KR101582416B1 - 프로합토글로빈을 이용한 간암 진단방법 - Google Patents

프로합토글로빈을 이용한 간암 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간암 진단을 위한 프로합토글로빈(prohaptoglobin, proHp)의 용도 및 이를 이용한 간암 진단 방법에 관한 것으로, 프로합토글로빈의 발현 또는 활성 여부를 검출할 수 있는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 간암 진단방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 방법을 이용하면 간암을 조기에 손쉽게 진단할 수 있는 효과가 있다.

Description

프로합토글로빈을 이용한 간암 진단방법{Method for diagnosising liver cancer using prohaptoglobin}
본 발명은 간암 진단을 위한 프로합토글로빈의 신규 용도 및 이를 이용한 간암 진단방법에 관한 것이다.
암은 한국인의 질병에 의한 사망의 42%를 차지하여 사망 원인 1위를 차지하고 있는 질병이다. 암에 의한 사망률은 전 세계적으로 빠르게 증가하고 있으며, 한국의 경우 폐암, 간암, 위암, 대장암 순으로 주요 사망 원인이 되고 있다. 그 중 간염, 간경변 및 간암 등을 포함한 간질환은 한국, 일본, 대만, 중국 및 대부분의 동남아 국가에서 단일 질병으로는 가장 많은 환자가 발생하고 있다.
암은 조기 진단하여 치료하는 경우 완치율이 크게 높아진다. 또한 암의 진전 정도에 따라 투여해야 할 약 및 수술시 절제해야 할 부위 등이 크게 달라지기 때문에 암을 효과적으로 치료하기 위해서는 암의 진전 정도를 파악하는 것도 매우 중요하다. 현재까지는 종양의 크기, 림프절 전이유무 등을 조사하거나, 종양 조직 또는 림프절 등을 생검하여 면역조직화학방법으로 분석하거나 X-ray 촬영, 전산화 단층 촬영, 내시경을 이용하여 진단하는 것이 일반적이다. 그러나, 이는 종양의 크기가 일정 크기 이상인 경우에 관찰 가능하고, 관찰하기 어려운 부위에 있는 종양은 진단하기 어려워서 암의 조기진단에 한계가 있었다. 또한 암의 진전 정도를 정확하게 판단하기 어려웠다.
특히, 간암 진단을 위하여, 조직검사를 실시하거나 AFP 및 PIVKA-II와 같은 간암표지 단백질 검사를 실시하고 있으나, 혈청학적으로 조기에 효율적으로 진단할 수 있는 표지자가 충분치 않아 정기적인 초음파 검사 또는 전산화 단층촬영 등의 영상학적 진단에 주로 의존할 수밖에 없는 현실이다. 이러한 기존 진단방법의 단점을 보완하기 위한 방법으로, 대상으로부터 혈액, 뇨, 객담, 조직 등의 시료를 채취하여 그 안에 존재하는 암세포 및 암 유전자의 존재를 유전자 검사나 항체 검사로 찾는 방법이 시도되고 있다.
그러나 암은 다수 유전자의 이상을 동반하고 다양한 변이를 보이기 때문에 암을 정확하게 진단하기 위해서는 다수 유전자를 동시에, 그리고 정확하게 자동분석할 수 있는 방법이 요구되나, 아직 이러한 방법은 정립되어 있지 않은 실정이다. 또한, 환자의 혈액에서 각종 당단백, 효소, 호르몬들을 이용하여 암을 진단하려는 다양한 시도가 있으나, 이러한 종양 표지자들의 진단적 또는 예후 인자로서의 가치는 연구되어 왔지만 아직까지 제한적으로 사용되고 있을 뿐으로 공식적으로 권장되고 있는 암 표지자는 없는 실정이다.
혈청α2 글로불린의 일종인 합토글로빈(haptoglobin, Hp)은 유리 헤모글로빈의 글로빈 부분과 결합하여 헤모글로빈의 요배출을 막는 역할을 하는데, 이와 관련하여 여러 가지 질환에서 변동이 나타나는 급성 병기 단백질(Acute Phase Protein, APP)으로 알려져 있다.
인간에게는 두 개의 주요 합토글로빈 대립 유전자, Hp1 및 Hp2가 존재하며, 이에 따라 Hp1-1(Hp1/Hp1), Hp2-1(Hp1 / Hp2), Hp2-2(Hp2 / Hp2)의 세 가지 표현형을 갖는다. Hp1 대립유전자는 α1-β폴리펩타이드를 암호화하는 반면 Hp2 대립유전자는 α2-β폴리펩타이드를 암호화한다. Hp1-1은 (α1β)2로 구성된 헤테로다이머(heterodimer)이며 Hp2-1과 Hp2-2는 폴리머(polymer) 형태인데, Hp2-1은 [(α1β)2 + (α2β)n(n≥0)]으로 구성되어 있고 Hp2-2는 (α2β)n(n≥3) 형태이다.
