CN104428316A

CN104428316A - 抗cd22抗体

Info

Publication number: CN104428316A
Application number: CN201380022320.0A
Authority: CN
Inventors: 杰·肖特; 格哈德·弗雷; 华文昌; 威廉·泊伊尔
Original assignee: Bioatla Inc
Current assignee: Bioatla Inc
Priority date: 2012-04-26
Filing date: 2013-04-26
Publication date: 2015-03-18
Also published as: KR20150008080A; BR112014026744A8; CA2871764A1; MX361533B; AU2013251482B2; AU2013251482A1; US20180086843A1; EP2841459A1; EP2841459A4; HK1207653A1; RU2014147452A; US20150086562A1; AU2017268687A1; US9856323B2; BR112014026744A2; JP2015516984A; MX2014012977A; WO2013163519A1

Abstract

本发明公开了抗CD22抗体、载体、宿主细胞、转基因动物或植物，其中所述抗体包括编码至少一种这类抗CD22抗体的分离的核酸，以及其制备和使用方法，包括药物组合物、方法和装置。

Description

抗CD22抗体

发明背景

发明领域

本发明涉及抗体，其包括对至少一种CD22蛋白或其片段有特异性的特定部分或变体，以及编码这类抗CD22抗体的核酸分子，互补核酸分子，载体，宿主细胞以及其制备和使用方法，包括药物制剂、施用和装置。

相关技术

CD22是唾液酸结合受体蛋白超家族(Siglec,sialic acid bindingreceptor protein superfamily)的一员，且其是通过发育B细胞生成的。在体内，B细胞代表CD22的主要来源。其他细胞如淋巴瘤、白血病和淋巴球B细胞也可产生CD22。CD22作为预后因子与非霍奇金淋巴瘤和急性与慢性淋巴细胞白血病的癌症进展有关。可通过淋巴结的生发中心中B细胞的分化进程来调控CD22的生成。

作为CD22配体的含唾液酸的胞外表面分子，可与体液免疫应答期间在发育B细胞上表达的CD22受体结合。CD22受体具有负责CD22配体结合的免疫球蛋白样重复序列。

CD22有至少两种主要的生物学功能，即CD22可与B细胞受体络合物(BCR)相互作用以刺激细胞信号传导，从而促进B细胞分化和免疫球蛋白的生成，并且其还可与BCR相互作用以抑制细胞信号传导、细胞生长和分化。鼠科单克隆抗CD22抗体的结合刺激CD22酪氨酸磷酸化并负向调节有丝分裂的信号传导(Carnahan et al.,Cancer Res September 1,2003 9；3982s)。

需要提供对CD22或其片段具有高亲和力的中和嵌合抗体或人抗体，以用于预防、治疗、改善或诊断与淋巴瘤、急性与慢性白血病和其他B细胞发育异常和B细胞依赖自体免疫性疾病相关的病症。

发明概述

如本文描述和实施的，结合现有技术，本发明提供了分离的人源化抗CD22抗体，其具有来自高亲和性VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014或VM1015抗CD22抗体的至少一个抗原结合区，以及抗CD22抗体组合物，这些抗CD22抗体的缀合物，与其相关的编码或互补核酸分子，载体，宿主细胞，组合物，制剂，装置，转基因动物，转基因植物以及其制备和使用方法。本发明的抗体以高亲和力特异性中和人CD22。

如本文所述，本发明提供了至少一种分离的抗CD22抗体。本发明的抗体包括VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014或VM1015的任一种，或包含来源于VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014或VM1015其中之一的重链或轻链或其配体结合部分的至少一个互补决定区(CDR)(如CDR1、CDR2或CDR3)的任何蛋白或肽分子，所述重链或轻链或其配体结合部分与可并入本发明抗体的重链或轻链恒定区、框架区或其任意部分结合。在一个实施方案中，本发明涉及包含轻链和重链的抗CD22抗体，每一链包含至少一部分人恒定区和至少一部分可变区，其来源于VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014或VM1015的一种或多种，每一种对人CD22都具有特异性，所述抗体以高亲和力结合至人CD22的抑制和/或中和表位。本发明还包括这类抗体的片段或衍生物，如抗体链的一个或多个部分，如重链恒定区、结合区、多元化(diversity)区或可变区，或轻链恒定区、结合区或可变区。

本发明可以包含来源于抗CD22抗体(该术语如文中定义)的至少一个互补决定区(CDR)(例如，重链或轻链可变区的CDR1、CDR2或CDR3)的至少一个特定部分，和/或至少一个恒定或可变框架区或其任何部分。如本文所述或现有技术已知，所述抗体氨基酸序列还可以任选地包含至少一个特定的取代、插入或缺失。

本发明优选的抗体包括VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015，以及其片段和区域。

在一个实施方案中，本发明提供了与人CD22结合的分离的抗体或抗体片段，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的重链可变区；具有氨基酸序列SEQ ID NO:17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32的轻链可变区；以及来源于一种或多种人抗体的恒定区。在一个方面，本发明提供了与人CD22结合的分离的抗体或抗体片段，其包含来源于VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015的一种或多种的可变区的重链和轻链互补决定区(CDR)，以及来源于一种或多种人抗体的恒定区。在另一方面，本发明提供了权利要求1或2所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段竞争性地抑制体内抗CD22鼠抗体对人CD22的结合。

本发明优选的抗体是结合人CD22且诱导CD22酪氨酸磷酸化和内化并负向调节B细胞生长和分化的那些。通过竞争性抑制测定单克隆抗体特异性和亲和力的优选方法可见于Harlow,et al.(Antibodies:ALaboratory Manual(实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory,Press，Cold Spring Harbor,N.Y.,1988)，在此其通过引用并入本申请。本发明的至少一种抗体结合至少一种对人CD22蛋白、亚基、片段、部分或其任意组合有特异性的特定表位，例如(Stein R,Belisle E,Hansen HJ,Goldenberg DM:Epitope specificityof the anti-(B cell lymphoma)monoclonal antibody,LL2.Cancer Immunol Immunother 1993,37:293-298.)所描述的。单克隆抗体LL2结合至CD22胞外域中的第三免疫球蛋白(Ig)重复序列，并且因其对CD22表达B细胞群和淋巴瘤与白血病细胞的调节作用而重要。该表位可包含至少一个抗体结合区，该表位优选由其至少一部分的至少1-5个氨基酸组成，诸如但不限于人CD22蛋白或其任意部分的至少一种功能性、胞外、可溶性、亲水性、外部或胞质结构域。

在一个方面，本发明提供了至少一种分离的哺乳动物抗CD22抗体，其包含来自VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015之一的至少一个可变区，以及为其编码的核酸序列。

在另一方面，本发明提供了至少一种分离的哺乳动物抗CD22抗体，其包含(i)来源于VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014或VM1015的所有重链互补决定区(CDR)氨基酸序列，以及为其编码的核酸序列；或(ii)来源于VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014或VM1015的所有轻链CDR氨基酸序列，以及为其编码的核酸序列。

在一个方面，本发明提供了至少一种分离的哺乳动物抗CD22抗体，其包含具有来源于VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015的氨基酸序列的至少一个重链或轻链CDR，以及为其编码的核酸序列。

在其他方面，本发明提供了至少一种分离的哺乳动物嵌合、人源化或CDR嫁接的抗CD22抗体，其包含至少一种人CDR，或不含人CDR，其中所述抗体特异性结合包含人CD22表位的至少1-3个氨基酸的至少一个表位。

至少一种抗体可任选进一步以至少10^-9M、优选至少10^-10M的亲和力(K_d)结合CD22，和/或实质上中和至少一种CD22蛋白的至少一种活性。在优选的实施方案中，该抗体以至少5×10^-10M、优选5×10^-11M、更优选5×10^-12M的亲和力(K_d)结合CD22且中和人CD22。

在一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码上述包含至少一种具体序列、其结构域、部分或变体的特定抗CD22抗体的多核苷酸，或与其互补，或与其杂交。本发明还提供了包含所述抗CD22抗体核酸分子的重组载体，含有此类核酸和/或重组载体的宿主细胞，以及生成和/或使用此类抗体核酸、载体和/或宿主细胞的方法。如此，本发明包含编码至少一种分离的哺乳动物抗CD22抗体的分离的核酸，包含该分离的核酸的分离的核酸载体；和/或包含该分离的核酸的原核或真核宿主细胞。该宿主细胞可任选地是选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、骨髓瘤、或淋巴瘤细胞、或其任何衍生物、永生化或转化细胞的至少一种。本发明还提供了用于生成至少一种抗CD22抗体的方法，其包括在体外、在体内或原位在一定条件下翻译抗体编码核酸，使得CD22抗体以可检测或可回收的量表达。

本发明还提供了用于在宿主细胞中表达至少一种上述抗CD22抗体的至少一种方法，其包括在其中至少一种抗CD22抗体以可检测和/或可回收的量表达的条件下培养本文所述的宿主细胞。

本发明还提供了至少一种组合物，其包含(a)本文所述的分离的抗CD22抗体编码核酸和/或抗体；和(b)合适的载体或稀释剂。该载体或稀释剂可任选地是药学可接受的已知载体或稀释剂。该组合物可任选进一步包含至少一种其他化合物、蛋白质或组合物。

本发明还提供了至少一种抗CD22抗体方法或组合物，用于施用治疗有效量以调控或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种CD22相关病症，和/或在相关病症之前、之后、或期间施用，如本领域已知的和/或如本文中描述的。因此，本发明提供了用于诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中CD22相关症状的方法，其包括使包含有效量的本发明的至少一种分离的抗CD22抗体的组合物接触或施用于细胞、组织、器官或动物。该方法可任选进一步包括对细胞、组织、器官或动物施用有效量为0.001-50mg/kg的本发明的抗CD22抗体。该方法可任选进一步包括通过选自胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内(intracelebellar)、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、含服、舌下、鼻内、或经皮的至少一种模式来使用接触或施用。该方法可任选进一步包括在该抗体接触或施用之前、并行、或之后施用至少一种组合物，其包含有效量的至少一种选自下述至少一项的化合物或蛋白质：可检测标记物或报告体(reporter)、TNF拮抗剂、抗风湿药、肌肉松弛药、麻醉药、非类固醇抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静药、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、红细胞生成素、免疫剂、免疫球蛋白、免疫抑制药、生长激素、激素替代药物、放射学药物、抗抑郁药、安定药、兴奋剂、哮喘药物、β激动剂、吸入的类固醇、肾上腺素或其类似物、细胞毒性或其它抗癌剂、抗代谢药诸如甲氨蝶呤、抗增殖剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂和抗TNFα或其他单克隆抗体或双功能抗体。

本发明还提供了用于诊断细胞、组织、器官、动物或患者中至少一种CD22相关病症和/或在相关病症之前、之后、或期间的至少一种抗CD22抗体方法，如本领域已知的和/或如本文描述的。

本发明还提供了至少一种本发明的抗CD22抗体的用于诊断的至少一种组合物、装置和/或递送方法。

还提供了一种医疗装置，其包含本发明的至少一种分离的哺乳动物抗CD22抗体，其中所述装置适合于通过选自胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内(intracelebellar)、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、含服、舌下、鼻内、或经皮的至少一种模式来接触或施用所述至少一种抗CD22抗体。

在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含第一容器中冻干形式的至少一种本发明的抗CD22抗体或片段，和装有无菌水、无菌缓冲水、或至少一种防腐剂的任选的第二容器，所述防腐剂选自水性稀释剂中的下组：酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁、对羟基苯甲酸烃基酯、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或其混合物。在一个方面，在该试剂盒中，将第一容器中抗CD22抗体或特定部分或变体的浓度用第二容器中的内容物重建为约0.1mg/ml至500mg/ml的浓度。在另一个方面，第二容器还包含等张剂。在另一个方面，第二容器还包含生理可接受的缓冲剂。在一个方面，本发明提供了治疗至少一种抗CD22介导的病症的方法，其包括对有需要的患者施用试剂盒中提供的并在施用前重建的制剂。

还提供了用于人类制药或诊断用途的制品，其包含包装材料和装有本发明的至少一种分离的哺乳动物抗CD22抗体的溶液或冻干形式的容器。该制品可任选地具有容器，其作为胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、含服、舌下、鼻内或经皮递送装置或系统的部件。

本发明还提供了本文所述的任何发明。

附图简述

图1示出分别用于VM1000的轻链(SEQ ID NO:1,17)和重链(SEQ IDNOs:33,49)可变区的核酸序列和氨基酸序列。

图2示出分别用于VM1001的轻链(SEQ ID NO:2,18)和重链(SEQ IDNOs:34,50)可变区的核酸序列和氨基酸序列。

图3示出分别用于VM1002的轻链(SEQ ID NO:3,19)和重链(SEQID NOs:35,51)可变区的核酸序列和氨基酸序列。

图4示出分别用于VM1003的轻链(SEQ ID NO:4,20)和重链(SEQID NOs:36,52)可变区的核酸序列和氨基酸序列。

图5示出分别用于VM1004的轻链(SEQ ID NO:5,21)和重链(SEQID NOs:37,53)可变区的核酸序列和氨基酸序列。

图6示出分别用于VM1005的轻链(SEQ ID NO:6,22)和重链(SEQID NOs:38,54)可变区的核酸序列和氨基酸序列。

图7示出分别用于VM1006的轻链(SEQ ID NO:7,23)和重链(SEQID NOs:39,55)可变区的核酸序列和氨基酸序列。

图8示出分别用于VM1007的轻链(SEQ ID NO:8,24)和重链(SEQID NOs:40,56)可变区的核酸序列和氨基酸序列。

图9示出分别用于抗CD22抗体VM1008的轻链(SEQ ID NO:9,25)和重链(SEQ ID NOs:41,57)可变区的核酸序列和氨基酸序列。

图10示出分别用于VM1009的轻链(SEQ ID NO:10,26)和重链(SEQID NOs:42,58)可变区的核酸序列和氨基酸序列。

图11示出分别用于VM1010的轻链(SEQ ID NO:11,27)和重链(SEQID NOs:43,59)可变区的核酸序列和氨基酸序列。

图12示出分别用于VM1011的轻链(SEQ ID NO:12,28)和重链(SEQID NOs:44,60)可变区的核酸序列和氨基酸序列。

图13示出分别用于VM1012的轻链(SEQ ID NO:13,29)和重链(SEQID NOs:45,61)可变区的核酸序列和氨基酸序列。

图14示出分别用于VM1013的轻链(SEQ ID NO:14,30)和重链(SEQID NOs:46,62)可变区的核酸序列和氨基酸序列。

图15示出分别用于VM1014的轻链(SEQ ID NO:15,31)和重链(SEQID NOs:47,63)可变区的核酸序列和氨基酸序列。

图16示出分别用于VM1015的轻链(SEQ ID NO:16,32)和重链(SEQID NOs:48,64)可变区的核酸序列和氨基酸序列。

图17示出本发明的VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015的选定克隆的亲和ELISA分析的数据。

图18示出表面等离子体共振(SPR)测定本发明的VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015和对照(VM006G和VM006H)的重组CD22胞外域的亲和常数(KD)的数据。

图19示出对CD22表达人淋巴瘤细胞如Daudi、RAMOS和RAJI B细胞系的表面结合和内化分析的数据，其是通过对来自VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015以及对照的选定克隆进行荧光激活细胞分选(FACS)而进行的。每一框中所有右边的峰代表对照(无抗体)；每一框中所有左边的峰显示有抗体时的数据，通过向较低荧光信号移动来表示受体/抗体的内化。框1表示阳性对照抗体，框2表示VM1000，框3表示VM1001，框4表示VM1002，框5表示VM1004，框6表示VM1005，框7表示VM1006，框8表示VM1011。

图20示出来自使用VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015以及对照(BA006G)的FACS的表面结合和内化分析的数据的表。

图21示出使用本发明的抗体VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015的定量共焦荧光免疫显微镜的快速表面结合和细胞内内化的数据。

图22A和22B示出存在于人淋巴瘤细胞系Daudi表面上的CD22在暴露于来自本发明的VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015的选定抗体后诱导的CD22酪氨酸磷酸化。

图23示出显示抗CD22抗体与灵长类动物物种食蟹猴(Macacafascicularis)的细胞上表达的CD22的交叉反应性的数据。将用于每一测试条件的细胞在PBS中清洗，然后于室温下用含4％甲醛的PBS固定10分钟。然后将细胞重悬在含2％FBS的0.5ml PBS中，然后通过荧光激活细胞分选(FACS)分析CD22和CD20的表面染色(1)。未用抗体处理的细胞不论在FITC还是PE通道中都没有很大的荧光强度的移动(1A)，而用抗VM101-PE染色的细胞含有CD22阳性群(1B)。同样，用抗CD20-FIT染色的细胞含有CD20阳性群(1C)。基于PBMC中两种抗原的表达模式本领域技术人员会预期到同时用VM101-PE和CD20-FITC抗体染色的细胞具有双标记群(1D)。VM101特异性识别食蟹猴CD22蛋白。

图24示出本发明的抗CD22抗体在哺乳动物中的高水平表达数据。

发明详述

引用

本文中引用的所有出版物或专利通过引用完整并入本文，因为它们显示了本发明之时的现有技术状态和/或提供了本发明的说明和实施。出版物指任何科学或专利出版物，或者以任何介质形式提供的任何其它信息，包括所有记录的、电子的或印刷的形式。下述参考文献通过引用完整并入本文：Ausubel,et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学实验室指南),John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2001)；Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册),2.sup.nd Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Harlow andLane,Antibodies(抗体),a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Colligan,et al.,eds.,Current Protocols in Immunology(免疫学实验室指南),John Wiley&Sons,Inc.,NY(1994-2001)；Colligan et al.,CurrentProtocols in Protein Science(蛋白质科学实验室指南),John Wiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)。

