CN101636413A - 单克隆抗cxcl13抗体 - Google Patents

单克隆抗cxcl13抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN101636413A
CN101636413A CN200880005506A CN200880005506A CN101636413A CN 101636413 A CN101636413 A CN 101636413A CN 200880005506 A CN200880005506 A CN 200880005506A CN 200880005506 A CN200880005506 A CN 200880005506A CN 101636413 A CN101636413 A CN 101636413A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cxcl13
binding members
antibody
structural domain
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200880005506A
Other languages
English (en)
Inventor
W·巴克
F·A·凯斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MedImmune Ltd
AstraZeneca AB
Original Assignee
MedImmune Ltd
AstraZeneca AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MedImmune Ltd, AstraZeneca AB filed Critical MedImmune Ltd
Publication of CN101636413A publication Critical patent/CN101636413A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)

Abstract

本发明涉及CXCL13的结合成员，特别是抗体分子。所述结合成员可以用于治疗与CXCL13相关的病症，包括关节炎病症，如类风湿关节炎。

Description

单克隆抗CXCL13抗体
本发明涉及CXCL13的结合成员，特别是抗体分子。所述结合成员可以用于治疗与CXCL13相关的病症，包括关节病症，如类风湿关节炎。
CXCL13是有效的B细胞化学引诱物，其指导幼稚B细胞进入二级淋巴器官的滤泡，并且由二级淋巴器官的富含B细胞的区域中的滤泡树突细胞(FDCs)和基质细胞组成型表达。CXCL13也称作吸引B细胞的趋化因子1(BCA-1)。CXCL13通过其受体CXCR5传递信号。CXCR5是7次跨膜的G蛋白偶联的受体，并且是1类GPCR家族的CXC趋化因子受体亚家族的成员。CXCR5以高水平在幼稚和激活的B细胞，包括外周血和扁桃体B细胞上表达。它也在激活的外周血CD4+T细胞的一个亚群和二级淋巴组织中的大多数CD4+细胞上表达。CXCL13是CXCR5的唯一已知配体。
CXCL13在外周淋巴器官的发育中起作用。例如，Ansel等人[]显示了CXCL13缺陷的小鼠在外周淋巴结发育中具有严重缺陷。CXCL13诱导募集到滤泡中的幼稚B细胞上的膜淋巴毒素α1β2的表达，其促进FDCs的成熟，并且进一步增强CXCL13产生[1]。用T细胞依赖性抗原免疫的CXCL13缺陷小鼠在淋巴结和脾中形成生发中心，但它们很小，并且具有不规则的构造，提示CXCL13是滤泡内B细胞的募集和正确定位所需要的[1]。
CXCL13也在先天免疫中起作用。CXCL13缺陷小鼠缺乏腹膜腔和胸膜腔B1细胞，并且缺乏针对体腔细菌抗原的天然抗体的产生(Ansel，KM.等Immunity，16：67-76，2002)。
如本文其它地方所讨论的，存在证据表明CXCL13参与多种病症。
本领域报道了CXCL13结合成员。例如，MAB801是可商购的鼠抗人CXCL13单克隆抗体(R&D Systems：MAB801)。MAB470是大鼠抗小鼠CXCL13单克隆抗体。
通过利用合适设计的选择技术和测定，我们开发了CXCL13的结合成员，其抑制CXCL13与其靶受体CXCR5的结合。
本发明的结合成员抑制CXCL13与靶受体CXCR5的结合。结合的抑制可以是直接抑制。
本文描述了CXCL13的结合成员，也称作CXCL13结合成员。该结合成员结合并且可以中和人CXCL13和非人灵长动物CXCL13，如猕猴CXCL13。非人CXCL13表示在除人之外的物种中天然存在的CXCL13的直向同源物。
本发明的结合成员正常情况下相对于CXC家族趋化因子的其他成员，包括例如CXCL3，CXCL5，CXCL6，CXCL8，CXCL10和/或CXCL12，对于CXCL13是特异性的，并且因此选择性结合CXCL13。这例如可以在竞争测定中确定或证明。例如，合适的测定在本文的实施例2.5中描述。
这些结合成员可以用于体内或体外抑制CXCL13与CXCR5的结合，并且可以用于治疗与CXCL13相关的病症，例如类风湿关节炎，如本文其它地方的详细描述。
如下文更详细描述的，已经显示了本发明的结合成员能够以高效价中和CXCL13。中和表示抑制CXCL13的生物活性。本发明的结合成员可以中和CXCL13的一种或多种活性。受抑制的生物活性典型是CXCL13与结合配偶体的结合。例如，受抑制的生物活性可以是CXCL13与CXCR5的结合。
根据本发明，可以抑制人或非人CXCL13与CXCR5的结合，例如，结合成员可以抑制非人灵长动物，如猕猴CXCL13与CXCR5的结合。CXCR5可以是人或非人的，如非人灵长动物，如猕猴或小鼠的CXCR5。一方面，CXCR5与CXCL13是同一物种的。典型地，CXCR5是人CXCR5。
CXCL13与CXCR5的结合的中和例如可以测量为CXCR5信号传递介导的活性的函数，因为CXCL13与CXCR5的结合刺激所述活性。
由于CXCR5是G蛋白偶联的受体，所述活性可以是与G蛋白偶联的受体相关的活性。
例如，CXCL13与CXCR5的结合可以通过G蛋白亚基Gαi(其抑制腺苷酸环化酶)的释放导致腺苷酸环化酶活性的下调和细胞cAMP水平的降低。因此，合适的测定可以包括检测在缺乏结合成员的条件下发生的细胞cAMP水平的降低的抑制，即本文称作cAMP的测定可以测量CXCL13介导的细胞cAMP水平的抑制(通过本文的结合成员)。典型地，用于cAMP测定中的细胞是用腺苷酸环化酶激活物如NKH477共刺激的。用于所述测定中的合适的细胞在本文中描述。
合适的(细胞)cAMP测定包括以均相测定形式组合了荧光共振能量转移(FRET)和时间分辨荧光(TRF)技术的那些测定(在本文中称作TRF/FRET cAMP测定)。TRF/FRET cAMP测定的实例包括
Figure A20088000550600101
(均相时间分辨荧光)cAMP测定(CisBio International)(参见例如Gabriel D等，(2003)Assay and Drug Development Technologies 1(2)：291-303)和
Figure A20088000550600102
cAMP测定(Perkin Elmer)(参见例如Hemmila等人(1999)JBiomol Screen 4(6)：303-308)。
FRET是指供体荧光团和合适的受体荧光团(FRET供体-受体对)之间的激发能量的非放射性能量转移。典型地，该测定成分包括：标记的cAMP(示踪剂cAMP)和标记的cAMP特异性抗体。示踪剂cAMP和抗体都用供体-受体对的一个成员标记。当抗体结合示踪剂cAMP时，发生FRET，并且通过TRF确定受体发射的信号。样品中的游离cAMP与示踪剂cAMP竞争结合抗体，并且减少FRET信号。该测定因此包含确定受体发射的信号。
优选地，该测定包括确定供体和受体的特异性信号作为内部对照，以得到比值测量值，其补偿测定中有色化合物的存在。
在本测定中，供体受体对典型地使得供体受到约337-340nm的光的激发。典型地，在供体和受体之间的FRET之后，受体发射约665nm的信号(其可以是时间分辨的)。例如，XL665(cAMP测定中的受体)和Alexa
Figure A20088000550600104
-647染料(
Figure A20088000550600105
cAMP测定中的受体)都在665nm发射荧光信号。例如，供体可以在约615-620nm发射信号。
受体可以是例如吸收红色的荧光染料，特别是亲水的吸收红色的染料(Buschmann等，Bioconjugate Chem.2003，14：195-204)。吸收红色的荧光染料可以是例如Alexa-647(Perkin Elmer)，例如用于
Figure A20088000550600107
cAMP测定中。
供体-受体对的实例包括例如用于
Figure A20088000550600108
cAMP测定中的铕穴状化合物(供体)/XL665(受体)和例如用于
Figure A20088000550600109
cAMP测定中的铕螯合物(供体)/Alexa
Figure A200880005506001010
-647染料(受体)。
示踪剂cAMP或抗体可以用供体或受体标记。因此，测定可以包括使用(供体标记-示踪剂cAMP)和(受体标记-cAMP特异性抗体)或使用(受体标记-示踪剂cAMP)和(供体标记-cAMP特异性抗体)。例如，测定可以包括使用XL665-cAMP和铕穴状化合物-抗-cAMP单克隆抗体，如在测定中。测定可以包括使用铕螯合物标记的cAMP和Alexa-647染料标记的cAMP抗体，如在测定中。
通过TRF确定TRF/FRET测定中的荧光信号。
TRF/FRET cAMP测定可以用于测定用腺苷酸环化酶激活物NKH477共刺激CH0qi5CXCR5细胞后细胞cAMP水平的CXCL13介导的降低的抑制。
通常，在
Figure A20088000550600114
测定中，对可以彼此结合的大分子进行标记，一个用铕(Eu3+)穴状化合物(供体)标记，另一个用第二荧光标记XL665(或Xlent)(稳定的交联别藻蓝蛋白)标记。当分子彼此结合时以及在激发后(在337nm)，发生FRET，并且XL665在665nm重新发射特异性的长期存在的荧光。在该测定中，供体(在620nm)和受体(在665nm)的特异性信号都测量为内部对照，在测定中给出补偿有色化合物的存在的比值测定值。
Figure A20088000550600115
cAMP测定典型地包括：混合XL665-cAMP(示踪剂cAMP)、铕穴状化合物-抗cAMP单克隆抗体和含cAMP的样品；施加337nm的光(从而激发铕穴状化合物供体)；通过TRF确定620nm处(供体)和665nm处(受体)的荧光信号；和将信号665nm/620nm的比值确定为发生过的FRET的测量值。来自样品的任何游离cAMP与XL665-cAMP(示踪剂cAMP)竞争结合铕穴状化合物-抗cAMP单克隆抗体。当样品不含任何cAMP时发生最大FRET，并且FRET信号随着样品cAMP的增加而减少。
因此，
Figure A20088000550600116
技术利用了荧光提供的可能性，以便在发射的信号的光谱特征(许可的比值校正)上和时间分辨的检测模式下(例如消除自身荧光)工作。该技术是均相的，表示样品和检测试剂在平板中混合在一起，所述平板可以在合适的平板读数器中读数，即所谓的“混合和读数”方案。
Figure A20088000550600117
cAMP测定合并了TRF和FRE以及红色偏移的
Figure A20088000550600118
Fluor染料(Perkin Elmer)的利用，这使得能够进行FRET测定而无需与蓝色染料相关的化合物干涉。
Figure A20088000550600119
cAMP测定典型地包括：混合铕-铕的螯合物/链霉亲和素-生物素/cAMP示踪剂、Alexa
Figure A200880005506001110
-647标记的cAMP特异性抗体和含cAMP的样品；施加340nm的光(从而激发铕供体)；通过TRF将665nm处的荧光信号(受体)确定为发生过的FRET的测量值。来自螯合物的残余能量产生615nm处的光。来自样品的任何游离cAMP与铕标记的cAMP(示踪剂cAMP)竞争结合
Figure A20088000550600121
标记的抗cAMP单克隆抗体。当样品不含任何cAMP时发生最大FRET，并且FRET信号随着样品cAMP的增加而减少。
可以用合适的标准来对测定进行校准。
这些测定的测定方案和执行的实例在本文的材料和方法部分详细描述。
可以进行测定从而确定CXCL13与CXCR5的结合的中和的另一CXCR5信号传递介导的活性是CXCL13诱导的钙释放。典型地，测定结合成员对表达CXCR5和G蛋白Gqi5的细胞中CXCL13诱导的钙释放的抑制作用。用CXCL13刺激这些细胞，通过诱导细胞内储存物的释放和从细胞外介质的流入，以浓度依赖性方式产生了细胞质Ca2+的增加。这可以在荧光成像平板读数器(FLIPR)中用钙敏感性染料测量。例如，一个这样的测定利用人CXCL13和用Gqi5和人CXCR5转染的CHO细胞系。
可以用哺乳动物细胞系，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，如表达CXCR5和含有Gαi亚基的G蛋白Gqi5的CHO K1细胞体外进行cAMP测定和Ca2+释放测定。可以通过用编码CXCR5和Gqi5的核酸转染细胞而产生合适的细胞系。
CXCL13是有效的B细胞化学引诱物。CXCL13通过CXCR5受体传递信号，所述受体以高水平在幼稚和激活的B细胞上以及激活的T细胞的一个亚群上表达。因此，可以进行测定从而确定CXCL13与CXCR5的结合的中和的另一活性是表达CXCR5的B细胞中CXCL13诱导的趋化性。
测定中的B细胞可以是非原代B细胞。一种这样的测定利用已经用人重组CXCR5(B300.19hCXCR5细胞)转染的鼠前B细胞系。
或者，可以使用原代B细胞。一个这样的测定使用从鼠脾分离的混合淋巴细胞群。
这样，合适的测定，如cAMP、钙释放和B细胞趋化性测定可以用于计算成员抑制CXCL13与CXCR5结合的效价，如下文的描述。这些测定可以用于计算结合成员中和CXCL13与CXCR5的结合的效价。中和效价计算为CXCR5信号传递介导的活性的函数。该测定可以测量诱导的中和CXCL13的效价；细胞cAMP水平的降低；细胞钙水平的升高；或B细胞趋化性。
生物活性的抑制可以是部分或全部的。结合配偶体可以使CXCL13生物活性，即不存在结合成员情况下的活性的100％，或至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少60％，或至少50％被抑制。
可以测定结合成员的中和效价。效价通常表示为IC50值，除非特别指出，是以nM表示。在功能测定中，IC50是使生物反应减少其最大值的50％的结合成员的浓度。在配体结合研究中，IC50是使受体结合减少最大特异性结合水平的50％的浓度。可以通过以下方法计算IC50：将最大生物反应的％作图为结合成员浓度的对数的函数，并且用软件程序，如Prism(GraphPad)将S形函数拟合于数据，从而产生IC50值。可以用技术人员已知和/或本文描述或提到的一种或多种测定来确定或测量效价。
在本文描述的测定，如cAMP、钙释放或B细胞趋化性测定中由结合成员对CXCL13活性的中和，表明结合成员结合CXCL13并且抑制CXCL13与CXCR5的结合。可以用于确定结合成员与CXCL13的结合的其他方法包括ELISA、蛋白印迹、免疫沉淀、亲和层析和生物化学测定。
利用来自第一物种(如人)的CXCL13在测定中计算的结合成员的中和效价可以与用来自第二物种(如非人灵长动物如猕猴)的CXCL13在同一测定中计算的结合成员的中和效价进行比较，从而评估这两个物种的CXCL13的结合成员的交叉反应性程度。或者，可以在本文其他地方更详细描述的竞争结合测定中评估交叉反应性。
本发明的结合成员具有的中和人CXCL13与CXCR5结合的效价可以是中和猕猴CXCL13与CXCR5结合的效价的10倍以内。例如，可以分别用人和猕猴CXCL13在cAMP测定(如TRF-FRET测定，如
Figure A20088000550600131
cAMP测定)或在B细胞趋化性测定中测量效价。用人CXCL13进行的cAMP测定如
Figure A20088000550600132
cAMP测定中的效价与用猕猴CXCL13进行的cAMP测定中的效价的差别例如可以不超过10、5、4、3或2倍。对于人或猕猴CXCL13的2nM的终浓度，确定cAMP测定中的效价。用人CXCL13和猕猴进行的
Figure A20088000550600141
cAMP测定中获得的数据的实例示于表2和5。
本发明的结合成员结合人CXCL13可以比结合猕猴CXCL13更强。如竞争结合测定中所测量的，结合成员与人CXCL13结合的强度可以例如比结合猕猴CXCL13的强度高不超过10、9、8、7、6、5、4、3或2倍。例如，对人CXCL13的结合强度可以比对猕猴CXCL13的结合强度高不超过4倍。用人和猕猴CXCL13进行的竞争测定中获得的数据的实例示于表8中。
如本文描述的，本发明的结合成员在人CXCL13cAMP测定中的中和效价或IC50可以不超过12nM，其中CXCL13的终浓度是2nM。IC50可以例如不超过11，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1nM，如不超过5nM。结合成员可以是本文描述的任何形式，例如，IgG或scF或任何其他合适的形式。
如本文的描述，本发明的结合成员在猕猴CXCL13cAMP测定中的中和效价或IC50可以不超过12nM，其中CXCL13的终浓度是2nM。IC50可以是例如不超过11，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1nM，例如不超过3nM。结合成员可以是本文描述的任何形式，例如IgG或scFv或任何其他合适的形式。
例如，本发明的结合成员在人CXCL13
Figure A20088000550600142
cAMP测定中的中和效价或IC50可以不超过12nM，其中CXCL13的终浓度是2nM。IC50可以是例如不超过11，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1nM，例如不超过5nM。在人CXCL13
Figure A20088000550600143
cAMP测定中获得的数据的实例示于表1。
例如，本发明的结合成员在猕猴CXCL13
Figure A20088000550600144
cAMP测定中的中和效价或IC50可以不超过12nM，其中CXCL13的终浓度是2nM。IC50可以是例如不超过11，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1nM，例如不超过3nM。在猕猴CXCL13
Figure A20088000550600145
cAMP测定中获得的数据的实例示于表1。
一方面，例如，当测定的结合成员是IgG形式时，如本文的描述，结合成员在人CXCL13cAMP测定中的中和效价或IC50可以是不超过5nM，其中CXCL13的终浓度是2nM。IC50可以是例如不超过4.5，4，3.5，3，2.5，2，1.9，1.7，1.5，1.3，1.1，1.0，0.9，0.7或0.5nM，例如不超过1.4或不超过1.6nM。
一方面，例如，当测定的结合成员是IgG形式时，如本文的描述，结合成员在猕猴CXCL13cAMP测定中的中和效价或IC50可以是不超过5nM，其中CXCL13的终浓度是2nM。IC50可以是例如不超过4.5，4，3.5，3，2.5，2，1.5，1，0.5，0.4或0.2nM，例如不超过0.3nM。
例如，本发明的结合成员，如IgG，在人CXCL13
Figure A20088000550600151
cAMP测定中的中和效价或IC50可以是不超过5nM，其中CXCL13的终浓度是2nM。IC50可以是例如不超过4.5，4，3.5，3，2.5，2，1.9，1.7，1.5，1.3，1.1，1.0，0.9，0.7或0.5nM，例如不超过1.4或不超过1.6nM。人CXCL13
Figure A20088000550600152
cAMP测定中获得的数据的实例示于表2和5中。
例如，发明的结合成员，如IgG，在猕猴CXCL13
Figure A20088000550600153
cAMP测定中的中和效价或IC50可以是不超过5nM，其中CXCL13的终浓度是2nM。IC50可以是例如不超过4.5，4，3.5，3，2.5，2，1.5，1，0.5，0.4或0.2nM，例如不超过0.3nM。猕猴CXCL13
Figure A20088000550600154
cAMP测定中获得的数据的实例示于表2和5中。
本发明的结合成员在人CXCL13钙释放测定中的中和效价或IC50可以是不超过40nM，其中CXCL13的终浓度是100nM。IC50可以是例如不超过38，36，34，32，20，28，26，24，22，20，18，16，14，12，10，8，6，4或2nM。在人CXCL13钙释放测定中获得的数据的实例示于表4和7中。
本发明的结合成员在人CXCL13B细胞趋化性测定中的中和效价或IC50可以是不超过12nM，其中人CXCL13的终浓度产生约ED80反应，并且其中的非原代B细胞系已经用人重组CXCR5转染过。IC50可以例如是不超过11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1或1.5nM。典型地，该测定使用B细胞系，如已经用人重组CXCR5转染的鼠前B细胞系，如表达人重组CXCR5的B300.19细胞。在使用人CXCL13的人CXCL13B细胞趋化性测定中获得的数据的实例示于表3和6。
本发明的结合成员在猕猴CXCL13B细胞趋化性测定中的中和效价或IC50可以是不超过10nM，其中猕猴CXCL13的终浓度产生约ED80反应，并且其中的非原代B细胞系已经用人重组CXCR5转染。IC50可以例如是不超过9，8，7，6，5，4，3，2或1nM。典型地，该测定使用B细胞系，如已经用人重组CXCR5转染的鼠前B细胞系，如表达人重组CXCR5的B300.19细胞。在猕猴CXCL13B细胞趋化性测定中获得的数据的实例示于表6。
本发明的结合成员在人CXCL13原代细胞趋化性测定中的中和效价或IC50可以是不超过40nM，其中人CXCL13的终浓度产生约ED80反应，并且采用混合的淋巴细胞群。IC50可以例如是不超过38，36，34，32，30，28，26，24，22，20，18，16，14，12，10，8，6，4或2nM。典型地，该测定使用从小鼠脾新鲜分离的原代淋巴细胞群。在采用人CXCL13和鼠原代淋巴细胞的人CXCL13B细胞趋化性测定中获得的数据的实例示于表12。
可以例如用表面等离子共振，如BIAcore确定CXCL13的CXCL13结合成员的结合动力学和亲和力(表示为平衡解离常数KD)。本发明的结合成员与人CXCL13的亲和力通常小于400pM，例如小于380，360，340，320，300，290，280，270，260，250，240，230，220，210，200，190，180，170，160，150，140，130，120，110，100，90，80，70，60或50pM。对猕猴CXCL13的亲和力通常类似于对人CXCL13的亲和力。采用BIAcore对人CXCL13和猕猴CXCL13获得的数据的实例示于表10和11。
本发明的结合成员对人CXCL-13和猕猴CXCL-13的亲和力可以小于150pM。
可以通过将人或猕猴CXCL-13流过包含结合成员的表面，用表面等离子共振测量结合动力学和亲和力。
通常，除非特别指出，上述测定描述的中和效价可以应用于以本文描述的任何形式测定的结合成员。例如，效价可以应用于抗体分子，包括本文描述的任何抗体片段，例如IgG结合成员。
当CXCL13在哺乳动物细胞系(MEL细胞)中重组表达时，获得人CXCL13的糖基化和非糖基化形式。产生的大部分人CXCL13是未糖基化的，但是当按比例放大表达时，可以获得含有糖基化形式的较小比例。在MEL细胞中表达的猕猴CXCL13是糖基化的。如在本文描述的B细胞趋化性测定中所测量的，糖基化和未糖基化的人CXCL13的抗体1的效价的差异在10倍以内，并且可以认为是等效的。未糖基化的人CXCL13、糖基化的人CXCL13和糖基化的猕猴CXCL13的示例性效价数据示于实施例2.3中的表6。与糖基化的人CXCL13的结合可以代表本发明的结合成员的优点，因为内源CXCL13可以是糖基化的，因此糖基化的人CXCL13可以代表人类治疗的治疗靶抗原。
在本文描述的测定中，重组CXCL13，例如，人CXCL13，可以未糖基化或糖基化的形式使用。我们的数据表明，本发明的结合成员可以结合不受糖基化影响的CXCL13的区域中的表位(参见实施例2.3和表6)。因此，本文描述的测定中的结合成员对人CXCL13的效价可以应用于未糖基化的人CXCL13和糖基化的人CXCL13。
在本文描述的测定，如B细胞趋化性测定中，与糖基化的人CXCL13相比，本发明的结合成员对未糖基化的人CXCL13的效价可以高不超过10、5、4、3、2.5或2倍。当然，对糖基化的人CXCL13的效价可以高于对未糖基化的人CXCL13的效价。
如在本文描述的竞争结合测定、cAMP测定、钙释放测定或B细胞趋化测定中测量的，本发明的结合成员对糖基化的人CXCL13的效价可以与对未糖基化的人CXCL13的效价相似或相同，如差异可以是不超过10、5、4、3、2.5或2倍。
本发明的结合成员可以包括抗体分子，例如人抗体分子。结合成员通常包含抗体VH和/或VL结构域。结合成员的VH和VL结构域也提供为本发明的一部分。互补决定区(“CDRs”)和构架区(“FRs”)位于VH和VL结构域的每一个中。VH结构域包含HDRs组，VL结构域包含LCDRs组。抗体分子可以包含抗体VH结构域，该结构域包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及构架区。它可以替代地或还包含抗体VL结构域，该结构域包含VL CDR1、CDR2和CDR3以及构架区。本发明的抗体VH和VL结构域以及CDRs的实例列于所附序列表中，所述序列表构成本公开内容的一部分。本文公开的所有VH和VL序列、CDR序列、CDRs组和HCDRs组代表了本发明实施方案的各方面。如本文描述的，“CDRs组”包括CDR1、CDR2和CDR3。因此，HCDRs组是指HCDR1、HCDR2和HCDR3，LCDRs组是指LCDR1、LCDR2和LCDR3。除非特别之处，“CDRs组”包括HCDRs和LCDRs。本发明的结合成员典型地是单克隆抗体。
本发明的结合成员可以包含非抗体分子内的抗原结合位点，其通常是由非抗体蛋白支架中的一个或多个CDRs，如CDRs组提供的，如下文进一步的讨论。
如实施例中更详细描述的，我们分离了抗体分子，编号为抗体1。如本文描述的，抗体1是指具有抗体1的CDRs组的抗体。抗体1的序列示于所附序列表中，其中按以下顺序具有以下序列：编码VH结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)；VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)；VH CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO：3)；VH CDR2氨基酸序列(SEQ IDNO：4)；VH CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO：5)；编码VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)；VL结构域的氨基酸序列(SE1 ID NO：7)；VLCDR1氨基酸序列(SEQ ID NO：8)；VL CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO：9)；VL CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。
本发明的结合成员可以包含本文描述的一个或多个CDRs，如CDR3，并且任选还包含CDR1和CDR2，以形成CDRs组。如本文的描述，CDR或CDRs组可以是抗体1的CDR或CDRs组，或可以是其变体。
本发明提供了包含抗体1的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3和/或抗体1的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，如抗体1的CDRs组的结合成员。结合成员可以包含抗体1的VH CDRs组。任选地，它也可以包含抗体1的VL CDRs组，并且所述VL CDRs可以与VH CDRs来自相同或不同的抗体。本发明也提供了包含抗体1的HCDRs组的VH结构域和/或包含抗体1的LCDRs组的VL结构域。
典型地，VH结构域与VL结构域配对，以提供抗体抗原结合位点，但如下文件进一步讨论的，可以用单独的VH或VL来结合抗原。抗体1VH结构域可以与抗体1VL结构域配对，使得形成包含抗体1VH和VL结构域这两者的抗体抗原结合位点。在其他实施方案中，抗体1VH与抗体1VL之外的VL结构域配对。本领域充分描述了轻链混杂。因此，抗体1的VH可以与抗体1或其他抗体的VL配对。
结合成员可以包含抗体1的H和/或L CDRs组，其中具有公开的H和/或L CDRs组内的一个或多个氨基酸突变。突变可以是氨基酸取代、插入或缺失。因此，例如，在H和/或L CDRs组内，可以存在最多10、9、8、7、6、5、4、3或2个突变，如取代。例如，HCDR3中可以存在1个或最多5、4、3或2个突变，如取代，和/或LCDR3中可以存在1个或最多5、4、3或2个突变，如取代。
结合成员可以包括在抗体构架区内具有一个或多个CDRs，如CDRs组的抗体分子。例如，抗体的一个或多个CDRs或CDRs组可以移植到构架区(如人构架区)中，以提供抗体分子。构架区可以是人种系基因片段序列的构架区。因此，构架区可以种系化，从而改变构架区内的一个或多个残基，以匹配最相似的人种系构架区中等同位置上的残基。本发明的结合成员可以是分离的人抗体分子，其具有包含人种系构架区中的HCDRs组的VH结构域，如人种系构架区，如人VH3-23。通常，结合成员也具有包含例如人种系构架区中的LCDRs组的VL结构域，如人VK1L12。种系化的VH或VL结构域可以在或不在一个或多个Vernier残基上种系化。
非种系化的抗体分子与种系化的抗体分析相比，具有相同的CDRs，但不同的构架区。在本文所附序列表中显示的抗体1的抗体序列是种系化的。如本文实施例中的描述，从分离的抗体1VH和VL结构域种系化，包括在VH结构域产生以下突变：Q1E，V5L，R16G，V23A，G24A，H39Q，G83R和R105Q；和在VL结构域中产生以下突变：115V，A58V和D70E。因此，一方面，本发明的VH结构域(包括含有所述VH结构域的结合成员)可以包含SEQ ID NO：2中的氨基酸序列，但是上述VH突变中的1个或多个，如2、3、4、5、6、7或全部8个被取消。在一个实施方案中，VH结构域在SEQ ID NO.2的第30、97和98位不被取代。类似地，本发明的VL结构域可以包含SEQ ID NO：7中的氨基酸序列，但是上述1、2或全部3个突变被取消。在一个实施方案中，VL在SEQ ID NO.7的第2位不被取代。
一方面，本发明的结合成员可以包含(i)在一个或多个构架区中包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或具有一个或多个氨基酸改变(如取代)(如1、2、3、4、5、6、7或8个取代)的氨基酸序列SEQ ID NO：2的VH结构域；和(ii)在一个或多个构架区中包含SEQ ID NO：7中的氨基酸序列或具有一个或多个氨基酸改变(如取代)(如1、2或3个取代)的氨基酸序列SEQ ID NO：2的VL结构域。在这方面的一个实施方案中，结合成员(如IgG)的VH结构域在SEQ ID NO.2的第30、97和98位中的一个或全部位置上不被取代，并且VL结构域在SEQ ID NO：7的第2位上不被取代。VH结构域可以包含SEQ ID NO：2中的氨基酸序列或可以包含具有以下氨基酸取代中的一个或多个取代(如1、2或全部)的SEQ ID NO：2中的氨基酸序列：G30S；T97A；R98K。VL结构域可以包含SEQ ID NO：7中的氨基酸序列或可以包含具有以下氨基酸取代中的SEQ ID NO：2中的氨基酸序列：T2Ile。
本文提供的抗体1的数据是针对种系化的和/或非种系化的形式显示的，并且在合适的时候指出。对于以种系化的形式测试的抗体，与非种系化的形式相比，获得了非常相似的数据。
在抗体1的表达的scFv和IgG序列中包括了在该抗体的кVL结构域的核苷酸和氨基酸序列中显示的3’cgt密码子和相应精氨酸残基。序列的C末端精氨酸残基相应于Kabat残基108。下文解释了该残基及编码它的三联密码子cgt的来源。
为了表达IgG的轻链，提供了编码抗体轻链的核苷酸序列，其中包含编码VL结构域的第一外显子、编码CL结构域的第二外显子、和分隔第一外显子和第二外显子的内含子。在正常情况下，内含子通过细胞mRNA加工机制剪切下来，使第一外显子的3′末端与第二外显子的5′末端连接起来。这样，当具有所述核苷酸序列的DNA表达为RNA时，第一和第二外显子一起剪接。剪接过的RNA的翻译产生了包含VL结构域和CL结构域的多肽。剪接后，Kabat残基108处的Arg由VL结构域构架区4序列的最后一个碱基(c)和CL结构域的前两个碱基(gt)编码。
Kabat残基108处的精氨酸残基可以认为是抗体分子的VL结构域的C末端残基。
本发明的结合成员可以与任何具有以下性质的结合成员竞争结合CXCL13：
(i)结合CXCL13和
(ii)包含本文公开的结合成员、VH和/或VL结构域、CDR如HCDR3，和/或CDRs组。
一方面，本发明提供了结合成员，其竞争结合具有SEQ ID NO：11的scFv抗体分子。SEQ ID NO：11中的序列相应于通过接头序列(Gly120至Ser134)与SEQ ID NO：7的VL结构域连接的SEQ ID NO：2的VH结构域。结合成员可以包括本文其他地方描述的抗体1的CDR或CDRs组或其变体。结合成员可以是本文其他地方描述的抗体分子，如IgG(如IgG1)或scFv。
结合成员在竞争测定中可以显示完全或部分竞争。例如，在竞争测定中结合成员可以显示对结合CXCL13的至少50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，97，99或100％竞争，例如，与具有SEQ ID NO：11的抗体scFv分子竞争。
可以容易地在体外测定结合成员之间的竞争，例如，采用ELISA和/或通过标记一个结合成员的特异性报道分子，所述结合成员可以在一个或多个其他未标记的结合成员存在下被检测到，从而使得能够鉴定出结合相同表位或重叠表位的结合成员。所述方法是本领域普通技术人员熟知的，并且在本文中更详细描述。例如，可以使用本文中联系cAMP测定描述的TRF-FRET技术的表位竞争测定(TRF-FRET表位竞争测定)，如表位竞争测定。
本文联系cAMP描述了
Figure A20088000550600212
技术。
Figure A20088000550600213
表位竞争测定典型地包括：混合XL665标记的CXCL13、铕穴状化合物标记的参照抗体(如具有SEQ ID NO：11的scFv抗体分子)和测试结合成员；施加337nm处的光(从而激发铕穴状化合物供体)；通过TRF确定620nm(供体)和665nm(受体)处的荧光信号；以及将信号665nm/620nm的比值确定为发生的FRET的测量值。与参照抗体竞争结合CXCL13的受试结合成员，如IgG或scFv抗体分子，减少发生的FRET。该测定的详细方法提供在实施例中。
因此，本发明的另一方面提供了包含与抗体分子竞争结合CXCL13的人抗体抗原结合位点的结合成员，所述抗体分子例如特别是包含抗体1的VH和/或VL结构域、CDR如HCDR3或CDRs组的抗体分子。
在本发明的另一方面，提供了包含人抗体抗原结合位点的结合成员，所述人抗体抗原结合位点与抗体抗原结合位点竞争结合CXCL13的，其中后一抗体抗原结合位点由VH结构域和VL结构域组成，并且其中所述VH和VL结构域包含本文公开的抗体1的CDRs组。
本发明的结合成员可以结合人CXCL-13的表位，其中所述表位包括成熟的人IL-17A的31-42位上的序列Ile-Leu-Pro-Arg-Gly-Asn-Gly-Cys-Pro-Arg-Lys-Glu(SEQ ID NO：20)的至少一个残基。它可以例如结合SEQ ID NO：20的1、2、3、4、5或5个以上的残基。除SEQ ID NO：20外，本发明的结合成员还可以结合人CXCL-13的其他区域。
任何合适的方法可以用于确定由结合成员结合的残基的序列，所述方法如氢-氘交换、定点诱变、质谱、NMR和X线结晶学。
肽酰胺氢交换是非常充分描述的用于研究蛋白的方法(Englander，S.W.等Methods Enzymol.232：26-42，1994)。最近，进一步开发了该方法，以便使用能够交换质子的氘标记的蛋白，并且将该方法与质谱法偶联，以测量跨整个蛋白的交换速度(Pantazatos，D.等Proc.Natl.Acad.Sci.101(3)：751-756，2004)。通过对溶剂的可接近性，可以显著改变氢/氘交换(H/D交换)的该速度，使得当蛋白的一部分参与结合另一分子时，交换的速度将显著减慢。已经用该方法对参与与抗体的相互作用的蛋白的区域作图，并且用于研究参与本发明的结合抗体的CXCL-13的区域，如本文实施例7的详细描述。联合使用质谱和H/D交换，以鉴定与结合成员接触的人CXCL-13的区域。例如，可以证明当人CXCL-13与本发明的结合成员结合时，SEQ ID NO：20内的残基的H/D交换会显著减慢。
在其他方面，本发明提供了包含编码本发明的结合成员、VH结构域和/或VL结构域的序列的分离的核酸和制备本发明的结合成员、VH结构域和/或VL结构域的方法，所述方法包括在使得能够产生所述结合成员、VH结构域和/或VL结构域的条件下表达所述核酸，并且回收所述结合成员、VH结构域和/或VL结构域。
本发明的另一方面提供了编码本文公开的VH CDR或VL CDR序列的核酸，通常是分离的。
另一方面提供了含有本发明的核酸或用本发明的核酸转化的宿主细胞。
本发明的另一方面提供了含有本发明的结合成员的组合物，以及它们在抑制和/或中和CXCL13的方法，包括通过疗法治疗人体或动物体的方法中的用途。
本发明的结合成员可以用于治疗或诊断方法中，例如治疗人体或动物体中(例如人患者中)的疾病或病症的治疗(其可以包括预防性处理)方法中，其包括给所述患者施用有效量的本发明的结合成员。可以根据本发明治疗的状况包括CXCL13在其中起作用的任何状况，如本文其他地方详细讨论的。
本发明的这些和其他方面在下文进一步详细描述。
可以在本文中方便地指出本文使用的“和/或”认为是这两种指定特征和/或组分中每一种(具有或不具有另一种)的具体公开。例如，“A和/或B”认为是以下每一种情况的具体公开：(i)A，(ii)B以及(iii)A和B，正如本文中单独阐述其中的每一种。
CXCL13