이러한 합토글로빈 대립유전자의 다형성(polymorphism)은 합토글로빈의 기능적 특성 및 혈관 질환에 대한 감수성(susceptibility)에 영향을 미친다. 즉, 항산화력은 Hp1-1이 가장 강한 반면, 혈관 신생성능은 Hp2-2가 더 강하다. 이에 따라 Hp2-2 표현형을 가지는 사람이 Hp1-1 표현형의 사람보다 당뇨성 혈관 합병증이나 신장 질환 위험이 더 높다.
합토글로빈 단백질은, 단일 mRNA로부터 신호 펩타이드, α-서브유닛 및 β-서브유닛의 세 영역으로 이루어진 프리-프로합토글로빈(pre-prohaptoglobin)으로 생합성된 후, 아미노말단의 신호 펩타이드가 제거되고 프로합토글로빈(prohaptoglobin)으로 만들어진다. 이후 프로합토글로빈은 α-β 접합부위가 세린 프로테아제(serine protease)에 의하여 절단되어 α-체인과 β-체인으로 나누어진다. 상기 두 체인은 다시 이황화 결합으로 연결되어 성숙한 합토글로빈((αβ)n)을 형성한다. 체내에서 대부분의 합토글로빈은 성숙된 단백질 형태로 순환계로 분비되고 있으며, 약간의 프로합토글로빈도 분비가 되기는 하지만 이는 혈액 내의 세린 프로테아제에 의하여 동일한 부위가 절단(cleavage)된다. 따라서 순환하는 혈액 내에서는 오직 성숙한 형태의 합토글로빈만이 존재한다고 알려져 있다.
상술한 급성 병기 단백질인 합토글로빈은 다양한 연구를 통하여 간 질환이나 용혈성 빈혈환자에서는 낮은 수치를 나타내고, 염증성 질환에서는 높은 수치를 나타내며, 그 외 대장암, 난소암, 유방암, 두경부암, 전립선암, 위암, 간암, 폐암 등의 경우에도 수치의 변동을 보이는 것으로 알려져 있어 이를 질병 진단에 연결하려는 시도가 있었다. 그러나 합토글로빈은 정상인 혈장에도 비교적 높은 농도로 존재하며, 더구나 혈중 합토글로빈 농도는 대립유전자의 다형성(polymorphism)에 의해 개인 간의 차이가 매우 크기 (30 - 200 mg/dL) 때문에 바이오마커로 이용하는 데 한계가 있었다. 또한 정상인 혈중에는 거의 존재하지 않는 프로합토글로빈 즉 전구체 합토글로빈을 간암 진단을 위한 마커로 사용할 수 있다는 내용은 아직까지 보고된 바 없다.
1. 대한민국 공개특허 2012-7021866 2. 일본 공개특허 2006-300689 3. 미국특허 6,479,637 4. 대한민국 공개특허 2013-0018204
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하여 보다 효과적인 간암 진단용 조성물, 키트 및 진단 방법을 제공하기 위하여 안출된 것으로, 프로합토글로빈(prohaptoglobin, proHp) 폴리펩타이드를 검출할 수 있는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물, 간암 진단용 키트 및 이를 사용한 간암 진단방법을 제공한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위하며, 본 발명은 프로합토글로빈(prohaptoglobin, proHp) 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로합토글로빈 폴리펩타이드는 서열목록 1 또는 서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로합토글로빈 폴리펩타이드는 서열목록 3 또는 서열목록 4의 염기서열을 통해 코딩되어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 물질은 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 물질은 형광물질, 색소 및 방사성 동위원소로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나 이상에 의하여 표지될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 상기 물질이 성숙된 합토글로빈에 대한 결합과 프로합토글로빈에 대한 결합을 구별할 수 있는 구성을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 성숙한 합토글로빈과 프로합토글로빈을 구별할 수 있는 구성은 분자량 측정, 알파-베타 접합 부위 인식 또는 헤모글로빈과의 결합여부를 측정할 수 있는 물질일 수 있다.
또한, 본 발명은, (a) 생물학적 시료에 존재하는 프로합토글로빈(prohaptoglobin, proHp) 단백질을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 정상대조군 시료의 프로합토글로빈 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 간암의 예측 및 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로합토글로빈 폴리펩타이드는 서열목록 1 또는 서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로합토글로빈(prohaptoglobin, proHp) 단백질의 측정은 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 물질은 형광물질, 색소 및 방사성 동위원소 중에서 선택된 어느 하나 이상에 의하여 표지된 형태의 물질일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로합토글로빈(prohaptoglobin, proHp) 단백질의 측정은 시료 속에 존재하는 합토글로빈이 성숙한 합토글로빈인지 프로합토글로빈인지 구별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 구별하는 단계는 분자량 측정, 알파-베타 접합 부위 인식 또는 헤모글로빈과의 결합여부를 측정하여 구별할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 체액, 타액 및 뇨로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 프로합토글로빈 폴리펩타이드를 검출하는 결합제를 포함하는 간암 진단용 키트 및 간암 진단방법을 이용하면 간암을 조기에 진단하여 치료할 수 있다.　따라서 간암을 조기에 쉽게 진단하여 보다 효과적으로 치료하는 데 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1A 및 도 1B는 프로합토글로빈과 헤모글로빈의 결합력을 확인한 결과이다. 프로합토글로빈 proHp2 또는 인간 혈청에서 정제한 성숙 합토글로빈 Hp2-2를 충분한 양의 인간 헤모글로빈(Hb)과 혼합한 후 웨스턴 블럿을 수행한 결과는 도 1A에, 벤지딘/과산화수소 스테이닝한 결과는 도 1B에 도시하였다.