氨基酸代码

常常将构成本发明抗CD22抗体的氨基酸缩写。氨基酸名称可以通过以其单字母代码、其三字母代码、名称、或三核苷酸密码子来表示，正如本领域普遍理解的(参见Alberts,B.,et al.,Molecular Biology of TheCell(细胞的分子生物学),Third Ed.,Garland Publishing,Inc.,New York,1994)。

定义

本文中使用的“抗CD22抗体”、“抗CD22抗体”、“抗CD22抗体部分”、或“抗CD22抗体片段”和/或“抗CD22抗体变体”等包括任何蛋白质或肽，所述蛋白质或肽含有包含至少部分免疫球蛋白分子的分子，含有来源于VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014或VM1015的至少一种的重链或轻链或其配体结合部分的至少一个互补决定区(CDR)，其与可并入本发明的抗体中的非鼠来源的、优选人来源的重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何部分相结合。或者，术语“抗CD2抗体”可统称为或单独地指人源化单克隆抗体VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015。此类抗体能够在体外、原位和/或在体内调控、降低、拮抗、减低、减轻、阻断、抑制、消除和/或干扰至少一种CD22活性或结合，或CD22受体活性或结合。作为非限制性例子，本发明的合适的抗CD22抗体、特定部分或变体能以高亲和力结合至由VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014或VM1015单克隆抗体的至少一种识别的抑制性和/或中和性人CD22表位。合适的抗CD22抗体、特定部分或变体还可任选地影响至少一种CD22活性或功能，诸如但不限于RNA、DNA或蛋白质合成、CD22释放、CD22受体信号传导、膜CD22切割(cleavage)、CD22活性、CD22生成和/或合成。

术语“抗体”还意图涵盖抗体、其酶切片段、特定部分和变体，包括抗体模拟物或者包含模拟抗体或其特定片段或部分的结构和/或功能的抗体部分，包括单链抗体及其片段，每一个均含有来源于抗CD22的至少一个CDR。功能性片段包括与哺乳动物CD22结合的抗原结合片段。例如，本发明还包括能够与CD22或其部分结合的抗体片段，包括但不限于Fab(例如通过木瓜蛋白酶消化)、Fab’(例如通过胃蛋白酶消化和部分还原)和F(ab’)₂(例如通过胃蛋白酶消化)、facb(例如通过纤溶酶消化)、pFc’(例如通过胃蛋白酶或纤溶酶消化)、Fd(例如通过胃蛋白酶消化、部分还原和再聚集)、Fv或scFv(例如通过分子生物学技术)片段(参见例如Colligan,Immunology,同上)。

抗体片段可通过酶促切割、合成或重组技术来生成，如本领域已知的和/或如本文中描述的。还可以使用其中在天然终止位点的上游已引入一个或多个终止密码子的抗体基因生成多种截短形式的抗体。例如，编码F(ab’)₂重链部分的组合基因可设计成包括编码重链的CH₁域和/或铰链区的DNA序列。抗体的各部分可通过常规技术化学地结合在一起，或者可使用遗传工程技术制备为连续蛋白质。

本文使用的“嵌合”抗体或“人源化”抗体或“CDR嫁接的”包括本文所述的抗CD22抗体或自其来源的任何CDR与来源于非鼠、优选人抗体的一种或多种蛋白质或肽组合的任何组合。根据本发明，嵌合或人源化抗体包括下述抗体，其中CDR来源于一种或多种本文所述的抗CD22抗体且抗体的至少一部分或剩余部分来源于一种或多种人抗体。因此，抗体的人部分可包括在人中基本上没有免疫原性的框架、C_L、C_H域(例如C_H1、C_H2、C_H3)、铰链(V_L、V_H))区。抗体中自人抗体来源的区域不需要与人抗体具有100％同一性。在优选的实施方案中，保留尽可能多的人氨基酸残基以使免疫原性可忽略，但是必要时可修饰人的残基以在使抗体人源化最大化的同时支持由CDR形成的抗原结合位点。相对于未修饰抗体，此类变化或变形任选且优选保持或降低在人或其它物种中的免疫原性。指出人源化抗体可由能够表达功能性重排的人免疫球蛋白(例如重链和/或轻链)基因的非人类动物或原核或真核细胞来生成。另外，当抗体是单链抗体时，它可包含在天然人抗体没有发现的连接肽。例如，Fv可包含连接肽，如两个至约八个甘氨酸或其它氨基酸残基，其连接重链可变区和轻链可变区。此类连接肽被认为是人来源的。

抗体人源化可通过例如合成组合文库来实施，所述组合文库包含非人靶单克隆抗体的六个CDR，其框架内(in frame)融合至单个的人框架集合(pool)中。可利用含有代表所有已知重链和轻链人种系基因的基因的人框架文库。然后可对所得组合文库筛选用于与目的抗原的结合。这种方法可容许在维持亲本抗体的结合活性方面选择全人框架的最有利组合。然后可通过各种技术来进一步优化人源化抗体。

对于全长抗体分子，可以自杂交瘤细胞系的基因组DNA或mRNA获得免疫球蛋白基因。在哺乳动物载体系统中克隆抗体重链和轻链。用双链序列分析记录(documented)装配。可以在其它人或哺乳动物宿主细胞系中表达抗体构建物。然后可通过所表达的目的抗体的瞬时转染测定和Western印迹分析来验证该构建物。可使用快速测定方法来分离和筛选具有最高生产力的稳定细胞系。

数个出版物详细地描述了用途、应用和使用方法以及抗CD22抗体(包括本发明的抗CD22抗体)的应用，例如美国专利申请号US20110182887，名称为“人源化抗CD22抗体及其用途”，美国专利申请号US20110020344，名称为“对CD22有特异性的人单克隆抗体”，和美国专利申请号US20100143368，名称为“结合CD22的人抗体及其用途”，其全部内容通过引用并入本文。

本发明的抗体

根据本发明，抗CD22抗体包括VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014或VM1015抗体中的任一种，或者其中可变区或CDR来源于VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014或VM1015抗体的任一种并且抗体的框架和恒定区来源于一种或多种人抗体的抗体。来源于抗体的可变区或CDR优选与VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014或VM1015抗体的任一种的可变区或CDR具有约90％至约100％的同一性，但是只要嵌合抗体维持结合和抑制CD22的能力，就可以预期任何和所有修饰(包括替代、插入和缺失)。来源于人抗体的嵌合、人源化或CDR嫁接的抗体区域不需要与人抗体具有100％同一性。在一个优选的实施方案中，保留尽可能多的人氨基酸残基以使免疫原性可忽略，但是根据本发明在必要时及如本文下文中教导的可替换人残基，特别是框架区的残基。本文中公开的此类修饰是在使抗体人源化最大化的同时支持由CDR形成的抗原结合位点所必需的。

根据本发明，抗CD22抗体可变区(轻链和重链)的核酸序列和推导氨基酸序列列于图1-15。重链和轻链可变区各自含有三个CDR，它们结合形成抗原结合位点。三个CDR被四个框架区包围，后者的主要功能是支持CDR。重链和轻链可变区序列内的CDR序列可通过计算机辅助比对(Kabat et al.(1987)in Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学研究的蛋白序列),4^th ed.,United States Department of Health and HumanServices,U.S.Government Printing Office,Washington,D.C.)或通过可变区的分子建模，例如利用ENCAD程序(如Levitt(1983)J.Mol.Biol.168:595所述)来鉴定。

在一个优选的实施方案中，CDR来源于VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014或VM1015的任一种。重链CDR和轻链CDR的确定完全在本领域技术范围内。参见例如http://www.bioinf.org.uk/abs/。

抗CD22抗体的CDR的序列可通过插入、替代和缺失来修饰，直到CDR嫁接的抗体维持结合和抑制人CD22的能力的程度。通过实施本文下文描述的功能测定法，普通技术人员能够确定对这种活性的维持。

或者，可以将VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014或VM1015中的任一种的整个重链可变区和轻链可变区与人恒定区和框架区组合以形成本发明的嵌合抗体。克隆VM1000包含轻链VM1000LC(SEQ ID NO:1)和重链VM1000HC(SEQID NO:33)。克隆VM1001包含轻链VM1001LC(SEQ ID NO:2)和重链VM1001HC(SEQ ID NO:34)。克隆VM1002包含轻链VM1002LC(SEQID NO:3)和重链VM1002HC(SEQ ID NO:35)。克隆VM1003包含轻链VM1003LC(SEQ ID NO:4)和重链VM1003HC(SEQ ID NO:36)。克隆VM1004包含轻链VM1004LC(SEQ ID NO:5)和重链VM1004HC(SEQID NO:37)。克隆VM1005包含轻链VM1005LC(SEQ ID NO:6)和重链VM1005HC(SEQ ID NO:38)。克隆VM1006包含轻链VM1006LC(SEQID NO:7)和重链VM1006HC(SEQ ID NO:39)。克隆VM1007包含轻链VM1007LC(SEQ ID NO:8)和重链VM1007HC(SEQ ID NO:40)。克隆VM1008包含轻链VM1008LC(SEQ ID NO:9)和重链VM1008HC(SEQID NO:41)。克隆VM1009包含轻链VM1009LC(SEQ ID NO:10)和重链VM1009HC(SEQ ID NO:42)。克隆VM1010包含轻链VM1010LC(SEQID NO:11)和重链VM1010HC(SEQ ID NO:43)。克隆VM1011包含轻链VM1011LC(SEQ ID NO:12)和重链VM1011HC(SEQ ID NO:44)。克隆VM1012包含轻链VM1012LC(SEQ ID NO:13)和重链VM1012HC(SEQID NO:45)。克隆VM1013包含轻链VM1013LC(SEQ ID NO:14)和重链VM1013HC(SEQ ID NO:46)。克隆VM1014包含轻链VM1014LC(SEQID NO:15)和重链VM1014HC(SEQ ID NO:47)。克隆VM1015包含轻链VM1015LC(SEQ ID NO:16)和重链VM1015HC(SEQ ID NO:48)。

通过已知方法，编码本发明的人源化抗体、片段和区的恒定(C)区的人基因可来源于人胎肝文库。人C区基因可来源于任何人细胞，包括表达和生成人免疫球蛋白的那些。人C_H区可来源于任何已知类或同种型的人H链，包括γ、μ、α、δ、ε及它们的亚型，诸如G1、G2、G3和G4。由于H链同种型负责抗体的多种效应子功能，因此C_H区的选择会由期望的效应子功能来指导，诸如补体固定或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中的活性。优选地，C_H区来源于伽马1(IgG1)。

人C_L区可来源于人L链同种型k或λ型，优选k型。

通过标准克隆技术，自人细胞获得编码人免疫球蛋白C区的基因(Sambrook,et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册),2^nd Edition,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)和Ausubel et al.,eds.Current Protocols in Molecular Biology(1987-1993))。人C区基因易于从含有代表两类L链、五类H链及其亚类的基因的已知克隆中获得。嵌合抗体片段，如F(ab¹)₂和Fab，可通过设计恰当截短的嵌合H链基因来制备。例如，编码F(ab¹)₂片段H链部分的嵌合基因会包括编码H链CH1域和铰链区的DNA序列，接着是翻译终止密码子以产生截短分子。

一般而言，在一个实例中，本发明的人源化抗体、片段和区如下生成，即克隆编码抗CD22特异性抗体H和L链抗原结合区的DNA区段，并分别将这些DNA区段连接至包括C_H和C_L区的DNA区段，以生成全长免疫球蛋白编码基因。

抗体可变区的序列可通过插入、替代和缺失来修饰，直到嵌合抗体维持结合和抑制人CD22的能力的程度。通过实施本文下文描述的功能测定法，普通技术人员能够确定对这种活性的维持。可变区可以与SEQID NO：1-64的可变区具有例如约50％至约100％的同源性。在优选的实施方案中，抗体可变区与SEQ ID NO：1-64的可变区具有约80％至约100％的同源性。在更优选的实施方案中，可变区与SEQ ID NO：1-64的可变区具有约90％至约100％的同源性。

在一个具体的方面，本发明的优选抗CD22单抗包含与SEQ ID NO：17-32具有95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同源性的可变轻链区，而且还包含与SEQ ID NO：49-64具有95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同源性的可变重链区。

在一个具体的方面，本发明的优选抗CD22单抗包含选自SEQ IDNO：1-16之一的可变轻链区。在另一个具体的方面，本发明的优选抗CD22单抗包含选自SEQ ID NO：33-48之一的可变重链区。

可使用用于工程化或人源化非人抗体或人抗体的方法，而且它们是本领域公知的。一般而言，人源化或工程化抗体具有来自非人来源(例如但不限于小鼠、大鼠、家兔、非人灵长类动物或其它哺乳动物)的一个或多个氨基酸残基。这些人氨基酸残基常常称作“输入(import)”残基，它们通常取自已知人序列的“输入”可变域、恒定域或其它域。已知人Ig序列公开于例如以下文件：

www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi；

www.atcc.org/phage/hdb.html；

www.sciquest.com/；

www.abcam.com/；

www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；

www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html；

www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html；

www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm；

www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html；

www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；

www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html；

www.antibodyresource.com/；

mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.com/；

pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html；

www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/；

www.pebio.com/pa/340913/340913.html；

www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；

www.m.ehime-u.ac.jp/.about.yasuhito/Elisa.html；

www.biodesign.com/table.asp；

www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html；

www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html；

www.isac-net.org/sites_geo.html；

aximt1.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEPStart.html；

baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/links1.html；

www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwvu.edu/；

www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html；

www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html；

imgt.cnusc.fr:8104/；

www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html；

antibody.bath.ac.uk/；

abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html；

www.unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/Slide01.html；

www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/；

www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；

www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html；

www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；

www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；

www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html；

www.jerini.de/fr_products.htm；

www.patents.ibm.con/ibm.html.

Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest(蛋白序列的免疫学研究),U.S.Dept.Health(1983)，其全部内容通过引用并入本文。

此类输入序列可用于降低免疫原性或者降低、增强或改变结合、亲和力、结合速率(on-rate)、解离速率(off-rate)、亲合力、特异性、半衰期、或任何其它合适的特征，如本领域已知的。一般而言，保留部分或所有非人或人CDR序列，同时用人或其它氨基酸替换非人可变区和恒定区序列。抗体还可任选在人源化的同时保留对抗原的高亲和力和其它有利生物学特性。为了实现这个目标，人源化抗体可任选地通过如下过程来制备，即使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物。三维免疫球蛋白模型是公众可得的，而且是本领域技术人员熟悉的。说明并展示选定的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可得的。检查这些展示图允许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以选择和组合来自共有和输入序列的FR残基，使得期望抗体特征(诸如提高的对靶抗原的亲和力)得以实现。一般而言，CDR残基直接且最实质性地参与影响抗原结合。本发明抗体的人源化或工程化可使用任何已知方法来实施，诸如但不限于记载于下述文献的那些：Winter(Jones et al.,Nature 321:522(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323(1988)；Verhoeyen et al.,Science 239:1534(1988)),Sims etal.,J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901(1987),Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992)；Presta etal.,J.Immunol.151:2623(1993),美国专利号5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539；4,816,567、PCT/:US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755；WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP 229246，其全部内容包括其中引用的参考文献均通过引用并入本文。

本发明人源化抗体的人恒定区可以是任何类(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等)或同种型，而且可包含k或λ轻链。在一个实施方案中，人恒定区包含IgG重链或规定片段，例如同种型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的至少一种。在另一个实施方案中，抗人CD22人抗体包含IgG1重链和IgG1K轻链。本发明分离的抗CD22抗体同样包含由任何合适多核苷酸编码的本文中公开的抗体氨基酸序列。优选地，抗体或抗原结合片段结合人CD22，并由此部分或实质性中和所述蛋白质的至少一种生物学活性。抗体或其特定部分或变体部分或优选实质性中和至少一种CD22蛋白或片段的至少一种生物学活性，并由此抑制经由CD22结合CD22受体或经由其它CD22依赖性或介导的机制介导的活性。本文使用的术语“中和性抗体”指能根据测定法将CD22依赖性活性抑制约20-120％，优选至少约10、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或以上的抗体。抗CD22抗体抑制CD22依赖性活性的能力优选通过至少一种合适的CD22蛋白或受体测定法来评价，如本文中描述的和/或如本领域已知的。

本发明的至少一种抗体结合对至少一种CD22蛋白、亚基、片段、部分或其任何组合有特异性的至少一个特定表位。该至少一个表位可包含至少一个抗体结合区，其包含至少一个蛋白质部分，该表位优选由蛋白质的至少一个胞外、可溶性、亲水性、外部或胞质部分组成。一般而言，本发明的人抗体或抗原结合片段会包含如下的抗原结合区，其包含自本文所述抗CD22抗体来源的至少一个人互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)或至少一个重链可变区的变体和至少一个人互补决定区(CDR4、CDR5和CDR6)或至少一个轻链可变区的变体。在一个具体的实施方案中，抗体或抗原结合片段可具有如下的抗原结合区，其包含具有相应CDR1、2和/或3的氨基酸序列的至少一种重链CDR(即CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少一部分。在另一个具体的实施方案中，抗体或抗原结合部分或变体可具有如下的抗原结合区，其包含具有相应CDR4、5和/或6的氨基酸序列的至少一种轻链CDR(即CDR4、CDR5和/或CDR6)的至少一部分。在一个优选的实施方案中，抗体或抗原结合片段的三个重链CDR和三个轻链CDR具有VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014或VM1015中至少一种的相应CDR的氨基酸序列。此类抗体可通过如下来制备，即使用常规技术将抗体的各个部分(例如CDR、框架)化学地连接到一起，使用重组DNA技术的常规技术来制备和表达编码抗体的(一种或多种)核酸分子，或使用任何其它合适的方法和使用任何可能的冗余密码子(其会导致本发明的多肽表达)。

