JP2010519280A - モノクローナル抗ｃｘｃｌ１３抗体 - Google Patents

モノクローナル抗ｃｘｃｌ１３抗体 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＣＸＣＬ１３に対する結合要素、特に抗体分子に関する。該結合要素は、関節リウマチなどの関節障害を含むＣＸＣＬ１３に関連する障害の処置に有用である。

Description

本発明は、ＣＸＣＬ１３に対する結合要素、特に抗体分子に関する。該結合要素は、関節リウマチなどの関節障害を含むＣＸＣＬ１３に関連する障害の処置に有用である。
ＣＸＣＬ１３は、ナイーブＢ細胞を二次リンパ器官の濾胞に向け、二次リンパ器官のＢ細胞に富んだ領域の濾胞性樹状細胞(ＦＤＣ)および間質細胞により発現される強力なＢ細胞化学遊走物質である。ＣＸＣＬ１３はまた、Ｂ細胞誘引性ケモカイン１(ＢＣＡ−１)としても知られる。ＣＸＣＬ１３はその受容体ＣＸＣＲ５を介してシグナルを伝達する。ＣＸＣＲ５は７回膜貫通型のＧタンパク質共役受容体であり、クラス１ ＧＰＣＲファミリーのＣＸＣ−ケモカイン受容体サブファミリーのメンバーである。ＣＸＣＲ５は、末梢血Ｂ細胞および扁桃Ｂ細胞を含むナイーブＢ細胞および活性化Ｂ細胞において高レベルで発現される。ＣＸＣＲ５はまた、活性化末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットおよび二次リンパ組織のＣＤ４＋細胞の大部分でも発現される。ＣＸＣＬ１３は、ＣＸＣＲ５に対して唯一知られているリガンドである。
ＣＸＣＬ１３は、末梢リンパ器官の発達において役割を果たし、例えば、Ansel et al［１］は、ＣＸＣＬ１３欠損マウスが末梢リンパ節の発達に重大な欠陥を持つことを示した。ＣＸＣＬ１３は、濾胞に補充されたナイーブＢ細胞で膜リンホトキシンα１β２発現を誘発し、ＦＤＣの成熟を促進し、さらに、ＣＸＣＬ１３産生を増強する［１］。Ｔ細胞依存性抗原で免疫したＣＸＣＬ１３欠損マウスはリンパ節および脾臓に胚中心を形成するが、これらは小さく、不規則な構造を持ち、このことは濾胞内のＢ細胞の補充および正確な位置にはＣＸＣＬ１３が必要であることを示唆している［１］。
ＣＸＣＬ１３はまた、先天性免疫に役割を持ち、ＣＸＣＬ１３欠損マウスは腹腔および胸腔双方のＢ１細胞を欠き、体腔細菌抗原に対する天然抗体の産生に欠陥がある(Ansel, KM. et al. Immunity, 16: 67-76, 2002)。
本明細書の他所に述べられている通り、種々の障害にＣＸＣＬ１３が関与している証拠がある。
ＣＸＣＬ１３結合要素は当技術分野ですでに報告されている。例えば、ＭＡＢ８０１は市販のマウス抗ヒトＣＸＣＬ１３モノクローナル抗体である(R & D Systems: MAB801)。ＭＡＢ４７０はラット抗マウスＣＸＣＬ１３モノクローナルである。
本発明者らは、適宜設計された選択技術とアッセイを用いることで、ＣＸＣＬ１３とその標的受容体ＣＸＣＲ５との結合を阻害するＣＸＣＬ１３に対する結合要素を開発した。
本発明の結合要素は、ＣＸＣＬ１３と標的受容体ＣＸＣＲ５との結合を阻害する。結合の阻害は直接的阻害であり得る。
本明細書では、ＣＸＣＬ１３に対する結合要素(ＣＸＣＬ１３結合要素とも呼ばれる)を記載する。該結合要素はヒトＣＸＣＬ１３および非ヒト霊長類ＣＸＣＬ１３、例えば、カニクイザルＣＸＣＬ１３と結合し、それを中和し得る。非ヒトＣＸＣＬ１３は、本来ヒト以外の種に存在するＣＸＣＬ１３のオーソログである。
本発明の結合要素は通常、例えば、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１０および／またはＣＸＣＬ１２を含むケモカインのＣＸＣファミリーの他の要素よりもＣＸＣＬ１３に対して特異的であり、従って選択的にＣＸＣＬ１３と結合する。これは例えば競合アッセイで判定または証明することができる。例えば、好適なアッセイが本明細書の実施例２.５に記載されている。
該結合要素はin vivoまたはin vitroにおいてＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合を阻害するのに有用であり、本明細書の他所に詳細に記載されている通り、関節リウマチなどのＣＸＣＬ１３に関連する障害を処置するのに使用可能である。
以下にさらに詳細に記載される通り、本発明の結合要素は高い効力でＣＸＣＬ１３を中和することが示されている。中和とは、ＣＸＣＬ１３の生物活性の阻害を意味する。本発明の結合要素はＣＸＣＬ１３の１以上の活性を中和し得る。阻害される生物活性は一般にＣＸＣＬ１３と結合相手との結合である。例えば、阻害される生物活性はＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合であり得る。
本発明によれば、ヒトまたは非ヒトＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合が阻害され得、例えば、結合要素はカニクイザルなどの非ヒト霊長類ＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合を阻害し得る。ＣＸＣＲ５はヒトまたは非ヒトであってよく、例えば、非ヒト霊長類、例えばカニクイザル、またはマウスＣＸＣＲ５である。一態様において、ＣＸＣＲ５は、ＣＸＣＬ１３と同種のものである。一般に、ＣＸＣＲ５はヒトＣＸＣＲ５である。
ＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合の中和は例えば、ＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合はＣＸＣＲ５のシグナル伝達が介在する活性を刺激することから、このような活性の関数として測定することができる。
ＣＸＣＲ５はＧタンパク質共役受容体であるので、その活性はＧタンパク質共役受容体に関連する活性であり得る。
例えば、ＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合は、アデニリルシクラーゼを阻害するＧタンパク質サブユニットＧαｉの放出を介したアデニリルシクラーゼ活性のダウンレギュレーションおよび細胞ｃＡＭＰレベルの低下をもたらし得る。従って、好適なアッセイは、結合要素の不在下で起こる細胞ｃＡＭＰレベルの低下の阻害を検出すること、すなわち、本明細書においてＣＸＣＬ１３により媒介される細胞ｃＡＭＰレベルの低下の阻害(本発明の結合要素による)を測定することが言及されるｃＡＭＰアッセイを含み得る。一般に、ｃＡＭＰアッセイに用いる細胞は、ＮＫＨ４７７などのアデニルシクラーゼアクチベーターで同時刺激する。このようなアッセイに用いるのに好適な細胞は本明細書に記載されている。
好適な(細胞)ｃＡＭＰアッセイは、均質アッセイ形式(本明細書に言及されているようなＴＲＦ／ＦＲＥＴ ｃＡＭＰアッセイ)において蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)と時間分解蛍光(ＴＲＦ)の技術を組み合わせたものを含む。ＴＲＦ／ＦＲＥＴ ｃＡＭＰアッセイの例としては、ＨＴＲＦ(登録商標)(均質時間分解蛍光)ｃＡＭＰアッセイ(CisBio International)(例えば、Gabriel D et al, (2003) Assay and Drug Development Technologies 1(2): 291-303参照)およびＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイ(Perkin Elmer)(例えば、Hemmila et al (1999) J Biomol Screen 4(6): 303-308参照)が含まれる。
ＦＲＥＴは、ドナー蛍光団と好適なアクセプター蛍光団(ＦＲＥＴドナー−アクセプター対)の間の励起エネルギーの非放射性エネルギー移動を指す。一般に、アッセイ成分としては、標識ｃＡＭＰ(トレーサーｃＡＭＰ)と標識ｃＡＭＰ特異的抗体を含む。このトレーサーｃＡＭＰおよび抗体はそれぞれドナー−アクセプター対の一方の要素で標識される。抗体がトレーサーｃＡＭＰと結合するとＦＲＥＴが起こり、そのアクセプターによって発せられたシグナルがＴＲＦにより測定される。サンプル中の遊離ｃＡＭＰは抗体との結合に関してトレーサーｃＡＭＰと競合し、ＦＲＥＴシグナルを低減する。よって、このアッセイはアクセプターによって発せられたシグナルを測定することを含む。
好ましくは、このアッセイは、ドナーおよびアクセプター双方の特異的シグナルを内部対照として測定して比率測定値を得ることを含み、これによりアッセイ中の有色化合物の存在が補正される。
本アッセイにおいて、ドナー−アクセプター対は一般に、ドナーが約３３７〜３４０ｎｍの光によって励起されるようなものである。一般に、ドナーとアクセプターの間のＦＲＥＴの後に、アクセプターは約６６５ｎｍのシグナルを発する(時間分解可能)。例えば、ＸＬ６６５(ＨＴＲＦ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイにおけるアクセプター)およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商標)−６４７色素(ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイにおけるアクセプター)は双方とも６６５ｎｍの蛍光シグナルを発する。ドナーは例えば約６１５〜６２０ｎｍのシグナルを発し得る。
アクセプターは例えば、赤色吸収蛍光色素、特に親水性の赤色吸収色素(Buschmann et al, Bioconjugate Chem. 2003, 14: 195-204)であり得る。赤色吸収蛍光色素は例えば、ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイで用いられるようなＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商標)−６４７(Perkin Elmer)であり得る。
ドナー−アクセプター対の例としては、例えばＨＴＲＦ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイで用いられるようなユウロピウムクリプテート(ドナー)／ＸＬ６６５(アクセプター)および例えばＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイで用いられるようなユウロピウムキレート(ドナー)／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商標)−６４７色素(アクセプター)が挙げられる。
トレーサーｃＡＭＰまたは抗体のいずれかをドナーまたはアクセプターで標識することができる。従って、アッセイは、(ドナーで標識されたトレーサーｃＡＭＰ)と(アクセプターで標識されたｃＡＭＰ特異的抗体)か、または(アクセプターで標識されたトレーサーｃＡＭＰ)と(ドナーで標識されたｃＡＭＰ特異的抗体)の使用を含み得る。例えば、アッセイは、例えばＨＴＲＦ(登録商標)アッセイのように、ＸＬ６６５−ｃＡＭＰとユウロピウムクリプテート−抗ｃＡＭＰモノクローナル抗体の使用を含み得る。アッセイは、例えばＬＡＮＣＥ(登録商標)アッセイのように、ユウロピウムキレート標識ｃＡＭＰとＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商標)−６４７色素標識ｃＡＭＰ抗体の使用を含み得る。
ＴＲＦ／ＦＲＥＴアッセイにおける蛍光シグナルはＴＲＦにより検出される。
ＴＲＦ／ＦＲＥＴ ｃＡＭＰアッセイは、ＣＨ０ｑｉ５ ＣＸＣＲ５細胞をアデニリルシクラーゼアクチベーターＮＫＨ４７７で同時刺激した際の、ＣＸＣＬ１３により媒介される細胞ｃＡＭＰレベルの低下の阻害をアッセイするために使用可能である。
ＨＴＲＦ(登録商標)アッセイでは、一般に、互いに結合し得る高分子を、一方はユウロピウム(Ｅｕ３＋)クリプテート(ドナー)で、他方を第二の蛍光標識ＸＬ６６５(またはＸＬｅｎｔ)(安定な架橋アロフィコシアニン)で標識する。これらの分子が互いに結合し、励起されると(３３７ｎｍ)、ＦＲＥＴが起こり、ＸＬ６６５は６６５ｎｍの特異的な長寿命蛍光を再び発する。このアッセイでは、ドナー(６２０ｎｍ)およびアクセプター(６６５ｎｍ)双方の特異的シグナルを内部対照として測定し比率測定値を得、これによりアッセイ中の有色化合物の存在が補正される。
ＨＴＲＦ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイは一般に、ＸＬ６６５−ｃＡＭＰ(トレーサーｃＡＭＰ)、ユウロピウムクリプテート−抗ｃＡＭＰモノクローナル抗体およびｃＡＭＰ含有サンプルを混合すること；３３７ｎｍの光を当てること(それにより、ユウロピウムクリプテートドナーを励起させる)；ＴＲＦにより６２０ｎｍ(ドナー)および６６５ｎｍ(アクセプター)で蛍光シグナルを測定すること；および起こったＦＲＥＴの指標としてのシグナル６６５ｎｍ／６２０ｎｍ比を求めることを含む。サンプル由来の遊離ｃＡＭＰは、ユウロピウムクリプテート−抗ｃＡＭＰモノクローナル抗体との結合に関してＸＬ６６５−ｃＡＭＰ(トレーサーｃＡＭＰ)と競合する。サンプルがｃＡＭＰを含まない場合に最大ＦＲＥＴが起こり、サンプルｃＡＭＰが増すにつれＦＲＥＴシグナルが低下する。
従って、ＨＴＲＦ(登録商標)技術は、発せられたシグナルのスペクトル特徴(特許比率補正)上、また、時間分解検出モード(例えば、自己蛍光の消失)下の双方で機能する、蛍光により与えられる可能性を利用する。この技術は均質であり、均質とは、サンプルと検出試薬がプレートにおいて一緒に混合され、好適なプレートリーダーで読み取ることができる、いわゆる「ミックス・アンド・リード」プロトコールを意味する。
ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイはＴＲＦとＦＲＥＴを組み合わせ、青色色素に関連する化合物干渉無しにＦＲＥＴアッセイを可能とする赤色シフトＡｌｅｘａ(登録商標)Ｆｌｕｏｒ色素(Perkin Elmer)も使用する。
ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイは一般に、ユウロピウム／ストレプトアビジン−ビオチン／ｃＡＭＰトレーサーのユウロピウム−キレート、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商標)−６４７標識ｃＡＭＰ特異的抗体およびｃＡＭＰ含有サンプルを混合すること；３４０ｎｍの光を当てること(それにより、ユウロピウムドナーを励起する)；および起こったＦＲＥＴの指標としてのＴＲＦにより６６５ｎｍの蛍光シグナル(アクセプター)を測定することを含む。キレートからの残存エネルギーは６１５ｎｍの光を生じる。サンプルからの遊離ｃＡＭＰは、Ａｌｅｘａ(登録商標)標識抗ｃＡＭＰモノクローナル抗体との結合に関してユウロピウム標識ｃＡＭＰ(トレーサーｃＡＭＰ)と競合する。サンプルがｃＡＭＰを含まない場合に最大ＦＲＥＴが起こり、サンプルｃＡＭＰが増すにつれＦＲＥＴシグナルが低下する。
好適な標品を用いてこれらのアッセイを較正することができる。
これらのアッセイのアッセイプロトコールおよび実施例は、本明細書の材料および方法の節に詳細に記載されている。
ＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合の中和を測定するためにアッセイ可能なもう１つのＣＸＣＲ５シグナル伝達により媒介される活性は、ＣＸＣＬ１３により誘発されるカルシウム放出である。一般に、結合要素が、ＣＸＣＲ５およびＧタンパク質Ｇｑｉ５を発現する細胞における、ＣＸＣＬ１３により誘発されるカルシウム放出に対する阻害作用に関してアッセイされる。これらの細胞をＣＸＣＬ１３で刺激すると、細胞内貯蔵庫からの放出および細胞外培地からの流入を誘発することにより、濃度依存的な様式で細胞質Ｃａ２＋に増加が生じる。これは蛍光イメージングプレートリーダー(ＦＬＩＰＲ)でカルシウム感受性色素を用いて測定することができる。例えば、このような１つのアッセイでは、ヒトＣＸＣＬ１３とＧｑｉ５およびヒトＣＸＣＲ５でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系統を用いる。
ｃＡＭＰアッセイおよびＣａ２＋放出アッセイは、in vitroにおいて、ＣＸＣＲ５とＧαｉサブユニットを含むＧタンパク質Ｇｑｉ５とを発現する哺乳類細胞系統、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、例えば、ＣＨＯ Ｋ１細胞を用いて行うことができる。好適な細胞系統は、ＣＸＣＲ５とＧｑｉ５をコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることにより作出することができる。
ＣＸＣＬ１３は、強力なＢ細胞化学遊走物質である。ＣＸＣＬ１３は、ナイーブＢ細胞および活性化Ｂ細胞において、また、活性化Ｔ細胞のサブセットにおいて高レベルで発現されるＣＸＣＲ５受容体を介してシグナルを伝達する。従って、ＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合の中和を測定するためにアッセイ可能なもう１つの活性は、ＣＸＣＲ５を発現するＢ細胞における、ＣＸＣＬ１３により誘発される走化性である。
このアッセイにおけるＢ細胞は非一次Ｂ細胞であり得る。このような１つのアッセイでは、ヒト組換えＣＸＣＲ５でトランスフェクトされたマウスプレＢ細胞系統(Ｂ３００.１９ ｈＣＸＣＲ５細胞)を用いる。
あるいは、一次Ｂ細胞も使用可能である。このような１つのアッセイでは、マウス脾臓から単離された混合リンパ球集団を用いる。
よって、ｃＡＭＰ、カルシウム放出およびＢ細胞走化性アッセイなどの好適なアッセイを用いて、下記のように結合要素の、ＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合を阻害する効力を算出することができる。これらのアッセイを用いて、結合要素の、ＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合を中和する効力を算出することができる。この中和効力はＣＸＣＲ５シグナル伝達により媒介される活性の関数として算出される。該アッセイは誘発されたＣＸＣＬ１３中和効力、すなわち、細胞ｃＡＭＰレベルの低下、細胞カルシウムレベルの増加、またはＢ細胞の走化性を評価することができる。
生物活性の阻害は部分的であってもまたは完全なものであってもよい。結合要素は、ＣＸＣＬ１３生物活性、結合要素の不在下での活性の１００％、あるいはまた少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害し得る。
結合要素の中和効力は測定可能である。効力は通常、特に断りのない限り、ＩＣ５０値(ｎＭ)で表される。機能アッセイでは、ＩＣ５０は、生物学的応答をその最大の５０％低下させる結合要素の濃度である。リガンド結合研究では、ＩＣ５０は、受容体結合を最大特異的結合レベルの５０％低下させる濃度である。ＩＣ５０は、最大生物学的応答の％を結合要素濃度のｌｏｇの関数としてプロットし、Ｐｒｉｓｍ(GraphPad)などのソフトウエアプログラムを用い、そのデータにシグモイド関数を当てはめてＩＣ５０値を求めることにより計算することができる。効力は、当業者に公知であり、かつ／または本明細書に記載もしくは言及されている１以上のアッセイを用いて決定または測定することができる。
本明細書に記載の、例えばｃＡＭＰアッセイ、カルシウム放出アッセイまたはＢ細胞走化性アッセイなどのアッセイにおける結合要素によるＣＸＣＬ１３活性の中和は、その結合要素がＣＸＣＬ１３と結合し、ＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合を中和することを示す。結合要素とＣＸＣＬ１３の結合を決定するために用い得る他の方法としては、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィーおよび生化学アッセイが含まれる。
２種のＣＸＣＬ１３に対する結合要素の交差反応性の程度を評価するためには、第一の種(例えば、ヒト)由来のＣＸＣＬ１３を用いたアッセイにおいて算出された結合要素の中和効力を、第二の種(例えば、カニクイザルなどの非ヒト霊長類)由来のＣＸＣＬ１３を用いた同様のアッセイにおける結合要素の中和効力と比較すればよい。あるいは、交差反応性は、本明細書の他所により詳細に記載されている通り競合結合アッセイで評価することもできる。
本発明の結合要素は、カニクイザルＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合の中和効力の１０倍以内の、ヒトＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合の中和効力を有し得る。効力は、それぞれヒトおよびカニクイザルＣＸＣＬ１３を用いてｃＡＭＰアッセイにおいて(例えば、ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイなどのＴＲＦ−ＦＲＥＴアッセイ)またはＢ細胞走化性アッセイで測定されるようなものであり得る。ヒトＣＸＣＬ１３を用いた、例えばＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイなどのｃＡＭＰアッセイにおける効力は、カニクイザルＣＸＣＬ１３を用いたｃＡＭＰアッセイの場合の１０倍、５倍、４倍、３倍または２倍を超えない範囲で高いものであり得る。このｃＡＭＰアッセイにおける効力は、終濃度２ｎＭのヒトまたはカニクイザルＣＸＣＬ１３に関して測定されるものである。ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイにおいてヒトＣＸＣＬ１３およびカニクイザルＣＸＣＬ１３を用いて得られたデータの例を表２および５に示す。
本発明の結合要素はカニクイザルＣＸＣＬ１３よりもヒトＣＸＣＬ１３と強く結合し得る。結合要素とヒトＣＸＣＬ１３との結合の強度は例えば、競合結合アッセイにおいて測定した場合、カニクイザルＣＸＣＬ１３に対する場合の１０倍、９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍または２倍を超えない範囲で高いものであり得る、例えば、結合強度は、カニクイザルＣＸＣＬ１３に対する場合よりものヒトＣＸＣＬ１３の場合の方が４倍を超えない範囲で高いものであり得る。ヒトおよびカニクイザルＣＸＣＬ１３を用いた競合アッセイで得られたデータの例を表８に示す。
本発明の結合要素は、本明細書に記載されているようにヒトＣＸＣＬ１３ ｃＡＭＰアッセイにおいて終濃度２ｎＭのＣＸＣＬ１３で、中和効力または１２ｎＭ以下のＩＣ５０を持ち得る。ＩＣ５０は例えば１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｎＭ以下、例えば５ｎＭ以下であり得る。結合要素は本明細書に記載のいずれの形態であってもよく、例えば、ＩｇＧまたはｓｃＦｖまたは他のいずれかの好適な形態である。
