CN101484180A - Cxcl13拮抗剂及其用于治疗炎性疾病的用途 - Google Patents

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Abstract

治疗与CXCL13活性有关的疾病的方法利用了CXCL13拮抗剂和任选TNFα拮抗剂，如抗体(包括指定部分或变体)、多肽、多核苷酸、siRNA、shRNA、核酶和DNA酶。与CXCL13活性有关的疾病包括炎性疾病，如肺部疾病例如哮喘、肺气肿和COPD和系统性红斑狼疮。

Description

CXCL13拮抗剂及其用于治疗炎性疾病的用途
发明领域
本发明涉及CXCL13拮抗剂和用CXCL13拮抗剂治疗肺部疾病、症状和病况以及相关疾病和病况的方法。本发明更具体的涉及通过单独使用CXCL13拮抗剂或与TNFα拮抗剂一起使用以治疗此类疾病的方法，所述CXCL13拮抗剂例如干扰RNA、DNA酶和针对CXCL13的抗体，包括对至少一种蛋白质或其片断有特异性的指定部分或变体，其量能有效抑制CXCL13的活性。本发明还涉及使用CXCL13拮抗剂和TNF α拮抗剂治疗动物其他炎性疾病，如系统性红斑狼疮的方法。
发明背景
哮喘是综合性慢性疾病，具有遗传因素和环境因素(1)。其特征是可逆性气道阻塞、气道高反应性、气道发炎和重塑(2)。哮喘估计影响着1500万美国人，并且在工业化国家中与其有关的发病率和死亡率在增高(3，4)。过敏性哮喘患者气道中的炎症与CD4+T细胞的T协助细胞(Th)2亚型和嗜酸性粒细胞的粘膜浸润有关(5，6)。这些细胞之间的相互作用导致产生各种参与哮喘发病机理的促炎性介质(7，8)。其它形式的哮喘是因运动、病毒、阿司匹林和职业引起的哮喘。虽然造成这些形式的哮喘的机制可能涉及Th2淋巴细胞和细胞因子，但哮喘可能通过不同的方式引发(9-12)。有许多细胞因子和趋化因子参与哮喘的发病机理(13，14)。具体地，Th2衍生的细胞因子(白细胞介素4、5、9和13)在过敏性疾病包括哮喘中起到重要的作用。
慢性阻塞性肺病(COPD)是一种慢性肺部炎症，其特征是中性粒细胞、巨噬细胞、B和T细胞的浸润。这些免疫活性细胞通过各种细胞因子和趋化因子激活，该细胞因子和趋化因子在肺中释放以回应持续暴露于有毒气体和粒子(15)。支气管炎和肺气肿，与不可逆的气流障碍一起，是所述疾病的临床表现。没有已知的物质延迟COPD特征的肺功能的加速下降。
最近，观察到COPD的进展与通过固有的和合适的炎性免疫细胞形成包含生发中心的异位淋巴滤泡的实质浸润强烈关联。淋巴滤泡的存在与增厚末梢小气道壁的重塑过程偶联(16)。此结果强烈表明异位淋巴滤泡在COPD中的潜在药理作用。
为试图鉴定参与哮喘发病机理的新基因，研究人员已使用DNA微阵列技术来剖析哮喘动物模型中差异表达的基因(17，18)。微阵列技术是有效的工具，因为它使得能够同时分析成千上万个基因的表达，且还可自动化，从而允许以高通量形式进行。在多因素疾病如哮喘中，微阵列结果能提供基因表达谱，这在设计新的治疗法中可证明非常有用。而且在鉴定新基因和评注功能未知的基因中可证明非常有效(19)。
CXCL13(a.k.a BLC(B细胞趋化因子)或BCA-1(B细胞吸附因子1)或Angie2))是一种最强烈并有选择地吸引B细胞的趋化因子。它也通过受体CXCR5促进某些T细胞和巨噬细胞的移动(20)。CXCL13在Peyer氏斑、脾和淋巴结的滤泡中表达，并且相信在滤泡发育和稳态中是重要的(21)。
经过多年观察到，在慢性炎症的位点中炎性浸润(T、B和间质细胞)的排列与淋巴组织共有许多结构特性，所述淋巴组织形成所谓的异位淋巴滤泡(21)。此外，在慢性炎性疾病中CXCL13的高度异位产生与淋巴细胞积聚和异位淋巴滤泡形成相关联，所述慢性炎性疾病，如类风湿性关节炎(21)、Sjogren氏综合征(22)、各种形式的狼疮如系统性红斑狼疮(23，24)、溃疡性结肠炎(25，26)、多发性硬化(27-29)、I型糖尿病(30-32)和自身免疫性甲状腺疾病(33，34)。虽然异位淋巴滤泡的准确的致病作用不明确，但证据显示其在从急性分解为慢性、持久性炎症的转变中的重要性，所述转变通过允许淋巴细胞在局部炎症组织中积聚进行(35)。因此，分散或消除所述异位淋巴滤泡将提供一种控制慢性炎性疾病的新治疗方法。由于CXCL13在异位淋巴滤泡中的高度表达水平和其在维持它们的微观结构和吸引B细胞中的作用，因此CXCL13是理想的治疗靶标。
系统性红斑狼疮(SLE或狼疮)是一种慢性自身免疫性疾病，该疾病潜在使人衰弱并且有时当免疫系统攻击身体细胞和组织时，导致炎症和组织损伤而致命。SLE可以影响身体的任何部份，但最常见的是心脏、关节、皮肤、肺部、血管、肝脏、肾脏及神经系统的损伤。
CXCL13基因(GenBank登录号NM_006419，SEQ ID NO：1)位于人染色体4q21上。CXCL13属于CXC趋化因子家族。CXCL13对淋巴器官形成/发展、B细胞滤泡形成和B细胞招募是危险的。在多发性慢性炎性疾病的发炎组织中高度异位产生，并且相信在维持局部B和T细胞的激活和炎症中起重要作用。
基因表达可通过几种不同的方式来调节，包括通过使用siRNAs、shRNAs、反义分子和DNA酶来调节。SiRNAs和shRNAs都是通过RNAi途径起作用，并且已被成功用来抑制基因的表达。RNAi最初在蠕虫中发现，且与dsRNA有关的基因沉默现象最早由Fire和Mello报道出现在植物中，并且据认为是植物细胞抵抗RNA病毒感染的一种方式。在这一途径中，长dsRNA病毒产物被DICER-样酶处理为长度21-25bp的较小片断，然后双链分子被解旋和输入到RNA诱导性沉默复合物(RISC)中。在哺乳动物细胞中鉴定出类似的途径，主要的差别在于dsRNA分子长度必需小于30bp，以避免诱导所谓的干扰素应答，所述干扰素应答没有基因特异性，并且会导致细胞蛋白质合成的全面停止。
合成的siRNAs可被设计成特异性靶向一个基因，并且它们可容易地被递送到体外或体内细胞。ShRNAs是siRNA分子的DNA对等物，其优点在于能被掺入到细胞的基因组中，然后在每个有丝分裂周期中被复制。
DNA酶也已被用来调节基因表达。DNA酶是能切割单链RNA的催化性DNA分子。它们对靶RNA序列具有高度选择性，并且因此它们能用来通过靶向信使RNA下调特定的基因。
因此，需要鉴定和表征用于诊断和治疗涉及CXCL13的肺部疾病，例如哮喘，以及相关疾病和病况的新方法。此外，需要鉴定和表征治疗如系统性红斑狼疮病症的新方法。
发明概述
本发明涉及CXCL13、或其受体CXCR5、和/或它们之一或两者的活性的激动剂和/或拮抗剂(下文称“CXCL13拮抗剂”)，以及使用对至少一种CXCL13蛋白或其片断有特异性的CXCL13拮抗剂来治疗肺部相关病症的方法，所述CXCL13拮抗剂包括针对CXCL13的抗体及其指定部分或变体。这些CXCL13拮抗剂可与TNF α拮抗剂，如TNF α抗体，例如英夫利昔单抗等一起给予。CXCL13拮抗剂，如单克隆抗体，抑制局部B和T细胞招募和随后的激活以提供一种控制慢性免疫介导的炎性疾病的新方法。
在一个实施方案中，CXCL13拮抗剂是特异性结合CXCL13或其受体的抗体。这种抗体的特别优点在于它们能够以阻止CXCL13或其受体的作用的方式结合CXCL13或其受体。因此，本发明的方法利用了具有所需的中和特性的抗体，这种特性使得抗体理想地适用于治疗性和预防性治疗人或非人患者中各种与肺部相关疾病有关的疾病状态。因此，本发明涉及治疗需要此治疗的患者中肺部相关疾病或病况的方法，所述方法包括给予所述患者一定量的中和性CXCL13抗体以抑制肺部相关疾病或病况。
在另一个方面，本发明提供调节CXCL13或其受体活性的方法，所述方法包括使细胞与可调节(抑制或增强)CXCL13或其受体的活性或表达的物质(例如拮抗剂或激动剂)接触，使得在细胞中的活性或表达受到调节。在一个优选实施方案中，所述物质是能特异性结合CXCL13或其受体的抗体。在其它实施方案中，调节剂是肽、模拟肽或其它小分子。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗需要此治疗的患者中肺部相关疾病或病况的方法，所述方法包括给予所述患者一定量的中和性CXCL13抗体或其他与一种或多种TNFα拮抗剂一起的拮抗剂以抑制肺部相关疾病或病况。
本发明还提供治疗患有肺部或相关疾病的患者的方法，其中所述疾病可通过调节CXCL13的量或活性来改善。本发明也提供通过给予所述患者CXCL13活性的调节剂或CXCL13表达的调节剂的物质来治疗患有疾病的患者的方法，该疾病特征为CXCL13或其编码多核苷酸的活性异常。
在一个实施方案中，调节剂是多肽或小分子化合物。在另一个实施方案中，调节剂是多核苷酸。在一个具体的实施方案中，所述CXCL13拮抗剂是能够阻止细胞产生CXCL13的siRNA分子、shRNA分子或DNA酶。
本发明的另一个方面是一种治疗动物系统性红斑狼疮的方法，所述方法包括提供动物CXCL-13拮抗剂，并且提供动物TNF-α拮抗剂；其中各拮抗剂以引起动物中系统性红斑狼疮症状减少的有效量提供。在本方法的一个实施方案中，CXCL-13拮抗剂是CXCL-13结合抗体或CXCL-13结合抗体片断并且TNF α拮抗剂是TNF α结合抗体或TNF α结合抗体片断。
在本方法的另一个实施方案中，所述动物是哺乳动物。在本方法的另一个实施方案中，所述哺乳动物是人。在本方法的另一个实施方案中，提供的每个抗体或结合的抗体片断的量为约25mg/kg动物体重～约40mg/kg动物体重。在本方法的另一个实施方案中，系统性红斑狼疮的症状是通过肾组织检查鉴定的动脉周围淋巴细胞浸润病灶的数量。在本方法的另一个实施方案中，系统性红斑狼疮的症状是尿总蛋白与尿总肌酐的比值。在本方法的另一个实施方案中，CXCL-13拮抗剂是CXCL-13结合抗体或CXCL-13结合抗体片断并且TNFα拮抗剂是TNF α结合抗体或TNF α结合抗体片断。在本方法的另一个实施方案中，CXCL-13拮抗剂是CXCL-13结合抗体或CXCL-13结合抗体片断并且TNF α拮抗剂是TNF α结合抗体英夫利昔单抗(infliximab)。
此外，本发明提供本文描述的任何发明。
附图简述
图1显示患病肺组织中提高的CXCL13mRNA转录水平。
图2显示对TNF-α和CXCL13具有特异性的单克隆抗体联合治疗减轻肺部疾病症状，并通过患病肺组织中异位滤泡的大小来评定。
图3显示对TNF-α和CXCL13具有特异性的单克隆抗体联合治疗减少表达CD22.2的B-细胞向肺组织的浸润。
图4显示对TNF-α和CXCL13具有特异性的单克隆抗体联合治疗减少表达CD19的B-细胞向肺组织的浸润。
图5显示对TNF-α和CXCL13具有特异性的单克隆抗体联合治疗减少表达CD45R/B220的B-细胞向肺组织的浸润。
图6显示对TNF-α和CXCL13具有特异性的单克隆抗体联合治疗减少表达CD4的B-细胞向肺组织的浸润。
图7显示对CXCL-13和TNF-α具有特异性的mAbs联合给予，减少呈现系统性红斑狼疮(SLE)症状的NZB/W F1小鼠的肾小球肾炎相关的尿蛋白水平至仅接受PBS的未处理的对照NZB/W F1小鼠的水平以下。
图8显示对CXCL-13和TNF-α具有特异性的mAbs联合给予，减少呈现SLE症状的NZB/W F1小鼠中系统性红斑狼疮(SLE)相关的肾脏疾病的等级评分至仅接受PBS的未处理的对照NZB/W F1小鼠的水平以下(图8)。
发明详述
定义
给出以下定义以说明和限定用来描述本文发明的各种术语的含义和范围。
多肽的“活性”、生物活性和功能活性是指通过CXCL13或其受体响应其与另一蛋白质或分子的特异性相互作用所发挥的活性，该活性按照标准技术在体内、原位或体外测定。此类活性可以是直接活性，如与第二蛋白质的缔合或对第二蛋白质的酶促活性，或者是间接活性，如由所述蛋白质与第二蛋白质的相互作用或者胞内信号转导或凝固级联中的一系列相互作用所介导的细胞过程。
“抗体”包括任何含分子的多肽或肽，该分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，例如但不限于重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区或其任何部分、片断或变体。术语“抗体”还意指包括抗体、其消化片断、特定部分及变体，包括抗体模拟物或包含模拟抗体或其特定片断或部分的结构和/或功能的抗体部分，包括单链抗体、单区抗体及其片断。例如，抗体片断包括但不限于Fab(例如通过木瓜蛋白酶消化)、Fab′(例如通过胃蛋白酶消化和部分还原)和F(ab′)2(例如通过胃蛋白酶消化)、facb(例如通过纤溶酶消化)、pFc′(例如通过胃蛋白酶或纤溶酶消化)、Fd(例如通过胃蛋白酶消化、部分还原和重聚集)、Fv或scFv(例如通过分子生物学技术)片断，都为本发明所涵括(参见例如Colligan等(编辑)，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.，NY(1994-2001)；Colligan等，Current Protocols in Polypeptide Science，JohnWiley & Sons，NY(1997-2001))。
“嵌合”或“融合”分子是通过例如将一种或几种CXCL13拮抗剂(或其部分)与另外的核酸序列组合所创造的核酸或多肽。这种组合序列可引入到适当的载体中并表达，产生嵌合或融合多肽。
本发明核酸序列的“互补物”或“与”本发明核酸序列“互补”，是指与第一多核苷酸相比具有互补碱基序列和反方向的多核苷酸分子。
“片断”是指其氨基酸序列与CXCL13拮抗剂的部分而不是全部任何氨基酸序列完全相同的变体多肽，或者其核酸序列与任何CXCL13拮抗剂多核苷酸的一部分而不是全部任何核酸序列完全相同的变体多核苷酸。片断可包括，例如截断多肽或其变体，如包括异源氨基-和/或羧基-末端氨基酸序列的一系列连续残基。也包括由宿主细胞或者在其中产生的CXCL13拮抗剂的降解形式。其它示例性片断以结构或功能属性为特征，如包含α-螺旋或α-螺旋形成区、β-片层或β-片层形成区、转角或转角形成区、卷曲或卷曲-形成区、亲水区、疏水区、α-两亲区、β-两亲区、柔性区、表面-形成区、底物结合区、胞外区和高抗原指数区的片段。
本领域所知的“一致性”是两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列通过比较序列所确定的一种关系。在本领域中，＂一致性＂还指多肽或多核苷酸序列之间通过这种序列串之间的匹配所确定的序列的相关性程度。“一致性”和“相似性”可容易地用已知方法来计算，包括但不限于以下文献中描述的方法：Computational MolecularBiology，Lesk，A.M.(编辑)，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.(编辑)，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，(编辑)，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，AcademicPress，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，(编辑)M Stockton Press，New York，1991；及Carillo，H.，和Lipman，D.，Siam J.Applied Math.，48：1073(1988)。此外，从使用Vector NTI Suite8.0(Informax，Frederick，MD)AlignX组件的默认设置产生的氨基酸和核苷酸序列比对，可获得一致性百分值。
设计出优选的一致性确定方法，以产生所测试序列之间的最大匹配。用以确定一致性和相似性的方法编集在公共可得到的计算机程序中。优选的用于确定两个序列之间一致性和相似性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.，等，Nucleic Acids Research12(1)：387(1984))，BLASTP，BLASTN和FASTA(Atschul，S.F.等，J.Molec.Biol.215：403-410(1990))。BLAST X程序可从NCBI和其他来源公开获得(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBINLM NIH Bethesda，Md.20894：Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。也可用众所周知的Smith Waterman算法来确定一致性。