可采用轻链和重链的组合可变域人源化文库的液相合成。例如，人源化轻链(LC)可变域文库的装配例如含有人轻链框架(FW)和非人互补决定区(CDR)。文库通过例如使用逐步液相连接FW和CDR DNA片段来装配。文库通过本领域技术人员已知的技术使用逐步液相连接以FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3次序的FW和CDR DNA片段来装配。例如，通过一篇或多篇下述参考文献的技术进行，其通过引用并入本文：Lo,B.K.,2003,Antibody humanization by CDR grafting(通过CDR嫁接的抗体人源化).Antibody Engineering,Methods and protocols(抗体工程，方法与流程).Edit by Benny K.C.Lo,Methods in Molecular Biology(分子生物学方法),248,135-159；Kashmiri et al.,2003,Developing aminimally immunogenic humanized antibody by CDR grafting(通过CDR嫁接产生最低限度的致免疫人源化抗体).Antibody Engineering,Methodsand protocols.Edit by Benny K.C.Lo,Methods in Molecular Biology,248,361-376；Bassette,P.H.,et al.,2003,Construction of Designed ProteinLibraries Using Gene Assembly Mutagenesis(使用基因组装突变构建设计蛋白文库).Directed Evolution Library Creation,Methods and protocols.Edit.Arnold and Georgiou,Methods in Molecular Biology(分子生物学方法),231,29-37；Chames,P.,et al.,2001,Selections on Biotinylatedantigens(对生物素化抗原的筛选).Antibody Engineering,Edit by R.Kontermann and S.Dubel,Springer Lab Manual,149-166；O’Brien S.,andJones,T.,2001,Humanising antibodies by CDR grafting(通过CDR嫁接的抗体人源化).Antibody Engineering,Edit by R.Kontermann and S.Dubel,Springer Lab Manual,567-590。

结合人CD22和包含规定重链或轻链可变区或CDR区的抗体可使用合适方法来制备，诸如噬菌体展示(Katsube,Y.,et al.,Int J.Mol.Med,1(5):863-868(1998))或采用转基因动物的方法，如本领域已知的和/或如本文中描述的。例如，抗体、特定部分或变体可使用编码核酸或其部分在合适宿主细胞中表达。

如所述的，本发明还涉及在序列中包含与本文所述氨基酸序列实质相同的氨基酸的抗体、抗原结合片段、免疫球蛋白链和CDR。此类抗CD22抗体可包括一个或多个氨基酸替代、缺失或添加，或是来自天然突变或是来自人操作，如本文中描述的。优选地，此类抗体或抗原结合片段和包含此类链或CDR的抗体能以高亲和力(例如K_D小于或等于约10^-9M)结合人CD22。与本文所述序列实质相同的氨基酸序列包括包含保守性氨基酸替代以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守氨基酸替代指用与第一种氨基酸具有相似的化学和/或物理特性(例如电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)的第二种氨基酸替换第一种氨基酸。保守性替代包括下述各组内用一种氨基酸替换另一种氨基酸：赖氨酸(K)，精氨酸(R)和组氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，酪氨酸(Y)，K，R，H，D和E；丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)，脯氨酸(P)，苯丙氨酸(F)，色氨酸(W)，甲硫氨酸(M)，半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)；F，W和Y；C，S和T。

当然，熟练技术人员会进行的氨基酸替代的数目取决于多种因素，包括上文描述的那些。一般而言，任何给定抗CD22抗体、片段或变体的氨基酸替代、插入或缺失的数目不会超过40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1，如1-30或其中的任何范围或值，如本文中规定的。

本发明的抗CD22抗体中对功能至关重要的氨基酸可通过本领域已知的方法来鉴定，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如Ausubel,同上，Chapters 8,15；Cunningham and Wells,Science 244:1081-1085(1989))。后一种方法在分子中的每一个残基处引入单一丙氨酸突变。然后对所得突变体分子测试生物学活性，诸如但不限于至少一种CD22中和活性。对抗体结合至关重要的位点还可通过结构分析来鉴定，诸如结晶、核磁共振或光亲和标记(Smith,et al.,J.Mol.Biol.224:899-904(1992)和de Vos,et al.,Science 255:306-312(1992))。

本发明的抗CD22抗体可包括但不限于选自来源于SEQ ID NO：17-32和49-64中至少一种CDR的5个至所有连续氨基酸的至少一部分、序列或组合。

抗CD22抗体可任选进一步包含来源于SEQ ID NO：17-32和49-64至少一种中的CDR的70-100％连续氨基酸的至少一种的的多肽。在一个具体的方面，抗CD22抗体包含与SEQ ID NO：1-16具有95-99％序列同源性的多肽。在另一个具体的方面，抗CD22抗体包含与SEQ ID NO：33-48具有95-99％序列同源性的多肽。

在一个实施方案中，免疫球蛋白链或其部分(例如可变区、CDR)的氨基酸序列与SEQ ID NO：17-32或49-64中至少一种的氨基酸序列具有约70-100％同一性(例如70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或者其中的任何范围或数值)。优选地，使用本领域已知的合适计算机算法测定70-100％的氨基酸同一性(即90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或者其中的任何范围或数值)。在一个具体的方面，抗CD22抗体包含与SEQ ID NO：17-32或49-64具有95-99％序列同源性的多肽。

示例性重链和轻链可变区序列提供于SEQ ID NO：1-64。本发明的抗体或其特定变体可包含来自本发明抗体的任意数目的连续氨基酸残基，其中该数目选自下述整数组：抗CD22抗体中连续残基数目的10-100％。任选地，这种连续氨基酸子序列的长度为至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或更多个氨基酸，或者其中的任何范围或数值。另外，此类子序列的数目可以是选自下组的任何整数：1至20，诸如至少2、3、4或5。

如技术人员会领会的，本发明包括本发明的至少一种生物活性抗体。生物活性抗体的比活性为天然(非合成)、内源或相关和已知抗体的比活性的至少20％、30％或40％，优选至少50％，60％或70％，最优选至少80％、90％或95％-100％。测定和定量测定酶活性和底物特异性的方法是本领域技术人员公知的。

在另一个方面，本发明涉及本文所述人抗体和抗原结合片段，其通过共价连接有机部分来修饰。此类修饰可生成具有改良药动学特性(例如延长的体内血清半衰期)的抗体或抗原结合片段。有机部分可以是线性或支化亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在具体的实施方案中，亲水性聚合物基团可具有约800至约120000道尔顿的分子量，而且可以是聚烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，而且脂肪酸或脂肪酸酯基团可包含约8个至约40个碳原子。

本发明经修饰的抗体和抗原结合片段可包含直接或间接共价键合至抗体的一个或多个的有机部分。每一个键合至本发明抗体或抗原结合片段的有机部分可独立为亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。本文使用的术语“脂肪酸”涵盖单羧酸和二羧酸。本文中使用的术语“亲水性聚合物基团”指在水中比在辛烷中更易溶的有机聚合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中更易溶。如此，本发明涵盖通过共价连接聚赖氨酸而修饰的抗体。适合于修饰本发明抗体的亲水性聚合物可以是线性或支化，而且包括例如聚烷二醇(例如PEG、单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水化合物(例如右旋糖苷、纤维素、寡糖、多糖等)、亲水性氨基酸的聚合物(例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚烷氧化物(例如聚氧化乙烯、聚氧化丙烯等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本发明抗体的亲水性聚合物作为单独的分子实体具有约800至约150000道尔顿的分子量。例如，可使用PEG₅₀₀₀和PEG₂₀₀₀₀，其中下标是聚合物以道尔顿计的平均分子量。亲水性聚合物基团可用一个至约六个烃基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代。经脂肪酸或脂肪酸酯基团取代的亲水性聚合物可通过采用合适的方法来制备。例如，包含胺基团的聚合物可偶联脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸根，而脂肪酸或脂肪酸酯上活化的羧酸根(例如用N,N-羰二咪唑活化的)可偶联聚合物上的羟基。

适合于修饰本发明抗体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的，或可以含有一个或多个不饱和单元。适合于修饰本发明抗体的脂肪酸包括例如正十二烷酸盐(C₁₂，月桂酸盐)、正十四烷酸盐(C₁₄，肉豆蔻酸盐)、正十八烷酸盐(C₁₈，硬脂酸盐)、正二十烷酸盐(C₂₀，花生酸盐)、正二十二烷酸(C₂₂，山萮酸盐)、正三十烷酸(C₃₀)、正四十烷酸(C₄₀)、顺式-δ9-十八烷酸(C₁₈，油酸盐)、全顺-δ5,8,11,14-二十碳四烯酸盐(C₂₀，花生四烯酸盐)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸酯包括包含线性或支化低级烷基的二羟酸的单酯。低级烷基可包含1个至约12个，优选1个至约6个碳原子。

经修饰的人抗体和抗原结合片段可使用合适的方法来制备，诸如通过与一种或多种修饰剂反应。如本文中使用的，术语“修饰剂”指包含活化基团的合适有机基团(例如亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”为如下的化学部分或官能团，其在适宜条件下能与第二化学基团反应，由此在修饰剂与第二化学基团之间形成共价键。例如，胺反应性活化基团包括亲电子基团，诸如甲苯磺酸根、甲磺酸根(mesylate)、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚氨基酯(NHS)等。能与硫醇反应的活化基团包括例如马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基、吡啶基二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-thiol)等。醛官能团可偶联含胺或酰肼的分子，而叠氮基团能与三价磷基团反应以形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺(phosphorimide)连接。将活化基团引入分子的合适方法是本领域已知的(参见例如Hernanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press:SanDiego,Calif.(1996))。活化基团可直接地或经由连接部分(例如二价C₁-C₁₂基团，其中一个或多个碳原子可以用杂原子诸如氧、氮或硫置换)与有机基团(例如亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)键合。合适的连接部分包括例如四乙二醇，--(CH2)3--，--NH--(CH₂)₆--NH--，--(CH₂)₂--NH--和--CH₂--O--CH₂--CH₂--O--CH₂--CH₂--O--CH--NH--。包含连接部分的修饰剂可例如通过在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)存在下使单Boc-烃基二胺(例如单Boc-乙二胺、单Boc-二氨基己烷)与脂肪酸反应以在游离胺和脂肪酸羧酸根之间形成酰胺键来生成。可通过用三氟乙酸(TFA)处理以从产物清除Boc保护基团以暴露伯胺，其可以偶联另一羧酸根，如描述的，或者可以与马来酸酐反应，并且所得产物环化以生成脂肪酸的活化的马来酰亚氨衍生物(参见例如Thompson,et al.，WO92/16221，通过述及将完整教导收入本文)。

本发明经修饰的抗体可通过使人抗体或抗原结合片段与修饰剂反应来生成。例如，可以通过采用胺反应性修饰剂，例如PEG的NHS酯，以非位点特异性方式将有机部分键合至抗体。经修饰的人抗体或抗原结合片段还可如下来制备，即还原抗体或抗原结合片段的二硫键(例如链内二硫键)。然后使还原的抗体或抗原结合片段与硫醇反应性修饰剂反应以生成本发明经修饰的抗体。包含键合至本发明抗体特定位点的有机部分的经修饰人抗体和抗原结合片段可使用合适方法来制备，诸如反相蛋白水解(Fisch et al.,Bioconjugate Chem.,3：147-153(1992)；Werlen et al.,Bioconjugate Chem.，5：22411-417(1994)；Kumaran et al.,Protein Sci.6(10)：2233-2241(1997)；Itoh et al.,Bio org.Chem.,24(1)：59-68(1996)；Capellasetal.,Biotechno l.B ioe ng.,56(4)：456-463(1997))及Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，Calif.(1996)中记载的方法。

本发明的抗体可以较宽范围的亲和力(K_D)结合人CD22。在优选的实施方案中，本发明的至少一种人单抗任选能以高亲和力结合人CD22。例如，单抗能以等于或小于约10^-7M的K_D结合人CD22，诸如但不限于0.1-9.9(或其中的任何范围或数值)×10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12、10^-13或者其中的任何范围或数值。

抗体对抗原的亲和力或亲合力可使用任何合适方法以实验来测定(参见例如Berzofsky,et al.,“Antibody-Antigen Interactions(抗体-抗原相互作用)”，In Fundamental Immunology,Paul，W.E.，Ed.，Raven Pre ss：New Yo rk，N.Y.(1984)；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman andCompany:New York，N.Y.(1992)；及本文所述方法)。特定抗体-抗原相互作用的测定亲和力若在不同条件(例如盐浓度、pH)下测定则可变化。如此，亲和力和其它抗原结合参数(例如K_D、K_a、K_d)的测定优选用抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲液如本文所述缓冲液来进行。

用于本发明的方法和组合物中的抗CD22抗体特征在于对CD22的高亲和力结合及任选和优选具有低毒性。特别是，其中各成分诸如可变区、恒定区和框架单独地和/或共同地任选和优选拥有低免疫原性的本发明抗体、特定片段或变体在本发明中是有利的。可用于本发明的抗体任选特征在于它们治疗患者的能力，在延长的时段里有可测量的症状缓解和低和/或可接受的毒性。低或可接受的免疫原性和/或高亲和力，以及其它合适特性可促进所实现的治疗结果。“低免疫原性”在本文中定义为在少于约75％、或优选少于约50％的所治疗患者中引起显著的HAHA、HACA或HAMA应答和/或在所治疗患者中引起低效价(少于约300、优选少于约100，用双重抗原酶免疫测定法测定)(Elliott et al.,Lancet 344:1125-1127(1994)，其通过引用全部入本文)。

还可使用双特异性、异特异性、异源偶联或类似抗体，它们是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆人源化抗体。在本申请中，结合特异性之一是对于至少一种CD22蛋白，另一是对于任何其它抗原。用于生成双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组生成基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有不同特异性(Milstein and Cuello,Nature 305：537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机配合，这些杂交瘤(四源杂交瘤)生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤来进行的对正确分子的纯化相当麻烦，而且产物产率低。相似方法公开于例如WO 93/08829,美国专利号6,210,668、6,193,967、6,132,992、6,106,833、6,060,285、6,037,453、6,010,902、5,989,530、5,959,084、5,959,083、5,932,448、5,833,985、5,821,333、5,807,706、5,643,759、5,601,819、5,582,996、5,496,549、4,676,980、WO 91/00360、WO 92/00373、EP 03089、Traunecker et al.,EMBO J.10:3655(1991),Suresh et al.,Methods in Enzymology 121:210(1986)，其全部内容通过引用并入本文。

核酸分子

使用本文中提供的信息，如编码SEQ ID NO：17-32或49-64中至少一项的连续氨基酸的至少70-100％的核苷酸序列或其变体或共有序列，或包含至少一种这些序列的保藏载体，可使用本文中描述的或本领域已知的方法获得本发明编码至少一种抗CD22抗体的核酸分子。

本发明的核酸分子可以是RNA的形式，如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其它形式，或者是DNA的形式，包括但不限于通过克隆获得的或合成生成的cDNA和基因组DNA，或者其任意组合。DNA可以是三链的、双链的或单链的，或者其任意组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分可以是编码链，也称作有义链，或者其可以是非编码链，也称作反义链。

本发明的分离的核酸分子可包括含任选地具有一个或多个内含子的开放阅读框(ORF)的核酸分子，例如但不限于至少一个重链(例如SEQ IDNO:33-48)或轻链(例如SEQ ID NO:1-16)的至少一个CDR，如CDR1、CDR2和/或CDR3的至少一个特定部分；包含抗CD22抗体或可变区的编码序列的核酸分子；和包含与上述核酸序列基本不同的核酸序列，但由于遗传编码的简并，仍然编码本文所述和/或现有技术已知的至少一种抗CD22抗体的核酸分子。当然，遗传密码是本领域熟知的。因此，生成编码本发明的特异性抗CD22抗体的这类退化的核酸变体对本领域技术人员是常规的。参见例如Ausubel,et al.(同上)，并且这类核酸分子变体包括在本发明中。本发明的分离的核酸分子的非限制性实例包括SEQID NO:1-16和33-48；其对应于分别编码HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3、HC可变区和LC可变区的核酸的非限制性实例。

如本文所指明，本发明的包含编码抗CD22抗体的核酸的核酸分子可包括但不限于，自身(by itself)编码抗体片段的氨基酸序列的核酸分子、用于完整抗体或其部分的编码序列、用于抗体、片段或部分的编码序列，以及其他序列，如至少一种信号前导或融合肽的编码序列，具有或缺少前述其他编码序列，如至少一种内含子，连同其他非编码序列，包括但不限于非编码5'和3'序列，如转录非翻译序列，其在转录、mRNA加工包括剪接和多腺苷酸化信号(例如，核糖体的结合和mRNA的稳定)中发挥作用；为其他氨基酸如提供其他功能性的氨基酸编码的其他编码序列。因此，编码抗体的序列可以与标记物序列融合，所述标记物序列例如编码促进含抗体片段或部分的融合抗体的纯化的肽的序列。