本発明の結合要素は、本明細書に記載されているようにカニクイザルＣＸＣＬ１３ ｃＡＭＰアッセイにおいて終濃度２ｎＭのＣＸＣＬ１３で、中和効力または１２ｎＭ以下のＩＣ５０を持ち得る。ＩＣ５０は例えば１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｎＭ以下、例えば３ｎＭ以下であり得る。結合要素は本明細書に記載のいずれの形態であってもよく、例えば、ＩｇＧまたはｓｃＦｖまたは他のいずれかの好適な形態である。
例えば、本発明の結合要素は、ヒトＣＸＣＬ１３ ＨＴＲＦ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイにおいて終濃度２ｎＭのＣＸＣＬ１３で、中和効力または１２ｎＭ以下のＩＣ５０を持ち得る。ＩＣ５０は例えば１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｎＭ以下、例えば５ｎＭ以下であり得る。ヒトＣＸＣＬ１３ ＨＴＲＦ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイで得られたデータの例を表１に示す。
例えば、本発明の結合要素は、カニクイザルＣＸＣＬ１３ ＨＴＲＦ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイにおいてＣＸＣＬ１３終濃度２ｎＭで、中和効力または１２ｎＭ以下のＩＣ５０を持ち得る。ＩＣ５０は例えば１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｎＭ以下、例えば３ｎＭであり得る。カニクイザルＣＸＣＬ１３ ＨＴＲＦ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイで得られたデータの例を表１に示す。
一例では、例えば、アッセイされる結合要素がＩｇＧ型である場合、結合要素は、記載されているようなヒトＣＸＣＬ１３ ｃＡＭＰアッセイにおいて終濃度２ｎＭのＣＸＣＬ１３で、中和効力または５ｎＭ以下のＩＣ５０を持ち得る。ＩＣ５０は例えば４.５、４、３.５、３、２.５、２、１.９、１.７、１.５、１.３、１.１、１.０、０.９、０.７または０.５ｎＭ以下、例えば１.４以下または１.６ｎＭ以下であり得る。
一例では、例えば、アッセイされる結合要素がＩｇＧ型である場合、結合要素は、本明細書に記載されているようにカニクイザルＣＸＣＬ１３ ｃＡＭＰアッセイにおいて終濃度２ｎＭのＣＸＣＬ１３で、中和効力または５ｎＭ以下のＩＣ５０を持ち得る。ＩＣ５０は、例えば４.５、４、３.５、３、２.５、２、１.５、１、０.５、０.４または０.２ｎＭ以下、例えば０.３ｎＭ以下であり得る。
例えば、本発明の結合要素、例えば、ＩｇＧは、ヒトＣＸＣＬ１３ ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイにおいて終濃度２ｎＭのＣＸＣＬ１３で、中和効力または５ｎＭ以下のＩＣ５０を持ち得る。ＩＣ５０は例えば４.５、４、３.５、３、２.５、２、１.９、１.７、１.５、１.３、１.１、１.０、０.９、０.７または０.５ｎＭ以下、例えば１.４以下または１.６ｎＭ以下であり得る。ヒトＣＸＣＬ１３ ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイで得られたデータを表２および５に示す。
例えば、本発明の結合要素、例えば、ＩｇＧは、カニクイザルＣＸＣＬ１３ ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイにおいて終濃度２ｎＭのＣＸＣＬ１３で、中和効力または５ｎＭ以下のＩＣ５０を持ち得る。ＩＣ５０は例えば４.５、４、３.５、３、２.５、２、１.５、１、０.５、０.４または０.２ｎＭ以下、例えば０.３ｎＭ以下であり得る。カニクイザルＣＸＣＬ１３ ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイで得られたデータの例を表２および５に示す。
本発明の結合要素は、ヒトＣＸＣＬ１３カルシウム放出アッセイにおいて終濃度１００ｎＭのＣＸＣＬ１３で、中和効力または４０ｎＭ以下のＩＣ５０を持ち得る。ＩＣ５０は例えば３８、３６、３４、３２、２０、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、８、６、４または２ｎＭ以下であり得る。ヒトＣＸＣＬ１３カルシウム放出アッセイで得られたデータの例を表４および７に示す。
本発明の結合要素は、ヒトＣＸＣＬ１３ Ｂ細胞走化性アッセイにおいて、およそＥＤ８０の応答を与える終濃度のヒトＣＸＣＬ１３と、ヒト組換えＣＸＣＲ５でトランスフェクトされた非一次Ｂ細胞系統を用いた場合に、中和効力または１２ｎＭ以下のＩＣ５０を持ち得る。ＩＣ５０は例えば１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１または１.５ｎＭ以下であり得る。一般に、このアッセイでは、Ｂ細胞系統、例えば、ヒト組換えＣＸＣＲ５を発現するＢ３００.１９細胞などの、ヒト組換えＣＸＣＲ５でトランスフェクトされたマウスプレＢ細胞系統を用いる。ヒトＣＸＣＬ１３を用いたヒトＣＸＣＬ１３ Ｂ細胞走化性アッセイで得られたデータの例を表３および６に示す。
本発明の結合要素は、カニクイザルＣＸＣＬ１３ Ｂ細胞走化性アッセイにおいて、およそＥＤ８０の応答を与える終濃度のカニクイザルＣＸＣＬ１３と、ヒト組換えＣＸＣＲ５でトランスフェクトされた非一次Ｂ細胞系統を用いた場合に、中和効力または１０ｎＭ以下のＩＣ５０を持ち得る。ＩＣ５０は例えば９、８、７、６、５、４、３、２または１ｎＭ以下であり得る。一般に、このアッセイでは、Ｂ細胞系統、例えば、組換えＣＸＣＲ５を発現するＢ３００.１９細胞などの、ヒト組換えＣＸＣＲ５でトランスフェクトされたマウスプレＢ細胞系統を用いる。カニクイザルＣＸＣＬ１３ Ｂ細胞走化性アッセイにおいて得られたデータの例を表６に示す。
本発明の結合要素は、ヒトＣＸＣＬ１３一次細胞走化性アッセイにおいて、およそＥＤ８０の応答を与える終濃度のヒトＣＸＣＬ１３と混合リンパ球集団を用いた場合に、中和効力または４０ｎＭ以下のＩＣ５０を持ち得る。ＩＣ５０は例えば３８、３６、３４、３２、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、８、６、４または２ｎＭ以下であり得る。一般に、このアッセイでは、マウス脾臓から新しく単離された一次リンパ球集団を用いる。ヒトＣＸＣＬ１３とマウス一次リンパ球を用いたヒトＣＸＣＬ１３ Ｂ細胞走化性アッセイで得られたデータの例を表１２に示す。
ＣＸＣＬ１３に対するＣＸＣＬ１３結合要素の結合速度論および親和性(平衡解離定数ＫＤとして表される)は、例えばＢＩＡｃｏｒｅなどの表面プラズモン共鳴を用いて測定することができる。本発明の結合要素は通常、ヒトＣＸＣＬ１３に対して４００ｐＭ未満、例えば、３８０、３６０、３４０、３２０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０または５０ｐＭ未満の親和性を有する。カニクイザルＣＸＣＬ１３に対する親和性は通常、ヒトＣＸＣＬ１３に対する親和性に類似する。ＢＩＡｃｏｒｅを用いてヒトＣＸＣＬ１３およびカニクイザルＣＸＣＬ１３に関して得られたデータの例を表１０および１１に示す。
本発明の結合要素はヒトＣＸＣＬ−１３およびカニクイザルＣＸＣＬ−１３に対して１５０ｐＭ未満の親和性を持ち得る。
結合速度論および親和性は、結合要素を含む表面にヒトまたはカニクイザルＣＸＣＬ−１３を流すことによる表面プラズモン共鳴を用いて測定することができる。
一般に、特に断りのない限り、上記のアッセイで言及する中和能は本明細書に記載のいずれの形態でアッセイされる結合要素にも当てはまる。例えば、この中和能は、本明細書に記載のいずれの抗体フラグメントも含む抗体分子、例えば、ＩｇＧ結合要素にも当てはまる。
ＣＸＣＬ１３が哺乳類細胞系統(ＭＥＬ細胞)において組換え発現された際には、ヒトＣＸＣＬ１３のグリコシル化型と非グリコシル化型が得られた。生成されたヒトＣＸＣＬ１３の大部分は非グリコシル化型であったが、発現をスケールアップした場合にはグリコシル化型を含有する小画分を得ることができた。ＭＥＬ細胞で発現されたカニクイザルＣＸＣＬ１３はグリコシル化されていた。グリコシル化型および非グリコシル化型のヒトＣＸＣＬ１３に対する抗体１の効力は、本明細書に記載のＢ細胞走化性アッセイで測定した場合、１０倍の範囲内で異なり、等能とみなすことができる。非グリコシル化ヒトＣＸＣＬ１３、グリコシル化ヒトＣＸＣＬ１３およびグリコシル化カニクイザルＣＸＣＬ１３の効力データの例を実施例２.３の表６に示す。内因性ＣＸＣＬ１３はグリコシル化型であり、従って、グリコシル化ヒトＣＸＣＬ１３はヒト療法にとっての治療標的抗原であり得ることから、グリコシル化ヒトＣＸＣＬ１３との結合は本発明の結合要素の利点と言える。
本明細書に記載のアッセイでは、組換えＣＸＣＬ１３、例えば、ヒトＣＸＣＬ１３は、非グリコシル化型またはグリコシル化型で使用可能である。本発明者らのデータは、本発明の結合要素が、ＣＸＣＬ１３の、グリコシル化に影響を受けない領域でエピトープと結合し得ることが示唆している(実施例２.３および表６)。よって、ヒトＣＸＣＬ１３に対する、本明細書に記載されるアッセイにおける結合要素の能力は、非グリコシル化ヒトＣＸＣＬ１３と非グリコシル化ヒトＣＸＣＬ１３の双方に当てはまる。
本発明の結合要素は、本明細書に記載のアッセイ、例えば、Ｂ細胞走化性アッセイにおいてグリコシル化ヒトＣＸＣＬ１３と比べた場合に、非グリコシル化ヒトＣＸＣＬ１３に対して１０倍、５倍、４倍、３倍、２.５倍または２倍を超えない範囲で大きな効力を持ち得る。グリコシル化ヒトＣＸＣＬ１３に対する効力は非グリコシル化ヒトＣＸＣＬ１３に対する効力よりももちろん高いものであり得る。
グリコシル化ヒトＣＸＣＬ１３に対する本発明の結合要素の効力は、非グリコシル化ヒトＣＸＣＬ１３に対するものと類似または同一であり得、例えば、本明細書に記載の競合結合アッセイ、ｃＡＭＰアッセイ、カルシウム放出アッセイまたはＢ細胞走化性アッセイで評価した場合に１０倍、５倍、４倍、３倍、２.５倍または２倍を超えない範囲で異なり得る。
本発明の結合要素は抗体分子、例えば、ヒト抗体分子を含み得る。結合要素は通常、抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む。結合要素のＶＨおよびＶＬドメインは本発明の一部として提供される。このＶＨおよびＶＬドメイン内にそれぞれ相補性決定領域(「ＣＤＲ」)とフレームワーク領域(「ＦＲ」)がある。ＶＨドメインは１セットのＨＣＤＲを含み、ＶＬドメインは１セットのＬＣＤＲを含む。抗体分子はＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とフレームワークを含む抗体ＶＨドメインを含み得る。あるいは、また、またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とフレームワークを含む抗体ＶＬドメインを含み得る。本発明の抗体ＶＨおよびＶＬドメインとＣＤＲは、本開示の一部をなす添付の配列表に挙げられている。
本明細書に開示されるＶＨおよびＶＬ配列、ＣＤＲ配列、ＣＤＲセットならびにＨＣＤＲセットおよびＬＣＤＲセットは本発明の態様および実施形態に相当する。本明細書に記載されているように、「ＣＤＲセット」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。従って、ＨＣＤＲセットはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を指し、ＬＣＤＲセットはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を指す。特に断りのない限り、「ＣＤＲセット」はＨＣＤＲとＬＣＤＲを含む。一般に本発明の結合要素はモノクローナル抗体である。
本発明の結合要素は、以下にさらに述べられるように、例えば、非抗体タンパク質スキャフォールド内のＣＤＲセットなど、通常、１以上のＣＤＲによって提供される非抗体分子内の抗原結合部位を含み得る。
実施例でさらに詳細に記載されるように、本発明者らは抗体１と符番された抗体分子を単離した。本明細書に記載されているように、抗体１は、抗体１のＣＤＲセット内の抗体を指す。
抗体１の配列は、下記の配列を下記の順序で含む添付の配列表に示されている：ＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列(配列番号１)；ＶＨドメインのアミノ酸配列(配列番号２)；ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列(配列番号３)；ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列(配列番号４)；ＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列(配列番号５)；ＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列(配列番号６)；ＶＬドメインのアミノ酸配列(配列番号７)；ＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列(配列番号８)；ＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列(配列番号９)；ＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列(配列番号１０)。
本発明の結合要素は、本明細書に記載されているような１以上のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ３、および所望によりＣＤＲ１およびＣＤＲ２も含んでＣＤＲセットを形成していてもよい。ＣＤＲまたはＣＤＲセットは抗体１のＣＤＲまたはＣＤＲセットであってもよいし、あるいは本明細書に記載されているようなその変異体であってもよい。
本発明は、抗体１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３、および／または抗体１のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３、例えば、抗体１のＣＤＲセットを含む結合要素を提供する。結合要素は抗体１のＶＨ ＣＤＲセットを含み得る。所望により、それはまた、抗体１のＶＬ ＣＤＲセットを含んでもよく、このＶＬ ＣＤＲはＶＨ ＣＤＲと同じ抗体または異なる抗体に由来してもよい。抗体１のＨＣＤＲセットを含むＶＨドメインおよび／または抗体１のＬＣＤＲセットを含むＶＬドメインもまた本発明により提供される。
一般に、ＶＨドメインはＶＬドメインと対をなして抗体抗原結合部位を提供するが、以下でさらに述べる通り、抗原と結合させるためにＶＨドメインまたはＶＬドメインを単独で用いてもよい。抗体１ ＶＨドメインは抗体１ ＶＬドメインと対をなして抗体１ ＶＨドメインとＶＬドメインの双方を含む抗体抗原結合部位が形成される。他の実施形態では、抗体１ ＶＨは抗体１ ＶＬ以外のＶＬドメインと対をなす。軽鎖の混合状態(promiscuity)は当技術分野で十分に確立されている。よって、抗体１のＶＨは抗体１のＶＬとも、あるいは別の抗体のＶＬとも対をなすことができる。
結合要素は、開示されているＨおよび／またはＬ ＣＤＲセット内に１以上のアミノ酸突然変異を有する抗体１のＨおよび／またはＬ ＣＤＲセットを含み得る。この突然変異はアミノ酸置換、挿入または欠失であり得る。よって、Ｈおよび／またはＬ ＣＤＲセット内に例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３または２までの突然変異、例えば置換が存在し得る。例えば、ＨＣＤＲ３内に１または５、４、３または２までの突然変異、例えば置換が存在し、および／またはＬＣＤＲ３内に１または５、４、３または２までの突然変異、例えば置換が存在し得る。
結合要素は、抗体フレームワーク内に１以上のＣＤＲ、例えばＣＤＲセットを有する抗体分子を含み得る。例えば、抗体の１以上のＣＤＲまたはＣＤＲセットをフレームワーク(例えば、ヒトフレームワーク)にグラフトして抗体分子を提供することができる。このフレームワーク領域はヒト生殖細胞系遺伝子セグメント配列のものであってよい。よって、このフレームワークは生殖系列化(germlined)により、フレームワーク内の１以上の残基が、最も類似性の高いヒト生殖細胞系フレームワークの等価の位置の残基と適合するように変化させてもよい。本発明の結合要素は、ヒト生殖細胞系フレームワーク、例えば、ヒト生殖細胞系フレームワーク、例えば、ヒトＶＨ３−２３内にＨＣＤＲセットを含むＶＨドメインを有する単離されたヒト抗体分子であり得る。通常、この結合要素はまた、例えば、ヒト生殖細胞系フレームワーク、例えば、ヒトＶＫ１ Ｌ１２内にＬＣＤＲセットを含むＶＬドメインも有する。生殖系列化されたＶＨまたはＶＬドメインは１以上のバーニヤ(Vernier)残基で生殖系列化されていてもされていなくてもよい。
非生殖系列化(non-germlined)抗体分子は、生殖系列化された抗体分子と同じＣＤＲを有するが、フレームワークが異なる。本明細書において添付の配列表で示される抗体１の抗体配列は生殖系列化されている。本明細書の実施例に記載されている通り、単離された際の抗体１ ＶＨおよびＶＬドメインからの生殖系列化は、ＶＨドメインにおける以下の突然変異：Ｑ１Ｅ、Ｖ５Ｌ、Ｒ１６Ｇ、Ｖ２３Ａ、Ｇ２４Ａ、Ｈ３９Ｑ、Ｇ８３ＲおよびＲ１０５Ｑと、ＶＬドメインにおける以下の突然変異：Ｉ１５Ｖ、Ａ５８ＶおよびＤ７０Ｅを作出することを含んだ。従って、一態様において、本発明のＶＨドメイン(このようなＶＨドメインを含む結合要素を含む)は、１以上、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つ全ての上記ＶＨ突然変異が復帰した、配列番号２のアミノ酸配列を含み得る。一実施形態において、ＶＨドメインは配列番号２の３０番、９７番および９８番が置換されていない。同様に、本発明のＶＬドメインは、１つ、２つまたは３つ全ての上記ＶＬ突然変異が復帰した、配列番号７のアミノ酸配列を含み得る。一実施形態において、ＶＬドメインは配列番号７の２番が置換されていない。
一態様において、本発明の結合要素は、(ｉ)配列番号２のアミノ酸配列または１以上のフレームワーク領域に１以上のアミノ酸変異(例えば、置換)(例えば、１、２、３、４、５、６、７または８置換)を有する配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、(ｉｉ)配列番号７のアミノ酸配列または１以上のフレームワーク領域に１以上のアミノ酸変異(例えば、置換)(例えば、１、２または３置換)を有する配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み得る。この態様の一実施形態において、結合要素(例えば、ＩｇＧ)のＶＨドメインは配列番号２の３０番、９７番および９８番の１つまたは全ての位置で置換されておらず、ＶＬドメインは配列番号７の２番で置換されていない。ＶＨドメインは配列番号２のアミノ酸配列を含み得るか、または以下のアミノ酸置換：Ｇ３０Ｓ；Ｔ９７Ａ；Ｒ９８Ｋの１以上の(例えば、１、２または全て)を有する配列番号２のアミノ酸配列を含み得る。ＶＬドメインは配列番号７のアミノ酸配列を含み得るか、または以下のアミノ酸置換：Ｔ２Ｉｌｅを有する配列番号２のアミノ酸配列を含み得る。
抗体１に関して本明細書で提供されているデータは、生殖系列化形式および／または非生殖系列化形式で示され、これは適宜表示されている。生殖系列化型で試験された抗体では、非生殖系列化型に比べて極めて類似したデータが得られた。
抗体１のκＶＬドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列に示されている３’ｃｇｔコドンおよび対応するアルギニン残基は、発現されたこの抗体のｓｃＦｖおよびＩｇＧ配列に含まれていた。この配列のＣ末端アルギニン残基はＫａｂａｔ残基１０８に相当する。この残基の起源とそのコードするトリプレットｃｇｔを以下に説明する。
ＩｇＧの軽鎖を発現させるため、ＶＬドメインをコードする第一のエキソン、ＣＬドメインをコードする第二のエキソンおよび第一のエキソンと第二のエキソンを隔てるイントロンを含む抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列が提供される。通常の状況下で、イントロンは細胞ｍＲＮＡプロセシング機構によりスプライシングされて第一のエキソンの３’末端と第二のエキソンの５’末端を連結する。従って、前記ヌクレオチド配列を有するＤＮＡがＲＮＡとして発現されると、第一のエキソンと第二のエキソンがともにスプライシングされた。スプライシングされたＲＮＡが翻訳されると、ＶＬドメインとＣＬドメインを含むポリペプチドが生じる。スプライシング後、Ｋａｂａｔ残基１０８番のＡｒｇはＶＬドメインフレームワーク４配列の最後の塩基(ｃ)とＣＬドメインの最初の２つの塩基(ｇｔ)によりコードされる。
Ｋａｂａｔ残基１０８番のアルギニン残基は抗体分子のＶＬドメインのＣ末端残基であると考えることができる。
本発明の結合要素は、ＣＸＣＬ１３との結合に関して
(ｉ)ＣＸＣＬ１３と結合し、そして、
(ｉｉ)結合要素、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ＣＤＲ、例えば、ＨＣＤＲ３、および／または本明細書に開示されているＣＤＲセットを含む
結合要素のいずれとも競合するものであり得る。
一態様において、本発明は、結合に関して、配列番号１１を有するｓｃＦｖ抗体分子と競合する結合要素を提供する。配列番号１１の配列は、リンカー配列(Ｇｌｙ１２０〜Ｓｅｒ１３４)によって配列番号７のＶＬドメインと連結された配列番号２のＶＨドメインに相当する。結合要素は抗体１のＣＤＲもしくはＣＤＲセットまたは本明細書の他所に記載されているようなその変異体を含み得る。結合要素は、本明細書の他所に記載されているように、抗体分子、例えば、ＩｇＧ(例えば、ＩｇＧ１)またはｓｃＦｖであり得る。
結合要素は競合アッセイにおいて完全なまたは部分的な競合を示し得る。例えば、結合要素は競合アッセイにおいてＣＸＣＬ１３との、例えば、配列番号１１の配列を有する抗体ｓｃＦｖ分子との結合に関して少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９または１００％の競合を示し得る。