도 1C는 프로합토글로빈과 헤모글로빈의 결합력을 헤모글로빈 결합 세파로즈 4B 겔에서 확인한 결과이다. 프로합토글로빈 proHp2 또는 인간 혈청에서 정제한 성숙 합토글로빈 Hp2-2를 헤모글로빈이 결합되어 있는 세파로즈 4B 겔에 혼합한 후 실온에서 3시간 동안 배양함. 상청액 및 침강물에 존재하는 합토글로빈을 웨스턴 블랏으로 측정하여 왼쪽에 도시함.
도 2A는 간암 환자에서 프로합토글로빈의 검출을 확인한 결과이다. 정상인 또는 간암 환자 각각의 혈청 5㎕를 항-Hpβ-체인 항체로 면역침강시킨 후, 항-Hpα-체인 항체를 사용하여 웨스턴 블랏함. 각 밴드의 강도는 상대값으로 측정함. 또한 각 혈청내 합토글로빈 농도 (성숙 형태의 합토글로빈 농도로 간주됨)과 총 단백질 농도(total protein)는 각각 ELIZA와 브래드포드 방법으로 측정함.
도 2B는 간암 환자의 프로합토글로빈의 밴드 강도 및 합토글로빈 농도를 정상인과 대비한 결과이다. 수평선은 평균값을 나타냄. 유의수준 **p<0.01 정상군 대비.
도 2C는 간암 세포주에서의 프로합토글로빈 분비를 확인한 실험결과이다. HepG2 세포를 재조합 인터루킨(rIL)-6를 10ng/㎖ 포함하는 무혈청 RPMI 1640 배지에서 48시간 동안 배양한 후, Hpαβ, Hpα-체인, Hp-β체인에 대응하는 다중클론 항체를 이용하여 웨스턴 블랏함. 성숙 합토글로빈은 물론 프로합토글로빈인 Hpα1β 및 Hpα2β도 분비된 것을 확인함.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로합토글로빈(prohaptoglobin, proHp) 폴리펩타이드를 검출하는 결합제를 포함하는 간암 진단용 조성물, 키트 및 이를 사용한 간암 진단방법을 제공한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.
즉, 본 발명은 프로합토글로빈(prohaptoglobin, proHp)을 간암 진단을 위한 마커로 사용할 수 있음을 최초로 규명하였고, 이를 통해 상기 프로합토글로빈의 폴리펩타이드에 결합하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물 및 키트를 본 발명을 통해 제공할 수 있다.
상기 '물질', 즉 프로합토글로빈(prohaptoglobin, proHp) 폴리펩타이드를 검출하는 물질은 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
"항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
다클론 항체는 상기한 간암 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법 (Kohler 및 Milstein, 1976, European Journal of Immunology, 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 (Clackson et al, 1991, Nature, 352:624-628; Marks et al, 1991, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597 참조) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서 프로합토글로빈에 결합하는 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 다양한 공지 문헌에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명의 일예에 따르면, 상기 프로합토글로빈에 결합하는 결합제는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)을 포함하며, 보다 바람직하게는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 키메릭 항체이고, 보다 더 바람직하게는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체이며, 가장 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
본 발명에서, 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)인 것이 바람직하며, 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)인 것이 바람직하다.
본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, 엘라이자 키트, 또는 면역학적 도트 키트등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 키트의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 복합마커를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다.
또한 단백질 마이크로어레이 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 간암 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.
상기 간암 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 포함하는 간암 진단 키트는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 래피드 테스트(Rapid test)를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다.
상기 면역크로마토그래피 스트립은 (a) 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad); (b) 시료 내의 프로합토글로빈 폴리펩티드와 결합하는 결합 패드(conjugate pad); (c) 상기 프로합토글로빈 폴리펩티드에 대한 단일클론 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응막(test membrane); (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및 (e) 지지체를 포함하는 것이 바람직하다.
또한 면역크로마토그래피 스트립 (Immunochromatographic strip)을 포함하는 래피드 테스트 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다.
또한 래피드 테스트 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 테스트 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로셀룰로오스 멤브레인,항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수 패드와 샘플 패드 등 진단에 필요한 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
상기의 방법 등을 통하여 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 간암 의심 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수도 있고, 간암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여, 간암 의심 환자의 실제 간암 발병 여부를 진단할 수 있다.