用于多肽序列比较的优选参数包括以下：
(1)算法：Needleman和Wunsch，J.Mol Biol.48：443-453(1970)比较矩阵：BLOSSUM62，获自Hentikoff和Hentikoff，Proc.Natl.Acad.Sci，USA.89：10915-10919(1992)
空隙罚分：12
空隙长度罚分：4
可与这些参数使用的程序可作为“空隙”程序公开获自GeneticsComputer Group，Madison Wis。上述参数是肽序列比较的默认参数(同时末端空隙无罚分)。
用于多核苷酸比较的优选参数包括以下：
(1)算法：Needleman和Wunsch，J.Mol Biol.48：443-453(1970)
比较矩阵：匹配＝+10，错配＝0
空隙罚分：50
空隙长度罚分：3
可作为“空隙”程序从Genetics Computer Group，Madison Wis获得。
这些是进行核算序列比较的默认参数。
举例说明，多核苷酸序列可与序列相同，即100％一致性，或它与参考序列相比可包括高达某一整数量的核苷酸变更。这种变更选自：至少一个核苷酸缺失、置换，包括转换和颠换(transversion)，或插入，并且其中所述变更可出现在参考核苷酸序列的5′或3′末端位置或这些末端位置之间的任何地方，个别地散布在参考序列的核苷酸中或在参考序列当中的一个或多个连续组中。核苷酸变更的数量通过以下确定：将该序列中的核苷酸总数乘以各自百分一致性的百分数值(除以100)，并且将序列中的核苷酸总数减去所得乘积，或者：
n.sub.n.ltorsim.x.sub.n-(x.sub.n.y)，
其中n.sub.n是核苷酸变更的数量，x.sub.n是序列中的核苷酸总数，且y是例如对于70％为0.70、对于80％为0.80、对于85％为0.85、对于90％为0.90、对于95％为0.95等等，且其中x.sub.n减去x.sub.n和y的任何非整数乘积前，先将该非整数乘积约减为最接近的整数。
编码该序列的多核苷酸序列的变更可造成这一编码序列中出现无义、错义或移码突变，并且因此改变在这种变更后由该多核苷酸编码的多肽。类似地，多肽序列可与参考序列相同，即100％一致性，或它与参考序列相比可包括高达某一整数量的氨基酸变更，结果一致性百分数小于100％。此类变更选自以下：至少一个氨基酸缺失、置换，包括保守和非保守置换、或插入，且其中所述变更可出现在参考多肽序列的氨基-或羧基-末端位置或这些末端位置之间的任何地方，个别地散布在参考序列的氨基酸中或在参考序列当中的一个或多个连续组中。对于给定的一致性百分数，氨基酸变更的数量通过以下确定：将该序列中的氨基酸总数乘以各自百分一致性的百分数值(除以100)，然后将序列中的氨基酸总数减去所得乘积，或者：
n.sub.a.ltorsim.x.sub.a-(x.sub.a.y)，
其中n.sub.a是氨基酸变更的数量，x.sub.a是该序列中的氨基酸总数，且y是例如对于70％为0.70、对于80％为0.80、对于85％为0.85等等，且其中x.sub.a减去x.sub.a和y的任何非整数乘积前，先将该非整数乘积约减为最接近的整数。
“核酸”是核苷酸的聚合物，其中核苷酸包含与糖连接的碱基，所述糖通过插入至少二价分子如磷酸一个接另一个依次连接。在天然核酸中，糖是2′-脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)。非天然的多或寡核苷酸包含修饰的碱基、糖或连接分子，但通常认为它们模拟了它们设计所模拟的天然核酸的互补性质。非天然寡核苷酸的一个实例是具有硫代磷酸骨架的反义分子组合物。“寡核苷酸”通常指具有少于30个核苷酸的核酸分子。
“多肽”是氨基酸残基通过肽键连接而成的聚合物，并且肽通常指残基数12个或以下的氨基酸聚合物。肽键可在核酸模板的指导下天然产生，或通过本领域众所周知的方法合成产生。
“蛋白质”是包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质还可包含连接到不参与肽键形成的氨基酸侧基的取代基。通常，真核细胞表达所形成的蛋白质还含碳水化合物。蛋白质在本文中根据其氨基酸序列或骨架来定义，并且取代基不管是否已知都不作指定。
术语“受体”表示由于与特异性配体或结合配偶体的相互作用而具有影响生物活性(在例如细胞中)的能力的分子。细胞膜结合受体以胞外配体结合结构域、一个或多个跨膜或穿膜结构域和通常参与信号转导的胞内效应结构域为特征。结合到细胞膜受体的配体造成胞外结构域的变化，该变化沿细胞膜传送，直接或间接与一种或多种胞内蛋白质相互作用，并且改变细胞特性，如酶特性、细胞形状或基因表达谱。受体也可不粘连在细胞表面，并且可以是胞质的、核的或完全从细胞中释放。非细胞伴随受体称为可溶性受体。
所有本文引述的出版物或专利无论是否作相应的具体指明，全部内容通过引用并入本文，因为它们显示了本发明当时的技术发展水平和/或提供了本发明的描述和实现。出版物是指任何科学或专利出版物，或可以任何媒体形式获得的任何其它信息，包括所有的录制形式、电子形式或印刷形式。以下参考文献全部内容通过引用并入本文：Ausubel等(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，NY(1987-2001)；Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow和Lane，antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan等(编辑)，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.，NY(1994-2001)；Colligan等，Current Protocols in Protein Science，John Wiley & Sons，NY(1997-2001)。
CXCL13的生物功能
已在多种人疾病和动物模型中鉴定了CXCL13的新表达和新功能及其在淋巴器官形成/发展、B细胞滤泡形成和B细胞募集中的生物功能。第一次，异位表达已与淋巴滤泡形成相连接，该淋巴滤泡形成与肺部疾病，具体但不限于，COPD相关。
CXCL13组合物可包含一种或多种蛋白质亚型、其免疫原性部分或编码此部分的多核苷酸。或者，治疗性组合物可包含表达CXCL13蛋白质的细胞、或对表达基因所编码的多肽细胞具有特异性的T细胞、或其它类型的激动剂；和拮抗剂，如针对CXCL13 DNA、RNA或蛋白质的任何部分的中和性单克隆抗体(mAb)、核酸基础治疗或小分子化合物。这些组合物可用于，例如，用于预防和治疗免疫介导的炎性疾病范围。公开了基于检测样本中CXCL13蛋白质或编码此类蛋白质的mRNA的诊断和预后方法。
CXCL13及其受体蛋白质、多肽和编码它们的核酸分子包含具有某些保守结构和功能特征的分子家族。这些分子的每一种都包括在CXCL13的定义中。本文所用的术语“家族”是指两种或多种具有共同或类似的结构域结构并且具有足够的如本文所定义的氨基酸或核苷酸序列一致性的蛋白质或核酸分子。家族成员可来自相同或不同的物种。例如，家族可包括两种或多种人类起源的蛋白质，或者可包括一种或多种人类起源的蛋白质和一种或多种非人类起源的蛋白质。
CXCL13蛋白质中可能存在的结构域是信号序列。本文所用的“信号序列”包括长度至少约10个氨基酸残基的肽，其出现在膜结合蛋白的氨基末端，并且其含有至少约45％疏水性氨基酸残基，如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸或缬氨酸。在一个优选的实施方案中，信号序列含有至少约10～35个氨基酸残基，优选约10～20个氨基酸残基，且具有至少约35～60％、更优选40～50％、且更优选至少约45％的疏水性残基。信号序列用于将含有这种序列的蛋白质导向脂质双层。因此，在一个实施方案中，CXCL13蛋白质可含有信号序列。信号序列在成熟蛋白质的加工过程中被切割。
CXCL13蛋白质包括胞外结构域。本文所用的“胞外结构域”是指当编码某蛋白质的核酸在细胞中表达时，该蛋白质定位到细胞脂质双层非胞质侧的部分。
此外，CXCL13蛋白质包括跨膜结构域。本文所用的“跨膜结构域”指长度至少约15个氨基酸残基，含有至少约65～70％疏水性氨基酸残基如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋白质、酪氨酸、色氨酸或缬氨酸的氨基酸序列(Erik等，Proc.of Sixth Int.Conf.on Intelligent Systems forMolecular Biology，第175-182页)。在一个优选的实施方案中，跨膜结构域含有约15～30个氨基酸残基，优选约20～25个氨基酸残基，且具有至少约60～80％、更优选65～75％、且更优选至少约70％的疏水性残基。
CXCL13蛋白质具有胞质结构域，特别包括具有羧基末端胞质结构域的蛋白质。本文所用的“胞质结构域”指当编码某蛋白质的核酸在细胞中表达时，该蛋白质定位到细胞脂质双层胞质侧的部分。CXCL13蛋白质通常包含多个潜在的翻译后修饰位点(常位于胞外结构域当中)。
CXCL13拮抗剂
本文所用的术语“CXCL13拮抗剂”是指抑制或中和CXCL13或其受体，CXCR5的生物活性的物质。这种拮抗剂通过多种方式来实现这一作用。一类CXCL13拮抗剂会以足够的亲和力和特异性结合CXCL13蛋白质，以中和CXCL13的生物效应。这类分子包括抗体和抗体片断(例如，如F(ab)或F(ab′)2分子)。另一类CXCL13拮抗剂包含CXCL13蛋白质的片断、突变蛋白质或有机小分子，即模拟肽，它们将结合CXCL13或CXCL13结合配偶体，从而抑制CXCL13的生物活性。CXCL13拮抗剂可为任何这些类别，只要它是抑制CXCL13生物活性的物质。CXCL13拮抗剂包括CXCL13抗体、CXCL13受体抗体、修饰的CXCL13和CXCL13的部分肽。另一类CXCL13拮抗剂包括本文公开的本领域所公知的靶向CXCL13基因序列的siRNAs、shRNAs、反义分子和DNA酶。
因此，本文所用的“CXCL13抗体”、“抗-CXCL13抗体”、“抗-CXCL13抗体部分”或“抗-CXCL13抗体片断”和/或“抗-CXCL13抗体变体”等等，包括任何含分子的蛋白质或多肽，该分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，例如但不限于重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区或其任何部分，或者包含衍生自CXCL13蛋白质或肽的CXCL13结合蛋白质的至少一部分，所述至少一部分能渗入到抗体中用于本发明。这种抗体任选还影响特异性配体，例如，但不限于这种抗体在体外、原位和/或在体内调节、降低、增加、拮抗、激动、缓和、减轻、阻断、抑制、消除和/或干扰CXCL13活性的情况。作为非限制性实例，本发明的合适的抗-CXCL13抗体、指定部分或变体可结合至少一种CXCL13蛋白质或肽或者其指定部分、变体或结构域。合适的抗-CXCL13抗体、指定部分或变体以多种方式影响CXCL13的功能，例如，但不限于RNA、DNA或蛋白质合成、CXCL13释放、CXCL13信号转导、CXCL13结合、CXCL13产生和/或合成。
抗体可包含以下中的一个或多个：至少一个CDR、至少一个可变区、至少一个恒定区、至少一条重链(例如g1、g2、g3、g4、m、a1、a2、d、e)、至少一条轻链(例如κ和λ)或其任何部分或片断，并且还可包含链间和链内二硫键、铰链区、可被铰链区隔开的糖基化位点以及重链和轻链。轻链的分子量通常为约25Kd并且重链的分子量通常为约50K～77Kd。轻链可以以kappa(κ)和lambda(λ)这两种不同的形式或同种型存在，它们可与任何重链类型组合。所有的轻链都具有至少一个可变区和至少一个恒定区。IgG抗体被认为是典型的抗体结构，并且在轻链中具有两个链间二硫键(一个在可变区，一个在恒定区)，重链中具有四个，并且这种键包括约60～70个氨基酸的肽环，组成链中约110个氨基酸的“结构域”。IgG抗体可被表征成IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四种类别。每种免疫球蛋白类别具有不同的一组功能。表1总结了每种免疫球蛋白各类别和各亚类的理化性质。
表1
 
性质 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM IgA1 IgA2 SigA IgD IgE
重链 γ1 γ1 γ1 γ1 μ α1 α2 α1/α2 δ e
平均血清浓度(mg/ml)       9 3 1 0.5 1.5 3.0 0.5 0.05 0.03 0.00005
沉降常数 7s 7s 7s 7s 19s 7s 7s 11s 7s 8s
分子量(X103) 146 146 170 146 970 160 160 385 184 188
半衰期(天) 21 20 7 21 10 6 6 ？ 3 2
％血管内分布 45 45 45 45 80 42 42 Trace 75 50
碳水化合物(％) 2-3 2-3 2-3 2-3 12 7-11 7-11 7-11 9-14 12
表2总结了人抗体各类别和各亚类的抗体作用功能的非限制性是实例。
表2
 
作用功能 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM IgA IgD IgE
补体结合 + +/- ++ - ++ - - -
胎盘转移 + +/- + + - - - -
与Staph A的结合 +++ +++ - +++ - - - -
与Strep G的结合 +++ +++ +++ +++ - - - -
+++＝非常高；++＝高；+＝中等；+/-＝极少；-＝无；？＝可疑
因此，可根据具体的治疗性或诊断性用途所需的特性和功能，如但不限于血清半衰期、血管内分布、补体结合等，为根据本发明的用途来选定抗体或其片断的类型。
分离的CXCL13多肽或其片断可用作免疫原，采用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术来产生抗体。可使用全长多肽或蛋白质，或者本发明提供抗原的肽片断用作免疫原。CXCL13蛋白质的抗原的肽片断包含至少8个(优选10、15、20或30或者更多个)氨基酸残基，并且包括该蛋白质的表位，使得针对该肽产生的抗体与该蛋白质形成特异性免疫复合物。
通常使用免疫原免疫合适的(即具有免疫能力的)对象，如兔、山羊、小鼠或其它哺乳动物或脊椎动物来制备抗体。适当的免疫原制品可含有，例如重组表达的或化学合成的多肽。所述制品可另外包括佐剂，如Freund氏完全或不完全佐剂，或者类似的免疫刺激剂。
抗体产生细胞可以从己用目标免疫原免疫的人或其它合适的动物的外周血，或者优选脾脏或淋巴结中获得。任何其它合适的宿主细胞也可用来表达编码本发明抗体、其指定片断或变体的异源或内源核酸。融合细胞(杂交瘤)或重组细胞可用选择性培养条件或其它合适的已知方法来分离，并通过有限稀释或细胞分选或者其它已知的方法来克隆。能产生具有所需特异性的抗体的细胞可通过合适的测定法(例如ELISA)来选择。
在一种方法中，通过将合适的以下进行融合，来产生杂交瘤：无限增值细胞系(例如骨髓瘤细胞系，如但不限于Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5，>243、P3X63Ag8.653、Sp2SA3、Sp2 MAI、Sp2 SS1、Sp2 SA5、U937、MLA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH 3T3、HL-60、MLA 144、NAMALWA、NEURO 2A等)，或者异源骨髓瘤、其融合产物、或其衍生的任何细胞或融合细胞、或任何其它本领域公知的合适细胞系(参见例如www.atcc.org，www.lifetech.com等)，与抗体产生细胞，例如但不限于分离的或克隆的脾脏、外周血、淋巴、扁桃体或者其它免疫或含细胞的B细胞，或者任何其它表达重链或轻链恒定的或可变的或构架或CDR序列的细胞。作为内源或异源的核酸，作为重组或内源的病毒、细菌、藻类、原核生物、两栖动物、昆虫、爬行动物、鱼、哺乳动物、啮齿动物、马、羊、山羊、绵羊、灵长类动物、真核动物基因组DNA、cDNA、rDNA、线粒体DNA或RNA、叶绿体DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA，单链、双链或三链的、杂交的等等或其任何组合。参见例如Ausubel(出处同上)和Colligan，Immunology(出处同上)第2章，它们全部内容通过引用并入本文。