結合要素間の競合は、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて、および／または同じエピトープまたは重複エピトープと結合する結合要素の同定を可能とするため、１以上の他の非タグ結合要素の存在下で検出可能な１つの結合要素に特異的リポーター分子をタグ付けすることにより、in vitroで容易にアッセイすることができる。このような方法は当業者に容易に知られ、本明細書にさらに詳細に記載されている。例えば、ｃＡＭＰアッセイに関して本明細書に記載されているＴＲＦ−ＦＲＥＴ技術を用いたエピトープ競合アッセイ(ＴＲＦ−ＦＲＥＴエピトープ競合アッセイ)、例えば、ＨＴＲＦ(登録商標)エピトープ競合アッセイが使用可能である。
ＨＴＲＦ(登録商標)技術は、ｃＡＭＰアッセイに関して本明細書に記載されている通りである。ＨＴＲＦ(登録商標)エピトープ競合アッセイは一般に、ＸＬ６６５標識ＣＸＣＬ１３、ユウロピウムクリプテート標識参照抗体(例えば、配列番号１１を有するｓｃＦｖ抗体分子)と試験結合要素を混合すること；３３７ｎｍの光を当てること(それによりユウロピウムクリプテートドナーを励起する)；ＴＲＦにより６２０ｎｍ(ドナー)および６６５ｎｍ(アクセプター)で蛍光シグナルを測定すること；および生じたＦＲＥＴの指標としてシグナル６６５ｎｍ／６２０ｎｍの比を求めることを含む。ＣＸＣＬ１３との結合に関して参照抗体と競合する試験結合要素、例えば、ＩｇＧまたはＳｃＦｖ抗体分子は、生じるＦＲＥＴを低減する。このアッセイに関する詳細な方法は実施例で提供される。
よって、本発明のさらなる態様は、ＣＸＣＬ１３との結合に関して、抗体分子、例えば特に、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、抗体１のＣＤＲ、例えば、ＨＣＤＲ３またはＣＤＲセットを含む抗体分子と競合するヒト抗体抗原結合部位を含む結合要素を提供する。
さらなる態様において、本発明は、ＣＸＣＬ１３との結合に関して抗体抗原結合部位と競合するヒト抗体抗原結合部位を含む結合要素を提供し、該抗体抗原結合部位はＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、このＶＨおよびＶＬドメインは本明細書に開示されている抗体１のＣＤＲセットを含む。
本発明の結合要素はヒトＣＸＣＬ−１３のエピトープと結合することができ、該エピトープは成熟ヒトＩＬ−１７Ａの３１〜４２番の配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ(配列番号２０)のうち少なくとも１つの残基を含む。それは例えば配列番号２０の１個、２個、３個、４個、５個または５個を超える残基と結合し得る。本発明の結合要素は配列番号２０に加えてヒトＣＸＣＬ−１３の他の領域とも結合し得る。
例えば、水素−重水素交換、部位特異的突然変異誘発、質量分析、ＮＭＲおよびＸ線結晶学など好適ないずれかの方法を用いて、結合要素が結合した残基の配列を決定することができる。
ペプチドアミド水素交換はタンパク質の研究に用いられる十分記載された方法論である(Englander, S.W. et al. Methods Enzymol. 232:26-42, 1994)。より最近では、これは、プロトンと交換可能な重水素標識タンパク質およびタンパク質全体にわたって交換速度を測定することを目的としたこれと質量分析との組合せを用いるためにさらに開発された(Pantazatos, D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 101(3):751-756, 2004)。この水素／重水素交換(Ｈ／Ｄ交換)速度は、このタンパク質の一部が別の分子との結合に関与する場合に交換速度が有意に遅くなるといったように、溶媒に対する接近性によって有意に改変され得る。このアプローチは、抗体との相互作用に関与するタンパク質領域をマッピングするために用いられており、また、本明細書の実施例７に詳説される通り、本発明の抗体との結合に関与するＣＸＣＬ−１３の領域を調べるために用いられた。質量分析は、結合要素と接触するヒトＣＸＣＬ−１３の領域を同定するために、Ｈ／Ｄ交換と併用した。例えば、ヒトＣＸＣＬ−１３が本発明の結合要素と結合すると、配列番号２０内の残基とのＨ／Ｄ交換が有意に示されることが実証され得る。
さらなる態様において、本発明は、本発明の、結合要素をコードする配列、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含む単離された核酸、および本発明の結合要素、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを製造する方法を提供し、その方法は該結合要素、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの産生をもたらす条件下で該核酸を発現させること、およびそれを回収することを含む。
本発明の別の態様は、本明細書に開示されるＶＨ ＣＤＲまたはＶＬ ＣＤＲ配列をコードする核酸(一般に単離されたもの)を提供する。
さらなる態様は、本発明の核酸を含有するまたは本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明のさらなる態様は、本発明の結合要素を含有する組成物、および療法によりヒトまたは動物の身体の処置方法を含む、ＣＸＣＬ１３を阻害および／または中和する方法におけるそれらの使用を提供する。
本発明の結合要素は、本発明の結合要素の有効量を患者に投与することを含む、ヒトまたは動物の身体(例えば、ヒト患者)における疾病または障害の処置方法(予防処置を含み得る)などの処置または診断方法で使用可能である。本発明に従って処置可能な症状は、本明細書の他所に詳細に述べられているように、ＣＸＣＬ１３が役割を果たすいずれのものも含む。
本発明のこれらの、またその他の態様を以下にさらに詳細に記載する。
ここで、本明細書で用いる「および／または」は、明示されたその２つの特徴または成分のそれぞれの、他の特徴または成分を含む場合または含まない場合の具体的開示として理解すべきであることを指摘しておくのが便宜であろう。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、それぞれが本明細書に個々に示されている場合と同じく、(ｉ)Ａ、(ｉｉ)Ｂおよび(ｉｉｉ)ＡとＢの具体的開示として理解すべきである。
ＣＸＣＬ１３
ＣＸＣＬ１３はケモカイン(Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ)リガンド１３である。全長ヒトＣＸＣＬ１３の配列は受託番号ＮＰ＿００６４１０ 配列番号１２として寄託されている。この全長アミノ酸配列は２２残基のＮ末端ペプチドを含み、これがin vivoで切断されて成熟型を生じる。成熟ＣＸＣＬ１３は配列番号１３のアミノ酸配列を有する。成熟ＣＸＣＬ１３は治療適用および診断適用のin vivo標的抗原であり、本明細書においてヒトＣＸＣＬ１３という場合には、特に断りのない限り成熟ＣＸＣＬ１３を指す。
本明細書に記載のある特定のアッセイおよび実験に関しては、ヒトＣＸＣＬ１３はＭＥＬ細胞系統で発現させた。ＭＥＬ細胞から発現されたヒトＣＸＣＬ１３はＣ末端で切断されており、そのアミノ酸配列は配列番号１４である。よって、配列番号１４は、本明細書に記載のアッセイで用いられる、ＭＥＬにより発現されたヒトＣＸＣＬ１３である。成熟非末端切断型ＣＸＣＬ１３(配列番号１３)もまたアッセイでの使用に好適であり、末端切断が得られる結果に影響を及ぼすとは考えられない。
本明細書に記載のいくつかのアッセイではビオチニル化ヒトＣＸＣＬ１３を用いた。このＣＸＣＬ１３は合成生産されたものであり、最もＣ末端にあるリシン残基にビオチンを有する配列番号１３の成熟ＣＸＣＬ１３配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１３はカニクイザルＣＸＣＬ１３であり得る。本明細書において実験的研究のためにＭＥＬ細胞から発現させた場合、カニクイザルＣＸＣＬ１３はＣ末端においてアミノ酸５個が切断され、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
成熟非末端切断型カニクイザルＣＸＣＬ１３の推定配列は配列番号１５である。示されているように、全長非末端切断型カニクイザル配列は、ヒトおよびアカゲザルＣＸＣＬ１３の場合と同様、そのＣ末端にＫＲＫＩＰを含むと提案されている。これは、クローニングに用いられるアカゲザルプライマーが、末端切断された際に成熟ヒトＣＸＣＬ１３から除去される領域とアニーリングするように設計されたためであると思われる。
成熟非末端切断型ＣＸＣＬ１３(配列番号１５)もまたアッセイでの使用に好適であり、末端切断が得られる結果に影響を及ぼすとは考えられない。
本明細書の他所に記載されているように、ＣＸＣＬ１３は組換えであり、および／またはグリコシル化型もしくは非グリコシル化型のいずれであってもよい。グリコシル化型および／または非グリコシル化型ＣＸＣＬ１３は組換え系、例えば哺乳類細胞、例えばヒト細胞系統、マウス細胞系統、例えばＭＥＬ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞において発現可能である。
ＣＸＣＲ５
ＣＸＣＲ５は、本明細書の他所に記載されているように、ＣＸＣＬ１３の受容体である。ヒトＣＸＣＲ５は２つのイソ型で存在する。ＣＸＣＲ５イソ型１のアミノ酸配列は受託番号ＮＰ＿００１７０７として寄託され、本明細書では配列番号１７として示される。ＣＸＣＲ５イソ型２のアミノ酸配列は受託番号ＮＰ＿１１６７４３として寄託され、本明細書では配列番号１８として示される。イソ型２はＮ末端においてアミノ酸４５個が切断されている。従って、イソ型２は変異体１の翻訳開始コドンと細胞外ドメインを欠き、おそらくリガンドと結合せず、本明細書の実験では配列番号１７を有するヒトＣＸＣＲ５のイソ型１を用いた。よって、本明細書においてＣＸＣＲ５という場合には、特に断りのない限り、ヒトイソ型１を指す。
本明細書に言及されるＣＸＣＲ５は、文脈によって示されているようにヒトまたは非ヒトであり得る。例えば、ヒトＣＸＣＬ１３または非ヒトＣＸＣＬ１３を用いる中和アッセイでは、適当な種のＣＸＣＲ５を選択することができる。結合相手が同じ種に由来するヒトまたは非ヒトＣＸＣＬ１３である場合、適当な種はヒトまたは非ヒトＣＸＣＲ５であり得る。あるいは、ヒトまたは非ヒトＣＸＣＬ１３が交差反応することが知られている場合には、アッセイにおいてヒトまたは非ヒトＣＸＣＬ１３を異なる種に由来するヒトまたは非ヒトＣＸＣＲ５とともに使用してもよい。
結合要素
これは互いに結合する１対の分子の一方の要素をいう。結合対の要素は天然由来のものであってもよいし、あるいは完全もしくは部分合成により製造することもできる。これらの分子対の一方の要素はその表面またはキャビティーに、その分子対の他方の要素と結合する、従って、その他方の要素の特定の空間構成および極性構成と相補的な領域を有する。結合対のタイプの例は抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、および酵素−基質である。本発明は抗原−抗体タイプの応答と関係している。
結合要素は通常、抗原結合部位を有する分子を含む。例えば、結合要素は、抗原結合部位を含む抗体分子または非抗体タンパク質であり得る。
抗原結合部位は、フィブロネクチンまたはシトクロムＢなど［２、３、４］の非抗体タンパク質スキャフォールド上にＣＤＲを配置する手段により、または所望の標的に対する結合特異性を付与するためにタンパク質スキャフォールド内のループのアミノ酸残基を無作為化もしくは突然変異誘発させることにより、提供することができる。タンパク質内で新規な結合部位を操作するためのスキャフォールドについては、Nygren et al.［４］による詳細な総説がある。抗体ミミックスのためのタンパク質スキャフォールドがＷＯ／００３４７８４(出典明示によりその全内容が本明細書の一部とされる)に開示され、その中で発明者らは、少なくとも１つの無作為化ループを有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むタンパク質(抗体ミミックス)を記載している。１以上のＣＤＲ、例えば、ＨＣＤＲセットをグラフトするのに好適なスキャフォールドは、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのいずれかのドメイン要素によって提供され得る。このスキャフォールドはヒトまたは非ヒトタンパク質であり得る。非抗体タンパク質スキャフォールドの利点は、少なくともいくつかの抗体分子より小さく、および／または製造が容易なスキャフォールド分子において抗原結合部位を提供するということである。小型の結合要素は細胞に入る、組織に深く浸透する、または標的を他の構造内へ到達させる能力、あるいは標的抗原のタンパク質キャビティー内で結合する能力など、有用な生理学的特性を付与し得る。非抗体タンパク質スキャフォールドにおける抗原結合部位の使用はWess, 2004［５］で検証されている。安定な主鎖と１以上の可変ループを有し、標的抗原と結合する抗原結合部位を作出するためにそのループのアミノ酸配列が特異的または無作為に突然変異されているタンパク質が典型である。このようなタンパク質としては、黄色ブドウ球菌(S. aureus)由来のＡタンパク質のＩｇＧ結合ドメイン、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン(例えば、第１０番フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン)、リポカリンならびにγ−クリスタリンおよび他のアフィリン(Affikin)(商標)スキャフォールド(Scil Proteins)が含まれる。他のアプローチの例としては、サイクロチドに基づく合成「マイクロボディー」(分子内ジスルフィド結合を有する小タンパク質)、マイクロプロテイン(Versabodies(商標)、Amunix)およびアンキリンリピートタンパク質(DARPins、Molecular Partners)が挙げられる。
抗体配列および／または抗原結合部位の他、本発明の結合要素は、例えば、折りたたまれたドメインのようなペプチドまたはポリペプチドを形成する、あるいはその分子に抗原結合能に加えて別の機能的特徴を与えるための他のアミノ酸を含んでもよい。本発明の結合要素は検出可能な標識を有してもよく、あるいは毒素または標的化部分または酵素とコンジュゲートさせてもよい(例えば、ペプチジル結合またはリンカーを介して)。例えば、結合要素は、触媒部位(例えば、酵素ドメイン内)ならびに抗原結合部位を含んでもよく、この抗原結合部位は抗原と結合するので、この触媒部位を抗原へ向ける。触媒部位は、例えば切断によって抗原の生物学的機能を阻害し得る。
述べたようにＣＤＲは非抗体スキャフォールドによって保持させることができるが、本発明のＣＤＲまたはＣＤＲセットを担持するための構造は一般に、そのＣＤＲまたはＣＤＲセットが、再配列された免疫グロブリン遺伝子によってコードされている天然ＶＨおよびＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲまたはＣＤＲセットに相当する位置に置かれている抗体重鎖もしくは軽鎖配列またはその実質的部分である。これらの免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置はKabat, et al., 1987［６］およびその更新版を参照することにより決定することができる。このデータベースを検索するために、多くの学術的および商業的オンライン情報源が利用可能である。例えば、参照文献［７］および現在のウェブアドレスhttp://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.htmlの関連オンライン情報源を参照。
ＣＤＲ領域またはＣＤＲとは、Kabat et al. 1991［８］およびその後続版により定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すものとする。抗体は一般に３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲを含む。本明細書においてＣＤＲとは、この場合、抗体が認識する抗原またはエピトープに対する抗体の親和性による結合に関与する主要なアミノ酸残基を含む、これらの領域の１つ、またはこれらの領域のいくつか、またはさらには全部を示すために用いる。
６つの短いＣＤＲ配列のうち、重鎖の３番目のＣＤＲ(ＨＣＤＲ３)は大きなサイズ変動を持つ(大きな多様性は本質的に、それを生じる遺伝子の再配列機構によるものである)。それは短ければアミノ酸２個である場合もあるが、知られている最長サイズは２６である。ＣＤＲの長さはまた、基礎にある特定のフレームワークによって適合可能な長さに応じて可変である。機能上、ＨＣＤＲ３は、１つには抗体の特異性の決定に役割を果たす［参照文献９,１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６参照］。
抗体分子
抗体分子は天然であれ、部分的もしくは完全合成生産されたものであれ、免疫グロブリンを指す。この用語はまた、抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチドまたはタンパク質も包含する。ここで、本発明は天然型の抗体に関するのではなく、すなわち、その天然環境にはなく、天然源からの精製によって単離または入手することができたものであるか、または遺伝子組換えもしくは化学合成によって得ることができたものであること、ならびに以下に記載されるように非天然アミノ酸を含み得ることを理解しなければならない。抗体抗原結合部位を含む抗体フラグメントとしては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂおよびＦｄなどの分子が含まれる。例えば、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディーおよびミニボディーを含む、１以上の抗体抗原結合部位を含む他の様々な抗体分子が加工されている。抗体分子およびそれらの構築のための方法および使用は［１７］に記載されている。
モノクローナルおよびその他の抗体を採用すること、ならびに標的抗原と結合する他の抗体またはキメラ分子を製造するために組換えＤＮＡ技術を使用することが可能である。このような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域またはＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域とフレームワーク領域へ導入することを含み得る。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８ＡまたはＥＰ−Ａ−２３９４００、およびそれに続く相当数の文献を参照。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞に対して、遺伝子突然変異または他の変異を起こさせることもでき、これらは産生される抗体の結合特異性を変化させるものでも変化させないものでもよい。
抗体は多くの方法で修飾することができるので、「抗体分子」とは、必要な特異性および／または抗原結合性を備えた抗体抗原結合部位を有するいずれの結合要素または物質も包含すると考えるべきである。よって、この用語は、天然型のものであれ、完全もしくは部分合成のものであれ、抗体抗原結合部位を含むポリペプチドを含む抗体フラグメントおよび誘導体を包含する。従って、抗体抗原結合部位を含むキメラ分子、または別のポリペプチド(例えば、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属するもの)と融合された等価物も含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３、ならびに相当数の後続文献に記載されている。
抗体工学分野に利用可能なさらなる技術は、ヒトおよびヒト化抗体の単離も可能としてきた。例えば、ヒトハイブリドーマをKontermann & Dubel［１８］が記載しているように製造することができる。結合要素を作り出すための別の確立された技術であるファージディスプレーが、Kontermann & Dubel［１８］およびＷＯ９２／０１０４７(下記でさらに記載)、および米国特許第５,９６９,１０８号、同第５,５６５,３３２号、同第５,７３３,７４３号、同第５,８５８,６５７号、同第５,８７１,９０７号、同第５,８７２,２１５号、同第５,８８５,７９３号、同第５,９６２,２５５号、同第６,１４０,４７１号、同第６,１７２,１９７号、同第６,２２５,４４７号、同第６,２９１,６５０号、同第６,４９２,１６０号、同第６,５２１,４０４号などの多くの刊行物に詳細に記載されている。
ヒト抗体を単離するには、マウス免疫系の他の成分はそのままに、マウス抗体遺伝子が不活性化され、機能的にヒト抗体遺伝子に置き換えられているトランスジェニックマウスが使用可能である［１９］。ヒト化抗体は、例えばＷＯ９１／０９９６７、米国特許第５,５８５,０８９号、ＥＰ５９２１０６、米国特許第５,５６５,３３２号およびＷＯ９３／１７１０５に開示されているものなど、当技術分野で公知の技術を用いて製造することができる。さらに、ＷＯ２００４／００６９５５には、非ヒト抗体の可変領域のＣＤＲ配列に関してカノニカル(canonical)なＣＤＲ構造タイプとヒト抗体配列、例えば、生殖細胞系抗体遺伝子セグメントのライブラリーに由来する対応するＣＤＲに関してカノニカルなＣＤＲ構造タイプを比較することによる、ヒト抗体遺伝子からの可変領域フレームワーク配列の選択に基づき、抗体をヒト化する方法が記載されている。非ヒトＣＤＲと類似のカノニカルなＣＤＲ構造タイプを有するヒト抗体可変領域は、ヒトフレームワーク配列を選択するためのヒト抗体配列の要素のサブセットを形成する。これらのサブセット要素は、ヒトＣＤＲ配列と非ヒトＣＤＲ配列の間のアミノ酸類似性によってさらにランク付けすることができる。ＷＯ２００４／００６９５５の方法では、選択されたサブセット要素のヒトフレームワークを用い、ヒトＣＤＲ配列が非ヒトＣＤＲ相手に機能的に置き換わっているキメラ抗体を構築するためのフレームワーク配列を提供するためにトップランクのヒト配列が選択され、それにより、非ヒト抗体とヒト抗体の間でフレームワーク配列を比較する必要なく、高親和性および低免疫原性のヒト化抗体が提供される。この方法に従って製造されたキメラ抗体も開示されている。
合成抗体分子は、例えば、Knappik et al.［２０］またはKrebs et al.［２１］］により記載されているように、合成され、好適な発現ベクター内にアセンブルされたオリゴヌクレオチドの手段によって製造された遺伝子からの発現により作出することができる。