본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 간암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로도 측정 가능하다.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 간암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 간암 발병 여부를 확인할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 간암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 간암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 간암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대강도) 차이로 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 결합제는 표지될 수 있는데, 이러한 표지는 형광물질, 색소, 효소, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 중에서 선택된 것에 의하여 될 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 표지 라벨로 사용되는 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ ,[RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
또한, 상기 진단용 마커(diagnosis marker)란 간암의 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 간암의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 간암 진단용 마커는 정상상태에 비해 간암 발병시 발현양이 증가하는 프로합토글로빈 유전자 또는 단백질일 수 있으며, 바람직하게 상기 프로합토글로빈는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 서열번호 1은 프로합토글로빈 1(proHp1)의 아미노산 서열이며, 서열번호 2는 프로합토글로빈 2(proHp2)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 상기 프로합토글로빈 유전자는 상기 프로합토글로빈 단백질을 암호화하는 염기서열일 수 있는데, 바람직하게 상기 프로합토글로빈 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열일 수 있고, 상기 서열번호 3은 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열이고, 서열번호 4는 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열이다.
또한, 본 발명은 프로합토글로빈 유전자의 수준 또는 프로합토글로빈 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공할 수 있는데, 본 발명에서 상기 프로합토글로빈 유전자의 수준은, 바람직하게 프로합토글로빈 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 프로합토글로빈 수준을 측정할 수 있는 물질로는 프로합토글로빈 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 프로합토글로빈 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 프로합토글로빈 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.
본 발명에서 상기프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 프로합토글로빈 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.
상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 프로합토글로빈 단백질(폴리펩타이드)의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 프로합토글로빈 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의간암 진단용 키트는 간암의 진단 또는 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 간암의 진단 또는 예후 분석용 키트는 간암의 진단 또는 예후 분석용 조성물과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.
본 명세서의 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 명세서에서의 용어 간암(liver cancer)이란 일반적으로 간세포에서 기원하는 암을 의미한다. 간암에는 처음부터 간에서 생기는 원발성 간암과 다른 조직에서 발생한 암이 간에 전이되어 발병하는 전이성 간암이 있다. 원인은 대부분 불분명하나, 간경변이 있는 경우가 많으며, 간경변이 있는 환자와 만성 활동성 B형 간염, 또는 B형 간염 보균자에서 간암이 잘 발생하는 것으로 밝혀지고 있다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 키트는 상기 결합제가 합토글로빈에 결합된 결합체와 프로합토글로빈에 결합된 결합체를 구별하는 구성을 포함할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 프로합토글로빈에 결합하는 결합자가 인식하는 부위와 동일한 결합 부위를 갖는 합토글로빈이 있는 경우 상기 결합자는 프로합토글로빈이 아닌 합토글로빈에도 결합될 수 있다. 이 경우 본 발명의 효과를 높이기 위하여 프로합토글로빈 결합체를 구별하는 것이 바람직하다.
일례로, 합토글로빈 결합체와 프로합토글로빈 결합체를 구별하는 구성은 분자량의 차이를 나타내는 구성 또는 알파-베타 접합 부위를 표시하는 구성일 수 있다. 즉, 프로합토글로빈이 합토글로빈 보다 분자량이 크기 때문에, 해당 분자량을 갖는 결합체를 표시하도록 하여 합토글로빈과 구별할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 프로합토글로빈(prohaptoglobin, proHp) 폴리펩타이드에 결합하는 결합제(물질)를 분석 대상 시료에 가하는 단계; 및 상기 분석 대상 시료 속의 프로합토글로빈을 검출하는 단계를 포함하는 간암 진단방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 사용되는 상기 결합제(물질)는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 결합제는 형광물질, 색소 및 방사성 동위원소 중에서 선택된 어느 하나 이상에 의하여 표지된 것일 수 있다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 결합제가 합토글로빈에 결합된 결합체와 프로합토글로빈에 결합된 결합체를 구별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 구별하는 단계는 분자량의 차이를 나타내는 방법 또는 알파-베타 접합 부위를 표시하는 방법일 수 있다.
각 구성의 구체적인 내용은 앞서 간암 진단용 키트에서 서술한 바와 같다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
[ 실시예 ]
1. 실험방법
1) 샌드위치 효소면역측정법
인간 혈청에서 정제한 Hp2-2(Sigma-Aldrich, 미국)를 표준으로 사용하는 샌드위치 효소면역측정법(sandwich enzyme-linked immunosorben assay, ELIZA)을 사용하여 혈청 내 합토글로빈 농도를 측정하였다.
ELIZA 플레이트(Nunc, 덴마크)의 각 well을 10㎍ 항-인간 Hp 항체(Sigma-Aldrich, 미국)가 들어있는 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS) 100㎕로 채우고 4℃에서 16시간 둠으로써 코팅하였다. 상기 항체가 고정된 플레이트를 0.1% Tween 20을 포함하는 인산완충식염수로 세척한 후, 3% 무지방 우유에 2시간 동안 실온에 담가 블라킹하였다. 시료들을 첨가한 후 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 세척한 후, 상기 플레이트를 고추냉이 과산화수소 (horseradish peroxidase, Abcam, 영국)와 결합된 이차 항-인간 Hp 항체와 2시간 동안 실온에서 반응시켰다.
