KR20080046693A - 요로상피암의 검출용 키트 및 방법 - Google Patents

요로상피암의 검출용 키트 및 방법 Download PDF

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히또시 노부마사
오사무 오가와
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Abstract

본 발명은 피검자 유래의 생체 시료 중 CXCL1 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 시험관 내에서 측정하는 것을 포함하는 요로상피암을 검출하는 방법, 및 상기 단백질 또는 유전자에 특이적으로 결합 가능한 항체 또는 핵산 프로브를 포함하는 요로상피암 진단용 키트에 관한 것이다.
요로상피암, CXCL1 단백질, 핵산 프로브, 키트

Description

요로상피암의 검출용 키트 및 방법 {KIT AND METHOD FOR DETECTION OF UROTHELIAL CANCER}
본 발명은 요로상피암의 검출 또는 진단에 유용한 CXCL1 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 측정하는 것에 의한 요로상피암의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 요로상피암의 검출을 위해 사용되는 상기 단백질 또는 유전자와 결합 가능한 물질을 포함하는 상기 암의 진단용 키트에 관한 것이다.
요로상피암이란, 방광암과 신우암, 요관암 등의 총칭이고, 이들 암은 모두 요로의 이행 상피 세포가 암화된 것으로, 그 성질은 공통이라고 생각된다. 요로상피암은 요로성기암으로는 전립선암에 이어 이환자가 많고, 2001년의 일본 후생노동부 대신관방 통계 정보부 "인구 동태 통계"에서는 방광암만으로도 일본의 연간 이환수는 남자 9765명, 여자 3243명, 사망수는 남자 3459명, 여자 1587명에 이른다. 신우암, 요관암은 비교적 적고, 사망수는 각각 남녀 합쳐서 797명, 713명이다.
방광암 또는 그 밖의 요로상피암의 예방에 관한 연구는 없지만, 방광암은 50세 이상에게 흔히 발생하고, 남성이 여성의 2 내지 3배의 빈도로 발증한다. 또한 흡연자는 비흡연자에 비하여 4배 정도 발생률이 높다고 생각되고 있다. 방광암에 는 크게 2가지 타입이 있고, 표재성 유두상암은 비교적 악성도가 낮은 암으로, 방광의 내강(방광의 내면)에 돌출하지만 뿌리는 얕고, 표면은 유두상(컬리플라워 모양)으로 좁은 줄기를 갖는다. 내시경적으로 치료할 수 있지만, 절반 이상의 환자에게서 방광 내에 재발한다. 암의 깊이는 점막하에 미치는 경우도 있지만, 방광의 근육층에는 도달하지 않는다. 이에 대하여 침윤성암은 악성도가 높은 암으로, 뿌리가 넓고, 방광의 벽심부까지 침윤하는 경향이 있으며, 전이하는 경우도 있다. 따라서, 방광 적출, 항암제의 사용, 방사선 요법 등, 몸에 부담이 가는 치료가 필요해진다.
방광암의 증상에서 가장 많은 것은 아픔이 없는 혈뇨이지만, 뇨의 횟수가 많고, 배뇨시의 아프며, 배뇨 후에도 개운하지 않는 등의 방광염 증상인 경우도 있다. 진단에는 뇨 검사(세포진), X선 촬영, 내시경 등이 이용된다. 그러나 조기 진단에 유용한 혈액이나 뇨에서 이용 가능한 특이적이고 감도가 높은 종양 마커가 존재하지 않아, 암이 진행된 후 검사에 의해서 발견이 되는 경우가 많다. 또한 방광 이외의 부위에서 발생하는 요로상피암도 동일한 성질을 가지고 있다. 따라서, 요로상피암, 특히 방광암을 위한 특이적이고 감도가 높은 종양 마커에 의한 간편한 검사 방법의 실용화가 기대되고 있다.
방광암의 검사·판정을 위한 여러 가지 마커 및 방법이 제안되어 있다. 예를 들면 뉴클레오포스민/B23(특허 문헌 1), HURP(특허 문헌 2), CYP4B1 또는 CYP4B2(특허 문헌 3) 등의 유전자의 발현 수준의 변화에 의해서 방광암을 판정하는 방법, 뇨 검체 중 특정한 단백질의 존재 또는 양에 의해서 판정하는 방법(특허 문 헌 4, 특허 문헌 5), 혈액 중 가용성 Fas 농도를 지표로서 판정하는 방법(특허 문헌 6) 등을 들 수 있다.
특허 문헌 1: 일본 특허 공개 제2004-337120
특허 문헌 2: 일본 특허 공개 제2004-248508
특허 문헌 3: 일본 특허 공개 제2002-238599
특허 문헌 4: 일본 특허 공개 제2004-61288
특허 문헌 5: 일본 특허 공개 (평)7-309895호 공보
특허 문헌 6: 일본 특허 공개 제2000-131321
본 발명의 과제는 신규인 요로상피암 종양 마커를 발견하고, 요로상피암, 특히 방광암을 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
<과제를 해결하기 위한 수단>
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, CXCL1 단백질을 종양 마커로서, 이것에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 그의 전사 산물 또는 그 cDNA에 결합 가능한 핵산을 이용함으로써, 요로상피암을 유의하게 검출할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
<발명의 개요>
즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.
(1) 피험자 유래의 생체 시료 중 CXCL1 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 시험관 내에서 측정하는 것을 포함하는 요로상피암을 검출하는 방법.
(2) 상기 (1)에 있어서, 상기 단백질량 또는 상기 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
(3) 상기 (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 단백질량 또는 상기 유전자의 발현량이 대조 시료의 것과 비교하여 유의하게 증대하는 것을 지표로 하는 방법.
(4) 상기 (3)에 있어서, 상기 증대가 2배 이상인 방법.
(5) 상기 (3)에 있어서, 상기 증대가 3배 이상인 방법.
(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 측정이 면역학적 방법에 의한 것인 방법.
(7) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 측정이 혼성화에 의한 것인 방법.
(8) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 상기 측정이 상기 단백질 또는 상기 유전자와 결합 가능한 물질을 이용하여 행해지는 방법.
(9) 상기 (8)에 있어서, 상기 단백질과 결합 가능한 물질이 항체 또는 그의 단편인 방법.
(10) 상기 (8)에 있어서, 상기 유전자와 결합 가능한 물질이 핵산 프로브인 방법.
(11) 상기 (10)에 있어서, 상기 핵산 프로브가 서열 1로 표시되는 염기 서열 또는 그의 변이체로 이루어지는 핵산, 그의 상보적 서열로 이루어지는 핵산, 이들의 핵산과 엄격한 조건으로 혼성화하는 핵산, 또는 이들의 15 이상의 연속한 염기를 포함하는 단편을 포함하는 방법.
(12) 상기 (9) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 핵산 프로브가 표지되어 있는 방법.
(13) 상기 (1) 내지 (6), (8), (9) 및 (12) 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 또는 그의 단편과 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 이용하여, 시료 중 상기 단백질을 면역학적으로 측정하고, 상기 단백질의 양이 대조 시료의 것과 비교하여 증대하고 있는 것을 지표로 하여 요로상피암을 검출하는 것을 포함하는 방법.
(14) 상기 (1) 내지 (5), (7), (8) 및 (10) 내지 (12) 중 어느 하나에 있어서, 서열 1로 표시되는 염기 서열 또는 그의 변이체로 이루어지는 핵산, 그의 상보적 서열로 이루어지는 핵산, 이들의 핵산과 엄격한 조건으로 혼성화하는 핵산, 또는 이들의 15 이상의 연속한 염기를 포함하는 단편으로 이루어지는 프로브를 이용하여, 시료 중 상기 유전자의 발현량을 측정하고, 상기 발현량이 대조 시료의 것과 비교하여 증대하고 있는 것을 지표로 하여 요로상피암을 검출하는 것을 포함하는 방법.
(15) 상기 (1) 내지 (14) 중 어느 하나에 있어서, 상기 요로상피암이 방광암, 신우암, 요관암 및 요도암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
(16) 상기 (1) 내지 (15) 중 어느 하나에 있어서, 상기 시료가 혈액, 혈장, 혈청 또는 뇨인 방법.
(17) 상기 (1) 내지 (15) 중 어느 하나에 있어서, 상기 시료가 요로상피 조직 또는 세포인 방법.
(18) (1) 내지 (6), (8), (9), (12), (13) 및 (15) 내지 (17) 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질이 서열 2에 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 변이체 서열을 갖는 방법.
(19) 상기 (1) 내지 (5), (7), (8), (10) 내지 (12) 및 (14) 내지 (17) 중 어느 하나에 있어서, 상기 유전자가 서열 1에 표시되는 염기 서열 또는 그의 변이체 서열을 갖는 방법.
(20) CXCL1 단백질 또는 그의 단편과 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편, 또는 이들의 화학 수식 유도체를 포함하는 요로상피암 진단용 키트.
(21) 상기 (20)에 있어서, 상기 단백질이 서열 2에 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 변이체 서열을 갖는 키트.
(22) 상기 (20) 또는 (21)에 있어서, 상기 단백질의 단편이 8개 이상의 아미노산으로 이루어지는 에피토프를 포함하는 키트.
(23) 상기 (20) 내지 (22) 중 어느 하나에 있어서, 상기 요로상피암이 방광암, 신우암, 요관암 및 요도암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 키트.
(24) 상기 (20) 내지 (23) 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편이 고상 담체에 결합되어 있는 키트.
(25) 상기 (20) 내지 (24) 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편과 결합 가능한 표지 이차 항체를 더욱 포함하는 키트.
(26) 상기 (25)에 있어서, 상기 이차 항체의 표지가 효소, 형광 또는 방사성 표지인 키트.
(27) 서열 1로 표시되는 염기 서열 또는 그의 변이체 서열로 이루어지는 핵산, 그의 상보적 서열로 이루어지는 핵산, 이들의 핵산과 엄격한 조건으로 혼성화하는 핵산, 이들의 15 이상의 연속한 염기를 포함하는 단편, 또는 이들의 화학 수식 유도체를 포함하는 요로상피암 진단용 키트.
(28) 상기 (27)에 있어서, 상기 핵산이 서열 1에 표시되는 염기 서열 또는 그의 변이체 서열을 갖는 키트.
(29) 상기 (27) 또는 (28)에 있어서, 상기 요로상피암이 방광암, 신우암, 요관암 및 요도암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 키트.
(30) 상기 (27) 내지 (29) 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산이 고상 담체에 결합되어 있는 키트.
(31) 상기 (30)에 있어서, 상기 고상 담체가 DNA 칩 또는 마이크로어레이의 기판인 키트.
(32) 피험자에게서의 요로상피암의 시험관 내 검출을 위한, 상기 (20) 내지 (31) 중 어느 하나에 기재된 키트의 용도.
<용어의 정의>
본 명세서 중에서 사용하는 용어는 이하의 정의를 갖는다.
핵산, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 등의 약호에 의한 표시는 "염기 서열 또는 아미노산 서열을 포함하는 명세서 등의 제조를 위한 가이드 라인"(일본 특허청편) 및 당 기술 분야에서의 관용에 따르는 것으로 한다.
