CN105012952A - Cxcl13癌蛋白及其靶向药物在肿瘤方面的应用 - Google Patents

Abstract

CXCL13癌蛋白及其靶向药物在肿瘤方面的应用。用于制备肿瘤靶向药物的方法包括：筛选能够有效降低CXCL13癌蛋白高表达或中和CXCL13活性的抗体；以及利用所述抗体制备相应的肿瘤靶向药物。本发明的抗CXCL13单克隆抗体可以通过抑制p-AKT、p-ERK及EMT信号通路，从而抑制肿瘤细胞生长及侵袭转移而达到良好的抗肿瘤效果。

Description

CXCL13癌蛋白及其靶向药物在肿瘤方面的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种癌蛋白CXCL13(chemokine(C-X-Cmotif)ligand 13)及其靶向药物在治疗肿瘤及相关疾病中的应用。

背景技术

肺癌已经成为全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，根据组织学类型不同，肺癌主要分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。肺癌发病与关键基因的功能异常、信号通路的异常活化、肿瘤微环境密切相关。肺癌发生的危险因素主要包括氡、石棉等的暴露、遗传因素、环境暴露与吸烟等，吸烟以及被动吸烟是导致肺癌发生的主要因素。约87％的肺癌可归因为烟草暴露。然而，近几十年，伴随着中国经济的高速发展，空气污染问题愈发突出。全国范围内爆发了严重的雾霾，尤其是北京、天津、石家庄等大城市持续笼罩在雾霾中，并连续出现PM2.5严重超标。与此同时，呼吸道相关疾病患病率直线上升，肺癌的发病率显著升高。中国卫生部调查结果显示，在20世纪70年代，中国肺癌病人平均每10万人当中有5.47人死亡(其中，男性为每10万病人7.17人，女性为每10万病人3.69人)，在当时所有致死癌症中排名第五，且远远低于欧美国家的肺癌死亡率(美国，每10万病人30.3人；苏格兰，每10万病人46.6人)。然而，2004-2005年的第三次全国人口调查报告显示，肺癌一跃成为所有肿瘤中致死率最高的癌症。平均每10万人中30.83人，其中男性为每10万病人41.34人，女性为每10万病人19.84人。仅仅三十年间，无论是总体死亡率还是男女死亡率都提高了6倍，而且还在快速增长中。因此环境致癌物暴露在肺癌发生中发挥越来越重要的作用。但到目前为止环境污染及吸烟引发的肺癌发病机理仍不清楚，因此发现促进肺癌发生发展的癌蛋白并开发相应的靶向药物，在肿瘤治疗中具有关键作用。

烟草及环境污染物中含有多种致癌物质，其中有20中致癌物和肺癌的发生密切相关。苯并(a)芘(BaP)是其中最主要的、含量最高的、致癌性最强的一种致癌物质。BaP可以活化AKT信号通路，使得NF-κB、Bcl-2等下游蛋白磷酸化，从而促进细胞增殖；也可以在细胞内形成DNA加和物，导致基因突变(K-Ras、TH53)、DNA甲基化、染色体缺失等，也可诱导炎症相关的一些趋化因子及其受体(IL-10，CCL1、CXCL1、CXCL5、TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-8)的改变。因此，与肺癌尤其是空气污染及吸烟诱发肺癌发生发展密切相关的趋化因子将成为肺癌治疗的新靶标。