可使用其它合适的产生或分离具有所需特异性的抗体的方法，包括但不限于从肽或多肽文库选择重组抗体的方法，所述文库例如，但不限于噬菌体、核糖体、寡核苷酸、RNA、cDNA等展示文库；例如可获自以下的文库：Cambridge antibody Technologies，Cambridgeshire，UK；MorphoSys，Martinsreid/Planegg，DE；Biovation，Aberdeen，Scotland，UK；BioInvent，Lund，Sweden；Dyax Corp.，Enzon，Affymax/Biosite；Xoma，Berkeley，CA；Ixsys。参见例如EP公开号368,684，PCT/GB91/01134；PCT/GB92/01755；PCT/GB92/002240；PCT/GB92/00883；PCT/GB93/00605；美国专利第5,962,255号；PCT/GB94/01422；PCT/GB94/02662；PCT/GB97/01835；(CAT/MRC)；WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；PCT/US94/1234；WO92/18619；WO96/07754；(Scripps)；EP 614 989(MorphoSys)；WO95/16027(BioInvent)；WO88/06630；WO90/3809(Dyax)；US4,704,692(Enzon)；PCT/US91/02989(Affymax)；WO89/06283；EP 371998；EP 550 400；(Xoma)；EP 229 046；PCT/US91/07149(Ixsys)；或者随机产生的肽或多肽—美国专利第5723323号、第5763192号、第5814476号、第5817483号、第5824514号和第5976862号，WO86/05803，EP 590 689(Ixsys，现为Applied Molecular Evolution(AME)，各专利全部内容通过引用并入本文)或者依靠对如本领域所公知和/或如本文所描述能够产生人抗体库的转基因动物(例如SCID小鼠，Nguyen等，Microbiol.Immunol.41：901-907(1997)；Sandhu等，Crit.Rev.Biotechnol.16：95-118(1996)；Eren等，Immunol.93：154-161(1998)，各文献以及相关的专利和申请全部内容通过引用并入本文)的免疫而产生的肽或多肽。这种技术，包括但不限于核糖体展示(Hanes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：4937-4942(1997年5月)；Hanes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：14130-14135(1998年11月))；单细胞抗体产生技术(例如选择淋巴细胞抗体方法(“SLAM”)(美国专利第5,627,052号，Wen等，J.Immunol.17：887-892(1987)；Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：7843-7848(1996))；凝胶微滴技术和流式细胞术(Powell等，Biotechnol.8：333-337(1990)；One Cell Systems，Cambridge，MA；Gray等，J.Imm.Meth.182：155-163(1995)；Kenny等，Bio/Technol.13：787-790(1995))；B-细胞选择(Steenbakkers等，Molec.Biol.Reports19：125-134(1994)；Jonak等，Progress Biotech，第5卷，In VitroImmunization in Hybridoma Technology，Borrebaeck(编辑)，ElsevierScience Publishers B.V.，Amsterdam，Netherlands(1988))。
也可使用非人或人抗体的工程改造或人源化方法，并且这些方法是本领域众所周知的。通常，人源化或工程改造的抗体具有一个或多个来自非人来源的氨基酸残基，所述非人来源例如但不限于小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或其它哺乳动物。这些人氨基酸残基常称为“输入”残基，通常取自己知人序列的“输入”可变的、恒定的或其它结构域。已知的人Ig序列公开于例如：
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi；www.ncbi.nih.gov/igblast；
www.atcc.org/phage/hdb.html；
www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php；
www.kabatdatabase.com/top.html；ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat；
www.sciquest.com；
www.abcam.com；www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；
www.public.iastate.edu/～pedro/research_tools.html；
www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm；
www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab；
www.path.cam.ac.uk/～mrc7/mikeimages.html；
mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html；www.immunologylink.com；
pathbox.wustl.edu/～hcenter/index.html；
www.appliedbiosystems.com；www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody；
www.m.ehime-u.ac.jp/～yasuhito/Elisa.html；www.biodesign.com；
www.cancerresearchuk.org；
www.biotech.ufl.edu；www.isac-net.org；
baserv.uci.kun.nl/～jraats/linksl.html；
www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu；www.mrc-cpe.cam.ac.uk；
www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html；
http://www.bioinf.org.uk/abs；antibody.bath.ac.uk；www.unizh.ch；
www.cryst.bbk.ac.uk/～ubcg07s；
www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.html；
www.path.cam.ac.uk/～mrc7/humanisation/TAHHP.html；
www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；
www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；
www.jerini.de；Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，美国卫生部(1983)，各自全部内容通过引用并入本文。
此类输入序列可用来降低免疫原性或者降低、增强或修饰结合、亲和力、结合速度(on-rate)、解离速度(off-rate)、亲合力、特异性、半衰期或本领域所公知的任何其它合适的特性。通常，保持部分或全部的非人或人CDR序列，同时将可变区和恒定区的非人序列用人氨基酸或其它氨基酸取代。还可任选将抗体人源化，但保持对抗原的高亲和力和其它有利的生物性质。为实现这一目标，可任选通过使用母体和人源化序列的三维模型分析母体序列和各种概念构想的人源化产物的过程，来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型可常规得到，并且本领域技术人员对其是熟悉的。可获得计算机程序以图解和展示选定候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。检查这些展示结果允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析能影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。这样，可从共有和输入序列选出FR残基并进行组合，从而获得所需的抗体特性，如对靶抗原的亲和力增强。一般来说，CDR残基直接地并最充分地参与影响抗原结合。本发明抗体的人源化或工程改造可用任何已知的方法来进行，包括但不限于以下文献中描述的那些方法：Winter(Jones等，Nature 321：522(1986)；Riechmann等，Nature 332：323(1988)；Verhoeyen等，Science239：1534(1988))；Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Clothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901(1987)；Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151：2623(1993)；美国专利第5723323号；第5976862号；第5824514号；第5817483号；第5814476号；第5763192号；第5723323号；第5766886号；第5714352号；第6204023号；第6180370号；第5693762号；第5530101号；第5585089；第5225539号和第4816567号；PCT/US98/16280；US96/18978；US91/09630；US91/05939；US94/01234；GB89/01334；GB91/01134；GB92/01755；WO90/14443；WO90/14424和WO90/14430；EP229246；每个文献包括其中引证的参考文献全部内容通过引用并入本文。
如本文中描述和/或本领域已知的，CXCL13抗体也可任选通过免疫能够产生人抗体库的转基因动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、非人灵长类动物等)来产生。产生人CXCL13抗体的细胞可从此类动物中分离，并用合适的方法如本文描述的方法来无限增值化。
能产生结合人抗原的人抗体库的转基因小鼠可通过已知的方法来生产(例如，但不限于授予Lonberg等的美国专利第5,770,428号、第5,569,825号、第5,545,806号、第5,625,126号、第5,625,825号、第5,633,425号、第5,661,016号和第5,789,650号；Jakobovits等的WO98/50433、Jakobovits等的WO 98/24893、Lonberg等的WO 98/24884、Lonberg等的WO 97/13852、Lonberg等的WO 94/25585、Kucherlapate等的WO 96/34096、Kucherlapate等的EP 0463 151 B1、Kucherlapate等的EP 0710 719 A1、Surani等的美国专利第5,545,807号、Bruggemann等的WO 90/04036、Bruggemann等的EP 0438 474 B1、Lonberg等的EP0814 259 A2、Lonberg等的GB 2 272 440 A、Lonberg等，Nature368：856-859(1994)，Taylor等，Int.Immunol.6(4)579-591(1994)，Green等，Nature Genetics 7：13-21(1994)，Mendez等，Nature Genetics15：146-156(1997)，Taylor等，Nucleic Acids Research 20(23)：6287-6295(1992)，Tuaillon等，Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724(1993)，Lonberg等，Int Rev Immunol13(1)：65-93(1995)和Fishwald等，NatBiotechnol 14(7)：845-851(1996)，这些文献各自全部内容通过引用并入本文)。通常，这些小鼠包含至少一个转基因，该转基因包含来自至少一个功能重排或可进行功能重排的人免疫球蛋白基因座的DNA。这种小鼠中的内源免疫球蛋白基因座可被破坏或缺失，以消除该动物产生由内源基因编码的抗体的能力。
本发明抗体也可在奶中制备：通过将至少一种抗-CXCL13抗体编码核酸给予转基因动物或哺乳动物，如山羊、牛、马、绵羊等，由这些动物在其奶中产生抗体。这种动物可用已知的方法提供。参见例如，但不限于美国专利第5,827,690号；第5,849,992号；第4,873,316号；第5,849,992号；第5,994,616号；第5,565,362号；第5,304,489号等，每个专利通过应用整体结合到本文中。本发明抗体另外可以这样制备：使用至少一种CXCL13抗体编码核酸以提供转基因植物和培养的植物细胞(例如，但不限于烟草和玉米)，在植物部分中或培养的细胞中产生这种抗体、其指定部分或变体。
本发明抗体能以宽范围的亲和力(KD)结合人CXCL13。在一个优选的实施方案中，至少一种本发明人单克隆抗体能任选以高亲和力结合人CXCL13。例如，人单克隆抗体能以等于或小于约10-7M的KD结合人CXCL13，所述KD例如但不限于0.1～9.9(或其中的任何范围或数值)X10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13或其中的任何范围或数值。
抗体对抗原的亲和力或亲合力可用任何合适的方法试验确定。(参见，例如Berzofsky等，“Antibody-Antigen Interactions，”见FundamentalImmunology，Paul，W.E.(编辑)，Raven Press：New York，NY(1984)；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman和Company：New York，NY(1992)；及本文描述的方法)。如果在不同的条件下(例如盐浓度、pH)进行测量，则所测得的具体抗体-抗原相互作用的亲和力会不同。因此，亲和力和其它抗原结合参数(例如KD、Ka、Kd)的测量优选用标准化的抗体和抗原溶液及标准化的缓冲液，如本文描述的缓冲液来进行。
可使用CXCL13拮抗剂(例如单克隆抗体)，通过标准的技术，例如亲和层析或免疫沉淀作用来分离CXCL13多肽。此外，可用这种抗体来检测蛋白质(例如在细胞裂解液或细胞上清液中)，以评估多肽表达的丰度和模式。还可诊断性使用所述抗体作为临床试验程序的一部分来监测组织中的蛋白质水平，例如以，例如确定给定治疗方案的功效。将抗体偶联到可检测物质会有助于进行检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻红素；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；合适的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。