与如本文所述的多核苷酸选择性杂化的多核苷酸

本发明提供了在本文公开的多核苷酸的选择性杂化条件下杂化的分离的核酸。因此，该实施方案的多核苷酸可用于分离、检测和/或量化含该多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可用于在储存库中鉴定、分离或扩增部分或全长克隆。在一些实施方案中，多核苷酸为基因组的或分离的cDNA序列，或其他与来自人类或哺乳动物类核酸文库的cDNA互补的。

优选的是，cDNA文库包括至少80％的全长序列，优选至少85％或90％的全长序列，更优选至少95％的全长序列。可使cDNA文库标准化(normalized)以提高罕见序列的代表性。对于具有相对于互补序列具有降低的序列同一性的序列，通常(但不是绝对)采用低严格性或中等严格性的杂化条件。对于较高同一性的序列，可选地采用中等严格性或高严格性的条件。低严格性条件允许具有约70％序列同一性的序列的选择性杂化，并可以采用该条件来识别直系同源序列和旁系同源序列。

可选地，本发明的多核苷酸将编码由本文所述多核苷酸编码的抗体的至少一部分。本发明的多核苷酸包含可用于与编码本发明抗体的多核苷酸选择性杂化的核酸序列。参见例如Ausubel，同上；Colligan，同上，各自的全部内容通过引用并入本文。

核酸的构建

如本领域已知的，本发明的分离的核酸可使用(a)重组方法、(b)合成技术、(c)纯化技术，或其组合来制备。

核酸可适宜地包含除本发明的多核苷酸以外的序列。例如，可将含一个或多个核酸内切酶限制位点的多克隆位点插入核酸中，以协助多核苷酸的分离。并且，可插入可译序列，以协助分离本发明的翻译的多核苷酸。例如，六组胺酸标记序列提供了纯化本发明的蛋白的便利手段。本发明的核酸(除编码序列)可选地为用于本发明的多核苷酸的克隆和/或表达的载体、接头(adapter)或连接体。

可将其他序列加入该克隆和/或表达序列中，以优化其在克隆和/或表达中的功能，并帮助分离多核苷酸，或提高多核苷酸向细胞的导入。克隆载体、表达载体、接头和连接体的使用是本领域熟知的(参见例如Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。

用于构建核酸的重组方法

使用许多本领域技术人员已知的克隆方法可从生物来源获得本发明的分离的核酸的组合物，如RNA、cDNA、基因组DNA或其任意组合。在一些实施方案中，与本发明的多核苷酸在严格条件下选择性杂化的寡核苷酸探针被用于在cDNA或基因组DNA文库中识别所需序列。RNA的分离和cDNA的构建以及基因组文库对于本领域技术人员而言是公知的(参见例如Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。

核酸的筛选和分离方法

可使用基于本发明的多核苷酸序列如本文所述的多核苷酸序列的探针来筛选cDNA或基因组文库。探针可用于与基因组DNA或cDNA序列杂化，以在同一生物体或不同生物体中分离同源基因。本领域技术人员将认识到，在本试验中可采用各种严格程度的杂化；并且杂化或洗涤介质可以是严格的。随着杂化条件变为越来越严格，在探针与靶之间必须有更高程度的互补性，以发生二聚体的形成。可通过温度、离子强度、pH和部分变性溶剂如甲酰胺的存在来控制严格程度。例如，例如通过将甲酰胺浓度操作于0％-50％的范围内来改变反应物溶液的极性，从而方便地改变杂化的严格性。用于可检测的结合所需的互补程度(序列同一性)将根据杂化介质和/或洗涤介质的严格性而变化。互补程度将最佳为100％，或70％-100％，或其中的任意范围或值。然而，应理解的是，探针和引物的微小序列变化可通过降低杂化和/洗涤介质的严格性来补偿。

RNA或DNA的扩增方法是本领域熟知的，并且根据本发明，在没有进行过多实验的情况下，基于本文出现的教导和指导，可以使用这些方法。

DNA或RNA扩增的已知方法包括但不限于，聚合酶链反应(PCR)和相关扩增方法(参见例如Mullis,et al.的美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；Tabor,et al.的4,795,699和4,921,794；Innis的5,142,033；Wilson,et al.的5,122,464；Innis的5,091,310；Gyllensten,et al.的5,066,584；Gelfand,et al.的4,889,818；Silver,et al.的4,994,370；Biswas的4,766,067；Ringold的4,656,134)，以及RNA介导的扩增，其将反义RNA用于作为双链DNA合成的模板的靶序列。(Malek,et al.的美国专利号5,130,238，商品名称NASBA)，参考文献的全部内容通过引用并入本文。(参见例如Ausubel，如上；或Sambrook，同上)。

例如，可将聚合酶链反应(PCR)技术用于扩增本发明的多核苷酸序列和直接来自基因组NA或cDNA库的相关基因。PCR和其他体外扩增方法还可用于例如克隆编码待表达蛋白的核酸序列、使核酸用作用于检测样品中所需mRNA的存在的探针、用于核酸测序，或者用于其他用途。足以指导技术人员通过体内扩增方法的技术示例见于Berger，同上，Sambrook，同上，和Ausubel，同上，以及Mullis,et al.的美国专利号4,683,202(1987)；和Innis,et al.,PCR Protocols A Guide to Methods andApplications,Eds.,Academic Press Inc.,San Diego,Calif.(1990)。用于基因组PCR扩增的市售试剂盒是本领域已知的。参见例如Advantage-GC基因组PCR试剂盒(Clontech)。此外，可将例如T4基因32蛋白(BoehringerMannheim)用于提高长PCR产物的产率。

用于构建核酸的合成方法

本发明的分离的核酸也可通过已知方法由直接的化学合成来制备(参见例如Ausubel,et al.，同上)。化学合成一般产生单股寡核苷酸，可通过与互补序列杂化或者用DNA聚合酶使用单链作为模板通过聚合作用将其转化为双链DNA。本领域技术人员会认识到虽然DNA的化学合成可能限于约100或更多个碱基的序列，但是更长的序列可通过较短序列的连接来获得。

重组表达框(Expression Cassette)

本发明还提供了包含本发明的核酸的重组表达框。本发明的核酸序列，例如编码本发明抗体的cDNA或基因组序列，可用于构建重组表达框，其可以导入至少一种期望的宿主细胞中。重组表达框通常会包含本发明的多核苷酸，其与转录启动调节序列可操作地连接，它们会指导预定宿主细胞中多核苷酸的转录。异源和非异源(即内源)启动子均可用于指导本发明核酸的表达。

在一些实施方案中，充当启动子、增强子或其它元件的分离核酸可引入以非异源形式的本发明多核苷酸的适宜位置(上游、下游或在内含子中)，以上调或下调本发明多核苷酸的表达。例如，可通过突变、缺失和/或替代在体内或在体外改变内源启动子。

载体和宿主细胞

本发明还涉及包括本发明的分离的核酸分子的载体、经重组载体遗传工程改造的宿主细胞，和通过重组技术生产至少一种抗CD22抗体，如本领域公知的。参见例如Sambrook,et al.，同上；Ausubel,et al.，同上，其全部内容通过引用并入本文。

多核苷酸可任选连接至含有选择性标记物的载体，以在宿主中扩增。一般地，在沉淀物如磷酸钙沉淀物中或在与带电荷的脂质的复合物中导入质粒载体。如果载体是病毒，可使用适宜的包装细胞系在体外包装病毒，然后再导入宿主细胞。

DNA插入物应当可操作地连接适宜的启动子。表达构建体还将含有用于转录起始、终止的位点，并在转录区中含有供翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分会优选包括开始处的翻译起始和恰当位于待翻译mRNA结束处的终止密码子(例如UAA、UGA或UAG)，其中UAA和UAG是哺乳动物或真核细胞表达所优选的。

表达载体会优选但任选包括至少一种选择性标记物。此类标记物包括例如但不限于用于真核细胞培养的甲氨蝶呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR，美国专利号4,399,216；4,634,665；4,656,134；4,956,288；5,149,636；5,179,017)、氨苄青霉素、新霉素(G418)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利号5,122,464；5,770,359；5,827,739)抗性，及用于在大肠杆菌和其它细菌或原核生物培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因(上述专利的全部内容通过引用的方式并入本文)。对于上述宿主细胞适宜的培养基和条件是本领域已知的。合适的载体对于熟练技术人员会是显而易见的。将载体构建体导入宿主细胞中可通过磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它已知方法来实现。此类方法在本领域有记载，如Sambrook，同上，第1-4和16-18章；Ausubel，同上，第1、9、13、15、16章。

本发明的至少一种抗体可以以修饰形式表达，如融合蛋白，并且可以不仅包括分泌信号，还包括其他异源功能区。例如，可将额外氨基酸(特别是带电荷氨基酸)的区域添加至抗体的N端以提高纯化期间或后续操作和贮存期间在宿主细胞中的稳定性和持久性。还有，可将肽部分添加至本发明的抗体以促进纯化。此类区域可在抗体或其至少一个片段的最终制备之前除去。此类方法在许多标准实验室手册中有记载，如Sambrook，同上，第17.29-17.42和18.1-18.74章；Ausubel，同上，第16、17和18章。

本领域普通技术人员知道多种表达系统可供表达编码本发明蛋白质的核酸。

或者，本发明的核酸可以通过在含有编码本发明抗体的内源DNA的宿主细胞中的开启(通过操作)而在宿主细胞中表达。此类方法是本领域公知的，例如记载于美国专利号5,580,734，5,641,670，5,733,746和5,733,761，其全部内容通过引用的方式并入本文。

可用于生产抗体、其特定部分或变体的细胞培养物的示例是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统常常会是细胞单层的形式，尽管也可使用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。本领域已经开发了多种能够表达完整糖基化蛋白质的合适宿主细胞系，并包括COS-1(例如ATCC CRL 1650)、COS-7(例如ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如ATCC CRL-10)、CHO(例如ATCC CRL 1610)和BSC-1(例如ATCC CRL-26)细胞系、Cos-7细胞、CHO细胞、hep G2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293细胞、HeLa细胞等，它们易于获自例如美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection,Manassas,Va.)(www.atcc.org)。优选的宿主细胞包括淋巴样起源的细胞，如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞是P3X63Ag8.653细胞(ATCC登记号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞(ATCC登记号CRL-1851)。在特别优选的实施方案中，重组细胞是P3X63Ab8.653或SP2/0-Ag14细胞。

用于这些细胞的表达载体可包括一种或多种下述表达控制序列，如但不限于，复制起点；启动子(例如晚期或早期SV40启动子、CMV启动子(美国专利号5,168,062；5,385,839)、HSV tk启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(美国专利号5,266,491)、至少一种人免疫球蛋白启动子；增强子，和/或加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(例如SV40大T抗原poly A添加位点)和转录终止子序列。参见例如Ausubel et al.，同上；Sambrook，et al.，同上。对于生成本发明的核酸或蛋白质有用的其它细胞是已知的和/或可得的，例如美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录(www.atcc.org)或其它已知的或商业性的来源。

当采用真核宿主细胞时，通常将聚腺苷酸化或转录终止子序列并入载体中。终止子序列的实例是来自牛生长激素基因的聚腺苷酸化序列。还可包括用于精确剪接转录物的序列。剪接序列的实例是来自SV40的VP1内含子(Sprague,et al.,J.Virol.45:773-781(1983))。另外，如本领域已知的，可将在宿主细胞中控制复制的基因序列并入载体。

抗体的生成

如本领域所公知，本发明的至少一种抗CD22抗体可任选通过细胞系、混合细胞系、永生化细胞或永生化细胞的克隆群来生成。参见例如Ausubel,et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学的实验室指南),John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2001)；Sambrook,etal.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册),2.sup.nd Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Harlow and Lane,antibodies,a Laboratory Manual(抗体，实验室手册),Cold Spring Harbor,N.Y.(1989).Colligan,et al.,eds.,Current Protocols in Immunology(免疫学实验室指南),John Wiley&Sons,Inc.,NY(1994-2001)；Colligan et al.,Current Protocols in Protein Science(蛋白质科学的实验室指南),JohnWiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)，其全部内容通过引用的方式并入本文。

在一种方法中，通过使合适的永生化细胞系(例如骨髓瘤细胞系，如但不限于Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、＞243、P3X63Ag8.653、Sp2SA3、Sp2MAI、Sp2SS1、Sp2SA5、U937、MLA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH3T3、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEURO 2A)等，或异源骨髓瘤、其融合产物，或自其来源的任何细胞或融合细胞，或本领域已知的任何其它合适细胞系(参见例如www.atcc.org，www.lifetech.com等)与抗体生成细胞融合来生成杂交瘤，所述抗体生成细胞例如但不限于，分离的或克隆的脾、外周血、淋巴、扁桃体或含有其它免疫或B细胞的细胞，或表达重链或轻链恒定或可变或框架或CDR序列(或是作为内源或异源核酸，或作为重组体，或是内源、病毒、细菌、藻类、原核、两栖类、昆虫、爬虫类、鱼类、哺乳类、啮齿类、马、羊、山羊、绵羊、灵长类、真核的基因组DNA、cDNA、rDNA、线粒体DNA或RNA、叶绿体DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、单链、双链或三链、杂交的等或它们的任意组合)的任何其它细胞。参见例如Ausubel，同上，和Colligan,Immunology,同上，第2章，其全部内容通过引用的方式并入本文。

任何其它合适的宿主细胞也可用于表达编码本发明抗体、其特定片段或变体的异源或内源核酸。融合细胞(杂交瘤)或重组细胞可使用选择性培养条件或其它合适的已知方法来分离，并通过有限稀释或细胞分选或其它已知方法来克隆。生成具有期望特异性的抗体的细胞可通过合适的试验(例如ELISA)来选择。

本发明的抗体还可如下制备，即使用编码至少一种抗CD22抗体的核酸来提供在它们的乳中生成此类抗体的转基因动物或哺乳动物，如山羊、牛、马、绵羊等。此类动物可通过已知的方法提供。参见例如但不限于美国专利号5,827,690；5,849,992；4,873,316；5,849,992；5,994,616，5,565,362；5,304,489等，其全部内容通过引用的方式并入本文。

本发明的抗体另外可如下来制备，即使用编码至少一种抗CD22抗体的核酸来提供在植物部分中或在自其培养的细胞中生成此类抗体、特定部分或变体的转基因植物和培养的植物细胞(例如但不限于烟草和玉米)。作为一个非限制性实例，表达重组蛋白的转基因烟草叶已经成功用于例如使用诱导型启动子提供大量的重组蛋白。参见例如Cramer et al.,Curr.Top.Microbol.Immunol.240:95-118(1999)及其中引用的参考文献。还有，转基因玉米已经用于在商业性生产水平上表达哺乳动物蛋白质，其生物学活性等同于在其它重组系统生成的或自天然来源纯化的那些。参见例如Hood et al.,Adv.Exp.Med.Biol.464:127-147(1999)及其中引用的参考文献。还已从转基因植物种子大量生产抗体，包括抗体片段，如单链抗体(scFv's)，包括烟草种子和马铃薯块茎。参见例如Conrad et al.,Plant Mol.Biol.38:101-109(1998)及其中引用的参考文献。因此，本发明的抗体还可依照已知方法使用转基因植物来生成。还可参见例如Fischeret al.,Biotechnol.Appl.Biochem.30:99-108(October,1999),Ma et al.,Trends Biotechnol.13:522-7(1995)；Ma et al.,Plant Physiol.109:341-6(1995)；Whitelam et al.,Biochem Soc.Trans.22:940-944(1994)；及其中引用的参考文献。以上参考文献的全部内容通过引用的方式并入本文。

抗体的纯化

抗CD22抗体可通过公知方法从重组细胞培养物回收并纯化，方法包括但不限于蛋白A纯化、蛋白G纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。高效液相层析(“HPLC”)也可用于纯化。参见例如Colligan,Current Protocols in Immunology，或CurrentProtocols in Protein Science，John Wiley&Sons，NY，N.Y.，(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9和10章，其全部内容通过引用并入本文。

本发明的抗体包括天然纯化的产物、化学合成流程的产物和通过重组技术从真核宿主(包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)生成的产物。根据重组生产流程中采用的宿主，本发明的抗体可以是糖基化的，或者可以是未糖基化的，优选糖基化的。此类方法在许多标准实验室手册中有记载，如Sambrook，同上，第17.37-17.42章节；Ausubel，同上，第10、12、13、16、18和20章；Colligan，Protein Science，同上，第12-14章，其全部内容通过引用并入本文。

纯化的抗体可通过例如ELISA、ELISPOT、流式细胞术、免疫细胞学、分析、Sapidyne KinExA^TM动力学排阻测定法、SDS-PAGE和Western印迹，或通过HPLC分析以及通过如本文中公开的多种其它功能测定法来表征。

哺乳动物细胞中CD22抗体的克隆和表达

典型的哺乳动物表达载体含有至少一种介导mRNA转录启动的启动子元件、抗体编码序列及转录物的转录终止和聚腺苷酸化所需信号。其他元件包括增强子、Kozak序列及侧翼为RNA剪接供体和受体位点的间插序列。高效的转录可用来自SV40的早期和晚期启动子、来自逆转录病毒例如RSV、HTLVI、HIVI的长末端重复(LTRS)和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子来实现。然而，也可使用细胞元件(例如人肌动蛋白启动子)。用于实施本发明的合适的表达载体包括例如载体，如pIRES1neo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN、或pLNCX(Clonetech Labs，Palo Alto，Calif.)、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL和PMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC 67109)。可使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela293、H9和Jurkat细胞，小鼠NIH3T3和C127细胞，Cos 1、Cos 7和CV 1，鹌鹑QC1-3细胞，小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