본 명세서에서 "CXCL1"(케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 1, GRO-α, GRO-1, 멜라노마 성장 촉진 활동, 알파) 단백질이란, C-X-C 케모카인 패밀리에 속하는 아미노산 107 잔기로 이루어지는 분자량 약 1.1 kDa의 단백질이다. 이 단백질은 7회 막관통형 수용체인 CXCR1 및 CXCR2의 리간드로서 작용하고, 이들 수용체를 발현하는 호중구, 호염기구, 마스트 세포 등의 유주를 야기한다(문헌[Richmond, A 등, 1988, EMBO journal, 제7권, p.2025-712033 등]). 또한 인간 악성 흑색종에서의 세포 분열 유도 인자로서의 활성이 보고되어 있다(Anisowicz, A 외, 1987, Proceedings of the national Academy of Sciences, USA, 제84권, p.7188-7192).
본 명세서에서 "핵산"이란, RNA 및 DNA의 모두 포함하는 것으로서 이용된다. 또한, 상기 DNA에는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA가 모두 포함된다. 또한 상기 RNA에는, 전체 RNA, mRNA, rRNA 및 합성 RNA가 모두 포함된다. 또한, 본 명세서에서는 핵산은 폴리뉴클레오티드와 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 "cDNA"란, 유전자의 발현에 의해서 발생한 RNA에 상보적인 서열의 DNA쇄 전장 및 그 부분 서열로 이루어지는 DNA 단편을 포함한다. cDNA는 RNA를 주형으로 하여, 폴리 T 프라이머를 이용하는 RT-PCR(역전사 효소-폴리메라제 연쇄 반응)에 의해서 합성될 수 있다.
본 명세서에서 "유전자"란, 2개쇄 DNA 뿐만 아니라, 그것을 구성하는 플러스쇄(또는 감지쇄) 또는 상보쇄(또는 안티 감지쇄) 등의 각 1개쇄 DNA를 포함하는 것을 의도하여 이용된다. 또한 그 길이에 의해서 특별히 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 명세서에서 "유전자"는 특별히 언급하지 않는 한, 인간게놈 DNA를 포함하는 2개쇄 DNA, cDNA를 포함하는 1개쇄 DNA(플러스쇄), 상기 플러스쇄와 상보적인 서열을 갖는 1개쇄 DNA(상보쇄) 및 이들 단편을 모두 포함한다. 또한 상기 "유전자"는 특정한 염기 서열(또는 서열)로 표시되는 "유전자"뿐만 아니라, 이들에 의해서 코딩되는 단백질과 생물학적 기능이 동등한 단백질, 예를 들면 동족체(즉, 호모로그), 스플라이스 버라이언트(splice variant) 등의 변이체 및 유도체를 코딩하는 "유전자"가 포함된다. 이러한 동족체, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 "유전자"로는, 구체적으로는 후술하는 엄격한 조건하에서 서열 1로 표시되는 염기 서열의 상보 서열과 혼성화하는 염기 서열을 갖는 "유전자"를 들 수 있다.
예를 들면 인간 유래의 단백질의 동족체(즉, 호모로그) 또는 그것을 코딩하는 유전자로는, 해당 단백질 또는 그것을 코딩하는 인간 유전자에 대응하는 타생물종의 단백질 또는 유전자를 예시할 수 있고, 이들 단백질 또는 유전자 호모로그는 호몰로젠(HomoloGene)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/호몰로젠/)에 의해 동정할 수 있다. 구체적으로는 특정한 인간 아미노산 또는 염기 서열을 블라스트(BLAST) 프로그램(문헌[Karlin, S. 외, Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A., 1993년, 제90권, p.5873-5877, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/])에 걸쳐서 일치하는(스코어가 가장 높고, E-값이 0이며, 동정이 100 ％를 나타냄) 서열의 등록번호를 취득할 수 있다. 블라스트 프로그램으로는 BLASTN(유전자), BLASTX(단백질) 등이 알려져 있다. 예를 들면, 유전자 검색의 경우, 상기 블라스트 검색으로부터의 등록번호를 유니젠(UniGene)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)에 입력하여 얻어진 유니젠 클러스터 ID(Hs.로 나타내는 번호)를 호몰로젠에 입력한다. 결과적으로 얻어진 타생물종 유전자와 인간 유전자와의 유전자 호모로그의 상관을 나타낸 리스트로부터, 특정한 염기 서열로 표시되는 인간 유전자에 대응하는 유전자 호모로그로서, 타생물종의 유전자를 선발할 수 있다. 또한 이 방법에서, 블라스트 프로그램 대신에 파스타(FASTA) 프로그램(http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/fasta-e.html)을 이용할 수도 있다.
또한, "유전자"는 기능 영역별에 관계없이, 예를 들면 발현 제어 영역, 코딩 영역, 엑손 또는 인트론을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "전사 산물"이란, 유전자의 DNA 서열을 주형으로 하여 합성된 메신저 RNA(mRNA)의 것을 말한다. RNA 폴리메라제가 유전자의 상류에 있는 프로모터라 불리는 부위에 결합하고, DNA의 염기 서열에 상보적으로 되도록 3' 말단에 리보뉴클레오티드를 결합시키는 형태로 mRNA가 합성된다. 이 mRNA에는 유전자 그 자체뿐만 아니라, 발현 제어 영역, 코딩 영역, 엑손 또는 인트론을 비롯한 전사 개시점에서 폴리 A 서열의 말단에 이르기까지의 전체 서열이 포함된다.
본 명세서에서 "번역 산물"이란, 전사에 의해서 합성된 mRNA가 스플라이싱 등의 수식을 받는/받지 않는 것에 관계없이, 그 정보를 바탕으로 합성된 단백질을 나타낸다. mRNA의 번역 과정에서는, 우선 리보솜과 메신저 RNA가 결합하고, 이어서 mRNA의 염기 서열에 따라서 아미노산이 연결되어, 단백질이 합성된다.
본 명세서에서 "프로브"란, 유전자의 발현에 의해서 생긴 RNA 또는 그것에서 유래하는 핵산을 특이적으로 검출하기 위해서 사용되는 핵산 및/또는 그것에 상보적인 핵산을 포함한다.
본 명세서에서 "프라이머"란, 유전자의 발현에 의해서 생긴 RNA 또는 그것에서 유래하는 핵산을 특이적으로 인식하고, 증폭하는, 연속하는 핵산 및/또는 그것에 상보적인 핵산을 포함한다.
여기서 상보적인 핵산(상보쇄, 역쇄)이란, 서열에 의해서 정의되는 염기 서열로 이루어지는 핵산의 전장 서열, 또는 그 부분 서열(여기서는 편의상, 이것을 플러스쇄라 함)에 대하여 A:T(U), G:C라는 염기쌍 관계에 기초하는, 염기적으로 상보적인 관계에 있는 핵산을 의미한다. 단, 이러한 상보쇄는 대상으로 하는 플러스쇄의 염기 서열과 완전히 상보 서열을 형성하는 경우로 한정되지 않고, 대상으로 하는 플러스쇄와 엄격한 조건으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보 관계를 가질 수도 있다.
본 명세서에서 "엄격한 조건"이란, 프로브가 다른 서열에 대한 것보다도, 검출 가능이 큰 정도(예를 들면 백그라운드보다도 적어도 2배)이고, 그 표적 서열에 대하여 혼성화하는 조건을 말한다. 엄격한 조건은 서열 의존성이고, 혼성화가 행해지는 환경에 따라 다르다. 혼성화 및/또는 세정 조건의 엄격함을 제어함으로써, 프로브에 대하여 100 ％ 상보적인 표적 서열이 동정될 수 있다.
본 명세서에서 "변이체"란, 핵산의 경우, 다형성, 돌연변이, 전사시의 선택적 스플라이싱 등에 기인한 천연의 변이체, 동족체, 또는 유전 암호의 축중(縮重)에 기초하는 변이체, 또는 서열 1로 표시되는 염기 서열 또는 그 부분 서열에서 1 이상, 바람직하게는 1 또는 수개의 염기의 결실, 치환, 부가 또는 삽입을 포함하는 변이체, 또는 상기 염기 서열 또는 그 부분 서열과 약 80 ％ 이상, 약 85 ％ 이상, 바람직하게는 약 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 약 95 ％ 이상, 약 97 ％ 이상, 약 98 ％ 이상, 또는 약 99 ％ 이상의 ％ 동일성을 나타내는 변이체, 또는 상기 염기 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드와 상기 정의된 엄격한 조건으로 혼성화하는 핵산을 의미하고, 한편 단백질 또는 펩티드의 경우, 서열 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 그 부분 서열에서 1 이상, 바람직하게는 1 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 부가 또는 삽입을 포함하는 변이체, 또는 상기 아미노산 서열 또는 그 부분 서열과 약 80 ％ 이상, 약 85 ％ 이상, 바람직하게는 약 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 약 95 ％ 이상, 약 97 ％ 이상, 약 98 ％ 이상, 또는 약 99 ％ 이상의 ％ 동일성을 나타내는 변이체를 의미한다.
본 명세서에서 "수개"란, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 정수를 의미한다.
본 명세서에서 "％ 동일성"은 상기한 블라스트나 파스타에 의한 단백질 또는 유전자의 검색 시스템을 이용하여, 갭을 도입하여 결정할 수 있다(문헌[Karlin, S. 외, 1993년, Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A., 제90권, p.5873-5877; Altschul, S. F. 외, 1990년, Journal of Molecular Biology, 제215권, p.403-410; Pearson, W. R. 외, 1988년, Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A., 제85권, p.2444-2448]).
본 명세서에서 "유도체"란, 핵산의 경우, 형광단, 방사성 동위원소 등에 의한 라벨화 유도체, 수식 뉴클레오티드(예를 들면 할로겐, 메틸 등의 알킬, 메톡시 등의 알콕시, 티오, 카르복시메틸 등의 기를 포함하는 뉴클레오티드, 비오틴화 뉴클레오티드 및 염기의 재구성, 이중 결합의 포화, 탈아미노화, 산소 분자의 황 분자로의 치환 등을 받은 뉴클레오티드 등)를 포함하는 유도체 등, 한편 단백질의 경우, 아세틸화, 아실화, 알킬화, 인산화, 황산화, 글리코실화, 비오틴화/아비딘화, 라벨화(예를 들면 효소, 형광단, 발광 물질 등의 라벨) 등의 화학 수식 유도체를 의미한다.
본 명세서에서 "진단(또는 검출 또는 판정)용 키트"란, 요로상피암의 이환의 유무, 이환의 정도 또는 개선의 유무나 개선의 정도를 진단하기 위해서, 또한 요로상피암의 예방, 개선 또는 치료에 유용한 후보 물질을 스크리닝하기 위해서, 직접 또는 간접적으로 이용되는 것을 말한다. 이것에는 요로상피도암의 이환에 관련하여 생체 내, 특히 요로상피 조직에서 발현이 변동하는 유전자를 특이적으로 인식하고, 또한 결합할 수 있는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드, 이들 뉴클레오티드가 포함된다. 이들 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드는 상기 성질에 기초하여 생체 내, 조직이나 세포내 등에서 발현한 상기 유전자를 검출하기 위한 프로브로서, 또한 생체 내에서 발현한 상기 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로서 유효하게 이용할 수 있다. 또한, 이것에는 상기 유전자의 번역 산물인 단백질을 검출할 수 있는 항체도 포함된다.