테트라메틸벤지딘 기질 용액 (Tetramethylbenzidine substrate solution, Gendepot, 미국)을 사용하여 발색한 후, 2M 황산(H2SO4)를 첨가하여 정지시켰다. Victor2 ELIZA 판독기(PerkinElmer, 미국)를 사용하여 450nm 에서 흡광도를 측정하였다.
2) 웨스턴 블랏 분석
10% SDS-폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 젤 또는 7% native-폴리아크릴아마이드 젤을 사용하여 전기영동하고 PVDF 멤브레인으로 단백질을 이동시켰다. PVDF 멤브레인을 블라킹 용액(5% 스킴 밀크)을 사용하여 상온에서 1시간 동안 블라킹 한 후, 항-인간 Hp(Sigma-Aldrich, 미국), 항-인간 Hpα-체인, 또는 항-인간 Hpβ-체인 항체와 상온에서 2시간 반응시켰다. 상기 PVDF 멤브레인을 PBS로 10분간 3번 세척한 후, HRP-conjugated 이차 항체(Sigma-Aldrich, 미국)로 상온에서 1시간 동안 반응시킨 다음 화학발광(enhanced chemiluminescence, ECL) 검출 키트(Amersham Bioscience, 영국) 및 발광 영상 분석기(luminescent image analysis) LAS-300 시스템(Fujifilm, 일본)을 사용하여 분석하였다.
3) 합토글로빈과 헤모글로빈 결합
합토글로빈-헤모글로빈 결합체(Hp-Hb complex)를 벤지딘(benzidine)/과산화수소로 염색하기 위하여, 0.5㎕ 인간 혈청(Hp2-2 타입) 또는 0.3㎍ proHp2 를 함유하는 30㎕ COS-7 세포 배양배지(CM)를 1㎍ 인간 헤모글로빈과 혼합하였다. 실온에서 1시간 동안 처리한 후, 상기 혼합액을 7% 네이티브 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동하였다. 상기 겔을 벤지딘 용액(20% 아세트산 용액에 1% 벤지딘 용해한 용액)에 담금 후 합토글로빈-헤모글로빈 결합체가 감지될 때까지 3% 과산화수소를 첨가하였다.
또 다른 방법으로, 인간 헤모글로빈을 50㎕ CNBr-활성 세파로즈 4B 겔(Sigma-Aldrich)에 결합시켜서 친화성 겔을 준비하였다. 희석한 인간 혈청(200㎕ DMEM에 0.1㎕ 혈청) 또는 0.4㎍ proHp2 를 포함하는 200㎕ 배지를 상기 헤모글로빈 결합한 겔에 첨가하였다. 상기 혼합액을 3시간 동안 실온에서 부드럽게 흔든 후 원심분리하여 침전 잔여물과 상청액을 분리하였다. 상기 침전 잔여물을 인산완충식염수로 4회 세척하고, 각 단편내에 존재하는 proHp2의 양을 웨스턴 블랏으로 측정하였다.
4) 면역침강법( Immunoprecipitation )
정상군 또는 암환자 혈청 (각 5㎕)을 Hpβ-체인에 대한 항체와 혼합한 후 4℃에서 4시간 동안 부드럽게 흔들면서 반응시킨 후, Protein G 결합 아가로즈 비드(Invitrogen)를 혼합한 후 4℃에서 밤새도록 추가로 반응시켰다. 상기 반응물을 원심분리하여 상청액을 제거한 후, 침강된 면역복합체를 차가운 인산완충식염수로 3회 세척하였다. 상기 면역복합체를 환원상태에서 10% SDS-폴리아크릴아마이드겔에서 전기영동하고, Hpα-체인에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿으로 검출하였다.
5) 통계 분석
모든 통계 분석은 PASW Statistics 소프트웨어(Version 18, SPSS Inc., 미국)를 이용한 unpaired Student's t-test로 수행하였으며, 자료는 p-value가 0.05 보다 낮은 경우 통계적으로 유의한 것으로 처리하였다.
< 실시예 1> 헤모글로빈( Hb )과의 결합력 분석
프로합토글로빈이 헤모글로빈과 결합하는지를 확인하기 위하여, 성숙 합토글로빈 Hp2-2를 포함하는 인간 혈청, 프로합토글로빈 proHp2를 포함하는 세포배양배지를 각각 충분한 인간 헤모글로빈과 혼합한 후 웨스턴 블랏 및 벤지딘 염색(benzidine staining)을 수행하였다.
실험 결과, 성숙 합토글로빈은 헤모글로빈과 결합체를 형성한 반면, 프로합토글로빈은 헤모글로빈과 결합체를 형성하지 않았으며(웨스턴 결과는 도 1A, 벤지딘 염색 결과는 도 1B), 프로합토글로빈은 헤모글로빈이 결합된 겔에도 부착하지 않았다(도 1C).
