者らは、ＧａｌＮＡｃＴ３
が、腺組織に特異的に発現していることを見出し、また
癌との関連では、ＧａｌＮＡｃＴ３が分化型腺癌細胞で
発現し、低分化型腺癌細胞では発現しないという報告が
なされている（Sutherlin et al.,Cancer Res ．57，47
44-4748(1997））。しかし、ＧａｌＮＡｃＴ３の臨床的
意義は明らかにされておらず、腺癌組織中のＧａｌＮＡ
ｃＴ３の発現量が癌患者の生存期間と高い相関を示すこ
とは全く予測することができなかったことである。
が、腺組織に特異的に発現していることを見出し、また
癌との関連では、ＧａｌＮＡｃＴ３が分化型腺癌細胞で
発現し、低分化型腺癌細胞では発現しないという報告が
なされている（Sutherlin et al.,Cancer Res ．57，47
44-4748(1997））。しかし、ＧａｌＮＡｃＴ３の臨床的
意義は明らかにされておらず、腺癌組織中のＧａｌＮＡ
ｃＴ３の発現量が癌患者の生存期間と高い相関を示すこ
とは全く予測することができなかったことである。
【００１３】本発明の予後判定方法において用いられる
腺癌組織とは、胃癌、大腸癌、甲状腺癌、乳癌、前立腺
癌、肺癌、すい臓癌等の腺癌が発症した腺組織いい、具
体的には、手術や生検等によって摘出された癌組織が用
いられる。
腺癌組織とは、胃癌、大腸癌、甲状腺癌、乳癌、前立腺
癌、肺癌、すい臓癌等の腺癌が発症した腺組織いい、具
体的には、手術や生検等によって摘出された癌組織が用
いられる。
【００１４】本発明の予後判定方法におけるＧａｌＮＡ
ｃＴ３の測定は、摘出された癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ
３を特異的に検出できる方法であれば特に限定されず、
例えば酵素免疫測定（染色）法、ＥＬＩＳＡ法等の免疫
学的手法を挙げることができ、ＧａｌＮＡｃＴ３の有無
を肉眼、顕微鏡下、吸光、蛍光等で判定することにより
行われる。好ましい測定法としては、簡便性の点から抗
ＧａｌＮＡｃＴ３抗体を用いた免疫染色法が挙げられ
る。
ｃＴ３の測定は、摘出された癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ
３を特異的に検出できる方法であれば特に限定されず、
例えば酵素免疫測定（染色）法、ＥＬＩＳＡ法等の免疫
学的手法を挙げることができ、ＧａｌＮＡｃＴ３の有無
を肉眼、顕微鏡下、吸光、蛍光等で判定することにより
行われる。好ましい測定法としては、簡便性の点から抗
ＧａｌＮＡｃＴ３抗体を用いた免疫染色法が挙げられ
る。
【００１５】従って、本発明の予後検査薬は、当該Ｇａ
ｌＮＡｃＴ３測定試薬、即ち免疫学的測定試薬、好まし
くは抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体を含む免疫測定試薬が好ま
しい。
ｌＮＡｃＴ３測定試薬、即ち免疫学的測定試薬、好まし
くは抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体を含む免疫測定試薬が好ま
しい。
【００１６】斯かる抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体としては、
ＧａｌＮＡｃＴ３を特異的に認識できるものであれば特
に限定されないが、通常はＧａｌＮＡｃＴ３又はそれと
同等の抗原性を有するペプチド、例えばＧａｌＮＡｃＴ
３タンパク中の特定のアミノ酸配列を有するペプチドに
対する抗体が挙げられ、ポリクローナル抗体及びモノク
ローナル抗体のいずれでもよい。
ＧａｌＮＡｃＴ３を特異的に認識できるものであれば特
に限定されないが、通常はＧａｌＮＡｃＴ３又はそれと
同等の抗原性を有するペプチド、例えばＧａｌＮＡｃＴ
３タンパク中の特定のアミノ酸配列を有するペプチドに
対する抗体が挙げられ、ポリクローナル抗体及びモノク
ローナル抗体のいずれでもよい。
【００１７】ここで、ＧａｌＮＡｃＴ３中の特定のアミ
ノ酸配列を有するペプチドの選定方法としては、例え
ば、ＧａｌＮＡｃＴ３のアミノ酸配列から、Ｇｅｎｏｍ
ｅ Ｎｅｔ内のアミノ酸配列より３次元構造を推定する
モデリングツールを用いてＧａｌＮＡｃＴ３の立体構造
を推定し、その表面に露出しているアミノ酸配列のうち
他のＧａｌＮＡｃＴ（例えば、ＧａｌＮＡｃＴ１、Ｇａ
ｌＮＡｃＴ２等）のアミノ酸配列と相違する部分を抽出
する方法が挙げられる。
ノ酸配列を有するペプチドの選定方法としては、例え
ば、ＧａｌＮＡｃＴ３のアミノ酸配列から、Ｇｅｎｏｍ