본 명세서에서 검출·진단 대상이 되는 "생체 시료"란, 요로상피암의 발생에 따라 본 발명의 단백질 및/또는 유전자가 발현 변화하는 시료(또는 검체)이고, 피험자로부터 채취된 시료를 가리킨다. 구체적으로는, 상기 시료에는 요로상피 조직 및 그 주변의 림프절, 또한 전이가 의심되는 다른 장기, 혈액, 혈청, 혈장, 림프구배양 상청, 뇨, 수액, 타액, 땀, 복수 등의 체액, 또한 세포 또는 장기의 추출액 등이 포함된다.
본 명세서에서 "요로상피암"이란, 신배(腎杯), 신우(腎孟), 요관, 방광, 요도에 있는 이행 상피부에 발생하는 암을 의미한다. 요로상피암의 예로는, 방광암, 신우암, 요관암, 요도암을 들 수 있고, 본 발명은 특히 방광암의 검출에서 바람직하게 사용된다.
본 명세서에서 "피험자"란, 요로상피암을 갖는 동물, 바람직하게는 포유 동물, 보다 바람직하게는 인간을 가리킨다.
본 명세서에서 "특이적이다"란, 특정한 단백질 또는 핵산만을 인식하거나, 또는 이들과만 결합 또는 반응하는 것을 의미한다.
<발명의 효과>
본 발명에 의해 요로상피암을 용이하고 높은 신뢰도로 검출하는 것이 가능하게 되었다. 예를 들면, 환자의 뇨 중 CXCL1 농도/크레아티닌 농도의 비율을 측정하는 것만으로, 용이하게 요로상피암의 여부를 판정할 수 있다. 이 경우, 특히 침윤성 종양의 검출에 유효하다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 2005-255370호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
[도 1] 방광암 주화 세포 및 정상뇨 피상피 세포에서의 CXCL1의 RT-PCR 측정에 의한 mRNA 발현량 비교.
[도 2] 방광암 주화 세포 및 정상뇨 피상피 세포의 배양 상청에서의 CXCL1 단백질 발현량.
[도 3] 방광암 환자의 뇨 중에서의 CXCL1 단백질 발현.
[도 4] 방광암 환자의 뇨 중에서의 CXCL1 단백질 발현량의 측정. 백색환은 각각의 데이터의 수치를 나타내고, 평균값과 표준 오차를 +자로 나타내었다. *는 위험율 P<0.001에서 건강한 정상인(대조)과 조기 암 환자(Ta) 사이에 유의한 차가 있는 것을 나타낸다. +는 위험율 P<0.01에서 조기 암 환자와 진행 암 환자(T1 이상) 사이에 유의한 차가 있는 것을 나타낸다.
[도 5] 방광암 환자의 조직 중에서의 CXCL1 단백질 발현의 면역 염색도. 진행암(pT2G3) 및 림프절 전이소에서는 강하게 염색이 보인다. 이에 대하여, 정상 요로상피 조직(pTaG1)에서는 염색이 보이지 않았다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
본 발명자들은 금회 정상 요로상피 세포와 비교하여 방광암 환자 유래의 암 세포에서 발현이 증강하는 단백질에 대해서, 각각의 세포 배양 상청의 프로테옴 해석에 의해 스크리닝을 행하였다. 그 결과, 전장 CXCL1 단백질에 대해서 정상 요로상피 세포의 배양 상청보다도 암 세포의 배양 상청에서 많이 검출되는 것을 발견하 였다. 여기서 정상 요로상피 세포란, 요로상피암에 이환하지 않은 신적출증 예환자의 정상 요관으로부터 얻어진 상피 세포이다.
본 발명자들은 추가로 방광암 환자의 암 적출 수술 전과 수술 후의 혈액 및 뇨 중 CXCL1 단백질의 양을 면역학적 방법에 의해서 측정한 바, CXCL1 단백질은 방광암 적출 전의 환자의 혈액 및 뇨에서 방광암 적출 후에 비하여 고도로 검출되는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 또한 방광암 환자 유래의 세포와 정상 요로상피 세포에서 발현하고 있는 전체 RNA를 회수하고, 상기 전체 RNA 중 CXCL1을 코딩하는 유전자의 발현량을 DNA 어레이법 및 정량 PCR법에 의해서 측정하고, 방광암 환자 유래의 세포에서 CXCL1을 코딩하는 mRNA 양이 정상 세포에 비하여 증가하고 있는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 그 중 하나의 양태에서 피험자 유래의 생체 시료 중 CXCL1 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 시험관 내에서 측정하는 것을 포함하는 요로상피암을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서는, 일반적으로 생체 시료 중 상기 단백질의 존재 또는 존재량, 또는 상기 유전자의 발현 또는 발현량이 측정된다. 여기서 본 발명에서의 표적 단백질 또는 유전자는 피험자의 종류(예를 들면 인종)나 개체에 의존한 다형성, 스플라이스 변이 등에 기인한 변이체도 포함한다. 이러한 단백질의 존재나 양, 또는 유전자의 발현이나 발현량은 상기 단백질 또는 유전자와 특이적으로 결합 가능한 물질을 이용하여 측정할 수 있다. 그러한 물질에는 이하에서 설명하는 바 와 같은 항체, 핵산 프로브 등이 포함된다.
본 발명에서 사용 가능한 항체는 CXCL1 단백질(바람직하게는, 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질)을 인식하고, 그것에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편, 또는 화학 수식 유도체(상기에 정의)이다. 항체에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 또는 항체 단편, 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ScFv 등이 포함된다. 본 발명의 항체는 상기 단백질의 5개 이상, 바람직하게는 8개 이상의 아미노산으로 이루어지는 1 또는 복수개의 에피토프에 대한 항체이다. 특이적인 폴리클로날 항체는, 예를 들면 아가로스 등의 담체에 CXCL1 단백질을 결합한 칼럼에 상기 단백질을 면역한 토끼 등의 항혈청을 통과시키고, 칼럼 담체에 결합한 IgG 항체를 회수하는 것을 포함하는 수법에 의해서 제조할 수 있다. 모노클로날 항체는 후술하는 수법에 의해서 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 핵산 프로브는, 서열 1로 표시되는 염기 서열 또는 그의 변이체 서열로 이루어지는 핵산, 그의 상보적 서열로 이루어지는 핵산, 이들의 핵산과 엄격한 조건으로 혼성화하는 핵산, 또는 이들의 15 이상의 연속한 염기를 포함하는 단편, 또는 이들의 화학 수식 유도체(상기에 정의)를 포함한다.
본 발명의 방법에서는, 그 실시 형태에 의해 피험자로부터의 생체 시료 중 상기 단백질의 존재량 또는 상기 유전자의 발현량을 측정한다. 상기 단백질의 양 또는 유전자의 발현량이 대조 시료의 것과 비교하여 유의하게 증대하고 있는 경우, 피험자가 요로상피암에 이환하고 있다고 판정된다. 여기서 대조 시료는, 예를 들 면 정상 또는 건강한 정상의 개체, 또는 요로상피암을 갖지 않는 개체로부터의 대응하는 시료, 예를 들면 혈액, 뇨 등의 체액, 요로상피 조직 또는 세포 등이다. 특히 조직이나 세포에 대해서는, 이들 시료로부터 통상법에 의해 mRNA를 회수하고, 정량 RT-PCR법에 의해 생성·증폭된 cDNA 양(이는 표적 유전자의 발현량에 대응함)을 결정하거나, 또는 상기 세포를 배양하고, 그 배양 상청 중 CXCL1 단백질의 농도를 측정할 수 있다.
대조 시료에 대한 증대율은 통상 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 가장 바람직하게는 5배 이상이다. 증대율이 3배 이상이면 신뢰도가 증가한다. 증대의 정도는 측정된 실측값의 대비뿐만 아니라, 예를 들면 어느 종류의 보정용 물질(예를 들면 크레아티닌 등)의 양을 기준으로 하고, 이에 대한 상대값의 비교로부터 결정할 수 있다.
요로상피암으로는 상기 정의와 같이, 예를 들면 방광암, 신우암, 요관암, 요도암 등이 포함된다. 특히 방광암의 검출에서는 표재성 종양과 비교하여 침윤성 종양에서 암의 검출 신뢰성이 유의하게 높았다. 그렇기 때문에, 본 발명은 요로상피암 중에서도, 전이를 일으키기 쉬운 침윤성 종양의 검출에 유효할 것이다.
이와 같이, 본 발명의 요로상피암의 검출 방법은 프라이머 또는 프로브를 이용하여 시료 중 요로상피암 세포로부터 생산된 CXCL1 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 핵산의 발현량을 측정하는 것, 또는 요로상피암 세포에 의해서 생산된 시료 중 CXCL1 단백질을 항체를 이용하여 면역학적으로 측정하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해서 피험자가 요로상피암에 이환하고 있는지를 판정할 수 있을 뿐 만 아니라, 요로상피암 환자와 비요로상피암 환자의 식별을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 방법에 의해서 시료 중 CXCL1 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 핵산의 발현량 또는 CXCL1 단백질을 정량함으로써, 요로상피암의 진행도를 판정하는 것도 가능하게 한다.
본 발명의 실시 형태에 의해 본 발명은 상기 CXCL1 단백질 또는 그의 단편과 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 이용하여, 시료 중 CXCL1 단백질을 면역학적으로 정량함으로써 방광암으로 대표되는 요로상피암을 검출하는 방법을 제공한다.
또한 별도의 실시 형태에 의해, 본 발명은 CXCL1 단백질을 코딩하는 염기 서열로 이루어지는 핵산, 그것과 상보적인 서열로 이루어지는 핵산, 이들 핵산과 엄격한 조건으로 혼성화하는 핵산, 또는 이들의 핵산의 15 이상의 연속한 염기 단편을 이용하여, 시료 중 CXCL1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정함으로써 방광암으로 대표되는 요로상피암을 검출하는 방법을 제공한다.
<CXCL1 유전자의 검출>
본 발명에서 요로상피암의 검출 방법의 하나로서, 핵산을 프라이머 또는 프로브로서 이용하여 시료 중 요로상피암 세포로부터 생산된 CXCL1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 방법을 들 수 있다.
본 발명에서 요로상피암의 존재 및/또는 부재를 판정하기 위해서, 또는 요로상피암을 진단하기 위해서 사용 가능한 핵산은 인간 유래의 CXCL1 유전자, 그의 동족체, 그의 전사 산물 또는 cDNA, 또는 그의 변이체 또는 유도체의 존재, 발현 수 준 또는 존재량을 정성적 및/또는 정량적으로 측정하는 것을 가능하게 한다.
CXCL1 유전자는 비암 조직에 비하여 요로상피암 조직에서 그 발현 수준이 유의하게 증대한다. 그렇기 때문에, 본 발명의 조성물은 비암 조직과 요로상피암 조직에 대해서 CXCL1 유전자의 발현 수준을 측정하고, 이들을 비교하기 위해서 유효하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 핵산은 요로상피암에 이환한 환자의 생체 조직에서 서열 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 핵산 및 그의 상보적 핵산, 상기 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건으로 각각 혼성화하는 핵산 및 그의 상보적 핵산 및 이들의 핵산군의 염기 서열에서 15 이상의 연속한 염기를 포함하는 핵산군으로부터 선택된 1 또는 복수개의 핵산의 조합을 포함한다.