CXCL13是趋化因子(C-X-C基序)配体13。全长人CXCL13的序列以保藏号NP_006410SEQ ID NO：12保藏。全长氨基酸序列包括22个残基的N末端肽，其体内切割产生成熟形式。成熟CXCL13具有氨基酸序列SEQ ID NO：13。成熟CXCL13是用于治疗和诊断应用的体内靶抗原，本文提到人CXCL13时是指成熟CXCL13，除非特别指出。
对于本文描述的某些测定和实验，人CXCL13在MEL细胞系中表达。在C末端截短从MEL细胞表达的人CXCL13，并且其氨基酸序列是SEQ ID NO：14。这样，SEQ ID NO：14是本文描述的测定中使用的MEL表达的人CXCL13。成熟、未截短的CXCL13(SEQ ID NO：13)也将适用于测定中，并且不认为截短会影响获得的结果。
在本文描述的一些测定中使用生物素化的人CXCL13。该CXCL13是合成产生的，并且具有成熟CXCL13序列SEQ ID NO：13，其在最C末端的赖氨酸残基携带生物素。
在一些实施方案中，CXCL13可以是猕猴CXCL13。当从MEL细胞表达用于本文的实验工作时，猕猴CXCL13从C末端截短5个氨基酸，并且具有氨基酸序列SEQ ID NO：16。
计划的成熟的未截短猕猴CXCL13的序列是SEQ ID NO 15。如所示的，对于人和猕猴CXCL13，完全未截短的猕猴序列计划在C末端包括KRKIP。这样假定是因为用于克隆的猕猴引物设计为与从成熟的人CXCL13去除(当其截短时)的区域退火。
成熟的、未截短的CXCL13(SEQ ID NO：15)也将适用于测定中，并且不认为截短会影响获得的结果。
如本文其他地方描述的，CXCL13可以是重组的和/或可以是糖基化或非糖基化的。糖基化和/或非糖基化的CXCL13可以在重组系统中表达，例如，在哺乳动物细胞如人细胞系、鼠细胞系如MEL细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。
CXCR5
CXCR5是本文其他地方描述的CXCL13受体。人CXCR5以两种同工型存在。CXCR5同工型1的氨基酸序列以保藏号NP_001707保藏，并且在本文表示为SEQ ID NO：17。CXCR5同工型2的氨基酸序列以保藏号NP_116743保藏，并且在本文表示为SEQ ID NO：18。同工型2在N末端截短45个氨基酸。因此，同工型2缺乏变体1的翻译起始密码子和胞外域，并且不太可能结合配体，并且不太可能是功能性的。
具有SEQ ID NO：17的人CXCR5的同工型1用于本文的实验中。因此，本文提到的CXCR5是指人同工型1，除非特别指出。
如上下文指出的，本文提到的CXCR5可以是人或非人的。例如，在使用人CXCL13或非人CXCL13的中和测定中，可以选择来自合适物种的CXCR5。合适的物种可以是人或非人CXCR5，其中结合配偶体是来自相同物种的人或非人CXCL13。或者，人或非人CXCL13可以用于采用来自不同物种的人或非人CXCR5的测定中，其中已知人或非人CXCL13交叉反应。
结合成员
这描述了彼此结合的一对分子的一个成员。结合对的成员可以是天然来源的或完全或部分合成产生的。这对分子的一个成员在其表面或腔内具有一个区域，所述区域结合并且因此互补于该对分子的另一成员的特定空间和极性组构。结合对的类型的实例是抗原-抗体、生物素-亲和素、激素-激素受体、受体-配体和酶-底物。本发明涉及抗原-抗体型反应。
结合成员通常包括具有抗原结合位点的分子。例如，结合成员可以是包含抗原结合位点的抗体分子或非抗体蛋白。
可以通过在非抗体蛋白支架，如纤连蛋白或细胞色素B等[2，3，4]上排列CDRs或通过使蛋白支架内的环的氨基酸残基随机化或突变以赋予对所需靶的结合特异性的方式，提供抗原结合位点。用于对蛋白中的新的结合位点进行工程化的支架由Nygren等详细综述[4]。抗体模拟物的蛋白支架公开于WO/0034784，其在此全文引入作为参考，其中发明人描述了包括具有至少一个随机化环的纤连蛋白III型结构域的蛋白(抗体模拟物)。可以由免疫球蛋白基因超家族的任何结构域成员提供移植了一个或多个CDRs，如HCDRs组的合适支架。支架可以是人或非人蛋白。非抗体蛋白支架的一个优点是它可以在比至少一些抗体分子更小和/或更容易制备的支架分子中提供抗原结合位点。结合成员的小尺寸可以赋予有用的生理特性，如进入细胞、深入穿透组织或到达其他结构中的靶，或在靶抗原的蛋白腔内结合的能力。非抗体蛋白支架中的抗原结合位点的用途综述于Wess，2004[5]。典型的是具有稳定骨架和一个或多个可变环的蛋白，其中环的氨基酸序列是特异性或随机突变的，以产生结合靶抗原的抗原结合位点。所述蛋白包括来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的IgG结合域、转铁蛋白、四连蛋白、纤连蛋白(如第10个纤连蛋白III型结构域)、脂笼蛋白，以及γ晶体和其他AffilinTM支架(ScilProteins)。其他方法的实例包括基于植物环蛋白(cyclotides)的合成″微体(Microbodles)″，即具有分子内二硫键的小蛋白、微蛋白(VersabodiesTM，Amunix)和锚蛋白重复蛋白(DARPins，MolecularPartners)。
除了抗体序列和/或抗原结合位点，本发明的结合成员可以包含其他氨基酸，例如，形成肽或多肽，如折叠结构域，或给分子赋予除结合抗原的能力之外的其他功能特征。本发明的结合成员可以携带可检测标记，或可以与毒素或导向部分或酶缀合(如通过肽键或接头)。例如，结合成员可以包含催化位点(如在酶结构域中)和抗原结合位点，其中抗原结合位点与抗原结合，由此将催化位点导向于抗原。催化位点可以抑制抗原的生物功能，如通过切割。
尽管如指出的，CDRs可以由非抗体支架携带，本发明的携带CDR或CDRs组的结构一般将是抗体重链或轻链序列或其主要部分，其中CDR或CDRs组位于相应于由重排的免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变区的CDR或CDRs组的位置。免疫球蛋白可变区的结构和位置可以参照Kabat，等，1987[6]及其中的更新内容而确定。许多学术和商业在线资源可以用于查询该数据库。例如，参见参考文献[7]及目前在网址http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html的相关在线资源。
CDR区或CDR意欲表示Kabat等1991[8]以及后期版本定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高变区。抗体典型地包含3个重链CDRs和3个轻链CDRs。术语CDR或CDRs在本文中用于根据情况表示这些区域中的一个，或这些区域中的一些，或甚至全部，其含有大多数负责通过抗体对抗原或其识别的表位的亲和力而进行的结合的氨基酸。
在6个短的CDR序列中，重链的第三个CDR(HCDR3)具有更大的尺寸可变性(基本由于产生它的基因的排列机制而具有更大的多样性)。它可以短至2个氨基酸，但已知最长的尺寸是26。CDR长度也可以根据能够由特定的作为基础的构架区容纳的长度而改变。功能上，HCDR3在确定抗体的特异性的决定中起部分作用[9，10，11，12，13，14，15，16]。
抗体分子
这描述了一种免疫球蛋白，无论是天然或部分或完全合成产生的。该术语也涵盖了包含抗体抗原结合位点的任何多肽或蛋白。此处必须理解，本发明不涉及天然形式的抗体，也就是说，它们不是在它们的天然环境中，而是它们能够通过从天然来源纯化而分离或纯化，或通过基因重组获得，或通过化学合成活动，并且它们可以含有后文将描述的非天然氨基酸。包含抗体抗原结合位点的抗体片段包括但不限于诸如Fab，Fab’，Fab’-SH，scFv，Fv，dAb和Fd的分子。已经工程化了包含一个或多个抗体抗原结合位点的许多其他抗体分子，包括例如Fab2，Fab3，双抗体(diabodies)，三抗体(triabodies)，四抗体(tetrabodies)和微抗体(minibodies)。抗体分子以及构建和使用它们的方法描述于[17]中。
可以采用单克隆抗体和其他抗体，并且采用重组DNA技术来生产结合靶抗原的其他抗体或嵌合分子。所述技术可以涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDRs的DNA导入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加构架区。参见例如EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400，以及大量后续文献。产生抗体的杂交瘤或其他细胞可以进行基因突变或其它改变，这可以改变或不改变产生的抗体的结合特异性。
可以通过多种方式修饰抗体，术语“抗体分子”应该解释为涵盖任何具有抗体抗原结合位点的结合成员或物质，所述位点具有需要的对抗原的特异性和/或结合抗原。因此，该术语涵盖抗体片段和衍生物，包括任何含有抗体抗原结合位点的多肽，无论是天然或完全或部分合成的。因此，包括了嵌合分子，其包含与另一多肽(如来源于另一物种或属于另一抗体类型或亚类)融合的抗体抗原结合位点或等同物。嵌合抗体的克隆和表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023以及大量后续文献中。
抗体工程化领域可以获得的其他技术使得能够分离人和人源化抗体。例如，可以按照Kontermann&Dubel[18]的描述制备人杂交瘤。噬菌体展示，即用于制备结合成员的另一确立的技术，已经在很多公开文献中描述，如Kontermann&Dubel[18]和WO92/01047(下文进一步讨论)，和美国专利US5969108，US5565332，US5733743，US5858657，US5871907，US5872215，US5885793，US5962255，US6140471，US6172197，US6225447，US6291650，US6492160，US6521404。
可以将转基因小鼠用于分离人抗体，其中小鼠抗体基因被灭活，并且用人抗体基因功能性取代，而留下小鼠免疫系统的完整的其他成分[19]。可以用本领域已知的技术制备人源化抗体，如公开于例如W091/09967，US 5,585,089,EP592106，US 565,332和WO93/17105中的那些技术。此外，WO2004/006955描述了用于对抗体进行人源化的方法，所述方法基于通过比较非人抗体可变区的CDR序列的规范CDR结构类型与来自人抗体序列文库的相应CDRs的规范CDR结构类型(如种系抗体基因片段)而从人抗体基因选择可变区构架区序列。与非人CDRs具有相似规范CDR结构类型的人抗体可变区形成了一个亚群的成员人抗体序列，从其选择人构架区序列。该亚群成员可以根据人和非人CDR序列之间的氨基酸相似性进一步排序。在WO2004/006955的方法中，排序在前面的序列被选择用于提供构架区序列，其用于采用选择的亚群成员人构架区，构建用非人CDR对应物功能上替代人CDR序列的嵌合抗体，从而提供具有高亲和力和低免疫原性的人源化抗体，而无需比较非人和人抗体之间的构架区序列。也公开了根据该方法制备的嵌合抗体。
可以从通过在合适的表达载体内合成和组装的寡核苷酸产生的基因进行表达，建立合成的抗体分子，如Knappik等[20]或Krebs等[21]中的描述。
已经显示了完整抗体的片段能够行使结合抗原的功能。结合片段的实例是(i)由VL，VH，CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH或VL结构域组成的dAb片段[22，23，24]；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab′)2片段，即一种包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH和VL结构域由允许这两个结构域缔合形成抗原结合位点的肽接头连接[25，26]；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)″双抗体″，即通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；[27])。可以通过掺入连接VH和VL结构域的二硫桥而稳定Fv、scFv或双抗体分子[28]。也可以制备包含与CH3结构域连接的scFv的微抗体[29]。结合片段的其他实例是Fab’，其与Fab片段的差异在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸和Fab’-SH，后者是一种Fab’片段，其中恒定区的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团。
可以通过诸如由酶，例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化或/或通过化学还原裂解二硫键的方法从抗体分子1开始获得本发明的抗体片段。以另一方式，包含在本发明中的抗体片段可以通过本领域技术人员公知的基因重组技术等或通过肽合成而获得，所述肽合成是通过例如自动化肽合成仪(例如Applied Biosystems公司等提供的)，或通过核酸合成和表达。
本发明的功能性抗体片段包含任何可以通过化学修饰而增加半衰期的功能性片段，所述化学修饰特别是通过聚乙二醇化或通过掺入到脂质体中。
dAb(结构域抗体)是抗体的小单体抗原结合片段，即抗体重链或轻链的可变区[24]。VH dAbs天然存在于骆驼类(如骆驼、美洲驼)中，并且可以通过以下方法产生：用靶抗原免疫骆驼类，分离抗原特异性B细胞，并且从单个B细胞直接克隆dAb基因。dAbs也可以在细胞培养物中产生。它们的小尺寸、良好的溶解度和温度稳定性使得它们在生理学上特别有用，并且适用于选择和亲和力成熟。正在开发骆驼类VHdabs，用于在名称″nanobodiesTM″下的使用。本发明的结合成员可以是dAb，其包含基本如本文所阐述的VH或VL结构域，或包含基本如本文所阐述的CDRs组的VH或VL结构域。
双特异性或双功能抗体形成第二代单克隆抗体，其中两个不同的可变区组合成同一分子[30]。已经在诊断领域和治疗领域证明了它们的用途，从它们募集新效应物的能力到靶定肿瘤细胞表面上的一些分子的能力。当要使用双特异性抗体时，它们可以是常规的双特异性抗体，其可以通过多种途径制备[31]，例如，化学制备或从杂交瘤制备，或可以是上文提到的任何双特异性抗体片段。可以通过化学方法[32，33]或体细胞方法[34，35]获得这些方法，但是同样地并且优选地通过基因工程技术，其允许进行异二聚化，并且由此促进寻求的抗体的纯化过程[36]。双特异性抗体的实例包括BiTETM技术的抗体，其中可以使用具有不同特异性的两个抗体的结合域，并且通过短的柔性肽直接连接。这在短的单多肽链上组合了两个抗体。可以仅仅用可变区而不使用Fc区构建双抗体和scFv，优先降低抗独特型反应的效果。
可以将双特异性抗体构建为完整IgG，构建为双特异性Fab′2，构建为Fab′PEG，构建为双抗体或构建为双特异性scFv。此外，可以用本领域已知的常规方法连接双特异性抗体，以形成四价抗体。
双特异性双抗体(与双特异性完整抗体相反)也可以是特别有用的，因为它们可以容易地在大肠杆菌中构建和表达。具有合适结合特异性的双抗体(和很多其他多肽，如抗体片段)可以采用从文库进行噬菌体展示(WO94/13804)而容易地选择。如果双抗体的一个臂保持恒定，例如，具有针对CXCL13的特异性，则可以制备文库，其中另一个臂改变，并且选择具有合适特异性的抗体。双特异性完整抗体可以通过Ridgeway等，1996[37]中描述的替代工程化方法制备。
本领域有多种方法可以用于获得抗CXCL13的抗体。所述抗体可以是单克隆抗体，特别是人、鼠、嵌合或人源化来源，其可以根据本领域技术人员公知的标准方法获得。
通常，为了制备单克隆抗体或它们的功能性片段，特别是鼠来源的单克隆抗体或它们的功能性片段，可以参照特别是描述于手册“抗体”[38]中的技术或
Figure A20088000550600291
和Milstein[39]描述的从杂交瘤制备的技术。
可以例如从抗CXCL13或其含有由所述单克隆抗体识别的表位的片段之一免疫的动物细胞获得单克隆抗体。本文描述了包含它们的合适的片段和肽或多肽，并且可以用于免疫动物，以产生抗CXCL13的抗体。可以特别根据通常的工作方法，通过以编码CXCL13或其片段的cDNA序列中包含的核酸序列开始的基因重组，通过从包含在CXCL13和/或其片段的肽序列中的氨基酸序列开始的肽合成，生产所述CXCL13或其片段之一。
可以例如在亲和柱上纯化单克隆抗体，在所述柱上以前已经固定了CXCL13或其含有由所述单克隆抗体识别的表位的片段之一。更具体地，可以通过以下方法纯化单克隆抗体：在蛋白A和/或G上层析，然后进行或不进行目标在于消除残留蛋白污染物以及DNA和LPS自身的离子交换层析，然后进行或不进行在琼脂糖凝胶上的排阻层析，以消除由于存在二聚体或其他多聚体而导致的可能聚集物。在一个实施方案中，这些技术的全部可以同时或连续使用。
抗原结合位点
这描述了分子的部分，其结合并且互补于靶抗原的全部或部分。在抗体分子中，它称作抗体抗原结合位点，并且包含抗体的部分，所述部分结合并且互补于靶抗原的全部或部分。当抗原是大抗原时，抗体可以仅仅结合抗原的特定部分，所述部分称作表位。可以由一个或多个抗体可变区提供抗体抗原结合位点。抗体抗原结合位点可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
分离的
这表示一种状态，其中本发明的结合成员，或编码所述结合成员的核酸通常是根据本发明的。因此，本发明的结合成员、VH和/或VL结构域和编码核酸分子和载体可以例如，以基本上纯的或均相形式从其天然环境分离和/或纯化提供，或在核酸的情况下，不含或基本不含除了编码具有所需功能的多肽的序列之外的来源的核酸或基因。分离的成员和分离的核酸将不含或基本不含它们天然相关的材料，例如与它们一起在它们的天然环境或制备它们的环境(如细胞培养物)中存在的其他多肽或核酸(当所述制备是通过体外或体内实施的重组DNA技术时)。可以用稀释剂或佐剂配制成员和核酸，并且为了实施的目的仍然是分离的-例如，如果用于包被用于免疫测定中的微量滴定板，该成员通常将与明胶或其他载体混合，或当用于诊断或治疗中时，将与药学可接受的载体或稀释剂混合。结合成员可以天然或通过异源真核细胞(如CHO或NSO((ECACC 85110503)细胞)的系统糖基化，或它们可以是(例如，如果通过在真核细胞中表达而生产)非糖基化的。
包含抗CXCL13抗体分子的异源制剂也形成本发明的一部分。例如，所述制剂可以是具有全长重链和缺乏C末端赖氨酸的重链的抗体的混合物，所述重链具有各种程度的糖基化和/或具有衍生的氨基酸，例如，N末端谷氨酸的环化，以形成焦谷氨酸残基。
本文用到的短语“基本如所述的”是指本文描述的结合成员的VH或VL结构域的相关CDRs的特征将与指定区域相同或高度相似，本文阐述了所述指定区域的序列。如本文所述的，针对一个或多个可变区的指定区域的术语“高度相似的”，意欲表示可以在CDR和/或VH或VL结构域中进行1-约5个，例如1-4个，包括1-3，或1-2或3或4个氨基酸取代。
发明详述
如上文指出的，本发明的结合成员结合CXCL13并且可以中和CXCL13的生物活性。本发明的结合成员可以进行效价优化，以进一步改进其中和效价。通常，效价优化涉及使选择的结合成员的序列(通常是抗体可变区序列)突变，以产生结合成员的文库，随后测定效价，并且选择更有效的结合成员。这样，选择的“效价优化的”结合成员倾向于具有比来自产生文库的结合成员更高的效价。
然而，可以获得高效价结合成员，而无需优化。如本文所证明的，可以从最初的筛选，如生化中和测定直接获得高效结合成员。
“效价优化的”结合成员是指具有中和CXCL13的特定活性或下游功能的优化效价的结合成员。在本文其他地方更详细描述了测定和效价。
效价优化的和非优化的结合成员以及用于从选定的结合成员进行效价优化的方法是本发明的方面。因此，本发明允许技术人员制备具有高效价的结合成员。
另一方面，本发明提供了获得能够结合抗原的一个或多个结合成员的方法，该方法包括使本发明的结合成员的文库与所述抗原接触，并且选择能够结合所述抗原的文库的一个或多个结合成员。
该文库可以展示在颗粒或分子复合物，例如，可复制的遗传包装，如酵母、细菌或噬菌体(如T7)颗粒、病毒、细胞或共价、核糖体或其它体外展示系统上，每个颗粒或分子复合物含有编码在其上展示的抗体VH可变区的核酸，并且如果存在，任选含有编码展示的VL结构域的核酸。噬菌体展示描述于WO92/01047和例如美国专利US5969108，US5565332，US5733743，US5858657，US5871907，US5872215，US5885793，US5962255，US6140471，US6172197，US6225447，US6291650，US6492160和US6521404，上述每篇文献都通过全文引用的方式并入本文。
在选择能够结合抗原并且在噬菌体或其他文库颗粒或分子复合物上展示的结合成员后，可以从展示所述选择的结合成员的噬菌体或其他颗粒或分子复合物取出核酸。所述核酸可以用于随后通过从核酸表达而生产结合成员或抗体VH或VL可变区，所述核酸具有取自展示所述选择的结合成员的噬菌体或其他颗粒或分子复合物的核酸的序列。
可以用分离的形式提供具有所述选择的结合成员的抗体VH可变区的氨基酸序列的抗体VH可变区，也可以用包含所述VH结构域的结合成员的形式提供。
可以进一步测试结合CXCL13的能力，也可以确定与结合成员如抗体1(如scFv形式和/或IgG形式，如IgG1)竞争结合CXCL13的能力。如本文其他地方进一步讨论的，可以测试中和CXCL13的能力。
本发明的结合成员可以以抗体1如scFv或IgG1的亲和力，或以更好的亲和力结合CXCL13。
本发明的结合成员可以以抗体1如scFv或IgG1d效价，或以更好的效价中和CXCL13的生物活性。
可以在合适的条件下比较不同的结合成员的结合亲和力和中和效价。
可以通过序列改变或突变和筛选具有需要的特征的抗原结合成员的方法获得本发明的VH和VL结构域和CDRs的变体，包括氨基酸序列已经在本文中阐明的那些，以及可以用于CXCL13的结合成员中的那些。需要的特征的实例包括但不限于：
·相对于对抗原特异的已知抗体，对抗原的结合亲和力的增加
·如果活性已知，相对于对抗原特异的已知抗体，抗原活性的中和增加
·以特定摩尔比与抗原的已知抗体或配体的指定竞争能力
·免疫沉淀复合物的能力
·与指定表位结合的能力
о线性表位，如用本文描述的肽结合扫描，如采用以线性和/或受限构象筛选的肽鉴定的肽序列
о由非连续残基形成的构象表位
·调节CXCL13或下游分子的新生物活性的能力
所述方法也在本文中提供。
可以制备本文公开的抗体分子的变体并且在本发明中使用。在将多变量数据分析技术应用于结构/特性-活性关系中的计算化学的引导后[40]，可以用公知的数学技术，如统计回归、模式识别和分类来推导抗体的定量活性-特性关系[41，42，43，44，45，46]。可以从抗体序列、功能和三维结构的经验和理论模型(例如，可能接触的残基的分析或计算的物理化学特性)推导抗体的特性，并且可以单独和组合考虑这些特性。
由VH结构域和VL结构域组成的抗体抗原结合位点典型地由多肽的6个环形成：3个来自轻链可变区(VL)，3个来自重链可变区(VH)。具有已知原子结构的抗体的分析在抗体组合位点的序列和三维结构之间具有阐明的关系[47，48]。这些关系暗示，除了VH结构域中的第三个区域(环)，结合位点环具有小量主链构象之一：规范结构。已经显示了在特定环中形成的规范结构由其大小以及环和构架区两者中关键位点的某些残基的存在决定[47，48]。
这种序列-结构关系的研究可以用于预测具有已知序列，但具有未知三维结构的抗体中的那些残基，所述残基对于保持其CDR环的三维结构，因此对于保持结合特异性是重要的。通过比较预测值与来自前导优化实验的输出值，可以支持这些预测。在结构方法中，可以用自由获得或商业软件包如WAM[50]建立抗体分子的模型[49]。然后，可以用蛋白显现和分析软件包，如Insight II(Accelrys，Inc.)或Deep View[51]来评估CDR中每个位置上可能的取代。然后，可以用该信息来进行可能对活性具有最小或有益效果的取代。
在CDRs、抗体VH或VL结构域和结合成员的氨基酸序列内进行取代所需的技术通常是本领域可获得的。可以用取代制备变体序列，所述取代可以或不可以预测对活性具有最小或有益效果，并且测试结合和/或中和CXCL13的能力和/或任何其他需要的特性。
如讨论的，序列在本文特别公开的任何VH和VL结构域的可变区氨基酸序列变体可以根据本发明使用。
本发明的另一方面是包含VH结构域和/或包含VL结构域的抗体分子，所述VH结构域与所附序列表中所示抗体1的VH结构域具有至少60、70、80、85、90、95、98或99％的氨基酸序列同一性，所述VL结构域与所附序列表中所示抗体1的VL结构域具有至少60、70、80、85、90、95、98或99％的氨基酸序列同一性。可以用于计算两个氨基酸序列的同一性百分比的算法包括例如BLAST[52]，FASTA[53]或Smith-Waterman算法[54]，例如采用默认参数。
VH结构域、VL结构域和/或CDRs或CDRs组的特定变体可以包括一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)。变体可以包括少于约20个改变，例如少于约15个，少于约10个，或少于约5个改变，如5、4、3、2或1个。
可以在一个或多个构架区和/或一个或多个CDRs中进行改变。改变通常不导致功能丧失，所以包含由此改变的氨基酸序列的结合成员可以保留结合和/或中和CXCL13的能力。如本文描述的测定中所测量的，它可以保留与不进行改变的结合成员相同的定量结合和/或中和能力。包含如此改变的氨基酸序列的结合成员可以具有改进的结合和/或中和CXCL13的能力。
改变可以包括用非天然存在的或非标准氨基酸替代一个或多个氨基酸残基，将一个或多个氨基酸残基修饰为非天然存在或非标准形式，或将一个或多个非天然存在的或非标准氨基酸插入序列中。本发明的序列中改变的数目和位置在本文其他地方描述。天然存在的氨基酸包括20个“标准”L氨基酸，其由它们的标准单字母代码鉴定为G，A，V，L，I，M，P，F，W，S，T，N，Q，Y，C，K，R，H，D，E。非标准氨基酸包括任何可以掺入多肽主链或由存在的氨基酸残基的修饰的得到的其他氨基酸。非标准氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的。一些天然存在的非标准氨基酸是本领域已知的，如4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、N-乙酰丝氨酸等[55]。在N-α位置衍生化的氨基酸残基将仅仅位于氨基酸序列的N末端。通常，在本发明中，氨基酸是L-氨基酸，但它也可以是D-氨基酸。因此，改变可以包括将L-氨基酸修饰为D-氨基酸，或用D-氨基酸取代L-氨基酸。氨基酸的甲基化、乙酰化和/或磷酸化形式也是已知的，并且本发明中的氨基酸可以进行所述修饰。
本发明的抗体结构域和结合成员中的氨基酸序列可以包含上文描述的非天然或非标准氨基酸。非标准氨基酸(如D-氨基酸)可以在合成过程中掺入氨基酸序列中，或在氨基酸序列合成后修饰或取代“原始”标准氨基酸。
非标准和/或非天然存在的氨基酸的使用增加了结构和功能多样性，并且因此能够增加实现本发明的结合成员中所需的CXCL13结合和中和特性的潜能。此外，已经显示了D-氨基酸及其类似物与标准L-氨基酸相比具有不同的药代动力学谱，这是由于在施用于动物如人之后具有L-氨基酸的多肽的体内降解，表明D-氨基酸对于一些体内应用是有利的。
可以采用一个或多个选定的VH和/或VL基因的随机诱变来制备携带本发明的CDR衍生的序列的新VH或VL区，从而在整个可变区内产生突变。所述技术描述于Gram等[56]，其使用易错PCR。在一些实施方案中，在整个可变区或CDRs组内进行一个或两个氨基酸取代。
可以使用的另一方法是对VH或VL基因的CDR区直接诱变。所述技术公开于Barbas等[57]和Schier等[58]。
所有上述技术在本领域都是已知的，因此技术人员能够利用所述技术，用本领域的常规方法提供本发明的结合成员。
本发明的另一方面提供了用于获得CXCL13的抗体抗原结合位点的方法，所述方法包括：通过在本文所述VH结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸而提供作为VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域，任选组合由此提供的VH结构域与一个或多个VL结构域，并且测试VH结构域或VH/VL组合，从而鉴定CXCL13的结合成员或抗体抗原结合位点，其任选具有一种或多种需要的特性，如中和CXCL13的能力。所述VL结构域可以具有基本如本文所述的氨基酸序列。可以使用类似方法，其中本文公开的VL结构域的一个或多个序列变体与一个或多个VH结构域组合。
如上文指出的，基本如本文所述的CDR氨基酸序列可以携带为人抗体可变区或其主要部分中的CDR。基本如本文所述的HCDR3序列代表了本发明的实施方案，并且其中的每一种都可以携带为人重链可变区或其主要部分中的HCDR3。
可以从任何种系或重排的人可变区获得或衍生本发明中采用的可变区，或可以是基于已知人可变区的共有或实际序列的合成的可变区。可变区可以来源于非人抗体。可以用重组DNA技术将本发明的CDR序列(如CDR3)导入缺乏CDR(如CDR3)的可变区的所有组成成分。例如，Marks等[59]描述了制备抗体可变区所有组成成分的方法，其中针对或邻近可变区5’末端的共有引物与人VH基因的第三构架区的共有引物结合使用，从而提供缺乏CDR3的VH可变区的所有组成成分。Marks等进一步描述了这种所有组成成分如何能够与特定抗体的CDR3组合。采用类似技术，本发明的CDR3衍生的序列可以用缺乏CDR3的VH或VL结构域的所有组成成分进行改组，并且将改组的完整VH或VL结构域与相关VL或VH结构域组合，从而提供本发明的结合成员。然后所述所有组成成分可以在合适的宿主系统，如WO92/01047(在此通过全文引用而并入本文)或任何后续的大量文献(包括Kay，Winter&McCafferty[60])中的噬菌体展示系统中展示，从而可以选择合适的结合成员。所有组成成分可以由从104个单个成员直到例如至少105，至少106，至少107，至少108，至少109或至少1010个成员或更多。其他合适的宿主系统包括但不限于酵母展示，细菌展示，T7展示，病毒展示，细胞展示，核糖体展示和共价展示。
提供了制备CXCL13抗原的结合成员的方法，所述方法包括：
(a)提供编码VH结构域的核酸的起始所有组成成分，所述VH结构域包括要被取代的CDR3或缺乏CDR3编码区；
(b)将所述所有组成成分与编码基本如本文所述的VH CDR3的氨基酸序列的供体核酸组合，使得所述供体核酸插入该所有组成成分的CDR3区中，从而提供编码VH结构域的核酸的产物所有组成成分；
(c)表达所述产物所有组成成分的核酸；
(d)选择CXCL13的结合成员；和
(e)回收所述结合成员或编码它的核酸。
也可以采用类似的方法，其中本发明的VL CDR3与编码VL结构域的核酸的所有组成成分组合，所述VL结构域包含要被取代的CDR3或缺乏CDR3编码区。
类似地，一个或多个或所有三个CDRs可以移植到VL或VH结构域的所有组成成分中，随后对其筛选，得到CXCL13的结合成员。
例如，可以采用抗体1HCDR1、HCDR2和HCDR3的一个或多个，或抗体1的HCDRs组，和/或抗体1LCDR1、LCDR2和LCDR3的一个或多个，或抗体1的LCDRs组。
类似地，可以采用本文公开的其他VH和VL结构域、CDRs组和HCDRs组和/或LCDRs组。
免疫球蛋白可变区的主要部分可以至少包含所述3个CDRs区，以及它们的间插构架区。该部分也可以包含第1和第4构架区中任一个或全部两个的至少约50％，所述50％是第1构架区的C末端的50％和第4构架区的N末端的50％。可变区主要部分的N末端或C末端上的额外的残基可以是通常不与天然存在的可变区相关的那些。例如，通过重组DNA技术制备的本发明的结合成员的构建，可以导致由导入用于促进克隆或其他操作步骤的接头编码的N或C末端残基的导入。其他操作步骤包括导入接头，以连接本发明的可变区与其他蛋白序列，包括本文其他地方更详细讨论的抗体恒定区、其他可变区(例如在双抗体的制备中)或可检测的/功能性标记。
尽管在本发明的一些方面，结合成员包含一对VH和VL结构域，但基于VH或VL结构域序列的单个结合域形成本发明的其他方面。已知单个免疫球蛋白结构域，特别是VH结构域，能够以特异性方式结合靶抗原。例如，参见上文dAbs的讨论。
在单个结合域的任何一个的情况下，这些结构域可以用于筛选能够形成由两个结合域组成的结合成员的互补结构域，所述结合成员能够结合CXCL13。这可以通过使用WO92/01047中公开的所谓等级双组合方法，通过噬菌体展示筛选方法实现，所述文献通过全文引用并入本文，其中用含有H或L链克隆的单个菌落感染编码另一条链(L或H)的克隆的完整文库，并且根据噬菌体展示技术(如该文献中描述的那些)选择得到的两链结合成员。这一技术也公开于Marks等，同上。
本发明的结合成员可以进一步包括抗体恒定区或其部分，如人抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可以在其C末端与抗体轻链恒定区，包括人Cк或Cλ链连接。类似地，基于VH结构域的结合成员可以在其C末端与来源于抗体同种型，如IgG，IgA，IgE和IgM以及任何同种型亚类，特别是IgG1和IgG4的免疫球蛋白重链的全部或部分(如CH1结构域)连接。由于其效应物功能和易于制造，IgG1是有利的。具有这些特性并且使可变区稳定的任何合成的或其他恒定区变体也可以用于本发明。
本发明的结合成员可以用可检测或功能性标记进行标记。因此，结合成员或抗体分子可以以免疫缀合物的形式存在，从而获得可检测和/或可定量的信号。免疫缀合物可以包含与可检测标记或功能性标记缀合的本发明的抗体分子。标记可以是任何产生信号或可被诱导产生信号的分子，包括但不限于荧光剂、放射性标记、酶、化学发光剂或光敏剂。因此，可以通过检测荧光或发光、放射性、酶活性或光吸收来检测和/或测量结合。
举例说明但不限制，合适的标记包括
-酶，如碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(″G6PDH″)、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶和过氧化物酶，如辣根过氧化物酶；
-染料；
-荧光标记物或荧光剂，如荧光素及其衍生物、荧光染料、罗丹明化合物及衍生物、GFP(GFP代表“绿色荧光蛋白”)、丹酰、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺；荧光团如镧系元素穴状化合物和螯合物，如铕等(Perkin Elmer and CisBiointernational)，
-化学发光标记或化学发光剂，如异鲁米诺、鲁米诺和二氧杂环丁烷；
-生物发光标记，如荧光素酶和荧光素；
-感光剂；
-辅酶；
-酶底物；
-放射性标记，包括但不限于溴77，碳14，钴57，氟8，镓67，镓68，氢3(氚)，铟111，铟113m，碘123m，碘125，碘126，碘131，碘133，汞107，汞203，磷32，铼99m，铼101，铼105，钌95，钌97，钌103，钌105，钪47，硒75，硫35，锝99，锝99m，碲121m，碲122m，碲125m，铥165，铥167，铥168，钇199和本文提到的其他放射性标记物；
-颗粒，例如乳胶或碳颗粒；金属溶胶；微晶；脂质体；细胞等，其可以进一步用染料、催化剂或其他可检测基团进一步标记；
-诸如生物素、洋地黄毒苷或5-溴脱氧尿苷的分子；
-毒素部分，如选自下组的毒素部分：假单胞菌外毒素(PE或其细胞毒性片段或突变体)、白喉毒素或其细胞毒性片段或突变体、肉毒杆菌毒素A，B，C，D，E或F、蓖麻毒蛋白或其细胞毒性片段，如蓖麻毒蛋白A、相思豆毒蛋白或其细胞毒性片段、皂草毒蛋白或其细胞毒性片段、美洲商陆抗病毒毒素或其细胞毒性片段，以及异株泻根毒蛋白1或其细胞毒性蛋白。
合适的酶和辅酶公开于Litman，等，US4275149和Boguslaski，等，US4318980，所述文献的每一篇都在此通过全文引用而并入本文。合适的荧光剂和化学发光剂公开于Litman，等，US4275149，所述文献在此通过全文引用而并入本文。标记进一步包括化学部分，如可以通过与特异性相关可检测部分如标记的亲和素或链霉亲和素结合而检测的生物素。可检测的标记可以用本领域已知的常规化学连接于本发明的抗体。
可以通过本领域技术人员已知的方法制备免疫缀合物或其功能性片段。它们可以直接与酶或荧光标记偶联，或通过间隔基或连接基团(例如聚醛，如戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯-三胺五乙酸)的媒介进行连接，或在偶联剂存在下进行偶联，所述偶联剂如上文对治疗性缀合物所提到的那些。含有荧光素类型的标记的缀合物可以通过与异硫氰酸酯的反应而制备。
可以将本领域技术人员已知的、用于直接或通过螯合剂如上述EDTA、DTPA将治疗性放射性同位素偶联于抗体的方法用于放射性元素，所述放射性元素可以用于诊断中。同样，可以通过氯胺T方法[61]用钠25进行标记，或通过Crockford等，(US4424200，通过全文引用而并入本文)的技术，用锝99m标记，或按照Hnatowich(US4479930，通过全文引用并入本文)的描述，通过DTPA连接。
存在许多方法，可以通过这些方法产生可通过外部手段检测的信号，所述手段例如肉眼检查、电磁辐射、热和化学试剂。标记也可以与结合本发明的抗体的另一结合成员或与支持物结合。
标记可以直接产生信号，因此，不需要额外的成分来产生信号。许多有机分子，例如荧光剂，可以吸收紫外线和可见光，其中所述光吸收可以将能量转移到这些分子，并且将它们升高到激发的能量状态。这种吸收的能量随后通过发射第二波长的光而消散。这种第二波长发射也可以将能量转移到标记的受体分子，并且得到的能量通过发射光，例如荧光共振能量转移(FRET)从受体分子消散。其他直接产生信号的标记包括放射性同位素和染料。
或者，标记可能需要其他成分来产生信号，并且随后信号产生系统包括产生可测量信号所需的成分，可以包括底物、辅酶、增强剂、其他酶、与酶产物反应的物质、催化剂、激活剂、辅因子、抑制剂、清除剂、金属离子和结合信号产生物质所需的特异性结合物质。合适的信号产生系统的详细讨论可以参见Ullman，等US5185243，所述文献在此通过全文引用而并入本文。
本发明提供了一种方法，包括导致或允许本文提供的结合成员与CXCL13结合。如所指出的，所述结合可以体内发生，例如，在施用结合成员或编码结合成员的核酸之后，或它可以体外发生，例如在ELISA、蛋白印记、免疫细胞化学、免疫沉淀、亲和层析和生物化学或基于细胞的测定，如cAMP、钙释放或B细胞趋化性测定中。
本发明也提供了例如在生物传感器系统中通过采用本发明的结合成员，直接测量抗原水平。例如，本发明包括检测和/或测量与CXCL13的结合的方法，包括，(i)将所述结合成员暴露于CXCL13，和(ii)检测所述结合成员与CXCL13的结合，其中所述结合是采用本文描述的任何方法或可检测标记进行检测的。本文描述的这种和任何其他结合检测方法可以由进行该方法的人直接解释，例如，通过肉眼观察可检测标记。或者，本文描述的这种和任何其他结合检测方法可以产生以下形式的报道：放射自显影照片、照片、计算机打印输出、流式细胞术报道、图、表、含有结果的试管或容器或孔，或该方法的结果的其他视觉或物理表现。