ｅ Ｎｅｔ内のアミノ酸配列より３次元構造を推定する
モデリングツールを用いてＧａｌＮＡｃＴ３の立体構造
を推定し、その表面に露出しているアミノ酸配列のうち
他のＧａｌＮＡｃＴ（例えば、ＧａｌＮＡｃＴ１、Ｇａ
ｌＮＡｃＴ２等）のアミノ酸配列と相違する部分を抽出
する方法が挙げられる。
【００１８】斯かる手法により選定された好適なペプチ
ドとして、例えばヒトＧａｌＮＡｃＴ３タンパクの一部
分である配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド又
は該ペプチドを含有するペプチドが挙げられ、該ペプチ
ドに対する抗体は、高い抗体価を有する新規抗ＧａｌＮ
ＡｃＴ３抗体として有用である。
ドとして、例えばヒトＧａｌＮＡｃＴ３タンパクの一部
分である配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド又
は該ペプチドを含有するペプチドが挙げられ、該ペプチ
ドに対する抗体は、高い抗体価を有する新規抗ＧａｌＮ
ＡｃＴ３抗体として有用である。
【００１９】尚、これらのペプチド類は、ペプチド合成
機等を用いて化学合成することにより得ることができ
る。
機等を用いて化学合成することにより得ることができ
る。
【００２０】抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体の調製は常法に従
って行なわれるが、例えば以下の操作によればＧａｌＮ
ＡｃＴ３に対するポリクローナル抗体を得ることができ
る。即ち、１）ペプチド（例えば配列番号１で示される
アミノ酸配列からなるペプチド）をＥＤＣ等の架橋剤に
よりアセチル化牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等のキャリ
アー蛋白と結合し、免疫用コンジュゲートを作成する。
２）これを注射直前に完全もしくは不完全フロイントア
ジュバント中で乳化、懸濁させ、ウサギ、ヤギ、ウマ等
の動物の皮下又は腹腔内に２〜３週間毎に数回（好まし
くは３〜４回）注射を繰り返すことにより動物を免疫す
る。３）最終免疫より約５〜７日後、免疫動物から採血
し、血清画分を常法に従って調整しポリクローナル抗体
を得る。４）さらに、必要に応じてプロティンＧセフア
ロースカラム等により抗体を精製する。
って行なわれるが、例えば以下の操作によればＧａｌＮ
ＡｃＴ３に対するポリクローナル抗体を得ることができ
る。即ち、１）ペプチド（例えば配列番号１で示される
アミノ酸配列からなるペプチド）をＥＤＣ等の架橋剤に
よりアセチル化牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等のキャリ
アー蛋白と結合し、免疫用コンジュゲートを作成する。
２）これを注射直前に完全もしくは不完全フロイントア
ジュバント中で乳化、懸濁させ、ウサギ、ヤギ、ウマ等
の動物の皮下又は腹腔内に２〜３週間毎に数回（好まし
くは３〜４回）注射を繰り返すことにより動物を免疫す
る。３）最終免疫より約５〜７日後、免疫動物から採血
し、血清画分を常法に従って調整しポリクローナル抗体
を得る。４）さらに、必要に応じてプロティンＧセフア
ロースカラム等により抗体を精製する。
【００２１】斯かる方法により、正常腺組織及び腺癌組
織中のＧａｌＮＡｃＴ３の発現量を測定したところ、
胃、大腸等の正常腺上皮細胞においては生涯活動期にあ
ることから、ＧａｌＮＡｃＴ３が多く発現され（図２参
照）、一方、癌組織においてはＧａｌＮＡｃＴ３が発現
している場合（図３参照）と、その発現が消失している
場合（図４参照）があった。そこで本発明においては、
後記試験例に示すように、腺癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ
３発現量と組織学的分化度及び生存期間と比較したとこ
ろ、組織学的分化度に関係なく、患者の生存期間と有意
に相関し、ＧａｌＮＡｃＴ３を発現している場合には生
存期間が長く、発現していない場合には生存期間が短い
ことが示された（図５参照）。即ち、本発明の予後判定
法によれば、例えば手術時に摘出された腺癌組織につい
てＧａｌＮＡｃＴ３量を測定し、解析することにより、
その後の経過観察を行うことなく腺癌患者の予後を判定
することができる。
織中のＧａｌＮＡｃＴ３の発現量を測定したところ、
胃、大腸等の正常腺上皮細胞においては生涯活動期にあ
ることから、ＧａｌＮＡｃＴ３が多く発現され（図２参
照）、一方、癌組織においてはＧａｌＮＡｃＴ３が発現