상기한 폴리뉴클레오티드의 단편은 각 핵산의 염기 서열에서, 예를 들면 연속하는 15 내지 서열의 전체 염기수, 15 내지 300 염기, 15 내지 250 염기, 15 내지 200 염기, 15 내지 150 염기, 15 내지 140 염기, 15 내지 130 염기, 15 내지 120 염기, 15 내지 110 염기, 15 내지 100 염기, 15 내지 90 염기, 15 내지 80 염기, 15 내지 70 염기, 15 내지 60 염기, 15 내지 50 염기, 15 내지 40 염기, 15 내지 30 염기 또는 15 내지 25 염기; 25 내지 서열의 전체 염기수, 25 내지 300 염기, 25 내지 250 염기, 25 내지 200 염기, 25 내지 150 염기, 25 내지 140 염기, 25 내지 130 염기, 25 내지 120 염기, 25 내지 110 염기, 25 내지 100 염기, 25 내지 90 염기, 25 내지 80 염기, 25 내지 70 염기, 25 내지 60 염기, 25 내지 50 염기 또는 25 내지 40 염기; 50 내지 서열의 전체 염기수, 50 내지 300 염기, 50 내 지 250 염기, 50 내지 200 염기, 50 내지 150 염기, 50 내지 140 염기, 50 내지 130 염기, 50 내지 120 염기, 50 내지 110 염기, 50 내지 100 염기, 50 내지 90 염기, 50 내지 80 염기, 50 내지 70 염기 또는 50 내지 60 염기; 60 내지 서열의 전체 염기수, 60 내지 300 염기, 60 내지 250 염기, 60 내지 200 염기, 60 내지 150 염기, 60 내지 140 염기, 60 내지 130 염기, 60 내지 120 염기, 60 내지 110 염기, 60 내지 100 염기, 60 내지 90 염기, 60 내지 80 염기 또는 60 내지 70 염기 등의 범위의 염기수를 포함할 수 있지만, 이들로 한정되지 않는 것으로 한다.
본 발명에서 사용되는 상기 핵산류 또는 그의 단편류는 모두 DNA이거나 RNA일 수도 있다.
본 발명의 조성물로서의 핵산은 DNA 재조합 기술, PCR법, DNA/RNA 자동 합성기에 의한 방법 등의 일반적인 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
DNA 재조합 기술 및 PCR법은, 예를 들면 문헌[Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey ＆ Sons, US(1993)]; 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, US(1989)] 등에 기재되는 기술을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 방법에서 프로브(및 경우에 따라 프라이머)로서 사용 가능한 핵산, 그의 변이체 및/또는 그의 단편 중 1개 또는 복수개를 포함하는 요로상피암 진단(검출)용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는, 바람직하게는 상기에 기재한 핵산류로부터 선택되는 1 또는 복수개의 핵산 또는 그의 단편을 포함한다.
본 발명의 키트는 서열 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 핵산, 그의 상보적 서열을 포함하는 핵산, 이들의 핵산과 엄격한 조건으로 혼성화하는 핵산, 또는 이들의 핵산의 단편을 1개 이상 포함할 수 있다.
바람직한 실시 형태로는, 상기 핵산이 서열 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 핵산, 그의 상보적 서열을 포함하는 핵산, 이들의 핵산과 엄격한 조건으로 혼성화하는 핵산, 또는 이들의 15 이상의 연속한 염기를 포함하는 단편이다.
바람직한 실시 형태로는, 상기 단편은 15 이상, 바람직하게는 30 이상, 바람직하게는 50 이상, 바람직하게는 60 이상, 예를 들면 50 내지 100의 연속한 염기를 포함하는 핵산일 수 있다.
본 발명의 키트를 구성하는 상기의 조합은 어디까지나 예시이고, 다른 여러 가지 가능한 조합이 모두 본 발명에 포함되는 것으로 한다.
본 발명의 키트에 포함되는 핵산, 그 변이체 또는 그의 단편은 개별적으로 또는 임의로 조합하여 다른 용기에 포장된다.
본 발명의 키트에 포함되는 프로브로서의 핵산은 고상 담체에 결합되어 있을 수도 있다. 담체에는, 예를 들면 DNA 마이크로어레이, DNA 칩 등의 기판이 포함된다. 즉, 상기 핵산을 포함하는 DNA 마이크로어레이나 DNA 칩도 본 발명의 범위내이다.
고상화될 수 있는 핵산은 상기에서 설명한 본 발명의 모든 핵산이다. 예를 들면, 그러한 핵산은 이하의 1 또는 복수개의 핵산 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
·서열 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 핵산, 이들의 변이체, 또는 15 이상의 연속한 염기를 포함하는 이들의 단편.
·서열 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 핵산.
·서열 1로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건으로 혼성화하는 핵산군, 또는 15 이상의 연속한 염기를 포함하는 이들의 단편.
·서열 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건으로 혼성화하는 핵산군, 또는 15 이상의 연속한 염기를 포함하는 이들의 단편.
·서열 1로 표시되는 염기 서열 또는 그의 상보적 서열의 각각에서 60 이상의 연속한 염기를 포함하는 핵산.
본 발명에서 고상화되는 핵산은 게놈 DNA, cDNA, RNA, 합성 DNA, 합성 RNA 중 어느 하나일 수도 있고, 또는 1개쇄이거나 또는 2개쇄일 수도 있다.
표적 유전자, RNA 또는 cDNA의 발현 수준을 검출, 측정할 수 있는 DNA 칩의 예로는, 아피메트릭스(Affymetrix)사의 진 칩 휴먼 게놈 U133 플러스 2.0 어레이, 에이질런트(Agilent)사의 홀 휴먼 게놈 올리고 마이크로어레이, 다카라바이오사의 인텔리진(IntelliGene)(등록상표) HS 휴먼 익스프레스 칩 등을 들 수 있다.
DNA 마이크로어레이의 제조에 대해서, 예를 들면 미리 제조한 프로브를 고상 표면에 고정화하는 방법을 사용할 수 있다. 미리 제조한 핵산 프로브를 고상 표면에 고정화하는 방법으로는 관능기를 도입한 핵산을 합성하고, 표면 처리한 고상 담체 표면에 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 점착하고, 공유 결합시킨 다(예를 들면, 문헌[J. B. Lamture 등, Nucleic. Acids. Research, 1994년, 제22권, p.2121-2125], 문헌[Z. Guo 등, Nucleic. Acids. Research, 1994년, 제22권, p.5456-5465]). 핵산은 일반적으로는 표면 처리한 고상 담체에 스페이서나 크로스 링커를 통해 공유 결합된다. 유리 표면에 폴리아크릴아미드겔의 미소편을 정렬시키고, 거기에 합성 핵산을 공유 결합시키는 방법도 알려져 있다(문헌[G. Yershov 외, Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A., 1996년, 제94권, p.4913]). 또한, 실리카 마이크로어레이 상에 미소 전극의 어레이를 제조하고, 전극 상에는 스트렙트아비딘을 포함하는 아가로스의 침투층을 설치하여 반응 부위로 하고, 이 부위를 플러스로 하전시킴으로써 비오틴화 폴리뉴클레오티드를 고정하고, 부위의 하전을 제어함으로써, 고속으로 엄밀한 혼성화를 가능하게 하는 방법도 알려져 있다(문헌[R. G. Sosnowski 등, Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A., 1997년, 제94권, p.1119-1123]).
DNA 칩의 기판으로는, DNA를 고상화할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없고, 슬라이드 유리, 실리콘제 칩, 중합체제 칩 및 나일론 멤브레인 등을 예시할 수 있다. 또한 이들 기판에는 폴리 L 리신 코트나 아미노기, 카르복실기 등의 관능기 도입 등의 표면 처리가 되어 있을 수도 있다.
또한 고상화법에 대해서는 일반적으로 이용되는 방법이면 특별히 제한은 없고, 스퍼터 또한 어레이어라 불리는 고밀도 분주기를 이용하여 DNA를 스폿하는 방법이나, 노즐로부터 미소한 액적을 압전 소자 등에 의해 분사하는 장치(잉크젯)를 이용하여 DNA를 기판에 분무하는 방법, 또는 기판 상에서 차례로 뉴클레오티드 합 성을 행하는 방법을 예시할 수 있다. 고밀도 분주기를 이용하는 경우에는, 예를 들면 다수의 웰을 갖는 플레이트의 각각의 웰에 다른 유전자 용액을 넣고, 이 용액을 핀(바늘)으로 들어 올려 기판 상에 순서대로 스폿하는 것에 의한다. 잉크젯법으로는 노즐로부터 유전자를 분사하고, 기판 상에 고속도로 유전자를 정렬 배치하는 것에 의한다. 기판 상에서의 DNA 합성은 기판 상에 결합한 염기를 빛에 의해서 이탈하는 관능기로 보호하고, 마스크를 이용함으로써 특정 부위의 염기에만 빛을 조사하여 관능기를 이탈시킨다. 그 후, 염기를 반응액에 첨가하여, 기판 상의 염기와 커플링시키는 공정을 반복함으로써 행해진다.
혼성화 조건은 한정되지 않지만, 예를 들면 30 ℃ 내지 50 ℃에서 3 내지 4×SSC, 0.1 내지 0.5 ％ SDS 중에서 1 내지 24 시간의 혼성화, 보다 바람직하게는 40 ℃ 내지 45 ℃에서 3.4×SSC, 0.3 ％ SDS 중에서 1 내지 24 시간의 혼성화, 그 후의 세정을 포함한다. 세정 조건으로는, 예를 들면 2×SSC와 0.1 ％ SDS를 포함하는 용액 및 1×SSC 용액, 0.2×SSC 용액에 의한 실온에서의 연속한 세정 등의 조건을 들 수 있다. 여기서 1×SSC는 150 mM 염화나트륨 및 15 mM 시트르산나트륨을 포함하는 수용액(pH 7.2)이다. 상보쇄는 이러한 조건으로 세정하여도 대상으로 하는 플러스쇄와 혼성화 상태를 유지하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 이러한 상보쇄로서, 대상 플러스쇄의 염기 서열과 완전히 상보적인 관계에 있는 염기 서열로 이루어지는 쇄 및 상기 쇄와 적어도 80 ％의 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어지는 쇄를 예시할 수 있다.
본 발명의 키트의 폴리뉴클레오티드 단편을 프라이머로서 PCR을 실시할 때의 엄격한 혼성화 조건의 예로는, 예를 들면 10 mM Tris-HCL(pH 8.3), 50 mM KCl, 1 내지 2 mM MgCl2 등의 조성의 PCR 버퍼를 이용하고, 해당 프라이머의 서열로부터 계산된 융해 온도(Tm)-5 내지 10 ℃에서 15 초 내지 1 분 정도 처리하는 것 등을 들 수 있다. 이러한 Tm의 계산 방법으로서 Tm=2×(아데닌 잔기수+티민 잔기수)+4×(구아닌 잔기수+시토신 잔기수) 등을 들 수 있다.
이들 혼성화에서의 "엄격한 조건"의 다른 예에 대해서는, 예를 들면 문헌[Sambrook, J. ＆ Russel, D. 저, Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001년 1월 15일 발행의 제1권 7.42 내지 7.45, 제2권 8.9 내지 8.17] 등에 기재되어 있고, 본 발명에서 이용할 수 있다.