可以确定结合成员与CXCL13的结合量。定量可以与测试样品中抗原的量相关，其可以具有诊断意义。对CXCL13结合的筛选和/或其定量，可以用于例如筛选患者中的本文提到的疾病或病症和/或其他涉及异常CXCL13表达和/或活性的疾病或病症。
许多疾病与水平增加的CXCL13相关。CXCL13水平是用于许多病症的有用诊断和/或预后指标，例如，本文其他地方描述的炎症和/或自身免疫疾病。例如，CXCL13的升高的水平，例如在血清或滑液样品中的升高的水平，可以用作类风湿关节炎的预测指标。
本发明的诊断方法可以包括(i)从受试者获得组织或液体样品，(ii)将所述组织或液体样品暴露于一个或多个本发明的结合成员；和(iii)检测与对照样品相比的结合的CXCL13，其中与对照相比，CXCL13结合量的增加，可以表示CXCL13表达或活性的异常水平。要测试的组织或液体样品包括血液、血清、尿、活检材料、肿瘤或任何怀疑含有异常CXCL13水平的组织。测试为异常CXCL13水平或活性阳性的受试者也可以从下文公开的治疗方法中获益。
本领域技术人员能够根据他们的偏好和一般知识，根据本文公开的方法，选择用于确定结合成员与抗原的结合的合适模式。
可以通过任何合适的方法确定样品中结合成员的反应性。放射免疫测定(RIA)是一种可能性。放射性标记的抗原与未标记的抗原(测试样品)混合，并且使其与结合成员结合。结合的抗原是与未结合的抗原物理上分开的，并且确定与结合成员结合的放射性抗原的量。测试样品中的抗原越多，与结合成员结合的放射性抗原就越少。采用与报道分子连接的抗原或类似物，竞争性结合测定也可以与非放射性抗原一起使用。报道分子可以是具有光谱上分离的吸收或发射的荧光染料、磷或激光染料。合适的荧光染料包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白和得克萨斯红，以及镧系元素螯合物或穴状化合物。合适的发色染料包括二氨基联苯胺。
其他报道物包括大分子胶体颗粒或颗粒状材料，例如有色的、磁性或顺磁乳胶珠，和能够直接或间接导致可检测的信号能够被肉眼观察、电子检测或以其他方式记录的生物或化学活性试剂。这些分子可以是酶，其催化例如显色或改变颜色或导致电特性改变的反应。它们可以是分子可激发的，使得能量状态之间的电转变能够导致特征性光谱吸收或发射。它们可以包括与生物传感器一起使用的化学实体。可以使用生物素/亲和素或生物素/链霉亲和素和碱性磷酸酶检测系统。
由单个结合成员-报道物缀合物产生的信号可以用于得到样品(正常和测试样品)中相关结合成员的可定量绝对或相对数据。
包含本发明的任何方面或实施方案的结合成员的试剂盒也可以提供为本发明的一方面。在试剂盒中，结合成员可以进行标记，使得能够确定其在样品中的反应性，如下文进一步的描述。进一步，结合成员可以与固体支持物连接，或不与其连接。试剂盒的成分通常是无菌的，并且在密封的管型瓶或其他容器中，试剂盒可以用于诊断分析或其他方法(结合成员对于所述方法有用)。试剂盒可以含有在方法(例如本发明的方法)中使用各成分的说明书。本发明的试剂盒中可以包含辅助材料，用于辅助进行所述方法，或使得能够进行所述方法。辅助材料包括第二种不同的结合成员，其结合于第一结合成员，并且缀合于可检测的标记(如荧光标记、放射性同位素或酶)。基于抗体的试剂盒也可以包含用于进行免疫沉淀的珠。试剂盒的每种成分通常在其自身的合适容器中。因此，这些试剂盒通常包含适用于每个结合成员的不同容器。此外，试剂盒可以包含进行所述测定的试剂盒和用于解释和分析进行测定所得到的数据的方法。
本发明也提供了用上述结合成员在竞争测定中测量抗原水平的方法，也就是说，提供了在竞争测定中通过使用本发明提供的结合成员而测量样品中的抗原水平的方法。这可以是其中不需要结合与未结合抗原的物理分离。将报道分子与结合成员连接，使得结合而发生的物理或光学改变是一种可能性。报道分子可以直接或间接产生可检测信号，所述信号是可以定量的。报道分子的连接可以是直接或间接的、共价的(例如通过肽键)或非共价的。通过肽键的连接可以是编码抗体和报道分子的基因融合物重组表达的结果。
在多个方面和实施方案中，本发明延伸到与本文定义的任何结合成员如抗体1(如IgG1形式)竞争结合CXCL13(如人CXCL13)的结合成员。可以在体外容易地测定结合成员之间的竞争，例如，通过将特异性报道分子加标签(tagged)于一个结合成员，使其可以在其他未加标签的结合成员存在下被检测到，使得能够鉴定结合相同表位或重叠表位的结合成员。可以例如用ELISA确定竞争，其中将CXCL13固定于平板，并且将加标签的或标记的第一结合成员与一个或多个其他未加标签的或未标记的结合成员一起添加到平板中。通过加标签的结合成员发射的信号的减少，观察到与加标签的结合成员竞争的、未加标签的结合成员的存在。在一个实例中，可以使用
Figure A20088000550600421
表位竞争测定。
例如，本发明包括鉴定CXCL13结合化合物的方法，包括(i)将CXCL13固定于支持物，(ii)使所述固定的CXCL13同时或以逐步方式与至少一个本发明的加标签的或标记的结合成员和一个或多个未加标签的或未标记的测试结合化合物接触，和(iii)通过观察结合的标签从加标签的结合成员减少的量，鉴定新的CXCL13结合化合物。所述方法可以用多孔或阵列形式以高通量方式进行。所述测定也可以在溶液中进行。参见例如U.S.5,814,468，该文献在此通过引用而并入本文。如上文所描述的，例如通过肉眼观察可检测的标记或其存在下的减少，可以由执行该方法的人直接解释结合的检测。或者，本发明的结合方法可以产生以下形式的报道：放射自显影照片、照片、计算机打印输出、流式细胞术报道、图、表、含有结果的试管或容器或孔，或该方法的结果的其他视觉或物理表现。
竞争测定也可以用于表位作图中。在一种情况下，表位作图可以用于鉴定由CXCL13结合成员结合的表位，所述结合成员任选可以具有优化的中和和/或调节特征。所述表位可以是线性或构象的。构象表位可以包含CXCL13的至少两个不同的片段，其中当CXCL13折叠为其三级或四级结构时，所述片段彼此邻近，以形成构象表位，所述构象表位由CXCL13的抑制剂，如CXCL13结合成员识别。在测试竞争时，可以使用抗原的肽片段，特别是包括感兴趣的表位或基本由感兴趣的表位组成的肽。可以使用在任一末端具有表位序列加上一个或多个氨基酸的肽。本发明的结合成员可以是这样的，即它们对抗原的结合受到具有或包括给定序列的肽的抑制。
本发明进一步提供了编码本发明的结合成员的分离的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA。一方面，本发明提供了核酸，其编码上文定义的本发明的CDR或CDRs组或VH结构域或VL结构域或抗体抗原结合位点或抗体分子，如scFv或IgG1。
本发明也提供了质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，其包含至少一种上文所述的多核苷酸。
本发明也提供了重组宿主细胞，其包含一个或多个上文所述的构建体。编码提供的任何CDR或CDRs组或VH结构域或VL结构域或抗体抗原结合位点或抗体分子，如scFv或IgG1的核酸自身形成了本发明的一个方面，制备所编码的产物的方法也形成了本发明的一个方面，因此所述方法包括从编码核酸表达。可以通过在合适的条件下培养含核酸的重组宿主细胞而方便地实现表达。在通过表达VH或VL结构域而产生后，可以用任何合适的技术分离和/或纯化结合成员，然后合适地使用。
本发明的核酸可以包括DNA或RNA，并且可以是完全或部分合成的。本文提到的核苷酸序列包括具有指定序列的DNA分子，并且包括具有指定序列的RNA分子，其中U代替T，除非上下文有其他要求。
另一方面提供了制备抗体VH可变区的方法，该方法包括导致从编码核酸表达。所述方法可以包括在用于生产所述抗体VH可变区的条件下培养宿主细胞。
提供了用于生产VL可变区和包含VH和/或VL结构域的结合成员的类似方法，作为本发明的其他方面。
生产方法可以包括分离和/或纯化产物的步骤。生产方法可以包括将产物配制为组合物，所述组合物包含至少一种额外的成分，如药学可接受的赋形剂。
用于在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是公知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母和杆状病毒系统和转基因植物和动物。在原核细胞中表达抗体和抗体片段是本领域公知的。综述参加例如Plückthun[62]。共同的细菌宿主是大肠杆菌。
在培养中的真核细胞中表达，也可以被本领域技术人员用作生产结合成员的选项[63，64，65]。本领域中可以用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Hela细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚肾细胞、人胚视网膜细胞和很多其他细胞。
可以选择或构建合适的载体，其中含有合适的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他合适的序列。载体可以是质粒，如噬菌粒，或病毒，如合适的噬菌体[66]。很多例如在制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA导入细胞和基因表达以及蛋白分析中用于操作核酸的已知技术和方案详细描述于Ausubel等[67]。
本发明的另一方面提供了包含本文公开的核酸的宿主细胞。所述宿主细胞可以是体外的，并且可以是培养中的。所述宿主细胞可以是体内的。宿主细胞的体内存在可以允许本发明的结合成员在细胞内表达为“胞内抗体”或细胞内抗体。胞内抗体可以用于基因治疗。
另一方面提供了一种方法，包括将本发明的核酸导入宿主细胞。所述导入可以采用任何可利用的技术。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐、电穿孔、脂质体介导的转染和用逆转录病毒或其他病毒如痘苗病毒转导，或对于昆虫细胞，用杆状病毒转导。将核酸导入宿主细胞，特别是真核细胞，可以使用基于病毒或质粒的系统。质粒系统可以附加保持或可以掺入宿主细胞或掺入人工染色体。可以通过在单个或多个基因座随机或导向整合一个或多个拷贝而进行掺入。对于细菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和用噬菌体转染。
导入可以通过导致或允许从核酸表达而进行，例如，通过在用于表达基因的条件下培养宿主细胞。可以通过本领域技术人员已知的方法实现表达的产物的纯化。
本发明的核酸可以整合到宿主细胞的基因组(如染色体)中。可以根据标准技术，通过引入促进与基因组重组的序列而促进整合。
本发明也提供了一种方法，包括在表达系统中使用上文所述的构建体，以便表达上文所述的结合成员或多肽。
本发明的结合成员可以用于诊断或治疗人或动物受试者如人的方法中。CXCL13的结合成员可以用于治疗与CXCL13相关，如与异常CXCL13表达和/或活性相关的病症。如本文其他地方所讨论的，存在CXCL13参与多种病症的证据。本发明的结合成员可以用于抑制CXCL13结合CXCR5，从而用于治疗由CXCL13结合CXCR5所介导的疾病或病症。与CXCL13相关的病症包括由CXCL13结合于其受体CXCR5导致和/或加重的病症。本发明的方面涉及通过缓解或改善一种或多种症状和/或病症的原因而治疗所述病症。
CXCL13的结合成员可以用于抑制或减少淋巴滤泡，如异位淋巴滤泡，如关节滑膜中存在的异位淋巴滤泡的异常形成和/或发展。结合成员可以抑制或减少：CXCL13-CXCR5信号传导介导的B细胞和/或树突细胞和/或滤泡B辅助T细胞募集到滤泡；和/或减少由滤泡B细胞产生免疫球蛋白；和/或抑制或减少滤泡B细胞产生细胞因子和/或激活T细胞。结合成员也可以用于抑制或减少异常骨和/或软骨破坏。
因此，结合成员可以用于治疗与异常或异位淋巴滤泡相关的疾病或病症。与异位淋巴滤泡相关的病症包括类风湿关节炎、干燥综合征、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性甲状腺疾病(如格雷夫斯病，桥本氏甲状腺炎)、慢性感染，如莱姆神经疏螺旋体病(Lyme Neuroborreliosis)和以Quilty效应为特征的急性心脏排斥。
例如，发炎的关节滑膜通常特征在于：含有生发中心的异位淋巴滤泡；炎性细胞浸润；B细胞产生自身抗体和细胞因子；T细胞的B细胞激活；和/或骨和软骨破坏。结合成员可以破坏如本文描述的异位滤泡的形式，由此抑制B细胞自身抗体生成和/或滑膜炎症。因此，结合成员可以用于治疗关节炎病症，如类风湿关节炎(RA)和/或骨关节炎。
本发明的结合成员可以用于治疗骨和/或关节疾病或病症，特别是与骨和/或软骨的破坏和/或重塑相关的疾病或病症，如骨和软骨的异常更新。例如，结合成员可以用于治疗类风湿关节炎和/或骨关节炎。
本发明的结合成员可以用于抑制淋巴细胞(如B和/或T细胞)趋化性，并且因此可以用于治疗与淋巴细胞趋化性相关的病症，如病毒感染(如HIV感染)和白血病(如T细胞系急性淋巴细胞白血病和B细胞系急性和慢性淋巴细胞白血病)。
本发明的结合成员可以用于抑制淋巴瘤的增殖，因此可以用于治疗与淋巴瘤增殖相关的病症，如白血病(如T细胞系急性淋巴细胞白血病和B细胞系急性和慢性淋巴细胞白血病)。
如本文所述的，CXCL13的结合成员可以用于抑制淋巴滤泡，如异位淋巴滤泡的异常形成和/或发展，抑制异常骨和/或软骨破坏和/或重塑，和/或抑制淋巴细胞的趋化性和/或淋巴瘤的增殖。因此，本发明提供了抑制淋巴滤泡，如异位淋巴滤泡的异常形成和/或发展，抑制异常骨和/或软骨破坏和/或重塑，和/或抑制淋巴细胞的趋化性和/或淋巴瘤的增殖的方法，包括给需要其的患者施用有效量的、单独或在与另一种本领域已知的或本文描述的合适药物的组合治疗方案中的一种或多种本发明的结合成员，使得淋巴滤泡，如异位淋巴滤泡的异常形成和/或发展，异常骨和/或软骨破坏和/或重塑，和/或淋巴细胞的趋化性和/或淋巴瘤的增殖被抑制。
本发明的结合成员可以用于诊断与CXCL13相关的疾病或病症，例如，其中CXCL13的水平改变，例如相对于正常水平升高。结合成员可以用于诊断本文描述的一种或多种疾病或病症，包括例如类风湿关节炎、干燥综合征、HIV、重症肌无力、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(angioimmunoblastic T-cell lymphoma)和可传播的海绵状脑病(TSE)。
下文和本文其他地方描述了CXCL13参与某些病症的证据。此外，本文提供的数据进一步表明本发明的结合成员可以用于治疗所述病症，包括预防性处理病症和降低病症的严重程度。因此，本发明提供了治疗本文所述任何病症的至少一种症状或减轻其严重程度的方法，包括给需要其的患者施用有效量的、单独的或在与另一种本领域已知或本文描述的合适药物的组合治疗方案中的一种或多种本发明的结合成员，使得任何上述病症的至少一种症状的严重程度减轻。
CXCL13在外周淋巴器官和先天免疫的发育中的作用的证据部分描述于本文其他地方。
除此之外，一系列证据表明了CXCL13在男性类风湿关节炎(RA)的致病中的作用。例如，CXCL13mRNA和蛋白的表达在RA滑膜中升高[68]，在RA滑膜中的CXCL13蛋白水平和疾病严重程度之间存在正相关[69]。我们也发现了，在RA患者的血清和滑膜液中测量到了升高水平的CXCL13，表明本发明的结合成员可以用于本文描述的诊断RA的方法中。
发炎的滑膜的特征在于炎性细胞浸润和类似淋巴组织的有组织的淋巴细胞聚集物的存在。这些异位淋巴结构含有生发中心的特征，包括FDCs的存在和高内皮小静脉(HEVs)的存在。生发中心提供了支持B细胞分化为浆细胞和高亲和力抗体如类风湿因子产生的微环境[70]。RA滑膜中的CXCL13蛋白已经免疫定位于生发中心内的FDCs[69]和细胞浸润物中的巨噬细胞[71]。在RA病变中，CXCL13强烈预测异位淋巴滤泡形成和生发中心反应的发展(Takemura，S.等J.Immunol.167：1072-1080，2001)。
通过来自疾病的动物模型的体内证据，进一步支持了CXCL13在RA中的作用。CXCL13中和抗体的预防性给药减少了小鼠中胶原诱导的关节炎(CIA)的疾病严重程度，伴随向关节炎关节中的炎性细胞浸润减少和软骨和骨侵蚀程度的降低[72]。在CIA模型中，用抗CXCL13抗体治疗的小鼠的脾和关节与对照小鼠相比，含有较少的生发中心，并且生发中心的大小更小[72]。
其他研究显示了CXCR5缺陷的小鼠在佐剂诱导的关节炎(AIA)模型中发生较不严重的症状，伴有滑膜炎症和关节破坏减少(Hartmann，S.等，European Congress on Immunology，abstract 2672，2006)。在该研究中，有组织的生发中心、抗-抗原抗体和抗原诱导的T细胞增殖反应的水平也降低。
也通过来自培养的软骨细胞和成骨细胞的体外证据证明了CXCL13在骨和软骨更新中的作用。CXCR5在分离自骨关节炎(OA)患者的关节软骨的软骨细胞上表达。在含有CXCL13的培养条件中处理这些软骨细胞，诱导了基质金属蛋白酶(MMPs)和组织蛋白酶B的释放，并且诱导了增殖[73]。CXCL13也诱导来源于OA患者的培养的成骨细胞的增殖和白介素-1(IL-1)mRNA的表达[74]。也可以通过IL-1处理增强从培养的成骨细胞的基本CXCL13分泌[75]。在从进行关节手术的RA患者取出的骨样品中，将CXCL13蛋白免疫定位于含淋巴新生特征的骨髓中的单核细胞聚集物[76]。
CXCR5受体在具有B细胞辅助功能的一个亚群的记忆T细胞上表达，所述T细胞是指定的滤泡B辅助T细胞(TFH)。CXCL13诱导从人扁桃体分离的表达CXCR5的TFH细胞的趋化性[77]，而在二级淋巴器官中，CXCR5阳性TFH细胞定位于B细胞滤泡和生发中心，在此处它们支持免疫球蛋白产生[78]。新鲜分离自生发中心的TFH细胞分泌低水平的CXCL13，但是该水平在通过TCR和CD28刺激后显著升高(Kim，CH.等Blood，104：1952-1960，2004)。
已经鉴定了一个亚群的树突细胞，它们表达CXCR5并且反应于CXCL13而定位于淋巴滤泡[79]。这种反应依赖于B细胞来源的膜结合的淋巴毒素，所述淋巴毒素刺激由滤泡基质细胞表达CXCL13，并且确立了将CXCR5阳性细胞募集到滤泡中必须的趋化成分。
尽管B细胞运输的抑制在临床上没有先例，但是存在关于RA患者中B细胞清除治疗的效力的临床先例[80]。用嵌合的抗CD20单克隆抗体进行的B细胞清除是有效的，并且在经历单疗程治疗后数月到数年的持续疾病缓解期的患者中是耐受良好的。减少自身抗体水平是B细胞清除成功的关键机理，因为临床复发与血清自身抗体恢复到治疗前水平相关[81]。除了自身抗体产生，认为B细胞通过抗原呈递引起的细胞因子产生和T细胞激活而导致RA进展。
CXCL13中和作用对B细胞运输的抑制，代表了治疗RA的新方法。CXCL13中和作用通过破坏RA滑膜中的异位滤泡和生发中心反应，对抑制自身抗体产生和滑膜炎症都具有作用。CXCL13中和作用通过防止由直接和间接机理引起的骨和软骨破坏，可以提供额外的益处。
已经在HIV中描述了升高水平的CXCL13(Widney，DP.等J.Int.Cyt.Res.25：702-706，2005)。也已经报道了将CXCL13用作可传播的海绵状脑病(TSE)的替代标记物(EP1703282A1)。
本发明的结合成员可以用于治疗以下任何疾病：
1.呼吸道：气道的阻塞性疾病，包括：间歇性和持续性并且具有所有严重程度的哮喘，包括支气管性、过敏性、内源性、外源性、运动诱导的、药物诱导的(包括阿斯匹林和NSAID诱导的)和灰尘诱导的哮喘，以及其他原因的气道高反应性；慢性阻塞性肺疾病(COPD)；支气管炎，包括感染性和嗜酸性细胞支气管炎；肺气肿；支气管扩张；囊性纤维化；肉状瘤病；农民肺和相关疾病；过敏性肺炎；肺纤维化，包括隐发性纤维化肺泡炎，特发性间质性肺炎，合并抗肿瘤治疗和慢性感染，包括肺结核和曲霉病和其他真菌感染的纤维化；肺移植的合并症；肺脉管系统的脉管炎和血栓形成病症，和肺高压；抗组织活性，包括治疗与气道的炎症和分泌状况相关的慢性咳嗽，和医源性咳嗽；急性和慢性鼻炎，包括药物性鼻炎和血管运动性鼻炎；终年性和季节性过敏性鼻炎，包括神经性鼻炎(枯草热)；鼻息肉；急性病毒感染，包括普通感冒，和呼吸道合胞病毒，流感病毒，冠状病毒(包括SARS)和腺病毒引起的感染；
2.骨和关节：原发的和继发于例如先天性髋骨发育不良的、与骨关节炎/骨关节病相关或包括骨关节炎/骨关节病的关节炎疹；颈椎和腰椎脊柱炎，以及下背部和颈部疼痛；类风湿关节炎和斯蒂尔病；血清阴性脊柱关节病，包括强直性脊柱炎、牛皮癣关节炎、反应性关节炎和未分化的脊柱关节病；脓毒症关节炎和其他感染相关的关节病和骨病症，如结核，包括Pott病和Poncet综合征；急性和慢性晶体诱导的滑膜炎，包括急性痛风、磷酸钙沉积疾病和钙磷灰石相关的腱、囊和滑膜炎症；贝切特病；原发和继发性干燥综合征；系统性硬化和局限性硬皮病；系统性红斑狼疮、混合结缔组织病和未分化的结缔组织病；炎性肌病，包括皮肌炎和多肌炎；风湿性多肌痛；幼年关节炎，包括任何关节分布的特发性炎性关节炎疹和相关综合征，和风湿热及其系统合并症；脉管炎(vasculitides)，包括巨细胞关节炎、高安动脉炎、丘-施综合征、结节性多动脉炎、显微多动脉炎和与病毒感染、过敏反应、冷球蛋白和副蛋白相关的脉管炎；下背痛；家族性地中海热、Muckle-Wells综合征和家族性爱尔兰热、Kikuchi病；药物诱导的关节痛、腱炎和肌病；
3.由于损伤(例如运动损伤)或疾病导致的肌肉骨骼病症的疼痛和结缔组织重塑：关节炎(例如类风湿关节炎、骨关节炎、痛风或晶体关节病)、其他关节疾病(例如椎间盘变性或颞下颌关节变性)、骨重塑疾病(例如骨质疏松、佩吉特病或骨坏死)、多软骨炎、硬皮病、混合结缔组织病症、脊柱关节病或牙周病(如牙周炎)；
4.皮肤：牛皮癣、特应性皮炎、接触性皮炎或其他湿疹性皮肤病，和延迟型过敏反应；植物性皮炎和光皮炎；脂溢性皮炎、疱疹样皮炎、扁平苔藓、硬化萎缩性苔藓、坏疽性脓皮病(pyoderma gangrenosum)、皮肤结节病、盘状红斑狼疮、天疱疮、类天疱疮、大疱性表皮松解、荨麻疹、血管性水肿、脉管炎、毒性红斑、皮肤嗜酸性细胞增多、斑秃、男型秃、斯威特综合征、韦-克综合征、多形性红斑、感染性和非感染性蜂窝织炎、脂膜炎；皮肤淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌和其他发育异常病变；药物诱导的病症，包括固定的药疹；
5.眼：睑炎；结膜炎，包括终年性和春季过敏性结膜炎；虹膜炎；前和后葡萄膜炎；脉络膜炎；影响视网膜的自身免疫、退化性或炎性病症；眼炎，包括交感神经性眼炎；结节病；感染，包括病毒、真菌和细菌感染；
6.胃肠道：舌炎、齿龈炎、牙周炎；食管炎，包括反流；嗜酸性细胞胃肠炎、肥大细胞增多症、克隆氏病、结肠炎，包括溃疡性结肠炎、直肠炎、肛门瘙痒；腹部疾病、肠激惹综合征和可能具有远离肠道的影响(例如偏头痛、鼻炎或湿疹)的食物相关过敏；
7.腹部：肝炎，包括自身免疫性、酒精性和病毒性肝炎；肝纤维化和硬化；胆囊炎；急性和慢性胰腺炎；
8.泌尿生殖：肾炎，包括间质性肾炎和肾小球肾炎；肾病综合征；膀胱炎，包括急性和慢性(间质性)膀胱炎和杭那溃疡；急性和慢性尿道炎、前列腺炎、附睾炎、卵巢炎和输卵管炎；外阴-阴道炎；佩罗尼病；勃起功能障碍(男性和女性)；
9.同种异体移植排斥：在例如肾、心脏、肝、肺、骨髓、皮肤或角膜移植后或输血后的急性和慢性移植排斥；或慢性移植物抗宿主疾病；
10.CNS：阿尔茨海默病和其他痴呆病症，包括CJD和nvCJD；淀粉样变；多发性硬化和其他脱髓鞘综合征；脑动脉粥样硬化和脉管炎；颞动脉炎；重症肌无力；急性和慢性疼痛(急性、间歇性或持续性，无论是中枢还是外周来源)，包括内脏痛、头痛、偏头痛、三叉神经痛、非典型面部痛、关节和骨痛、由癌症和肿瘤侵入导致的疼痛、神经病疼痛综合征，包括糖尿病、疱疹后和HIV相关神经病；神经结节病；恶性、感染性或自身免疫过程的外周神经系统合并症；
11.其他自身免疫和过敏性病症，包括桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、阿迪森病、糖尿病、特发性血小板减少性紫癜、嗜酸性细胞筋膜炎、高IgE综合征、抗磷脂综合征；
12.其他具有炎性和免疫成分的病症；包括获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、麻风病、赛扎里综合征；和副肿瘤综合征；
13.心血管：影响冠状动脉和周围循环的动脉粥样硬化；心包炎；心肌炎；炎性和自身免疫性心肌病，包括心肌类肉瘤；缺血再灌注损伤；心内膜炎、心瓣膜炎和主动脉炎，包括感染性(例如梅毒性)主动脉炎；脉管炎(vasculitides)；近端和外周静脉的病症，包括静脉炎和血栓形成，包括深静脉血栓形成和静脉曲张的合并症；
14.肿瘤：治疗常见的癌症，包括前列腺、乳腺、肺、卵巢、胰腺、肠和结肠、胃、皮肤和脑肿瘤和影响骨髓(包括白血病)和淋巴增殖系统的恶性肿瘤，如何杰金和非何杰金淋巴瘤；包括预防和治疗转移性疾病和肿瘤复发，以及副肿瘤综合征；和
15.胃肠道：腹部疾病、直肠炎、嗜酸性细胞胃肠炎、肥大细胞增多症、克隆氏病、溃疡性结肠炎、显微结肠炎、不定位的结肠炎(indeterminant colitis)、肠激惹病症、肠激惹综合征、非炎性腹泻、具有远离肠道的影响的食物相关的过敏，例如偏头痛、鼻炎和湿疹。
本发明的结合成员可以用于动物或疾病的动物模型，包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、鱼、狗、牛、羊、马，等等。涉及CXCL13/CXCR5信号传递系统的动物模型是本领域已知的。例如，类风湿关节炎的动物模型是已知的，例如CIA、AIA和链球菌细胞壁(SCW)模型。MS的动物模型是实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)小鼠模型。SLE的小鼠模型包括MRL/lpr小鼠模型和NZB x NZW F1(BWF1)小鼠模型。
因此，本发明的结合成员可以用作治疗涉及CXCL13，例如CXCL13表达和/或活性，特别是异常表达/活性的疾病或病症的治疗剂。治疗方法可以包括给有需要的患者施用有效量的本发明的结合成员，其中CXCL13的异常表达和/或活性降低。治疗方法可以包括(i)例如用上文描述的诊断方法鉴定表现异常CXCL13水平或活性的患者，并且，(ii)给患者施用有效量的本发明的结合成员，其中CXCL13的异常表达和/或活性降低。根据本发明的有效量是降低CXCL13的异常表达和/或活性的量，从而降低或减轻受治疗的特定疾病或病症的至少一种症状的严重程度，但不一定治愈该疾病或病症。
本发明也提供了拮抗CXCL13的至少一种作用的方法，包括接触或施用有效量的一种或多种本发明的结合成员，使得CXCL13的所述至少一种作用被拮抗。可以被本发明的方法拮抗的CXCL13的作用包括与CXCR5的结合，和由这些结合反应的结果产生的任何下游作用。因此，本发明的结合成员可以用作治疗剂，用于涉及CXCL13-CXCR5，特别是异常CXCL13-CXCR5信号传递的疾病或病症的治疗。
因此，本发明的进一步的方面提供了治疗方法，包括施用所提供的结合成员、包含所述结合成员的药物组合，并且将所述结合成员用于制备要施用的药物中，例如，用于制备药物或药物组合物的方法中，包括用药学可接受的赋形剂配制结合成员。
药学可接受的赋形剂可以是化合物或化合物的组合，其进入药物组合物并且不激发继发反应，并且允许例如促进活性化合物的施用、其在体内的寿命和/或效价的增加，其在溶液中的溶解度的增加，或其保存的改进。这些药学可接受的载体是本领域技术人员公知的，并且可以根据选择的活性化合物的性质和施用方式而进行调整。
本发明的结合成员通常将以药物组合物形似施用，所述药物组合物除结合成员外还包含至少一种成分。因此，根据本发明的、并且用于本发明的用途中的药物组合物除活性成分外还包含药学可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其他材料。所述材料应该是无毒的，并且不应该干扰活性成分的效力。载体或其他材料的精确性质将依赖于施用的途径，如下文所讨论的，所述途径可以是口服、吸入、气管内、局部、血管内或通过注射。
本发明也考虑用于口服施用的药物组合物，如单结构域抗体分子(如″nanobodiesTM″)等。所述口服制剂可以是片剂、胶囊、粉末、液体或半固体形式。片剂可以包含固体载体，如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水、葡萄糖或其他糖类溶液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉内注射，或在受损部位注射，活性成分将是肠胃外可接受的含水溶液形式，其是无热原的，并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域技术人员完全能够用例如等渗载体，如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸化林格氏注射液等制备合适的溶液。可以根据需要使用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂，包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵；苯索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对氨基苯甲酸烷酯，如对氨基酸苯甲酸甲酯或对氨基苯甲酸丙酯；儿荼酚；雷琐酚；环己烷；3’-戊醇；和间甲酚)；低分子量多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属复合物(如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
根据分子的生理化学特性和送递途径，本发明的结合成员可以配制为液体、半固态或固体形式。制剂可以包括赋形剂或赋形剂的组合，例如：糖、氨基酸和表面活性剂。液体制剂可以包括宽范围的抗体浓度和pH。例如可以通过冻干、喷雾干燥或超临界流体技术干燥而生产固体制剂。抗CXCL13的制剂将依赖于预期的送递途径：例如，用于肺送递的制剂可以由具有确保吸入后穿透进入深肺部的物理性质的颗粒组成；局部制剂(例如用于治疗疤痕如皮肤疤痕)可以包括粘度调节剂，其延长药物保留在作用部位的时间。可以用保护结合成员抗迅速释放的载体制备结合成员，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊包被的送递系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。很多用于制备所述制剂的方法都是本领域技术人员已知的[82]。
抗CXCL13治疗可以口服给予(例如单结构域抗体分子(如″nanobodiesTM″))、通过注射给予(例如皮下、关节内、静脉内、腹膜内、动脉内或肌内)、通过吸入给予、气管内给予、通过囊内途径给予(滴注到膀胱内)、或局部给予(例如眼内、鼻内、直肠、伤口内、皮肤上)。可以通过脉冲输注，特别是用剂量逐渐减少的结合成员施用治疗。可以通过治疗的物理化学特征、通过疾病的特殊考虑、或通过对优化效力或减少副作用的考虑而确定施用途径。一种特定的施用途径是静脉内。另一种施用本发明的药物组合物的途径是皮下。预期抗CXCL13治疗不限于临床使用。因此，用无针头装置皮下注射也是有利的。
依赖于要治疗的状况，可以同时或顺序、单独或与其他治疗组合施用组合物。
CXCL13的结合成员可以用作与另外的药物成分组合的组合治疗的一部分。组合治疗可以用于提供显著的协同效应，特别是抗CXCL13结合成员与一种或多种其他药物的组合。CXCL13的结合成员可以与另外的治疗剂同时或序贯施用或作为与另外的治疗剂的组合制剂而施用，用于治疗一种或多种本文列出的状况。
本发明的结合成员可以与一种或多种以下试剂组合或叠加提供：
-细胞因子或细胞因子的激动剂或拮抗剂(如作用于细胞因子信号传递途径的试剂，如SOCS系统的调节剂)，如α、β和/或γ-干扰素；I型胰岛素样生长因子(IGF-1)、其受体和相关的结合蛋白；白介素(IL)，如IL-1至IL-33的一种或多种，和/或白介素拮抗剂或抑制剂，如阿那白滞素(anakinra)；白介素家族成员受体的抑制剂或所述受体的特定亚基的抑制剂、肿瘤坏死因子α(TNF-α)抑制剂，如抗TNF单克隆抗体(例如英夫单抗、阿达木单抗(adalimumab)和/或CDP-870)和/或TNF受体拮抗剂，例如免疫球蛋白分子(如依那西普(etanercept))和/或低分子量试剂，如己酮可可碱；
-B细胞的调节剂，例如导向于B淋巴细胞的单克隆抗体(如CD20(利妥希玛、MRA-aIL16R或Belimumab))或导向于T淋巴细胞的单克隆抗体(如CTLA4-Ig(Abatacept)、HuMax I1-15)；
-B细胞激活、成熟或存活的调节剂(如Atacicept)；
-免疫功能的调节剂，如淋巴毒素LIGHT途径的拮抗剂(如LTBR-Fc)
-抑制破骨细胞活性的调节剂，例如RANKL的抗体；
-趋化因子或趋化因子受体功能的调节剂，例如CCR1，CCR2，CCR2A，CCR2B，CCR3，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR8，CCR9，CCR10和CCR11(用于C-C家族)；CXCR1，CXCR2，CXCR3，CXCR4和CXCR5和CXCR6(用于C-X-C家族)和CX3CR1(用于C-X3-C家族)的拮抗剂；
-基质金属蛋白酶(MMPs)的抑制剂，即以下一种或多种：溶基质蛋白酶、胶原酶和明胶酶以及可聚蛋白聚糖，特别是胶原酶-1(MMP-1)，胶原酶-2(MMP-8)，胶原酶-3(MMP-13)，溶基质蛋白酶-1(MMP-3)，溶基质蛋白酶-2(MMP-10)和/或溶基质蛋白酶-3(MMP-11)和/或MMP-9和/或MMP-12，例如，诸如多西环素的药剂；
-白三烯生物合成抑制剂、5-脂加氧酶(5-LO)抑制剂或5-脂加氧酶激活蛋白(FLAP)拮抗剂，如弃白通；ABT-761；芬留顿(fenleuton)；太波沙林；Abbott-79175；Abbott-85761；N-(5-取代的)-噻吩-2-烷基磺胺；2，6-二-叔丁基苯酚腙；甲氧基四氢吡喃，如Zeneca ZD-2138；化合物SB-210661；吡啶基取代的2-氰基萘化合物，如L-739，010；2-氰基喹啉化合物，如L-746，530；吲哚和/喹啉化合物，如MK-591，MK-886和/或BAY x1005；
-白三烯(LT)B4、LTC4、LTD4和LTE4的受体拮抗剂，选自酚噻嗪-3-1s，如L-651，392；脒基化合物，如CGS-25019c；benzoxalamines，例如昂唑司特(ontazolast)；benzenecarboximidamides，如BIIL 284/260；和化合物，如扎鲁司特、阿鲁司特(ablukast)、孟鲁司特、普仑司特、维卡斯特(MK-679)、RG-12525、245913、iralukast(CGP 45715A)和BAYx 7195；
-磷酸二酯酶(PDE)抑制剂，如methylxanthanine，如茶碱和氨荼碱；和/或选择性PDE同工酶抑制剂，如PDE4抑制剂和/或同工型PDE4D的抑制剂和/或PDE5的抑制剂；
-组胺I型受体拮抗剂，如西替利嗪、氯雷他定、desloratadine、甲镁芳铵、阿伐司丁、特非那定、阿司咪唑、氮卓司丁、左卡巴司丁、chlorpheniramine、异丙嗪、苯甲嗪和/或咪唑斯汀(通常口服、局部或肠胃外施用)；
-质子泵抑制剂(如奥美拉唑)或保护胃的组胺2型受体拮抗剂；
-组胺4型受体的拮抗剂；
-α-1/α-2肾上腺素受体激动剂血管收缩剂拟交感神经剂，如丙己君、苯肾上腺素、苯丙醇胺、肾上腺素、麻黄碱、伪麻黄碱、盐酸萘甲唑林、盐酸氧甲唑林、盐酸四氢唑林、盐酸赛洛唑林、盐酸曲马唑林和盐酸乙基去甲肾上腺素；
-抗胆碱剂，如毒蕈碱受体(M1、M2和M3)拮抗剂，如阿托品、东莨菪碱、格隆溴铵、异丙托品、噻托溴胺(tiotropium bromide)、溴乙东莨菪碱、哌伦西平和替伦西平；
-β肾上腺素受体激动剂(包括β受体亚型1-4)，如异丙肾上腺素、舒喘宁、氟莫特罗、沙美特罗、特步他林、奥西那林、甲磺酸比托特罗和/或吡布特罗，如其手性对应异构体；
-色酮，如色甘酸钠和/或奈多罗米钠；
-糖皮质激素，如氟尼缩松、醋酸去炎松、二丙酸培氯米松、布地奈德、丙酸氟地松、环缩松和/或糠酸毛他松；
-调节细胞核激素受体的试剂，如PPAR；
-免疫球蛋白(Ig)或Ig制剂或调节Ig功能的拮抗剂或抗体，如抗IgE(如omalizumab)；
-其他全身或局部施用的抗炎剂，如沙利度胺或其衍生物、类维生素A、地蒽酚和/或钙泊三醇；
-氨基水杨酸酯和磺胺吡啶，如柳氮磺吡啶、美沙拉秦、巴柳氮和奥沙拉嗪与免疫调节剂，如硫嘌呤；和皮质类固醇如布地奈德的组合；
-抗细菌剂，如青霉素衍生物、四环素、大环内酯、β-内酰胺、氟喹诺酮、甲硝唑和/或吸入的氨基糖苷；和/或抗病毒剂，如阿昔洛韦、法昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、西多福韦；金刚烷胺、金刚乙胺；利巴韦林；扎那米韦和/或奥塞米韦；蛋白酶抑制剂，如吲哚那韦、奈非那韦、利托那韦/或沙喹那韦；核苷逆转录酶抑制剂，如地达诺新、拉米夫定、司他夫定、扎西胞苷、齐多夫定；非核苷逆转录酶抑制剂，如奈韦拉平、依非韦仑；
-心血管药剂，如钙通道阻断剂、β-肾上腺素受体阻断剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素-2受体拮抗剂；降脂剂，如抑制素和/或fibrate；血细胞形态调节剂，如己酮可可碱；溶栓剂和/或抗凝剂，如血小板聚集抑制剂；
-CNS药剂，如抗抑郁剂(如舍曲林)、抗帕金森药物(如盐酸司来吉兰、L-多巴、累匹利洛、派拉米苏；MAOB抑制剂，如司来吉兰和rasagiline；comP抑制剂，如托卡朋；A-2抑制剂、多巴胺再摄取抑制剂、NMDA拮抗剂、烟碱激动剂、多巴胺激动剂和/或神经元一氧化氮合酶抑制剂)和抗阿尔茨海默病药物，如杜尼匹次、雷司替明、他克林、COX-2抑制剂、丙戊茶碱或敌百虫；
-用于治疗急性和慢性疼痛的药剂，例如作用于中枢或外周的止痛剂，如阿片样物质类似物或衍生物、卡巴咪嗪、苯妥英、丙戊酸钠、阿米替林或其他抗抑郁剂、对乙酰氨基酚或非甾体类抗炎剂；
-肠胃外或局部施用的(包括吸入的)局部麻醉剂，如利诺卡因或其类似物；
-抗骨质疏松剂，如激素制剂，如雷洛昔芬或双磷酸酯，如阿仑特罗；