或者，可在含有整合入染色体的基因的稳定细胞系中表达基因。与选择性标记物如dhfr、gpt、新霉素或潮霉素的共转染允许鉴定和分离转染的细胞。

所转染的基因还可扩增以表达大量所编码的抗体。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记物可用于开发携带目的基因的数百个或甚至数千个拷贝的细胞系。另一种有用的选择标记物是谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy,et al.,Biochem.J.227:277-279(1991)；Bebbington,et al.,Bio/Technology10:169-175(1992))。使用这些标记物，在选择性培养基中培养哺乳动物细胞，并选择具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有扩增的基因，其整合入染色体中。中国仓鼠卵巢(CHO)和NSO细胞常常用于抗体的生产。

CHO细胞中的克隆和表达

用T4DNA连接酶连接分离的可变和恒定区编码DNA和去磷酸化载体。然后转化大肠杆菌HB101或XL-1Blue细胞，并使用例如限制酶分析来鉴定含有插入质粒pC4中的片段的细菌。

将缺乏活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用于转染。使用Lipofectin与0.5μg质粒pSV2-neo一起转染5μg表达质粒pC4。质粒pSV2neo含有一种显性选择标记物，即来自Tn5的neo基因，其编码对一组包括G418在内的抗生素赋予抗性的酶。在补充有1μg/ml G418的α-MEM中接种细胞。2天后，将细胞用胰蛋白酶处理，并在杂交瘤克隆板(Greiner，Germany)中在补充有10、25或50ng/ml甲氨蝶呤加1μg/mlG418的α-MEM中接种。约10-14天后，将单克隆用胰蛋白酶处理，然后在6孔皮氏皿或10ml烧瓶中接种，使用不同浓度的甲氨蝶呤(50nM，100nM，200nM，400nM，800nM)。然后将在最高浓度的甲氨蝶呤中生长的克隆转移至新的6孔板，其中含有甚至更高浓度的甲氨蝶呤(1mM，2mM，5mM，10mM，20mM)。重复相同流程，直至获得在浓度100-200mM生长的克隆。例如通过SDS-PAGE和Western印迹、ELISA，或者通过反相HPLC分析来分析期望基因产物的表达。

抗CD22抗体组合物

本发明还提供了至少一种抗CD22抗体组合物，其包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或更多种其抗CD22抗体，如本文中描述的和/或如本领域已知的，以非天然存在的组合物、混合物或形式提供。此类组合物包含非天然存在的组合物，其包含抗CD22抗体氨基酸序列的至少一种或两种全长、C和/或N端缺失的变体、结构域、片段或特定变体，所述抗CD22抗体氨基酸序列选自：本文所述抗体的CDR区的70-100％连续氨基酸，或其特定片段、结构域或变体。优选的抗CD22抗体组合物包括至少一种或两种全长、片段、结构域或变体，像含有本文所述抗CD22抗体序列一部分的至少一种CDR或LBR。其他优选组合物包含40-99％的至少一种本文所述抗CD22抗体的CDR区的70-100％。所述组合物百分比以液体的或干的溶液、混合物、悬浮液、乳状液或胶体的重量、体积、浓度、容积摩尔数或质量摩尔数计，如本领域已知的或如本文中描述的。

本发明的抗CD22抗体组合物还可包含至少一种任何合适和有效量的如下组合物或药物组合物，其包含至少一种抗CD22抗体，对需要此类调控、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者(施用)，任选地还包含以下的至少一种，选自：至少一种TNF拮抗剂(例如但不限于TNF抗体或片段、可溶性TNF受体或片段、其融合蛋白，或小分子TNF拮抗剂)、抗风湿药(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、金诺芬(auranofin)、金硫代葡萄糖(aurothioglucose)、硫唑嘌呤(azathioprine)、依那西普(etanercept)、硫代苹果酸金钠(gold sodium thiomalate)、硫酸羟氯喹(hydroxychloroquinesulfate)、来氟米特(leflunomide)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine))、肌肉松弛药、麻醉药、非类固醇抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静药、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂(例如氨基糖苷(aminoglycoside)、抗真菌药、抗寄生物药、抗病毒药、碳青霉烯、头孢菌素、氟喹诺酮(flurorquinolone)、大环内酯、青霉素、磺胺、四环素、其它抗微生物剂)、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、糖尿病相关药剂、矿物质、营养物、甲状腺药剂、维生素、钙相关激素、止泻药、镇咳药、止吐药、抗溃疡药、轻泻药、抗凝血药、红细胞生成素(例如依泊亭α)、非格司亭(例如G-CSF，Neupogen)、沙莫司亭(GM-CSF，Leukine)、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制药(例如巴利昔单抗(basiliximab)、环孢霉素(cyclosporine)、达克珠单抗(daclizumab))、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调控剂、扩瞳药、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢药、有丝分裂抑制剂、放射学药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、安定药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐、他克林、哮喘药物、β激动剂、吸入的类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸钠、肾上腺素或类似物、domaseα(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。此类细胞因子的非限制性实例包括但不限于任何IL-1至IL-34。合适的剂量是本领域公知的。参见例如Wells et al.,eds.,Pharmacotherapy Handbook,2.sup.nd Edition,Appleton and Lange,Stamford,Conn.(2000)；PDRPharmacopoeia,Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000,Deluxe Edition,Tarascon Publishing,Loma Linda,Calif.(2000)，各参考文献的全部内容通过引用并入本文。

本发明抗CD22抗体化合物、组合物或组合还可包含至少一种任何合适助剂，例如但不限于稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等。药学上可接受的助剂是优选的。此类无菌溶液的非限制性实例和制备方法是本领域公知的，例如但不限于Gennaro,Ed.,Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学),18^th Edition,Mack Publishing Co.(Easton,Pa.)1990。如本领域公知的或如本文中描述，可常规选择适合抗CD22抗体、片段或变体组合物的施用模式、溶解性和/或稳定性的药学上可接受载体。

用于本发明组合物的药物赋形剂和添加剂包括但不限于蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，如糖醇(alditol)、醛糖酸、酯化的糖等；和多糖或糖聚合物)，其可以单独或组合存在，包含单独的或以重量或体积计1-99.99％组合的。示例性蛋白质赋形剂包括血清清蛋白如人血清清蛋白(HSA)、重组人清蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也能在缓冲能力上发挥功能的代表性氨基酸/抗体成分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。

适合用于本发明的碳水化合物赋形剂包括例如单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖(melezitose)、糊精-麦芽糖复合物(maltodextrin)、右旋糖酐(dextran)、淀粉等；和糖醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽醇(maltitol)、拉克替醇(lactitol)、木糖醇(xylitol)山梨醇(sorbitol)(glucitol)、肌醇等。在本发明中使用的碳水化合物赋形剂优选是甘露醇、海藻糖和棉子糖。

抗CD22抗体组合物还可包括缓冲剂或pH调节剂；通常，缓冲剂是自有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐，如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或酞酸的盐；Tris、盐酸氨丁三醇(tromethamine hydrochloride)或磷酸盐缓冲剂。本发明组合物中使用的缓冲剂优选是有机酸盐，如柠檬酸盐。

另外，本发明的抗CD22抗体组合物可包括聚合赋形剂/添加剂，如聚乙烯吡咯烷酮、Ficolls(一种聚合糖)、葡萄糖结合剂(例如环糊精，如2-羟基丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、增味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨酯如“TWEEN 20”和“TWEEN80”)、脂质(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)和螯合剂(例如EDTA)。

这些和其他适合于在本发明的抗CD22抗体、部分或变体组合物中使用的已知药物赋形剂和/或添加剂是本领域已知的，例如"Remington:The Science&Practice of Pharmacy",19.sup.th ed.,Williams&Williams,(1995),and in the"Physician's Desk Reference",52^nd ed.,MedicalEconomics,Montvale,N.J.(1998)中所列，其全部公开内容通过引用并入本文。优选的载体或赋形剂材料是碳水化合物(例如糖和糖醇)和缓冲剂(例如柠檬酸盐)或聚合剂。

制剂

同上所述，本发明提供了在药学上可接受的制剂中包含至少一种抗CD22抗体的稳定制剂，其优选为含盐水或选择的盐的磷酸盐缓冲液，以及含有防腐剂的防腐溶液和制剂以及适合于药学或兽医用途的多用途防腐制剂。防腐制剂含有至少一种抑制防腐剂或任选选自水性稀释剂中的下组：至少一种酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(例如六水合物)、对羟基苯甲酸烃基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或其混合物。可使用本领域已知的任何合适浓度或混合物，如0.001-5％，或其中的任何范围或数值，例如但不限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或其中的任何范围或数值。非限制性实例包括无防腐剂，0.1-2％间甲酚(例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％)，0.1-3％苯甲醇(例如0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)，0.001-0.5％硫柳汞(例如0.005，0.01)，0.001-2.0％苯酚(例如0.05，0.25，0.28，0.5，0.9，1.0％)，0.0005-1.0％对羟基苯甲酸烃基酯(例如0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)等。

同上所述，本发明提供了制品，其包含包装材料和至少一个管形瓶，其中装有至少一种抗CD22抗体及指定缓冲剂和/或防腐剂的溶液(任选在水性稀释剂中)，其中所述包装材料包含标签，其指明此类溶液可保存1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小时或更久的时段。本发明还包括一种制品，其包含包装材料、装有冻干的至少一种抗CD22抗体的第一管形瓶和装有指定缓冲剂或防腐剂的水性稀释剂的第二管形瓶，其中所述包装材料包含标签，其指示患者在水性稀释剂中重建至少一种抗CD22抗体以形成能保存24小时或更久的时段的溶液。

依照本发明使用的至少一种抗CD22抗体可以通过重组手段来生产，包括从哺乳动物细胞或转基因制备物，或者可以自其它生物来源纯化，如本文中描述的或如本领域已知的。

本发明的产品中至少一种抗CD22抗体的范围包括重建后产生的量，如果在湿/干体系中，为约1.0μg/ml至约1000mg/ml的浓度，尽管更低或更高的浓度是可行的且取决于预定的递送媒介，例如溶液制剂会不同于透皮贴剂、肺、经粘膜或渗透或微量泵方法。

优选的是，水性稀释剂还任选地包含药学上可接受的防腐剂。优选的防腐剂包括以下防腐剂：酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烃基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或其混合物。制剂中使用的防腐剂的浓度为足以产生抗微生物效果的浓度。该浓度取决于所选择的防腐剂，而且是熟练技术人员易于确定的。

可将其它赋形剂，例如等张剂、缓冲剂、抗氧化剂、防腐增效剂，任选和优选地添加至稀释剂。通常以已知浓度使用等张剂，如甘油。优选添加生理学耐受的缓冲剂以提供改良的pH控制。制剂可覆盖较宽范围的pH，如约pH 4至约pH 10，和约pH 5至约pH 9的优选范围，和约6.0至约8.0的最优选范围。优选的是，本发明的制剂具有介于约6.8和约7.8之间的pH。优选的缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂，最优选磷酸钠，特别是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

其它添加剂，如药学上可接受的增溶剂，像Tween 20(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)、Tween 40(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单棕榈酸酯)、Tween 80(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯)、Pluronic F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇)或非离子型表面活性剂如聚山梨酯20或80或Poloxamer 184或188、Pluronic.RTM.polyls、其它嵌段共聚物和螯合剂如EDTA和EGTA可任选添加至制剂或组合物以降低聚集。如果使用泵或塑料容器来施用制剂的话，这些添加剂是特别有用的。药学上可接受的表面活性剂的存在降低蛋白质聚集的倾向。

本发明的制剂可通过如下过程来制备，其包括在水性稀释剂中混合至少一种抗CD22抗体和选自下组的防腐剂：酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烃基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或其混合物。在水性稀释剂中混合至少一种抗CD22抗体和防腐剂是使用常规溶解和混合流程来进行的。为了制备稳定的制剂，例如，以足以提供期望浓度的蛋白质和防腐剂的量将缓冲溶液中实测量的至少一种抗CD22抗体与缓冲溶液中期望的防腐剂组合。本领域普通技术人员会领会这种过程的变化。例如，成分的添加次序、是否使用另外的添加剂、制备制剂的温度和pH都是可以为所使用的浓度和施用手段进行优化的因素。

要求保护的制剂可作为清澈溶液或作为双管形瓶提供给患者，所述双管形瓶中包含一管冻干的至少一种抗CD22抗体，其用容纳有水、水性稀释剂中的防腐剂和/或赋形剂优选磷酸盐缓冲液和/或盐水和选择的盐的第二管形瓶重建)。单一溶液管形瓶或需要重建的双管形瓶均能多次再使用，而且能满足单个或多个周期的患者治疗，并因此能提供比当前可得的要更加方便的治疗方案。

本发明要求保护的制品有利于在即刻至24小时或更久的时段给药。因而，本发明要求保护的制品给患者提供显著优势。本发明的制剂可任选安全地贮存于约2℃至约40℃的温度，并在较长的时间段保留蛋白质的生物学活性，如此容许包装标签指明溶液可以在6、12、18、24、36、48、72或96小时或更久的时段上保存和/或使用。如果使用防腐稀释剂，此类标签可包括长达1-12个月、半年、1年半和/或两年的使用。

本发明的至少一种抗CD22抗体的溶液可通过如下过程来制备，其包括在水性稀释剂中混合至少一种抗体。混合是使用常规溶解和混合过程来进行的。为了制备合适的稀释剂，例如，以足以提供期望浓度的蛋白质和任选防腐剂或缓冲剂的量组合水或缓冲液中实测量的至少一种抗体。本领域普通技术人员会领会这种过程的变化。例如，成分的添加次序、是否使用另外的添加剂、制备制剂的温度和pH都是可以为所使用的浓度和施用手段进行优化的因素。

要求保护的产品可作为清澈溶液或作为双管形瓶提供给患者，所述双管形瓶包括一管冻干的至少一种抗CD22抗体，其用容纳有水性稀释剂的第二管形瓶重建。单一溶液管形瓶或需要重建的双管形瓶均能多次再使用，而且能满足单个或多个周期的患者的治疗，并因此能提供比当前可使用的要更加方便的治疗方案。

通过给药房、诊所或其它此类机构和单位提供清澈溶液或作为双管形瓶(其包括一管冻干的至少一种抗CD22抗体，其用容纳有水性稀释剂的第二管形瓶重建)，可将要求保护的产品间接提供给患者。这种情况中的清澈溶液的体积可多达1升或甚至更大，提供一个大储库，自其可一次或多次取得至少一种抗体溶液的较小部分以转移入较小的管形瓶中，并由药房或诊所提供给它们的客户和/或患者。

包含这些单一管形瓶系统的公认装置包括那些用于递送溶液的笔式喷射器装置，如BD Pens、BD Autojector.RTM.、Humaject.RTM.、NovoPen.RTM.、B-D.RTM.Pen、AutoPen.RTM.和OptiPen.RTM.、GenotropinPen.RTM.、Genotronorm Pen.RTM.、Humatro Pen.RTM.、Reco-Pen.RTM.、Roferon Pen.RTM.、Biojector.RTM.、iject.RTM.、J-tipNeedle-Free Injector.RTM.、Intraject.RTM.、Medi-Ject.RTM.，例如由BectonDickensen(Franklin Lakes,N.J.,www.bectondickenson.com),Disetronic(Burgdorf,Switzerland,www.disetronic.com；Bioject,Portland,Oreg.(www.bioject.com)；National Medical Products,Weston Medical(Peterborough,UK,www.weston-medical.com),Medi-Ject Corp(Minneapolis,Minn.,www.mediject.com)生产或开发的。包含双管形瓶系统的公认装置包括那些用于重建弹药筒(cartridge)中的冻干药物，用于递送重建的溶液的笔式喷射器系统，如HumatroPen.RTM。

当前要求保护的产品包括包装材料。除了监管机构要求的信息之外，包装材料还提供可使用该产品的状况。对于两个管形瓶的湿的/干的产品，本发明的包装材料给患者提供在水性稀释剂中重建至少一种抗CD22抗体以形成溶液及在2-24小时或更久的时段里使用该溶液的指导。对于单一管形瓶溶液产品，标签指明此类溶液可以在2-24小时或更久的时段里使用。当前要求保护的产品对于人类药学产品用途是有用的。

本发明的制剂可通过如下过程来制备，其包括混合至少一种抗CD22抗体和选择的缓冲剂，优选含有盐水或选择的盐的磷酸盐缓冲剂。在水性稀释剂中混合至少一种抗体和缓冲剂是使用常规溶解和混合流程来进行的。为了制备合适的制剂，例如，以足以提供期望浓度的蛋白质和缓冲剂的量将水或缓冲液中实测量的至少一种抗体与水中期望的缓冲剂组合。本领域普通技术人员会领会这种过程的变化。例如，成分的添加次序、是否使用另外的添加剂、制备制剂的温度和pH都是可以为所使用的浓度和施用手段进行优化的因素。

要求保护的稳定或防腐的制剂可作为清澈溶液或作为双管形瓶提供给患者，所述双管形瓶包括一管冻干的至少一种抗CD22抗体，其用容纳有水性稀释剂中的防腐剂或缓冲剂和赋形剂的第二管形瓶重建。单一溶液管形瓶或需要重建的双管形瓶均能多次再使用，而且能满足单个或多个周期的患者的治疗，并因此能提供比当前可利用的要更加方便的治疗方案。

本文中描述的稳定或防腐的制剂或溶液中的至少一种抗CD22抗体可依照本发明经多种递送方法包括SC或IM注射施用于患者；经皮、肺、经粘膜、植入物、渗透泵、弹药筒、微量泵或熟练技术人员知晓的其它手段，如本领域公知的。