<CXCL1 단백질의 검출>
본 발명에 따른 요로상피암의 별도의 검출 방법으로서, 항체를 이용하여 시료 중 요로상피암 세포로부터 생산된 CXCL1 단백질의 존재 또는 양을 측정하는 방법을 들 수 있다.
본 발명에서 요로상피암의 존재 및/또는 부재를 판정하기 위해서, 또는 요로상피암을 진단하기 위해서 사용 가능한 항체는 인간 유래의 CXCL1 유전자, 그의 동족체, 또는 그의 변이체 또는 유도체의 번역 산물의 발현 수준 또는 존재량을 정성적 및/또는 정량적으로 측정하는 것을 가능하게 한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 항체로는, CXCL1 단백질 또는 그의 단편과 특이적으로 결합하는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 모노클로날 항체나 폴리클로날 항체로도 사용할 수 있지만, 모노클로날 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체의 글로블린 타입은 상기 특징을 갖는 한 특별히 한정되는 것은 아니고, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 중 어느 하나일 수도 있지만, IgG 및 IgM이 바람직하다. 예를 들면 모노클로날 항체로서 20326.1(ab10375, 아브캄(Abcam)사) 등을 사용할 수 있고, 폴리클로날 항체도 아브캄사 등으로부터 시판되고 있다. 또한, CXCL1 단백질과 특이적으로 결합하는 항체는 이하에 기재하는 바와 같은 방법에 의해서 제조할 수도 있다.
면역원의 제조
본 발명에서 항체를 제조함에 있어서, 면역원(항원)이 되기 위한 단백질을 제조한다. 면역원 단백질로는 CXCL1 단백질 또는 그의 단편을 이용한다. 본 발명에서 면역원으로서 사용 가능한 CXCL1 단백질의 아미노산 서열(서열 2) 및 상기 단백질을 코딩하는 cDNA 서열(서열 1)은, 각각 진뱅크(GenBank)에서 등록번호 NP_001502, NM_001511로서 공개되어 있다. 따라서, 공개되어 있는 아미노산 서열 정보를 이용하여, 당 기술 분야에서 공지된 수법, 예를 들면 고상 펩티드 합성법 등에 의해 면역원으로서 사용하기 위한 CXCL1 단백질 단편을 합성할 수 있다. 면역원으로서 CXCL1 단백질 단편을 사용하는 경우는 KLH, BSA 등의 캐리어-단백질에 연결시켜 사용하는 것이 바람직하다.
또한 CXCL1 단백질은 CXCL1 단백질을 코딩하는 cDNA의 정보를 이용하고, 공지된 DNA 재조합 기술을 이용하여 얻을 수 있다. CXCL1 단백질을 코딩하는 cDNA는 cDNA 클로닝법에 의해서 제조할 수 있다. 본 발명에서 표적인 CXCL1 유전자가 발 현되는 단구, 멜라노마 세포, 기도 상피 세포, 케라티노사이트, 폐포 대식 세포 등의 생체 조직으로부터 추출한 전체 RNA를, 올리고 dT 셀룰로오스 칼럼으로 처리하여 얻어지는 폴리 A(+) RNA에서 RT-PCR법에 의해서 cDNA 라이브러리를 제조하고, 이 라이브러리에서 혼성화 스크리닝, 발현 스크리닝, 항체 스크리닝 등의 스크리닝에 의해서 목적으로 하는 cDNA 클론을 얻을 수 있다. 필요에 따라서, cDNA 클론을 PCR법에 의해서 증폭시킬 수도 있다. 프로브 또는 프라이머는 서열 1에 표시되는 염기 서열에 기초하여 15 내지 100 염기의 연속하는 서열 중으로부터 선택하고, 합성할 수 있다. cDNA 클로닝 기술은, 예를 들면 문헌[Sambrook, J. ＆ Russel, D. 저, Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001년 1월 15일 발행의 제1권 7.42 내지 7.45, 제2권 8.9 내지 8.17]에 기재되어 있다.
CXCL1 단백질은, 예를 들면 상기한 바와 같이 하여 얻어진 cDNA 클론을 발현 벡터에 조립하고, 상기 벡터에 의해서 형질 전환 또는 트랜스펙션된 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 배양함으로써 상기 세포 또는 배양 상청으로부터 얻을 수 있다. 발현 벡터로는 대장균 유래의 플라스미드(예를 들면 pET21a, pGEX4T, pC118, pC119, pC18, pC19 등), 고초균 유래의 플라스미드(예를 들면 pUB110, pTP5 등), 효모 유래의 플라스미드(예를 들면 YEp13, YEp24, YCp50 등) 등을 들 수 있고, 파지 DNA로는 λ 파지 (λgt11, λZAP 등)를 들 수 있다. 또한, 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등의 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus) 등의 곤충 바이러스 벡터를 이용할 수도 있다. 벡터 및 발현계는 노바진(Novagen)사, 다까라 슈죠, 다이이찌 가가꾸 야꾸힝, 퀴아진(Qiagen)사, 스트라타진(Stratagene)사, 프로메가(Promega)사, 로체 다이아그노시틱스(Roche Diagnositics)사, 인비트로진(Invitrogen)사, 제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute)사, 아머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscience)사 등으로부터 입수 가능하다.
벡터에 CXCL1의 cDNA를 삽입하기 위해서는, 우선 정제된 DNA를 적당한 제한 효소로 절단하고, 적당한 벡터의 제한 효소 부위 또는 멀티클로닝 부위에 삽입하여 벡터로 연결하는 방법 등이 채용된다. 벡터에는 상기 단백질을 코딩하는 DNA 이외에 조절 요소, 예를 들면 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 시그널, 리보솜 결합 부위, 복제 개시점, 터미네이터, 선택 마커 등을 포함할 수 있다. 또한 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하기 위해서, 표지 펩티드를 폴리펩티드의 C 말단 또는 N 말단에 붙인 융합 폴리펩티드일 수도 있다. 대표적인 표지 펩티드에는 6 내지 10 잔기의 히스티딘리피트, FLAG, myc 펩티드, GFP 단백질 등을 들 수 있지만, 표지 펩티드는 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한 DNA 재조합 기술에 대해서는, 문헌[Sambrook, J. ＆ Russel, D.](상기)에 기재되어 있다. DNA 단편과 벡터 단편을 연결시키기 위해서는 공지된 DNA 리가아제를 이용한다.
숙주 세포로는 세균 등의 원핵 세포(예를 들면 대장균, 고초균), 효모(예를 들면 사카로미세스 세레비시아), 곤충 세포(예를 들면 Sf 세포), 포유 동물 세포(예를 들면 COS, CHO, BHK) 등을 사용할 수 있다. 숙주 세포에의 재조합 벡터의 도입 방법은 각각의 숙주에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 칼슘 이온을 이용하는 방법, 리포솜을 이용하는 방법, 전기 천공법, 마이크로 인젝션법 등을 들 수 있다.
대장균이나 효모균 등의 미생물을 숙주로서 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는 미생물이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기 염류 등을 함유하고, 형질 전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면 천연 배지, 합성 배지 중 어느 하나를 이용할 수도 있다. 배양은 통상 진탕 배양 또는 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하, 37 ℃에서 6 내지 24 시간 동안 행한다. 배양 기간 중, pH는 중성 부근으로 유지한다. pH의 조정은 무기 또는 유기산, 알칼리 용액 등을 이용하여 행한다. 배양 중에는 필요에 따라서 암피실린이나 테트라사이크린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수도 있다. 포유류 세포 등의 형질 전환체를 배양하는 경우에도, 각각의 세포에 알맞은 배지 중에서 배양한 후, 배양 상청 또는 세포 내에 정산된 단백질을 회수한다. 이 때 배지에는 혈청을 포함하거나, 포함하지 않을 수도 있지만, 무혈청 배지에서의 배양이 보다 바람직하다. CXCL1 단백질이 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우에는 균체 또는 세포를 파쇄함으로써 단백질을 추출한다. 또한, CXCL1 단백질이 균체외 또는 세포외에 생산되는 경우에는 배양액을 그대로 사용하거나, 원심 분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다.
표지 펩티드를 붙이지 않고 본 발명에 따른 단백질을 생산한 경우에는, 그 정제법으로서 예를 들면 한외 여과, 염석, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 등을 포함하는 방법을 들 수 있다. 또한 이것 추가로, 어피니티 크로마토그래피, HPLC, 소수성 크로마토그래피, 등전점 크로마토그래피 등을 조합하는 방법일 수도 있다. 한편, 해당 단백질에 히스티딘 리피트, FLAG, myc, GFP라는 표지 펩티드를 붙이고 있는 경우에는, 일반적으로 이용되는 각각의 표지 펩티드에 알맞은 어피니티 크로마토그래피에 의한 방법을 들 수 있다. 단리·정제가 용이해지는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 특히 폴리펩티드와 표지 펩티드와의 융합 단백질의 형태로 발현하도록 발현 벡터를 구축하고, 유전자 공학적으로 해당 단백질을 제조하면 단리·정제도 용이하다. CXCL1 단백질이 얻어지는지는 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동 등에 의해 확인할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 단백질을 인식하는 항체는, 항체의 항원 결합 부위를 통해 상기 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 구체적으로는, CXCL1 단백질 또는 그의 단편, 그의 변이체 단백질 또는 융합 단백질 등을 각각에 면역 반응성인 항체를 생산하기 위한 면역원으로서 사용하는 것이 가능하다.
보다 구체적으로는 단백질, 단편, 변이체, 융합 단백질 등은 항체 형성을 인출하는 항원 결정기 또는 에피토프를 포함하지만, 이들 항원 결정기 또는 에피토프는 직쇄일 수도 있고, 보다 고차 구조(단속적)일 수도 있다. 또한, 상기 항원 결정기 또는 에피토프는 해당 기술 분야에 알려지는 모든 방법에 의해서 동정할 수 있다.
본 발명의 단백질에 의해서 모든 양태의 항체가 유도된다. 상기 단백질의 전부 또는 일부, 또는 에피토프가 단리되어 있으면, 관용적 기술을 이용하여 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체가 모두 제조 가능하다. 방법에는 예를 들면, 문헌[Kennet 등(감수), Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Ple num Press, New York, 1980]에 개시된 방법이 있다.
이어서, 얻어진 단백질을 완충액에 용해시켜 면역원을 제조한다. 또한, 필요하면 면역을 효과적으로 행하기 위해서 보조제를 첨가할 수도 있다. 보조제로는, 시판되고 있는 완전 프로인트 보조제, 불완전 프로인트 보조제, 수산화알루미늄(alum), 무라밀 펩티드 등을 들 수 있으며, 이들을 모두 혼합할 수도 있다.