-(i)类胰蛋白酶抑制剂；(ii)血小板激活因子(PAF)拮抗剂；(iii)白介素转化酶(ICE)抑制剂；(iv)IMPDH抑制剂；(v)粘附分子抑制剂，包括VLA-4拮抗剂；(vi)组织蛋白酶；(vii)激酶抑制剂，如酪氨酸激酶(如Btk，Itk，Jak3MAP)的抑制剂(抑制剂的实例可以包括吉非替尼(Gefitinib)、甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate))、丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(如MAP激酶，如p38，JNK，蛋白激酶A、B和C以及IKK的抑制剂)或参与细胞周期调节的激酶(如细胞周期蛋白依赖性激酶)的抑制剂；(viii)葡萄糖-6磷酸脱氢酶抑制剂；(ix)激肽-B1和/或激肽-B2受体拮抗剂；(x)抗痛风剂，如秋水仙碱；(xi)黄嘌呤氧化酶抑制剂，如别嘌呤醇；(xii)排尿酸剂，如丙磺舒、磺吡酮和/或苯溴马隆；(xiii)生长素促分泌剂；(xiv)转化生长因子(TGFβ)；(xv)血小板衍生的生长因子(PDGF)；(xvi)成纤维细胞生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；(xvii)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；(xviii)辣椒素膏；(xix)速激肽NK1和/或NK3受体拮抗剂，如NKP-608C，SB-233412(talnetant)和/或D-4418；(xx)弹性蛋白酶抑制剂，如UT-77和/或ZD-0892；(xxi)TNF-α转化酶抑制剂(TACE)；(xxii)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂或(xxiii)TH2细胞上表达的化学引诱物受体-同源分子(如CRTH2拮抗剂)；(xxiv)P38抑制剂；(xxv)调节Toll样受体(TLR)功能的试剂；和(xxvi)调节嘌呤能受体的试剂，如P2X7；(xxvii)转录因子激活抑制剂，如NFkB，API和/或STATS。
抑制剂可以是特异性的或可以是混合抑制剂，例如，靶定上文所述一种以上的分子(如受体)或分子类型的抑制剂。
结合成员也可以与化疗剂或另一种酪氨酸激酶抑制剂联合，用于共同施用或免疫缀合物形式。所述抗体的片段也可以用于通过重组机理或生物化学偶联获得的双特异性抗体中，然后将上文描述的抗体的特异性与其他抗体的特异性关联，所述其他抗体能够识别参与CXCL13相关活性的其他分子。
对于治疗炎性疾病，例如类风湿关节炎、骨关节炎、哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)或牛皮癣，本发明的结合成员可以与一种或多种试剂组合，所述试剂如非甾体类抗炎剂(下文称作NSAIDS)，包括局部或全身施用的非选择性环加氧酶(COX)-1/COX-2抑制剂，如吡罗昔康，双氯酚酸，丙酸，如萘普生，氟比洛芬，苯氧苯丙酸钙，酮基布洛芬和布洛芬，安芬钠，如甲芬那酸，吲哚美辛，舒林酸，阿扎丙宗，吡唑啉酮，如保泰松、水杨酸盐，如阿斯匹林)；选择性COX-2抑制剂(如美洛昔康、塞来昔布、洛芬昔布、valdecoxib、lumarocoxib、parecoxib和etoricoxib)；抑制环加氧酶的一氧化氮供体(CINODs)；糖皮质激素(无论是通过局部、口服、肌内、静脉内或关节内途径)；甲氨喋呤、来氟洛米、羟基氯喹、d-青霉胺、金诺芬或其他肠胃外或口服金制剂；镇痛剂；达赛瑞英；关节内治疗，如透明质酸衍生物；和营养补充物，如葡糖胺。
本发明的结合成员也可以与现有的用于治疗癌症的治疗剂组合。组合使用的合适试剂包括：
(i)用于药物肿瘤学中的抗增殖/抗肿瘤药物及其组合，如Gleevec(甲磺酸伊马替尼)、烷化剂(例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安和硝基脲)；抗代谢药(例如抗叶酸药，如氟嘧啶，例如5-氟尿嘧啶和喃氟啶、雷替曲塞、甲氨喋呤、胞嘧啶阿拉伯糖苷、羟基脲、吉西他滨和紫杉醇)；抗肿瘤抗生素(例如亚德里亚霉素、博莱霉素、阿霉素、道诺霉素、表阿霉素、去甲柔毛霉素、丝裂霉素-C、放线菌素和光神霉素)；抗有丝分裂剂(例如长春碱类，如长春新碱、长春花碱、长春地辛和长春烯碱，以及紫杉碱类，如紫杉醇和多西他赛)；以及拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素类，如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、托泊替堪和喜树碱)；
(ii)细胞生长抑制剂，如抗雌激素药物(例如他莫昔芬、托瑞米酚、雷洛昔芬、屈洛昔芬和iodoxyfene)、雌激素受体下调剂(例如氟维司群(fulvestrant))、抗雄激素药物(例如比卡鲁胺、氟利坦、尼鲁米特和环丙孕酮)、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如性瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如醋酸甲地孕酮)、芳化酶抑制剂(例如阿钠曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorazole)和依西美坦)和5α-还原酶抑制剂，例如非那雄胺；
(iii)抑制癌细胞侵入的试剂(例如金属蛋白酶抑制剂，如马马司他和尿激酶纤溶酶原激活物受体功能的抑制剂)；
(iv)生长因子功能的抑制剂，例如包括以下的抑制剂：生长因子抗体、生长因子受体抗体(例如抗erbb2抗体trastuzumab和抗erbb1抗体cetuximab[C225])、法尼基转移酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，例如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼，AZD1839)，N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(erlotinib，OSI-774)和6-芳基酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI 1033))，例如血小板衍生的生长因子家族的抑制剂和例如肝细胞生长因子家族的抑制剂；
(v)抗血管发生剂，例如抑制血管内皮生长因子的作用的那些(例如抗血管内皮细胞生长因子抗体bevacizumab、化合物，例如国际专利申请WO 97/22596，WO 97/30035，WO 97/32856和WO 98/13354公开的那些，上述每篇申请都通过全文引用而并入本文)和通过其他机理起作用的化合物(例如罗喹美克，即整联蛋白αvβ3功能的抑制剂和制管张素)；
(vi)血管破坏剂，如combretastatin A4和国际专利申请WO 99/02166，WO 00/40529，WO 00/41669，WO 01/92224，WO 02/04434和WO02/08213中公开的化合物(上述每篇申请都通过全文引用而并入本文)；
(vii)反义治疗，例如针对上文列出的靶的那些，例如ISIS 2503、抗ras反义治疗；
(viii)基因治疗方法，包括例如替代异常基因，例如异常p53或异常BRCA1或BRCA2的方法、GDEPT(针对基因的酶药物前体治疗)方法，例如使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的方法和增加患者对化疗或放疗的耐受性的方法，如多药物抗性基因治疗；和
(ix)免疫治疗方法，包括例如增加患者肿瘤细胞的免疫原性的离体和体外方法，例如用细胞因子(如白介素2、白介素4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)转染；减少T细胞无反应性的方法；采用转染的免疫细胞，如细胞因子转染的树突细胞的方法；采用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法；和采用抗独特型抗体的方法。
本发明的结合成员和一种或多种上述另外的药物成分可以用于制备药物。所述药物可以用于分开或组合施用给个体，因此，可以包含作为组合制剂或分开制剂的结合成员和另外的成分。分开的制剂可以用于促进分开的和序贯或同时施用，并且使得能够通过不同的途径，例如口服和肠胃外施用方式而施用各成分。
根据本发明，可以给哺乳动物施用提供的组合物。施用通常是以“治疗有效量”，这足以对患者显示益处。所述益处可以是至少改善至少一种症状。施用的实际量和施用的速度和时程，将依赖于治疗的疾病的性质和严重程度、要治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、送递组合物的部位、结合成员的类型、施用的方法、施用的方案和医学从业者已知的其他因素。治疗的处方，例如对剂量等的判断，是通常的从业者和其他医生的职责范围内的，并且可以依赖于症状的严重程度和/或治疗的疾病的进展。抗体的合适剂量是本领域公知的[83，84]。可以采用对于要施用的药物类型合适的、本文或医生手册(2003)中指出的具体剂量。可以通过比较本发明的结合成员体外活性和在动物中的体内活性，而确定其治疗有效量或合适剂量。将小鼠和其他测试动物中的有效剂量外推到人的方法是已知的。精确剂量将依赖于许多因素，包括抗体是用于诊断、预防还是治疗，要治疗的部位大小和定位，抗体的精确性质(例如完整抗体、片段或双抗体)和连接于抗体的任何可检测标记或其他分子的性质。对于全身应用，典型的抗体剂量将在100μg-1g的范围，对于局部应用，典型的抗体剂量将在1μg-1mg的范围。可以施用最初较高的加载剂量，然后是一个或多个更低的剂量。典型地，抗体将是完整抗体，如IgG1同种型。这是用于单次治疗成年患者的剂量，其可以按比例调整，用于儿童和婴儿，并且也可以按照分子量比例，调整用于其他抗体形式。治疗可以根据医生的判断，以每日、每周两次、每周或每月的间隔重复。治疗可以每两周到4周用于皮下施用，每4周-8周用于静脉内施用。治疗可以是周期性的，并且施用之间的阶段是约2周或更多，如约3周或更多、约4周或更多，或约每月1次。可以在手术前和/或手术后给予治疗，和/或可以在手术治疗的解剖部位直接施用或涂敷。
按照本文的描述，本发明的结合成员可以离体使用，用于确定样品中CXCL13的水平。所述方法通常包括在允许结合成员与CXCL13结合的条件下使样品与本发明的结合成员接触，并且测量样品中结合的CXCL13的水平。可以将CXCL13的水平与合适的标准或对照进行比较。
该方法可以用于个体中疾病或状况的诊断或预后，其中从所述个体获得样品，并且预测所述个体的CXCL13水平。例如，该方法可以用于诊断或预后类风湿关节炎中的疾病严重程度，所述方法包括确定获自患有或怀疑患有类风湿关节炎的个体的合适样品，如血清或滑液样品中的CXCL13水平。与对照样品相比，升高的CXCL13水平表示存在疾病，并且CXCL13水平和疾病严重程度之间存在正相关。
实施例
测定材料和方法
材料
CHO Gqi5细胞：表达G蛋白Gqi5(SEQ ID NO：19)的CHO K1细胞。
CHO Gqi5hCXCR5细胞或CHO Gqi5hCXCR5c4.4细胞：稳定表达人CXCR5(SEQ ID NO：17)的CHO Gqi5细胞。
基本必须培养基(Gibco 31095)
1％非必须氨基酸(Gibco 11140)
用于
Figure A20088000550600611
cAMP测定的测定培养基
基本必须培养基(Gibco 31095)，其中含有
0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Sigma I7018)
1％非必须氨基酸(Gibco 11140)
0.1％BSA
用于HTRF测定的cAMP-XL665溶液：包含XL665(一种别藻蓝蛋白染料，80kD大小，直接偶联于cAMP)的溶液
用于HTRFcAMP测定的缀合物裂解缓冲液
用于HTRF测定的抗-cAMP铕穴状化合物溶液
Hanks平衡盐溶液(Sigma H8264)
用于cAMP测定的测定培养基：
Hanks平衡盐溶液(Sigma H8264)，其中含有
5mM HEPES pH7.4
0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Sigma I7018)0.1％BSA
用于cAMP测定的Alexa
Figure A20088000550600614
-647抗cAMP抗体：用染料Alexa
Figure A20088000550600615
-647标记的cAMP特异性抗体，配制在50mM Tris HCl(pH7.8)盐溶液，0.9％氯化钠，0.1％BSA，0.05％叠氮化钠(防腐剂)中。
Figure A20088000550600616
检测混合物
Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(Invitrogen)
不含L-谷氨酰胺的MEM-非必须氨基酸(Invitrogen)
CXCL13诱导的Ca2+释放测定培养基：
含有10％(v/v)热灭活的胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(Invitrogen)
不含L-谷氨酰胺的1％(v/v)MEM-非必须氨基酸(Invitrogen)
用于CXCL13诱导的Ca2+释放测定的染料加载溶液
用于CXCL13诱导的Ca2+释放测定的Fluo-4NW染料混合物
FLIPR缓冲液：
125mM NaCl
5mM KCl
1mM MgCl2
1.5mM CaCl2
30mM Hepes
2.5mM丙磺舒(4-(二丙基氨磺酰)苯甲酸)5mM葡萄糖
1％(v/v)热灭活的FBS
B300.19hCXCR5细胞：用人CXCR5稳定转染的鼠前B细胞系
用于采用B300.19hCXCR5细胞的趋化性测定的培养基：(RPMI-1640Sigma，Cat#R0883)，含有10％胎牛血清(FCS)；1％青霉素，链霉素和谷氨酰胺(PSG)；1％丙酮酸钠；1.5μg/ml嘌呤霉素和0.1％2-β-巯基乙醇。
方法
CXCL13受体-配体结合测定(FMAT)
CXCL13受体配体结合测定用荧光微体积测定技术(FMAT)(Dietz等人1996，Miraglia等人1999，Mellentin-Michelotti等1999)测量生物素化的人CXCL13(Almac)和B300.19细胞(Almac)上超量表达的CXCR5之间的相互作用。该测定可以用于筛选抑制CXCL13：CXCR5相互作用的scFV周质粗提物或纯化的scFv。
选择输出物筛选为200mM Tris缓冲液pH7.4，0.5M蔗糖中制备的含scFV的稀释的周质粗提物。在含有0.025％牛血清白蛋白(BSA)和0.01％叠氮化钠的Hanks平衡盐溶液(Sigma H8264)中进行样品和试剂的所有稀释。在384孔透明底非结合表面板(Costar 3655)中，以50μL的总测定体积，室温下将稀释的样品(20μL)与1nM生物素化的人CXCL13，25ng/mL链霉亲和素FMAT-Blue(Applied Biosystems 4362492)和B300.19CXCR5细胞(4000个细胞/孔)一起温育2小时。分别用测定缓冲液或3nM最终测定浓度的抗人CXCL13单克隆抗体(R&D SystemsMAB801)设定总的结合和非特异性结合(NSB)对照。采用FL1门控＜1600，大小＜15和色比＜0.4的Wang Goldman算法，在Applied Biosystems细胞检测系统8200上对板读数，并且分析数据。
采用公式1，从FL1总数据确定％特异性结合，其中总的NSB FL1是非特异性结合对照孔的平均值，总的结合FL1是总的结合对照孔的平均值。
公式1：
Figure A20088000550600631
Figure A20088000550600632
cAMP测定
通过激活腺苷酸环化酶家族，增加细胞中的3’，5’环腺苷酸(cAMP)水平，所述酶催化三磷酸腺苷(ATP)转化为cAMP和焦磷酸。CXCL13与其G蛋白偶联的受体CXCR5的结合可以导致腺苷酸环化酶的下调，因此通过释放抑制腺苷酸环化酶的G-蛋白亚基Gαi的释放，降低细胞cAMP水平。
我们使用了
Figure A20088000550600633
(均相时间释放分辨的)cAMP测定试剂盒(CisBio International 62AM4PEC)来测定细胞cAMP水平。在CXCL13
Figure A20088000550600634
cAMP测定中，测量了稳定表达CXCR5的CHO Gqi5细胞中CXCL13介导的cAMP水平的降低。
用腺苷酸环化酶激活物NKH477(Tocris Cookson 1603)，即一种水溶性毛喉素衍生物共刺激细胞，确保CXCL13反应位于
Figure A20088000550600635
cAMP测定试剂盒的检测线性范围内。
可以用该测定来确定scFVs用于抑制CHO Gqi5hCXCR5细胞中细胞cAMP水平的CXCL13介导的调节作用的效价。
除非特别指出，在测定培养基(含有0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Sigma I7018)，1％非必须氨基酸(Gibco 11140)和0.1％BSA的基本必须培养基(Gibco 31095))中制备scFv样品、试剂和CHO Gqi5hCXCR5细胞。从组织培养烧瓶收获CHO Gqi5hCXCR5细胞，以1.2×106个细胞/ml重悬于测定培养基中。根据制造商的说明书(CisBio International)，将cAMP-XL665和抗-cAMP铕穴状化合物在蒸馏水中重配。
在384孔低体积板(Costar 3676)中，室温下将scFVs与4nM人(SEQID NO：14)或猕猴(SEQ ID NO：16)CXCL13(MEL细胞来源的)一起温育30分钟。将5μl预先温育的样品转移到测定板(Costar 3676)中，然后加入2.5μl NKH477和2.5μLCHO Gqi5hCXCR5细胞悬浮液，得到含有0.5μM NKH477和3000个细胞/孔的10μl的最终反应体积。采用以下对照设置每个板：NKH477对照(CHO Gqi5hCXCR5细胞和0.5μMNKH477)，CXCL13对照(2nM CXCL13，0.5μMNKH477和CHO Gqi5hCXCR5细胞)，基本cAMP对照(仅有CHO Gqi5hCXCR5细胞)和阴性对照(仅有测定培养基)。也在每个实验中进行CXCL13和NKH477酒定，以确保用于测定中的浓度在EC50-EC85范围内，因此在
Figure A20088000550600641
cAMP测定试剂盒的检测线性范围内。添加细胞后，将板在室温下温育30分钟，然后通过加入5μl cAMP-XL665溶液终止反应。此后在阴性对照孔中加入5μl缀合物裂解缓冲液，或在所有其他孔中加入5μl抗cAMP铕穴状化合物溶液。
将测定板在室温下温育2小时，然后用EnVision平板读数器(PerkinElmer)读出620nm和665nm发射波长处的时间分辨的荧光。
通过计算每个样品的ΔF％值分析数据。根据公式2计算ΔF％，其中CXCL13对照ΔF％是CXCL13对照孔的平均值，NKH477对照ΔF％是NKH477对照孔的平均值。
公式2：
Figure A20088000550600642
随后用ΔF％值计算如公式3描述的％抑制。
公式3：
Figure A20088000550600643
采用scFv浓度滴定来确立通过测定中的IC50值测量的克隆效价。用GraphPad Prism软件，通过采用4参数对数公式(公式4)的曲线拟合来确定IC50值。
公式4：
Y＝底部+(顶部-底部)/(1+10y6∧((LogEC50-X)*斜率)
X是浓度的对数。Y是％抑制。
CXCL13
Figure A20088000550600651
cAMP测定
CXCL13
Figure A20088000550600652
cAMP测定的原理与对CXCL13
Figure A20088000550600653
cAMP测定概括的原理类似，但是用
Figure A20088000550600654
cAMP测定试剂盒(Perkin ElmerAD0263)测量细胞cAMP水平。可以用CXCL13
Figure A20088000550600655
cAMP测定来确定用NKH477共刺激后对于CHO Gqi5hCXCR5细胞中cAMP水平的CXCL13介导的降低的抑制的IgGs效价。
除非特别指出，所有的稀释都在测定培养基(含5mM HEPES pH7.4，0.5mM 3-异丁基-1-甲氧基黄嘌呤(Sigma I7018)和0.1％BSA的Hanks平衡盐溶液(Sigma H8264))中进行。从组织培养烧瓶收获CHO Gqi5hCXCR5细胞，以1.2×106个细胞/ml重悬于测定培养基中。以1∶100的稀释度将Alexa
Figure A20088000550600656
-647抗-cAMP抗体加入细胞悬浮液中。在使用前至少15分钟，根据制造商的说明书制备含有1∶2250稀释的铕-W8044链霉素和1∶750倍稀释的生物素-cAMP的
Figure A20088000550600657
检测混合物。铕-W8044是具有DCA(二氯三嗪基)反应臂的铕螯合物。
在384孔低体积板(Costar 3676)中，室温下将IgG样品与4nM人(SEQ ID NO：14)或猕猴(SEQ ID NO：16)CXCL13(MEL细胞来源的)一起温育1小时。将5μl预先温育的样品转移到白色Proxiplate Plus 384孔测板(Perkin Elmer Cat no.6008280)中。Alexa
Figure A20088000550600658
-647抗-cAMP抗体/CHO Gqi5hCXCR5细胞悬浮液(5μL)，得到含有1μM NKH477和3000个CHO Gqi5hCXCR5细胞/孔和1∶200稀释的Alexa
Figure A20088000550600659
-647抗-cAMP抗体的10μl的最终反应体积。采用以下对照设置每个板：NKH477对照(CHO Gqi5hCXCR5细胞/Alexa
Figure A200880005506006510
-647抗-cAMP抗体和1μM NKH477)和CXCL13对照(2nM CXCL13，1μM NKH477和CHO Gqi5hCXCR5细胞/Alexa
Figure A200880005506006511
-647抗-cAMP抗体)。也在每个实验中进行CXCL13和NKH477滴定，以确保用于测定中的浓度在EC50-EC85范围内，因此在
Figure A200880005506006512
cAMP测定试剂盒的检测线性范围内。添加细胞悬浮液后，将板在室温下温育30分钟，然后通过加入10μl
Figure A20088000550600661
检测混合物到所有孔中而终止反应。词汇在阴性对照孔中加入5μl缀合物裂解缓冲液，或在所有其他孔中加入5μl抗cAMP铕穴状化合物溶液。将板在室温下温育3小时，然后用EnVision平板读数器(Perkin Elmer)确定665nm波长处的发射。
用665nm发射数据计算公式7中描述的％抑制，其中CXCL13对照665nm发射是CXCL13对照孔的平均值，NKH477对照665nm发射是NKH477对照孔的平均值。
公式7：
Figure A20088000550600662
用GraphPad Prism软件，通过采用4参数对数公式(参见公式4)的曲线拟合来确定IC50值。
CHO Gqi5hCXCR5c4.4CXCL13诱导的Ca2+释放测定
以1×105个细胞/孔将CHO Gqi5hCXCR5c4.4细胞接种在96孔黑壁聚-D-赖氨酸处理的组织培养测定板(BD)中。然后将细胞在100μL测定培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(Invitrogen)，10％(v/v)热灭活的胎牛血清(FBS)(Invitrogen)，不含L-谷氨酰胺的1％(v/v)MEM-非必须氨基酸(Invitrogen))中，在潮湿的气氛中，在37℃和5％CO2中培养过夜。
采用商购试剂盒(Fluo-4免洗钙测定试剂盒F36206，MolecularProbes)，如下采用免洗FLIPR方案。通过将10mls测定缓冲液(1X Hanks平衡盐溶液中的20mM HEPES)和100μl 4-(二丙基氨磺酰基)苯甲酸储液(测定缓冲液中的250mM)加入单个管型瓶的Fluo-4NW染料混合物中，制备染料加载溶液。从细胞吸出培养基，加入70μl/孔的染料加载溶液，37℃下温育30分钟，然后室温下温育30分钟。在此温育阶段后，在FLIPR缓冲液(125mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl2，1.5mM CaCl2，30mM Hepes，2.5mM 4-(二丙基氨磺酰基)苯甲酸，5mM葡萄糖和1％(v/v)热灭活的FBS)中制备纯化的IgGs的滴定液，并且也在FLIPR缓冲液中与CXCL13(100nM终浓度)一起在37℃下温育30分钟。
温育后，在荧光计成像平板读数器系统(FLIPR)中测量标记的细胞对CXCL13/IgG滴定液的反应。用470-495nm激发滤光器和515-575nm发射滤光器在×120秒的读数阶段测定细胞内钙敏感性染料的荧光。
通过将每个孔的最大峰值高度输出到Excel(Microsoft)，分析数据。用缺乏抑制剂的情况下对CXCL13的反应，将抑制剂数据标准化为CXCL13诱导的细胞内Ca2+的百分比，并且将反应扣除到单独的测定缓冲液。在Prism(GraphPad)中进行进一步的分析，其中将数据作为对照反应的百分比对IgG浓度的对数作图。用Prism曲线拟合软件(Graphpad)计算IC50值。
CXCL13荧光连接的免疫吸附测定(FLISA)
CXCL13FLISA测量采用荧光微体积测定技术(Dietz等人1996，Swartzman等人1999)测量与链霉亲和素珠偶联的生物素化的人CXCL13(Almac)与IgG形式的CXCL13结合成员之间的相互作用。该测定可以用于确定与竞争测定形式中的相关趋化因子家族成员相比，生物素化的人CXCL13的IgGs的特异性。
样品和试剂在测定缓冲液(含有0.1％BSA，0.1％Tween-20和0.01％叠氮化钠的磷酸缓冲液)中稀释。室温下将0.25nM生物素化的CXCL13(Almac)与0.004％w/v 6-8μm链霉亲和素包被的聚苯乙烯颗粒(Spherotec SVP-60-5)一起预先温育1小时。然后将珠子在3000rpm离心5分钟，弃去上清液，将沉淀物重新悬浮于原始体积的测定缓冲液中，得到0.004％w/v珠/生物素化的人CXCL13混合物。将10μL竞争物、测定缓冲液(总结合对照)或过量的人CXCL13(非特异性结合(NSB)对照)加入384孔的透明底非结合表面测定板(Costar 3655)中。然后加入10μL 5nM山羊抗人(H+L)Alexa
Figure A20088000550600671
-647(Invitrogen A21445)、10μL0.31nM抗体1(种系化的IgG)和20μL珠/生物素化的CXCL13混合物，室温下将板温育4小时。在Applied Biosystems细胞检测系统8200上读出FL1信号。采用大小门控3-12，色比＜0.4，最小计数20的WangGoldman算法分析数据。
采用公式8从FL1数据确定％特异性结合，其中NSB FL1是非特异性结合对照孔的平均值，并且总结合FL1是总结合对照孔的平均值。
公式8：
Figure A20088000550600681
用GraphPad Prism软件，通过采用4参数对数公式(参见公式4)的曲线拟合来确定IC50值。
抗体1(种系化的IgG)与人和猕猴CXCL13的相互作用的BIAcore评估
试剂：
CXCL13
人CXCL13(MEL细胞表达的)
0.1mg mL-1，预期的平均质量9,694.53Da，10.31μM。稀释到6nM，是6,869μL HBS-EP中的4μL。
猕猴CXCL13(MEL细胞表达的)
0.6mg mL-1，稀释到0.3mg mL-1，预期平均质量9,670Da，31.02μM)。稀释到6nM，是20,678μL HBS-EP中的4μL。
免疫球蛋白
抗体1(种系化的)
4.42mg mL-1(例如3a)；1.06mg mL-1(例如3b)
用于实施例3a的方法
芯片制备参见实施例32
对于每个实验周期(方向1)，通过以5μL/min滴定抗体1(种系化的IgG1)的0.5μL/mL HBS-EP溶液，用Fc2蛋白G的表面捕获240-385Rus抗体1(种系化的IgG1)。
然后以100μL/min的流速，使HBS-EP缓冲液中的人或猕猴CXCL13的指定稀释液(对于人CXCL13是0.25，0.3125，0.50，0.625，1.0，1.25，2.5，5.0，10.0和20.0nM或对于猕猴是0.125，0.25，0.50，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0和40.0nM)流过芯片表面(缔合时间2.5分钟，解离10分钟，用20μL10mM甘氨酸pH 1.75的脉冲然后20μL 10mM甘氨酸pH 1.50的脉冲进行再生)。用单独的HBS-EP制备空白注射液。制备所有的溶液，在聚丙二醇中储存。
用于实施例3b的方法
在10mM醋酸缓冲液pH 4.5中将抗体稀释到1.0μg/mL。用标准的胺连接化学(用胺偶联试剂盒BR-1000-50)在CM3芯片(BIAcore，BR-1005-41，批号：1160100有效期至07年4月)上建立空白(Fc1)和IgG的500RU表面。采用的洗涤溶液是甘氨酸pH 2.0。
使人和猕猴CXCL13流过芯片表面。在HBS-EP缓冲液中建立每种CXCL12的系列稀释液(0.10，0.20，0.30，0.40，0.50和0.60nM)，以30μL/min流过所有流动室(缔合时间4分钟，解离10分钟，用20μL 10mM甘氨酸pH 2.0的脉冲两次进行再生)。用相同的缓冲液制备空白注射液。所有溶液都在丙二醇中制备和储存。
scFv重新定为IgG1形式
通过将VH和VL结构域分别亚克隆到表达完整抗体重链和轻链的载体中，将克隆从scFV转化到IgG形式。将VH结构域克隆到含有人重链恒定区和调节元件的载体(pEU15.1)中，以便在哺乳动物细胞中表达完整的IgG1重链。类似地，将VL结构域克隆到用于表达人轻链恒定区和调节元件的载体中，以便在哺乳动物细胞中表达完整的IgG轻链(pEU3.4用于к轻链，pEU4.4用于入)。用于表达重链和轻链的载体最初在Persic等，1997中描述。对载体进行了工程化，从而允许载体的附加型复制。
为了获得IgGs，将表达重链和轻链IgG的载体转染到EBNA-HEK293哺乳动物细胞中。将IgGs表达并分泌到无血清的培养基中。合并收获物，过滤，然后纯化。用蛋白A层析来纯化IgG。将培养上清液加样到合适大小的陶瓷蛋白A(BioSepra)柱上，用50mM Tris-HClpH 8.0，250mM NaCl洗涤。用0.1M柠檬酸钠(pH 3.0)从柱上洗脱结合的IgG，通过加入Tris-HCl(pH 9.0)进行中和。用Nap10柱(Amersham，#17-0854-02)将洗脱的材料缓冲液交换到PBS中，基于IgG的氨基酸序列(Mach 1992)，用消光系数分光光度确定IgG的浓度。用SEC-HPLC和通过SDS-PAGE分析纯化的IgGs的聚集或降解。
Figure A20088000550600691
表位竞争测定
可以用
Figure A20088000550600701
表位竞争测定来确定结合成员结合生物素化的CXCL13之间的竞争。该测定中测试的抗体分子可以例如是scFv或IgG形式。
Figure A20088000550600702
技术的原理如本文所描述。
在用于确定结合成员与具有氨基酸序列SEQ ID NO：11的抗体scFv分子竞争结合CXCL13的能力时，在穴状化合物标记的ScFv(SEQ IDNO：11)、生物素化的人CXCL13和链霉亲和素XLent(与XL665交联的链霉亲和素，在优化的条件下偶联)之间形成FRET复合物。与穴状化合物标记的scFv识别相同(或可能重叠)的表位的scFV或IgG将竞争与生物素化的CXCL13的结合，因此减少测定信号。
在测定缓冲液(磷酸缓冲液，0.1％BSA，0.4M氟化钾)中进行样品和试剂的所有稀释。将生物素化的人CXCL13(AlmacAlmac)和链霉亲和素-XLent(CisBio International 611SAXLB)在室温下预温育30分钟。将10μL样品(scFv或IgG)、测定缓冲液(总结合对照)或50X最终测定浓度的未标记的IgG(以确定非特异性结合(NSB))加入384孔低体积板(Costar 3676)，然后加入5μL预先温育的生物素化的CXCL13/链霉亲和素Xlent混合物。将板室温下温育1小时，然后加入5μL穴状化合物标记的ScFv。室温下将板温育3小时，然后用EnVision平板读数器(PerkinElmer)确定620nm和665nm发射波长处的时间分辨的荧光。
CXCL13、链霉亲和素-XLent和穴状化合物标记的IgG的光浓度可以进行滴定，以确定产生合适的测定信号的每种试剂的浓度。
通过计算每个样品的ΔF％值，分析数据(参见公式5)。
公式5：
随后用ΔF％值计算公式6中描述的％特异性结合，其中NSB ΔF％是非特异性结合对照孔的平均值，总结合ΔF％是总结合对照孔的平均值。
公式6：
Figure A20088000550600711
用GraphPad Prism软件，通过采用4参数对数公式(参见公式4)的曲线拟合来确定IC50值。
公式4：
Y＝底部+(顶部-底部)/(1+10∧((LogEC50-X)*斜率))
X是浓度的对数。Y是％抑制。
B300.19hCXCR5细胞CXCL13驱动的趋化性测定
在进行测定前至少两天，用培养基(含10％胎牛血清(FCS)；1％青霉素、链霉素和谷氨酰胺(PSG)；1％丙酮酸钠；1.5μg/ml嘌呤霉素和0.1％2-β-巯基乙醇的RPMI-1640Sigma，Cat#R0883)在37℃，5％CO2的潮湿的气氛下将B300.19hCXCR5细胞调节到5×105个细胞/ml。测定当天，对B300.19hCXCR5细胞计数，在离心和在缓冲液(RPMI-1640(SigmaCat#R0883)+0.35％BSA(Sigma Cat#A2153))中洗涤一次后调节到6×106个细胞/ml。
在测定缓冲液中进行IgGs的滴定。在37℃，5％CO2的潮湿气氛下，将IgGs与ED80浓度的CXCL13一起预先温育30分钟。
该温育阶段后，将31μl/孔的预先温育的CXCL13和IgG转移到趋化性板(Receptor Technologies，Cat#106-5)的下室中，其中采用反向滴定以避免气泡。然后在孔上加上滤膜，固定每个角。然后将50μl B300.19hCXCR5细胞(6×106个细胞/ml)分散到趋化性滤器上室的圈出的区域中。将趋化性板上盖上盖子，在潮湿的气氛(37℃，5％CO2)中温育2小时。
温育2小时后，从温育箱取出板，洗涤，以便从滤器表面除去过量细胞。这是通过将PBS灌注在膜表面并且用细胞刮刀(Corning，Cat#3011)除去所有过量细胞/PBS而实现的。然后将趋化性板在1500rpm离心10分钟，留下滤器。
旋转后，取下滤膜，将趋化性板的下室的内容物转移到含有80μl/孔的测定缓冲液和15μl/孔的裂解缓冲液(H2O+9％Triton-X)的96孔聚苯乙烯平底板(Corning，Cat#3598)(酶促板)。将板在潮湿的气氛下(37℃，5％CO2)温育1小时。
然后使每个板进行非放射性细胞毒性测定，其测量细胞裂解时释放的乳酸脱氢酶(LDH)，即一种稳定的胞质溶胶酶。该测定提供了细胞数目的定量测量值。CytoTox 96非放射性细胞毒性测定(Promega Cat#G1780)由以下试剂组成：5个管型瓶的底物混合物；60ml测定缓冲液；25μl LDH阳性对照(未使用过)；3ml裂解溶液(10X)(未使用过)；65ml终止溶液(1M乙酸)；1方案。对于LDH测量，使测定缓冲液解冻；取出12ml，将未使用的部分迅速储存在-20℃。37℃水浴可以用于使测定缓冲液解冻。将12ml的测定缓冲液温热到室温(避光)。将12ml室温的测定缓冲液加入一瓶底物混合物中。倒置，轻柔振荡，以使底物混合物溶解。
一瓶将提供足够的用于两个96孔板的底物。一旦重悬，底物应该避免强的直接光照，并且立即使用。将50μl重配的底物混合物加入酶测定板的每个孔中，所述板含有从趋化性测定板转移的裂解的样品。用金属箔或不透明盒覆盖板，使其避光，并且在室温下温育30分钟。在每个孔中加入50μl终止溶液。用注射器针头使大气泡破裂，记录加入终止溶液后1小时内490或492nm处的吸光度。
将数据输入GraphPad Prism 4，该软件基于产生的剂量反应曲线产生IC50值。
人扁桃体B细胞CXCL13驱动的趋化因子测定
在地区伦理委员会批准下在扁桃体切除手术后从患者获得人扁桃体。将样品加入含10％胎牛血清，1％青霉素(10,000单位/ml)+链霉素(10mg/ml)+谷氨酰胺(200mM)溶液(Sigma：G1146)的RPMI-1640(Sigma：R0883)培养基中，得到100单位/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素+2mM谷氨酰胺溶液，100μg/ml庆大霉素(Sigma：G1522)，0.1％β-巯基乙醇(Gibco：31350-010)，1％丙酮酸钠(Sigma：S8636)，1％非必须氨基酸(Gibco：11140-035)的终浓度。
用细胞分离筛(60目大小)(Sigma：CD1)从扁桃体组织分离原代扁桃体B细胞。然后通过300g(1500rpm)下离心，洗涤细胞悬浮液5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于总共20ml冷的组织培养基中。将细胞悬浮液铺在20ml Ficoll hypaque(Lymphoprep)(Axis Shields：1114544)上，以2000rpm离心15分钟，以除去死细胞、细胞碎屑和红细胞。用塑料巴斯德移液管取出位于淋巴细胞制备物和组织培养基的界面上的细胞，并且转移到15ml离心管中。用冷的组织培养基将细胞悬浮液制成15ml的体积，并且在1500rpm下离心5分钟。弃去上清液，并且将细胞沉淀重新悬浮于10ml冷的组织培养基中。用coulter计数器进行活细胞计数。将细胞调节到5×106个细胞/ml的浓度，并且用1μg/ml LPS培养过夜(大约20小时)。
温育后，离心并在缓冲液(RPMI-1640(Sigma Cat#R0883)+0.35％BSA(Sigma Cat#A2153))中洗涤一次后将扁桃体细胞调节到1×107个细胞/ml。
然后按照前面对B300.19hCXCR5细胞的描述，进行趋化性测定。
ELISA中天然hCXCL13与抗体1(种系化的IgG1)的结合
在地区伦理委员会的批准下，将全血采集到肝素化的容器中。将血液缓慢铺于等体积的淋巴细胞制备物上，用stripette移入50ml Falcon管中。室温下关掉制动，以2000rpm将管离心25分钟。
用巴斯德移液管除去淋巴细胞层，转移到新的Fisher 50ml管中。然后用预热的RPMI-1640(Sigma：R0883)培养基洗涤细胞。然后通过在打开制动的条件下以1500rpm离心10分钟而洗涤细胞。弃去上清液，然后通过在打开制动的条件下以1500rpm离心10分钟而将细胞再洗涤两次。对于最终的洗涤，将沉淀重新悬浮于50ml RPMI中，取出200μl样品，用于采用Coulter计数器进行计数。
最终洗涤后，将细胞重新悬浮于适量培养基(含10％胎牛血清，1％青霉素(10,000单位/ml)+链霉素(10mg/ml)+谷氨酰胺(200mM)溶液(Sigma：G1146)的RPMI-1640(Sigma：R0883))中，得到100单位/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素+2mM谷氨酰胺的终浓度，以获得3.3×106个细胞/ml的细胞浓度。
然后将细胞分散到6孔聚苯乙烯组织培养板中，每孔3ml。这得到了大约1×107个细胞/孔的最终细胞数目。设置尽可能多的板，用于6天的刺激。
然后将板在37℃，5％CO2温育3-4小时。在此温育期间，应该将单核细胞粘附于孔的底部，留下其他细胞群在悬浮液中。