治疗应用

CD22是Siglec唾液酸结合蛋白受体超家族的一员，其以高度特异性方式在发展中的B细胞上和各种B细胞癌症包括淋巴瘤和急性与慢性淋巴细胞白血病上表达(Crocker et al,Nature Reviews Immunology 7,255-266,2007)。已发现抗CD22抗体负向调节CD22表达B细胞的生长，并涉及多种疾病的治疗。临床试验中已测试患有B细胞依赖性自身免疫疾病的患者和患有CD22表达血液癌症的患者中的CD22抗体。某些抗体已显示诱导CD22的酪氨酸磷酸化，其是刺激阻断细胞复制的负向生长信号的过程。另外，已显示CD22抗体在胞内分泌途径和溶酶体内被内化。因此，具有有效负向生长调节特性并被快速内化的对CD22具有高亲和力的人抗体会希望用于CD22相关疾病，如血液癌症、SLE、类风湿性关节炎、多发性硬化症以及其他B细胞依赖性自身免疫疾病。抗CD22抗体或这些单抗的任何衍生物(包括嵌合或人源化的)或片段可用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤、其他淋巴瘤和淋巴增生性病症、急性和慢性淋巴细胞性白血病和CD22所涉及的其它疾病。这些抗体可作为单一药剂或与其它治疗剂组合使用。它们还可以与其他肿瘤免疫调控剂如IL-2、IL-12和/或IFNα组合使用。另外，抗CD22抗体可以与其它单克隆抗体如抗TNF-α、IL-12/IL-23、IL-2、GpIIb/IIIa受体、CD52、CD20、RSV蛋白、HER2/neu受体等；以及与得到商业批准的抗体包括Rituxan、Herceptin、Mylotarg、Campath、Zevalin、Bexxar、Erbitux、Avastin和Vectibix组合使用。

这些抗体可作为单一药剂或与其它治疗剂组合使用。它们还可以与其他肿瘤免疫调控剂如IL-2、IL-12和/或IFNα组合使用。另外，抗CD22抗体可以与其它单克隆抗体如抗TNF-α、IL-12/IL-23、IL-2、GpIIb/IIIa受体、CD52、CD20、RSV蛋白、HER2/neu受体等；以及与得到商业批准的抗体包括Rituxan、Herceptin、Mylotarg、Campath、Zevalin、Bexxar、Erbitux、Avastin和Vectibix组合使用。

如此，本发明还提供了用于在细胞、组织、器官、动物或患者中调控或治疗至少一种CD22相关疾病的方法，如本领域已知的或如本文中描述的，其使用本发明的至少一种抗CD22抗体。

已知CD22在B细胞癌症和异型增生中高水平表达，并可调节涉及诱导恶性细胞凋亡的自分泌或旁分泌机制。高水平表达CD22的B细胞癌症包括但不限于弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBC)、滤泡性淋巴瘤、急性和慢性B细胞淋巴细胞性白血病(ALL/CLL)、粘膜相关淋巴系统淋巴瘤(MALT)、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和其他淋巴浆细胞增殖(WHO肿瘤分类,2001)。抗CD22抗体因此可以用于单独或与其他化学疗法和B细胞靶向生物疗法组合治疗这些疾病。另外，涉及B细胞产生的自身抗体形成的其他B细胞依赖性自身免疫疾病为例如系统性红白浪船(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)的疾病，其可以用抗CD22抗体来治疗。

通过抗CD22单抗在体外和体内对肿瘤生长的抑制效果，使针对CD22的抗体调控肿瘤细胞存活和疾病进展的能力得到了证实。据报道，某些抗CD22抗体与CD22表达淋巴细胞的结合可抑制体外生长(Stein etal Epitope specificity of the anti-B-cell lymphoma monoclonal antibody,LL2.Cancer Immunol.Immunother.,37:293,1993)。可使鼠抗CD22单抗(原称EPB-2，现称为LL2)人源化，并用于成像和治疗NHL或慢性淋巴细胞白血病。免疫组织学研究揭示，LL2与几乎所有例NHL(包括弥漫性和结节性)、低分化淋巴细胞淋巴瘤和组织细胞大细胞淋巴瘤起反应。LL2具有高度严格特异性，仅与正常淋巴结生发中心的B细胞群和白脾髓反应，而不与骨髓中的巨核细胞、髓细胞或类红细胞反应。此外，LL2不与任何外周血细胞包括血的正常B细胞或任何其他正常组织反应。LL2还具有与其靶抗原相关的其他特性，将其与其他抗B细胞淋巴瘤抗体区分。体外研究已清楚表明，LL2在与Raji淋巴瘤细胞系表面上的其CD22靶抗原结合后被内化，并且抗原在细胞表面快速重新表达。人源化的鼠单克隆抗体(称为依帕珠单抗)对人淋巴瘤细胞系具有免疫调节和生长调节作用(Carnahan et al.,Molecular Immunology 44:1331,2007)al.2001)。

抗CD22单克隆抗体

CD22还可以是恶性肿瘤的预后因子和标志物。在几乎所有淋巴瘤以及大多数ALL和CLL B细胞淋巴瘤中CD22以高水平表达。经CD20靶治疗抗体利妥昔治疗后，CD22表达提高，这表明CD22靶抗体可用于治疗利妥昔单抗耐药与复发患者(Micallef et al.,Blood 118:4053,2011)。

CD22被假设是癌症相关发病如虚弱/恶病质和骨再吸收中的病因因素。发现肿瘤诱导的恶病质(Cahlin et al.2000)和骨再吸收(后续高钙血症)(Sandhu et al.1999)在CD22敲除小鼠中降低。已经将脑瘤继发的癌症相关抑郁和脑水肿与高水平CD22联系起来(Musselman et al.2001)。本发明的抗CD22抗体还能在裸鼠中抑制人黑素瘤和人前列腺癌诱导的恶病质。

本发明包括用于调控或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中至少一种恶性疾病的方法，所述恶性疾病包括但不限于以下至少一种：非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤、白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、B细胞、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和毛细胞白血病。通过在施用此类CD22抗体之前、并行或之后施用，此类方法可任选与放射疗法、抗血管发生剂、化疗剂、法尼基转移酶抑制剂等组合使用。

本发明还提供了用于调控或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中至少一种CD22介导的免疫相关疾病的方法，所述免疫相关疾病包括但不限于以下至少一种：类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、系统发作幼年型类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、胃溃疡、血清阴性关节病、骨关节炎(asteoarthritis)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、抗磷脂综合征、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、特发性肺纤维化、系统性血管炎/韦格纳(Wegener)氏肉芽肿病、结节病、睾丸炎/输精管切除逆转术、变应性/特应性疾病、哮喘、变应性鼻炎、湿疹、变应性接触性皮炎、变应性结膜炎、超敏感性肺炎、移植物、器官移植物排斥、移植物抗宿主病、全身炎症反应综合征、脓毒病综合征、革兰氏阳性脓毒病、革兰氏阴性脓毒病、培养物阴性脓毒病、真菌性脓毒病、中性白细胞减少性发热、尿脓毒病、脑膜炎球菌血症、外伤/出血、烧伤、电离辐射暴露、急性胰腺炎、成人呼吸窘迫综合征、类风湿性关节炎、酒精诱发的肝炎、慢性炎性病理、结节病、克罗恩(Crohn)氏病理、镰状细胞贫血、糖尿病、肾病、特应性疾病、超敏感性反应、变应性鼻炎、枯草热、常年性鼻炎、结膜炎、子宫内膜异位症、哮喘、荨麻疹、系统性过敏反应、皮炎、恶性贫血、溶血性疾病、血小板减少、任何器官或组织的移植物排斥、肾移植物排斥、心移植物排斥、肝移植物排斥、胰移植物排斥、肺移植物排斥、骨髓移植物(BMT)排斥、皮肤同种异体移植物排斥、软骨移植物排斥、骨移植物排斥、小肠移植物排斥、胎儿胸腺植入物排斥、甲状旁腺移植物排斥、任何器官或组织的异种移植物排斥、同种异体移植物排斥、抗受体超敏感性反应、格雷夫斯(Graves)氏病、雷诺(Raynoud)氏病、B型胰岛素抗性糖尿病、哮喘、重症肌无力、抗体介导的细胞毒性、III型超敏感性反应、系统性红斑狼疮、POEMS综合征(多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤变化综合征)、多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤变化综合征、抗磷脂综合征、天疱疮、硬皮病、混合性结缔组织病、特发性阿狄森(Addison)氏病、糖尿病、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、白癜风、血管炎、MI心切开术后综合征、IV型超敏感性、接触性皮炎、超敏感性肺炎、同种异体移植物排斥、细胞内生物体所致肉芽肿、药物敏感性、代谢的/特发性的、威尔逊(Wilson)氏病、血色病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、糖尿病、桥本(Hashimoto)氏甲状腺炎、骨质疏松症、下丘脑-垂体-肾上腺轴评估、原发性胆汁性肝硬化、甲状腺炎、脑脊髓炎、恶病质、囊性纤维化病、新生儿慢性肺病、慢性阻塞性肺病(COPD)、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增生症、皮肤病学病症、银屑病、脱发、肾病综合征、肾炎、肾小球肾炎、急性肾衰竭、血液透析、尿毒症、毒性反应、先兆子痫、okt3疗法、抗cd3疗法、细胞因子疗法、化学疗法、放射疗法(例如包括但不限于虚弱、贫血、恶病质等)、慢性水杨酸盐中毒、睡眠呼吸暂停、肥胖症、心力衰竭、窦炎、炎性肠病等。参见例如the Merck Manual,12th-17th Editions,Merck&Company,Rahway,N.J.(1972,1977,1982,1987,1992,1999)，Pharmacotherapy Handbook,Wells et al.,eds.，Second Edition,Appleton and Lange,Stamford,Conn.(1998,2000)，各文献的全部内容通过引用收录。

治疗处理

本发明的任何方法可包含用于治疗CD22介导的病症的方法，包括对需要此类调控、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者施用有效量的包含至少一种抗CD22抗体的组合物或药物组合物。此类方法可任选进一步包括用于治疗此类免疫疾病的共施用或组合疗法，其中施用所述至少一种抗CD22抗体、其特定部分或变体进一步包括在之前、并行和/或之后施用至少一种上文所述药剂。

通常，病理状况的治疗通过施用有效量或有效剂量的至少一种抗CD22抗体组合物来实现，总共平均范围为至少约0.01至500mg至少一种抗CD22抗体每千克患者每剂，和优选至少约0.1至100mg抗体/千克患者每单次或多次施用，这取决于组合物中所含的比活性。或者，有效血清浓度可包含0.1-5000.mu.g/ml血清浓度每单次或多次施用。合适的剂量是医学从业人员已知的，而且当然会取决于具体的疾病状态、所施用的组合物的比活性和接受治疗的具体的患者。在一些情况中，为了实现期望的治疗量，可能需要提供重复施用，即重复各次施用特定监控或计量的剂量，其中重复各次施用直至实现期望的日剂量或效果。

优选的剂量可任选包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和/或100-500mg/kg/施用，或其任何范围、数值或分数，或每单次或多次施用以实现0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、4.9、5.0、5.5.、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、1.6、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500和/或5000μg/ml的血清浓度，或其任何范围、数值或分数的血清浓度。

或者，施用的剂量可随已知的因素而变化，如具体药剂的药效学特征及其施用模式和途径；接受者的年龄、健康状况和体重；症状的性质和程度、并行治疗的种类、治疗的频率和期望的效果。通常，活性组分的剂量可以是约0.1至100mg每千克体重。通常，每次施用0.1至50，优选0.1至10mg每千克体重或以持续释放形式给药以有效获得期望的结果。

作为非限制性实例，人类或动物的治疗可作为一次性或周期性剂量(periodic dosage)的至少一种本发明抗体来提供，所述剂量为0.1至100mg/kg，如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg每日，持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天，或者或另外至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52周，或者或另外至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20年，或其任意组合，使用单一、输注或重复剂量。

适合于内部施用的剂量形式(组合物)一般含有每单位或容器约0.1mg至约500mg活性成分。在这些药物组合物中，活性成分通常会以基于组合物的总重以重量计约0.5-99.999％的量存在。

胃肠外制剂与施用

为了胃肠外给药，可将抗体配制成溶液、悬浮液、乳剂或冻干粉末，其与药学上可接受的胃肠外媒介联合或分开提供。此类媒介的实例是水、盐水、林格(Ringer)氏溶液、右旋糖(dextrose)溶液和1-10％人血清清蛋白。脂质体和非水性媒介如不挥发性油也可使用。媒介或冻干粉末可含有维持等张性(例如氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如缓冲剂和防腐剂)的添加剂。制剂通过已知的或合适的技术来灭菌。

合适的药物载体记载于最新版的Remington’s PharmaceuticalSciences,A.Osol，它是本领域的标准参考书。

用于胃肠外给药的制剂可含有无菌水或盐水、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油、氢化萘等作为常规赋形剂。用于注射的水性或油性悬浮液可通过依照已知方法使用适宜的乳化剂或增湿剂和悬浮剂来制备。用于注射的药剂可以是无毒、非口服施用的稀释剂，如水性溶液或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。作为可使用的媒介或溶剂，水、林格(Ringer)氏溶液、等张盐水等是容许的；作为普通溶剂或悬浮溶剂，可使用无菌不挥发性油。为了这些目的，可使用任何种类的不挥发性油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成甘油单或二或三酯。胃肠外给药是本领域已知，而且包括但不限于常规的注射手段、气体加压无针头注射装置如美国专利号5,851,198中记载的，和激光射孔器装置如美国专利号5,839,446中记载的，其全部内容通过引用并入本文。

备选递送

本发明进一步涉及通过胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内(intracelebellar)、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、含服、舌下、鼻内或经皮手段来施用至少一种抗CD22抗体。可制备至少一种抗CD22抗体组合物供用于胃肠外(皮下、肌内或静脉内)或任何其它施用，特别是液体溶液或悬浮液的形式；用于阴道或直肠施用，特别是半固体的形式，例如但不限于乳膏剂和栓剂；用于含服或舌下施用，例如但不限于片剂或胶囊剂的形式；或鼻内，例如但不限于粉剂、滴鼻剂或气雾剂或某些药剂的形式；或经皮，例如但不限于凝胶剂、软膏剂、洗剂、悬浮液或贴剂递送系统，其具有化学增效剂如二甲亚砜来改变皮肤结构或提高透皮贴剂中的药物浓度(Junginger,et al.In"Drug PermeationEnhancement"；Hsieh,D.S.,Eds.,pp.59-90,Marcel Dekker,Inc.New York1994,其全部内容通过引用并入本文)，或具有氧化剂，其能够将含有蛋白质和肽的制剂应用到皮肤上(WO 98/53847)，或应用电场来创建瞬时运输途径，如电穿孔，或提高带电荷药物穿过皮肤的移动性，如离子电渗，或应用超声波，如超声促渗(美国专利号4,309,989和4,767,402)(通过引用将上述出版物和专利完整收入本文)。

肺/鼻施用

为了肺施用，以有效到达肺或窦的下气道的粒度递送优选至少一种抗CD22抗体。依照本发明，至少一种抗CD22抗体可通过本领域已知用于通过吸入来施用治疗剂的多种吸入或鼻腔装置中的任一种来递送。这些能够在患者的窦腔或肺泡中沉积气雾化制剂的装置包括计量吸入器、雾化器、干粉生成器、喷雾器等。适合于指导抗体的肺或鼻施用的其它装置也是本领域已知的。所有此类装置可使用适合于施用的制剂，用于在气雾剂中分配抗体。此类气雾剂可包含溶液(水性的和非水性的二者)或固体颗粒。计量吸入器像Ventolin.RTM.计量吸入器通常使用推进气体且需要在吸气期间开启(参见例如WO 94/16970，WO 98/35888)。干粉吸入器像Turbuhaler.TM.(Astra)、Rotahaler.RTM.(Glaxo)、Diskus.RTM.(Glaxo)、Spiros.TM.吸入器(Dura)、由Inhale Therapeutics销售的装置、和Spinhaler.RTM.粉剂吸入器(Fisons)使用混合粉剂的呼吸开启(美国专利号4,668,218Astra，EP 237507Astra，WO97/25086Glaxo，WO 94/08552Dura，美国专利号5,458,135Inhale，WO94/06498Fisons，其全部内容通过引用并入本文)。雾化器像AERx.TM.Aradigm、Ultravent.RTM.雾化器(Mallinckrodt)和Acorn II.RTM.雾化器(MarquestMedical Products)(美国专利号5,404,871Aradigm，WO 97/22376)(通过引用将上述参考文献完整并入本文)自溶液生成气雾剂，而计量吸入器、干粉吸入器等产生小颗粒气雾剂。这些市售吸入装置的具体实例意图代表适合于实施本发明的具体装置，并非意图限制本发明的范围。优选的是，包含至少一种抗CD22抗体的组合物通过干粉吸入器或喷雾器来递送。用于施用至少一种本发明抗体的吸入装置有数项期望特征。例如，有利的是，通过吸入装置进行的递送是可靠，可再现且精确的。为了较好地适于呼吸，吸入装置能任选运送小的干的颗粒，例如小于约10μm，优选约1-5μm的颗粒。