している場合（図３参照）と、その発現が消失している
場合（図４参照）があった。そこで本発明においては、
後記試験例に示すように、腺癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ
３発現量と組織学的分化度及び生存期間と比較したとこ
ろ、組織学的分化度に関係なく、患者の生存期間と有意
に相関し、ＧａｌＮＡｃＴ３を発現している場合には生
存期間が長く、発現していない場合には生存期間が短い
ことが示された（図５参照）。即ち、本発明の予後判定
法によれば、例えば手術時に摘出された腺癌組織につい
てＧａｌＮＡｃＴ３量を測定し、解析することにより、
その後の経過観察を行うことなく腺癌患者の予後を判定
することができる。
【００２２】本発明の予後検査薬の好ましい態様は、抗
ＧａｌＮＡｃＴ３抗体、特に配列番号１のアミノ酸配列
からなるペプチドに対する抗体を含むものであるが、当
該抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体は、標識された抗体でもよ
い。ここで標識抗体としては、放射性同位元素、酵素、
蛍光色素、色素等が挙げられる。また、抗ＧａｌＮＡｃ
Ｔ３抗体以外に第二抗体を含んでいてもよく、これは抗
体作製時に用いた動物の免疫グロブリンに対する抗体が
好ましく、例えば、ウサギを使用した場合は抗ウサギ抗
体、ヤギを使用した場合は抗ヤギ抗体が好ましい。
ＧａｌＮＡｃＴ３抗体、特に配列番号１のアミノ酸配列
からなるペプチドに対する抗体を含むものであるが、当
該抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体は、標識された抗体でもよ
い。ここで標識抗体としては、放射性同位元素、酵素、
蛍光色素、色素等が挙げられる。また、抗ＧａｌＮＡｃ
Ｔ３抗体以外に第二抗体を含んでいてもよく、これは抗
体作製時に用いた動物の免疫グロブリンに対する抗体が
好ましく、例えば、ウサギを使用した場合は抗ウサギ抗
体、ヤギを使用した場合は抗ヤギ抗体が好ましい。
【００２３】
【実施例】実施例１ ポリクローナル抗体の製造 （１）アセチル化ＢＳＡの調製 ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）２００mgに２０mlの５０％酢
酸ナトリウム溶液を徐々に加え、４℃に静置し溶解後、
無水酢酸３４０μｌを滴下、攪拌せずに４℃終夜静置し
て拡散させた。精製水２Ｌ×２回に透析して酢酸を除去
後、５０mMリン酸緩衝液（ＰＢ）pH８．０（５００ml）
に透析してバッファー置換した。透析内容物を回収して
ＢＩＯ−ＲＡＤ社プロテインアッセイキットによりタン
パク質濃度を測定、蛍光試薬によりアミノ基残存量を定
量しアセチル化を確認した。
酸ナトリウム溶液を徐々に加え、４℃に静置し溶解後、
無水酢酸３４０μｌを滴下、攪拌せずに４℃終夜静置し
て拡散させた。精製水２Ｌ×２回に透析して酢酸を除去
後、５０mMリン酸緩衝液（ＰＢ）pH８．０（５００ml）
に透析してバッファー置換した。透析内容物を回収して
ＢＩＯ−ＲＡＤ社プロテインアッセイキットによりタン
パク質濃度を測定、蛍光試薬によりアミノ基残存量を定
量しアセチル化を確認した。
【００２４】（２）ペプチドの導入 公知のＧａｌＮＡｃＴ３のアミノ酸配列から、Ｇｅｎｏ
ｍｅ Ｎｅｔ内のアミノ酸配列より３次元構造を推定す
るモデリングツールを用いてＧａｌＮＡｃＴ３の立体構
造を推定し、その表面に露出しているアミノ酸配列のう
ち、ＧａｌＮＡｃＴ１及びＧａｌＮＡｃＴ２のアミノ酸
配列と相違する部分を抽出することにより選定されたア
ミノ酸配列のＮ末端にＬｙｓを付加した配列番号１のペ
プチドをペプチド合成機（Rainin社製）により作製し、
それを少量とり５０mM ＰＢ，pH８．０への溶解性が高
いことを確認ののち、アセチル化ＢＳＡへの導入を行っ
た。
ｍｅ Ｎｅｔ内のアミノ酸配列より３次元構造を推定す
るモデリングツールを用いてＧａｌＮＡｃＴ３の立体構
造を推定し、その表面に露出しているアミノ酸配列のう
ち、ＧａｌＮＡｃＴ１及びＧａｌＮＡｃＴ２のアミノ酸
配列と相違する部分を抽出することにより選定されたア
ミノ酸配列のＮ末端にＬｙｓを付加した配列番号１のペ
プチドをペプチド合成機（Rainin社製）により作製し、
それを少量とり５０mM ＰＢ，pH８．０への溶解性が高
いことを確認ののち、アセチル化ＢＳＡへの導入を行っ
た。
【００２５】アセチル化ＢＳＡ溶液（ＢＳＡ量：１０mg
（１．５×１０-7mole））にモル比でペプチドの５０倍