모노클로날 항체의 제조
(1) 면역 및 항체 생산 세포의 채취
상기와 같이 하여 얻어진 면역원을 포유 동물, 예를 들면 래트, 마우스(예를 들면 근교계 마우스의 Balb/c), 토끼 등에 투여한다. 면역원의 1회의 투여량은 면역 동물의 종류, 투여 경로 등에 의해 적절하게 결정되는 것이지만, 동물 1 마리당 약 50 내지 200 ㎍일 수 있다. 면역은 주로 피하, 복강 내에 면역원을 주입함으로써 행해진다. 또한, 면역의 간격은 특별히 한정되지 않으며, 첫회 면역 후, 수일 내지 수주간 간격으로, 바람직하게는 1 내지 4주간 간격으로 2 내지 10회, 바람직하게는 3 내지 4회 추가 면역을 행한다. 첫회 면역 후, 면역 동물의 혈청 중 항체가의 측정을 ELISA(효소 결합 면역 측정)법 등에 의해 반복하여 행하고, 항체가가 플래토에 도달했을 때는, 면역원을 정맥 내 또는 복강 내에 주사하여 최종 면역으로 한다. 최종 면역일로부터 2 내지 5일 후, 바람직하게는 3일 후에, 항체 생산 세포를 채취한다. 항체 생산 세포로는 비장 세포, 림프절 세포, 말초혈 세포 등을 들 수 있지만, 비장 세포 또는 국소 림프절 세포가 바람직하다.
(2) 세포 융합
또한 본 발명에 따르면, 각 단백질에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제조한다. 이러한 하이브리도마는 관용적 기술에 의해서 생산하고, 동정하는 것이 가능하다. 이러한 하이브리도마 세포주를 생산하기 위한 한가지 방법은 동물을 본 발명의 단백질로 면역하고, 면역된 동물로부터 비장 세포를 채취하여, 상기 비장 세포를 골수종 세포주에 융합시키고, 그에 따라 하이브리도마 세포를 생성하고, 이 효소에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 동정하는 것을 포함한다. 항체 생산 세포와 융합시키는 골수종 세포주로는 마우스 등의 동물의 일반적으로 입수가능한 주화 세포를 사용할 수 있다. 사용하는 세포주로는 약제 선택성을 갖고, 미융합의 상태로는 HAT 선택 배지화(히포크산틴, 아미노푸테린, 티민을 포함함)에서 생존할 수 없고, 항체 생산 세포와 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 성질을 갖는 것이 바람직하다. 또한 주화 세포는 면역 동물과 동종계의 동물에서 유래하는 것이 바람직하다. 골수종 세포주의 구체예로는 BALB/c 마우스 유래의 히포크산틴·구아닌·포스포리보실·트랜스페라제(HGPRT) 결손 세포주인 P3X63-Ag. 8주(ATCC TIB9) 등을 들 수 있다.
이어서, 상기 골수종 세포주와 항체 생산 세포를 세포 융합시킨다. 세포 융합은 혈청을 포함하지 않는 DMEM, RPMI-1640 배지 등의 동물 세포 배양용 배지 중에서 항체 생산 세포와 골수종 세포주를 약 1:1 내지 20:1의 비율로 혼합하고, 세포 융합 촉진제의 존재하에서 융합 반응을 행한다. 세포 융합 촉진제로서 평균 분자량 1500 내지 4000 달톤의 폴리에틸렌글리콜 등을 약 10 내지 80 ％의 농도로 사용할 수 있다. 또한 경우에 따라서는 융합 효율을 높이기 위해서, 디메틸술폭시드 등의 보조제를 병용할 수도 있다. 또한, 전기 자극(예를 들면 전기 천공)을 이용 한 시판되고 있는 세포 융합 장치를 이용하여 항체 생산 세포와 골수종 세포주를 융합시킬 수도 있다.
(3) 하이브리도마의 선별 및 클로닝
세포 융합 처리 후 세포로부터 목적으로 하는 하이브리도마를 선별한다. 그 방법으로서 세포 현탁액을, 예를 들면 소태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지 등에서 적당히 희석한 후, 마이크로타이터 플레이트 상에 200만개/웰 정도 감고, 각 웰에 선택 배지를 첨가하여, 이후 적당히 선택 배지를 교환하여 배양을 행한다. 배양 온도는 20 내지 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃이다. 골수종 세포가 HGPRT 결손주 또는 티미딘키나제 결손주인 경우에는 히포크산틴·아미노프테린·티미딘을 포함하는 선택 배지(HAT 배지)를 이용함으로써, 항체 생산능을 갖는 세포와 골수종 세포주의 하이브리도마만을 선택적으로 배양하고, 증식시킬 수 있다. 그 결과, 선택 배지에서 배양 개시 후, 약 14일 전후에서 생육되는 세포를 하이브리도마로서 얻을 수 있다.
이어서, 증식된 하이브리도마의 배양 상청 중에, 목적으로 하는 항체의 존재 여부를 스크리닝한다. 하이브리도마의 스크리닝은 통상의 방법에 따르면 되고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 하이브리도마로서 생육한 웰에 포함되는 배양 상청의 일부를 채취하고, 효소 면역 측정법(EIA: Enzyme Immuno Assay 및 ELISA), 방사 면역 측정법(RIA: Radio Immuno Assay) 등에 의해서 행할 수 있다. 융합 세포의 클로닝은 한계 희석법 등에 의해 행하고, 최종적으로 모노클로날 항체 생산 세포인 하이브리도마를 수립한다. 본 발명의 하이브리도마는 후술하는 바와 같이 RPMI-1640, DMEM 등의 기본 배지 중에서의 배양에서 안정적이고, 요로상피암에서 유래하는 CXCL1 단백질과 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 생산, 분비하는 것이다.
(4) 항체의 회수
모노클로날 항체는 관용적 기술에 의해서 회수 가능하다. 즉, 수립한 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 채취하는 방법으로서, 통상의 세포 배양법 또는 복수개 형성법 등을 채용할 수 있다. 세포 배양법에서는, 하이브리도마를 10 ％ 소태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지, MEM 배지 또는 무혈청 배지 등의 동물 세포 배양 배지 중에서, 통상의 배양 조건(예를 들면 37 ℃, 5 ％ CO2 농도)으로 2 내지 10일간 배양하고, 그 배양 상청으로부터 항체를 취득한다. 복수 형성법의 경우는 골수종 세포 유래의 포유 동물과 동종계 동물의 복강 내에 하이브리도마를 약 1000만개 투여하고, 하이브리도마를 대량으로 증식시킨다. 또한, 1 내지 2주간 후에 복수 또는 혈청을 채취한다.
상기 항체의 채취 방법에서 항체의 정제가 필요해지는 경우는 유안 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 적당히 선택하거나, 또는 이들을 조합함으로써, 정제된 본 발명의 모노클로날 항체를 얻을 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체에는 키메라 항체, 예를 들면 마우스 모노클로날 항체의 인간화형이 포함된다. 또한 본 발명에 따르면, 상기 항체의 항원 결합 단 편도 제공된다. 관용적 기술에 의해서 생산 가능한 항원 결합 단편의 예에는, Fab 및 F(ab')2 단편이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 유전자 공학 기술에 의해서 생산 가능한 항체 단편 및 유도체도 또한 제공된다. 본 발명의 항체는 시험관 내 및 생체 내 중 어디에서도 본 발명의 폴리펩티드 또는 그 (폴리)펩티드 단편의 존재를 검출하기 위한 에세이에 사용 가능하다. 또한 본 발명의 항체는 면역 어피니티 크로마토그래피에 의해서 단백질 또는 단백질 단편을 정제하는 것에도 사용할 수 있다.
폴리클로날 항체의 제조
폴리클로날 항체를 제조하는 경우는 상기와 마찬가지로 동물을 면역하고, 최종 면역일부터 6 내지 60일 후에 효소 면역 측정법(EIA 및 ELISA), 방사 면역 측정법(RIA) 등으로 항체가를 측정하고, 최대 항체가를 나타낸 날에 채혈하여 항혈청을 얻는다. 그 후에는 항혈청 중 폴리클로날 항체의 반응성을 ELISA법 등으로 측정한다.
<검출법>
본 발명의 방법은 본 발명의 상기 항체를 이용하는 측정법, 즉 면역학적 측정법, 또는 CXCL1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 방법 중 어느 하나의 방법도 바람직하다.
면역학적 측정법으로서 예를 들면, 효소 면역 측정법(ELISA 및 EIA), 형광 면역 측정법, 방사 면역 측정법(RIA), 발광 면역 측정법, 면역 비탁법, 라텍스 응 집 반응, 라텍스 비탁법, 적혈구 응집 반응, 입자 응집 반응 또는 웨스턴 블로팅법을 들 수 있다.
유전자 유래의 핵산의 발현량을 측정하는 방법으로는 정량 RT-PCR법, DNA 어레이법, 노던 블로팅법, 노던 혼성화법, 서던 블로팅법, 서던 혼성화법 등을 들 수 있다.
본 발명의 단백질 검출 방법에서 피검 대상이 되는 시료로는, 요로상피암에서 유래하는 CXCL1 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 핵산이 포함될 가능성이 있는 생체 시료이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 특히, 뇨, 혈액, 혈장, 혈청과 같은 체액 시료에서 얻어진 CXCL1 단백질의 측정값은 요로상피암의 지표로서 유용하다. 이와 같이, 본 발명의 요로상피암의 검출 방법은 암 조직뿐만 아니라 혈액이나 뇨에서 검출 가능하기 때문에, 간편한 검출법으로서 매우 유용하다.
본 발명의 단백질 검출 방법을 효소 면역 측정법, 형광 면역 측정법, 방사 면역 측정법 또는 발광 면역 측정법 등의 표지를 이용한 면역 측정법에 의해 실시하는 경우에는, 본 발명의 항체를 고상화하거나, 또는 시료 중의 성분을 고상화하여, 이들의 면역학적 반응을 행하는 것이 바람직하다.
고상 담체로는 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 폴리비닐톨루엔, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리염화비닐, 나일론, 폴리메타크릴레이트, 라텍스, 젤라틴, 아가로스, 셀룰로오스, 세파로스, 유리, 금속, 세라믹 또는 자성체 등의 재질로 이루어지는 비드, 마이크로플레이트, 시험관, 스틱 또는 시험편(테스트 스트립) 등의 형상의 불용성 담체를 사용할 수 있다.
고상화는, 고상 담체와 본 발명의 항체 또는 시료 성분을 물리적 흡착법, 화학적 결합법 또는 이들 병용 등의 공지된 방법에 따라서 결합시킴으로써 행할 수 있다.
본 발명에서는 본 발명의 항체와, 시료 중 요로상피암 세포에서 유래하는 CXCL1 단백질과의 반응을 용이하게 검출하기 위해서, 본 발명의 항체를 표지함으로써 상기 반응을 직접 검출하거나, 또는 표지 이차 항체를 이용함으로써 간접적으로 검출한다. 본 발명의 검출 방법에서는, 감도의 관점에서 후자의 간접적 검출(예를 들면 샌드위치법 등)을 이용하는 것이 바람직하다.
표지 물질로는, 효소 면역 측정법의 경우에는 퍼옥시다제(POD), 알칼리포스파타제, β-갈랄토시다제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스옥시다제, 락트산 탈수소 효소, 아밀라제 또는 비오틴-아비딘 복합체 등을, 형광 면역 측정법의 경우에는 플루오레세인 이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트, 치환 로다민 이소티오시아네이트, 디클로로트리아진 이소티오시아네이트, 알렉사(Alexa) 또는 알렉사플루오로(AlexaFluoro) 등을, 또한 방사 면역 측정법의 경우에는 트리튬, 요오드 125 또는 요오드 131 등을 사용할 수 있다. 또한, 발광 면역 측정법은 NADH-, FMNH2-, 루시페라제계, 루미놀-과산화수소-POD계, 아크리디늄 에스테르계 또는 디옥세탄 화합물계 등을 사용할 수 있다.