CD22抗体组合物作为喷雾的施用

包括CD22抗体组合物蛋白质的喷雾可以通过在压力下迫使至少一种抗CD22抗体的悬浮液或溶液穿过喷嘴来生成。可选择喷嘴尺寸和构造、应用的压力和液体进料速率来实现期望的输出和粒度。电子喷雾可通过例如与毛细或喷嘴进料联合的电场来生成。有利地是，通过喷雾器递送的至少一种抗CD22抗体组合物蛋白质具有小于约10μm，优选约1μm至约5μm且最优选约2μm至约3μm范围的粒度。

适合于与喷雾器使用的至少一种抗CD22抗体组合物蛋白质的制剂通常包括水性溶液中的抗体组合物蛋白质，其浓度为每ml溶液或mg/gm约0.1mg至约100mg至少一种抗CD22抗体组合物蛋白质，或该范围内的任何范围或数值，例如但不限于0.1、0.2.、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/ml或mg/gm。制剂可包括如赋形剂、缓冲剂、等张剂、防腐剂、表面活性剂和优选的锌等药剂。制剂还可包括赋形剂或用于稳定抗体组合物蛋白质的药剂，如缓冲剂、还原剂、填充蛋白或碳水化合物。在配制抗体组合物蛋白质中有用的填充蛋白包括清蛋白、鱼精蛋白等。在配制抗体组合物蛋白质中有用的典型碳水化合物包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。抗体组合物蛋白质制剂还可包括表面活性剂，其能降低或阻止表面诱导的抗体组合物蛋白质聚集，其是由形成气雾剂时溶液的雾化引起的。可采用各种常规表面活性剂，如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。量的范围一般会介于以制剂的重量计0.001和14％之间。为了本发明的目的尤其优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯、聚山梨酯80、聚山梨酯20等。本领域已知用于配制蛋白质如CD22抗体或特定部分或变体的其他药剂也可包括在制剂中。

CD22抗体组合物通过雾化器的施用

抗体组合物蛋白质可通过雾化器，如喷射雾化器或超声雾化器来施用。通常，在喷射雾化器中，使用加压气体源来产生高速气体喷射穿过喷口。随着气体离开喷嘴膨胀，产生低压区，其吸引抗体组合物蛋白质的溶液穿过连接液体储库的毛细管。随着它离开管，来自毛细管的液体流被剪切成不稳定的细丝和小滴，产生气雾剂。可采用一定范围的构造、流速和挡板类型以实现来自给定的喷射雾化器的期望的性能特征。在超声雾化器中，使用高频电能来产生震动能、机械能，通常采用压电换能器。这种能被直接地或经由耦合液传递给抗体组合物蛋白质的制剂，产生包括抗体组合物蛋白质的气雾剂。有利的是，通过雾化器递送的抗体组合物蛋白质的颗粒具有小于约10μm，优选约1μm至约5μm且最优选约2μm至约3μm范围的粒度。

适合于与雾化器(喷射的或超声的任一种)使用的至少一种抗CD22抗体的制剂通常包括每ml溶液约0.1mg至约100mg的至少一种抗CD22抗体蛋白质的浓度。制剂可包括如赋形剂、缓冲剂、等张剂、防腐剂、表面活性剂和优选的锌等药剂。制剂还可包括赋形剂或用于稳定至少一种抗CD22抗体组合物蛋白质的药剂，如缓冲剂、还原剂、填充蛋白或碳水化合物。在配制至少一种抗CD22抗体组合物蛋白质中有用的填充蛋白包括清蛋白、鱼精蛋白等。在配制至少一种抗CD22抗体中有用的典型碳水化合物包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。至少一种抗CD22抗体制剂还可包括表面活性剂，其能降低或阻止表面诱导的至少一种抗CD22抗体聚集，其是由形成气雾剂时溶液的雾化引起的。可采用各种常规表面活性剂，如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，和聚氧乙烯山梨醛(sorbital)脂肪酸酯。量的范围一般会介于以制剂的重量计0.001和4％之间。为了本发明的目的尤其优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯、聚山梨酯80、聚山梨酯20等。本领域已知用于配制蛋白质如抗体蛋白质的其他药剂也可包括在制剂中。

通过计量吸入器施用CD22抗体组合物

在计量吸入器(MDI)中，推进剂、至少一种抗CD22抗体和任何赋形剂或其它添加剂作为包括液化压缩气体的混合物装在罐中。计量阀的开启释放作为气雾剂的管芯混合物，其优选含有尺寸范围小于约10μm、优选约1μm至约5μm且最优选约2μm至约3μm的颗粒。期望的气雾剂粒度可通过采用以本领域技术人员已知的各种技术包括喷射-研磨、喷雾干燥、临界点冷凝等生产的抗体组合物蛋白质制剂来获得。优选的计量吸入器包括那些由3M或Glaxo制造及采用含氟烃推进剂的剂量吸入器。

与计量吸入器装置一起使用的至少一种抗CD22抗体制剂一般会包括含有至少一种抗CD22抗体的精细粉末，作为非水性介质中的悬浮液，例如在表面活性剂的帮助下悬浮在推进剂中。推进剂可以是用于此目的的任何常规材料，如氯氟烃(chlorofluorocarbon)、氢氯氟烃(hydrochlorofluorocarbon)、氢氟烃(hydrofluorocarbon)或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二四氟乙烷和1,1,1,2-四氟乙烷、HFA-134a(氢氟烷-134a)、HFA-227(氢氟烷-227)等。优选的是，推进剂是氢氟烃。可选择表面活性剂来稳定作为推进剂中悬浮液的至少一种抗CD22抗体，以保护活性剂免受化学降解等。合适的表面活性剂包括山梨聚糖三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。在一些情况中，优选溶液气雾剂，其使用如乙醇等溶剂。本领域已知用于配制蛋白质的其他试剂也可包括在制剂中。

本领域普通技术人员会认识到，本发明的方法可通过经本文中未描述的装置肺部施用至少一种抗CD22抗体组合物来实现。

口服制剂与施用

用于口服施用的制剂依赖于共施用佐剂(例如间苯二酚和非离子型表面活性剂如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚)来人为提高肠壁的通透性，以及共施用酶抑制剂(例如胰脏胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸酯(DFF)和特斯乐(trasylol))来抑制酶促降解。用于口服施用的固体型剂量形式的活性组分化合物可混合至少一种添加剂，包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖醇、右旋糖酐(dextran)、淀粉、琼脂、精氨酸盐、甲壳质、壳聚糖、果胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、明胶、胶原、酪蛋白、清蛋白、合成或半合成聚合物和甘油酯。这些剂量形式还可含有其它类型的添加剂，例如无活性的稀释剂，润滑剂如硬脂酸镁、对羟基苯甲酸酯，防腐剂如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚，抗氧化剂如半胱氨酸，崩解剂，粘合剂，增稠剂，缓冲剂，甜味剂，增味剂，增香剂等。

片剂和丸剂可进一步加工成包有肠溶衣的制剂。用于口服施用的液体制剂包括容许医疗用途的乳剂、糖浆剂、酏剂、悬浮剂和溶液制剂。这些制剂可含有所述领域常规使用的无活性稀释剂，例如水。脂质体也有记载作为胰岛素和肝素的药物递送系统(美国专利号4,239,754)。最近，混合氨基酸的人造聚合物(类蛋白质)的微球体已经用于递送药剂(美国专利号4,925,673)。另外，本领域已知美国专利No，5,879,681和美国专利号5,5,871,753中记载的载体化合物用于口服递送生物活性药剂。

粘膜制剂与施用

对于穿过粘膜表面的吸收，施用至少一种抗CD22抗体的组合物和方法包括乳剂，其包含多个亚微米颗粒、粘膜附着性大分子、生物活性肽和水性连续相，通过实现乳剂颗粒的粘膜附着来促进穿过粘膜表面的吸收(美国专利号5,514,670)。适合于应用本发明乳剂的粘膜表面可包括角膜、结膜、口腔、舌下、鼻、阴道、肺、胃、肠和直肠给药途径。用于阴道或直肠给药的制剂(例如栓剂)可含有例如聚亚烷基二醇、凡士林、可可脂等作为赋形剂。用于鼻内给药的制剂可以是固体且含有例如乳糖作为赋形剂，或者可以是水性或油性溶液滴鼻剂。对于含服给药，赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预凝胶化(pregelinatined)淀粉等(美国专利号5,849,695)。

经皮制剂与施用

对于经皮给药，将至少一种抗CD22抗体封装在递送装置中，如脂质体或聚合纳米颗粒、微粒、微胶囊或微球体(除非另有说明，统称为微粒)。许多合适的装置是已知的，包括由合成聚合物，例如聚羟基酸如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物、聚正酯、聚酐和聚磷腈，及天然聚合物如胶原、多聚氨基酸、清蛋白和其它蛋白质、藻酸盐和其它多糖，及其组合(美国专利号5,814,599)制成的微粒。

长期给药与制剂

有时可能希望自单次施用在长期时间段例如1周至1年的时间段里将本发明的化合物递送至个体。可使用多种缓慢释放、贮库(depot)或植入物剂量形式。例如，剂量形式可含有化合物的药学上可接受的无毒盐，其在体液中具有低度的溶解度，例如(a)与多元酸如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、单宁酸、帕莫酸、海藻酸、多聚谷氨酸、萘单或二磺酸、多聚半乳糖醛酸等的酸加成盐；(b)与多价金属阳离子如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等或者与由例如N,N′-二苄基-乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子的盐；或(c)(a)和(b)的组合，例如单宁酸锌盐。另外，本发明的化合物或优选的相对难溶盐如刚刚描述的那些盐可在适用于注射的含例如芝麻油的凝胶，例如单硬脂酸铝凝胶中配制。特别优选的盐是锌盐、单宁酸锌盐、帕莫酸盐等。另一类注射用缓慢释放贮库制剂会含有为在缓慢降解的无毒无抗原性聚合物如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物(例如在美国专利号3,773,919中记载的)中封装而分散的化合物或盐。化合物或优选的相对难溶的盐如上文所述的盐还可在胆固醇基质硅橡胶丸剂中配制，特别是用于动物。其他缓慢释放、贮库或植入物制剂，例如气态或液态脂质体是文献中已知的(美国专利号5,770,222和"Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems",J.R.Robinson ed.,MarcelDekker,Inc.,N.Y.,1978)。

缩写

BSA--牛血清清蛋白

EIA--酶免疫测定法

FBS--胎牛血清

H₂O₂--过氧化氢

HRP--辣根过氧化物酶

Ig--免疫球蛋白

CD22--ICD22

IP--腹膜内

IV--静脉内

Mab--单克隆抗体

OD--光密度

OPD--邻苯二胺二盐酸盐

PEG--聚乙二醇

PSA--青霉素、链霉素、两性霉素

RT--室温

SQ--皮下

v/v--体积/体积(体积比)

w/v--重量/体积(重量体积比)

实施例1：亲和和定量ELISA

将Nunc-Immuno MaxiSorp 96孔板用100μl的2μg/ml、0.2μg/ml、0.02μg/ml或0.002μg/ml重组CD22胞外结构域(PeproTech,Inc.目录号100-01)在包被溶液(含碳酸氢钠的PBS)中包被。用板密封器将板覆盖并于4℃孵育过夜。将板倒空并将残余液体在纸巾上扣出。添加200μl清洗溶液(含0.05％Tween-20的PBS)，并以200RPM于室温摇动5分钟。将板倒空并将残余液体在纸巾上扣出。添加200μl封闭溶液(含2％Carnation牛奶的PBS)，并以200RPM于室温摇动1小时。将板倒空并将残余液体在纸巾上扣出。将含有VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015抗体的100μl稀释样品用于ELISA。将样品以200RPM于室温摇动1小时；将板倒空并将残余液体在纸巾上扣出。添加200μl清洗溶液(含0.05％Tween-20的PBS)，以200RPM于室温摇动5分钟；将板倒空并将残余液体在纸巾上扣出。这个过程重复三次。为所有样品添加100μl在封闭溶液(含2％Carnation牛奶的PBS)中1∶2500稀释的缀合HRP的抗人IgG。为对照抗体添加100μl在封闭溶液(含2％Carnation牛奶的PBS)中1∶2500稀释的缀合HRP的抗兔IgG。将内容物以200RPM于室温摇动1小时，将板倒空并将残余液体在纸巾上扣出。添加200μl清洗溶液(含0.05％Tween-20的PBS)，以200RPM于室温摇动5分钟；将板倒空并将残余液体在纸巾上扣出。这个过程重复三次。添加100μl TMB底物溶液，并于室温孵育。用1N HCl终止反应，并于450nm读板，以确定相对结合亲和力(图17)。

定量ELISA

实施例2：CHO-S细胞转染

转染前1周，将CHO-S细胞(Invitrogen)转移至补充有血清的Dulbecco氏改良Eagle培养基(D-MEM)(Invitrogen)中的单层培养。转染前1天，以96孔形式为每一份转染样品在100uL补充有血清的D-MEM中平板接种0.4×10⁵个细胞。为每一份转染样品制备DNA-Lipofectamine复合物。在25uL Opti-MEM血清减少培养基中稀释0.25ug DNA并温和混合，并于室温孵育5分钟。在25uL Opti-MEM血清减少培养基中稀释0.5uL Lipofectamine 2000(Invitrogen)。温和混合并于室温孵育5分钟。组合稀释的DNA与稀释的Lipofectamine。温和混合并于室温孵育20分钟。向每一个含有细胞和培养基的孔添加50uL DNA-Lipofectamine复合物。通过摇动板来温和混合。将细胞于37℃在5％CO²温箱中孵育过夜。吸出每一个孔中的培养基。向每一个孔添加100uL补充有血清的D-MEM。为ELISA测定法收集上清液，并为β-半乳糖苷酶测定法收集细胞溶胞物。

实施例3：从细胞培养物上清液纯化抗体

以标准方式制备下述缓冲液。结合缓冲液：10mMNa₂HPO₄/NaH₂PO₄，pH7.0。洗脱缓冲液：12.5mM柠檬酸，pH2.7(使用柠檬酸三钠)。中和缓冲液：0.5M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，pH8.0。20％乙醇和水。所有缓冲液在使用前过滤(0.45μm)。使用配有HiTrap^TM蛋白GSepharose HP(1mL体积)柱的FPLC^TM系统来纯化上清液。为了样品加载，将加载管用乙醇(20mL，5mL/min)，然后用结合缓冲液(20mL，5mL/min)润洗。将蛋白G柱连上系统并用结合缓冲液(10mL，1mL/mn)润洗。以1mL/min或更慢(用于过夜加载)加载样品。加载后，将柱拆下并将加载管用水(20mL，5mL/min)，然后用20％乙醇(20mL，5mL/min)润洗。为了抗体纯化，用结合缓冲液洗涤AKTA系统(A泵和所有管道)。通过向每一个管添加50μl中和缓冲液，为级分收集准备收集管。将蛋白G柱装上系统。流速设为1mL/min，并运行直至基线稳定。将柱阀换至位置3。用结合缓冲液(最少10mL)清洗柱直至达到基线。关闭泵并用水，然后用洗脱缓冲液清洗。流速设为1mL/min，并运行直至基线稳定。将柱阀换至位置3并启动级分收集器(0.5mL级分)。收集级分直至达到基线，此时关闭系统。将洗脱图谱拷贝至剪贴板，并拷贝成WORD文件。用水，然后用结合缓冲液清洗泵。用结合缓冲液(10mL)清洗蛋白G柱。用20％乙醇清洗泵。用贮藏于冷室的20％乙醇(20mL)清洗柱。

将抗体在无菌1×PBS，pH7.4，0.02％叠氮钠，10mg/mL BSA中重建。抗原是CD22(21,000kDa)，在四个独立的管形瓶中，将0.5mg、1mg、0.5mg和0.5mg抗原用无菌1×PBS，pH7.4，0.02％叠氮钠稀释至375ug/mL、1mg/mL、500ug/mL和500ug/mL。标记物Cy5缀合的AffiniPure山羊抗人IgG(H+L)，Cy5，1.5μg/mL购自Jackson ImmunoResearch(WestGrove,PA)。将标记物在无菌1×PBS，pH7.4，0.02％叠氮钠中重建，并稀释至0.500mg/mL。过柱缓冲液(running buffer)是1×PBS，pH7.4，0.02％叠氮钠。样品缓冲液是1×PBS，pH7.4，0.02％叠氮钠，1mg/mL牛血清清蛋白(BSA)。PMMA珠(Part#440197/Lot3257)由SapidyneInstruments,Inc.(Boise,ID)提供并以下述方式用捕捉试剂包被。将干的珠等分成200mg部分并在1mL包被溶液(含30ug/mL BAP001的运行缓冲液)中摇动2小时。然后将珠在封闭溶液(含10mg/mL BSA的运行缓冲液)中摇动1小时并贮藏于4℃。

为了平衡分析，使用经CD22包被的PMMA珠从受体(抗CD22抗体)和配体(抗原；CD22)的平衡样品中捕捉一部分游离受体。为每一个数据点，将一个经配体包被的珠的新鲜柱引入流动室。使平衡样品快速穿过柱以使与固定化配体的接触时间最小化。这确保与固定化配体的接触时间不破坏样品平衡。如此固定化配体起探针的作用来捕获溶液中的游离受体。用荧光标记的抗人二抗来检测被捕捉的抗体。洗掉未结合的试剂，留下与平衡样品中的游离受体成比例的信号。荧光转换成与平衡样品中的游离受体(抗体)量直接成正比的电压。以高和低受体浓度二者运行实验，然后一起用于n-曲线分析以获得最佳结果。为了动力学分析的直接方法，动力学实验使用与平衡实验相同的固定化配体(经CD22包被的PMMA)作为捕捉试剂。在平衡前测量样品中的游离受体(抗体)量，随着样品朝向平衡移动，产生监测游离受体(抗体)随时间而降低的数据点。图33显示了与BA003(CNTO136)相比，来自前10名命中抗IL6抗体BAP001-克隆1至BAP001-克隆10的Sapidyne分析数据表。