完全抗体のフラグメントは抗原と結合する機能を遂行できることが示されている。結合フラグメントの例としては、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；(ｉｉ)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；(ｉｉｉ)単鎖抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；(ｉｖ)ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂフラグメント［２２、２３、２４］；(ｖ)単離されたＣＤＲ領域；(ｖｉ)連結した２本のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ(ａｂ’)２フラグメント；(ｖｉｉ)ＶＨドメインとＶＬドメインが、これら２つのドメインを結合させて抗原結合部位を形成可能とするペプチドリンカーによって連結されている単鎖Ｆｖ分子(ｓｃＦｖ)[２５、２６]；(ｖｉｉｉ)二重特異性単鎖Ｆｖ二量体(ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５)および(ｉｘ)遺伝子融合によって構築された多価または多重特異性フラグメントである「ダイアボディー」(ＷＯ９４／１３８０４；［２７］)がある。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはダイアボディー分子はＶＨドメインとＶＬドメインを連結するジスルフィド橋の組み込みによって安定化させることができる［２８］。ＣＨ３ドメインと連結されたｓｃＦｖを含むミニボディーもまた製造可能である［２９］。結合フラグメントの他の例としては、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端において、抗体ヒンジ領域に由来する１以上のシステインを含む数個の残基が付加されていることでＦａｂフラグメントとは異なるＦａｂ’、および定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持っているＦａｂ’フラグメントであるＦａｂ’−ＳＨがある。
本発明の抗体フラグメントは抗体分子１から出発し、例えばペプシンまたはパパインなどの酵素による消化、および／または化学的還元によるジスルフィド橋の切断などの方法によって得ることができる。別法では、本発明に含まれる抗体フラグメントは、当業者に周知の遺伝子組換え技術によるか、あるいはまた、例えば、Applied Biosystemsなどによって供給されているものなどの自動ペプチド合成装置の手段によるペプチド合成、または核酸の合成および発現によって得ることができる。
本発明の機能的抗体フラグメントとしては、化学修飾、特にペグ化により、またはリポソームへの封入によりその半減期が延長されたいずれの機能的フラグメントも含む。
ｄＡｂ(ドメイン抗体)は、抗体の小さな単量体抗原結合フラグメント、すなわち、抗体重鎖または軽鎖の可変領域である［２４］。ＶＨ ｄＡｂはラクダ科動物(例えば、ラクダ、ラマ)に天然に存在し、ラクダ科動物に標的抗原を感作させ、抗原特異的Ｂ細胞を単離し、個々のＢ細胞からのｄＡｂ遺伝子をそのままクローニングすることによって生産することができる。また、ｄＡｂは細胞培養でも生産可能である。それらの小さなサイズ、良好な溶解度および温度安定性は、それらを特に生理学上有用かつ選択および親和性成熟に好適なものとする。ラクダ科動物のＶＨ ｄＡｂは「ナノボディー(商標)」の名称で治療用に開発中である。本発明の結合要素は、実質的に本明細書に示されているようなＶＨまたはＶＬドメインを含むｄＡｂ、あるいは実質的に本明細書に示されているようなＣＤＲセットを含むＶＨまたはＶＬドメインであり得る。
二重特異性または二機能性抗体は、同じ分子内で２つの異なる可変領域が合わされた第二世代のモノクローナル抗体をなす［３０］。それらの使用は、診断分野および治療分野の双方で、それらの新しいエフェクター機能を補充する能力または腫瘍細胞の表面のいくつかの分子を標的とする能力から実証されている。二重特異性抗体が用いられる場合、これらは種々の方法［３１］で作成可能な、例えば、化学的にまたはハイブリッドハイブリドーマから製造することができる便宜な二重特異性抗体であってもよいし、あるいは上述の二重特異性抗体フラグメントのいずれであってもよい。これらの抗体は化学的方法［３２、３３］または体細胞的方法［３４、３５］によって得ることができるが、同様に好ましくは、ヘテロ二量体形成を課し、従って、求める抗体の精製過程を助けることを可能とする遺伝子工学的技術によって得ることもできる［３６］。二重特異性抗体の例としては、特異性の異なる２つの抗体の結合ドメインを用い、短い柔軟なペプチドを介して直接連結させることができるＢｉＴＥ(商標)技術のものが含まれる。これは短い単鎖ポリペプチド上に２つの抗体を合わせる。ダイアボディーおよびｓｃＦｖは、Ｆｃ領域を含まずに、可変ドメインだけを用いて構築することができ、潜在的に抗イディオタイプ反応の影響を軽減する。
二重特異性抗体は全ＩｇＧとして、二重特異性Ｆａｂ’２として、Ｆａｂ’ＰＥＧとして、ダイアボディーとして、あるいはまた二重特異性ｓｃＦｖとして構築することができる。さらに、当技術分野で公知の慣例法を用いて２つの二重特異性抗体を連結し、四価抗体を形成することができる。
二重特異性完全抗体に対して二重特異性ダイアボディーも、容易に構築でき、大腸菌(E. coli)で発現させることができるので特に有用であり得る。好適な結合特異性のダイアボディー(および抗体フラグメントなどの他の多くのポリペプチド)は、ファージディスプレー(ＷＯ９４／１３８０４)を用いてライブラリーから容易に選択することができる。ダイアボディーの一方の腕を、例えばＣＸＣＬ１３に対して特異性を持ったまま維持すべきである場合、他方の腕が多様なライブラリーを製造し、適当な特異性の抗体を選択することができる。二重特異性完全抗体は、Ridgeway et al., 1996［３７］に記載されているような択一的加工法により製造することができる。
当技術分野において、ＣＸＣＬ１３に対する抗体を得るには種々の方法を利用することができる。これらの抗体は特にヒト、マウス、キメラまたはヒト化起源のモノクローナル抗体であってよく、当業者に周知の標準的な方法に従って得ることができる。
一般に、特にマウス起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメントの製造のためには、特に手引き書「Antibodies」［３８］またはKoehler and Milstein［３９］により記載されているハイブリドーマから製造する技術を参照することができる。
モノクローナル抗体は例えば、ＣＸＣＬ１３に感作した動物細胞または該モノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含むそのフラグメントの１つから得ることができる。好適なフラグメントおよびそれらを含むペプチドまたはポリペプチドが本明細書に記載され、ＣＸＣＬ１３に対する抗体を生成するため動物に感作させるのに使用することができる。該ＣＸＣＬ１３またはそのフラグメントの１つは、特に、ＣＸＣＬ１３またはそのフラグメントをコードするｃＤＮＡ配列に含まれる核酸配列で出発する遺伝子組換えによる、ＣＸＣＬ１３および／またはそのフラグメントのペプチド配列に含まれるアミノ酸配列から出発するペプチド合成によるなど、通常の操作法に従って製造することができる。
モノクローナル抗体は、例えば、そのモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含むＣＸＣＬ１３またはそのフラグメントの１つが予め固定されているアフィニティーカラムで精製することができる。より詳しくは、これらのモノクローナル抗体はＡタンパク質および／またはＧタンパク質上でのクロマトグラフィーによって精製することができ、その後に本質的に残留タンパク質夾雑物ならびにＤＮＡおよびＬＰＳを排除する目的のイオン交換クロマトグラフィーを行っても行わなくてもよく、その後に二量体または他の多量体の存在による凝集の可能性を排除するためにセファロースゲルでの排除クロマトグラフィーを行っても行わなくてもよい。一実施形態では、これらの技術の全てを同時または順次に使用することができる。
抗原結合部位
抗原結合部位は、標的抗原と結合し、標的抗原の全てまたは一部と相補的である分子の部分をいう。抗体分子においては、それは抗体抗原結合部位を指し、標的抗原と結合し、標的抗原の全てまたは一部と相補的である抗体の部分を含む。抗原が大きい場合には、抗体は抗原の特定の部分とだけ結合することができ、この部分はエピトープと呼ばれる。抗体抗原結合部位は１以上の抗体可変ドメインによって提供され得る。抗体抗原結合部位は抗体軽鎖可変領域(ＶＬ)と抗体重鎖可変領域(ＶＨ)を含み得る。
単離
単離されたとは、本発明の結合要素またはこのような結合要素をコードする核酸が一般に本発明に従うものであることを示す。よって、本発明の、結合要素、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ならびにコード核酸分子およびベクターは、例えば、それらの天然環境から、実質的に純粋または均質な形態で、または核酸の場合には、必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸または遺伝子を含まない、または実質的に含まない形態で単離および／または精製されたものが提供され得る。単離された要素および単離された核酸は、それらの天然環境、またはこのような生成がin vitroまたはin vivoにおいて実施される組換えＤＮＡ技術によるものである場合には、それらが生成される環境(例えば、細胞培養)で、一緒に見られる他のポリペプチドまたは核酸など、それらが天然に会合している材料を含まない、または実質的に含まない。要素および核酸は希釈剤またはアジュバントとともに処方されてもよく、さらに実施目的では単離されてもよく、例えば、免疫アッセイで使用するためのマイクロタイタープレートをコーティングするために用いる場合には、これらの要素は通常ゼラチンまたは他の担体と混合され、あるいは診断または治療で用いる場合には、薬学上許容される担体または希釈剤と混合される。結合要素は自然に、または異種真核細胞(例えば、ＣＨＯまたはＮＳ０(ＥＣＡＣＣ ８５１１０５０３)細胞)系によってグリコシル化されてもよく、あるいはそれらは非グリコシル化型であってもよい(例えば、原核細胞での発現によって生産される場合)。
抗ＣＸＣＬ１３抗体分子を含む異種調製物も本発明の一部をなす。例えば、このような調製物は、種々の程度のグリコシル化を有し、および／またはピログルタミン酸残基を形成するためのＮ末端グルタミン酸の環化など、誘導体化されたアミノ酸を有する、抗体と全長重鎖およびＣ末端リシンを欠いた重鎖との混合物であり得る。
本明細書において「示されているように実質的に」とは、本明細書に記載の結合要素のＶＨまたはＶＬドメインの関連のＣＤＲの特徴が、その配列が本明細書に示されている特定の領域と同一であるか、または類似性が高いことを指す。本明細書に記載されているように、１以上の可変ドメインの特定の領域に関して「類似性が高い」とは、ＣＤＲおよび／またはＶＨまたはＶＬドメイン内に１〜約５、例えば１〜４(１〜３、あるいは１または２、あるいは３または４を含む)のアミノ酸置換が作出可能であることを意図する。
発明の詳細な説明
上述のように、本発明の結合要素はＣＸＣＬ１３と結合し、ＣＸＣＬ１３の生物活性を中和し得る。本発明の結合要素はその中和効力をさらに改良するために抗力の至適化を施すことができる。一般に、効力の至適化は、選択された結合要素の配列(通常、抗体の可変ドメイン配列)を突然変異させて結合要素のライブラリーを製造し、その後これを効力に関してアッセイし、より効力のある結合要素を選択することを含む。このようにして選択された「効力が至適化された」結合要素は、そのライブラリーが製造された結合要素よりも高い効力を有する傾向がある。
しかしながらやはり、効力の高い結合要素は至適化を行わなくても得られる。本明細書で実証されているように、効力の高い結合要素は、最初のスクリーニング、例えば生化学中和アッセイから直接得ることもできる。
「効力が至適化された」結合要素とは、ＣＸＣＬ１３の特定の活性または下流機能の中和の効力が至適化された結合要素を指す。アッセイおよび効力については、本明細書の他所により詳細に記載されている。
効力が至適化された結合要素も至適化されていない結合要素も、ならびに選択された結合要素からの効力の至適化のための方法も本発明の態様である。よって、本発明は、当業者に高い効力を有する結合要素を作出させる。
さらなる態様において、本発明は、抗原と結合し得る１以上の結合要素を得る方法を提供し、その方法は、本発明の結合要素のライブラリーと抗原を接触させ、該抗原と結合し得るライブラリーの１以上の結合要素を選択することを含む。
このライブラリーは粒子または分子複合体、例えば酵母、細菌またはバクテリオファージ(例えば、Ｔ７)粒子、ウイルス、細胞または共有結合性、リボゾーム性もしくはその他のin vitroディスプレー系などの複製可能な遺伝子パッケージ上にディスプレーすることができ、各粒子または分子複合体は、その上にディスプレーされた、抗体ＶＨ可変ドメインをコードする核酸を含み、および所望により存在する場合には、ディスプレーされたＶＬドメインも含む。ファージディスプレーはＷＯ９２／０１０４７、例えば、米国特許第５,９６９,１０８号、同第５,５６５,３３２号、同第５,７３３,７４３号、同第５,８５８,６５７号、同第５,８７１,９０７号、同第５,８７２,２１５号、同第５,８８５,７９３号、同第５,９６２,２５５号、同第６,１４０,４７１号、同第６,１７２,１９７号、同第６,２２５,４４７号、同第６,２９１,６５０号、同第６,４９２,１６０号および同第６,５２１,４０４号(それぞれ出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる)に記載されている。
抗原と結合し、バクテリオファージまたは他のライブラリー粒子もしくは分子複合体上にディスプレーされ得る結合要素を選択した後、選択された結合要素をディスプレーするバクテリオファージまたは他の粒子もしくは分子複合体から核酸を採取することができる。このような核酸は次に、該選択された結合要素をディスプレーするバクテリオファージまたは他の粒子もしくは分子複合体から採取された核酸の配列を有する核酸から発現させることによる、結合要素または抗体ＶＨもしくはＶＬ可変ドメインの産生に使用可能である。
該選択された結合要素の抗体ＶＨ可変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体ＶＨ可変ドメインも、このようなＶＨドメインを含む結合要素と同様に、単離形態で提供することができる。
さらにＣＸＣＬ１３と結合する能力、また、ＣＸＣＬ１３との結合に関して結合要素、例えば、抗体１(例えば、ｓｃＦｖ形式および／またはＩｇＧ形式、例えば、ＩｇＧ１)と競合する能力を測定することができる。ＣＸＣＬ１３中和能は、本明細書の他所でさらに述べられているように試験することができる。
本発明の結合要素は、抗体１、例えばｓｃＦｖもしくはＩｇＧ１の親和性で、またはより良好な親和性でＣＸＣＬ１３と結合し得る。
本発明の結合要素は、抗体１、例えばｓｃＦｖもしくはＩｇＧ１の効力で、またはより良好な効力でＣＸＣＬ１３の生物活性を中和し得る。
異なる結合要素の結合親和性および中和効力を適当な条件下で比較することができる。
アミノ酸配列が本明細書に示されているもの、およびＣＸＣＬ１３に対する結合要素に使用可能なものを含む、本発明のＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲの変異体は、配列変更または突然変異の手段および所望の特徴を有する抗原結合要素のスクリーニングによって得ることができる。所望の特徴の例としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる。
・その抗原に特異的な既知の抗体に比べて増強された抗原に対する結合親和性
・活性が既知であれば、その抗原に特異的な既知の抗体に比べて増強された抗原活性の中和
・その抗原に対する既知の抗体またはリガンドとの特定のモル比における特定の競合能
・複合体を免疫沈降させる能力
・特定のエピトープと結合する能力
・直鎖および／または拘束コンフォメーションにおいてスクリーニングされたペプチドを用い、本明細書に記載されているようなペプチド結合スキャンを用いて同定された直鎖エピトープ、例えば、ペプチド配列
・非連続残基により形成されたコンフォメーションエピトープ
・ＣＸＣＬ１３または下流分子の新規な生物活性を調節する能力。
このような方法も本明細書で提供される。
本明細書に開示されている抗体分子の変異体は本発明において製造および使用可能である。構造／特性−活性関係に対する多変量データ解析技術の適用においてコンピューター化学を導入［４０］した後、抗体の定量的活性−特性関係を、統計学的回帰、パターン認識および分類などの周知の数学的技術を用いて導くことができる［４１、４２、４３,４４、４５、４６］。抗体の特性は抗体配列、機能および三次元構造の経験的および理論的モデル(例えば、可能性のある接触残基の分析または算出された物理化学的特性)から導くことができ、これらの特性は単独で、また組み合わせて考慮することができる。
ＶＨドメインおよびＶＬドメインからなる抗体抗原結合部位は一般に、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)由来の３つと重鎖可変ドメイン(ＶＨ)由来の３つの、６つのポリペプチドループにより形成される。原子構造が既知の抗体の分析は、抗体結合部位の配列と三次元構造の間の関係を解明した［４７、４８］。これらの関係は、ＶＨドメインの三番目の領域(ループ)を除き、結合部位ループが少数の主鎖コンフォメーション：カノニカルな構造の１つを有することを意味する。特定のループにおいて形成されたカノニカルな構造は、その大きさならびにループおよびフレームワーク領域の双方の鍵となる部位における特定の残基の存在によって決定されることが示されている［４７、４８］。
この配列−構造関係の研究は、既知配列の抗体における残基の推定に使用できるが、そのＣＤＲループの三次元構造の維持に重要であり、従って結合特異性を維持する未知の三次元構造の抗体における残基の推定には使用できない。これらの推定は、その推定と主要な至適化実験からの出力との比較によってバックアップすることができる。構造アプローチでは、ＷＡＭ［５０］など、いずれかの無料利用可能なまたは市販のパッケージを用い、抗体分子のモデルを作出することができる［４９］。次に、Insight II (Accelrys, Inc.)またはDeep View［５１］などのタンパク質可視化および分析ソフトウエアパッケージを用いて、ＣＤＲの各位置に存在し得る置換を評価することができる。次に、この情報を用い、活性に対して最小のまたは有益な作用を持ち得る置換を作り出すことができる。
当技術分野において、一般に、ＣＤＲ、抗体ＶＨまたはＶＬドメインおよび結合要素のアミノ酸配列内に置換を作り出すために必要な技術は利用可能である。活性に対して最小のまたは有益な作用を持つと推定され得る、または推定されない置換を有する変異体配列を作り出し、ＣＸＣＬ１３と結合し、および／またはそれを中和する能力、および／または他のいずれかの所望の特性に関して試験することができる。
その配列が本明細書に具体的に開示されているＶＨおよびＶＬドメインのいずれかの可変ドメインアミノ酸配列変異体は、述べられている通り、本発明に従って使用することができる。
本発明のさらなる態様は、添付の配列表に示されている抗体１のＶＨドメインと少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含み、および／または添付の配列表に示されている抗体１のＶＬドメインと少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインを含む抗体分子である。２つのアミノ酸配列の同一性％を算出するために使用可能なアルゴリズムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ［５２］、ＦＡＳＴＡ［５３］またはSmith-Watermanアルゴリズム［５４］(例えば、デフォルトパラメーターを用いる)が含まれる。
ＶＨドメイン、ＶＬドメインおよび／またはＣＤＲもしくはＣＤＲセットの特定の変異体は、１以上のアミノ酸配列変異(アミノ酸残基の付加、欠失、置換および／または挿入)を含み得る。変異体は約２０未満、例えば約１５未満、１０未満または約５未満、例えば、５つ、４つ、３つ、２つまたは１つの変異を含み得る。
変異は１以上のフレームワーク領域および／または１以上のＣＤＲで作り出すことができる。変異は通常、機能欠損を招かず、従って、このように変異したアミノ酸配列を含む結合要素はＣＸＣＬ１３と結合し、および／またはそれを中和する能力を保持し得る。それは、例えば本明細書に記載のアッセイで測定した場合、変異が起こっていない結合要素と同量の結合および／または中和能を保持し得る。このように変異したアミノ酸配列を含む結合要素はＣＸＣＬ１３と結合し、および／またはそれを中和する能力の向上を示す場合もある。
変異は、１以上のアミノ酸残基の非天然または非標準アミノ酸での置換、１以上のアミノ酸残基の非天然または非標準型への改変、またはその配列への１以上の非天然または非標準アミノ酸の挿入を含み得る。本発明の配列における変異の数および位置の例は本明細書の他所に記載されている。天然アミノ酸としては、標準的な一文字コードでＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅとして表される２０の「標準」Ｌ−アミノ酸が含まれる。非標準アミノ酸としては、ポリペプチド主鎖に組み込み可能な、または既存のアミノ酸残基の修飾から生じ得る他のいずれの残基も含まれる。非標準アミノ酸は天然に存在する場合も天然に存在しない場合もある。４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシン、３−メチルヒスチジン、Ｎ−アセチルセリンなど、いくつかの天然に存在する非標準アミノ酸が当技術分野で知られている［５５］。そのＮ−α位で誘導体化されたアミノ酸残基はアミノ酸配列のＮ末端にしか存在しない。通常、本発明では、アミノ酸はＬ−アミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸であってもよい。従って、変異はＬ−アミノ酸のＤ−アミノ酸への修飾、またはＬ−アミノ酸のＤ−アミノ酸での置換を含み得る。メチル化、アセチル化および／またはリン酸化型のアミノ酸も知られており、本発明のアミノ酸はこのような修飾も受け得る。