温育后，将含有非贴壁细胞的3ml培养基轻柔吸出每个孔，弃去，仅仅留下每个孔底部的贴壁单核细胞。在每个板的每个孔中，加入3ml新鲜培养基。加入以下刺激物：
人M-CSF(R&D Systems：216-MC-025)，获得50ng/ml的终浓度，+人IL-4(R&D Systems：204-MC-025)，获得25ng/ml的终浓度。
1个孔不受刺激，作为对照，其中含有单独的培养基。
刺激6天后，在37℃，5％CO2，在所有受刺激的孔中加入LPS过夜，达到1μg/ml的终浓度。用LPS过夜刺激后，用stripette从每个孔取出上清液。合并所有上清液，然后分配到15ml试管(每管10ml)中。将约500μl收集到eppendorff管中，用于通过ELISA进行定量。根据制造商的说明书，进行通过ELISA的CXCL13定量。
(R&D systems：Quantikine人CXCL 13/BLC/BCA-1免疫测定Cat.N°：DCX130)
然后在阳离子交换树脂上纯化含有天然CXCL13的上清液，渗析到PBS中，用ELISA重新定量。
为了显示天然CXCL13与抗体1(种系化的IgG1)的结合，用CAZ-1040(5μg/ml 200μl/孔)包被maxi-sorp高结合96孔板。同样，在ELISA试剂盒中，提供用非特异性抗CXCL-13抗体包被的板。然后将纯化的天然CXCL13加入抗体1包被的和试剂盒提供的板中。然后根据制造商的说明书(R&D systems：Quantikine Human CXCL 13/BLC/BCA-1Immunoassay.Cat.N°：DCX130)进行ELISA。
抗体1以相等的配体浓度结合天然CXCL13和重组CXCL13(试剂盒中提供的标准物)，在测定中得到相等的信号。
结合成员干扰CXCL-13的H/D交换速度
在50mM Tris.HCl pH 7.4，150mM NaCl中以0.5mg/ml使用CXCL13。在PBS(1.54mM KH2PO4，2.71mM Na2HPO4，155mM NaClpH7.2)中以10.6mg/ml使用抗体。根据制造商的说明书将抗体偶联于POROS AL树脂(Applied Biosystems)，制备100μl柱，保持在1℃。
用在75％D2O中制备的50mM Tris.HCl pH7.5，150mM NaCl洗涤柱子。在用75％D2O制备的缓冲液中将CXCL13稀释到0.125mg/ml，并且温育150，500，1500和5000秒，然后注射到抗体柱上。迅速用H2O中的0.2ml缓冲液洗涤柱，然后温育相同的时间段，即，交换到D20中150s的样品交换回到H2O中150秒，在500，1500和5000秒，对于样品也是类似的。通过注射前面的80μl和随后40μl 0.8％甲酸，洗脱不同的时间点。收集后40μl，加入1℃的20μl 2M脲，1M TCEP pH3。将全部混合物注射到100μl含有胃蛋白酶的柱上，以便将蛋白消化为能通过采用12-28.5％乙腈梯度的rpHPLC分离的肽，在Thermo FinniganLCQ电喷射质谱仪和Micromass Q-TOF质谱仪上测定质量。用SEQUEST软件程序(Thermo Finnigan San Jose，CA)鉴定亲本肽离子的序列。
基本按照上文描述的步骤确定抗体对CXCL13的不同部分的交换速度的影响，具有以下例外：首先在含有H20的缓冲液中将CXCL13稀释到0.125mg/m，然后注射到用H20中制备的50mM TrisHCl pH7.5，150mM NaCl预先洗涤的柱上。结合后，用H2O中制备的50mM Tris.HClpH7.5，150mM NaCl洗涤柱子，然后用75％D2O中制备的50mMTris.HCl pH7.5，150mM NaCl温育150，500，1500和5000秒，然后交换回到H20中，并且如上文所述进行处理。
实施例1：抗体前导分离
人脾cDNA用作对人CXCL13的可读框进行PCR的模板。将其克隆到哺乳动物表达载体(pEV3)中，用于稳定转染MEL细胞。通过用可商购的抗CXCL13抗体的细胞培养物上清液的蛋白印迹鉴定最高表达CXCL13的克隆MEL细胞系。通过将pH调节到6，从表达蛋白的MEL细胞的培养基纯化重组的CXCL13，然后将其加入阳离子交换柱。在含有1M NaCl的pH6的MES缓冲液中洗脱CXCL13。将样品直接加入Resource rpc柱，用0.1％TFA中最高达90％的乙腈梯度洗脱。合并含CXCL13的级份，浓缩，并且通过在Superdex75柱上层析而纯化，产生＞95％纯度的材料。通过SDS-PAGE和LCMS分析纯化的蛋白，显示具有9690Da的质量。
1.1从scFv噬菌体展示文库选择
将克隆到基于丝状噬菌体M13的噬菌粒载体中的大单链Fv(scFv)人抗体文库用于选择(Vaughan 1996，Hutchings 2001)。基本按照以前的描述(Vaughan 1996)，用化学合成的生物素化人CXCL13(Almac)上的一系列选择循环，从噬菌体展示文库分离抗CXCL13特异性scFV抗体。简言之，使PBS-Marvel中的纯化的噬菌体(3％w/v)在溶液中与生物素化的人CXCL13结合1小时。然后按照制造商的推荐，将与抗原结合的scFv噬菌体捕获在链霉亲和素包被的顺磁珠(
Figure A20088000550600761
M-280)上。通过采用PBS-Tween(0.1％v/v)和PBS的一系列洗涤循环，除去未结合的噬菌体颗粒。洗脱结合的噬菌体颗粒，感染到细菌中，挽救用于下一轮选择(Vaughan 1996)。
使来自第二轮选择的代表性数目的单个克隆在96孔板中生长。ScFV在细菌周质中表达，并且用荧光微体积测定技术(FMAT)，根据它们抑制生物素化的人CXCL13(Almac)与B300.19hCXCR5细胞上表达的其受体CXCR5结合的能力进行筛选。对测定中作为粗制样品对CXCL13：CXCR5相互作用显示显著抑制作用的ScFvs进行DNA测序(Vaughan 1996，Osbourn 1996)。
再次在细菌中表达独特的scFvs，并且通过亲和层析纯化(如Bannister 2006中的描述)。通过在针对人和猕猴(cyno)非人灵长动物CXCL13(都来源于MEL细胞)的scFv HTRF cAMP (3’，5’环腺苷酸)测定中测试系列稀释的纯化scFvs，确定IC50值。
1.2确定功能活性.抑制CXCL13刺激的环AMP形成
在CXCL13
Figure A20088000550600762
cAMP测定中，测量了用腺苷酸环化酶激活物NKH477(0.5μM)共刺激CHO Gqi5hCXCR5细胞后，CXCL13的前导scFvs介导的cAMP水平降低的抑制。针对2nM人CXCL13(MEL细胞来源的)或2nM猕猴CXCL13(MEL细胞来源的)的最终浓度确定IC50值(参见表1)。关于测定方法的细节，参见“测定材料和方法”部分。
 克隆名称   人CXCL13IC50nM±SD(n数目)   猕猴CXCL13IC50nM(n＝1)
 抗体1(非种系化的)   5±1(n＝3)   3
表1.
Figure A20088000550600771
CXCL13cAMP测定中抗人CXCL13(平均IC50±标准差，n数目)或猕猴CXCL13(仅仅n＝1的数据)的抗体1scFv(非种系化的)效价的实例
1.3CXCL13cAMP测定中IgGs的效价
在cAMP测定中确定重新定为IgG1的克隆的活性(参见材料和方法)。该测定的原理与
Figure A20088000550600774
cAMP测定相似，但是采用
Figure A20088000550600775
cAMP测定试剂盒(Perkin Elmer)来确定细胞cAMP水平。关于测定方法的细节，参见“测定材料和方法”部分。在CXCL13
Figure A20088000550600776
cAMP测定中，确定用腺苷酸环化酶激活物NKH477(1μM)共刺激CHOGqi5hCXCR5细胞后，MEL细胞来源的CXCL13(2nM人CXCL13或2nM猕猴CXCL13)介导的cAMP水平降低的IgG抑制的IC50值(例如，数据参见表2)。
  克隆名称   人CXCL13IC50nM±SD(n数目)   猕猴CXCL13IC50nM±SD(n数目)
  抗体1(非种系化的IgG)   1.4±0.5(n＝10)   0.3±0.1(n＝6)
表2.
Figure A20088000550600777
CXCL13cAMP测定中抗MEL细胞来源的人CXCL13(平均IC50±标准差，n数目)或猕猴CXCL13(n＝6的数据)的抗体1IgG(非种系化的)效价的实例
1.4表达重组CXCR5的B300.19细胞中CXCL13诱导的趋化性的抑制
用人重组CXCR5转染的B300.19hCXCR5细胞(一种鼠前B细胞系)在趋化性测定中检测IgGs。针对产生大约ED80反应的非糖基化的人CXCL13的浓度(12.32nM)滴定IgGs。下表显示了抗体1IgG(非种系化的)的IC50值(nM)±SEM。每种IgG测试至少3次。
表3.B300.19hCXCR5趋化性测定中抗体1IgG(非种系化的)的IC50值(nM)±SEM的实例
1.5CXCL13诱导的钙释放的抑制
用G蛋白Gqi5和人CXCR5转染的CHO细胞系评估对CXCL13诱导的钙释放的IgG活性。用人CXCL13刺激这些细胞，通过诱导细胞内储存物的释放和从细胞外介质流入，导致细胞质Ca2+以浓度依赖性方式增加。这可以用钙敏感性染料在荧光成像平板读数器(FLIPR)中测量。
在该测定中，针对100nM人CXCL13(MEL细胞来源的)确定通过IC50值确定的抗CXCL13IgG的抑制活性。对抗体1(非种系化的)获得的IgG效价示于表4中。所有测定中都包括了阳性测定对照。关于测定方法的完整细节，参见“测定材料和方法”。
 克隆名称   IgG IC50nM(n＝8)
 抗体1(非种系化的)   17.1±11.2
表4.CXCL13介导的CHO Gqi5hCXCR5Ca2释放测定中抗体1IgG(非种系化的)效价(平均IC50±标准差)
实施例2：抗体种系化
2.1抗体种系化
将抗CXCL13抗体的VH和VL结构域的氨基酸序列与VBASE数据库(Tomlinson 1997)中的已知人种系序列进行比对，通过序列相似性鉴定最近的种系。对于抗体1的VH结构域，这是VH3-23。对于VL结构域，它是VK1L12。无须考虑保持不变的Vernier残基(Foote 1992)，VH结构域的构架区中有8个改变，VL结构域中有3个改变，通过采用合适诱变引物(VH中的Q1E，V5L，R16G，V23A，G24A，H39Q，G83R和R105Q，VL中的115V，A58V和D70E)的标准定点诱变技术，它们都回复为指出的种系序列，以形成种系化的IgG1。
2.2种系化的抗体1IgG在
Figure A20088000550600782
cAMP测定中的效价
用1.3部分概括的
Figure A20088000550600783
CXCL13cAMP测定，比较种系化的和亲本(非种系化的)抗体1IgG抑制人或猕猴CXCL13(MEL细胞来源)对CHO Gqi5hCXCR5细胞中cAMP水平的调节的效价。IC50值示于表5中。
克隆              人CXCL13              猕猴CXCL13
                  IC50nM(n数目)         IC50nM(n数目)
抗体1(亲本)       1.4+0.5(n＝10)        0.3+0.1(n＝6)
抗体1(种系化的)   1.6±0.3(n＝4)        0.3±0.1(n＝4)
表5.
Figure A20088000550600791
CXCL13cAMP测定中种系化的和亲本抗体1IgG1抗人或猕猴CXCL13的效价(平均IC50标准差，n数目)
亲本和种系化的抗体1IgG在该测定中显示相似的活性。
2.3种系化的抗体1IgG在采用B300.19hCXCR5细胞的趋化性测定中的效价
在采用B300.19hCXCR5细胞的趋化性测定中测试完全种系化的抗体1IgG1。针对非糖基化和糖基化的人CXCL13以及糖基化的猕猴CXCL13的ED80浓度滴定IgGs。结果作为IC50值(nM)±SEM示于下表6。IgGs至少测定3次。
Figure A20088000550600792
表6.B3300.19hCXCR5趋化性测定中种系化的抗体lIgG的IC50值(nM)±SEM的实例
2.4种系化的抗体1IgG对CXCL13诱导的钙释放的抑制
在1.5部分概况的FLIPR测定中比较种系化的和亲本(非种系化的)抗体1IgG的效价。
 克隆名称   IgG IC50nM±SD
 抗体1(亲本)   17.1±11.2(n＝8)
 抗体1(种系化的)   10.4±6.3(n＝7)
表7.CXCL13介导的CHO Gqi5hCXCR5c4.4Ca2+钙释放测定中IgG效价的实例(平均IC50±标准差，n数目).
2.5种系化的抗体1IgG对人CXCL13的特异性
用CXCL13FLISA(荧光连接的免疫吸附测定)测定种系化的抗体1IgG1相对于趋化因子的CXC家族的其他成员，对人CXCL13(MEL细胞来源的)的特异性。在该测定中，测试趋化因子CXCL3(R&D Systems)，CXCL5(R&D Systems)，CXCL6(R&D Systems)，CXCL8(R&D Systems)，CXCL10(R&D Systems)和CXCL12(Peprotech)与固定在链霉亲和素珠上的生物素化人CXCL13(Almac)对种系化的抗体1IgG1的结合的竞争。采用荧光微体积测定技术(细节参见“测定材料和方法”)，用荧光标记的抗人IgG抗体检测生物素化的人CXCL13抗体结合相互作用。结果示于表8。标准趋化因子名称(Zlotnik and Yoshie，2000)与它们最常用的同义词一起给出。
趋化因子   抑制种系化的抗体1IgG1与生物素化的人CXCL13的结合IC50(nM)
 人CXCL13(MEL细胞来源的)   0.2
 猕猴CXCL13(MEL细胞来源的)   0.8
 CXCL3(GROγ)   ＞1μM
 CXCL5(ENA-78)   ＞1μM
 CXCL6(GCP-2)   ＞1μM
 CXCL8(IL-8)   ＞1μM
 CXCL10(IP10)   ＞1μM
 CXCL12(SDF-1α)   ＞1μM
表8.趋化因子抑制生物素化的人CXCL13与种系化的抗体1IgG1的结合的实例(仅显示n＝1的数据)
人CXCL13和猕猴CXCL13与生物素化的人CXCL13竞争结合种系化的抗体1IgG1。其他测试的趋化因子最高达1μM浓度时都没有显示对生物素化的人CXCL13抗体1IgG的抑制。
实施例3a：抗体对人和猕猴CXCL13的亲和力
3.1通过BIAcore测量而确定抗体亲和力
基本如Karlsson等，1991的描述，用BIAcore 2000光学生物传感器(BIAcore AB，Upsalla，Sweden)通过表面等离子共振(SPR)进行动力学结合参数的确定。也参见测定材料和方法部分。
方向1.
分别在标准化的CM5芯片(BIAcore，BR-1000-14)的流动室(Fc)1和2上用标准胺连接化学建立空白和蛋白G’(Sigma P4689)的265RU表面。用这种Fc2蛋白G’表面捕获240-385Rus抗体1(种系化的IgG1)。
  流动室(Fc)   配体   反应1(结合的RU)
  1   空白(HBS-EP)   n/a
  2   蛋白G’(在10mM醋酸缓冲液pH 4.5中稀释到20μg/mL)   265
表9.
然后使人和猕猴CXCL13的稀释液(在HBS-EP缓冲液中)以100μL/min的流速流过芯片。
拟合于Fc 2-1数据的采用质量转移限制的1∶1Langmuir模型
拟合条件(在BIAevaluation 3.2上进行)：
扣除双空白(从IgG流动室数据扣除空白流动室，从数据集的其余部分扣除空白注射液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％v/v表面活性剂P20，HBS-EP))。局部将空白RI贡献都设置为0。
采用具有质量转移限制的1∶1Langmuir模型，将HBS-EP扣除和RI设置为0，基于0.25-20nM人CXCL13曲线(10种浓度)，获得以下参数。
  ka(M-1s-1)   kd(s-1)   Rmax(RU)   KD(M)   Chi2
 238RUs抗体1(种系化的)   2.13e7   6.84e-4   37.2   3.22e-11   0.425
 385RUs抗体1(种系化的)   1.42e7   7.15e-4   58.2   5.04e-11   0.529
 347RUs抗体1(种系化的)   1.76e7   7.36e-4   52.9   4.17e-11   0.690
表10a.
  ka(M-1s-1)   kd(s-1)   KD(M)
  来自三次实验的平均值   1.77e7   7.12e-4   4.14e-11
表10b.
采用具有质量转移限制的1∶1Langmuir模型，将HBS-EP扣除和RI设置为0，基于0.125-40nM猕猴CXCL13曲线(12种和9种浓度)，获得以下参数。
  ka(M-1s-1)   kd(s-1)   Rmax(RU)   KD(M)   Chi2
 303RUs抗体1(种系化的)   1.97e7   6.50e-4   49.6   3.30e-11   1.35
 296RUs抗体1(种系化的)   2.05e7   5.99e-4   47.2   2.91e-11   0.683
表11.
  ka(M-1s-1)   kd(s-1)   KD(M)
  来自两次实验的平均值   2.01e7   6.25e-4   3.11e-11
表11b.
适于抗体1(种系化的)的猕猴CXCL13与人CXCL13产生了非常相似的KD值，表明对每种变体的亲和力非常相似。
方向2.
分别在标准化的CM5芯片(BIAcore，BR-1000-14)的流动室(Fc)2和3上用标准胺连接化学建立空白(Fc 1)和链霉亲和素(Perbio/Pierce21125)的228和303RU表面。用这种Fc 3链霉亲和素表面捕获在C末端附近生物素化的28Rus人CXCL13(Almac custom synthesis)。
然后使大小排阻层析层析单体化的抗体1的Fab片段的稀释液(在HBS-EP缓冲液中稀释)以30μL/min的流速流过芯片表面。
拟合于Fc 3-1数据的1∶1Langmuir模型
拟合条件(在BIAevaluation 3.2上进行)：
扣除双空白(从IgG流动室数据扣除空白流动室，从数据集的其余部分扣除空白注射液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaC1，3mM EDTA，0.005％v/v表面活性剂P20，HBS-EP))。局部将空白RI贡献都设置为0。
采用具有质量转移限制的1∶1Langmuir模型，将HBS-EP扣除和RI设置为0，基于0.065-2.105nM抗体1(种系化的IgG1)Fab曲线，获得以下参数。
  ka(M-1s-1)   kd(s-1)   Rmax(RU)   KD(M)   Chi2
  28RUs人CXCL13   8.98e6   1.66e-3   41.6   1.85e-10   0.394
表13
实施例3b：抗体对人CXCL13的亲和力
在实施例3a阐述的更全面数据之前，按照下文的描述用较低的CXCL-13浓度分布确定最初亲和力数据(n＝1)。也参见材料和方法部分。
3.1b通过BIAcore测量而确定抗体亲和力
基本如Karlsson等，1991的描述，用BIAcore 2000光学生物传感器(BIAcore AB，Upsalla，Sweden)通过表面等离子共振(SPR)进行动力学结合参数的确定。
在CH3芯片(BIAcore，BR-1000-41)上用标准胺连接化学建立空白(Fc 1)和稀释在10mM醋酸缓冲液pH 4.5中的抗体1(种系化的IgG1)的500RU表面。
  流动室(Fc)  配体   反应1(结合的RU)   目标(RU)
  1  空白(HBS-EP)   n/a   -
  2  抗体1(种系化的)   579.9   500
表14.
然后使人和猕猴CXCL13的稀释液流过芯片表面。
拟合于Fc2-1和3-1数据的Langmuir模型
拟合条件(在BIAevaluation 3.2上进行)：
扣除双空白(从IgG流动室数据扣除空白流动室，从数据集的其余部分扣除空白注射液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％v/v表面活性剂P20，HBS-EP))。局部将空白RI贡献都设置为0。
采用1∶1Langmuir模型，将HBS-EP扣除和RI设置为0，基于0.10-0.60nM人CXCL13曲线，获得了以下参数。
  ka(M-1s-1)   kd(s-1)   Rmax(RU)   KD(M)   Chi2
 579RUs抗体1(种系化的)   2.02e6   5.24e-4   54.2   2.59e-10   0.183
表15.
采用1∶1Langmuir模型，将HBS-EP扣除和RI设置为0，基于0.10-0.60nM猕猴CXCL13曲线，对于每种IgG，获得了以下参数。
  ka(M-1s-1)   kd(s-1)   Rmax(RU)   KD(M)   Chi2
  579RUs抗体1(种系化的)   3.63e6   1.04e-4   38   2.85e-10   0.161
表16.
实施例4：抑制原代B细胞的CXCL13诱导的趋化性
4.1抑制从小鼠脾分离的原代淋巴细胞的CXCL13诱导的趋化作用
从小鼠脾新鲜分离原代淋巴细胞，用LPS培养过夜。然后将细胞用于通过可商购的鼠CXCL13(R&D Systems)或人CXCL13(MEL细胞来源的)刺激的趋化性测定中。抗体1IgG(非种系化的)的IC50数据(nM)示于下表12中(仅显示n＝1和n＝2的数据)。
表12.
实施例5：人扁桃体B细胞CXCL13驱动的趋化性测定
1.4抑制人扁桃体B细胞中CXCL13诱导的趋化性
从人扁桃体新鲜分离原代扁桃体B细胞，用LPS培养过夜。然后用ED80浓度(100nM)的人非糖基化CXCL13(ABL-MEL细胞来源的)将细胞用于趋化性测定中。关于测定方法的细节，参见“测定材料和方法”部分。抗体1(种系化的IgG1)的IC50数据(nM)示于表17中(n＝4的数据)。
  IgG  抗体1(种系化的IgG1)
  IC50(nM)  9.59+/-1.6
表17
实施例6：ELISA中天然hCXCL13与抗体1(种系化的IgG 1 )的结合
如“测定材料和方法”部分所述，在测定中，抗体1(种系化的IgG1)以相同的配体浓度结合天然CXCL13和重组CXCL13，得到相同的信号。
实施例7：抗体1(种系化的IgG1)干扰CXCL-13的H/D交换速度
在第一个实验中，CXCL13交换溶液中的D20，然后结合固定于柱上的抗体1(IgG1)。然后，它反向交换到H2O中，同时仍然与抗体柱结合，导致在反向交换反应中表位受到保护，并且随后用氘标记。在第二个实验中，CXCL13首先与柱上的抗体1结合，然后用D20标记，最后交换回到H2O中，同时仍然与柱结合，使得CXCL13的部分都不被氘标记。然后确定两个实验之间肽质量的差异。两个实验之间氘化水平的差异是与抗体结合时交换延迟的度量。该方案的详细方法提供在材料和方法部分。
具有SEQ ID NO 14所示序列的、在MEL细胞中表达的人CXCL13用于此研究中。
显示对H/D交换速度具有最大干扰的区域是在人CXCL-13的氨基酸31-42之间(SEQ ID No.20)。
在pH7，在缺乏抗体的条件下，跨几乎整个分子的交换速度都非常快，提示非常具有柔性的结构。当结合于抗体时，跨分子中心的交换减缓。这表明除了31-42的主要结合，可能具有其他相互作用部位，其具有较弱的结合。
表18显示了氚化水平的百分比差异，其中比较了当结合于抗体1时的氚化和交换回到质子与结合于抗体时溶液中的氚化和交换回到质子。当对四个时间点取平均值时超过10％的差异认为是显著的。残基计数是针对SEQ ID NO.14所示序列。
Figure A20088000550600871
表18
参考文献
本说明书中任何位置引用的所有参考文献，包括上文任何位置引用的参考文献，都在此通过全文引用并入本文，并且用于所有目的。
1Ansel，KM.et al.Nature，406：309-314，2000
2Haan&Maggos(2004)BioCentury，12(5)：A1-A6
3Koide et al.(1998)Journal of Molecular Biology，284：1141-1151.
4Nygren et al.(1997)Current Opinion in Structural Biology，7：463-469
5Wess，L.In：BioCentury，The Bernstein Report on BioBusiness，12(42)，A1-A7，2004
6Kabat，E.A.et al，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest.4thEdition.US Department of Health and Human Services.1987
7Martin，A.C.R.Accessing the Kabat Antibody Sequence Databasebv Computer PROTEINS：Structure，Function and Genetics，25(1996)，130-133
8Kabat，E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th Edition.US Department of Health andHuman Services，Public Service，NIH，Washington
9Secgal et al.，PNAS，71：4298-4302，1974
10Amit et al.，Science，233：747-753，1986
11Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196：901-917，1987
12Chothia et al.，Nature，342：877-883，1989
13Caton et al.，J.Immunol.，144：1965-1968，1990
14Sharon et al.，PNAS，87：4814-4817，1990
15Sharon et al.，J.Immunol.，144：4863-4869，1990
16Kabat et al.，J.Immunol.，147：1709-1719，1991
17Holliger&Hudson，Nature Biotechnology 23(9)：1126-11362005
18Kontermann，R&Dubel，S，Antibody Engineering，Springer-Verlag New York，LLC；2001，ISBN：3540413545
19Mendez，M.et al.(1997)Nature Genet，15(2)：146-156
20Knappik et al.J.Mol.Biol.(2000)296，57-86
21Krebs et al.Journal of Immunological Methods 254200167-84
22Ward，E.S.et al.，Nature 341，544-546(1989)
23McCaffertv et al(1990)Nature，348，552-554
24Holt et al(2003)Trends in Biotechnology 21，484-490
25Bird et al，Science，242，423-426，1988
26Huston et al，PNAS USA，85，5879-5883，1988
27Holliger，P.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，1993
28Reiter，Y.et al，Nature Biotech，14，1239-1245，1996
29Hu，S.et al，Cancer Res.，56，3055-3061，1996
30Holliger and Bohlen 1999Cancer and metastasis rev.18：411-419
31Holliger，P.and Winter G.Current Opinion Biotechnol 4，446-4491993
32Glennie M J et al.，1987J.Immunol.139，2367-2375
33Repp R.et al.，1995J.Hemat.377-382
34Staerz U.D.and Bevan M.J.1986PNAS 83
35Suresh M.R.et al.，1986Method Enzymol.121：210-228
36Merchand et al.，1998Nature Biotech.16：677-681
37Ridgeway，J.B.B.et al，Protein Eng.，9，616-621，1996
38Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor N.Y.，pp.726，1988
39
Figure A20088000550600891
and Milstein，Nature，256：495-497，1975
40Wold，et al.Multivariate data analysis in chemistry.Chemometrics-Mathematics and Statistics in Chemistry(Ed.：B.Kowalski)，D.Reidel Publishing Company，Dordrecht，Holland，1984(ISBN 90-277-1846-6)
41Norman et al.Applied Regression Analysis.Wiley-Interscience；3rd edition(April 1998)ISBN：0471170828
42Kandel，Abraham&Backer，Eric.Computer-Assisted Reasoningin Cluster Anslysis.Premtice Hall PTR，(May 11，1995)，ISBN：0133418847
43Krzanowski，Wojtek.Principles of Multivariate Analysis：AUser′s Perspective(Oxford Statistical Science Series，No 22(Paper)).Oxford University Press；(December 2000)，ISBN：0198507089
44Witten，Ian H.&Frank，Eibe.Data Mining：Practical MachineLearning Tools and Techniques with Java Implementations.MorganKaufmann；(October 11，1999)，ISBN：1558605525
45Denison David G.T.(Editor)，Christopher C.Holmes，Bani K.Mallick，Adrian F.M.Smith.Bayesian Methods for NonlinearClassification and Regression(Wiley Series in Probability andStatistics).John Wiley&Sons；(July 2002)，ISBN：0471490369
46Ghose，Arup K.&Viswanadhan，Vellarkad N..CombinatorialLibfary Design and Evaluation Principles，Software，Tools，andApplications in Drug Discovery.ISBN：0-8247-0487-8
47Chothia C.et al.Journal Molecular Biology(1992)227，799-817
48Al-Lazikani，et al.Journal Molecular Biology(1997)273(4)，927-948
49Chothia，et al.Science，223，755-758(1986)
50Whitelegg，N.R.u.and Rees，A.R(2000).Prot.Eng.，12，815-824
51Guex，N.and Peitsch，M.C.Electrophoresis(1997)18，2714-2723
52Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：405-410
53Pearson and Lipman(1988)PNAS USA 85：2444-2448
54Smith and Waterman(1981)J.Mol Biol.147：195-197
55Voet&Voet，Biochemistry，2nd Edition，(Wiley)1995.
56Gram et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89：3576-3580
57Barbas et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91：3809-3813
58Schier et al.，1996，J.Mol.Biol.263：551-567
59Marks et al Bio/Technology，1992，10：779-783
60Kay，B.K.，Winter，J.，and McCafferty，J.(1996)Phage Displayof Peptides and Proteins：A Laboratory Manual，San Diego：Academic Press
61Hunter W.M.and Greenwood F.C.(1962)Nature 194：495
62Plückthun，A.Bio/Technology 9：545-551(1991)
63Chadd HE and Chamow SM(2001)Current Opinion in Biotechnology12：188-194
64Andersen DC and Krummen L(2002)Current Opinion inBiotechnology 13：117
65Larrick JW and Thomas DW(2001)Current Opinion inBiotechnology 12：411-418
66Sambrook and Russell，Molecular Cloning：aLaboratory Manual：3rd edition，2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press
67Ausubel et al.eds.，Short Protocols in Molecular Biology：ACompendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，4th edition 1999
68Shi，K.et al.J.Immunol，166：650-655，2001
69Manzo，A.et al.Eur.J.Immunol，35：1347-1359，2005
70Kim，H-J.et al.J.Immunol，162：3053-3062，1999
71Carlson，HS.et al.Blood，104：3021-3027，2004
72Zheng，B.et al.Arthritis&Rheumatism，52(2)：620-626，2005
73Mazezetti，I.et al.Arthritis&Rheumatism，50(1)：112-122，2004
74Lisignoli，G.et al.J.Cell.Physiol，206：78-85，2006
75Lisignoli，G.et al.Experimental Gerontology，39：659-665，2004
76Bugatti，S.et al.Arthritis&Rheumatism，52(11)：3448-3459，2005
77Schaerli，P.et al.J.Exp.Med，192(11)：1553-1562，2000
78Breitfeld，D.et al.J.Exp.Med，192(11)：1545-1551，2000
79Yu，P.et al.J.Immunol，168：5117-5123，2002
80Edwards，JCW.et al.Rheum.Dis.Clin.N.Am，30：393-403，2004
81Edwards，JCW，Cambridge，G.Nature.Rev.Immunol，6：394-403，2006
82Robinson，J.R.ed.，Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978
83Ledermann J.A.et al.(1991)Int.J.Cancer 47：659-664
84Bagshawe K.D.et al.(1991)Antibody，Immunoconjugates andRadiopharmaceuticals 4：915-922
85Bannister D.，Wilson A.，Prowse L.，Walsh M.，Holgate R.，Jermutus J.and Wilkinson T.Biotechnology and Bioengineering，94(5)：931-937
86Dietz L.J.，Dubrow R.S.，Manian B.S.and Sizto.N.L.，Cytometry 23：177-186，1996
87Foote，J and Winter G.J.Mol.Biol.224(2)：487-499，1992
88Karlsson R.，Michaelsson A.and Mattsson L.J.Immunol.Methods，145(102)：229-240，1991
89Hutchings，C.Generation of
Figure A20088000550600921
Human Antibody Libraries，inAntibody Engineering，R.Kontermann and S.Dubel，Editors.2001，Springer Laboratory Manuals，Berlin.p.93
90Mach et al.Anal.Biochem.200(1)：20-26，1992
100Mellentin-Michelotti J.，Evangelista，L.，Swartzman E.E.，Miraglia，S.J.，Werner W.and Yuan P.-M Anal.Biochem 272：182-190，1999