术语“抗体”还意指涵括抗体、消化片断、指定部分及其变体，它们包括抗体模拟物或包含能模拟某抗体或其指定片断或部分的结构和/或功能的抗体部分，包括单链抗体及其片断。功能片断包括能结合哺乳动物CXCL13的抗原结合片断。例如，能够结合CXCL13或其部分的抗体片断包括但不限于Fab片断(例如通过木瓜蛋白酶消化)、Fab′片断(例如通过胃蛋白酶消化和部分还原)和F(ab′)2(例如通过胃蛋白酶消化)、facb片断(例如通过纤溶酶消化)、pFc′片断(例如通过胃蛋白酶或纤溶酶消化)、Fd片断(例如通过胃蛋白酶消化、部分还原和重聚集)、Fv或scFv片断(例如通过分子生物学技术)，都为本发明所涵括(参见例如Colligan，Immunology，出处同上)。
如本领域已知的和/或本文描述的，这种片断可通过酶促切割、合成或重组技术来产生。还可使用其中天然终止位点的上游已引入一个或多个终止密码子的抗体基因，来产生多种截短形式的抗体。例如，可将编码F(ab′)2重链部分的组合基因设计成包括编码重链的CH1结构域和/或铰链区的DNA序列。抗体的各个部分可通过常规技术化学法连接在一起，或者可使用遗传工程技术制备成连续蛋白质。
抗-CXCL13抗体可以是灵长类动物、啮齿动物或人抗体，或者是嵌合或人源化抗体。本文所用的术语“人抗体”是指这样的抗体，其中蛋白质的基本每个部分(例如CDR、构架、CL、CH结构域(例如CH1、CH2、CH3、铰链、(VL、VH))在人体中都基本无免疫原性，只有较少的序列变化或变异，和/或被工程改造为、衍生自或含有已知的人抗体成分。类似地，指明灵长类动物(猴、狒狒、黑猩猩等)、啮齿动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠等)和其它哺乳动物的抗体，是指此类物种、亚属、属、亚科、科特异性抗体。此外，本发明的嵌合抗体可包括任何上述抗体的组合。相对于非修饰抗体，这种变化或变异任选和优选地保持或减少在人或其它物种中的免疫原性。因此，人抗体与嵌合或人源化抗体不同。要指出的是，人抗体可由能够表达功能重排的人免疫球蛋白(例如重链和/或轻链)基因的非人动物细胞或原核生物细胞或者真核生物细胞产生。此外，当人抗体是单链抗体时，它可包含天然人抗体中不存在的接头肽。例如，Fv可包含如2～约8个甘氨酸或其它氨基酸残基的接头肽，该接头肽将重链可变区和轻链可变区连接在一起。认为这种接头肽来源于人类。
还可使用双特异性抗体、异种特异性抗体、杂缀合(heteroconjugate)抗体或类似的抗体，它们是对至少两种不同的抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优选人或人源化抗体。在这种情况下，一种结合特异性是针对至少一种CXCL13蛋白质，另一种结合特异性是针对任何其他抗原例如CXCL13受体或TNFα。制备双特异性抗体的方法是本领域公知的。传统上，双特异性抗体的重组生产是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共同表达，其中的两条重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四体瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化往往通过亲和层析步骤来进行，相当麻烦，且产物得率低。类似的程序公开于例如WO93/08829、美国专利第6210668号、第6193967号、第6132992号、第6106833号、第6060285号、第6037453号、第6010902号、第5989530号、第5959084号、第5959083号、第5932448号、第5833985号、第5821333号、第5807706号、第5643759号、第5601819号、第5582996号、第5496549号、第4676980号、WO 91/00360、WO 92/00373、EP03089，Traunecker等，EMBO J.10：3655(1991)，Suresh等，Methods inEnzymology 121：210(1986)，这些文献各自全部内容通过引用并入本文。
可用于本发明的方法和组合物中的抗-CXCL13抗体，可任选具有以高亲和力结合CXCL13并且任选和优选地具有低毒性的特征。具体的说，其中各单个成分如可变区、恒定区和构架单独地和/或共同地、任选地和优选地具有低免疫原性的本发明抗体、指定片断或变体，可用于本发明。可用于本发明的抗体任选具有以下能力特征：长时间治疗患者，使症状有相当的缓和，低和/或可接受毒性的能力特征。低或可接受的免疫原性和/或高亲和力以及其它合适的特性可有助于所获得的治疗结果。“低免疫原性”在本文中定义为在小于约75％、或优选小于约50％的受治疗患者中引起显著的HAHA、HACA或HAMA反应，和/或在受治疗患者中引起低滴度(用双抗原酶免疫测定法测出小于约300，优选小于约100)(Elliott等，Lancet 344：1125-1127(1994)，其全部内容通过引用并入本文)。
合适的抗体包括能与阻断CXCL13激活的单克隆抗体竞争结合人CXCL13的抗体。
siRNA、shRNA、反义、核酶和DNA酶形式的CXCL13拮抗剂
靶向CXCL13的诱导物的治疗药物可提供更好的成功机会。基因表达可以以几种不同的方式来调节，包括通过使用siRNAs、shRNAs、反义分子、核酶和DNA酶。合成的siRNAs、shRNAs、核酶和DNA酶可设计成特异性靶向一种或多种基因，且它们可容易地体外或体内递送到细胞中。
本发明涵括反义核酸分子，即与编码CXCL13多肽的有义核酸互补的分子，例如与双链cDNA分子的编码链互补或者与mRNA序列互补。因此，反义核酸可与有义核酸氢键连接。反义核酸可与整个编码链互补，或者只与其一部分例如全部或部分蛋白质编码区(或可读框)互补。反义核酸分子可反义于编码CXCL13多肽的核苷酸序列的编码链的全部或部分非编码区。非编码区(“5′和3′非翻译区”)是位于编码区的侧翼的5′和3′序列，并且不被翻译成氨基酸。
反义寡核苷酸长度可以是例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50或更多个核苷酸。本发明的反义核酸可使用本领域公知的方法用化学合成法或酶促连接反应来构建。例如，反义核酸(例如反义寡核苷酸)可用天然核苷酸或各种修饰的核苷酸化学合成，所述修饰的核苷酸被设计成提高分子的生物稳定性或提高反义核酸和有义核酸之间所形成的双链体的物理稳定性，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物、肽核酸(PNAs)和吖啶取代的核苷酸。可用来产生反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁苷、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸乙酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。或者，反义核酸可用其中核酸以反向亚克隆的表达载体生物产生(即从所插入的核酸转录的RNA对于目的靶核酸将是反向的，以下分段中进一步描述。
本发明的反义核酸分子通常给予患者或原位产生，使得它们与编码选定的CXCL13多肽的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而例如通过抑制转录和/或翻译来抑制表达。杂交可通过常规的核苷酸互补性进行，以形成稳定的双链体，或者例如在能结合DNA双链体的反义核酸分子的情况下，通过双螺旋的大沟中的特异性相互作用进行。本发明反义核酸分子的给予途径的一个实例是在组织部位直接注射。或者，可将反义核酸分子修饰为靶向选定的细胞，然后全身给予。例如，对于全身给予，可将修饰反义分子，例如通过将反义核酸分子连接到能结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体，使得它们能特异性结合在选定的细胞表面上表达的受体或抗原。反义核酸分子也可用本文描述的载体递送到细胞。为达到足够的细胞内反义分子浓度，优选其中反义核酸分子被置于强pol II或pol III启动子控制下的载体构建物。
本发明的反义核酸分子也可以是α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补RNA形成特殊的双链杂合体，在该双链杂合体中与通常的α-单位不同的是，各链互相平行(Gaultier等，(1987)Nucleic Acids Res.15：6625-6641)。反义核酸分子也可包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等，(1987)Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，(1987)FEBS Lett.215：327-330)。
本发明还包括核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它们对单链核酸如mRNA具有互补区而能够将其切割。因此，核酶(例如Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334：585-591中描述的锤头状核酶)可用来催化性切割mRNA转录物，从而抑制mRNA所编码的蛋白质的翻译。对编码CXCL13多肽的核酸分子具有特异性的核酶可基于本文公开的cDNA的核苷酸序列进行设计。例如，在Cech等美国专利第4,987,071号和Cech等美国专利第5,116,742号中，可构建四膜虫L-19 IVS RNA衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与待切割的核苷酸序列互补。或者，可以使用编码CXCL13多肽的mRNA，从RNA分子集合中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA。参见例如Haselhoff和Gerlach，出处同上；Bartel和Szostak(1993)Science261：1411-1418。
本发明还涵括为为互补、反义、双链同系物、siRNA或者为形成小发夹结构的序列特异性单链RNAs、shRNA(通称干扰RNA)，其可用来下调特定的基因表达(在本发明情况下CXCL13的表达)，从而抑制蛋白质表达并阐明它们各自的生物功能。(Fire，A.，等，(1998)Nature 391：806-811；Paddison，P.J.等(2002)Genes Develop 16：948-958)。
本发明还涵括能够切割RNA(Breaker和Joyce，1994；Santoro和Joyce，1997)或DNA(Carmi等，1996)分子的DNA酶。此类核酸酶的催化切割的比率取决于二价金属离子如Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+和Pb2+的存在和浓度(Santoro和Joyce，1998；Brown等，2003)。
催化DNA酶，如10:23和8:17DNA酶，具有多结构域。它们具有保守的催化结构域(催化核心)，其侧接两个非保守的底物结合结构域(杂交臂)，该底物结合结构域是特异性结合于底物的序列区域。10:23和8:17DNA酶能够在特异性RNA磷酸二酯键处切割核酸底物(Santoro和Joyce，1997)。10:23DNA酶具有15个脱氧核苷酸的催化结构域，其侧接两个底物-识别臂。8:17DNA酶有相似大小。
催化性核酸可切割具有符合最低要求的靶序列的核酸底物。所述底物序列必须与催化性核酸的杂交臂基本互补，并且所述底物必须在切割位点包含特异性序列。特异性序列要求在切割位点包括，例如，嘌呤：嘧啶核糖核苷酸序列，用于被10:23DNA酶切割(Santoro和Joyce，1997)。
在各个实施方案中，本发明的核酸分子可在碱基部分、糖部分或磷酸骨架进行修饰，以改进例如分子的稳定性、杂交性或溶解性。例如，可用如上所述的核苷酸类似物替代天然的核苷酸。
在另一个实例中，核酸的脱氧核糖磷酸骨架可进行修饰，以产生肽核酸(参见Hyrup等，(1996)Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1)：5-23)。本文所用的术语“肽核酸”或“PNAs”是指核酸模拟物例如DNA模拟物，其中脱氧核糖磷酸骨架被假肽骨架所代替，并且只保持着四种天然核碱基。PNAs的中性骨架已证实允许在低离子强度条件下与DNA和RNA进行特异性杂交。PNA寡聚体的合成可用Hyrup等(1996)，出处同上；Perry-O′Keefe等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14670-675中描述的标准固相肽合成方案来进行。
PNAs可用于治疗性和诊断性应用中。例如，PNAs可用作反义剂或反基因剂，以通过例如诱导转录或翻译停滞或者抑制复制来进行基因表达的序列特异性调节。PNAs也可通过例如PNA指导的PCR锁止技术(PCR clamping)用于例如分析基因中的单碱基对突变；当与其他酶例如S1核酸酶组合使用时用作人工限制酶(Hyrup(1996)，出处同上)；或者可用作DNA序列和杂交的探针或引物(Hyrup(1996)，出处同上；Perry-O′Keefe等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14670-675)。
在另一个实施方案中，可通过将亲脂性基团或其它辅助基团连接到PNA，通过形成PNA-DNA嵌合体，或者通过使用本领域公知的脂质体或其它药物递送技术，对PNA进行修饰，例如以增强其稳定性或细胞摄取。例如，可产生出组合了PNA和DNA的有利性质的PNA-DNA嵌合体。此类嵌合体允许DNA识别酶例如RNASE H和DNA聚合酶与DNA部分相互作用，而PNA部分则提供高结合亲和力和特异性。PNA-DNA嵌合体可用适当长度的接头连接，所述接头根据碱基堆积、核碱基之间的键数量和方向来选择(Hyrup(1996)，出处同上)。PNA-DNA嵌合体的合成可按Hyrup(1996)，出处同上和Finn等(1996)Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63中描述来进行。例如，可用标准的亚磷酰胺偶联化学和修饰的核苷类似物，在固相载体上合成DNA链。诸如5′-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5′-脱氧胸苷亚磷酰胺的化合物可用作PNA和DNA5′末端之间的接头(Mag等(1989)Nucleic Acids Res.17：5973-88)。然后以逐步的方式将PNA单体偶联，以产生带5′PNA区段和3′DNA区段(Finn等(1996)Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63)的嵌合分子。或者，可合成带5′DNA区段和3′PNA区段(Peterser等(1975)Bioorganic Med.Chem.Lett.5：1119-11124)的嵌合分子。
在其它实施方案中，寡核苷酸可包括其它附属基团如肽(例如用以靶向体内的宿主细胞受体)，或者包括能帮助转运通过细胞膜(参见例如Letsinger等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6553-6556；Lemaitre等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：648-652；PCT公开号WO 88/09810)或血脑屏障(参见例如PCT公开号WO 89/10134)的物质。此外，寡核苷酸可用杂交触发的切割剂(参见例如Krol等(1988)Bio/Techniques6：958-976)或嵌入剂(参见例如Zon(1988)Pharm.Res.5：539-549)进行修饰。为此，可将寡核苷酸缀合到另一分子，例如肽、杂交触发的交联剂、转运剂、杂交触发的切割剂等。
蛋白质
本发明还提供嵌合或融合蛋白质。本文所用的“嵌合蛋白质”或“融合蛋白质”包括有效连接到异源多肽(即相同CXCL13多肽之外的多肽)的全部或部分CXCL13多肽(优选生物活性的)。在融合蛋白质当中，术语“有效连接”意在表示所述CXCL13多肽和所述异源多肽相互框内融合在一起。所述异源多肽可融合到所述CXCL13多肽的氨基末端或羧基末端。在另一个实施方案中，可将CXCL13多肽或其结构域或活性片断与异源蛋白质序列或其片断融合形成嵌合蛋白质，其中多肽或结构域或片断不是末端对末端融合，而是插入到异源蛋白质构架当中。
一种有用的融合蛋白质是其中CXCL13多肽融合到GST序列的羧基末端的GST融合蛋白质。此类融合蛋白质可帮助重组CXCL13多肽的纯化。