本発明の抗体ドメインおよび結合要素のアミノ酸配列は、上記の非天然または非標準アミノ酸を含み得る。非標準アミノ酸(例えば、Ｄ−アミノ酸)は合成の際に、またはアミノ酸配列の合成の後に「元の」標準アミノ酸を修飾または置換することによって、アミノ酸配列へ組み込むことができる。
非標準的および／または非天然アミノ酸の使用は構造および機能の多様性を高め、従って、本発明の結合要素において所望のＣＸＣＬ１３結合および中和特性を達成する可能性を高め得る。さらに、Ｄ−アミノ酸および類似体は、動物、例えばヒトに投与した後に、Ｌ−アミノ酸を有するポリペプチドのin vivo分解のために、標準的なＬ−アミノ酸とは異なる薬物動態特性を有することが示されており、これはいくつかのin vivo適用においてＤ−アミノ酸が有利であることを意味する。
本発明のＣＤＲ由来配列を含む新規なＶＨまたはＶＬ領域は、全長可変ドメイン内に突然変異を作り出すための１以上の選択ＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム突然変異誘発を用いて製造することができる。このような技術は、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを用いたGram et al.［５６］によって記載されている。いくつかの実施形態では、全長可変ドメインまたはＣＤＲセット内に１または２つのアミノ酸置換が作出される。
使用可能な別法として、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に対する突然変異誘発を指定するものがある。このような技術はBarbas et al.［５７］およびSchier et al.［５８］に開示されている。
上記の技術は全てそれ自体当技術分野で既知であり、当業者ならばこのような技術を用い、当技術分野で慣例の方法を用いて本発明の結合要素を提供することができる。
本発明のさらなる態様は、ＣＸＣＬ１３に対する抗体抗原結合部位を得るための方法を提供し、その方法は、本明細書に示されるＶＨドメインのアミノ酸配列における１以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または挿入によって、ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを準備すること、所望により、このように準備されたＶＨドメインと１以上のＶＬドメインを組み合わせること、および所望により１以上の所望の特性、例えばＣＸＣＬ１３活性中和能を有する、ＣＸＣＬ１３に対する結合要素または抗体抗原結合部位を同定するためにこのＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの組合せを試験することを含む。該ＶＬドメインは本明細書に実質的に示されているアミノ酸配列を持ち得る。本明細書に開示されているＶＬドメインの１以上の配列変異体を１以上のＶＨドメインと組み合わせる類似の方法も使用可能である。
上述のように、実質的に本明細書に示されているようなＣＤＲアミノ酸配列は、ヒト抗体可変ドメインまたはその実質的一部にＣＤＲとして保持され得る。実質的に本明細書に示されているようなＨＣＤＲ３配列は本発明の実施形態に相当し、これらはそれぞれヒト重鎖可変ドメインまたはその実質的一部にＨＣＤＲ３として保持され得る。
本発明で用いられる可変ドメインは、いずれの生殖細胞系または再配列ヒト可変ドメインからも取得可能、または由来してもよく、あるいは既知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列または実際の配列に基づく合成可変ドメインであってもよい。可変ドメインは非ヒト抗体に由来してもよい。本発明のＣＤＲ配列(例えば、ＣＤＲ３)は、組換えＤＮＡ技術を用い、ＣＤＲ(例えば、ＣＤＲ３)を欠いた可変ドメインのレパートリーに導入してもよい。例えば、Marks et al.［５９］は、ＣＤＲ３を欠いたＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供するための、可変ドメイン領域の５’末端に、またはそれに隣接して指定されたコンセンサスプライマーが、ヒトＶＨ遺伝子の３番目のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーとともに用いられる、抗体可変ドメインレパートリー製造法を記載している。Marks et al.はさらに、このレパートリーを特定の抗体のＣＤＲ３といかに組み合わせればよいかも記載している。類似の技術を用い、本発明のＣＤＲ３由来配列を、ＣＤＲ３を欠いたＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフルし、シャッフルされた完全ＶＨまたはＶＬドメインをコグネイトＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて本発明の結合要素を提供することができる。次に、このレパートリーを、出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされるＷＯ９２／０１０４７、またはKay, Winter & McCafferty［６０］をはじめとする相当数の後続文献のファージディスプレー系など、好適な宿主系でディスプレーし、このようにして好適な結合要素を選択することができる。レパートリーは１０４以上、例えば、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９または少なくとも１０１０またはそれを超える個々の要素のいずれかからなり得る。他の好適な宿主系としては、限定されるものではないが、酵母ディスプレー、細菌ディスプレー、Ｔ７ディスプレー、ウイルスディスプレー、細胞ディスプレー、リボソームディスプレーおよび共有結合ディスプレーが含まれる。
ＣＸＣＬ１３抗原に対する結合要素を製造する方法が提供され、その方法は、
(ａ)置換されるＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３コード領域を欠いたＶＨドメインをコードする核酸の出発レパートリーを準備すること、
(ｂ)該レパートリーを、ＶＨ ＣＤＲ３に関して実質的に本明細書に示されているようなアミノ酸配をコードするドナー核酸と合わせ、その結果、該ドナー核酸がレパートリーのＣＤＲ３領域に挿入されて、ＶＨドメインをコードする核酸の生成物レパートリーが得られること、
(ｃ)該生成物レパートリーの核酸を発現させること、
(ｄ)ＣＸＣＬ１３に対する結合要素を選択すること、および
(ｅ)該結合要素またはそれをコードする核酸を回収すること
を含む。
また、本発明のＶＬ ＣＤＲ３を、置換されるＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３コード領域を欠いたＶＬドメインをコードする核酸のレパートリーと合わせる類似の方法も使用可能である。
同様に、３つのＣＤＲの１以上または全てをＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーにグラフトした後、ＣＸＣＬ１３に対する結合要素をスクリーニングしてもよい。
例えば、抗体１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の１以上、または抗体１のＨＣＤＲセットが使用可能であり、および／または抗体１のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の１以上、または抗体１のＬＣＤＲセットが使用可能である。
同様に、本明細書に開示されている他のＶＨおよびＶＬドメイン、ＣＤＲセットおよびＨＣＤＲセット、ならびに／またはＬＣＤＲセットも使用可能である。
免疫グロブリン可変ドメインの実質的一部は、少なくとも３つのＣＤＲ領域を、それらの介在フレームワーク領域とともに含み得る。この部分はまた、１番目と４番目のフレームワーク領域のいずれかまたは双方の少なくとも約５０％を含んでもよく、この５０％は１番目のフレームワーク領域のＣ末端５０％、そして４番目のフレームワーク領域のＮ末端５０％である。この可変ドメインの実質的一部のＮ末端またはＣ末端における付加的残基は、天然可変ドメイン領域とは通常会合していないものであり得る。例えば、組換えＤＮＡ技術によって行われる本発明の結合要素の構築は、クローニングまたは他の操作工程を容易にするために導入されるリンカーによってコードされているＮ末端またはＣ末端残基の導入をもたらし得る。他の操作工程には、本発明の可変ドメインと、本明細書の他所により詳細に記載されているように、抗体定常領域、その他の可変ドメイン(例えば、ダイアボディーの製造の場合)または検出可能な／機能的標識を含むさらなるタンパク質配列とを連結するためのリンカーの導入が含まれる。
本発明のいくつかの態様では、結合要素は１対のＶＨドメインとＶＬドメインを含むが、ＶＨドメインまたはＶＬドメイン配列のいずれかに基づく単鎖結合ドメインも本発明のさらなる態様をなす。単鎖免疫グロブリンドメイン、特に、ＶＨドメインは、特異的な様式で標的抗原と結合し得ることが知られている。例えば、上記のｄＡｂの考察を参照。
これらいずれかの単鎖結合ドメインの場合、これらのドメインは、ＣＸＣＬ１３と結合し得る２ドメイン結合要素を形成し得る相補的ドメインをスクリーニングするために使用可能である。これは、出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされるＷＯ９２／０１０４７に開示されているように、Ｈ鎖またはＬ鎖クローンのいずれかを含む個々のコロニーを用いて、他方の鎖(ＬまたはＨ)をコードするクローンの完全ライブラリーに感染させ、結果として得られる２鎖結合要素を、その参照文献に記載されているものなどのファージディスプレー技術に従って選択する、いわゆる階層的デュアルコンビナトリアルアプローチを用いたファージディスプレースクリーニング法によって果たすことができる。この技術もMarks et al.(同書)に開示されている。
本発明の結合要素は、抗体定常領域またはその一部、例えば、ヒト抗体定常領域またはその一部をさらに含み得る。例えば、ＶＬドメインは、ヒトＣκまたはＣγ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインのＣ末端に結合させることができる。同様に、ＶＨドメインに基づく結合要素は、抗体イソ型、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭのいずれか、また、イソ型サブクラス、特に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４のいずれかに由来する免疫グロブリン重鎖の全部または一部(例えば、ＣＨ１ドメイン)のＣ末端に結合させることができる。ＩｇＧ１が、そのエフェクター機能と製造の容易さのために有利である。これらの特性を有し、そして、可変領域を安定化させる、いずれの合成または他の定常領域変異体も本発明において有用であり得る。
本発明の結合要素は検出可能なまたは機能的標識で標識し得る。よって、結合要素または抗体分子は、検出可能なおよび／または定量可能なシグナルを得るための免疫複合体の形態で存在させ得る。免疫複合体は、検出可能なまたは機能的標識とコンジュゲートされた本発明の抗体分子を含み得る。標識はシグナルを生成するまたはシグナル生成を誘発し得るいずれの分子でもよく、限定されるものではないが、蛍光剤、放射性標識、酵素、化学発光剤または光増感剤が含まれる。よって、結合は、蛍光または化学発光、放射能、酵素活性または吸光度を検出することによって検出および／または測定可能である。
好適な標識としては、限定されるものではないが例を挙げれば、下記の通りである。
・アルカリ性ホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ(「Ｇ６ＰＤＨ」)、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびペルオキシダーゼ、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素；
・色素；
・フルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ローダミン化合物および誘導体、ＧＦＰ(ＧＦＰは「緑色蛍光タンパク質」)、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、ならびにフルオレスカミンなどの蛍光標識または蛍光剤；ランタニドクリプテートなどの蛍光団およびユウロピウム(Perkin Elmer and Cis Biointernational)などのキレート剤；
・イソルミノール、ルミノールおよびジオキセタンなどの化学発光標識または化学発光剤；
・ルシフェラーゼおよびルシフェリンなどの生物発光標識；
・増感剤；
・補酵素；
・酵素基質；
・限定されるものではないが、臭素７７、炭素１４、コバルト５７、フッ素８、ガリウム６７、ガリウム６８、水素３(トリチウム)、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ヨウ素１２３ｍ、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３１、ヨウ素１３３、水銀１０７、水銀２０３、リン３２、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、スカンジウム４７、セレン７５、硫黄３５、テクネチウム９９、テクネチウム９９ｍ、テルル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、イットリウム１９９および本明細書に記載の他の放射性標識を含む、放射性標識；
・ラテックスまたは炭素粒子などの粒子；金属ゾル；クリスタライト；リポソーム；細胞など(色素、触媒または他の検出可能な基でさらに標識してもよい)；
・ビオチン、ジゴキシゲニンまたは５−ブロモデオキシウリジンなどの分子；
・例えば、シュードモナス外毒素(ＰＥまたはその細胞傷害性フラグメントもしくは変異株)、ジフテリア毒またはその細胞傷害性フラグメントもしくは変異株、ボツリヌス菌毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦ、リシンまたはその細胞傷害性フラグメント、例えば、リシンＡ、アブリンまたはその細胞傷害性フラグメント、サポリンまたはその細胞傷害性フラグメント、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス毒素またはその細胞傷害性フラグメント、ならびにボリョジン(bryodin)１またはその細胞傷害性フラグメントの群から選択される毒素部分などの毒素部分
好適な酵素および補酵素はLitman, et al.の米国特許第４,２７５,１４９号およびBoguslaski, et al.の米国特許第４,３１８,９８０号(それぞれ出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる)に開示されている。好適な蛍光剤および化学発光剤はLitman, et al.の米国特許第４,２７５,１４９号(出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる)に開示されている。標識はさらに、例えば標識アビジンまたはストレプトアビジンなど、特異的コグネイト検出部分との結合を介して検出可能なビオチンのような化学部分をさらに含む。検出可能な標識は、当技術分野で公知の慣例の化学法を用いて本発明の抗体と結合させることができる。
免疫複合体またはそれらの機能的フラグメントは、当業者に公知の方法によって製造することができる。それらは酵素または蛍光標識に直接、またはグルタルアルデヒドのようなポリアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ジエチレン−トリアミン五酢酸(ＤＰＴＡ)などのスペーサー基または架橋基の介在により、または治療用コンジュゲートに関して上述したものなどのカップリング剤の存在下で結合させることができる。フルオレセインタイプの標識を含むコンジュゲートは、イソチオシアネートと反応させることにより製造することができる。
治療用放射性同位元素と抗体を直接、または上述のＥＤＴＡ、ＤＴＰＡなどのキレート剤を介して結合させるための当業者に公知の既存の方法が、診断に用い得る放射性元素に対しても使用可能である。同様に、クロラミンＴ法［６１］によるナトリウム１２５での標識、あるいはまたCrockford et al.(出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第４,４２４,２００号)の技術によるテクネチウム９９ｍでの標識を行うか、あるいはHnatowich(出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第４,４７９,９３０号)により記載されているようにＤＴＰＡを介して結合させることができる。
標識が外的手段、例えば、目視検査、電磁放射線、熱および化学試薬によって検出可能なシグナルを生成し得る多くの方法がある。標識はまた、本発明の抗体または支持体と結合する別の結合要素と結合させることもできる。
標識は直接シグナルを生成することができ、従って、シグナル生成のために他の成分は必要としない。多くの有機分子、例えば、蛍光剤は紫外線および可視光を吸収することができ、この光の吸収がこれらの分子にエネルギーを移し、それらを励起されたエネルギー状態にまで引き上げる。この吸収されたエネルギーは次に、第二の波長における発光によって放散される。この第二の波長の放出も標識されたアクセプター分子にエネルギーを移すことができ、生じたエネルギーは、発光、例えば蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)によってアクセプター分子から放散される。直接シグナルを生じる他の標識としては、放射性同位元素および色素が含まれる。
あるいは、標識はシグナルを生成するために他の成分を必要とする場合もあり、このシグナル生成系は測定可能なシグナルを生成するために必要な全ての成分を含み、基質、補酵素、エンハンサー、付加的酵素、酵素生成物と反応する物質、触媒、アクチベーター、補因子、阻害剤、スカベンジャー、金属イオン、およびシグナル生成物質の結合に必要な特定の結合物質を含み得る。好適なシグナル生成系の詳細な考察は、出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされるUllman et al.の米国特許第５,１８５,２４３号に見出せる。
本発明は、本明細書で提供される結合要素とＣＸＣＬ１３の結合を生じさせるまたは可能とすることを含む方法を提供する。述べたように、このような結合はin vivoにおいて、例えば、結合要素または結合要素をコードする核酸を投与した後に起こり得るか、あるいはin vitro、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、免疫細胞化学、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、および生化学または細胞に基づくアッセイ、例えば、ｃＡＭＰ、カルシウム放出またはＢ細胞走化性アッセイにおいて起こり得る。
本発明はまた、例えばバイオセンサー系において本発明の結合要素を使用することにより抗原のレベルを直接測定するために提供される。例えば、本発明は、ＣＸＣＬ１３との結合を検出および／または測定する方法を含み、その方法は、(ｉ)該結合要素をＣＸＣＬ１３に曝すこと、および(ｉｉ)該結合要素とＣＸＣＬ１３の結合を検出すること(結合は本明細書に記載のいずれかの方法または検出可能な標識を用いて検出される)を含む。この結合検出法および本明細書に記載の他のいずれかの結合検出法は、当業者によれば、例えば検出可能な標識を目視により観察することによる方法を行うことと直接解釈できる。あるいは、この方法または本明細書に記載の他のいずれかの結合検出法は、オートラジオグラフ、写真、コンピューターのプリントアウト、フローサイトメトリーレポート、グラフ、チャート、結果を含む試験管もしくは容器もしくはウェル、または本方法の結果の他の視覚的もしくは物理的提示の形態のレポートを作成し得る。
結合要素とＣＸＣＬ１３の結合量も測定可能である。定量は、診断対象であり得る試験サンプル中の抗原の量に関するものであり得る。ＣＸＣＬ１３結合に関するスクリーニングおよび／またはその定量は、例えば、本明細書で言及されている疾病もしくは障害、および／または異常なＣＸＣＬ１３の発現および／または活性を含む他のいずれかの疾病もしくは障害に関して患者をスクリーニングする上で有用であり得る。
いくつかの疾病がＣＸＣＬ１３のレベルの上昇に関連している。ＣＸＣＬ１３レベルは種々の障害、例えば本明細書の他所に記載されているような炎症性疾患および／または自己免疫疾患の有用な診断および／または予後指標である。例えば、血清または滑液サンプルにおけるＣＸＣＬ１３レベルの上昇は関節リウマチの予測因子として使用可能である。
本発明の診断方法は、(ｉ)被験体から組織または液体サンプルを得ること、(ｉｉ)この組織または液体サンプルを１以上の本発明の結合要素に曝すこと、および(ｉｉｉ)結合したＣＸＣＬ１３を対照サンプルと比較して検出し、対照と比較した際のＣＸＣＬ１３結合量の増加がＣＸＣＬ１３の発現または活性の異常なレベルを示し得ることを含む。供試組織または液体サンプルとしては、血液、血清、尿、生検材料、腫瘍または異常なＣＸＣＬ１３レベルを含むと思われるいずれの組織も含まれる。異常なＣＸＣＬ１３レベルまたは活性に関して陽性と判定された被験体もまた、本明細書の以降で開示される処置方法から利益が得られる。
当業者ならば、本明細書に開示されている方法に照らして、それらの優先性と全般知識に従って結合要素と抗原の結合を測定する好適な様式を選択することができる。
サンプル中の結合要素の反応性は適当ないずれかの方法によって測定することができる。ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)が１つの可能性である。放射性標識抗原を非標識抗原(試験サンプル)と混合し、結合要素と結合させる。結合した抗原を結合しなかった抗原から物理的に分離し、結合要素と結合した放射性抗原の量を測定する。試験サンプル中に存在する抗原が多いほど、結合要素と結合する放射性抗原は少なくなる。また、リポーター分子に結合させた抗原または類似体を用い、非放射性抗原との競合的結合アッセイを用いてもよい。リポーター分子は、スペクトル的に独立した吸収または発光特性を有する蛍光色素、燐光体またはレーザー色素であり得る。好適な蛍光色素としては、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリンおよびテキサスレッド、ならびにランタニドキレートまたはクリプテートが挙げられる。好適な発色色素としては、ジアミノベンジジンがある。