< 실시예 2> 간암 환자의 혈청에서 프로합토글로빈의 검출
상술한 방법에 의하여 인간 혈청에서의 합토글로빈을 측정한 결과를 도 7A 내지 7C에 도시하였다.
면역 침강과 웨스턴 블럿을 조합하여 실험한 결과, 정상군의 혈청에서는 프로합토글로빈이 매우 적거나 없는 반면, 간암 환자군에서는 총 8명 중 6명의 혈청에서 프로합토글로빈이 검출되었다(도 2A(i) 및 2A(ii)).
항-성숙 합토글로빈 항체를 사용한 ELIZA를 수행하여 측정한 총 합토글로빈 농도 (성숙 합토글로빈 농도로 간주할 수 있음)는, 간암 환자군이 정상군보다 조금 높게 나타났으나 통계적으로 유의적이지는 않았다(도 2B(ii)). 또한, 혈청의 총 단백질 농도는 간암 환자군이 정상군보다 조금 더 낮았으나, 통계적으로 유의적이지는 않았다(도 2B(iii)).
간암 환자 혈청에서 검출되는 프로합토글로빈 량은 성숙 단백질 량이나 혈청 총 단백질 량에 영향을 받지 않았다(도 2A).
또한, 인터루킨(IL)-6를 처리한 HepG2 간암 세포주에서 성숙 합토글로빈(개별 α1-, α2- 및 β-체인으로 구성된 Hp2-1 표현형) 뿐만 아니라 두 개의 프로합토글로빈, α1β 및 α2β가 분비됨을 확인하였다(도 2C).
상기 결과들은, 종양이나 염증과 같은 특정 상황에서 프로합토글로빈이 간에서 혈액으로 분비되어 중요한 기능을 수행한다는 것을 의미한다.
이를 종합적으로 살펴보면, 정상인군에서는 개체간 차이가 적으면서 프로합토글로빈의 발현이 낮은 반면, 간암 환자군에서는 프로합토글로빈이 상대적으로 강하게 검출되었으며 (도 2B(i)), 나아가 성장속도가 빠른 전이암의 경우는 초기암의 경우보다 혈중 프로합토글로빈 농도가 더 높게 나타나 암의 진행정도와 상관관계를 나타내는 경향이 있었다. 그런데 성숙 합토글로빈이 대부분인 혈액 내 총 합토글로빈 농도는 정상인에서도 높게 나타날 뿐만 아니라 개체간의 차이가 많아서 간암 환자군과 대비하여 통계적으로 차이가 없는 것으로 나타났다. (도 2B(ii)참조). 따라서 성숙 합토글로빈 보다 프로합토글로빈이 간암 진단 마커로서 훨씬 정확도가 높고 유용하게 사용될 수 있다.
나아가 도 2B(i)의 결과를 보면, 프로합토글로빈의 강도가 가장 낮은 수치를 보이는 것은 초기암에서 발견된 결과이며, 프로합토글로빈의 강도가 높을수록 전이암 및 암의 경과가 많이 진행된 암에서 발견된 결과이다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 성장속도가 빠른 전이암에서 더 높은 프로합토글로빈이 검출된다는 사실을 활용하여 암의 진행 상태까지도 예측할 수 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Method for diagnosising liver cancer using prohaptoglobin <130> pn1405-158 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 329 <212> PRT <213> proHp1 amino acid sequence <400> 1 Val Asp Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ala Asp Asp Gly Cys Pro 1 5 10 15 Lys Pro Pro Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val Arg Tyr 20 25 30 Gln Cys Lys Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val Tyr 35 40 45 Thr Leu Asn Asn Glu Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly Asp Lys 50 55 60 Leu Pro Glu Cys Glu Ala Val Cys Gly Lys Pro Lys Asn Pro Ala Asn 65 70 75 80 Pro Val Gln Arg Ile Leu Gly Gly His Leu Asp Ala Lys Gly Ser Phe 85 90 95 Pro Trp Gln Ala Lys Met Val Ser His His Asn Leu Thr Thr Gly Ala 100 105 110 Thr Leu Ile Asn Glu Gln Trp Leu Leu Thr Thr Ala Lys Asn Leu Phe 115 120 125 Leu Asn His Ser Glu Asn Ala Thr Ala Lys Asp Ile Ala Pro Thr Leu 130 135 140 Thr Leu Tyr Val Gly Lys Lys Gln Leu Val Glu Ile Glu Lys Val Val 145 150 155 160 Leu His Pro Asn Tyr Ser Gln Val Asp Ile Gly Leu Ile Lys Leu Lys 165 170 175 Gln Lys Val Ser Val Asn Glu Arg Val Met Pro Ile Cys Leu Pro Ser 180 185 190 Lys Asp Tyr Ala Glu Val Gly Arg Val Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly 195 200 205 Arg Asn Ala Asn Phe Lys Phe Thr Asp His Leu Lys Tyr Val Met Leu 210 215 220 Pro Val Ala Asp Gln Asp Gln Cys Ile Arg His Tyr Glu Gly Ser Thr 225 230 235 240 Val Pro Glu Lys Lys Thr Pro Lys Ser Pro Val Gly Val Gln Pro Ile 245 250 255 Leu Asn Glu His Thr Phe Cys Ala Gly Met Ser Lys Tyr Gln Glu Asp 260 265 270 Thr Cys Tyr Gly Asp Ala Gly Ser Ala Phe Ala Val His Asp Leu Glu 275 280 285 Glu Asp Thr Trp Tyr Ala Thr Gly Ile Leu Ser Phe Asp Lys Ser Cys 290 295 300 Ala Val Ala Glu Tyr Gly Val Tyr Val Lys Val Thr Ser Ile Gln Asp 305 310 315 320 Trp Val Gln Lys Thr Ile Ala Glu Asn 325 <210> 2 <211> 388 <212> PRT <213> proHp2 