趋化因子(Chemokine)是一类由生长因子、炎性细胞因子或致病原刺激诱导产生的能引起白细胞定向迁移的趋化性细胞因子，通过与细胞表面的G蛋白跨膜受体相互作用介导细胞的趋化性和定向转移。趋化因子家族是一类小分子蛋白，分子量为8-14KD，根据其氨基末端半胱氨酸的位置，数量以及排列方式，趋化因子被分为四大类：CXC趋化性细胞因子、C趋化性细胞因子、CC趋化性细胞因子和CX3C趋化性细胞因子。迄今为止，已经克隆出超过50多种趋化因子和至少18中趋化因子受体，这些趋化因子受体属于G蛋白偶联家族，具有7次跨膜疏水区，除了CXCR5、CXCR4、CCR6、CXCR6、CX3CR1和CCR9之外，其他趋化因子受体均与两种以上的趋化因子相互作用。趋化因子的主要功能是在不同的免疫反应中激活和趋化白细胞，但是越来越多的研究表明趋化因子以及相应的受体在肿瘤侵袭、转移以及转化中发挥着重要的作用。其中CXCR4已经被确立为多种肿瘤的预后标志物，CXCL12-CXCR4在各种肿瘤尤其是乳腺癌的转移中发挥关键性作用。但是，截止目前，趋化因子在肺癌中的表达情况及其与肺癌的关系并不清楚。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种肿瘤靶向药物的制备方法，这种药物能够有效治疗相应的肿瘤。

发明人利用趋化因子及其受体信号通路相关的RT²-PCRArray,对来自中国多环芳烃污染严重的肺癌高发地区的8个病人的癌及癌旁组织进行分析，首次发现了一系列差异表达的趋化因子(IL-1F5，IL-1F9，MIF，SPP1，CCL7，CCL26，CXCL6，CXCL9，CXCL14，IL-1α，IL-5，TNF-α，CCL4，CCL17，CCL18，CCL21，CCL23，CXCL1，CXCL2，CXCL3，CXCL5)，尤其是趋化因子CXCL13显著高表达。并通过real-time PCR、ELISA及免疫组化在201例肺癌病人标本中进行验证。同时还发现CXCL13的高表达与肺癌病人的生存预后负相关。

进一步，发明人以多环芳烃主要致癌物苯并芘(BaP)诱导小鼠肺癌模型为研究对象，发现CXCL13在上述肿瘤中高表达。CT是目前检测肺癌的重要方法。发明人发现，CXCL13的升高早于CT可检测到肺癌的时间，说明CXCL13可用于肺癌的早期诊断。CXCL13基因敲除小鼠也能显著抑制BaP诱导的肺癌发生，抗炎药物地塞米松也能通过抑制CXCL13的表达从而延缓肺癌的发生。

最终，发明人利用CXCL13不同肽段作为免疫原免疫小鼠，筛选得到了具有中和活性的抗CXCL13单克隆抗体。且该单克隆抗体可以通过抑制p-AKT、p-ERK及EMT信号通路，从而抑制肿瘤细胞生长及侵袭转移达到抗肿瘤效果。

一方面，本发明提供了CXCL13作为一种新的癌蛋白与肿瘤病人的预后显著负相关的分子标记。所述肿瘤为肺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、脑瘤、皮肤癌。同时也预测其适用于CXCL13高表达的慢性阻塞性肺疾病、肺气肿及心血管疾病。

另一方面，本发明提供了抗CXCL13单克隆抗体在制备肺癌诊断、预防、治疗与CXCL13高表达相关的肿瘤及其他相关疾病中的应用。本发明证明了抗CXCL13单克隆抗体可以通过抑制p-AKT、p-ERK及EMT信号通路，从而抑制肿瘤细胞生长及侵袭转移达到抗肿瘤效果。所述肿瘤为肺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、脑瘤、皮肤癌。同时也预测其适用于CXCL13高表达的慢性阻塞性肺疾病、肺气肿及心血管疾病。

再一方面，本发明提供了一种筛选CXCL13靶向药物的方法，该方法为利用CXCL13不同肽段作为免疫原免疫小鼠，筛选具有中和活性的抗CXCL13单克隆抗体。根据本发明的一个筛选方法的实例如下：

①抗原的制备：

多肽合成及偶联(PRGNGCPRKEIIVWKKNKSIV,CVQESSVFIPRRFID)