在另一个实施方案中，融合蛋白质在其氨基末端含有异源信号序列。例如，可将CXCL13多肽的天然信号序列去除，用来自另一蛋白质的信号序列代替。例如，可将杆状病毒包膜蛋白的gp67分泌序列用作异源信号序列(Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等(编辑)，John Wiley & Sons，1992)。真核生物异源信号序列的其它实例包括蜂毒肽和人胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；La Jolla，Calif)。在又一个实例中，有用的真核生物异源信号序列包括phoA分泌信号(Sambrook等，出处同上)和A蛋白分泌信号(Pharmacia Biotech；Piscataway，N.J.)。
在又一个实施方案中，融合蛋白是其中全部或部分的CXCL13多肽融合到衍生自免疫球蛋白家族成员的序列的免疫球蛋白融合蛋白。可将本发明的免疫球蛋白融合蛋白掺入到药物组合物中并给予患者，以抑制配体(可溶性的或细胞膜结合的)和细胞表面上的蛋白质(受体)之间的相互作用，从而抑制体内的信号转导。免疫球蛋白融合蛋白可用来影响CXCL13多肽的关联配体的生物利用度。对于治疗增殖性和分化性疾病和对于调节(例如促进或抑制)细胞存活，配体/受体相互作用的抑制是治疗上有用的。免疫球蛋白嵌合蛋白的优选实施方案是共同待审申请PCT WO/04002417中所教导的具有活性多肽片断插入修饰构架区中的CH1结构域缺失免疫球蛋白或“模拟抗体(mimetibody)”。此外，本发明的免疫球蛋白融合蛋白可作为免疫原，用以产生针对患者中的CXCL13多肽的抗体，用以纯化配体和在筛选测定中用以鉴定能抑制受体与配体的相互作用的分子。
本发明的嵌合蛋白和融合蛋白可通过标准的重组DNA技术产生。在另一个实施方案中，融合基因可通过常规技术来合成，包括自动DNA合成仪。或者，可使用锚定引物进行基因片断的PCR扩增，所述锚定引物在两条相邻基因片断之间产生互补突出端，然后随后可使这两条相邻基因片断退火和再扩增以产生嵌合基因序列(参见例如Ausubel等，出处同上)。此外，有许多已经编码融合部分(例如GST多肽)的表达载体可市售获得。可将编码CXCL13多肽的核酸克隆到此类表达载体中，使得融合部分与CXCL13多肽框内连接。
可用CXCL13多肽的信号序列来促进目的分泌蛋白质或其它蛋白质的分泌和分离。信号序列通常以疏水性氨基酸核心为特征，所述疏水性氨基酸在一个或多个切割事件中在分泌过程中从成熟蛋白质上切割下来。这种信号肽含有加工位点，其允许信号序列在成熟蛋白质通过分泌途径时从成熟蛋白质上切割下来。因此，本发明涉及所描述的具有信号序列的多肽，还涉及信号序列本身和不存在信号序列的多肽(即切割产物)。在一个实施方案中，可将编码本发明的信号序列的核酸序列在表达载体中有效连接到目的蛋白质，如平常不被分泌或另外难以分离的蛋白质。信号序列能指导蛋白质的分泌，如从转化了表达载体的真核生物宿主分泌，而信号序列随后或同时被切割。然后蛋白质就可容易地通过本领域公认的方法从胞外介质中纯化出来。或者，可用能促进纯化的序列如具有GST结构域的序列，将信号序列与目的蛋白质连接起来。
在另一个实施方案中，本发明的信号序列可用来鉴定调节序列，例如启动子、增强子和/阻抑物。由于信号序列是肽中最靠近氨基末端的序列，位于肽氨基末端侧上的信号序列的侧翼核酸很可能是影响转录的调节序列。因此，可将编码全部或一部分信号序列的核苷酸序列用作探针，以鉴定和分离信号序列及其侧翼区，并且可对这些侧翼区进行研究，以鉴定其中的调节元件。
本发明还涉及CXCL13多肽的变体，并且可包括一个或多个本文所指定的来自天然突变或人工操作的氨基酸置换、缺失或添加。这种突变体或置换体可包括突变蛋白质，其突变可足够显著到能改变肽的性质却又不改变肽的生物活性，以抑制人CXCL13与其配体的结合。当然，技术人员能作出的氨基酸置换数量取决于多种因素，包括上文描述的那些因素。在本发明的某些实施方案中，如本文所载明，任何给定CXCL13多肽、片断或变体的氨基酸置换、插入或缺失的数量，不会超过1-5或者这当中的任何范围或数值。
CXCL13多肽还可包含置换或添加到其氨基酸序列中的修饰的非天然和不常见氨基酸。以下提供示例性的修饰的非天然和不常见氨基酸的列表。
Figure A200780020598D00321
Figure A200780020598D00331
CXCL13多肽中其功能所必需的氨基酸可通过本领域公知的方法来鉴定，所述方法如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如Ausubel，出处同上，第8、15章；Cunningham和Wells，Science 244：1081-1085(1989))。后一方法在分子中的每个残基引入单丙氨酸突变。然后检测所得的突变分子的生物活性，例如但不限于至少一种CXCL13的中和活性。
这种变体具有改变了的氨基酸序列，并且能起到激动剂(模拟物)或拮抗剂的作用。变体可通过诱变例如不连续点突变或截短来产生。激动剂能基本保持天然形式蛋白质的同样生物活性或生物活性子集。蛋白质的拮抗剂能通过例如竞争性结合包括目的蛋白质在内的细胞信号转导级联的下游或上游成员，来抑制天然形成蛋白质的一种或多种活性。因此，通过用功能有限的变体进行治疗，可引起特定的生物效应。用具有天然形成蛋白质的生物活性子集的变体治疗患者，相比于用天然形式的蛋白质进行的治疗，在患者中会有较少的副作用。
能起到激动剂(模拟物)或拮抗剂的作用的CXCL13多肽变体，可通过筛选本发明蛋白质的突变体(例如截短突变体)的组合文库寻找激动剂或拮抗剂活性来鉴定出。在一个实施方案中，多样化变体文库通过核酸水平上的组合诱变产生，并且通过多样化基因文库来编码。多样化变体文库可例如这样产生：将合成寡核苷酸的混合物酶法连接到基因序列中，使得简并的一组潜在蛋白质序列可作为单个多肽表达，或者作为一组更大的融合蛋白表达(例如进行噬菌体展示)。有多种方法可用来从简并寡核苷酸序列产生CXCL13多肽的潜在变体文库。用以合成简并寡核苷酸的方法是本领域公知的(参见例如Narang(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等(1984)Science 198：1056；Ike等(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。
此外，可用CXCL13多肽的编码序列的片断文库来产生多样化多肽群体，以进行变体的筛选和随后的选择。例如，可如下产生编码序列片断文库：在其中每个分子只出现约一次切口的条件下用核酸酶处理目的编码序列的双链PCR片断，使该双链DNA变性，使该DNA复性以形成可包括来自不同带切口产物的有义/反义对的双链DNA，通过用S1核酸酶处理从再形成的双链体除去单链部分，将所得的片断文库连接到表达载体中。用这种方法可衍生出编码目的蛋白质的各种大小的氨基末端和内部片断的表达文库。
本领域已知有几种技术用来筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物，和用来筛选cDNA文库寻找具有选定特性的基因产物。最广泛使用的适于高通量分析的大基因文库筛选技术通常包括：将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所得的载体文库转化适当的细胞，和在其中对所需活性的检测有助于编码基因产物被检测的基因载体的分离的条件下，使组合基因表达。可将递归整体诱变(Recursiveensemble mutagenesis，REM)这种能提高文库中功能突变体的发生频率的技术与筛选测定法组合使用，以鉴定CXCL13拮抗剂多肽的变体(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave等(1993)Protein Engineering 6(3)：327-331)。
组合物及其用途
根据本发明，本文描述的中和性CXCL13拮抗剂如单克隆抗体，可以用来抑制CXCL13活性。此外，这种拮抗剂可用来抑制适于这种治疗的CXCL13相关炎性疾病，所述疾病可包括，但不限于肺部相关疾病。待治疗的个体可以是任何哺乳动物，并且优选是灵长类动物、哺乳动物类伴侣动物，并且最优选人患者。所给予的拮抗剂的量需根据其使用目的和给予方法加以改变。
抗-CXCL13拮抗剂可通过多种方法来给予，所述方法能在其中CXCL13活性需要预防或阻止的组织中产生作用。此外，CXCL13拮抗剂并不需要在局部部位存在以对CXCL13活性产生作用，因此，它们可在能进入含CXCL13的身体区室或流体的任何部位给予。在发炎的、恶性的或另外受损的组织的情况下，这些方法可包括直接应用含拮抗剂的制剂。这种方法包括液体组合物的静脉内给予、液体或固体制剂的透皮给予、口服、局部给予或者间质或手术间给予。可通过植入其主要功能可能不是作为药物递送介体的装置来实现给予。
给予也可为口服或者通过局部注射到肿瘤或组织中，但通常静脉内给予单克隆抗体。一般地，剂量范围在约0.05mg/kg～约12.0mg/kg。其可以是以推注或以可通过微处理器控制和可编程泵装置控制的慢速或连续输注。
或者，可从杂交瘤细胞中分离出优选编码单克隆抗体片断的DNA并给予哺乳动物。该DNA可以以裸形式或插入到重组载体例如痘苗病毒中来给予，插入的方式能导致该DNA在患者细胞中的表达和抗体的递送。
本发明方法中所用的单克隆抗体可通过任何已确立的药物组合物配制方法来配制，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，1985中描述的方法。为便于给予，通常将单克隆抗体与药物可接受的载体组合。这种载体包括水、生理盐水或油。
适合于胃肠外给予的制剂包括含水和非水无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和能使制剂与预定接受者的血液等渗的溶质；并且包括含水和非水无菌混悬剂，其可包含悬浮剂和增稠剂。预定可将任何常规介质用于任何组合物中，除非它们与活性成分及其预定用途到了不相容的地步。
制剂可以在单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶中存在，并且可保存在冷冻干燥(冻干)条件下，临用前只需要加入无菌液体载体例如注射用水。
可将CXCL13拮抗剂核酸分子、多肽和抗体掺入到适合于给药的药物组合物中。此类组合物通常包含核酸分子、蛋白质或抗体及药物可接受的载体。本文所用的专门用于“药物可接受的载体”意指包括任何和所有的与药物给予相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。将此类介质和物质用于药物活性物质是本领域众所周知的。预定可将任何常规介质或物质用于组合物中，除非它们与活性化合物到了不相容的地步。也可将辅助活性化合物掺入到组合物中。
在另一个方面，本发明涉及通过某个部分的共价连接而被修饰的本文所描述CXCL13拮抗剂。这种修饰可产生药物动力学特性得以改进(例如体内血清半衰期增加)的CXCL13拮抗剂。有机部分可以是直链或支链的亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在具体的实施方案中，亲水性聚合物基团其分子量可为约800～约120,000道尔顿，并且可以是聚烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，而脂肪酸基团或脂肪酸酯基团可包含约8～约40个碳原子。本文所用的术语“脂肪酸”涵括单羧酸和二羧酸。适合于修饰本发明抗体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的，或者可以含有一个或多个不饱和单位。适合于修饰本发明抗体的脂肪酸包括，例如正十二烷酸(C12，月桂酸)、正十四烷酸(C14，肉豆蔻酸)、正十八烷酸(C18，硬脂酸)、正二十烷酸(C20，花生酸)、正二十二烷酸(C22，山嵛酸)、正三十烷酸(C30)、正四十烷酸(C40)、顺-δ-9-十八烷酸(C18，油酸)、全顺-δ-5，8，11，14-eicosatetraenoate(C20，花生四烯酸)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸酯包括含直链或支链低级烷基的二羧酸的单酯。低级烷基可包含1～约12个，优选1～约6个碳原子。
修饰的人多肽和抗体可用合适的方法来制备，如通过与一种或多种修饰剂反应来制备。本文所用的术语“修饰剂”指包含活化基团的合适的有机基团(例如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”是在适当条件下能与另一化学基团反应，从而在修饰剂和所述另一化学基团之间形成共价键的化学部分或官能团。例如，胺反应性活性基团包括亲电子基团如甲苯黄酸根、甲磺酸根、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。能与硫醇反应的活化基团包括例如马来酰亚胺、碘代乙酰基、丙烯酰基(acrylolyl)、二硫代吡啶(pyridyldisulfides)、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。醛官能团可偶联到含胺或肼的分子，并且叠氮基能与三价磷基团反应形成氨基磷酸酯键或磷酰亚胺(phosphorimide)键。将活性基团引入到分子中的合适方法是本领域公知的(参见例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996))。
本发明包括用以调节CXCL13多肽、核酸或抗体的表达或活性的药物组合物的制备方法。这种方法包括将药物可接受的载体与可调节CXCL13多肽、核酸或抗体的表达或活性的物质配制在一起。这种组合还可包括另外的活性物质。因此，本发明还包括通过将药物可接受的载体与可调节CXCL13多肽、核酸或抗体的表达或活性的物质及一种或多种另外的活性化合物配制在一起，来制备药物组合物的方法。
可调节表达或活性的物质可以是，例如小分子。例如，此类小分子包括肽、肽模拟物、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、分子量小于约10,000克/摩尔的有机或无机化合物(即包括杂有机化合物和有机金属化合物)、分子量小于约5,000克/摩尔的有机或无机化合物、分子量小于约1,000克/摩尔的有机或无机化合物、分子量小于约500克/摩尔的有机或无机化合物，以及这种化合物的盐、酯和其他药物可接受的形式。
应该理解，小分子物质和蛋白质或多肽物质的合适剂量决定于多种因素，其在普通熟练的医师、兽医或研究人员的知识范围内。这些物质的剂量将例如根据患者或所处理样品的身份、大小和条件，还根据化合物的给予途径(如适用)，以及执业医生希望该物质对CXCL13多肽、核酸或抗体产生的作用而改变。小分子的示例性剂量包括mg或μg量/公斤患者或样本体重(例如，约1μg/kg～约500mg/kg、约100μg/kg～约5mg/kg或约1μg/kg～约50μg/kg)。蛋白质或多肽的示例性剂量包括克、mg或μg量/公斤患者或样本体重(例如约1μg/kg～约5g/kg、约100μg/kg～约500mg/kg或约1mg/kg～约50mg/kg)。还应该理解，一种这些物质的合适剂量决定于该物质对于待调节的表达或活性的效力。这种合适剂量可用本文描述的测定法来确定。
当将一种或多种这些物质给予动物(例如人)以调节CXCL13多肽、核酸或抗体的表达或活性时，医师、兽医或研究人员可，例如首先开出相对较低的剂量，然后增加剂量，直到获得适当的响应。另外应该理解，针对任何具体动物患者的具体剂量水平会决定于多种因素，包括所采用的具体物质的活性，患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，给药时间，给药途径，排泄率，任何药物组合及所要调节的表达或活性的程度。