amino acid sequence <400> 2 Val Asp Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ala Asp Asp Gly Cys Pro 1 5 10 15 Lys Pro Pro Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val Arg Tyr 20 25 30 Gln Cys Lys Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val Tyr 35 40 45 Thr Leu Asn Asp Lys Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly Asp Lys 50 55 60 Leu Pro Glu Cys Glu Ala Asp Asp Gly Cys Pro Lys Pro Pro Glu Ile 65 70 75 80 Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val Arg Tyr Gln Cys Lys Asn Tyr 85 90 95 Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val Tyr Thr Leu Asn Asn Glu 100 105 110 Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly Asp Lys Leu Pro Glu Cys Glu 115 120 125 Ala Val Cys Gly Lys Pro Lys Asn Pro Ala Asn Pro Val Gln Arg Ile 130 135 140 Leu Gly Gly His Leu Asp Ala Lys Gly Ser Phe Pro Trp Gln Ala Lys 145 150 155 160 Met Val Ser His His Asn Leu Thr Thr Gly Ala Thr Leu Ile Asn Glu 165 170 175 Gln Trp Leu Leu Thr Thr Ala Lys Asn Leu Phe Leu Asn His Ser Glu 180 185 190 Asn Ala Thr Ala Lys Asp Ile Ala Pro Thr Leu Thr Leu Tyr Val Gly 195 200 205 Lys Lys Gln Leu Val Glu Ile Glu Lys Val Val Leu His Pro Asn Tyr 210 215 220 Ser Gln Val Asp Ile Gly Leu Ile Lys Leu Lys Gln Lys Val Ser Val 225 230 235 240 Asn Glu Arg Val Met Pro Ile Cys Leu Pro Ser Lys Asp Tyr Ala Glu 245 250 255 Val Gly Arg Val Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Asn Ala Asn Phe 260 265 270 Lys Phe Thr Asp His Leu Lys Tyr Val Met Leu Pro Val Ala Asp Gln 275 280 285 Asp Gln Cys Ile Arg His Tyr Glu Gly Ser Thr Val Pro Glu Lys Lys 290 295 300 Thr Pro Lys Ser Pro Val Gly Val Gln Pro Ile Leu Asn Glu His Thr 305 310 315 320 Phe Cys Ala Gly Met Ser Lys Tyr Gln Glu Asp Thr Cys Tyr Gly Asp 325 330 335 Ala Gly Ser Ala Phe Ala Val His Asp Leu Glu Glu Asp Thr Trp Tyr 340 345 350 Ala Thr Gly Ile Leu Ser Phe Asp Lys Ser Cys Ala Val Ala Glu Tyr 355 360 365 Gly Val Tyr Val Lys Val Thr Ser Ile Gln Asp Trp Val Gln Lys Thr 370 375 380 Ile Ala Glu Asn 385 <210> 3 <211> 987 <212> DNA <213> proHp1 polynucleotide sequence <400> 3 gtggactcag gcaatgatgt cacggatatc gcagatgacg gctgcccgaa gccccccgag 60 attgcacatg gctatgtgga gcactcggtt cgctaccagt gtaagaacta ctacaaactg 120 cgcacagaag gagatggagt gtacacctta aacaatgaga agcagtggat aaataaggct 180 gttggagata aacttcctga atgtgaagca gtatgtggga agcccaagaa tccggcaaac 240 ccagtgcagc ggatcctggg tggacacctg gatgccaaag gcagctttcc ctggcaggct 300 aagatggttt cccaccataa tctcaccaca ggtgccacgc tgatcaatga acaatggctg 360 ctgaccacgg ctaaaaatct cttcctgaac cattcagaaa atgcaacagc gaaagacatt 420 gcccccactt taacactcta tgtggggaaa aagcagcttg tagagattga gaaggttgtt 480 ctacacccta actactccca agtagatatt gggctcatca aactcaaaca gaaggtgtct 540 gttaatgaga gagtgatgcc catctgccta ccatccaagg attatgcaga agtagggcgt 600 gtgggttatg tttctggctg ggggcgaaat gccaatttta aatttactga ccatctgaag 660 tatgtcatgc tgcctgtggc tgaccaagac caatgcataa ggcattatga aggcagcaca 720 gtccccgaaa agaagacacc gaagagccct gtaggggtgc agcccatact gaatgaacac 780 accttctgtg ctggcatgtc taagtaccaa gaagacacct gctatggcga tgcgggcagt 840 gcctttgccg ttcacgacct ggaggaggac acctggtatg cgactgggat cttaagcttt 900 gataagagct gtgctgtggc tgagtatggt gtgtatgtga aggtgacttc catccaggac 960 