②免疫及ELISA检测：

2条多肽分别免疫4只BALB/C雌性小鼠；

阳性血清ELISA检测，效价>10000；

③融合及细胞株筛选：

取效价最高的小鼠做融合实验；

从1000个单克隆细胞株中筛选阳性克隆；

将筛选的阳性细胞上清做针对肽段的Western blot/ELISA检测；

④抗体纯化及检测：

ProteinA/G亲和纯化；

⑤功能筛选

Western blot/Transwell实验验证抗体是否具有中和活性。

本发明测试结果表明，抗CXCL13单克隆抗体可以通过抑制p-AKT、p-ERK及EMT信号通路，从而抑制肿瘤细胞生长及侵袭转移而达到良好的抗肿瘤效果。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于制备肿瘤靶向药物的方法，包括：

筛选能够有效降低CXCL13癌蛋白高表达或中和CXCL13癌蛋白活性的抗体，利用所述抗体制备相应的肿瘤靶向药物。

通过将所述抗体与适当的辅剂混合，上述肿瘤靶向药物可以被制成片剂、针剂等任何合适形式的药剂。

上述肿瘤可以为肺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、脑瘤、皮肤癌。

上述肿瘤靶向药物还预期适用于CXCL13高表达的慢性阻塞性肺疾病、肺气肿及心血管疾病。

上述抗体是以CXCL13癌蛋白中的PRGNGCPRKEIIVWKKNKSIV及CVQESSVFIPRRFID肽段为免疫原所得到的单克隆抗体。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1高污染地区肺癌病人癌组织中差异表达的趋化因子；

图2趋化因子CXCL13在肺癌病人癌组织中高表达；

图3CXCL13高表达与肺癌病人的生存预后负相关；

图4BaP在细胞水平上促进CXCL13的分泌；

图5BaP在动物体内促进CXCL13的分泌，地塞米松通过抑制CXCL13的表达，减少肿瘤体积，延长小鼠的生存期；

图6敲除CXCL13能够延缓BaP引起的肺癌发生；以及

图7抗CXCL13单克隆抗体可以通过抑制p-AKT、p-ERK及EMT信号通路，从而抑制肿瘤细胞生长及侵袭转移。

具体实施方式

实施例1高污染地区肺癌病人癌组织中异常表达的趋化因子

利用RT2-PCRArray技术对来自环境高度污染的地区的8例肺癌病人标本的癌组织和相对应的癌旁组织进行筛查，发现4个细胞因子(IL-1F5，IL-1F9，MIF，SPP1)和7个趋化因子(CXCL13，CCL7，CCL20，CCL26，CXCL6，CXCL9，CXCL14)相对于其癌旁组织高表达。3个细胞因子(IL-1α，IL-5，TNF-α)和9个趋化因子(CCL4，CCL17，CCL18，CCL21，CCL23，CXCL1，CXCL2，CXCL3，CXCL5)相对于其癌旁组织低表达。其中，趋化因子CXCL13的在癌组织中的高表达最为显著，平均高表达63倍(10.84-173.65)(图1)。

实施例2趋化因子CXCL13在肺癌病人癌组织中高表达

通过real-time PCR分析发现，在高污染地区，所检测的70例肺癌病人标本中有63例高表达CXCL13，高表达率为90％。而在对照地区，所检测的131例肺癌病人标本中有71例高表达CXCL13，高表达率为54.2％。虽然CXCL13在不同地区肺癌病人癌组织中表达都增高，但是在高污染地区癌组织mRNA水平明显高于对照地区。在高污染地区，吸烟肺癌病人和非吸烟病人相比，CXCL13的表达并没有明显差异，提示了环境污染物的高致癌性。然而，在对照地区，CXCL13的表达(44/71，62％)在吸烟肺癌病人中远远高于非吸烟病人(27/60，45％)，揭示了烟草和CXCL13的表达之间存在一定的相关性。通过免疫组化，进一步验证了CXCL13蛋白水平在肺癌病人肿瘤组织中高表达。高污染地区CXCL13的表达高于对照地区，对照地区吸烟患者CXCL13的表达高于非吸烟患者。通过ELISA实验同样证明了肺癌病人血清中CXCL13的含量要高于正常捐赠者血清，尤其是在高污染地区，CXCL13的高表达尤为显著。说明CXCL13在不同地区肺癌病人癌组织中表达均增高，但是在高污染地区明显高于对照地区，且对照地区吸烟患者CXCL13的表达高于非吸烟患者(图2)。