本发明的药物组合物可配制成与其预定给药途径适合。给药途径的实例包括胃肠外给药，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入或口腔)、透皮(局部)、透黏膜和直肠给药。用于胃肠外、皮内或皮下应用的溶液剂或混悬剂可包括以下成分：无菌稀释剂，如注射用水、盐溶液、不挥发油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苄醇或羟苯甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸、柠檬酸或磷酸及用以调整张力的物质，如氯化钠或葡萄糖。pH可用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠来调整。胃肠外用制剂可封入玻璃或塑料制的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液剂(在水溶性情况下)或分散剂和供临时制备无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL(BASF；Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲液(PBS)。在所有情况下，组合物必须无菌，且流动性应达到容易可注射的程度。其在制造和贮藏条件下必须稳定，并且必须在防止微生物如细菌和真菌的污染作用下保存。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可例如通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散的情况下保持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂，保持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收，可通过在组合物中包括能延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶来引起。可用于稳定本发明组合物的药用赋形剂和添加剂包括但不限于多肽、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二、三、四和寡糖；衍生糖如醛醇、醛糖酸、酯化糖等；和多糖或糖聚合物)，它们可单独或组合存在，独自或组合在一起占1～99.99％(重量或体积)。示例性但非限制性的多肽赋形剂包括血清清蛋白如人血清清蛋白(HSA)、重组人清蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。还能以缓冲能力起作用的代表性氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬甜素等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。
无菌可注射溶液剂可通过下述制备：将活性化合物(例如多肽或抗体)以所需的量与一种上文列举的成分或其组合，按需要掺入到适当的溶剂中，然后过滤除菌。通常，分散剂通过下述制备：将活性化合物掺入到含有基本分散介质的无菌载体中，然后掺入所需的选自上文列举成分的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这种干燥法从其预先无菌过滤的溶液中得到所述活性成分加上任何另外所需成分的粉末。这种无菌溶液的非限制性实例和制备方法是本领域众所周知的，例如但不限于Gennaro(编辑)，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co.(Easton，PA)1990。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可封入明胶胶囊中或压制成片剂。出于口服治疗给药的目的，活性化合物可与赋形剂一起掺入，并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。口服组合物也可用流体载体制备用作漱口药，其中流体载体中的化合物施用在口部，并漱、并吐出或咽下。
药物相容性粘合剂和/或辅剂材料可作为组合物的一部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任何以下成分或性质相似的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶态二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或矫味剂如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙子香料。
对于吸入给药，化合物以从压力容器或含有合适的抛射剂，例如气体如二氧化碳的分配器或者喷雾器喷出的喷雾颗粒形式递送。或者，配制成颗粒的组合物可通过美国专利第4530464号、第4533082号、第5838350号、第6113001号、第6514496号、第5518179号、第5152456号、第5261601号和第4605167号中所教导的静电、机械手段，包括振动或超声手段来分散。
全身给药也可通过透黏膜或透皮手段来进行。对于透黏膜或透皮给药，在组合物中使用适于透过屏障的渗透剂。此类渗透剂是本领域通常所知的，并且包括，例如对于透黏膜给药包括去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。透黏膜给药可通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂来实现。对于透皮给药来说，如本领域通常所知，将活性化合物配制成软膏剂、药膏、凝胶剂或乳膏剂。
化合物也可制备成供直肠递药的栓剂(例如用常规的栓剂基料如可可脂和其它甘油酯)或保留灌肠剂的形式。
在一个实施方案中，活性化合物与保护化合物免受身体快速消除的载体一起制备，如制备成控释制剂，包括植入物和微胶囊化递送系统。也可使用生物可降解、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。脂质体悬浮液(包括其中或其上渗入有单克隆抗体的脂质体)也可用作药物可接受的载体。特别优选的组合物和方法在美国专利第5,891,468号和第6,316,024号中教导。
为使给药容易和剂量均匀，以剂量单位形式配制口服或胃肠外用组合物特别有利。本文所用的剂量单位形式指物理上分离的单位，其作为单元剂量而适用于待治疗患者；每个单位含有经计算能产生所需治疗作用的预定量活性化合物及与其组合的所需药物载体。本发明的剂量单位形式的规格受支配于和直接取决于活性化合物的独特特性和所要实现的特定治疗作用，及将这种活性化合物配成用于治疗患者个体的技术所固有的限制。
对于抗体，优选的剂量是约0.1mg/kg～100mg/kg体重(通常约10mg/kg～20mg/kg)。如果抗体要在大脑中起作用，约50mg/kg～100mg/kg的剂量通常是适当的。一般来说，部分人抗体和完全人抗体在人体中的半衰期比其它抗体要长。因此，往往有可能使用较低的剂量和较低的给药频率。可使用修饰如脂质化，使抗体稳定化并增强摄入和阻止渗透(例如到大脑中)。Cruikshank等((1997)J.Acquired ImmuneDeficiency Syndromes and Human Retrovirology 14：193)描述了抗体的脂质化方法。
可将CXCL13拮抗剂核酸分子插入到载体中并用作基因治疗载体。基因治疗载体可通过例如静脉注射、局部给药(美国专利第5,328,470号)或通过立体定向注射(参见例如Chen等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3054-3057)递送给患者。基因治疗载体的药物制剂可包括可接受稀释剂中的基因治疗载体，或者可包含其中嵌入基因递送介质的稀释基质。或者，在完全基因递送载体可从重组细胞，例如反转录病毒载体，完整产生的情况下，所述药物制剂可包括一个或多个产生基因递送系统的细胞。
药物组合物可随给予说明一起放在容器、包装或分配器中。
药物基因组学
按本文描述的筛选测定法鉴定的，对CXCL13多肽的活性或表达具有刺激性或抑制性作用的物质或调节剂，可给予患者个体以(预防性或治疗性)治疗与多肽的异常活性有关的疾病。可以考虑患者个体的药物基因组学(即研究个体的基因型和该个体对外来化合物或药物的反应之间的关系的学科)，以协助这种治疗。治疗药物代谢上的差异，会通过改变药理学活性药物的剂量和血液浓度之间的关系导致严重毒性或治疗失败。因此，个体的药物基因组学使得可以基于对个体基因型的考虑来选择有效物质(例如药物)进行预防性或治疗性治疗。这种药物基因组学还可用来确定适当的剂量和治疗方案。因此，可确定个体中CXCL13多肽的活性、CXCL13核酸的表达或CXCL13基因的突变含量，从而选择适当的物质对个体进行治疗性或预防性治疗。
药物基因组学研究因药物在患者中分布改变或作用异常而对药物相应出现的临床上显著的遗传变异。参见例如Linder(1997)Clin.Chem.43(2)：254-266。一般来说，可区分出两种类型的药物基因组学情况。被传递为改变药物作用于身体的方式的单因素的遗传情况称之为“改变的药物作用”。被传递为改变身体作用于药物的方式的单因素的遗传情况称之为“改变的药物代谢”。这些药物基因组学情况可作为稀有缺损或作为多态性出现。例如，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症是常见的遗传性酶不全病，该病的主要临床并发症是在摄取氧化性药物(抗疟疾药、磺胺药、止痛药、硝基呋喃药)和食用蚕豆后出现溶血。
作为示例性实施方案，药物代谢酶的活性是药物作用的强度和持续时间两者的主要决定因素。药物代谢酶(例如N-乙酰转移酶2(NAT2)和细胞色素P450酶CYP2D6和CYP2C19)的遗传多态性的发现，解释了为什么有些患者在服用标准和安全剂量的药物后，没有获得预期的药物作用或者显示出过大的药物反应和严重的毒性。这些多态性在人群中以两种表现型表达：强代谢者(EM)和弱代谢者(PM)。PM在不同人群当中的流行程度不同。例如，编码CYP2D6的基因具有高度多态性，并已在PM中鉴定出几个突变，它们都导致功能性CYP2D6的缺乏。CYP2D6和CYP2C19的弱代谢者当接受标准剂量时，相当经常地会经历过大的药物反应和副作用。如果代谢物是活性治疗性部分，PM会没有治疗反应显示，这在由其CYP2D6形成的代谢物吗啡所介导的可待因镇痛作用得到证明。另一极端是所谓的超快代谢者，他们对标准剂量没有反应。最近，超快代谢的分子基础已被鉴定为归因于CYP2D6基因扩增。
因此，可确定个体中CXCL13多肽的活性、编码该多肽的核酸的表达或编码该多肽的基因的突变含量，从而选择适当的物质用于个体的治疗性或预防性治疗。此外，可使用药物基因组学研究来将编码药物代谢酶的多态等位基因的基因型分型应用于个体的药物反应性表现型的鉴定。当用所述多肽的活性或表达的调节剂(如用本文描述的示例性筛选测定法中的一种所鉴定的调节剂)治疗患者时，将该知识应用于剂量或药物选择可避免不利反应或治疗失败，从而增强治疗或预防功效。
治疗方法
本发明提供治疗患者的预防性或治疗性方法，所述患者有风险会患(或者易患)或已患与CXCL13多肽的异常表达或活性有关的疾病和/或其中涉及CXCL13多肽的疾病。
本发明提供使用至少一种CXCL13拮抗剂来调节或治疗本领域公知或本文描述的细胞、组织、器官、动物或患者中至少一种CXCL13相关疾病或病况的方法。CXCL13拮抗剂的组合物可在肺部疾病相关病况如哮喘、肺气肿、COPD和新生儿慢性肺病的治疗中得到治疗性应用。
本发明还提供调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中至少一种免疫相关疾病的方法，所述疾病包括但不限于至少以下疾病之一：类风湿性关节炎、青年期类风湿性关节炎、全身发作青年期类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊椎炎、胃溃疡、血清反应阴性关节病、骨关节炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、抗磷脂综合征、虹膜睫状体炎/色素层炎/视神经炎、特发性肺纤维变性、全身性脉管炎/多发性肉芽肿病、肉样瘤病、睾丸炎/输精管切除术逆转程序、变应性/特应性疾病、过敏性鼻炎、湿疹、变应性接触性皮炎、过敏性结膜炎、超敏性肺炎、移植、器官移植、排斥、移植物抗宿主病、全身炎症反应综合征、脓毒症综合征、革兰氏阳性脓毒症、革兰氏阴性脓毒症、培养物阴性脓毒症、真菌脓毒症、嗜中性白血球减少造成的发烧、尿脓毒症、脑膜炎球菌血症、创伤/出血、烧伤、电离辐射暴露、急性胰腺炎、成人呼吸窘迫综合征、类风湿性关节炎、酒精性肝炎、慢性炎性病理、肉样瘤病、Crohn病理学、镰状细胞性贫血、糖尿病、肾变病、特应性疾病、超敏反应、过敏性鼻炎、枯草热、全年性鼻炎、结膜炎、子宫内膜异位、荨麻疹、全身性过敏反应、皮炎、恶性贫血、溶血性疾病、血小板减少症、任何器官或组织的移植排斥、肾脏移植排斥、心脏移植排斥、肝脏移植排斥、胰腺移植排斥、肺移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、皮肤同种异体移植排斥、软骨移植排斥、骨移植排斥、小肠移植排斥、胚胎胸腺植入排斥、副甲状腺移植排斥、任何器官或组织的异种移植排斥、同种异体移植排斥、抗受体超敏反应、格雷夫斯氏病、雷诺氏病、B型胰岛素抗性糖尿病、重症肌无力、抗体介导的细胞毒性、III型超敏反应、系统性红斑狼疮、POEMS综合征(多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆γ球蛋白病和皮肤变化综合征)、抗磷脂综合征、天疱疮、硬皮病、混合性结缔组织病、特发性艾迪逊氏病、糖尿病、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、白癜风、脉管炎、心肌梗塞心切开术后综合征、IV型超敏反应、接触性皮炎、超敏性肺炎、同种异体移植排斥、细胞内微生物所致肉芽肿、药物敏感、代谢性/原发性、血色素沉着症、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、糖尿病性视网膜病、桥本甲状腺炎、骨质疏松症、下丘脑-垂体-肾上腺轴评估、原发性胆汁性肝硬变、甲状腺炎、脑脊髓炎、恶病质、囊性纤维变性、家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生病、皮肤病症、牛皮癣、秃头症、肾病综合征、肾炎、肾小球肾炎、急性肾衰竭、血液透析、尿毒症、毒性、子痫前期、okt3疗法、抗cd3疗法、细胞因子疗法、化学疗法、放射疗法(例如包括但不限于虚弱、贫血、恶病质等)、慢性水杨酸中毒等。参见例如Merck Manual，第12-17版，Merck & Company，Rahway，NJ(1972，1977，1982，1987，1992，1999)，Pharmacotherapy Handbook，Wells等(编辑)，第二版，Appleton and Lange，Stamford，Conn.(1998，2000)，各自全部内容通过引用并入本文。
本发明还提供调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中至少一种恶性疾病的方法，所述疾病包括但不限于至少以下疾病之一：白血病、急性白血病、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、B细胞、T细胞或FAB ALL、急性髓细胞性白血病(AML)、急性前髓细胞性白血病(APL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞性白血病、脊髓发育不良综合征(MDS)、淋巴瘤、何杰金氏病、恶性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波济氏肉瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增多病、瘤外综合征/恶性肿瘤的多钙血、实体瘤、腺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、血管瘤、转移性疾病、癌症相关骨吸收、癌症相关骨痛等。
以CXCL13多肽的异常表达或活性为特征的疾病在本公开文件的其它地方有进一步的描述。
1.预防方法
在一个方面，本发明提供通过给予患者可调节多肽的表达或至少一种活性的物质，来在该患者中至少基本预防与CXCL13多肽的异常表达或活性有关的疾病或病况的方法。有风险会患由CXCL13多肽的异常表达或活性所引起或促成疾病的患者，可通过例如本文描述的任何诊断性或预后性测定法或者它们的组合来鉴定。预防性物质的给予可在所述异常特有的症状显示之前进行，使得疾病或病患得到预防，或者其进程受到延迟。取决于异常的类型，例如可使用激动剂或拮抗剂来治疗患者。适当的物质可根据本文描述的筛选测定法来确定。