实施例4：本发明的抗CD22抗体的重组CD22胞外结构域表面等离振子共振亲和力常数测定

使用BIAcore 3000，GE Healthcare来测定结合曲线和动力学参数。将抗人Fc(1.8mg/ml)在NaOAc缓冲液(10mM，pH4.8)中稀释至浓度50ug/ml并偶联至CM-5传感器芯片的羧甲基化右旋糖苷基质，使用制造商的如BIAcore系统手册中所述的胺偶联化学进行。使用目标为10000RU的表面制备向导，首先用NHS/EDC活化传感器表面上的羧基，接着添加抗人Fc。通过注射1M乙醇胺来封闭剩余的活化基团。个别地偶联每一个流动室。采用这些条件，准备了含有7554-9571RU抗人Fc的四个流动室表面。在预备实验中，确定了三次注射(15ul,30ul/min)100mMH₃PO₄/0.05％CHAPS会有效除去结合的免疫球蛋白并保留固定化抗人Fc的结合能力。

在BIAcore 3000上于25℃以流速30ul/min进行实验。将抗体候选在HBS(含0.15M NaCl、3.4mM EDTA和0.05％表面活性剂P20的10mMHEPES，pH7.4)中溶解为5ug/ml。将分析物CD22在HBS中溶解为0.25、0.125、0.062、0.031和0.015ug/ml。使3*30ul的5ug/ml抗体BA001流过其各自流动室，接着以30ul/min注射240ul每一种CD22浓度(结合期)及不间断的1200秒缓冲液流(解离期)。通过三次序贯注射，每次15ul100mM H₃PO₄/0.05％CHAPS来再生芯片的表面。HBS注射充当参照(空白传感图)，用于扣除容积(bulk)折射率，以进行分析。在BIAevaluation 4.1中使用1∶1模型，为解离(kd,[s^-1])和结合(ka,[M^-1s^-1])进行局部拟合和整体拟合二者，并计算(kd/ka)解离常数(K_D,[M])。

使用BIAeveluation 3.0版进行分析。通过将实验曲线拟合至从相互作用机制模型推导的速率方程，从传感图数据推导动力学常数。使用1∶1结合模型的整体分析及局部RUmax拟合，确定了ka、kd、和K_D。

使用下述方程：

K_{a} = \frac{[AbAg]}{[Ab] [Ag]} = \frac{1}{K_{d}}

亲和力成熟之前的人源化抗CD22单抗的Biacore数据列于图18(BA006G)。BA336G亲和力成熟和随后人源化之后，通过Biacore分析测试选定克隆，并示于图18中。

实施例5：抗CD22选择性抗CD22抗体结合在淋巴瘤细胞系中表达的细胞表面CD22并诱导内化

已显示CD22蛋白在发展中的B细胞和在大多数人非霍奇金氏淋巴瘤细胞系，包括Dauid、RAMOS和RAJI B细胞系中表达(Knowles D.M.,Chadburn A.,Inghirami G.Immunophenotypic markers useful in thediagnosis and classification of hematopoietic neoplasms Knowles D.M.eds..Neoplastic Hematopathology,73-95,Williams&Wilkins Baltimore 1992)。抗CD22抗体与B细胞系或来自健康个体和患有非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的原发性B细胞的结合，导致CD22/抗体复合物的快速内化。在早期时间点，细胞系中的内化显示比在原发性B细胞和NHL患者来源的B细胞中更快，但在数小时处理后，对于所有B细胞群达到的最大内化是相当的，并在较高抗体浓度下显示达到饱和。

如通过荧光激活细胞分类分析仪所测定的，测试了本文所选的抗CD22单克隆抗体，即本发明的克隆VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015结合Daudi、RAMOS和RAJI B淋巴瘤细胞系中的细胞表面表达的CD22的能力。分析前，将细胞培养物在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中维持，使其呈指数增长。使用商购的缀合藻红蛋白(PE)的抗CD22抗体(BectonDickenson,目录号340708)通过ELISA和FACS分析测定抗CD22表达水平。对于基线表面表达，在冰上用含2％FBS和12ug/ul抗CD22-PE缀合物的PBS对1×10⁶个Daudi细胞(例如)进行45分钟的孵育，然后用冰冷PBS-FBS溶液洗涤。然后通过FACS使用标准流程分析细胞，以量化靶细胞群中的表面结合。

作为平行，在37℃下，用相似浓度的本发明所选抗CD22单抗克隆VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015在PBS-FBS中的溶液对1×10⁶个Daudi细胞处理20小时，以允许结合和内化。在此时段后，洗涤细胞，然后暴露于并上的含12ug/ml抗CD22-PE缀合物的PBS-FBS溶液。在该条件下，如上所述使用FACS分析检测并量化残余的表面CD22。图19A中示出本发明的抗CD22抗体的典型结果。在暴露20小时后，如所测量的，荧光总体(population)向左移动，代表检测水平降低，即表面CD22表达降低。相对的CD22表面表达量的降低可表达为两总体(population)的比率。

图19B示出在37℃下暴露20小时后，一组抗CD22抗体使CD22受体内化的能力的评价结果，并通过暴露前后抗CD22-PE缀合物结合的移动百分比确定。由CD22阳性总体向左移动可见，检测到一系列CD22表达的变化。内化程度的定量示于图20中。如上所述分析本发明的各个抗CD22克隆，选择性抗CD22单抗克隆VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015，CD22内化的相对程度表达为抗体暴露后总体(population)从基线的移动百分比。

实施例6：通过定量共聚焦免疫荧光显微镜在淋巴瘤细胞系中测定本发明的抗CD22抗体的快速内化。

于37℃下，在含10％FBA的RPMI 1640培养基中于指数生长的条件下维持Daudi细胞，然后收集以供分析。使用Zenon标记复合物(Molecular Probes)，利用制造商建议的流程，将本发明所选的抗CD22选择性抗CD22单抗克隆VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015与FITC直接缀合。将约1×10⁷个Daudi细胞重悬于含5ug/ml标记抗CD22抗体的PBS中，并在冰上孵育45分钟。然后于0℃在PBS-FBS溶液中洗涤细胞两次。然后在37℃下，将细胞在含10％FBS的RPMI 1640培养基中以不同时间段孵育细胞，收集，并于0℃下在PBS中洗涤。然后室温下即刻将细胞在4％多聚甲醛溶液中固定5分钟，接着在含0.05％Triton X-100的PBS中洗涤。通过离心收集细胞团，并重悬于最小量的无水FBS中，然后应用于显微镜玻璃载片上。分析前用含核染剂DAPI的装配液处理载片，然后应用盖玻片。使用ACAS Ultima共聚焦显微镜(MeridianInstruments,Inc.,Okemos,MI)记录共聚焦图像，并使用100倍油浸物镜表现出穿过焦平面中心的1-μm部分。

分析了本发明的抗CD22单克隆抗体选择性克隆VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015快速内化到细胞内舱的能力，如通过细胞表面上相对胞内内吞舱(intracellular endo cytotic compartment)的免疫荧光信号所判断的。将本发明的抗体与BA006H和人源化版本的鼠单克隆抗体LL2对比。在本实施例中，如图21A，通过相对平均荧光(RMF)判断，相对于BA006H，本发明的抗CD22抗体以约20倍结合在Daudi细胞表面上表达的CD22蛋白，并用90分钟几乎完全在细胞中内化，主要定位于细胞核周围的高尔基体和溶酶体内。图21B示出了以该方法获得的本发明各个抗CD22抗体的RMF表面结合值的表。

实施例7：用本发明的CD22阳性淋巴瘤细胞系抗CD22单克隆抗体选择性克隆VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014和VM1015处理后，对CD22酪氨酸磷酸化的刺激。前面已显示抗CD22抗体结合表达CD22的细胞，并刺激受体胞质区的酪氨酸磷酸化(Carnahan et al,Clin Cancer Res September 1,2003 9；3982s)。抗CD22抗体的这种生物活性与BCR信号转导复合物的负向调节相关，导致淋巴瘤细胞生长和诱导细胞死亡的降低。因此对所选抗CD22抗体在暴露于受体表达细胞系后刺激CD22酪氨酸磷酸化的能力进行分析。通过在含10％FBS的RPMI 1640中培养以指数生长方式维持Daudi细胞，然后收集，并用抗CD22抗体处理。然后用洗涤缓冲液使处理的细胞溶解，并使用抗CD22BA006H免疫沉淀CD22，然后进行SDS-PAGE和Western印迹分析。然后用抗磷酸酪氨酸抗体(4G10)或兔多克隆抗CD22(Santa Cruz,目录号SC-7932)探针探测所得印迹。图22A和B示出这些分析的结果。以下示出每个抗体处理的酪氨酸磷酸化CD22蛋白与总CD22的比。作为对照，用抗IgM抗体处理Daudi细胞，以参与(engage)并刺激B细胞受体复合物，作为满足使CD22胞浆区转磷酸化(trans-phosphorylate)可能性的手段。

实施例8：交叉反应性。已知表面蛋白CD22在发展中的B细胞表面上和来源于B细胞谱系的淋巴瘤和白血病细胞上表达。对本发明的抗CD22抗体与在鼠科和啮齿动物B细胞上表达的CD22交叉反应的能力进行评价。结果表明，与啮齿类形式的蛋白没有明显结合。还对本发明的抗CD22抗体与灵长类物种食蟹猴(Macaca fascicularis)的交叉反应性进行评价。分析了从食蟹猴分离的外周血淋巴细胞(PBMC)(源于PrimateBiologicals,Inc.,Bethesda,MD)(富含CD22阳性B细胞)。用荧光分子藻红蛋白(PE)直接标记本发明的抗CD22抗体(在本文数据中将抗CD22抗体表示为“VM101”)。为测试正染色，将每个测试条件的约2.5×10⁶PBMC在PBS中洗涤，然后重悬于含10％胎牛血清(FBS)的PBS中。然后将细胞暴露于无抗体、抗CD22PE标记抗体(20ug/ml)或抗人CD20-FITC缀合抗体，该抗体显示与食蟹猴CD20(Miltenyl Biotech,目录号130-091-108，1:10稀释的原液)交叉反应，然后在0℃下孵育60分钟。在PBS中洗涤每个测试条件的细胞，然后在室温下用含4％甲酰胺的PBS固定10分钟。接着将细胞重悬于0.5ml含2％FBS的PBS中，然后通过荧光激活细胞分选(FACS)分析(图1)分析CD22和CD20表面染色。无抗体处理的细胞无论在FITC通道还是在PE通道均无明显的荧光强度移动(图1A)，而用VM101-PE染色的细胞含有CD22阳性群(图1B)。类似地，用抗CD20-FIT染色的细胞含有CD20阳性群(图1C)。如根据PBMC中两抗原的表达模式所期望的，同时用VM101-PE和CD20-FITC抗体染色的细胞具有双标记群(图1D)。VM101具体识别食蟹猴CD22蛋白。

实施例9：抗CD22抗体的相对表达。在哺乳动物细胞中表达本发明的抗CD22抗体，以确定其是否具有与生产临床研究用材料的制造方法的高水平生产一致的性质。将本非买那个的抗CD22抗体(抗体1、抗体2和抗体3)的表达与对照抗体人源化CD22抗体(“对照”)进行比较。在哺乳动物细胞培养条件和条件培养基中以等同时间段培养所得的表达各CD22抗体的细胞，并测试单克隆抗体的存在与产率。将结果与市售抗体(曲妥单抗，又称赫赛汀)进行比较，该市售抗体在这些条件期间以高水平表达，并充当比较者。表1示出在这些条件下该表达与可生产性测试的结果。

Claims

1.一种与人CD22结合的分离的抗体或抗体片段，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的重链可变区；具有氨基酸序列SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32的轻链可变区；和来源于一种或多种人抗体的恒定区。

2.一种与人CD22结合的分离的抗体或抗体片段，其包含来源于VM1000、VM1001、VM1002、VM1003、VM1004、VM1005、VM1006、VM1007、VM1008、VM1009、VM1010、VM1011、VM1012、VM1013、VM1014或VM1015中一种或多种的可变区的重链和轻链互补决定区(CDR)，和来源于一种或多种人抗体的恒定区。

3.如权利要求1或2所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段在体内竞争性抑制抗CD22鼠抗体与人CD22结合。

4.如权利要求1或2所述的抗CD22抗体或抗体片段，其中所述抗体或特定部分或变体以至少10^-9M的亲和力(K_d)结合CD22。

5.如权利要求1或2所述的CD22抗体或抗体片段，其中所述抗体或特定部分或变体以至少10^-11M的亲和力(K_d)结合CD22。

6.如权利要求1或2所述的CD22抗体或抗体片段，其中所述抗体或特定部分或变体以至少10^-12M的亲和力(K_d)结合。

7.如权利要求1或2所述的CD22抗体或抗体片段，其中所述抗体或特定部分或变体实质上中和至少一种CD22的至少一种活性。

8.CD22抗体组合物或抗体片段组合物，其包含权利要求1或2所述的分离的CD22抗体或特定部分或变体和载体或稀释剂。

9.一种用于治疗细胞、组织、器官或动物中的免疫病症、紊乱或疾病的方法，其包括：使至少一个选定的免疫调控有效量的权利要求1或2所述的至少一种抗CD22抗体或抗体片段接触或施用于所述细胞、组织、器官或动物。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述免疫病症、紊乱或疾病是选自下组的至少一种：类风湿性关节炎/血清阴性关节病，骨关节炎，炎性肠病，系统性红斑狼疮，虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎。

11.如权利要求9所述的方法，其中所述有效量是0.0001-50mg/kg所述细胞、组织、器官或动物。

12.一种用于调控细胞、组织、器官或动物中癌性紊乱或病症的方法，其包括使药学有效量的权利要求1或2所述的至少一种抗CD22抗体组合物或抗体片段接触或施用于所述细胞、组织、器官或动物。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述癌性紊乱或病症是选自下组的至少一种：白血病，急性白血病，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，B细胞、T细胞或FAB ALL，急性髓样白血病(AML)，慢性髓细胞性白血病(CML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，毛细胞白血病，脊髓发育不良综合征(MDS)，淋巴瘤，霍奇金(Hodgkin)氏病，恶性淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤，和多发性骨髓瘤。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述有效量是0.01-100mg/kg所述细胞、组织、器官或动物。

15.如权利要求12的方法，其中所述接触或所述施用是通过选自静脉内、肌内、推注、皮下、呼吸、吸入、阴道、直肠、含服、舌下、鼻内或经皮的至少一种模式。

16.一种医疗装置，其包含权利要求1或2所述的至少一种抗CD22抗体组合物或抗体片段，其中所述装置适合于通过选自静脉内、肌内、推注、皮下、呼吸、吸入、阴道、直肠、含服、舌下、鼻内或经皮的至少一种模式来接触或施用所述至少一种CD22抗体组合物或抗体片段。

17.一种分离的完全人的抗体组合物或其抗体片段，其中所述抗体或特定部分或变体与权利要求1或2所述的抗CD22抗体或片段结合相同表位或抗原区。

18.一种制剂，其包含权利要求1或2所述的至少一种抗CD22抗体组合物或抗体片段和选自无菌水、无菌缓冲水或至少一种防腐剂的至少一种载体，所述防腐剂选自在水性稀释剂中的下组：酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁、对羟基苯甲酸烃基酯、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或其混合物。

19.如权利要求18所述的制剂，其中所述抗CD22抗体组合物或抗体片段的浓度是约0.1mg/ml至约100mg/ml。

20.如权利要求18所述的制剂，其还包含等张剂。

21.如权利要求18所述的制剂，其还包含生理上可接受的缓冲液。

22.一种试剂盒，其包含在第一容器中为冻干形式的权利要求1或2所述的至少一种抗CD22抗体组合物或抗体片段，和任选的装有无菌水、无菌缓冲水或至少一种防腐剂的第二容器，所述防腐剂选自在水性稀释剂中的下组：酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁、对羟基苯甲酸烃基酯、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或其混合物。

23.如权利要求22所述的试剂盒，其中抗CD22抗体组合物或抗体片段的浓度重建为约0.1mg/ml至约500mg/ml的浓度。

24.如权利要求22所述的试剂盒，其还包含等张剂。

25.如权利要求22所述的试剂盒，其还包含生理上可接受的缓冲液。

26.治疗至少一种抗CD22介导的病症的方法，其包括将权利要求18所述的制剂施用至有需要的患者。

27.用于人制药用途的制品，其包含包装材料和含有权利要求1或2所述的至少一种CD22抗体组合物或抗体片段的溶液或冻干形式的容器。

28.如权利要求27所述的制品，其中所述容器是具有用于多用途施用的限位器的玻璃或塑料容器。

29.生产权利要求1或2所述的抗CD22抗体或片段的方法，包括从宿主细胞或转基因动物或转基因植物或用编码所述抗体或片段的核苷酸序列转化的植物细胞表达所述抗体或片段，以及从中回收所述抗体或片段。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、植物细胞或酵母细胞。

31.如权利要求29所述的方法，其中所述转基因动物是哺乳动物。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述转基因哺乳动物选自山羊、牛、绵羊、马和非人灵长类动物。

33.转基因动物或植物，其能够表达权利要求1或2所述的至少一种抗体。

34.通过权利要求29所述的方法生产的至少一种抗CD22抗体或特定部分或变体。