他のリポーターとしては、高分子コロイド粒子または粒状物質(有色、磁性または常磁性であるラテックスビーズなど)、および検出可能なシグナルを直接または間接的に、視覚により観察させ得るか、または電気的に検出させ得るか、または他の方法で記録させ得る生物学的または化学的に活性な薬剤が含まれる。これらの分子は、例えば発色または変色または電気的特性を変化させ得る反応を触媒する酵素であってもよい。それらは、エネルギー状態間の電気的遷移が特徴的なスペクトル吸収または発光をもたらすように分子的に励起可能であり得る。それらは、バイオセンサーと併用される化学存在を含み得る。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリ性ホスファターゼ検出系が使用可能である。
個々の結合要素−リポーターコンジュゲートにより生成されたシグナルは、サンプル(正常および試験)において関連のある結合要素の結合の定量可能な絶対的または相対的データを導くために使用することができる。
また、本発明のいずれかの態様または実施形態の結合要素を含むキットも、本発明の一態様として提供される。このキットにおいて、結合要素は、例えばさらに以下に記載される通り、サンプル中でのその反応性を測定可能とするよう標識することができる。さらに、結合要素は固相支持体に結合させても結合させなくてもよい。キットの成分は一般に無菌であり、密閉バイアルまたはその他の容器内にある。キットは診断分析または結合要素が有用な他の方法で使用可能である。キットは、例えば本発明の方法などの方法においてこれらの成分の使用説明書を含み得る。このような方法の実施を助けるまたは可能とする補助材料が本発明のキットに含まれてよい。補助材料としては、第一の結合要素と結合し、検出可能な標識(例えば、蛍光標識、放射性同位元素または酵素)とコンジュゲートされる第二の、異なる結合要素を含む。抗体に基づくキットはまた、免疫沈降を行うためのビーズも含み得る。キットの各成分は一般にその固有の好適な容器内にある。よって、これらのキットは一般に、各結合要素に好適な別個の容器を含む。さらに、これらのキットは、アッセイおよびアッセイの実行から得られるデータを解釈および分析するための方法を実行するための説明書を含み得る。
本発明はまた、競合アッセイにおいて抗原レベルを測定するための上記結合要素の使用、すなわち、競合アッセイにおいて本発明により提供される結合要素を利用することによってサンプル中の抗原のレベルを測定する方法を提供する。これは非結合抗原から結合抗原を物理的に分離する必要のない方法であり得る。結合の際に物理的または光学的変化が生じるようなリポーター分子と結合要素の連結が１つの可能性である。このリポーター分子は直接または間接的に、定量可能である検出可能なシグナルを生成し得る。このリポーター分子の連結は直接的または間接的、共有結合的(例えば、ペプチド結合を介する)または非共有結合的であり得る。ペプチド結合を介した連結は、抗体およびリポーター分子をコードする遺伝子融合物の組換え発現の結果としてのものであり得る。
種々の態様および実施形態において、本発明は、ＣＸＣＬ１３、例えばヒトＣＸＣＬ１３との結合に関して本明細書で定義されたいずれかの結合要素、例えば、抗体１、例えばＩｇＧ１形式のものと競合する結合要素に及ぶ。結合要素間の競合は、同じエピトープまたは重複するエピトープと結合する結合要素の同定を可能とするため、in vitroにおいて、例えば、検出可能な特異的リポーター分子をある結合要素に、他のタグ無しの結合要素の存在下でタグ付けすることにより、容易にアッセイすることができる。競合は例えば、ＣＸＣＬ１３がプレートに固定され、第一のタグ付きまたは標識結合要素が１以上の他のタグ無しまたは非標識結合要素とともにプレートに添加されるＥＬＩＳＡを用いて判定することができる。タグ付き結合要素と競合するタグ無し結合要素の存在は、タグ付き結合要素によって発せられるシグナルの低下によって観察される。一例では、ＨＴＲＦ(登録商標)エピトープ競合アッセイが使用可能である。
例えば、本発明は、ＣＸＣＬ１３結合化合物を同定する方法を含み、その方法は、(ｉ)ＣＸＣＬ１３を支持体に固定すること、(ｉｉ)該固定化ＣＸＣＬ１３を同時にまたは段階的に本発明の少なくとも１つのタグ付きまたは標識結合要素および１以上のタグ無しまたは非標識試験結合化合物と接触させること、および(ｉｉｉ)タグ付き結合要素に由来する結合タグの量の低下を観察することによって新規なＣＸＣＬ１３結合化合物を同定することを含む。このような方法はマルチウェルまたはアレイ形式を用い、ハイスループット様式で行うことができる。このようなアッセイはまた溶液中でも行うことができる。例えば、出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第５,８１４,４６８号参照。上記のように、結合の検出は、例えば、検出可能な標識またはその存在の低下を視覚的に観察することによるなど、本方法の実施者が直接解釈することが可能である。あるいは、本発明の結合方法はオートラジオグラフ、写真、コンピューターのプリントアウト、フローサイトメトリーレポート、グラフ、チャート、結果を含む試験管もしくは容器もしくはウェル、または本方法の結果の他の視覚的もしくは物理的提示の形態のレポートを作成し得る。
競合アッセイはまた、エピトープマッピングにも使用できる。１つの事例では、所望により、至適化された中和および／または調節特性を持ち得るＣＸＣＬ１３結合要素によって結合されるエピトープを同定するためにエピトープマッピングが使用可能である。このようなエピトープは直鎖であってもコンフォメーション型であってもよい。コンフォメーショナルエピトープは少なくとも２つの異なるＣＸＣＬ１３フラグメントを含むことができ、該フラグメントは、ＣＸＣＬ１３がその三次元または四次元構造に折りたたまれて、ＣＸＣＬ１３結合要素などのＣＸＣＬ１３の阻害剤により認識されるコンフォメーショナルエピトープを形成する場合には、互いに近接して配置される。競合の試験では、抗原のペプチドフラグメント、特に対象エピトープを含む、または本質的に対象エピトープからなるペプチドを使用することができる。いずれかの末端にエピトープ配列と１以上のアミノ酸を有するペプチドが使用可能である。本発明の結合要素は、抗原に対するそれらの結合が与えられた配列番号を有する、または含むペプチドによって阻害されるようなものであり得る。
本発明はさらに本発明の結合要素をコードする単離された核酸を提供する。核酸はＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含み得る。一態様において、本発明は、上記で定義されたような本発明のＣＤＲまたはＣＤＲセットまたはＶＨドメインまたはＶＬドメインまたは抗体抗原結合部位または抗体分子、例えばｓｃＦｖまたはＩｇＧ１をコードする核酸を提供する。
本発明はまた、上記のような少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態の構築物を提供する。
本発明はまた、上記のような１以上の構築物を含む組換え宿主細胞を提供する。提供されるようなＣＤＲまたはＣＤＲセットまたはＶＨドメインまたはＶＬドメインまたは抗体抗原結合部位または抗体分子、例えばｓｃＦｖまたはＩｇＧ１のいずれかをコードする核酸はそれ自体、コードされる産物の生産方法(この方法はそのコード核酸からの発現を含む)と同様に本発明の態様をなす。発現は便宜には、核酸を含む組換え宿主細胞を適当な条件下で培養することによって達成され得る。発現による生産の後、ＶＨもしくはＶＬドメインまたは結合要素は、いずれかの好適な技術を用いて単離および／または精製した後、適宜使用することができる。
本発明の核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを含んでよく、完全または部分合成品であってもよい。本明細書に示されているようにヌクレオチド配列という場合には、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、文脈上他の解釈が必要ではない限り、ＵがＴに置き換えられている特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
なおさらなる態様は抗体ＶＨ可変ドメインの生産方法を提供し、その方法はコード核酸から発現させることを含む。このような方法は、宿主細胞を該抗体ＶＨ可変ドメインの生産のための条件下で培養することを含み得る。
ＶＨおよび／またはＶＬドメインを含むＶＬ可変ドメインおよび結合要素の生産のための類似の方法が、本発明のさらなる態様として提供される。
生産方法は、生成物の単離および／または精製の工程を含み得る。生産方法は、生成物を薬学上許容される賦形剤などの少なくとも１つの付加的成分を含む組成物に処方することを含み得る。
多様な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は周知である。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳類細胞、植物細胞、微細線維真菌、酵母およびバキュロウイルス系ならびにトランスジェニック植物および動物が含まれる。原核細胞における抗体および抗体フラグメントの発現は当技術分野で十分確立されている。総説としては、例えば、Pluckthun［６２］参照。一般的な細菌宿主は大腸菌である。
培養真核細胞における発現も、結合要素の生産のための選択肢として当業者に利用可能である［６３、６４、６５］。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野で利用可能な哺乳類細胞系統としては、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胚腎臓細胞、ヒト胚網膜細胞その他多数が含まれる。
好適なベクターとしては、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適当であればその他の配列を含む適当な調節配列を含むものが選択または構築可能である。ベクターは、適当であれば、プラスミド、例えばファージミド、またはウイルス、例えば「ファージ」であり得る［６６］。例えば、核酸構築物の製造、突然変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における核酸の操作のための多くの既知の技術およびプロトコールがAusubel et al.［６７］に詳細に記載されている。
本発明のさらなる態様は、本明細書に開示されるような核酸を含む宿主細胞を提供する。このような宿主細胞はin vitroであってもよいし、培養系であってもよい。このような宿主細胞はin vivoであってもよい。in vivoにおける宿主細胞の存在は、「イントラボディー」または細胞内抗体としての本発明の結合要素の細胞内発現を可能とする。イントラボディーは遺伝子療法に使用可能である。
なおさらなる態様は、本発明の核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。この導入には利用可能ないずれの技術を用いてもよい。真核細胞のためには、好適な技術として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクションおよびレトロウイルスもしくは他のウイルス(例えば、ワクシニア)または昆虫細胞にはバキュロウイルスを用いた形質導入が含まれる。宿主細胞、特に真核細胞における核酸の導入には、ウイルスまたはプラスミドに基づく系を用い得る。プラスミド系はエピソームによって維持されてもよいし、あるいは宿主細胞または人工染色体へ組み込まれてもよい。組込みは単一または複数の遺伝子座における１以上のコピーの無作為または標的化された組込みのいずれかによるものであってよい。細菌細胞のためには、好適な技術として、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを用いたトランスフェクションが含まれる。
導入の後に、例えば宿主細胞を遺伝子の発現のための条件下で培養することにより、核酸からの発現を引き起こすまたは可能とすることができる。発現産物の精製は当業者に公知の方法によって達成することができる。
本発明の核酸は宿主細胞のゲノム(例えば、染色体)に組み込まれ得る。組込みは、標準的な技術に従い、ゲノムとの組換えを促進する配列を包含させることにより促進することができる。
本発明はまた、上記のような結合要素またはポリペプチドを発現させるために、発現系において上述の構築物を用いることを含む方法を提供する。
本発明の結合要素はヒトまたは動物対象、例えばヒトにおける診断または処置の方法に使用可能である。ＣＸＣＬ１３に対する結合要素はＣＸＣＬ１３に関連する、例えば、異常なＣＸＣＬ１３の発現および／または活性に関連する障害を処置するために使用可能である。本明細書の他所に述べられているように、種々の障害にＣＸＣＬ１３が関与している証拠がある。本発明の結合要素は、ＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合を阻害し、それによりＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合により媒介される疾病または障害を処置するために使用可能である。ＣＸＣＬ１３に関連する障害としては、ＣＸＣＬ１３とその受容体ＣＸＣＲ５との結合により引き起こされ、および／または悪化する障害が含まれる。本発明の態様は、障害の１以上の症状および／または原因を緩和または改善することによるこのような障害の処置に関する。
ＣＸＣＬ１３に対する結合要素は、リンパ濾胞異常な形成および／または発達、例えば、関節滑膜で見られるものなどの異所性リンパ濾胞を阻害または軽減するために使用可能である。結合要素は、ＣＸＣＬ１３−ＣＸＣＲ５シグナル伝達により媒介される、濾胞へのＢ細胞および／または樹状細胞および／または濾胞性ＢヘルパーＴ細胞の補充を阻害もしくは軽減することができ；および／または濾胞性Ｂ細胞による免疫グロブリンの産生を軽減することができ；および／またはＢ細胞のサイトカイン産生および／またはＴ細胞の活性化を阻害もしくは軽減することができる。結合要素はまた、異常な骨および／または軟骨の破壊を阻害または軽減するために使用可能である。
よって、結合要素は異常なまたは異所性のリンパ濾胞に関連する疾病または障害を処置するために使用可能である。異所性リンパ濾胞に関連する障害としては、関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythmatosis)(ＳＬＥ)、自己免疫性甲状腺疾患(例えば、グレーブス病、橋本甲状腺炎)、慢性感染、例えば、ライム神経ボレリア症およびＱｕｉｌｔｙ効果を特徴とする急性心臓拒絶症が含まれる。
例えば、炎症関節滑膜は一般に、胚中心を含む異所性リンパ濾胞；炎症性細胞浸潤；Ｂ細胞の自己抗体およびサイトカインの産生；Ｔ細胞のＢ細胞活性化；および／または骨および軟骨の破壊を特徴とする。結合要素は本明細書に記載されているように異所性濾胞の形成を混乱させ、よって、Ｂ細胞自己抗体の産生および／または滑膜炎症を阻害し得る。よって、結合要素は、関節リウマチ(ＲＡ)および／または変形性関節症などの関節障害の処置に使用可能である。
本発明の結合要素は、骨および／または関節の疾病または障害、特に、骨および／または軟骨の破壊および／またはリモデリングに関連する疾病または障害、例えば、骨または軟骨の異常なターンオーバーの処置に使用可能である。例えば、結合要素は、関節リウマチおよび／または変形性関節症を処置するために使用可能である。
本発明の結合要素は、リンパ球(例えば、Ｂおよび／またはＴ細胞)の走化性を阻害するために使用可能であり、従って、ウイルス感染(例えば、ＨＩＶ感染)および白血病(例えば、Ｔ細胞系急性リンパ性白血病ならびにＢ細胞系急性および慢性リンパ性白血病)などのリンパ球の走化性に関連する障害を処置するために使用可能である。
本発明の結合要素は、リンパ腫の増殖を阻害するために使用可能であり、従って、白血病(例えば、Ｔ細胞系急性リンパ性白血病ならびにＢ細胞系急性および慢性リンパ性白血病)などのリンパ腫の増殖に関連する障害を処置するために使用可能である。
ＣＸＣＬ１３に対する結合要素は、本明細書に記載されているように、リンパ濾胞の異常な形成および／または発達、例えば、異所性リンパ濾胞を阻害するため、異常な骨および／または軟骨の破壊および／またはリモデリングを阻害するため、および／またはリンパ球の走化性および／またはリンパ腫の増殖を阻害するために使用可能である。よって、本発明は、それを必要とする患者に有効量の本発明の１以上の結合要素を単独で、またはリンパ濾胞の異常な形成および／または発達、例えば、異所性リンパ濾胞、異常な骨および／または軟骨の破壊および／またはリモデリング、および／またはリンパ球の走化性および／またはリンパ腫の増殖が阻害されるような当技術分野で公知の、または本明細書に記載の適当な別の薬剤と組み合わせた治療計画で投与することを含む、リンパ濾胞の異常な形成および／または発達、例えば、異所性リンパ濾胞を阻害する方法、異常な骨および／または軟骨の破壊および／またはリモデリングを阻害する方法、および／またはリンパ球の走化性および／またはリンパ腫の増殖を阻害する方法を提供する。
本発明の結合要素は、例えば、ＣＸＣＬ１３のレベルが変更される、例えば、正常なレベルよりも高められる、ＣＸＣＬ１３に関連する疾病または障害の診断に使用可能である。結合要素は、例えば、関節リウマチ、シェーグレン症候群、ＨＩＶ、重症筋無力症、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫および伝達性海綿状脳症(ＴＳＥ)を含む、本明細書に記載の１以上の疾病または障害の診断に使用可能である。
ある特定の障害におけるＣＸＣＬ１３の関与の証拠は以下および本明細書の他所に記載されている。加えて、本明細書に示されているデータはさらに、本発明の結合要素が、これらの障害の予防処置および重篤度の軽減を含む、このような障害の処置に使用可能であることを示す。よって、本発明は、それを必要とする患者に有効量の本発明の１以上の結合要素を単独で、または上記障害のいずれかの少なくとも１つの症状の重篤度が軽減されるような当技術分野で公知の、または本明細書に記載の適当な別の薬剤と組み合わせた治療計画で投与することを含む、本明細書に記載の障害のいずれかの少なくとも１つの症状を処置する、または重篤度を軽減する方法を提供する。
末梢リンパ器官の発達および先天免疫におけるＣＸＣＬ１３の役割の証拠は、本明細書の他所に一部記載されている。
これに加え、ヒトの関節リウマチ(ＲＡ)の病因におけるＣＸＣＬ１３の役割を示す数系列の証拠がある、例えば、ＣＸＣＬ１３ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現はＲＡ滑膜で上昇し［６８］、ＲＡ滑膜におけるＣＸＣＬ１３タンパク質のレベルと疾病の重篤度の間には正の相関がある［６９］。本発明者らはまた、ＲＡ患者の血清および滑液中で高いレベルのＣＸＣＬ１３が測定されたことを見出したが、これは本明細書に記載されているように本発明の結合要素がＲＡを診断する方法に使用可能であることを示す。
炎症滑膜は炎症性細胞の浸潤とリンパ系組織に似ている組織化されたリンパ球凝集物の存在を特徴とする。これらの異所性リンパ構造は、ＦＤＣおよび高内皮細静脈(ＨＥＶ)の存在を含む胚中心の特徴を含む。胚中心は、Ｂ細胞の血漿細胞への分化とリウマチ因子などの高親和性抗体の生成を支える微小環境を提供する［７０］。ＲＡ滑膜におけるＣＸＣＬ１３タンパク質は胚中心内のＦＤＣおよび細胞浸潤中のマクロファージに免疫局在していた［７０］。ＲＡ病巣では、ＣＸＣＬ１３は異所性リンパ濾胞の形成および胚中心応答の発達を強く予測する(Takemura, S. et al. J. Immunol. 167: 1072-1080, 2001)。
ＲＡにおけるＣＸＣＬ１３の役割は、in vivoにおける疾病の動物モデルからの証拠によりさらに裏付けられる。ＣＸＣＬ１３中和抗体の予防的投与は、マウスのコラーゲン誘導関節炎(ＣＩＡ)において疾病の重篤度を軽減するとともに、関節炎の関節への炎症性細胞の浸潤を軽減し、軟骨および骨の糜爛程度を軽減する［７２］。ＣＩＡモデルでは、抗ＣＸＣＬ１３抗体で処置したマウスの脾臓および関節双方の濾胞が含む胚中心は少なく、その胚中心は対照マウスの場合に比べて小さい［７２］。
他の研究では、ＣＸＣＲ５を欠損したマウスはアジュバント誘発関節炎(ＡＩＡ)モデルで発症する重篤度が低く、滑膜性炎症および関節破壊の軽減を伴うことが示されている(Hartmann, S. et al, European Congress on Immunology, abstract 2672, 2006)。またこの研究では、組織化された胚中心の形成、抗抗原抗体および抗原誘発Ｔ細胞増殖応答のレベルも低減された。
また、骨および軟骨のターンオーバーにおけるＣＸＣＬ１３の役割も、in vitroにおける培養軟骨細胞および骨芽細胞からの証拠によって実証されている。ＣＸＣＲ５は変形性関節症(ＯＡ)患者の関節軟骨から単離された軟骨細胞で発現される。これらの軟骨細胞を培養条件下、ＣＸＣＬ１３で処置すると、マトリックスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)およびカテプシンＢの放出が誘発されるとともに増殖も誘発される［７３］。ＣＸＣＬ１３はまた、ＯＡ患者に由来する培養骨芽細胞の増殖およびインターロイキン−１(ＩＬ−１)ｍＲＮＡの発現も誘発する［７４］。培養骨芽細胞からのＣＸＣＬ１３の基本分泌もまた、ＩＬ−１処置により増強され得る［７５］。関節手術を受けているＲＡ患者から採取した骨サンプルでは、ＣＸＣＬ１３タンパク質は、リンパ系新生の特徴を含む骨髄の単核細胞凝集物に免疫局在している［７６］。
ＣＸＣＲ５受容体は、濾胞性ＢヘルパーＴ細胞(ＴＦＨ)と呼ばれる、Ｂ細胞ヘルパー機能を有する記憶Ｔ細胞のサブセットで発現される。ＣＸＣＬ１３はヒト扁桃から単離されたＣＸＣＲ５発現するＴＦＨ細胞の走化性を誘発し［７７］、一方、二次リンパ器官では、ＣＸＣＲ５陽性ＴＦＨ細胞がＢ細胞濾胞および胚中心に局在し、そこで免疫グロブリンの生産を支える［７８］。胚中心から単離されてすぐのＴＦＨ細胞は低レベルのＣＸＣＬ１３しか分泌しないが、これはＴＣＲおよびＣＤ２８によって刺激した後に有意に高まる(Kim, CH. et al. Blood, 104: 1952-1960, 2004)。
ＣＸＣＲ５を発現し、ＣＸＣＬ１３に応答してリンパ濾胞に局在する樹状細胞のサブセットが同定されている［７９］。この応答は、濾胞性間質細胞によるＣＸＣＬ１３の発現を刺激し、ＣＸＣＲ５陽性細胞を濾胞へ補充するのに必要な走化性勾配を確立するＢ細胞由来膜結合リンホトキシンに依存する。