2.治疗方法
本发明的另一个方面涉及为治疗目的而调节CXCL13多肽的表达或活性的方法。本发明的调节方法涉及使细胞与调节所述多肽的一种或多种活性的物质相接触。调节活性的物质可以是本文描述的物质，如核酸或蛋白质、所述多肽的天然关联配体、肽、模拟肽，或者其它小分子。在一个实施方案中，所述物质刺激所述多肽的一种或多种生物活性。在另一个实施方案中，所述物质抑制CXCL13多肽的一种或多种生物活性。这种抑制剂的实例包括反义核酸分子和抗体及本文描述的其它方法。这些调节方法可在体外进行(例如通过将细胞与物质一起培养)，或者在体内进行(例如通过将物质给予患者)。这样，本发明提供治疗患有疾病或病患的个体的方法，所述疾病或病患以CXCL13多肽的异常表达或活性为特征。在一个实施方案中，所述方法涉及给予可调节(例如上调或下调)表达或活性的物质(例如通过本文描述的筛选测定法鉴定的物质)或物质组合物。在活性或表达异常地高或受到上调的情况下，和/或降低活性很可能具有有利作用的情况下，抑制活性是合乎需要的。
本发明的方法包括给予需要这种调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者有效量的组合物或药物组合物，其包含至少一种CXCL13拮抗剂或指定部分或变体。这种方法还可任选包括联合给药或联合治疗以治疗这种免疫疾病，其中给予所述至少一种CXCL13拮抗剂、其指定部分或变体，还包括在给予选自以下的至少一种药物之前、同时和/或之后：格拉默乙酸盐(如Copaxone)、环磷酰胺、硫唑嘌呤、糖皮质激素、甲氨蝶呤、紫杉醇、2-氯脱氧腺苷、米托蒽醌、IL-10、TGBb、CD4、CD52、antegren、CD11、CD18、TNF α、IL-1、IL-2和/或CD4抗体或抗体受体融合、α干扰素、免疫球蛋白、Lismide(RequinimaxTM)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、elprodil、吡非尼酮、口服髓磷脂或者作用于至少一个以下一种或多种的化合物：髓磷脂破坏性自身免疫抑制、免疫调节、激活、增值、T细胞的迁移和/或细胞功能抑制、抑制T细胞受体/肽/MHC-II相互作用、诱导T细胞无反应性、自反应T细胞消除、跨血脑屏障运输减少、促前炎性(Th1)和免疫调节(Th2)细胞因子平衡的变化、基质金属蛋白酶抑制剂的抑制、神经蛋白、减缓神经胶质增生、促进髓鞘再生)、TNF拮抗剂(例如但不限于TNF Ig衍生蛋白或片断、可溶性TNF受体或片断、其融合蛋白或小分子TNF拮抗剂)、抗风湿剂、肌肉松弛药、麻醉药、非甾体抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉药、神经肌肉阻滞剂、抗菌剂(例如氨基糖苷类、抗真菌剂、抗寄生物剂、抗病毒类、青霉烯类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、大环内酯类、青霉素类、硫胺类、四环素、另一抗菌剂)、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、同化类固醇、矿物质、营养剂、甲状腺剂、维生素、钙有关的激素、止泻剂、镇咳剂、止吐剂、抗溃疡药、缓泻剂、抗凝血剂、促红细胞生成素(例如epoetin α)、非格司亭(例如G-CSF、优保津)、沙格司亭(GM-CSF、Leukine)、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂(例如basiliximab、环孢霉素、单抗)、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调节剂、扩瞳药、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢药、有丝分裂抑制剂、放射药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑剂、安眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐、他克林、哮喘药、β激动剂、吸入类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸钠、肾上腺素或类似物、阿法链道酶α(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。合适的剂量是本领域中众所周知的。参见例如Wells等(编辑)，Pharmacotherapy Handbook，第2版，Appleton andLange，Stamford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon PocketPharmacopoeia 2000，Deluxe Edition，Tarascon Publishing，Loma Linda，CA(2000)，其每篇参考文献全部内容通过引用并入本文。
适合本发明组合物、联合治疗、联合给药、装置和/或方法(还包含至少一种本发明的抗体、其特定部分和变体)的TNF拮抗剂包括但不限于抗-TNF Ig衍生蛋白、其抗原结合片断和特异性结合TNF的受体分子；阻止和/或抑制TNF合成、TNF释放或其作用于靶细胞的化合物，如沙立度胺、替尼达普，磷酸二酯酶抑制剂(如己酮可可豆碱和咯利普兰)，A2b腺苷受体激动剂和A2b腺苷受体增强剂；阻止和/抑制TNF受体信号转导的化合物，如有丝分裂原激活蛋白(MAP)激酶抑制剂；阻断和/抑制膜TNF裂解的化合物，如金属蛋白酶抑制剂；阻断和/抑制TNF活性的化合物，如血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(如卡托普利)；和阻断和/或抑制TNF产生和/或合成的化合物，如MAP激酶抑制剂。
本文所用的“肿瘤坏死因子Ig衍生蛋白”“TNF Ig衍生蛋白”“TNF α Ig衍生蛋白”或片断等，在体外、原位和/或优选在体内减少、阻断、抑制、消除或干扰TNF α的活性。例如，合适的本发明TNF人Ig衍生蛋白可结合TNF α，并且包括抗-TNF Ig衍生蛋白、其抗原结合片断和与TNF α特异性结合的特定突变体或结构域。合适的TNF抗体或片断还可减少、阻断、消除、干扰、阻止和/或抑制TNF RNA、DNA或蛋白的合成、TNF释放、TNF受体信号转导、膜TNF裂解、TNF活性、TNF产生和/或合成。
嵌合Ig衍生蛋白cA2由高亲和力中和小鼠抗人TNF α IgG1 Ig衍生蛋白的抗原结合可变区、指定的A2、和人IgG1的恒定区、κ免疫球蛋白组成。人IgG1 Fc区提高同种异体Ig衍生蛋白效应子功能，增加循环血清半衰期并且降低Ig衍生蛋白的免疫原性。嵌合Ig衍生蛋白cA2的亲合力和抗原表位特异性衍生于鼠类Ig衍生蛋白A2的可变区。在一个具体实施方案中，优选的编码鼠类Ig衍生蛋白A2可变区的核酸来源于A2杂交瘤细胞系。
嵌合A2(cA2)呈剂量依赖方式中和天然和重组人TNF α两者的细胞毒作用。从嵌合Ig衍生蛋白cA2和重组人TNF α的结合测定，计算嵌合Ig衍生蛋白cA2的亲和常数为1.04 x 1010M-1。通过竞争抑制确定单克隆Ig衍生蛋白特异性和亲和力的优选方法可在以下中发现：Harlow，等，Ig derived proteins：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1988；Colligan等(编辑)，Current Protocols in Immunology，Greene Publishing Assoc.和WileyInterscience，New York，(1992-2003)；Kozbor等，Immuno l.Today，4：72-79(1983)；Ausubel等(编辑)，Current Protocols in MolecularBiology，Wiley Interscience，New York(1987-2003)；和Muller，Meth.Enzymol.，92：589-601(1983)，其参考文献全部内容通过引用并入本文。
在一个具体实施方案中，鼠类单克隆Ig衍生蛋白A2由指定为c134A的细胞系产生。嵌合Ig衍生蛋白cA2由指定为c168A的细胞系产生。
可用于本发明的单克隆抗-TNF Ig衍生蛋白的另一个实例在本领域有描述(参见例如美国专利第5,231,024号；
Figure A200780020598D0047163020QIETU
A.等，Cytokine2(3)：162-169(1990)；美国专利申请第07/943,852号(1992年9月11日提交)；Rathjen等，国际公开号WO 91/02078(1991年2月21日公开)；Rubin等，欧洲专利公开号0 218 868(1987年4月22日公开)；Yone等，欧洲专利公开号0 288 088(1988年10月26日)；Liang等，Biochem.Biophys.Res.Comm.137：847-854(1986)；Meager等，Hybridoma6：305-311(1987)；Fendly等，Hybridoma 6：359-369(1987)；Bringman等，Hybridoma 6：489-507(1987)；和Hirai等，J.Immunol.Meth.96：57-62(1987)，其参考文献全部内容通过引用并入本文)。
TNF受体分子
用于本发明的优选TNF受体分子是那些以高亲和力结合TNF α(参见例如Feldmann等，国际公开号WO 92/07076(1992年4月30日公开)；Schall等，Cell 61：361-370(1990)；和Loetscher等，Cell 61：351-359(1990)，其参考文献全部内容通过引用并入本文)，并且任选具有低免疫原性的受体分子。具体地，55kDa(p55 TNF-R)和75kDa(p75 TNF-R)TNF细胞表面受体用于本发明。这些受体的截短形式，包括受体的胞外结构域(ECD)或其功能部分(参见，例如Corcoran等，Eur.J.Biochem.223：831-840(1994))也用于本发明。已在尿和血清中检测出作为30kDa和40kDa TNF α抑制结合蛋白的TNF受体的截短形式，其包含ECD(Engelmann，H.等，J.Biol.Chem.265：1531-1536(1990))。用于本发明的方法和组合物的TNF受体分子的另外实例是TNF受体多聚体分子和TNF免疫受体融合分子及其衍生物和片断或部分。可用于本发明的TNF受体分子的特征是它们能够以优良的缓和症状且低毒长期治疗患者。低免疫原性和/或高亲和力，以及其它未定义的性质，可能有助于达到治疗效果。
用于本发明的TNF受体多聚体分子包含两种或多种TNF受体的ECD的全部或功能部分，该TNF受体经一个或多个多肽连接体或其它非肽类连接体如聚乙二醇(PEG)连接。所述多聚体分子可进一步包含分泌蛋白的信号肽以指导多聚体分子的表达。这些多聚体分子及其制备方法在美国申请第08/437,533号中已有描述(1995年5月9日提交)，其内容全部内容通过引用并入本文。
用于方法和组合物的TNF免疫受体融合分子包含一种或多种免疫球蛋白分子的至少一部分和一种或多种TNF受体的全部或功能部分。这些免疫受体融合分子可装配为单体、或者异-或同-多聚体。所述免疫受体融合分子还可以是单价的或多价。此类TNF免疫受体融合分子的一个实例是TNF受体/IgG融合蛋白。TNF免疫受体融合分子及其制备方法在本领域中已有描述(Lesslauer等，Eur.J.Immunol.21：2883-2886(1991)；Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Peppel等，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991)；Kolls等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：215-219(1994)；Butler等，Cytokine 6(6)：616-623(1994)；Baker等，Eur.J.Immunol.24：2040-2048(1994)；Beutler等，美国专利第5,447,851号；和美国专利第08/442,133号(1995年5月16日提交)，其每篇参考文献全部内容通过引用并入本文)。制备免疫受体融合分子的方法还可发现于Capon等，美国专利第5,116,964号；Capon等的美国专利第5,225,538号；和Capon等，Nature 337：525-531(1989)，其参考文献全部内容通过引用并入本文。
TNF受体分子的功能等价物(equivalent)、衍生物、片断或区是指TNF受体分子的部分，或编码TNF受体分子的TNF受体分子序列的部分，其具有足够的大小和序列，在功能上类似用于本发明的TNF受体分子(例如以高亲和力结合TNF α并且具有低免疫原性)。TNF受体分子的功能等价物还包括修饰的TNF受体分子，其在功能上类似用于本发明的TNF受体分子(例如以高亲和力结合TNF α并且具有低免疫原性)。例如，TNF受体分子的功能等价物可包含＂SILENT＂密码子或者一个或多个氨基酸取代、删除或添加(例如一个酸性氨基酸取代另一个酸性氨基酸；或一个编码相同或不同疏水性氨基酸的密码子取代另一个编码疏水性氨基酸的密码子)。参见Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience，NewYork(1987-2003)。
已对本发明作了一般描述，现将在以下实施例中进一步公开本发明的实施方案，这些实施例不应被解释为限制权利要求书的范围。
实施例1
患病肺组织中提高的CXCL13 mRNA转录水平
与对照C57BL6小鼠相比，未处理的SP-C/TNF α小鼠和用TNF α特异性mAb处理的SP-C/TNF-α小鼠的肺组织中的编码所述CXCL13蛋白质的mRNA转录水平升高(图1)。SP-C/TNF-α小鼠是源自C57BL6鼠类株的转基因小鼠，其在肺组织中持续过度表达鼠TNF α。TNF α在肺(SP-C/TNF转基因小鼠)中的过度表达引起许多类似于在COPD患者中发现的那些病理改变，包括肺部炎症、肺气肿、肺纤维化[16]和异位淋巴滤泡形成。SP-C/TNF α小鼠是用于此类肺部疾病如肺部炎症、肺气肿、肺纤维化和阻塞性肺部疾病(COPD)的模型。肺中的异位淋巴滤泡形成是与每一个这些肺部疾病相关的病理。肺中的异位淋巴滤泡可通过B细胞向肺和其他肺部组织浸润形成。图1中的结果表明增加SP-C/TNF α小鼠肺组织中的CXCL13蛋白水平有助于形成肺中异位淋巴滤泡并且启动这些动物中相关肺部疾病。
在本实验中，12周龄的对照C57BL6小鼠和未处理的SP-C/TNFα小鼠每周一和周五，持续6周接受腹膜内注射200μLPBS。接受0.5mgTNFα特异性cV1q mAb的SP-C/TNFα小鼠每周一和周五，持续6周腹膜内注射200μL PBS。cV1q mAb是单克隆大鼠IgG1同种型单克隆抗体，其结合鼠TNF α。利用标准方法制备cV1q mAb。注射开始后6周，遵从动物保护惯例和使用规范处死小鼠。
从处死的动物中移除肺，匀浆，并采用标准方法提取和分离mRNA。还采用标准方法对CXCL13mRNAs和GAPDH mRNAs进行特异性RT-PCR。然后采用标准方法量化CXCL13和GAPDH mRNA水平并且CXCL13mRNA水平标化至GAPDH管家基因mRNA水平。呈现的数据表示标化的CXCL13mRNA水平在5个不同的小鼠中的+/-标准偏差(图1)。
实施例2
对TNF α和CXCL13具有特异性的单克隆抗体联合治疗 减轻肺疾病症状
在SP-C/TNF α小鼠中对TNF α和CXCL13具有特异性的mAbs联合给药减轻肺疾病相关症状(图2)。与未处理的对照动物相比，对TNF α和CXCL13具有特异性的mAbs联合治疗的SP-C/TNF α小鼠中异位滤泡大小明显减小(图2)。用抗-TNFα mAb处理8周的SP-C/TNF α转基因小鼠中，中性粒细胞气道浸润明显减少；然而，治疗对异位淋巴滤泡几乎没有影响。这个发现表明，异位淋巴滤泡一旦形成，则以TNF α独立形式维持其体内平衡。