101Miraglia S.，Swartzman E.E.，Mellentin-Michelotti J.，Evangelista，L.，Smith C.，GunawanI.，Lohman K.，Goldberg E.M.，Manian B.and Yuan P.-M.J Biomol.Screening 4：193-204，1999
102Osbourn，JK.et al.Immunotechnology，2(3)：181-96，1996
103Persic，L.et al.Gene.187(1)：9-18，1997
104Swartzman E.E.，Miraglia S.J.，Mellentin-Michelotti J.，Evangelista L.and Yuan P-M.Anal.Biochem 271：143-151，1999
105Tomlinson，I.，VBASE.MRC Centre of Protein Engineering，Cambridge，UK，1997
106Vaughan，TJ.et al.Nature Biotechnology 14(3)：309-14，1996
107Zlotnik，A.and Yoshie，O.Immunity 12：121-7，2000
序列表
<110>Barker，Wendy
     Keyes，Feenagh
     AstaZeneca AB
     MedImmune Limited
<120>单克隆抗CXCL13抗体
<130>102532
<150>US60/890,888
<151>2007-02-21
<150>US60/908,041
<151>2007-03-26
<160>20
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>357
<212>DNA
<213>人
<220>
<223>抗体1
<400>1
gaggtgcagc tgctggagtc tgggggaggc ttggtgcagc caggggggtc cctgagactc   60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttggt aattcttgga tgagttgggt ccgccaggct  120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac  180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat  240
ctgcaaatga acagcctgcg agctgaggac acggctgtgt attactgtac gagagatctt  300
ccgggtatag cagtggctgg ttactggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcgagt     357
<210>2
<211>119
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>抗体1
<400>2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asn Ser
            20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg Asp Leu Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>3
<211>5
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>抗体1
<400>3
Ash Ser Trp Met Ser
1               5
<210>4
<211>17
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>抗体1
<400>4
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>5
<211>10
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>抗体1
<400>5
Asp Leu Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Tyr
1               5                   10
<210>6
<211>324
<212>DNA
<213>人
<220>
<223>抗体1
<400>6
gacacccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc     60
atcacctgcc gggccagtga gggtatttat cactggttgg cctggtatca gcagaagcca    120
gggaaagccc ctaaactcct gatctataag gcctctagtt tagccagtgg ggtcccatca    180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct    240
gatgattttg caacttatta ctgccaacaa tatagtaatt atccgctcac tttcggcgga    300
gggaccaagc tggagatcaa acgt                                           324
<210>7
<211>108
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>抗体1
<400>7
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>8
<211>11
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>抗体1
<400>8
Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>9
<211>7
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>抗体1
<400>9
Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser
1               5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>抗体1
<400>10
Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210>11
<211>242
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>抗体1scFv氨基酸序列(VH后是具有接头序列的VL)
<400>11
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asn Ser
            20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg His Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ash Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ash Ser Leu Gly Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg Asp Leu Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Tyr Trp Gly Arg Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr
    130                 135                 140
Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
145                 150                 155                 160
Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
                165                 170                 175
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala
            180                 185                 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
        195                 200                 205
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
    210                 215                 220
Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
225                 230                 235                 240
Lys Arg
<210>12
<211>109
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>全长人CXCL13氨基酸序列
<400>12
Met Lys Phe Ile Ser Thr Ser Leu Leu Leu Met Leu Leu Val Ser Ser
1               5                   10                  15
Leu Ser Pro Val Gln Gly Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg
            20                  25                  30
Cys Arg Cys Val Gln Glu Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile
        35                  40                  45
Asp Arg Ile Gln Ile Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu
    50                  55                  60
Ile Ile Val Trp Lys Lys Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln
65                  70                  75                  80
Ala Glu Trp Ile Gln Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser
                85                  90                  95
Ser Thr Leu Pro Val Pro Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro
            100                 105
<210>13
<211>87
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>成熟的人CXCL13氨基酸序列
<400>13
Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg Cys Arg Cys Val Gln Glu
1               5                   10                  15
Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile Asp Arg Ile Gln Ile Leu
            20                  25                  30
Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu Ile Ile Val Trp Lys Lys
        35                  40                  45
Ash Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln Ala Glu Trp Ile Gln Arg
    50                  55                  60
Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser Ser Thr Leu Pro Val Pro
65                  70                  75                  80
Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro
                85
<210>14
<211>82
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>具有C末端截短的成熟的人CXCL13氨基酸序列
<400>14
Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg Cys Arg Cys Val Gln Glu
1               5                   10                  15
Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile Asp Arg Ile Gln Ile Leu
            20                  25                  30
Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu Ile Ile Val Trp Lys Lys
        35                  40                  45
Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln Ala Glu Trp Ile Gln Arg
    50                  55                  60
Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser Ser Thr Leu Pro Val Pro
65                  70                  75                  80
Val Phe
<210>15
<211>87
<212>PRT
<213>猕猴
<220>
<223>成熟的猕猴CXCL13氨基酸序列
<400>15
Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr His Leu Arg Cys Arg Cys Val Gln Glu
1               5                   10                  15
Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile Asp Arg Ile Gln Ile Ser
            20                  25                  30
Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu Ile Ile Val Trp Lys Lys
        35                  40                  45
Ash Lys Ser Val Val Cys Val Asp Pro Gln Ala Glu Trp Ile Gln Arg
    50                  55                  60
Ile Met Glu Met Leu Arg Lys Lys Ser Ser Ser Thr Pro Pro Val Pro
65                  70                  75                  80
Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro
                85
<210>16
<211>82
<212>PRT
<213>猕猴
<220>
<223>具有C末端截短的成熟的猕猴CXCL13氨基酸序列
<400>16
Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr His Leu Arg Cys Arg Cys Val Gln Glu
1               5                   10                  15
Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile Asp Arg Ile Gln Ile Ser
            20                  25                  30
Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu Ile Ile Val Trp Lys Lys
        35                  40                  45
Asn Lys Ser Val Val Cys Val Asp Pro Gln Ala Glu Trp Ile Gln Arg
    50                  55                  60
Ile Met Glu Met Leu Arg Lys Lys Ser Ser Ser Thr Pro Pro Val Pro
65                  70                  75                  80
Val Phe
<210>17
<211>372
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>人CXCR5同工型1氨基酸序列
<400>17
Met Asn Tyr Pro Leu Thr Leu Glu Met Asp Leu Glu Asn Leu Glu Asp
1               5                   10                  15
Leu Phe Trp Glu Leu Asp Arg Leu Asp Ash Tyr Asn Asp Thr Ser Leu
            20                  25                  30
Val Glu Asn His Leu Cys Pro Ala Thr Glu Gly Pro Leu Met Ala Ser
        35                  40                  45
Phe Lys Ala Val Phe Val Pro Val Ala Tyr Ser Leu Ile Phe Leu Leu
    50                  55                  60
Gly Val Ile Gly Asn Val Leu Val Leu Val Ile Leu Glu Arg His Arg
65                  70                  75                  80
Gln Thr Arg Ser Ser Thr Glu Thr Phe Leu Phe His Leu Ala Val Ala
                85                  90                  95
Asp Leu Leu Leu Val Phe Ile Leu Pro Phe Ala Val Ala Glu Gly Ser
            100                 105                 110
Val Gly Trp Val Leu Gly Thr Phe Leu Cys Lys Thr Val Ile Ala Leu
        115                 120                 125
His Lys Val Asn Phe Tyr Cys Ser Ser Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ala
    130                 135                 140
Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val His Ala Tyr Arg His
145                 150                 155                 160
Arg Arg Leu Leu Ser Ile His Ile Thr Cys Gly Thr Ile Trp Leu Val
                165                 170                 175
Gly Phe Leu Leu Ala Leu Pro Glu Ile Leu Phe Ala Lys Val Ser Gln
            180                 185                 190
Gly His His Asn Asn Ser Leu Pro Arg Cys Thr Phe Ser Gln Glu Asn
        195                 200                 205
Gln Ala Glu Thr His Ala Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu Tyr His Val
    210                 215                 220
Ala Gly Phe Leu Leu Pro Met Leu Val Met Gly Trp Cys Tyr Val Gly
225                 230                 235                 240
Val Val His Arg Leu Arg Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln Arg Gln Lys
                245                 250                 255
Ala Val Arg Val Ala Ile Leu Val Thr Ser Ile Phe Phe Leu Cys Trp
            260                 265                 270
Ser Pro Tyr His Ile Val Ile Phe Leu Asp Thr Leu Ala Arg Leu Lys
        275                 280                 285
Ala Val Asp Asn Thr Cys Lys Leu Asn Gly Ser Leu Pro Val Ala Ile
    290                 295                 300
Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala His Cys Cys Leu Asn Pro Met
305                 310                 315                 320
Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val Lys Phe Arg Ser Asp Leu Ser Arg Leu
                325                 330                 335
Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr Gly Pro Ala Ser Leu Cys Gln Leu Phe
            340                 345                 350
Pro Ser Trp Arg Arg Ser Ser Leu Ser Glu Ser Glu Asn Ala Thr Ser
        355                 360                 365
Leu Thr Thr Phe
    370
<210>18
<211>327
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>人CXCR5同工型2氨基酸序列
<400>18
Met Ala Ser Phe Lys Ala Val Phe Val Pro Val Ala Tyr Ser Leu Ile
1               5                   10                  15
Phe Leu Leu Gly Val Ile Gly Asn Val Leu Val Leu Val Ile Leu Glu
            20                  25                  30
Arg His Arg Gln Thr Arg Ser Ser Thr Glu Thr Phe Leu Phe His Leu
        35                  40                  45
Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Val Phe Ile Leu Pro Phe Ala Val Ala
    50                  55                  60
Glu Gly Ser Val Gly Trp Val Leu Gly Thr Phe Leu Cys Lys Thr Val
65                  70                  75                  80
Ile Ala Leu His Lys Val Asn Phe Tyr Cys Ser Ser Leu Leu Leu Ala
                85                  90                  95
Cys Ile Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val His Ala
            100                 105                 110
Tyr Arg His Arg Arg Leu Leu Ser Ile His Ile Thr Cys Gly Thr Ile
        115                 120                 125
Trp Leu Val Gly Phe Leu Leu Ala Leu Pro Glu Ile Leu Phe Ala Lys
    130                 135                 140
Val Ser Gln Gly His His Asn Asn Ser Leu Pro Arg Cys Thr Phe Ser
145                 150                 155                 160
Gln Glu Asn Gln Ala Glu Thr His Ala Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu
                165                 170                 175
Tyr His Val Ala Gly Phe Leu Leu Pro Met Leu Val Met Gly Trp Cys
            180                 185                 190
Tyr Val Gly Val Val His Arg Leu Arg Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln
        195                 200                 205
Arg Gln Lys Ala Val Arg Val Ala Ile Leu Val Thr Ser Ile Phe Phe
    210                 215                 220
Leu Cys Trp Ser Pro Tyr His Ile Val Ile Phe Leu Asp Thr Leu Ala
225                 230                 235                 240
Arg Leu Lys Ala Val Asp Asn Thr Cys Lys Leu Asn Gly Ser Leu Pro
                245                 250                 255
Val Ala Ile Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala His Cys Cys Leu
            260                 265                 270
Asn Pro Met Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val Lys Phe Arg Ser Asp Leu
        275                 280                 285
Ser Arg Leu Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr Gly Pro Ala Ser Leu Cys
    290                 295                 300
Gln Leu Phe Pro Ser Trp Arg Arg Ser Ser Leu Ser Glu Ser Glu Asn
305                 310                 315                 320
Ala Thr Ser Leu Thr Thr Phe
                325
<210>19
<211>353
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>G蛋白Gqi5氨基酸序列
<400>19
Met Ala Cys Cys Leu Ser Glu Glu Ala Lys Glu Ala Arg Arg Ile Asn
1               5                   10                  15
Asp Glu Ile Glu Arg Gln Leu Arg Arg Asp Lys Arg Asp Ala Arg Arg
            20                  25                  30
Glu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Gly Thr Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr
        35                  40                  45
Phe Ile Lys Gln Met Arg Ile Ile His Gly Ser Gly Tyr Ser Asp Glu
    50                  55                  60
Asp Lys Arg Gly Phe Thr Lys Leu Val Tyr Gln Asn Ile Phe Thr Ala
65                  70                  75                  80
Met Gln Ala Met Ile Arg Ala Met Asp Thr Leu Lys Ile Pro Tyr Lys
                85                  90                  95
Tyr Glu His Asn Lys Ala His Ala Gln Leu Val Arg Glu Val Asp Val
            100                 105                 110
Glu Lys Val Ser Ala Phe Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ala Ile Lys Ser
        115                 120                 125
Leu Trp Asn Asp Pro Gly Ile Gln Glu Cys Tyr Asp Arg Arg Arg Glu
    130                 135                 140
Tyr Gln Leu Ser Asp Ser Thr Lys Tyr Tyr Leu Asn Asp Leu Asp Arg
145                 150                 155                 160
Val Ala Asp Pro Ser Tyr Leu Pro Thr Gln Gln Asp Val Leu Arg Val
                165                 170                 175
Arg Val Pro Thr Thr Gly Ile Ile Glu Tyr Pro Phe Asp Leu Gln Ser
            180                 185                 190
Val Ile Phe Arg Met Val Asp Val Gly Gly Gln Arg Ser Glu Arg Arg
        195                 200                 205
Lys Trp Ile His Cys Phe Glu Asn Val Thr Ser Ile Met Phe Leu Val
    210                 215                 220
Ala Leu Ser Glu Tyr Asp Gln Val Leu Val Glu Ser Asp Asn Glu Asn
225                 230                 235                 240
Arg Met Glu Glu Ser Lys Ala Leu Phe Arg Thr Ile Ile Thr Tyr Pro
                245                 250                 255
Trp Phe Gln Asn Ser Ser Val Ile Leu Phe Leu Asn Lys Lys Asp Leu
            260                 265                 270
Leu Glu Glu Lys Ile Met Tyr Ser His Leu Val Asp Tyr Phe Pro Glu
        275                 280                 285
Tyr Asp Gly Pro Gln Arg Asp Ala Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Leu
    290                 295                 300
Lys Met Phe Val Asp Leu Asn Pro Asp Ser Asp Lys Ile Ile Tyr Ser
305                 310                 315                 320
His Phe Thr Cys Ala Thr Asp Thr Glu Asn Ile Arg Phe Val Phe Ala
                325                 330                 335
Ala Val Lys Asp Thr Ile Leu Gln Leu Asn Leu Lys Asp Gly Gly Leu
            340                 345                 350
Phe
<210>20
<211>12
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>人CXCL-13肽
<400>20
Ile Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu
1               5                   10