표지 물질과 항체와의 결합법은, 효소 면역 측정법의 경우에는 글루타르알데히드법, 말레이미드법, 피리딜디술피드법 또는 과요오드산법 등의 공지된 방법을, 방사 면역 측정법의 경우에는 클로라민 T법, 볼턴 헌터법 등의 공지된 방법을 사용할 수 있다. 측정의 조작법은, 공지된 방법(문헌[Current protocols in Protein Sciences, 1995년, John Wiley ＆ Sons Inc., Current protocols in Immunology, 2001년, John Wiley ＆ Sons Inc.])에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체를 직접 표지하는 경우에는 시료 중의 성분을 고상화하고, 표지한 본 발명의 항체와 접촉시켜 CXCL1 단백질-본 발명의 항체의 복합체를 형성시킨다. 또한, 미결합의 표지 항체를 세정 분리하여, 결합 표지 항체량 또는 미결합 표지 항체량으로부터 시료 중 CXCL1 단백질량을 측정할 수 있다.
또한 예를 들면, 표지 이차 항체를 이용하는 경우에는, 본 발명의 항체와 시료를 반응시키고(일차 반응), 또한 표지 이차 항체를 반응시킨다(이차 반응). 일차 반응과 이차 반응은 반대 순서로 행할 수도 있고, 동시에 행할 수도 있으며, 또는 시간차를 두고 행할 수도 있다. 일차 반응 및 이차 반응에 의해 고상화한 CXCL1 단백질-본 발명의 항체-표지 이차 항체의 복합체, 또는 고상화한 본 발명의 항체-CXCL1 단백질-표지 이차 항체의 복합체가 형성된다. 또한, 미결합의 표지 이차 항체를 세정 분리하여 결합 표지 이차 항체량 또는 미결합 표지 이차 항체량으로부터 시료 중 CXCL1 단백질량을 측정할 수 있다.
구체적으로는, 효소 면역 측정법의 경우는 표지 효소에 그 최적 조건하에서 기질을 반응시키고, 그 반응 생성물의 양을 광학적 방법 등에 의해 측정한다. 형광 면역 측정법의 경우에는 형광 물질 표지에 의한 형광 강도를, 방사 면역정법의 경우에는 방사성 물질 표지에 의한 방사능량을 측정한다. 발광 면역 측정법의 경 우는 발광 반응계에 의한 발광량을 측정한다.
본 발명의 방법으로는, 면역 비탁법, 라텍스 응집 반응, 라텍스 비탁법, 적혈구 응집 반응 또는 입자 응집 반응 등의 면역 복합체 응집물의 생성을 그 투과광이나 산란광을 광학적 방법에 의해 측정하거나, 육안적으로 측정하는 측정법에 의해 실시하는 경우에는, 용매로서 인산 완충액, 글리신 완충액, 트리스 완충액 또는 굿 완충액 등을 사용할 수 있고, 추가로 폴리에틸렌글리콜 등의 반응 촉진제나 비특이적 반응 억제제를 반응계에 포함시킬 수도 있다.
이하에, 본 발명의 검출법의 바람직한 실시 형태의 일례를 나타낸다.
최초로 본 발명의 항체를 일차 항체로서 불용성 담체에 고정한다. 또한, 바람직하게는 항원이 흡착하지 않은 고상 표면을 항원과는 무관계의 단백질(자(仔) 소혈청, 소혈청 알부민, 젤라틴 등)에 의해 블록킹한다. 계속해서, 고정화된 일차 항체와 피검 시료를 접촉시킨다. 이어서, 상기 일차 항체와 다른 부위에서 CXCL1 단백질과 반응하는 표지 이차 항체를 접촉시켜, 상기 표지로부터의 신호를 검출한다. 여기서 이용하는 "일차 항체와 다른 부위에서 CXCL1 단백질과 반응하는 이차 항체"는, 일차 항체와 CXCL1 단백질과의 결합 부위 이외의 부위를 인식하는 항체이면 특별히 제한은 없고, 면역원의 종류를 막론하고, 폴리클로날 항체, 항혈청, 모노클로날 항체 중 어느 하나일 수도 있으며, 또한 이들 항체의 단편(Fab, F(ab')2, Fab, Fv, ScFv 등)를 이용할 수도 있다. 또한, 이차 항체로서 복수종의 모노클로날 항체를 이용할 수도 있다.
또한 이것과는 반대로 본 발명의 항체에 표지를 붙여 이차 항체로 하고, 본 발명의 항체와 다른 부위에서, CXCL1 단백질과 반응하는 항체를 일차 항체로서 불용성 담체에 고정하고, 이 고정화된 일차 항체와 피검 시료를 접촉시키고, 이어서 이차 항체로서 표지를 붙인 본 발명의 항체를 접촉시키고, 상기 표지로부터의 신호를 검출할 수도 있다.
또한 본 발명의 항체는 상술한 바와 같이 요로상피암 세포에서 유래하는 CXCL1 단백질과 특이적으로 반응하기 때문에, 암의 진단약으로서 사용할 수 있다. 본 발명의 진단약은 본 발명의 항체를 포함하는 것이고, 따라서 본 발명의 진단약을 이용하여 요로상피암에의 환자로 의심되는 개체로부터 채취한 시료 중에 포함되는 요로상피암 세포에서 유래하는 CXCL1 단백질을 검출함으로써, 상기 개체의 요로상피암의 환자를 진단할 수 있다.
또한 본 발명의 진단약은 면역학적 측정을 행하기 위한 수단이면 어느 수단에서도 이용할 수 있지만, 당 기술 분야에서 공지된 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립 등의 간편한 수단과 조합하여 이용함으로써, 더욱 간편하고 신속히 암을 진단할 수 있다. 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립이란, 예를 들면 시료를 흡수하기 쉬운 재료를 포함하는 시료 수용부, 본 발명의 진단약을 함유하는 시약부, 시료와 진단약과의 반응물이 이동하는 전개부, 전개된 반응물을 정색(呈色)하는 표지부, 정색된 반응물이 전개되는 제시부 등으로 구성되는 것이고, 임신 진단약과 마찬가지의 형태로 할 수 있다. 우선, 시료 수용부에 시료를 제공하면, 시료 수용부는 시료를 흡수하여 시료를 시약부에까지 도달시킨다. 계속해서, 시약부에서 시료 중 요로상피암 세포 유래의 CXCL1 단백질과 본 발명의 항체와의 반응이 발생하고, 반응한 복합체가 전개부를 이동하여 표지부에 도달한다. 표지부에서는 상기 반응 복합체와 표지 이차 항체와의 반응이 발생하여, 그 표지 이차 항체와의 반응물이 제시부에까지 전개하면 정색이 인정되는 것으로 된다. 상기 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립은, 사용자에 대하여 고통이나 시약 사용에 의한 위험성을 일체 제공하지 않는 것이기 때문에, 가정에서의 모니터에 사용할 수 있고, 그 결과를 각 의료 기관 수준에서 정밀히 조사·치료(외과적 절제 등)하여, 전이·재발 예방으로 결부시키는 것이 가능해진다. 또한 현재 이 테스트 스트립은, 예를 들면 일본 특허 공개 (평)10-54830호 공보에 기재된 바와 같은 제조 방법에 의해 염가에 대량 생산할 수 있는 것이다. 또한, 본 발명의 진단약과 이미 알려진 요로상피암의 종양 마커에 대한 진단약을 조합하여 사용함으로써, 더욱 신뢰성이 높은 진단이 가능하게 된다.
따라서, 본 발명은 또한 CXCL1 단백질 또는 그 단편과 특이적으로 반응하는 항체 또는 그 단편을 포함하는 요로상피암 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트에 있어서 항체는 상기한 바와 같은 고상 담체에 결합되어 있을 수도 있다. 또한 본 발명의 키트는 표지 이차 항체, 담체, 세정 버퍼, 시료 희석액, 효소 기질, 반응 정지액, 정제된 표준 물질로서의 CXCL1 단백질 등을 포함할 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들에 의해서 한정되는 것은 아니다.
(1) 정상 요로상피 세포 배양상 제조 중 프로테옴 해석
정상 요로상피 세포는 신적증 예환자 유래의 정상 요관으로부터 얻었다. 정상 요관으로부터 추출한 요로상피 세포를 10 cm의 배양 접시 내에서 디파인드(Defined) KSFM 배지에 의해서 배양을 행하였다(문헌[Scriven, S. D. 외, 1997년, Journal of Urology, 제158권, p.1147-1152]). 직경 10 cm의 배양 접시 4매에 배양한 요로상피 세포가 90 ％ 컨플루언스가 된 시점에서 PBS(-)로 3회 세정 후, 혈청을 포함하지 않는 RPMI 1640 배지에 배지 교환을 행하여 24 시간 동안 배양하고, 배양 상청을 회수하였다. 이 배양 상청을 초원심(150,000 g, 30 분, 4 ℃) 처리하여 침사를 제거한 후, 원심 상청을 아미콘 울트라(Amicon Ultra)-15(밀리포어(Millipore)사)를 이용한 원심 처리에 의해서 농축하였다(4,000 g, 20 분, 4 ℃). 이 결과, 배양 세포 상청 40 ㎖로부터 1 mg의 단백질을 추출하였다.
추출한 단백질의 200 ㎍을 프로테옴랩(Proteome Lab)TM PF2D 시스템(베크만 콜터(Beckman Coulter)사) 역상 크로마토그래피로 26 분획으로 분리하고, 트립신 소화한 후, Q-TOF 울티마(마이크로매스(Micromass)사)로 망라적으로 단백질 동정을 행하였다. 그 결과, 약 600 종류의 단백질이 동정되고, 그 중 약 20 종류가 증식 인자 활성을 갖는 것이 추찰되었다.
(2) 발현 유전자 해석
방광암 주화 세포(RT112, 5637, T24, EJ)는 각각 10 ％ 소태아 혈청을 포함한 RPMI 1640, 정상 요로상피 세포는 디파인드-KSFM에 의해서 배양하였다. 이들 세포로부터 각각 트리졸(Trizol) 시약 (인비트로진사) 및 RNeasy 미니 키트(퀴아진)를 이용하여, 동일 회사 추장의 프로토콜에 의해 전체 RNA를 제조하였다. 전체 RNA 3 μg으로부터 퍼스트 스트랜드 cDNA 합성 키트(아머샴 바이오사이언스)를 사용하여, cDNA를 합성하였다. 이들 cDNA를 템플릿으로 하고, 프로테옴 해석으로부터 발견된 증식 인자 중 하나인 CXCL1 및 그 수용체인 CXCR2에 대한 프라이머를 각각 설계하여, 유전자 발현을 RT-PCR법에 의해서 검토하고, 아가로스겔 전기 영동에 의해서 분자량을 지표로서 발현의 유무를 확인하였다(도 1). 분자량 마커로는 Hi-Lo DNA 마커(바이오넥서스(BIONEXUS))를 이용하였다.
CXCL1의 mRNA 발현은 침윤성 방광암 유래의 세포주인 5637, T24에서는 고도의 발현이 보였다. 정상 조직에서는 발현이 검출되지만, 그 정도는 침윤성 암 유래의 세포주보다도 낮은 것이 발견되었다.