となるように架橋剤であるＥＤＣ ７０．９mg（３．７
×１０-4mol ）粉末を加え、溶解させた。次に約０．２
mlの５０mM ＰＢ，pH８．０に溶解した上記ペプチド
（モル比でアセチル化ＢＳＡの５０倍量）を加えVortex
後、４℃終夜静置した。反応終了後あらかじめＰＢＳ
（−）にて平衡化したＰＤ−１０に２mlの反応液をアプ
ライし、０．５ml／tubeずつ分画した。回収したフラク
ションのタンパク質濃度、アミノ基残存量を定量し、上
記ペプチドが導入されたことを確認した（アセチル化Ｂ
ＳＡ１分子当たり１６．６分子のペプチド）。
（１．５×１０-7mole））にモル比でペプチドの５０倍
となるように架橋剤であるＥＤＣ ７０．９mg（３．７
×１０-4mol ）粉末を加え、溶解させた。次に約０．２
mlの５０mM ＰＢ，pH８．０に溶解した上記ペプチド
（モル比でアセチル化ＢＳＡの５０倍量）を加えVortex
後、４℃終夜静置した。反応終了後あらかじめＰＢＳ
（−）にて平衡化したＰＤ−１０に２mlの反応液をアプ
ライし、０．５ml／tubeずつ分画した。回収したフラク
ションのタンパク質濃度、アミノ基残存量を定量し、上
記ペプチドが導入されたことを確認した（アセチル化Ｂ
ＳＡ１分子当たり１６．６分子のペプチド）。
【００２６】上記で得られたペプチド−ＢＳＡ結合物
は、完全フロイントアジュバントと混和後、ウサギ（Ｓ
ＰＥ，日本白色，雄９週齢）の背部皮下に初回免疫し
た。その後、２週間隔で３回追加免疫を行った。免疫前
及び各免役後約１週間で採血、抗体価の推移を下記ＥＬ
ＩＳＡ法で検定した。
は、完全フロイントアジュバントと混和後、ウサギ（Ｓ
ＰＥ，日本白色，雄９週齢）の背部皮下に初回免疫し
た。その後、２週間隔で３回追加免疫を行った。免疫前
及び各免役後約１週間で採血、抗体価の推移を下記ＥＬ
ＩＳＡ法で検定した。
【００２７】（３）抗体価測定方法 マイクロタイタープレートのwellに５，２．５，１．
０，０．５，０．１μｇ／mlの濃度に調製した各ペプチ
ド５０μｌを固相化した。１％ゼラチン−ＰＢＳ（−）
でブロッキング後、１０倍〜１０００００倍希釈（０．
１％アセチル化ＢＳＡで希釈）した抗血清を５０μｌず
つ添加し３７℃、１時間反応させた。ウエルを０．０５
％Tween ２０含有ＰＢＳ（−）にて洗浄後、３０００倍
希釈したパーオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋
Ｌ）抗体５０μｌを加え、室温１時間静置した。ウエル
を洗浄したのち基質溶液（O-Phenylenediamine）１００
μｌを加えて室温５分間反応させた。高い反応値が得ら
れる抗原濃度と抗血清の希釈率の条件をキャリブレーシ
ョンカーブ（図１）より求めた。これより、抗原濃度は
０．５μｇ／ml、抗血清の希釈率は１０００〜１００万
倍と決定した。４回の免疫により約１０万倍以上の抗体
価が認められたため、全血の採血を行ない血清画分を得
た。
０，０．５，０．１μｇ／mlの濃度に調製した各ペプチ
ド５０μｌを固相化した。１％ゼラチン−ＰＢＳ（−）
でブロッキング後、１０倍〜１０００００倍希釈（０．
１％アセチル化ＢＳＡで希釈）した抗血清を５０μｌず
つ添加し３７℃、１時間反応させた。ウエルを０．０５
％Tween ２０含有ＰＢＳ（−）にて洗浄後、３０００倍
希釈したパーオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋
Ｌ）抗体５０μｌを加え、室温１時間静置した。ウエル
を洗浄したのち基質溶液（O-Phenylenediamine）１００
μｌを加えて室温５分間反応させた。高い反応値が得ら
れる抗原濃度と抗血清の希釈率の条件をキャリブレーシ
ョンカーブ（図１）より求めた。これより、抗原濃度は
０．５μｇ／ml、抗血清の希釈率は１０００〜１００万
倍と決定した。４回の免疫により約１０万倍以上の抗体
価が認められたため、全血の採血を行ない血清画分を得
た。
【００２８】以上のようにして得られた抗血清を用い
て、下記試験例１に示すとおり正常粘膜組織の免疫染色
を行った。結果、ＧａｌＮＡｃＴ３を多く発現している
腺細胞の染色が確認された（図２参照）。従って、得ら
れた抗血清はＧａｌＮＡｃＴ３の測定においても１００
０〜１００万倍希釈の範囲で好ましくは２０００〜１０
万倍希釈の範囲で使用可能と考えられる。
て、下記試験例１に示すとおり正常粘膜組織の免疫染色
を行った。結果、ＧａｌＮＡｃＴ３を多く発現している
腺細胞の染色が確認された（図２参照）。従って、得ら