Claims (66)

1.CXCL13的分离的结合成员，其中所述结合成员抑制CXCL13与CXCR5的结合，并且其中所述结合成员与具有氨基酸序列SEQ IDNO：11的抗体scFv分子竞争结合CXCL13。
2.权利要求1的结合成员，其中所述结合成员包含HCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：5。
3.权利要求1或权利要求2的分离的结合成员，包含抗体1 CDRs组：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，定义为其中：
HCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：3；
HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：4；
HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：5；
LCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：8；
LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：9；并且
LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：10；
或包含具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的抗体1CDRs组。
4.CXCL13的分离的结合成员，其中所述结合成员抑制CXCL13与CXCR5的结合，并且其中所述结合成员包含抗体1 CDRs组：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，定义为其中：
HCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：3；
HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：4；
HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：5；
LCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：8；
LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：9；并且
LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：10；
或包含具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的抗体1 CDRs组。
5.权利要求3或权利要求4的结合成员，包含抗体1 CDRS组，或包含具有1个或两个取代的抗体1 CDRs组。
6.权利要求3或4的结合成员，包含抗体1 CDRS组。
7.前述任一项权利要求的结合成员，其中所述结合成员包括抗体分子，所述抗体分子包含抗体VH结构域和抗体VL结构域，其中所述抗体分子包含CDRs组：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述VH结构域包含HCDR1、HCDR2、HCDR3和构架区，所述VL结构域包含LCDR1、LCDR2、LCDR3和构架区。
8.权利要求7的结合成员，其中所述抗体分子是scFv。
9.权利要求7的结合成员，其中所述抗体分子包含抗体恒定区。
10.权利要求9的结合成员，其中所述抗体分子是IgG1。
11.权利要求7-10的任一项的结合成员，其中所述抗体分子包含人种系基因片段序列的构架区。
12.权利要求7-11的任一项的结合成员，其中所述抗体VH结构域包含人种系构架区VH3-23。
13.权利要求7-12的任一项的结合成员，其中所述抗体VH结构域具有一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有至少90％序列同一性。
14.权利要求7-11的任一项的结合成员，其中所述抗体VH结构域氨基酸序列是SEQ ID NO：2。
15.权利要求11-14的任一项的结合成员，其中所述抗体VL结构域包含人种系构架区VK1 L12。
16.权利要求11-15的任一项的结合成员，其中所述抗体分子包含VL结构域，该结构域具有一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO：7具有至少90％序列同一性。
17.权利要求11-14的任一项的结合成员，其中所述VL结构域氨基酸是SEQ ID NO：7。
18.权利要求7-10的任一项的结合成员，其中所述抗体VH结构域氨基酸序列是SEQ ID NO：2；并且所述抗体VL结构域氨基酸序列是SEQID NO：7。
19.前述任一项权利要求的结合成员，其中所述结合成员中和人CXCL13与CXCR5的结合的效价与所述结合成员中和猕猴CXCL13与CXCR5的结合的效价的差异不超过10倍，其中
所述结合成员中和人CXCL13与CXCR5的结合的效价由cAMP测定中测量的IC50表示，所述cAMP测定采用不超过2nM的人CXCL13浓度，并且其中
所述结合成员中和猕猴CXCL13与CXCR5的结合的效价由cAMP测定中测量的IC50表示，所述cAMP测定采用终浓度为2nM的猕猴CXCL13。
20.权利要求19的结合成员，其中中和人CXCL13与CXCR5的结合的效价与中和猕猴CXCL13与CXCR5的结合的效价的差异不超过5倍。
21.前述任一项权利要求的结合成员，其中在采用终浓度为2nM的CXCL13的人CXCL13 cAMP测定中，测量出所述结合成员具有不超过12nM的IC50。
22.前述任一项权利要求的结合成员，其中在采用终浓度为100nM的CXCL13的人CXCL13钙释放测定中，测量出所述结合成员具有不超过40nM的IC50。
23.前述任一项权利要求的结合成员，其中在采用给出大约ED80反应的终浓度的人CXCL13和非原代B细胞系的人CXCL13 B细胞趋化性测定中，所述结合成员具有不超过12nM的IC50。
24.前述任一项权利要求的结合成员，其中采用表面等离子共振，测量出所述结合成员以小于400pM的亲和力结合人CXCL13。
25.前述任一项权利要求的结合成员，其中用表面等离子共振，测量出所述结合成员以小于400pM的亲和力结合猕猴CXCL13。
26.前述任一项权利要求的结合成员，其中所述结合成员结合人CXCL-13的表位，并且其中所述表位包括位于成熟的人IL-17A的31-42位的序列Ile-Leu-Pro-Arg-Gly-Asn-Gly-Cys-Pro-Arg-Lys-Glu(SEQ ID NO：20)的至少一个残基。
27.权利要求7-26的任一项的抗体分子的分离的VH结构域。
28.权利要求7-26的任一项的抗体分子的分离的VL结构域。
29.组合物，包含权利要求1-26的任一项的分离的结合成员和药学可接受的赋形剂。
30.用于通过手术或疗法治疗人体或动物体的方法中的组合物，包含权利要求1-26的任一项的分离的结合成员。
31.权利要求30的组合，用于抑制CXCL13与CXCR5的结合。
32.权利要求1-26的任一项的分离的结合成员在制备用于抑制CXCL13与CXCR5结合的药物中的用途。
33.权利要求31的组合物或权利要求32的用途，用于抑制淋巴滤泡的异常形成和/或发展。
34.权利要求31的组合物或权利要求32的用途，用于抑制骨和/或软骨的破坏和/或重塑。
35.权利要求31的组合物或权利要求32的用途，用于抑制淋巴细胞的趋化性和/或淋巴瘤的增殖。
36.权利要求31的组合物或权利要求32的用途，用于治疗类风湿关节炎、骨关节炎、干燥综合征、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺疾病、莱姆神经疏螺旋体病、HIV感染和/或白血病。
37.权利要求31的组合物或权利要求32的用途，用于治疗类风湿关节炎。
38.用于治疗个体中与异常CXCL13表达和/或CXCL13活性相关的病症的方法，包括给个体施用权利要求1-26的任一项的结合成员。
39.权利要求38的方法，其中所述CXCL13活性是与CXCR5的结合。
40.权利要求39的方法，包括抑制个体中淋巴滤泡的异常形成和/或发展。
41.权利要求39的方法，包括抑制个体中骨和/或软骨的破坏和/或重塑。
42.权利要求39的方法，包括抑制个体中淋巴细胞的趋化性和/或淋巴瘤的增殖。
43.权利要求38-39的任一项的方法，其中所述病症是类风湿关节炎、骨关节炎、干燥综合征、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺疾病、莱姆神经疏螺旋体病、HIV感染和/或白血病。
44.权利要求43的方法，其中所述病症是类风湿关节炎。
45.分离的核酸分子，包含编码权利要求1-28的任一项的结合成员或结合成员的分离的VH或VL结构域的核苷酸序列。
46.用权利要求45的核酸体外转化的宿主细胞。
47.生产结合成员或抗体VH或VL结构域的方法，包括在用于生产结合成员或抗体VH或VL结构域的条件下培养权利要求46的宿主细胞。
48.权利要求47的方法，进一步包括分离和/或纯化所述结合成员、VH结构域或VL结构域。
49.权利要求47或权利要求48的方法，进一步包括将结合成员、VH结构域或VL结构域配制在包含至少一种另外的成分的组合物中。
50.生产CXCL13的抗体抗原结合域的方法，该方法包括
通过在包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的亲本VH结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸，提供作为亲本VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域，并且任选将由此提供的VH结构域与一个或多个VL结构域组合，以提供一个或多个VH/VL组合，所述亲本VH结构域HCDR1、HCDR2和HCDR3是抗体1HCDRs组；并且
测试所述作为亲本VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域或所述VH/VL组合，以鉴定CXCL13的抗体抗原结合域。
51.权利要求50的方法，其中所述亲本VH结构域是权利要求27的VH结构域。
52.权利要求50或权利要求51的方法，其中所述一个或多个VL结构域是通过在包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的亲本VL结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸而提供的，产生一个或多个各自作为亲本VL结构域的氨基酸序列变体的VL结构域，其中所述亲本VL结构域LCDR1、LCDR2和LCDR3是抗体1 CDRs的VL组。
53.权利要求52的方法，其中所述亲本VL结构域是权利要求28的VL结构域。
54.权利要求50-53的任一项的方法，其中作为亲本VH结构域的氨基酸序列变体的所述VH结构域是通过CDR诱变提供的。
55.权利要求50-53的任一项的方法，进一步包括生产作为IgG、scFv或Fab抗体分子的成分的抗体抗原结合域。
56.用于生产结合于CXCL13的结合成员的方法，该方法包括：
提供编码VH结构域的起始核酸或各自编码VH结构域的核酸的起始所有组成成分，其中所述VH结构域包括要被取代的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3或缺乏HCDR1、HCDR2和/或HCDR3编码区；
将所述起始核酸或起始所有组成成分与编码抗体1的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3的氨基酸序列的供体核酸或通过抗体1的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3的氨基酸序列突变产生的供体核酸组合，使得所述供体核酸插入起始核酸或起始所有组成成分中的CDR1、CDR2和/或CDR3区中，从而提供编码VH结构域的核酸的产物所有组成成分；
表达所述产物所有组成成分的核酸，以产生产物VH结构域；
任选将所述产物VH结构域与一个或多个VL结构域组合；
选择CXCL13的结合成员，所述结合成员包含VH结构域，任选包含VL结构域；并且
回收所述结合成员或编码它的核酸。
57.权利要求56的方法，其中所述供体核酸是通过所述HCDR1和/或HCDR2的突变产生的。
58.权利要求56的方法，其中所述供体核酸是通过HCDR3的突变产生的。
59.权利要求56的方法，包括通过核酸的随机突变提供供体核酸。
60.权利要求56-59的任一项的方法，进一步包括将回收的结合成员内包含的产物VH结构域连接于抗体恒定区。
61.权利要求56-60的任一项的方法，包括提供包含产物VH结构域和VL结构域的IgG、scFv或Fab抗体分子。
62.权利要求50-61的任一项的方法，进一步包括测试结合于CXCL13的抗体抗原结合域或结合成员中和CXCL13的能力。
63.权利要求62的方法，其中获得了包括结合并中和CXCL13的抗体分子的结合成员。
64.权利要求63的方法，其中所述抗体分子是scFv。
65.权利要求63的方法，其中所述抗体分子是IgG。
66.生产抗体分子组合物的方法，包括用权利要求50-65的任一项的方法获得抗体分子，并且将所述抗体配制于包含至少一种另外的成分的组合物中。
CN200880005506A 2007-02-21 2008-02-20 单克隆抗cxcl13抗体 Pending CN101636413A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US89088807P 2007-02-21 2007-02-21
US60/890,888 2007-02-21
US90804107P 2007-03-26 2007-03-26
US60/908,041 2007-03-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101636413A true CN101636413A (zh) 2010-01-27