Ｂ細胞輸送の阻害は臨床上先例が無いが、ＲＡ患者におけるＢ細胞枯渇療法の有効性については臨床先例がある［８０］。キメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を用いたＢ細胞枯渇が有効であり、十分な耐用性があり、患者は１回の処置コースの後、数ヶ月〜数年の範囲の持続的緩解期間を受ける。臨床的再発は血清自己抗体の処置前レベルへの復帰に相関していることから、自己抗体レベルの低下がこのＢ細胞枯渇の成功の重要な機構である［８１］。自己抗体の産生に加え、Ｂ細胞はサイトカインの産生、および抗原提示によるＴ細胞の活性化を介してＲＡの進行に寄与すると考えられる。
ＣＸＣＬ１３中和によるＢ細胞輸送の阻害はＲＡの処置のための新規なアプローチである。ＣＸＣＬ１３の中和は自己抗体の産生と、ＲＡ滑膜における異所性濾胞および胚中心反応の混乱による滑膜性炎症の双方を阻害する可能性を有する。ＣＸＣＬ１３の中和はまた、直接的または間接的機構により骨および軟骨の破壊を防ぐことによる付加的利益も提供し得る。
ＨＩＶにおいても高レベルのＣＸＣＬ１３が記載されている(Widney, DP. et al. J. Int. Cyt. Res. 25: 702-706, 2005)。伝達性海綿状脳症(ＴＳＥ)のサロゲートマーカーとしてのＣＸＣＬ１３の使用も報告されている(ＥＰ１７０３２８２Ａ１)。
本発明の結合要素は以下のいずれかの処置に使用可能である。
１. 呼吸器系：気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、外因性喘息、運動性喘息、薬物性喘息(アスピリン性およびＮＳＡＩＤ性喘息を含む)および塵埃喘息を含む喘息(間欠性と持続性の双方、あらゆる重症度のもの)、および他の原因の気道過敏感反応などの気道の閉塞疾患；慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)；感染性気管支炎および好酸球性気管支炎を含む気管支炎；気腫；気管支拡張症；嚢胞性繊維症；類肉腫症；農夫肺および関連の疾患；過敏性肺炎；潜源性繊維性肺胞炎、特発性間質性肺炎、抗新生物療法合併繊維症ならびに結核およびアスペルギルス症および他の真菌感染を含む慢性感染などの肺繊維症；肺移植合併症；肺血管の血管炎および血栓性疾患、および肺高血圧；気道の炎症症状および分泌症状に関連する慢性的な咳および医原性の咳の処置を含む鎮咳活性；薬物性鼻炎および血管運動性鼻炎を含む急性および慢性鼻炎；神経性鼻炎(枯草熱)を含む通年性鼻炎および季節性アレルギー性鼻炎；鼻ポリープ；風邪、および呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、コロナウイルス(ＳＡＲＳを含む)およびアデノウイルスによる感染を含む急性ウイルス感染；
２. 骨および関節：変形性関節症／変形性関節症に関連する、またはそれらを含む関節炎疹(原発性および続発性の双方、例えば先天性股関節形成異常)；頸椎および腰椎の脊椎炎、ならびに腰痛および頸部痛；関節リウマチおよびＳｔｉｌｌ病；強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎および未分類脊椎関節症を含む血清反応陰性脊椎関節症；敗血性関節炎ならびにＰｏｔｔｓ病およびＰｏｎｃｅｔ症候群を含む結核などの他の感染関連の関節症および骨疾患；尿酸痛風、ピロリン酸カルシウム沈着症、ならびにカルシウムアパタイト関連の腱、滑液包および滑膜の炎症を含む急性および慢性結晶誘発性滑膜炎；ベーチェット病；原発性および続発性シェーグレン症候群；全身性硬化症および局部的硬皮症；全身性紅斑性狼瘡、混合性結合組織病、および未分類結合組織病；皮膚筋炎および多発性筋炎を含む炎症性筋炎；リウマチ性多発筋痛症；関節配置によらず特発性の炎症性関節炎疹および関連の症候群、ならびにリウマチ熱およびその全身合併症を含む若年性関節炎；巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、チャーグ−ストラウス症候群、結節性多発性動脈炎、顕微鏡的多発動脈炎、ならびにウイルス感染、過敏感反応、寒冷グロブリン、およびパラプロテインに関連する動脈炎を含む動脈炎；腰痛；家族性地中海熱、マックル−ウェルズ症候群、および家族性アイルランド熱、菊池病；薬物性関節痛(arthalgias)、腱炎および筋障害；
３. 傷害(例えば、スポーツ傷害)または疾病による疼痛および筋骨格障害の結合組織リモデリング：関節症(例えば、関節リウマチ、変形性関節症、痛風または結晶性関節症)、他の関節疾患(椎間板変性または顎関節変性など)、骨リモデリング障害(骨粗鬆症、パジェット病または骨壊死など)、多発性軟骨炎、硬皮症、混合型結合組織障害、脊椎関節症または歯周病(歯周炎など)；
４. 皮膚：乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎または他の湿疹性皮膚病および遅延型過敏症反応；植物性および光線性皮膚炎；脂漏性皮膚炎、疱疹性皮膚炎、扁平苔癬、萎縮性硬化性苔癬、壊疽性膿皮症、皮膚類肉腫、円板状紅斑性狼瘡、天疱瘡、類天疱瘡、表皮水疱症、じんま疹、血管性浮腫、血管炎、中毒性紅斑、皮膚好酸球増加症、円形脱毛症、男性型脱毛症、スウィート症候群、ウェーバークリスチャン症候群、多形性紅斑；蜂巣炎(感染性および非感染性の双方)；皮下脂肪組織炎；皮膚リンパ腫、非黒色腫皮膚癌および他の形成不全病変；固定薬疹を含む薬物性障害；
５. 眼：眼瞼炎；通年性および春季性アレルギー結膜炎を含む結膜炎；虹彩炎；前部および後部ブドウ膜炎；脈絡膜炎；自己免疫疾患；網膜を侵す変性性および炎症性障害；交感神経性眼炎を含む眼炎；類肉腫症；ウイルス、真菌および細菌を含む感染症；
６. 消化管：舌炎、歯肉炎、歯周炎；逆流を含む食道炎；好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病、潰瘍性大腸炎を含む大腸炎、直腸炎、肛門掻痒症；腹腔疾患、過敏性腸症候群、および消化管から離れて作用することもある食物関連アレルギー(例えば、片頭痛、鼻炎または湿疹)；
７. 腹部：自己免疫性肝炎、アルコール性肝炎およびウイルス肝炎を含む肝炎；肝繊維症および肝硬変；胆嚢炎；膵炎(急性および慢性双方)；
８. 尿生殖器：間質性腎炎および糸球体腎炎を含む腎炎；ネフローゼ症候群；急性および慢性(間質性)膀胱炎およびハナー潰瘍を含む膀胱炎；急性および慢性尿道炎、前立腺炎、副睾丸炎、卵巣炎および卵管炎；外陰腟炎；ペーロニー病；勃起不全(男性および女性の双方)；
９. 同種移植片拒絶：例えば、腎臓、心臓、肝臓、肺、骨髄、皮膚もしくは角膜移植後、または輸血後の急性および慢性拒絶症；または慢性移植片対宿主病；
１０. ＣＮＳ：アルツハイマー病ならびにＣＪＤおよびｎｖＣＪＤなどの他の痴呆性障害；類澱粉症；多発性硬化症および他の脱髄症候群；脳のアテローム性動脈硬化症および血管炎；側頭動脈炎；重症筋無力症；内臓痛、頭痛、片頭痛、三叉神経痛、非定型顔面痛、関節痛および骨痛、癌および腫瘍の浸潤から起こる疼痛、神経因性疼痛症候群(糖尿病性神経傷害、疱疹後神経障害およびＨＩＶ関連神経障害を含む)を含む急性および慢性疼痛(中枢起源であれ末梢起源であれ、急性、間欠性または持続性)；神経類肉腫症；悪性過程、感染過程または自己免疫過程の中枢神経系および末梢神経系合併症；
１１. 橋本甲状腺炎、グレーブス病、アジソン病、真性糖尿病、特発性血小板減少性紫斑病、好酸球性筋膜炎、抗ＩｇＥ症候群、抗リン脂質抗体症候群を含む他の自己免疫疾患およびアレルギー性疾患；
１２. 後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)、らい病、セザリー症候群、および傍腫瘍症候群を含む炎症性成分または免疫成分を伴う他の疾患；
１３. 心血管：冠動脈循環および末梢循環を侵すアテローム性動脈硬化症；心膜炎；心筋類肉腫症を含む心筋炎、炎症性および自己免疫性心筋症；虚血性再潅流障害；感染性(例えば梅毒性)のものを含む心内膜炎、弁膜炎および大動脈炎；血管炎；深静脈血栓症および拡張蛇行静脈の合併症を含む、静脈炎および血栓症などの近位静脈および末梢静脈の障害；
１４. 腫瘍：前立腺、乳房、肺、卵巣、膵臓、腸および結腸、胃、皮膚および脳腫瘍を含む一般的な癌ならびに骨髄を侵す悪性疾患(白血病を含む)およびリンパ増殖系を侵す悪性疾患(ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫など)の処置；転移症および腫瘍再発および傍腫瘍症候群の予防および処置を含む；および
１５. 消化管：セリアック病、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病、潰瘍性大腸炎、顕微的大腸炎、非定型大腸炎、過敏性腸障害、過敏性腸症候群、非炎症性下痢、消化管から離れて作用する食物関連アレルギー(例えば、片頭痛、鼻炎または湿疹)。
本発明の結合要素は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、魚類、イヌ、ウシ、ヤギ、ウマなどを含む動物または疾病の動物モデルで使用可能である。ＣＸＣＬ１３／ＣＸＣＲ５シグナル伝達系を含む動物モデルは当技術分野で公知である。例えば、関節リウマチの動物モデルが知られており、例えばＣＩＡ、ＡＩＡおよび連鎖球菌細胞壁(ＳＣＷ)モデルなどがある。ＭＳの動物モデルとしては実験的自己免疫性脳脊髄炎(ＥＡＥ)マウスモデルがある。ＳＬＥのマウスモデルとしては、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスモデルおよびＮＺＢ ｘ ＮＺＷ Ｆ１(ＢＷＦ１)マウスモデルが含まれる。
よって、本発明の結合要素は、ＣＸＣＬ１３、例えば、ＣＸＣＬ１３の発現および／または活性、特に異常な産生、発現／活性を含む疾病または障害の処置において治療薬として有用である。処置方法は有効量の本発明の結合要素を、それを必要とする患者に投与し、そこでＣＸＣＬ１３の異常な発現および／または活性が低減されることを含み得る。処置方法は、(ｉ)例えば上記の診断方法を用いて異常なＣＸＣＬ１３レベルまたは活性を示す患者を特定すること、および(ｉｉ)その患者に有効量の本発明の結合要素を投与し、そこでＣＸＣＬ１３の異常な発現および／または活性が低減されることを含み得る。本発明の有効量は、ＣＸＣＬ１３の異常な発現および／または活性を低減し、その結果、処置される特定の疾病または障害の少なくとも１つの症状の重篤度を軽減または弱化するが、その疾病または障害を必ずしも治癒させる必要のない量である。
本発明はまた、ＣＸＣＬ１３の少なくとも１つの作用に拮抗作用を及ぼす方法も提供し、有効量の本発明の１以上の結合要素と接触させるか、またはそれを投与し、その結果、ＣＸＣＬ１３の少なくとも１つの作用が拮抗作用を受けることを含む。本発明の方法により拮抗作用を受け得るＣＸＣＬ１３の作用としては、ＣＸＣＲ５との結合、およびこれらの結合反応の結果として生じるいずれの下流作用も含む。よって、本発明の結合要素は、ＣＸＣＬ１３−ＣＸＣＲ５シグナル伝達、特に、異常なＣＸＣＬ１３−ＣＸＣＲ５シグナル伝達を含む疾病または障害の処置に治療薬として有用である。
よって、本発明のさらなる態様は、提供されるような結合要素の投与を含む処置方法、このような結合要素を含む医薬組成物、および投与用薬剤の製造における、例えば、結合要素を薬学上許容される賦形剤とともに処方することを含む薬剤または医薬組成物の製造方法における、このような結合要素の使用を提供する。
薬学上許容される賦形剤は、二次反応を引き起こさず、例えば、有効化合物の投与の助長、その寿命および／または身体におけるその有効性の増大、溶液中でのその溶解度の増大、あるいはまたその変換の改良を可能とする医薬組成物に入った化合物または化合物の組合せであり得る。これらの薬学上許容されるビヒクルは周知のものであり、当業者により、選択された有効化合物の性質および投与様式の関数として適合される。
本発明の結合要素は通常、結合要素に加えて少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。よって、本発明の、本発明に従って用いられる医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学上許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤または当業者に周知の他の材料を含み得る。このような材料は無毒であるべきであり、有効成分の有効性を妨げてはならない。担体または他の材料の厳密な性質は、下記に述べられるように、経口、吸入、気管内、局所的、小胞内または注射であり得る投与経路によって異なる。
本発明では、例えば単鎖ドメイン抗体分子(例えば、「ナノボディー(商標))などのような経口投与用の医薬組成物も考えられる。このような経口製剤は錠剤、カプセル剤、散剤、液剤または半固体状であり得る。錠剤はゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含み得る。液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油もしくは合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースまたは他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれ得る。
静脈内注射または罹患部位における注射では、有効成分は、発熱物質不含であり、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態である。当業者ならば、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル液注射液などの等張ビヒクルを用い、好適な溶液を調製することが十分できる。必要であれば、リン酸、クエン酸およびその他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；保存剤(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど)；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類およびその他の炭水化物(グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む)；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体)；および／またはＴＷＥＥＮ(商標)、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(商標)またはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)などの非イオン性界面活性剤を含む、保存剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤および／またはその他の添加剤が使用可能である。
本発明の結合要素は、その分子の物理化学的特性および送達経路によって、液体、半固体または固体形態で処方され得る。製剤は賦形剤、または賦形剤の組合せ、例えば、糖類、アミノ酸および界面活性剤を含み得る。液体製剤は広範囲の抗体濃度およびｐＨを含み得る。固体製剤は例えば凍結乾燥、噴霧乾燥または超臨界流体技術による乾燥によって製造され得る。抗ＣＸＣＬ１３製剤は意図する送達経路によって異なり、例えば、肺送達用の製剤は、吸入の際に肺深部への浸透を確保する物理的特性を有する粒子からなってよく；局所用製剤(例えば、瘢痕、例えば皮膚瘢痕の処置のため)は、薬剤がその作用部位に留まる時間を延長する粘度改質剤を含み得る。結合要素は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル送達系を含む徐放性製剤など、結合要素を即時放出から保護する担体を用いて調製してもよい。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用可能である。このような製剤を調製するための多くの方法が当業者に公知である［８２］。
抗ＣＸＣＬ１３処置は経口(例えば、単鎖ドメイン抗体分子(例えば、「ナノボディー(商標)」)、注射(例えば、皮下、関節内、静脈内、腹腔内、動脈内または筋肉内)、吸入、気管内、小胞内経路(膀胱への点滴)、または局所的(例えば、眼内、鼻腔内、直腸、創傷内、皮膚上)により与えることができる。処置は、パルス注入により、特に結合要素の用量を引き下げながら投与することができる。投与経路は処置の物理化学的特徴、疾病の特殊な考慮または、有効性を至適化するため、もしくは副作用を最小化するための要件によって決定され得る。１つの特定の投与経路は静脈内である。本発明の医薬組成物を投与するもう１つの経路は皮下である。抗ＣＸＣＬ１３処置は診療所での使用に限定されないと考えられる。よって、無針デバイスを用いた皮下注射も有利である。
組成物は処置される症状に応じて単独でまたは他の処置と組み合わせて、同時または逐次に投与することができる。
ＣＸＣＬ１３に対する結合要素は、併用療法の一部として、付加的な医薬成分とともに使用することができる。併用処置、特に、抗ＣＸＣＬ１３結合要素と１以上の他の薬剤との組合せは、有意な相乗作用を得るために用い得る。ＣＸＣＬ１３に対する結合要素は、本明細書に挙げられている１以上の症状の処置のために同時または逐次に、あるいは別の治療薬との組合せ製剤として投与することができる。
本発明の結合要素は、以下の薬剤の１以上と組み合わせて、またはそれらを加えて提供することができる：
・サイトカインまたはサイトカイン機能のアゴニストもしくはアンタゴニスト(例えば、サイトカインシグナル伝達経路に作用する薬剤、例えばＳＯＣＳ系のモジュレーター)、例えば、α−、β−および／またはγ−インターフェロン；インスリン様増殖因子Ｉ型(ＩＧＦ−１)、その受容体および関連の結合タンパク質；インターロイキン(ＩＬ)、例えば、１以上のＩＬ−１〜３３および／またはインターロイキンアンタゴニストまたは阻害剤、例えば、アナキンラ；インターロイキンファミリー要素の受容体の阻害剤またはこのような受容体の特異的サブユニットの阻害剤、腫瘍壊死因子α(ＴＮＦ−α)阻害剤、例えば、抗ＴＮＦモノクローナル抗体(例えば、インフリキシマブ(infliximab)、アダリムマブ(adalimumab)および／またはＣＤＰ−８７０)および／またはＴＮＦ受容体アンタゴニスト、例えば、免疫グロブリン分子(エタネルセプト(etanercept)など)および／またはペントキシフィリンなどの低分子量薬剤；
・Ｂ細胞のモジュレーター、例えば、Ｂリンパ球を標的とするモノクローナル抗体(ＣＤ２０(リツキシマブ)またはＭＲＡ−ａＩＬｌ６Ｒまたはベリムマブ(belimumab)など)またはＴリンパ球(例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ(アバタセプト(Abatacept))、ＨｕＭａｘ Ｉｌ−１５)；
・Ｂ細胞の活性化、突然変異または生存のモジュレーター(アタシセプト(Atacicept)など)；
・免疫機能のモジュレーター、例えば、リンホトキシンＬＩＧＨＴ経路のアンタゴニスト(ＬＴＢＲ−Ｆｃなど)；
・破骨細胞活性を阻害するモジュレーター、例えば、ＲＡＮＫＬに対する抗体；
・ケモカインまたはケモカイン受容体機能のモジュレーター、例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ２Ａ、ＣＣＲ２Ｂ、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０およびＣＣＲ１１(Ｃ−Ｃファミリーに対する)；ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５およびＣＸＣＲ６(Ｃ−Ｘ−Ｃファミリーに対する)ならびにＣ−Ｘ３−Ｃファミリーに対するＣＸ３ＣＲ１のアンタゴニスト；
・マトリックスメタロプロテアーゼ(ＭＭＰ)の阻害剤、すなわち、１以上のストロメライシン、コラゲナーゼおよびゼラチナーゼ、ならびにアグレカナーゼ、特にコラゲナーゼ−１(ＭＭＰ−１)、コラゲナーゼ−２(ＭＭＰ−８)、コラゲナーゼ−３(ＭＭＰ−１３)、ストロメライシン−１(ＭＭＰ−３)、ストロメライシン−２(ＭＭＰ−１０)および／またはストロメライシン−３(ＭＭＰ−１１)および／またはＭＭＰ−９および／またはＭＭＰ−１２、例えば、ドキシサイクリンなどの薬剤；
・ロイコトリエン生合成阻害剤、５−リポキシゲナーゼ(５−ＬＯ)阻害剤または５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(ＦＬＡＰ)アンタゴニスト、例えばジレウトン；ＡＢＴ−７６１；フェンレウトン(fenleuton)；テポキサリン(tepoxalin)；Ａｂｂｏｔｔ−７９１７５；Ａｂｂｏｔｔ−８５７６１；Ｎ−(５−置換)−チオフェン−２−アルキルスルホンアミド；２,６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノールヒドラゾン；メトキシテトラヒドロピラン、例えばＺｅｎｅｃａ ＺＤ−２１３８；化合物ＳＢ−２１０６６１；ピリジニル−置換２−シアノナフタレン化合物、例えば、Ｌ−７３９,０１０；２−シアノキノリン化合物、例えば、Ｌ−７４６,５３０；インドールおよび／またはキノリン化合物、例えば、ＭＫ−５９１、ＭＫ−８８６および／またはＢＡＹ ｘ １００５；
・Ｌ−６５１,３９２などのフェノチアジン−３−１；ＣＧＳ−２５０１９ｃなどのアミジノ化合物；オンタゾラスト(ontazolast)などのベンゾキサラミン；ＢＩＩＬ ２８４／２６０などのベンゼンカルボキシイミドアミド；ならびにザフィルルカスト(zafirlukast)、アブルカスト(ablukast))、モンテルカスト(montelukast)、プランルカスト(pranlukast)、ベルルカスト(verlukast)(ＭＫ−６７９)、ＲＧ−１２５２５、Ｒｏ−２４５９１３、イラルカスト(iralukast)(ＣＧＰ ４５７１５Ａ)およびＢＡＹ ｘ ７１９５などの化合物からなる群から選択されるロイコトリエン(ＬＴ)Ｂ４、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４の受容体アンタゴニスト；
・メチルキサンタニン、例えば、テオフィリンおよび／またはアミノフィリン；および／または選択性ＰＤＥイソ酵素阻害剤、例えば、ＰＤＥ４阻害剤および／またはイソ型ＰＤＥ４Ｄの阻害剤および／またはＰＤＥ５の阻害剤などのホスホジエステラーゼ(ＰＤＥ)阻害剤；