れた抗血清はＧａｌＮＡｃＴ３の測定においても１００
０〜１００万倍希釈の範囲で好ましくは２０００〜１０
万倍希釈の範囲で使用可能と考えられる。
【００２９】試験例１ （１）ＧａｌＮＡｃＴ３発現量の判定 摘出された１０６例の大腸癌について、パラフィン包埋
切片でのＧａｌＮＡｃＴ３発現量を免疫染色法で判定し
た。すなわち、実施例１で得られた抗血清を５０００倍
希釈したものを第一抗体として用い、その後第二抗体と
してアルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を
用いて検体を免疫染色することにより判定した。
切片でのＧａｌＮＡｃＴ３発現量を免疫染色法で判定し
た。すなわち、実施例１で得られた抗血清を５０００倍
希釈したものを第一抗体として用い、その後第二抗体と
してアルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を
用いて検体を免疫染色することにより判定した。
【００３０】図２に正常粘膜組織での染色例を、図３及
び４に癌部での染色例を示す。図２に示すように、正常
粘膜組織では、全例においてＧａｌＮＡｃＴ３が細胞質
に顆粒状に発現していた。一方、大腸癌１０６例中６７
例（６３．２％）では、細胞質に顆粒状、若しくはびま
ん性にＧａｌＮＡｃＴ３が発現していたが、残りの３９
例（３６．８％）は、図４に示すようにＧａｌＮＡｃＴ
３の発現を認めなかった。
び４に癌部での染色例を示す。図２に示すように、正常
粘膜組織では、全例においてＧａｌＮＡｃＴ３が細胞質
に顆粒状に発現していた。一方、大腸癌１０６例中６７
例（６３．２％）では、細胞質に顆粒状、若しくはびま
ん性にＧａｌＮＡｃＴ３が発現していたが、残りの３９
例（３６．８％）は、図４に示すようにＧａｌＮＡｃＴ
３の発現を認めなかった。
【００３１】（２）ＧａｌＮＡｃＴ３の発現と大腸癌の
予後規定因子の相関性 ＧａｌＮＡｃＴ３の発現と生存期間の比較を全症例及び
組織型別に症例を分類し解析した。判定は、腫瘍組織細
胞数の５０％以上が染色された場合を陽性、５０％未満
を陰性とした。
予後規定因子の相関性 ＧａｌＮＡｃＴ３の発現と生存期間の比較を全症例及び
組織型別に症例を分類し解析した。判定は、腫瘍組織細
胞数の５０％以上が染色された場合を陽性、５０％未満
を陰性とした。
【００３２】結果を図５〜７に示す。全症例及び高分化
型癌の症例において、ＧａｌＮＡｃＴ３陰性症例では５
年、１０年生存率が有意に低かった。尚、組織型及びス
テージとは統計学的相関関係は認められなかった。
型癌の症例において、ＧａｌＮＡｃＴ３陰性症例では５
年、１０年生存率が有意に低かった。尚、組織型及びス
テージとは統計学的相関関係は認められなかった。
【００３３】
【発明の効果】本発明の予後判定方法を用いることによ
り、大腸癌、胃癌等の腺癌患者の予後を、経過観察を行
わずに簡易に判定することができ、臨床診断や治療法の
決定において有力な情報を与える。
り、大腸癌、胃癌等の腺癌患者の予後を、経過観察を行
わずに簡易に判定することができ、臨床診断や治療法の
決定において有力な情報を与える。
【００３４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>TAIHO PHARMACEUTICAL CO., LTD <120>A method for judging prognosis <130>P05031112 <160>1 <210>1 <211>19 <212>PRT <213>Artificial <400>1 Gly Tyr Tyr Thr Ala Ala Glu Leu Lys Pro Val Leu Asp Arg Pro Pro 1 5 10 15 Gln Asp Ser 19
【図１】抗ペプチド抗血清測定条件検討のための検量曲
線を示す図である。
線を示す図である。
【図２】抗ＧａｌＮＡｃＴ３ポリクローナル抗体による
正常大腸粘膜の染色結果を示す図である。
正常大腸粘膜の染色結果を示す図である。
【図３】抗ＧａｌＮＡｃＴ３ポリクローナル抗体による
大腸癌の染色結果を示す図である。（陽性例）
大腸癌の染色結果を示す図である。（陽性例）
【図４】抗ＧａｌＮＡｃＴ３ポリクローナル抗体による
大腸癌の染色結果を示す図である。（陰性例）
大腸癌の染色結果を示す図である。（陰性例）
【図５】抗ＧａｌＮＡｃＴ３ポリクローナル抗体による
大腸癌（全症例）の染色結果と各症例での生存期間を比
較した図である。図中のＰ値はログランク有意差検定法
により求められた有意差を示す。