在本实验中，12周龄的对照SP-C/TNF α小鼠每周一和周五，持续6周接受腹膜内注射。对照动物仅接受200μL PBS注射。抗-TNF α处理的动物接受200μL PBS中0.5mg TNFα特异性cV1q mAb。抗-CXCL13处理的动物接受200μL PBS中0.5mg CXCL13特异性MAB4701 mAb。联合治疗动物接受200μL PBS中0.5mg TNF α特异性cV1q mAb和0.5mg CXCL13特异性MAB4701mAb。MAB4701是单克隆大鼠IgG1同种型单克隆抗体，其结合鼠CXCL13。MAB4701mAb采用标准方法产生并且是可购买的(R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN)。注射开始后6周，遵从动物保护惯例和使用规范处死小鼠。从处死动物中移除肺部，解剖，制备切片，并且采用标准方法进行组织病理学分析以测定异位滤泡大小和形成的数量。使用三相成像系统(Phase 3 Imaging System)(Glen Mills，PA)和相关分析软件进行显微镜检查并测量每个老鼠每个组织切片10～20个滤泡的大小。呈现的数据(图2)表示在来自各治疗组的5个不同的小鼠中的分析结果的平均值+/-标准偏差。
假设上述的结果可表明单独抗-CXCL13治疗可用于治疗呼吸相关疾病。由于鼠类模型已经增加了TNF α的表达，与抗-CXCL13治疗一起的TNF α的抑制可能必须显示这个模型中疾病状态的改善。对于其中TNF α不是过度表达的模型来说，抑制CXCL13就可满足改善疾病状态。此外，在上述的模型中，TNF的表达通过转基因动物并且独立于疾病进展。在病理学情况下，例如，患者治疗中，TNF表达最可能将减少炎症的减少，所以如果CXCL13拮抗剂可减少TNF α产生细胞的移动和累积，那么它单独可是治疗有效的。这已通过体内疾病模型测试。
实施例3
对TNF-α和CXCL13具有特异性的单克隆抗体联合治疗 减少B-细胞向肺组织浸润
对TNF α和CXCL13具有特异性的mAbs联合给药减少B-细胞向肺组织的浸润(图3、4、5和6)。分别由CD22.2、CD19、CD45R/B220和CD4 B-细胞标记物检测，用流式细胞术检测B-细胞浸润。与未处理的对照动物相比，采用对TNF α和CXCL13具有特异性的mAbs联合治疗的SP-C/TNFα小鼠中B-细胞在肺组织中的浸润明显减少(图3、4、5和6)。
如在上述实施例2中的描述来制备动物并进行处理。注射开始后6周，遵从动物保护惯例和使用规范处死小鼠。然后切碎肺组织并在37℃用胶原酶VII(1500IU/ml)消化45分钟以释放个体细胞。然后采用标准方法用标记的，可购买的CD22.2(图3)、CD19(图4)、CD45R/B220(图5)和CD4(图6)特异性mAbs培养制备的细胞。制备的细胞群中的B-细胞携带CD22.2、CD19、CD45R/B220或CD4标记物并且在用可购买的CD22.2、CD19、CD45R/B220或CD4mAbs培养后dectably标记。这种标记对于采用流式细胞术识别B-细胞是基础性的。采用标准方法在细胞群上进行流式细胞术测定，然后采用标准方法测定各标记物标记的B-细胞在细胞群上存在的百分率。呈现的数据(图3、4、5和6)表示制备的各治疗组的5个不同小鼠肺细胞的测定结果的平均值+/-标准偏差。
本文描述的CXCL13、CXCR5和TNF α的序列如下列：
表3
 
序号 核苷酸/蛋白质 名称/种属
1 核苷酸 鼠CXCL13
2 蛋白质 鼠CXCL13
3 核苷酸 人CXCL13
4 蛋白质 人CXCL13
5 核苷酸 鼠TNF α
6 蛋白质 鼠TNF α
7 核苷酸 人TNF α
8 蛋白质 人TNF α
9 核苷酸 人CXCR-5
10 蛋白质 人CXCR-5
11 核苷酸 鼠CXCR-5
12 蛋白质 鼠CXCR-5
实施例4
对TNF α和CXCL13具有特异性的单克隆抗体联合给予 治疗与系统性红斑狼疮相关的肾病理学
对CXCL-13和TNF α具有特异性的mAbs联合给予治疗鼠类模型中与系统性红斑狼疮(SLE)相关的肾脏病理学。肾小球肾炎是内部肾脏结构，称为肾小球的炎症并且是SLE的印记。蛋白尿是血清蛋白向尿液中的过度分泌并且是SLE相关的肾小球肾炎导致的肾脏疾病的评估方法。肾脏组织中组织学改变，如动脉周围淋巴细胞浸润病灶的形成，是另一个SLE相关的肾小球肾炎导致的肾脏疾病的印记。
对CXCL-13和TNF α具有特异性的mAbs联合给予减少呈现SLE症状的NZB/W F1小鼠尿液中肾小球肾炎相关的蛋白水平至低于单独接受PBS介质的未处理对照NZB/W F1小鼠的水平(图7)。
此外，对CXCL-13和TNF α具有特异性的mAbs联合给予减少呈现SLE症状的NZB/W F1小鼠中SLE相关肾脏疾病的等级评分严重度至低于单独接受PBS介质的未处理对照NZB/WF1小鼠的水平(图8)。采用等级评分系统测定NZB/W F1小鼠中SLE相关肾疾病的严重度。分值基于由肾脏组织的组织学检查鉴定的动脉周围淋巴细胞浸润病灶的数量和各治疗组NZB/W F1小鼠的肾脏组织中肾小球肾炎相关蛋白水平的严重度(图8)。
从Jackson Labs(Bar Harbor，ME)得到12-周龄NZB/W F1小鼠用于这些试验。当老时，NZB/W F1小鼠呈现系统性红斑狼疮(SLE)-样症状并且可接受为SLE鼠类模型。在0天，将研究动物随机分成对照组或治疗组(n＝15/组)。动物从18周龄到38周龄每周给予腹腔内注入PBS介质(对照动物)、抗-CXCL13 mAb(在PBS中，1mg/鼠)、抗-TNF α mAb(在PBS中，1mg/鼠)或抗-CXCL13 mAb(在PBS中，1mg/鼠)和抗-TNFα mAb(在PBS中，1mg/鼠)两者。抗-CXCL13 mAb是中和的鼠抗-CXCL13 mAb(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)。抗-TNF-α mAb是chimarized大鼠抗-TNF-α mAb，来自Centocor，Inc.，其采用标准方法产生。每周检查动物。经由自由捕捉，定期采集尿样并在-80℃保存。在研究结束时处死动物并在进一步分析前将得到的肾脏放入适合的储存缓冲液中。采用规定的动物保护惯例和使用规范照顾、处理和处死动物。
采用标准方法和Ace Analyzer测定采集的尿样中存在的总蛋白和肌酸(α Wasserman，West Caldwell，NJ)。在100μl未稀释的尿样中测定尿样总蛋白，并且在100μl 1:10去离子蒸馏水稀释的尿样中测定肌酐。然后用这些值来计算得到尿总蛋白与肌酸的比值。尿总蛋白/肌酐比用平均值加或减标准误表示并且采用双尾标准t检验方差分析检测样本之间的显著的统计学差异，p值<0.05。
当动物38周龄时，将得到的肾脏进行组织学分析。得到的肾脏的立即浸入0.7％过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛(PLP)缓冲液中，该缓冲液由0.1M磷酸盐缓冲液、0.7％多聚甲醛、75mM L赖氨酸和10mM NaIO4组成。用PLP缓冲液固定过夜后将肾包埋在石蜡块中。使用标准方法制备7μM切片和苏木素伊红染色。在盲法方式下检查样本并对SLE相关肾脏疾病严重度评分。分值基于由肾脏组织的组织学检查鉴定的动脉周围淋巴细胞浸润病灶的数量和各治疗组NZB/W F1小鼠的肾脏组织中肾小球肾炎相关蛋白水平的严重度。用Dunn校正进行等级分析的Kruskal-Wallis方差分析来多重比较并且用p值<0.05鉴定治疗组之间的差异达到可接受的统计学显著差异。
虽然上文就参考的某些具体实施方案对本发明做了说明和描述，不过并不意在使本发明局限于所展示的细节内容。更确切地，本发明涉及本文所公开的CXCL13拮抗剂多肽、多核苷酸、抗体、器械和试剂盒及其用途，以及控制CXCL13水平，任选与控制TNF-α水平一起的方法，并且按所述细节内容可作出各种修改方案，这些修改方案在权力要求书的范围和等同权利要求范围之内，并不偏离本发明的精神。
序列表
<110>CENTOCOR，INC.
<120>CXCL13拮抗剂及其用于治疗炎性疾病的用途
<130>CEN5134PCT
<140>TO BE ASSIGNED
<141>2007-04-20
<150>60/794,018
<151>2006-04-21
<150>60/909,128
<151>2007-03-30
<160>12
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>327
<212>DNA
<213>小鼠
<400>1
Figure A200780020598D00551
<210>2
<211>109
<212>PRT
<213>小鼠
<400>2
Figure A200780020598D00552
Figure A200780020598D00561
<210>3
<211>327
<212>DNA
<213>智人
<400>3
Figure A200780020598D00562
<210>4
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Figure A200780020598D00563
Figure A200780020598D00571
<210>5
<211>705
<212>DNA
<213>小鼠
<400>5
<210>6
<211>234
<212>PRT
<213>小鼠
<400>6
Figure A200780020598D00573
Figure A200780020598D00581
<210>7
<211>699
<212>DNA
<213>智人
<400>7
Figure A200780020598D00582
<210>8
<211>233
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Figure A200780020598D00583
Figure A200780020598D00591
<210>9
<211>2824
<212>DNA
<213>智人
<400>9
Figure A200780020598D00592
Figure A200780020598D00601
<210>10
<211>372
<212>PRT
<213>智人
<400>10
Figure A200780020598D00611
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<210>11
<211>2636
<212>DNA
<213>小鼠
<400>11
Figure A200780020598D00622
Figure A200780020598D00631
<210>12
<211>374
<212>PRT
<213>小鼠
<400>12
Figure A200780020598D00632
Figure A200780020598D00641

Claims (34)

1.一种治疗细胞、组织、器官或动物中的CXCL13活性相关疾病的方法，所述方法包括：
给予所述细胞、组织、器官或动物CXCL13拮抗剂，其量有效抑制所述细胞、组织、器官或动物中的所述CXCL13活性；并且
给予所述细胞、组织、器官或动物TNFα拮抗剂，其量有效抑制所述细胞、组织、器官或动物中的TNFα活性。
2.权利要求1的方法，其中所述CXCL13拮抗剂是CXCL13结合单克隆抗体或其片断并且所述TNFα拮抗剂是TNFα结合单克隆抗体或其片断。
3.权利要求2的方法，其中所述抗体片断是Fab、Fab′或F(ab′)2片断或其衍生物。
4.权利要求2的方法，其中所述动物是哺乳动物。
5.权利要求4的方法，其中至少一个单克隆抗体或片断通过至少一种选自以下的方式给予：胃肠外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、侧脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨骼内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊髓内、滑膜内、胸廓内、子宫内、膀胱内、伤口内、推注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内和透皮。
6.权利要求5的方法，其中至少一个单克隆抗体或片断以约0.05mg/kg～约30.0mg/kg所述哺乳动物体重的量给予。
7.权利要求5的方法，其中所述哺乳动物是人患者。
8.权利要求5的方法，其中至少一个单克隆抗体或片断腹腔内给予。
9.权利要求5的方法，其中至少一个单克隆抗体或片断以推注剂量给予，然后输注所述抗体。
10.权利要求1的方法，其中所述CXCL13活性相关疾病是炎性疾病。
11.权利要求1的方法，其中所述CXCL13活性相关疾病是肺部相关疾病。
12.权利要求1的方法，其中所述CXCL13活性相关疾病选自哮喘、肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺部炎症、肺纤维化和异位淋巴滤泡形成。
13.权利要求1的方法，其中所述CXCL13拮抗剂或TNFα拮抗剂选自多核苷酸和多肽。
14.权利要求1的方法，其中所述CXCL13拮抗剂或TNFα拮抗剂选自siRNA、shRNA、反义、核酶和DNA酶分子。
15.一种治疗细胞、组织、器官或动物中肺部相关疾病的方法，所述方法包括给予所述细胞、组织、器官或动物CXCL13拮抗剂，其量有效抑制所述细胞、组织、器官或动物中的所述CXCL13活性。
16.权利要求15的方法，其中所述CXCL13拮抗剂是CXCL13结合单克隆抗体或其片断。
17.权利要求16的方法，其中所述CXCL13单克隆抗体或片断通过至少一种选自以下的方式给予：胃肠外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、侧脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨骼内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊髓内、滑膜内、胸廓内、子宫内、膀胱内、伤口内、推注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内和透皮。
18.权利要求17的方法，其中所述CXCL13单克隆抗体或片断以约0.05mg/kg～约30.0mg/kg所述哺乳动物体重的量给予。
19.权利要求17的方法，其中所述CXCL13单克隆抗体或片断腹腔内给予。
20.权利要求17的方法，其中所述CXCL13单克隆抗体或片断以推注剂量给予，然后输注所述抗体。
21.权利要求17的方法，其中所述肺部相关疾病选自哮喘、肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺部炎症、肺纤维化和异位淋巴滤泡形成。
22.权利要求15的方法，其中所述CXCL13拮抗剂选自多核苷酸和多肽。
23.权利要求15的方法，其中所述CXCL13拮抗剂选自siRNA、shRNA、反义、核酶和DNA酶分子。
24.一种治疗动物系统性红斑狼疮的方法，该方法包括：
a)提供动物CXCL-13拮抗剂，并且
b)提供动物TNFα拮抗剂；
其中各拮抗剂以引起在所述动物中系统性红斑狼疮的症状减少的有效量提供。
25.权利要求24的方法，其中所述CXCL-13拮抗剂是CXCL-13结合抗体或CXCL-13结合抗体片断并且TNFα拮抗剂是TNFα结合抗体或TNFα结合抗体片断。
26.权利要求25的方法，其中所述动物是哺乳动物。
27.权利要求26的方法，其中所述哺乳动物是人。
28.权利要求25的方法，其中所述提供的各抗体或结合抗体片断的量为约0.05mg/kg～约50.0mg/kg所述动物体重。
29.权利要求28的方法，其中所述提供的各抗体或结合抗体片断的量为约25mg/kg动物体重～约40mg/kg所述动物体重。
30.权利要求24的方法，其中所述系统性红斑狼疮的症状是通过肾组织检查鉴定的动脉周围淋巴细胞浸润病灶的数量。
31.权利要求24的方法，其中所述系统性红斑狼疮的症状是尿总蛋白与尿总肌酐的比值。
32.权利要求30或权利要求31的方法，其中所述CXCL-13拮抗剂是CXCL-13结合抗体或CXCL-13结合抗体片断并且TNFα拮抗剂是TNFα结合抗体或TNFα结合抗体片断。
33.权利要求30或31的方法，其中所述CXCL-13拮抗剂是CXCL-13结合抗体或CXCL-13结合抗体片断并且TNFα拮抗剂是TNFα结合抗体英夫利昔单抗或其片断。
34.本文描述的任何发明。
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