tgggttcaga agaccatagc tgagaac 987 <210> 4 <211> 1164 <212> DNA <213> proHp2 polynucleotide sequence <400> 4 gtggactcag gcaatgatgt cacggatatc gcagatgacg gctgcccgaa gccccccgag 60 attgcacatg gctatgtgga gcactcggtt cgctaccagt gtaagaacta ctacaaactg 120 cgcacagaag gagatggagt atacacctta aatgataaga agcagtggat aaataaggct 180 gttggagata aacttcctga atgtgaagca gatgacggct gcccgaagcc ccccgagatt 240 gcacatggct atgtggagca ctcggttcgc taccagtgta agaactacta caaactgcgc 300 acagaaggag atggagtgta caccttaaac aatgagaagc agtggataaa taaggctgtt 360 ggagataaac ttcctgaatg tgaagcagta tgtgggaagc ccaagaatcc ggcaaaccca 420 gtgcagcgga tcctgggtgg acacctggat gccaaaggca gctttccctg gcaggctaag 480 atggtttccc accataatct caccacaggt gccacgctga tcaatgaaca atggctgctg 540 accacggcta aaaatctctt cctgaaccat tcagaaaatg caacagcgaa agacattgcc 600 cccactttaa cactctatgt ggggaaaaag cagcttgtag agattgagaa ggttgttcta 660 caccctaact actcccaagt agatattggg ctcatcaaac tcaaacagaa ggtgtctgtt 720 aatgagagag tgatgcccat ctgcctacca tccaaggatt atgcagaagt agggcgtgtg 780 ggttatgttt ctggctgggg gcgaaatgcc aattttaaat ttactgacca tctgaagtat 840 gtcatgctgc ctgtggctga ccaagaccaa tgcataaggc attatgaagg cagcacagtc 900 cccgaaaaga agacaccgaa gagccctgta ggggtgcagc ccatactgaa tgaacacacc 960 ttctgtgctg gcatgtctaa gtaccaagaa gacacctgct atggcgatgc gggcagtgcc 1020 tttgccgttc acgacctgga ggaggacacc tggtatgcga ctgggatctt aagctttgat 1080 aagagctgtg ctgtggctga gtatggtgtg tatgtgaagg tgacttccat ccaggactgg 1140 gttcagaaga ccatagctga gaac 1164

Claims (14)

  1. 프로합토글로빈(prohaptoglobin, proHp) 폴리펩타이드를 검출할 수 있는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프로합토글로빈 폴리펩타이드는 서열목록 1 또는 서열목록2로 표시되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 프로합토글로빈 폴리펩타이드는 서열목록 3 또는 서열목록 4의 염기서열을 통해 코딩되어지는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 물질은 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 물질은 형광물질, 색소 및 방사성 동위원소로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나 이상에 의하여 표지된 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 물질의 성숙된 합토글로빈에 대한 결합과 프로합토글로빈에 대한 결합 여부를 구별할 수 있는 구성으로 분자량 측정, 알파-베타 접합 부위 인식 또는 헤모글로빈과의 결합여부를 측정할 수 있는 구성을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
  7. 삭제
  8. (a) 인체로부터 채취한 혈청 시료에 존재하는 프로합토글로빈(prohaptoglobin, proHp) 단백질을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 정상대조군 시료의 프로합토글로빈 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 간암의 예측 및 진단을 위한 정보제공 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 프로합토글로빈 폴리펩타이드는 서열목록 1 또는 서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 간암의 예측 및 진단을 위한 정보제공 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 프로합토글로빈(prohaptoglobin, proHp) 단백질의 측정은 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 간암의 예측 및 진단을 위한 정보제공 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 물질은 형광물질, 색소 및 방사성 동위원소 중에서 선택된 어느 하나 이상에 의하여 표지된 형태의 물질인 것을 특징으로 하는 간암의 예측 및 진단을 위한 정보제공 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 프로합토글로빈(prohaptoglobin, proHp) 단백질의 측정은 시료 속에 존재하는 합토글로빈이 성숙한 합토글로빈인지 프로합토글로빈인지 구별하기 위하여 분자량 측정, 알파-베타 접합 부위 인식 또는 헤모글로빈과의 결합여부를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 간암의 예측 및 진단을 위한 정보제공 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
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