(3) 배양 상청 중 CXCL1 농도 측정
방광암 주화 세포(5637, T24)는 각각 10 ％ 소태아 혈청을 포함한 RPMI 1640, 정상 요로상피 세포는 디파인드-KSFM에 의해서 배양하였다. 각 세포를 96구멍 플레이트 내에서 24 시간 동안 배양하고, 거의 컨플루언스가 된 상태에서 배양액을 교환하였다. 또한 24 시간 후에 배양 상청을 회수하였다. 각 배양 상청 중 CXCL1 단백질 농도를 인간 GRO 알파/CXCL1 콴티킨 ELISA 키트(R＆D 시스템즈사)를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 정상 요로상피 세포의 배양 상청에서는 CXCL1은 검출되지 않았지만, 침윤성 암 유래의 세포주인 5637, T24의 배양 상청에서는 약 5 내지 20 ng/㎖ 이상의 고농도의 CXCL1가 검출되었다(도 2).
(4) 방광암 환자뇨 중 CXCL1 농도 측정
침윤성의 방광암 환자 3명 및 건강한 정상 대조자 1명으로부터 뇨 샘플을 얻어, 뇨 중 CXCL1 단백질 농도를 인간 GRO 알파/CXCL1 콴티킨 ELISA 키트(R＆D 시스템즈사)를 이용하여 측정하였다. 각 샘플에서 뇨 중 크레아티닌 농도를 이용하여 CXCL1 단백질 농도의 보정을 행한 바, 방광암 환자에게서 건강한 정상 대조자에 비하여 고가의 뇨 중 CXCL1 단백질 농도가 검출되었다(도 3).
(5) 진행도별의 방광암 환자 뇨 중 CXCL1 농도 측정
조기(Ta)의 방광암 환자 32명, 진행성(T1 이상)의 방광암 환자 35명 및 건강한 정상 대조자 40명으로부터 뇨 샘플을 얻어, 뇨 중 CXCL1 단백질 농도를 인간 GRO 알파/CXCL1 콴티킨 ELISA 키트(R＆D 시스템즈사)를 이용하여 측정하였다. 조기 및 진행성 방광암 환자에게서 건강한 정상 대조자에 비하여 고가의 뇨 중 CXCL1 단백질 농도가 검출되었다(도 4).
(6) 정상 요로상피 조직 및 방광암에서의 CXCL1 발현의 측정
정상적인 요로상피 조직 및 방광암 조직을 10 ％ 중성 포르말린에 의해서 고정하고, 파라핀 포매하였다. 이 파라핀 블록을 5 ㎛의 두께의 세그먼트로 하고, 탈파라핀화와 습윤화하고, 슬라이드 유리 상에 고정하였다. 내인성의 퍼옥시다제 활성을 과산화수소에 의해서 억제하였다. 슬라이드 유리를 PBS에서 세정한 후, 1 ％ 토끼 혈청을 포함하는 PBS에 의해서 30 분간 처리하였다. 1차 항체로서, 항 CXCL1 항체(Groα(C-15): SC1374, 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)사)를 1:150으로 희석하여 이용하고, 4 ℃에서 밤새 정치하였다. 또한, 히스토파인 심플 스테인 MAX-PO(가부시끼가이샤 니치레이 바이오사이언스, 일본)를 이용하여 디아미노벤지딘에 의한 발색을 행하였다. 또한 세그먼트를 헤마톡시린에 의해서 가볍게 염색하였다. 종양 세포의 세포질의 10 ％ 이상이 염색된 경우를 CXCL1 양성이라 판단하였다.
정상적인 요로상피 조직은 염색되지 않고, CXCL1의 발현은 인정되지 않았지만, 진행성(pT2G3) 방광암 조직 및 림프절 전이소에서는 강한 염색이 확인되어, CXCL1이 강하게 발현하고 있는 것이 나타났다(도 5).
따라서, 본 발명에 의해 상기 항체 또는 핵산 프로브를 이용하여 요로상피 조직 또는 세포 등에서의 CXCL1 유전자의 발현 또는 발현량을 측정하여 대조와 비교함으로써도, 상기 유전자의 발현의 검출, 또는 발현량의 증대를 지표로 하여 조기 또는 진행성의 방광암 등의 요로상피암을 효과적으로 검출할 수 있다.
본 발명에 의해 간이하고 염가인 방법으로 요로상피암을 효과적으로 검출할 수 있기 때문에, 요로상피암의 조기 발견, 진단 및 치료가 가능해진다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 환자 뇨를 이용하여 요로상피암을 비침습적으로 검출할 수 있기 때문에, 요로상피암을 간편하고 신속히 검출하는 것이 가능해진다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에서 도입한다.
SEQUENCE LISTING <110> TORAY Industries, Inc Kyoto University <120> Kit and method for diagnosis of urothelial cancer <130> PH-2869-PCT <140> PCT/JP2006/317379 <141> 2006-09-01 <150> JP 2005-255370 <151> 2005-09-02 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1103 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cacagagccc gggccgcagg cacctcctcg ccagctcttc cgctcctctc acagccgcca 60 gacccgcctg ctgagcccca tggcccgcgc tgctctctcc gccgccccca gcaatccccg 120 gctcctgcga gtggcactgc tgctcctgct cctggtagcc gctggccggc gcgcagcagg 180 agcgtccgtg gccactgaac tgcgctgcca gtgcttgcag accctgcagg gaattcaccc 240 caagaacatc caaagtgtga acgtgaagtc ccccggaccc cactgcgccc aaaccgaagt 300 catagccaca ctcaagaatg ggcggaaagc ttgcctcaat cctgcatccc ccatagttaa 360 gaaaatcatc gaaaagatgc tgaacagtga caaatccaac tgaccagaag ggaggaggaa 420 gctcactggt ggctgttcct gaaggaggcc ctgcccttat aggaacagaa gaggaaagag 480 agacacagct gcagaggcca cctggattgt gcctaatgtg tttgagcatc gcttaggaga 540 agtcttctat ttatttattt attcattagt tttgaagatt ctatgttaat attttaggtg 600 taaaataatt aagggtatga ttaactctac ctgcacactg tcctattata ttcattcttt 660 ttgaaatgtc aaccccaagt tagttcaatc tggattcata tttaatttga aggtagaatg 720 ttttcaaatg ttctccagtc attatgttaa tatttctgag gagcctgcaa catgccagcc 780 actgtgatag aggctggcgg atccaagcaa atggccaatg agatcattgt gaaggcaggg 840 gaatgtatgt gcacatctgt tttgtaactg tttagatgaa tgtcagttgt tatttattga 900 aatgatttca cagtgtgtgg tcaacatttc tcatgttgaa actttaagaa ctaaaatgtt 960 ctaaatatcc cttggacatt ttatgtcttt cttgtaaggc atactgcctt gtttaatggt 1020 agttttacag tgtttctggc ttagaacaaa ggggcttaat tattgatgtt ttcatagaga 1080 atataaaaat aaagcactta tag 1103 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Arg Ala Ala Leu Ser Ala Ala Pro Ser Asn Pro Arg Leu Leu 1 5 10 15 Arg Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Gly Arg Arg Ala 20 25 30 Ala Gly Ala Ser Val Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr 35 40 45 Leu Gln Gly Ile His Pro Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Lys Ser 50 55 60 Pro Gly Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn 65 70 75 80 Gly Arg Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Ile Val Lys Lys Ile 85 90 95 Ile Glu Lys Met Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn 100 105 1/3

Claims (32)

  1. 피험자 유래의 생체 시료 중 CXCL1 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 시험관 내에서 측정하는 것을 포함하는 요로상피암을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질량 또는 상기 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단백질량 또는 상기 유전자의 발현량이 대조 시료의 것과 비교하여 유의하게 증대하는 것을 지표로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증대가 2배 이상인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 증대가 3배 이상인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 측정이 면역학적 방법에 의한 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 측정이 혼성화에 의한 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 측정이 상기 단백질 또는 상기 유전자와 결합 가능한 물질을 이용하여 행해지는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 단백질과 결합 가능한 물질이 항체 또는 그의 단편인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 유전자와 결합 가능한 물질이 핵산 프로브인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 핵산 프로브가 서열 1로 표시되는 염기 서열 또는 그의 변이체로 이루어지는 핵산, 그의 상보적 서열로 이루어지는 핵산, 이들의 핵산과 엄격한 조건으로 혼성화하는 핵산, 또는 이들의 15 이상의 연속한 염기를 포함하는 단편을 포함하는 방법.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 핵산 프로브가 표지되어 있는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 단백질 또는 그의 단편과 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 이용하여, 시료 중 상기 단백질을 면역학적으로 측정하고, 상기 단백질의 양이 대조 시료의 것과 비교하여 증대하고 있는 것을 지표로 하여 요로상피암을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 서열 1로 표시되는 염기 서열 또는 그의 변이체로 이루어지는 핵산, 그의 상보적 서열로 이루어지는 핵산, 이들의 핵산과 엄격한 조건으로 혼성화하는 핵산, 또는 이들의 15 이상의 연속한 염기를 포함하는 단편으로 이루어지는 프로브를 이용하여 시료 중 상기 유전자의 발현량을 측정하고, 상기 발현량이 대조 시료의 것과 비교하여 증대하고 있는 것을 지표로 하여 요로상피암을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 요로상피암이 방광암, 신우암, 요관암 및 요도암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 시료가 혈액, 혈장, 혈청 또는 뇨인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 시료가 요로상피 조직 또는 세포인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 서열 2에 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 변이체 서열을 갖는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 유전자가 서열 1에 표시되는 염기 서열 또는 그의 변이체 서열을 갖는 방법.
  20. CXCL1 단백질 또는 그의 단편과 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편, 또는 이들의 화학 수식 유도체를 포함하는 요로상피암 진단용 키트.
  21. 제20항에 있어서, 상기 단백질이 서열 2에 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 변이체 서열을 갖는 키트.
  22. 제20항에 있어서, 상기 단백질의 단편이 8개 이상의 아미노산으로 이루어지는 에피토프를 포함하는 키트.
  23. 제20항에 있어서, 상기 요로상피암이 방광암, 신우암, 요관암 및 요도암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 키트.
  24. 제20항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편이 고상 담체에 결합되어 있는 키트.
  25. 제20항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편과 결합 가능한 표지 이차 항체를 더욱 포함하는 키트.
  26. 제25항에 있어서, 상기 이차 항체의 표지가 효소, 형광 또는 방사성 표지인 키트.
  27. 서열 1로 표시되는 염기 서열 또는 그의 변이체 서열로 이루어지는 핵산, 그의 상보적 서열로 이루어지는 핵산, 이들의 핵산과 엄격한 조건으로 혼성화하는 핵산, 이들의 15 이상의 연속한 염기를 포함하는 단편, 또는 이들의 화학 수식 유도체를 포함하는 요로상피암 진단용 키트.
  28. 제27항에 있어서, 상기 핵산이 서열 1에 표시되는 염기 서열 또는 그의 변이체 서열을 갖는 키트.
  29. 제27항에 있어서, 상기 요로상피암이 방광암, 신우암, 요관암 및 요도암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 키트.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 고상 담체에 결합되어 있는 키트.
  31. 제30항에 있어서, 상기 고상 담체가 DNA 칩 또는 마이크로어레이의 기판인 키트.
  32. 피험자에게서의 요로상피암의 시험관 내 검출을 위한, 제20항 또는 제27항에 기재된 키트의 용도.
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