实施例3 CXCL13高表达与肺癌病人的生存预后负相关

进一步分析肺癌病人的生存期资料，发现晚期肺癌病人(III期和IV期)中CXCL13的表达明显比早期病人(I期和II期)高。CXCL13高表达的肺癌病人平均生存期(965天)明显低于其低表达病人(1193天)。以上说明CXCL13的高表达与肺癌病人的生存预后负相关(图3)。

实施例4 BaP在细胞水平上促进CXCL13的分泌

低剂量(1μM)BaP长期(30天)处理16HBE细胞，通过RT2-PCRArray分析，发现CXCL13同样是BaP处理后上调最为显著的基因。高剂量BaP短时间处理16HBE和A549细胞，CXCL13的mRNA水平和蛋白水平也明显升高，并且CXCL13的表达量与BaP处理时间和剂量呈现正相关(图4)。

实施例5 BaP在动物体内促进CXCL13的分泌

发明人以BaP诱导小鼠肺癌模型为研究对象，MicroCT以及HE染色结果显示，所有的小鼠在给药6个月时都发生了肺癌。通过免疫组化和real-time PCR技术，发现CXCL13在BaP处理小鼠的肺组织中的表达显著性高于对照组小鼠，同样小鼠血清中CXCL13的表达结果与蛋白和mRNA水平一致。尤其是，在小鼠BaP处理一个月时已经检测到血清中CXCL13的高表达，但是microCT却未发现肺组织的异常，说明CXCL13的高表达不是肺癌发生的一个伴随现象。另外，广谱抗炎药物地塞米松也能够通过抑制CXCL13的高表达，从而减少肿瘤体积，延长小鼠的生存期(图5)。

实施例6敲除CXCL13能够延缓BaP引起的肺癌发生

发明人从Jackson实验室购买了CXCL13全身敲除小鼠，连续8周灌胃给药(BaP 100mg/kg)。MicroCT以及HE染色结果显示，BaP处理6个月后，野生型小鼠发现了明显的肿瘤，而CXCL13敲除组小鼠没有发现肿瘤。相对于敲除小鼠，BaP给药3个月后，在CXCL13杂合型小鼠和野生型小鼠的血清中能明显检测到CXCL13的表达，而没有发现肺组织的异常，也同样说明了CXCL13的表达对肺癌发生的重要作用。生存期结果同样证明CXCL13的敲除能明显的延长老鼠的生存期(图6)。

实施例7抗CXCL13单克隆抗体通过抑制p-AKT、p-ERK及EMT信 号通路，抑制肿瘤细胞生长及侵袭转移

发明人利用PRGNGCPRKEIIVWKKNKSIV及CVQESSVFIPRRFID肽段为免疫原免疫小鼠，经过一次融合实验(2只小鼠)，3筛和亚型鉴定后分别得到13株/18株阳性细胞株，杂交瘤细胞的上清经ELISA以及western blot试验鉴定有7株强阳性细胞株。进一步利用western blot及transwell实验在细胞水平验证，发现抗CXCL13单克隆抗体2-6及2-24能显著抑制p-AKT、p-ERK及EMT信号通路，从而抑制肿瘤细胞生长及侵袭转移(图7)。

Claims (4)

1.一种用于制备肿瘤靶向药物的方法，包括：

筛选能够有效降低CXCL13癌蛋白高表达或中和CXCL13活性的抗体；以及利用所述抗体制备相应的肿瘤靶向药物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤为肺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、脑瘤、皮肤癌。

3.根据权利要求1所述的方法，所述抗体是以CXCL13癌蛋白中的不同肽段为免疫原所得到的单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的方法，所述肽段为PRGNGCPRKEIIVWKKNKSIV及CVQESSVFIPRRFID。