Family

ID=39409730

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880005506A Pending CN101636413A (zh) 2007-02-21 2008-02-20 单克隆抗cxcl13抗体

Country Status (16)

Country Link
US (2) US20080199481A1 (zh)
EP (1) EP2129691A1 (zh)
JP (1) JP2010519280A (zh)
KR (1) KR20090114464A (zh)
CN (1) CN101636413A (zh)
AR (1) AR065433A1 (zh)
AU (1) AU2008217581A1 (zh)
BR (1) BRPI0807631A2 (zh)
CA (1) CA2677878A1 (zh)
EC (1) ECSP099572A (zh)
IL (1) IL200168A0 (zh)
MX (1) MX2009008608A (zh)
PE (1) PE20090161A1 (zh)
TW (1) TW200846369A (zh)
UY (1) UY30932A1 (zh)
WO (1) WO2008102123A1 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102221607A (zh) * 2011-03-29 2011-10-19 浙江大学医学院附属第一医院 一种抗体组合物及其应用
CN103347896A (zh) * 2010-09-02 2013-10-09 瓦西尼斯公司 抗cxcl13抗体和其使用方法
CN103608680A (zh) * 2010-12-14 2014-02-26 詹姆士·W·里拉尔德 抗cxcl13抗体和抗cxcr5抗体在恶性肿瘤的治疗或检测中的用途
CN104870012A (zh) * 2012-06-27 2015-08-26 吉安特科技公司 用于炎性疾病的抗-cxcl9、抗-cxcl10、抗-cxcl11、抗-cxcl13、抗-cxcr3和抗-cxcr5试剂
US9790271B2 (en) 2013-01-31 2017-10-17 Vaccinex, Inc. Methods for increasing immunoglobulin A levels
US9890213B2 (en) 2012-03-02 2018-02-13 Vaccinex, Inc. Methods for the treatment of B cell-mediated inflammatory diseases
CN112521499A (zh) * 2020-12-24 2021-03-19 四川大学 抗cxcl13抗体及其用途

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX353186B (es) * 2009-09-03 2018-01-05 Genentech Inc Metodos para el tratamiento, diagnosis y monitoreo de artritis reumatoide.
US9518127B2 (en) 2011-07-22 2016-12-13 Csl Behring Gmbh Inhibitory anti-factor XII/XIIA monoclonal antibodies and their uses
JP6531893B2 (ja) * 2014-12-11 2019-06-19 国立大学法人 東京大学 濾胞性ヘルパーｔ細胞増加剤
CN104569374B (zh) * 2015-01-04 2017-01-11 深圳市艾瑞生物科技有限公司 一种快速定量检测c‑反应蛋白的均相荧光免疫试剂组及其制备方法
CN104569409B (zh) * 2015-01-04 2017-01-11 深圳市艾瑞生物科技有限公司 一种快速定量检测髓过氧化物酶的均相荧光免疫试剂组及其制备方法
CN104569431B (zh) * 2015-01-04 2017-01-11 深圳市艾瑞生物科技有限公司 一种快速定量检测肌钙蛋白i的均相荧光免疫试剂组及其制备方法
MX2020005662A (es) * 2017-12-01 2020-08-20 Pfizer Anticuerpos anti-cxcr5 y composiciones y usos de los mismos.
KR20200106056A (ko) * 2018-09-18 2020-09-10 아이-맵 바이오파마 유에스 리미티드 자가면역 질환 및 암을 치료하기 위한 항-cxcl13 항체
WO2021026335A1 (en) * 2019-08-08 2021-02-11 The Trustees Of Indiana University Methods for identifying and treating urinary tract infections
CN116782930A (zh) 2020-06-11 2023-09-19 瓦西尼斯公司 Cxcl13结合分子促进周围神经再生的用途
WO2023042314A1 (ja) * 2021-09-15 2023-03-23 和幸 吉崎 免疫異常性炎症性疾患を治療または予防するための組成物

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5872215A (en) * 1991-12-02 1999-02-16 Medical Research Council Specific binding members, materials and methods
US5633149A (en) 1994-12-07 1997-05-27 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide encoding novel chemokine expressed in inflamed adenoid
JPH10513355A (ja) 1995-02-08 1998-12-22 ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・インコーポレイテッド ヒトケモカインβ−１１およびヒトケモカインα−１
EP0833914A4 (en) 1995-06-05 2003-05-28 Human Genome Sciences Inc HUMAN CHEMOKINE BETA-11 AND ALPHA-1
AU4804697A (en) 1996-10-04 1998-04-24 Human Genome Sciences, Inc. Therapeutic compositions and methods for treating disease states with leukocyte adhesion inhibitor-1 (lai-1), and chemokine beta-11 (ckbeta-11)
US6110695A (en) 1997-12-02 2000-08-29 The Regents Of The University Of California Modulating the interaction of the chemokine, B Lymphocyte Hemoattractant, and its Receptor, BLR1
CA2501422C (en) * 2004-04-29 2014-08-12 University Of Rochester Lymphoid chemokines in the diagnosis, monitoring and treatment of autoimmune disease
EP1703282A1 (en) 2005-03-15 2006-09-20 BRD, vertreten durch das BM für Gesundheit und Soziale Sicherung, Letztvertreten durch den Präsidenten des Robert-Koch-Inst. Method for ante mortem diagnosis of a TSE disease
GB0607774D0 (en) * 2006-04-20 2006-05-31 Renovo Group Plc Medicaments
BRPI0710636A2 (pt) * 2006-04-21 2011-08-23 Centocor Inc antagonistas de cxcl 31 e o uso dos mesmos para o tratamento de doenças inflamatórias

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103347896A (zh) * 2010-09-02 2013-10-09 瓦西尼斯公司 抗cxcl13抗体和其使用方法
US10829550B2 (en) 2010-09-02 2020-11-10 Vaccinex, Inc. Polynucleotides encoding anti-CXCL13 antibodies
CN103347896B (zh) * 2010-09-02 2017-06-13 瓦西尼斯公司 抗cxcl13抗体和其使用方法
US9963504B2 (en) 2010-09-02 2018-05-08 Vaccinex, Inc. Anti-CXCL13 antibodies and methods of using the same
CN103608680A (zh) * 2010-12-14 2014-02-26 詹姆士·W·里拉尔德 抗cxcl13抗体和抗cxcr5抗体在恶性肿瘤的治疗或检测中的用途
CN102221607A (zh) * 2011-03-29 2011-10-19 浙江大学医学院附属第一医院 一种抗体组合物及其应用
CN102221607B (zh) * 2011-03-29 2013-10-02 浙江大学医学院附属第一医院 一种抗体组合物及其应用
CN104520323B (zh) * 2012-03-02 2018-05-04 瓦西尼斯公司 用于治疗b细胞介导的炎性疾病的方法
US9890213B2 (en) 2012-03-02 2018-02-13 Vaccinex, Inc. Methods for the treatment of B cell-mediated inflammatory diseases
CN107478843A (zh) * 2012-06-27 2017-12-15 吉安特科技公司 用于炎性疾病的抗‑cxcl9、抗‑cxcl10、抗‑cxcl11、抗‑cxcl13、抗‑cxcr3和抗‑cxcr5试剂
CN104870012A (zh) * 2012-06-27 2015-08-26 吉安特科技公司 用于炎性疾病的抗-cxcl9、抗-cxcl10、抗-cxcl11、抗-cxcl13、抗-cxcr3和抗-cxcr5试剂
US9790271B2 (en) 2013-01-31 2017-10-17 Vaccinex, Inc. Methods for increasing immunoglobulin A levels
CN112521499A (zh) * 2020-12-24 2021-03-19 四川大学 抗cxcl13抗体及其用途
CN112521499B (zh) * 2020-12-24 2022-10-25 四川大学 抗cxcl13抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
UY30932A1 (es) 2009-01-30
ECSP099572A (es) 2009-10-30
BRPI0807631A2 (pt) 2014-06-03
AU2008217581A1 (en) 2008-08-28
TW200846369A (en) 2008-12-01
IL200168A0 (en) 2010-04-15
US20100086942A1 (en) 2010-04-08
MX2009008608A (es) 2009-09-16
AR065433A1 (es) 2009-06-10
WO2008102123A1 (en) 2008-08-28
JP2010519280A (ja) 2010-06-03
KR20090114464A (ko) 2009-11-03
PE20090161A1 (es) 2009-04-30
US20080199481A1 (en) 2008-08-21
CA2677878A1 (en) 2008-08-28
US8182811B2 (en) 2012-05-22
EP2129691A1 (en) 2009-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101636413A (zh) 单克隆抗cxcl13抗体
CN102307901B (zh) 抗il-1r1结合成员
CN101611057B (zh) 人il-17的抗体分子
CN101641374B (zh) 白介素-6的结合成员
US9255144B2 (en) Anti-IL-18 antibodies and their uses
ES2433380T3 (es) Anticuerpos específicos para el complejo de interleucina 6 y el receptor de interleucina 6

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20100127