大腸癌（全症例）の染色結果と各症例での生存期間を比
較した図である。図中のＰ値はログランク有意差検定法
により求められた有意差を示す。
【図６】抗ＧａｌＮＡｃＴ３ポリクローナル抗体による
大腸癌（高分化型）の染色結果と各症例での生存期間を
比較した図である。図中のＰ値はログランク有意差検定
法により求められた有意差を示す。
大腸癌（高分化型）の染色結果と各症例での生存期間を
比較した図である。図中のＰ値はログランク有意差検定
法により求められた有意差を示す。
【図７】抗ＧａｌＮＡｃＴ３ポリクローナル抗体による
大腸癌（中分化型）の染色結果と各症例での生存期間を
比較した図である。図中のＰ値はログランク有意差検定
法により求められた有意差を示す。
大腸癌（中分化型）の染色結果と各症例での生存期間を
比較した図である。図中のＰ値はログランク有意差検定
法により求められた有意差を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA61 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QR13 QR58 QS03 QS33 QX01 4B064 AG26 CA10 CC24 DA14 4H045 AA11 AA30 BA10 CA40 DA75 EA50 FA71
Claims (9)
- 【請求項１】 腺癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ３を測定す
ることを特徴とする腺癌患者の予後判定方法。 - 【請求項２】 抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体を用いてＧａｌ
ＮＡｃＴ３を測定するものである請求項１記載の腺癌患
者の予後判定方法。 - 【請求項３】 抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体が、配列番号１
のアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体である請
求項２記載の腺癌患者の予後判定方法。 - 【請求項４】 腺癌が、大腸癌又は胃癌である請求項１
〜３のいずれか１項記載の腺癌患者の予後判定方法。 - 【請求項５】 腺癌組織中のＧａｌＮＡｃＴ３測定試薬
からなる腺癌患者の予後検査薬。 - 【請求項６】 ＧａｌＮＡｃＴ３測定試薬が、抗Ｇａｌ
ＮＡｃＴ３抗体を含むものである請求項５記載の腺癌患
者の予後検査薬。 - 【請求項７】 抗ＧａｌＮＡｃＴ３抗体が、配列番号１
のアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体である請
求項６記載の腺癌患者の予後検査薬。 - 【請求項８】 腺癌が、大腸癌又は胃癌である請求項５
〜７のいずれか１項記載の腺癌患者の予後検査薬。 - 【請求項９】 配列番号１のアミノ酸配列を有するペプ
チドに対する抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34742099A JP4253094B2 (ja) | 1999-12-07 | 1999-12-07 | 予後判定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34742099A JP4253094B2 (ja) | 1999-12-07 | 1999-12-07 | 予後判定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001165933A true JP2001165933A (ja) | 2001-06-22 |
| JP4253094B2 JP4253094B2 (ja) | 2009-04-08 |
Family
ID=18390116
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34742099A Expired - Fee Related JP4253094B2 (ja) | 1999-12-07 | 1999-12-07 | 予後判定方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4253094B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004016790A1 (en) * | 2002-08-14 | 2004-02-26 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Novel n-acetylgalactosamine transferases and nucleic acids encoding the same |
| JP2011067130A (ja) * | 2009-09-25 | 2011-04-07 | Yamaguchi Univ | 大腸癌の予後予測方法 |
| WO2011145622A1 (ja) * | 2010-05-17 | 2011-11-24 | 国立大学法人東京工業大学 | 胃癌の検出方法 |
| US9075063B2 (en) | 2009-07-03 | 2015-07-07 | The University Of Tokyo | Methylation analysis to determine the presence of cancer cells |
| RU2612021C1 (ru) * | 2016-01-12 | 2017-03-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского" | Способ прогнозирования риска развития аденокарциномы желудка при хронических процессах язвообразования органа |
-
1999
- 1999-12-07 JP JP34742099A patent/JP4253094B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004016790A1 (en) * | 2002-08-14 | 2004-02-26 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Novel n-acetylgalactosamine transferases and nucleic acids encoding the same |
| US7494800B2 (en) | 2002-08-14 | 2009-02-24 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | N-acetylgalactosamine transferases and nucleic acids encoding the same |
| US8278037B2 (en) | 2002-08-14 | 2012-10-02 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | N-acetylgalactosamine transferases and nucleic acids encoding the same |
| US9075063B2 (en) | 2009-07-03 | 2015-07-07 | The University Of Tokyo | Methylation analysis to determine the presence of cancer cells |
| JP2011067130A (ja) * | 2009-09-25 | 2011-04-07 | Yamaguchi Univ | 大腸癌の予後予測方法 |
| WO2011145622A1 (ja) * | 2010-05-17 | 2011-11-24 | 国立大学法人東京工業大学 | 胃癌の検出方法 |
| JPWO2011145622A1 (ja) * | 2010-05-17 | 2013-07-22 | 国立大学法人東京工業大学 | 胃癌の検出方法 |
| RU2612021C1 (ru) * | 2016-01-12 | 2017-03-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского" | Способ прогнозирования риска развития аденокарциномы желудка при хронических процессах язвообразования органа |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4253094B2 (ja) | 2009-04-08 |
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