・ヒスタミン１型受容体アンタゴニスト、例えば、セチリジン(cetirizine)、ロラタジン(loratadine)、デスロラタジン(desloratadine)、フェキソフェナジン(fexofenadine)、アクリバスチン(acrivastine)、テルフェナジン(terfenadine)、アステミゾール(astemizole)、アゼラスチン(azelastine)、レボカバスチン(levocabastine)、クロロフェニラミン(chlorpheniramime)、プロメタジン(promethazine)、サイクリジン(cyclizine)および／またはミゾラスチン(mizolastine)(一般に経口、局所または非経口適用される)；
・プロトンポンプ阻害剤(例えば、オメプラゾール)または胃保護ヒスタミン２型受容体アンタゴニスト；
・ヒスタミン４型受容体のアンタゴニスト；
・プロピルヘキセドリン、フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、エフェドリン、シュードエフェドリン、塩酸ナファゾリン、塩酸オキシメタゾリン、塩酸テトラヒドロゾリン、塩酸キシロメタゾリン、塩酸トラマゾリンおよび塩酸エチルノルエピネフリンなどのα−１／α−２アドレノセプターアゴニスト血管収縮交感神経作用薬；
・抗コリン作用薬、例えば、ムスカリン性受容体(Ｍ１、Ｍ２およびＭ３)アンタゴニスト、例えば、アトロピン、ヒヨスチン、グリコピロレート、臭化イプラトロピウム、臭化チオトロピウム、臭化オキシトロピウム、ピレンゼピンおよびテレンゼピン；
・β−アドレノセプターアゴニスト(β受容体サブタイプ１〜４を含む)、例えば、イソプレナリン、サルブタモール、フォルモテロール、サルメテロール、テルブタリン、オルシプレナリン、メシル酸ビトルテロールおよび／またはピルブテロール、例えば、そのキラル鏡像異性体；
・クロモン、例えば、クロモグリク酸ナトリウムおよび／またはネドクロミルナトリウム；
・グルココルチコイド、例えば、フルニソリド、トリアムシノロンアセトニド、二プロピオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、プロピオン酸フルチカゾン、シクレソニドおよび／またはフロ酸モメタゾン；
・核ホルモン受容体を調節する薬剤、例えば、ＰＰＡＲ；
・免疫グロブリン(Ｉｇ)機能を調節するＩｇまたはＩｇ調製物またはアンタゴニストまたは抗体、例えば、抗ＩｇＥ(例えば、オマリズマブ(omalizumab))；
・その他の全身適用または局所適用抗炎症薬、例えば、サリドマイドまたはその誘導体、レチノイド、ジトラノールおよび／またはカルシポトリオール；
・アミノサリチレートとスルファピリジン(例えば、スルファサラジン、メサラジン、バルサラジドおよびオルサラジン)との；免疫調節薬、例えば、チオプリンとの；コルチコステロイド、例えば、ブデソニドとの組合せ；
・抗菌薬、例えば、ペニシリン誘導体、テトラサイクリン、マクロライド、β−ラクタム、フルオロキノロン、メトロニダゾールおよび／または吸入アミノグリコシド；および／または抗ウイルス薬、例えば、アシクロビル(acyclovir)、ファムシクロビル(famciclovir)、バラシクロビル(valaciclovir)、ガンシクロビル(ganciclovir)、シドフォビル(cidofovir)；アマンタジン(amantadine)、リマンタジン(rimantadine)；リバビリン(ribavirin)；ザナマビル(zanamavir)および／またはオセルタマビル(oseltamavir)；プロテアーゼ阻害剤、例えば、インジナビル(indinavir)、ネルフィナビル(nelfinavir)、リトナビル(ritonavir)および／またはサキナビル(saquinavir)；ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えば、ジダノシン(didanosine)、ラミブジン(lamivudine)、スタブジン(stavudine)、ザルシタビン(zalcitabine)、ジドブジン(zidovudine)；非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えば、ネビラピン(nevirapine)、エファビレンズ(efavirenz)；
・心血管薬、例えば、カルシウムチャネル遮断薬、β−アドレノセプター遮断薬、アンギオテンシン変換酵素(ＡＣＥ)阻害剤、アンギオテンシン−２受容体アンタゴニスト；脂質降下薬、例えば、スタチンおよび／またはフィブラート；血液細胞形態のモジュレーター、例えば、ペントキシフィリン；血栓溶解薬および／または抗凝固薬、例えば、血小板凝集阻害剤；
・ＣＮＳ薬、例えば、抗鬱薬(例えば、セルトラリン)、抗パーキンソン病薬(例えば、デプレニル、Ｌ−ドーパ、ロピニロール(ropinirole)、プラニペキソール(pramipexole)；ＭＡＯＢ阻害剤、例えば、セレジン(selegine)およびラサギリン(rasagiline)；ｃｏｍＰ阻害剤、例えば、タスマール(tasmar)；Ａ−２阻害剤、ドーパミン再取り込み阻害剤、ＮＭＤＡアンタゴニスト、ニコチンアゴニスト、ドーパミンアゴニストおよび／またはニューロン一酸化窒素合成酵素阻害剤)および抗アルツハイマー病薬、例えば、ドネペジル(donepezil)、リバスチグミン(rivastigmine)、タクリン(tacrine)、ＣＯＸ−２阻害剤、プロペントフィリン(propentofyllin)またはメトリフォネート(metrifonate)；
・急性および慢性疼痛の処置のための薬剤、例えば、中枢または末梢作用性鎮痛薬、例えば、オピオイド類似体または誘導体、カルバマゼピン(carmazepine)、フェニトイン(phenytoin)、バルプロ酸ナトリウム、アミトリプチリン(amitryptiline)または他の抗鬱薬、パラセタモール(paracetamol)または非ステロイド系抗炎症薬；
・非経口適用または局所適用(吸入を含む)局部麻酔薬、例えば、リグノカインまたはその類似体；
・抗骨粗鬆症薬、例えば、ホルモン剤、例えば、ラロキシフェン(raloxifene)、またはビホスホネート、例えば、アレンドロネート(alendronate)；
・(ｉ)トリプターゼ阻害剤；(ｉｉ)血小板活性化因子(ＰＡＦ)アンタゴニスト；(ｉｉｉ)インターロイキン変換酵素(ＩＣＥ)阻害剤；(ｉｖ)ＩＭＰＤＨ阻害剤；(ｖ)ＶＬＡ−４アンタゴニストを含む接着分子阻害剤；(ｖｉ)カテプシン；(ｖｉｉ)キナーゼ阻害剤、例えば、チロシンキナーゼの阻害剤(例えば、Ｂｔｋ、Ｉｔｋ、Ｊａｋ３ ＭＡＰの阻害剤の例としては、ゲフィチニブ、メシル酸イマチニブが含まれる)、セリン／トレオニンキナーゼの阻害剤(例えば、ＭＡＰキナーゼ、例えば、ｐ３８、ＪＮＫ、プロテインキナーゼＡ、ＢおよびＣ、ならびにＩＫＫの阻害剤)または細胞周期の調節に関与するキナーゼ(例えば、サイクリン依存性キナーゼ(cylin dependent kinase)の阻害剤；(ｖｉｉｉ)グルコース−６リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤；(ｉｘ)キニン−Ｂ１−および／またはＢ２−受容体アンタゴニスト；(ｘ)抗痛風薬、例えば、コルヒチン；(ｘｉ)キサンチンオキシダーゼ阻害剤、例えば、アロプリノール(allopurinol)；(ｘｉｉ)尿酸排泄薬、例えば、プロベネシド(probenecid)、スルフィンピラゾン(sulfinpyrazone)および／またはベンズブロマロン(benzbromarone)；(ｘｉｉｉ)成長ホルモン分泌促進薬；(ｘｉｖ)トランスフォーミング増殖因子(ＴＧＦβ)；(ｘｖ)血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)；(ｘｖｉ)繊維芽細胞増殖因子、例えば、塩基性繊維芽細胞増殖因子(ｂＦＧＦ)；(ｘｖｉｉ)顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)；(ｘｖｉｉｉ)カプサイシンクリーム；(ｘｉｘ)タキキニンＮＫ１および／またはＮＫ３受容体アンタゴニスト、例えば、ＮＫＰ−６０８Ｃ、ＳＢ−２３３４１２(タルネタント(talnetant))および／またはＤ−４４１８；(ｘｘ)エラスターゼ阻害剤、例えば、ＵＴ−７７および／またはＺＤ−０８９２；(ｘｘｉ)ＴＮＦ−α変換酵素阻害剤(ＴＡＣＥ)；(ｘｘｉｉ)誘発性一酸化窒素シンターゼ(ｉＮＯＳ)阻害剤または(ｘｘｉｉｉ)ＴＨ２細胞上で発現される化学遊走物質受容体ホモ分子(ＣＲＴＨ２アンタゴニスト)；(ｘｘｉｖ)Ｐ３８の阻害剤、(ｘｘｖ)Ｔｏｌｌ様受容体(ＴＬＲ)の機能を調節する薬剤および(ｘｘｖｉ)プリン受容体の活性を調節する薬剤、例えば、Ｐ２Ｘ７；(ｘｘｖｉｉ)転写因子活性化の阻害剤、例えば、ＮＦｋＢ、ＡＰＩおよび／またはＳＴＡＴＳ。
阻害剤は特異的であっても、または混合型阻害剤、例えば、上述の１を超える分子(例えば、受容体)または分子種を標的とする阻害剤であり得る。
結合要素はまた、同時投与で、または免疫複合体も形態で、化学療法薬または別のチロシンキナーゼ阻害剤と併用可能である。該抗体のフラグメントもまた、組換え機構または生化学的カップリングおよびその後の上記抗体の特異性と、ＣＸＣＬ１３が関連する活性に関与する他の分子を認識し得る他の抗体の特異性との結合によって得られる二重特異性抗体において使用可能である。
炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)または乾癬の処置のためには、本発明の結合要素を、局所適用であれ全身適用であれ非選択性シクロオキシゲナーゼ(ＣＯＸ)−１／ＣＯＸ−２阻害剤(例えば、ピロキシカム(piroxicam)、ジクロフェナク(diclofenac)、プロピオン酸(例えば、ナプロキセン(naproxen)、フルビプロフェン(flurbiprofen)、フェノプロフェン(fenoprofen)、ケトプロフェン(ketoprofen)およびイブプロフェン(ibuprofen))、フェナム酸(例えば、メフェナム酸、インドメタシン(indomethacin)、スリンダック(sulindac)、アザプロパゾン(azapropazone))、ピラゾロン(例えば、フェニルブタゾン)、サリチレート(例えば、アスピリン)；選択性ＣＯＸ−２阻害剤(例えば、メロキシカム(meloxicam)、セレコキシブ(celecoxib)、ロフェコキシブ(rofecoxib)、バルデコキシブ(valdecoxib)、ルマロコキシブ(lumarocoxib)、パレコシキブ(parecoxib)およびエトリコキシブ(etoricoxib))；一酸化窒素供与体阻害シクロオキシゲナーゼ(ＣＩＮＯＤ)；グルココルチコステロイド(局所投与されるものであれ、経口投与されるものであれ、筋肉内投与されるものであれ、静脈内投与されるものであれ、あるいは関節内経路により投与されるものであれ)；メトトレキサート(methotrexate)、レフルノミド(leflunomide)；ヒドロキシクロロキン(hydroxychloroquine)、ｄ−ペニシラミン(de-penicillamine)、オーラノフィン(auranofin)またはその他の非経口または経口金製剤；鎮痛薬；ジアセレイン(diacerein)；関節内治療薬(例えば、ヒアルロン酸誘導体)；および栄養サプリメント(例えば、グルコサミン)を含む非ステロイド系抗炎症薬(以下、ＮＳＡＩＤ)などの１以上の薬剤と組み合わせればよい。
本発明の結合要素はまた、癌処置のための既存の治療薬と組み合わせて使用することもできる。組み合わせて用いられる好適な薬剤としては下記のものが挙げられる。
(ｉ)グリベック(Gleevec)(メシル酸イマチニブ)、アルキル化剤(例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファンまたはニトロソ尿素)；代謝拮抗物質(例えば、５−フルオロウラシルおよびテガフールのようなフルオロピリミジン、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビンおよびパクリタキセルなどの抗葉酸薬)；抗腫瘍性抗生物質(例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンなどのアントラサイクリン)；細胞分裂抑制薬(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド、ならびにタキソールおよびタキソテールなどのタキソイド)；およびトポイソメラーゼ阻害剤(例えば、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、トポテカンおよびカンプトテシンなどのエピポドフィロトキシン)といった、医学的腫瘍学に用いられる抗増殖／抗新生物薬およびその組合せ
(ｉｉ)抗エストロゲン(例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン)、エストロゲン受容体ダウンレギュレーター(例えば、フルベストラント)、抗アンドロゲン作用薬(例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミドおよび酢酸シプロテロン)、ＬＨＲＨアンタゴニストまたはＬＨＲＨアゴニスト(例えば、ゴセレリン、ロイプロレリンおよびブセレリン)、プロゲストゲン(例えば、酢酸メゲストロール)、アロマターゼ阻害剤(例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾールおよびエキセメスタン)およびフィナステリドなどの５α−レダクターゼ阻害剤といった細胞増殖抑制剤
(ｉｉｉ)癌細胞の浸潤を阻害する薬剤(例えば、マリマスタットのようなメタロプロテイナーゼ阻害剤およびウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体機能の阻害剤)
(ｉｖ)増殖因子機能の阻害剤、例えば、このような阻害剤としては、増殖因子抗体、増殖因子受容体抗体(例えば、抗ｅｒｂｂ２抗体トラスツズマブ、または抗ｅｒｂｂ１抗体セツキシマブ［Ｃ２２５］)、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤およびセリン／トレオニンキナーゼ阻害剤、例えば、上皮細胞増殖因子ファミリーの阻害剤(例えば、ＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤、例えば、Ｎ−(３−クロロ−４−フルオロフェニル)−７−メトキシ−６−(３−モルホリノプロポキシ)キナゾリン−４−アミン(ゲフィチニブ、ＡＺＤ１８３９)、Ｎ−(３−エチニルフェニル)−６,７−ビス(２−メトキシエトキシ)キナゾリン−４−アミン(エルロチニブ、ＯＳＩ-７７４)および６−アクリルアミド−Ｎ−(３−クロロ−４−フルオロフェニル)−７−(３−モルホリノプロポキシ)キナゾリン−４−アミン(ＣＩ １０３３)など)、例えば、血小板由来増殖因子ファミリーの阻害剤、および例えば、肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤が含まれる。
(ｖ)血管内皮増殖因子の作用を阻害するもの(例えば、それぞれ出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる国際特許出願ＷＯ９７／２２５９６、ＷＯ９７／３００３５、ＷＯ９７／３２８５６およびＷＯ９８／１３３５４に開示されている化合物などの抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ)、ならびに別の機構により働く化合物(例えば、リノミド、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤またはアンギオスタチン)といった抗脈管形成薬
(ｖｉ)コンブレタスタチンＡ４、ならびに国際特許出願ＷＯ９９／０２１６６、ＷＯ００／４０５２９、ＷＯ００／４１６６９、ＷＯ０１／９２２２４、ＷＯ０２／０４４３４およびＷＯ０２／０８２１３(それぞれ出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる)に開示されている化合物などの血管傷害剤
(ｖｉｉ)アンチセンス治療薬、例えば、上記に挙げた標的に対するもの、例えば、ＩＳＩＳ ２５０３、抗ｒａｓアンチセンスなど
(ｖｉｉｉ)遺伝子療法アプローチ、例えば、異常なｐ５３または異常なＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２などの異常な遺伝子を置換するアプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌ニトロレダクターゼ酵素を用いるもの、および多剤耐性遺伝子療法など、患者の化学療法耐性または放射線療法耐性を高めるアプローチといったＧＤＥＰＴ(gene-directed enzyme pro-drug therapy)アプローチ
(ｉｘ)免疫療法アプローチ、例えば、インターロイキン２、インターロイキン４または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインでのトランスフェクションなど、患者の腫瘍細胞の免疫原性を高めるex vivoおよびin vivoアプローチ、Ｔ細胞のアネルギーを引き下げるアプローチ、サイトカインでトランスフェクトされた樹状細胞などのトランスフェクト免疫細胞を用いるアプローチ、サイトカインでトランスフェクトされた腫瘍細胞系統を用いるアプローチおよび抗イディオタイプ抗体を用いるアプローチ。
本発明の結合要素と１以上の上記の付加的医薬成分は薬剤の製造において使用可能である。この薬剤は個々への個別投与または組合せ投与のためのものであってよく、従って、結合要素および付加的成分を組合せ製剤または個別製剤として含み得る。個別製剤は個別投与および逐次または同時投与するために使用可能であり、例えば経口投与および非経口投与などの異なる経路によってこれら成分を投与することを可能とする。
本発明によれば、提供される組成物は哺乳類に投与し得る。投与は通常「治療上有効な量」であり、これは患者に利益を示すのに十分なものである。このような利益は少なくとも１つの症状の少なくとも改善であり得る。投与される実際の量ならびに投与の頻度およびタイムコースは、処置されるものの性質および重篤度、処置される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、その障害の経過、その組成物の送達部位、結合要素のタイプ、投与方法、投与計画および医師に知られているその他の因子によって異なる。例えば用量の判断などの処置の処方は一般的医師その他の医師の責任の範囲内であり、症状の重篤度および／または処置される疾病の進行によって異なり得る。抗体の適当な用量は当技術分野で周知である［８３、８４］。投与される薬剤のタイプに適当であれば、本明細書またはPhysician's Desk Reference (2003)に示されている特定の用量が使用可能である。本発明の結合要素の治療上有効な量または好適な用量は、そのin vitro活性と動物モデルにおけるin vivo活性を比較することによって決定することができる。マウスおよびその他の試験動物の有効用量をヒトに外挿する方法が知られている。厳密な用量は、その抗体が診断用のものであるか、予防用のものであるか、治療用のものであるか、処置される領域の大きさおよび場所、抗体の厳密な性質(例えば、完全抗体かフラグメントかダイアボディーか)および抗体と結合される任意の検出可能な標識またはその他の分子の性質を含む多数の因子によって異なる。典型的な抗体用量は全身適用では１００μｇ〜１ｇ、局所適用では１μｇ〜１ｍｇの範囲である。最初に高負荷量、続いて１回以上の低用量を投与することができる。一般に、この抗体は完全抗体、例えばＩｇＧ１イソ型である。これは成人患者の単回処置のための用量であり、小児および乳児にも比例的に調整でき、また、他の抗体形式についても分子量に比例して調整可能である。処置は、医師の判断で毎日、毎週２回、毎週または毎月の間隔で反復可能である。処置は、皮下投与では２〜４週間おき、静脈内投与では４〜８週間おきであり得る。処置は周期的であってよく、投与間の期間は約２週間またはそれ以上、例えば約３週間またはそれ以上、約４週間またはそれ以上、または約１か月である。処置は術前および／または術後に行ってもよく、および／または手術処置の解剖学的部位に直接投与または適用してもよい。
本発明の結合要素は、本明細書に記載されているようなサンプル中のＣＸＣＬ１３レベルを決定するためにex vivoで使用することができる。このような方法は一般に、サンプルと本発明の結合要素とを、結合要素とＣＸＣＬ１３との結合を可能とする条件下で接触させること、およびそのサンプルにおいて結合したＣＸＣＬ１３のレベルを測定することを含む。このＣＸＣＬ１３のレベルを好適な標準または対照と比較すればよい。
この方法は、そのサンプルが得られた、また、ＣＸＣＬ１３レベルが推定される個体におおける疾病または症状の診断または予後のために使用可能である。例えば、この方法は関節リウマチにおける疾病の重篤度を診断または予後するために使用可能であり、このような方法は、関節リウマチに罹患している、または罹患している疑いのある個体から得られた、例えば血清または滑液サンプルなどの好適なサンプル中のＣＸＣＬ１３レベルを測定することを含む。対照サンプルに比べてＣＸＣＬ１３レベルが高ければ疾病を示し、ＣＸＣＬ１３レベルと疾病の重篤度の間には正の相関がある。
アッセイの材料および方法
材料
ＣＨＯ Ｇｑｉ５細胞：Ｇタンパク質Ｇｑｉ５(配列番号１９)を発現するＣＨＯ Ｋ１細胞
ＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞またはＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５ ｃ４.４細胞：ヒトＣＸＣＲ５(配列番号１７)を安定発現するＣＨＯ Ｇｑｉ５細胞
最小必須培地(Gibco 31095)
１％非必須アミノ酸(Gibco 11140)
ＨＴＲＦ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイ用のアッセイ培地：
０.５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン(Sigma I7018)
１％非必須アミノ酸(Gibco 11140)
０.１％ＢＳＡ
を含有する最小必須培地(Gibco 31095)
ＨＴＲＦアッセイ用のｃＡＭＰ−ＸＬ６６５溶液：ＸＬ６６５(アロフィコシアニン色素、サイズ８０ｋＤ、ｃＡＭＰに直接結合)を含む溶液
ＨＴＲＦ ｃＡＭＰアッセイ用のコンジュゲート溶解バッファー
ＨＴＲＦアッセイ用の抗ｃＡＭＰユウロピウムクリプテート溶液
Ｈａｎｋｓ平衡塩溶液(Sigma H8264)
ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイ用のアッセイ培地：
５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４
０.５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン(Sigma I7018)
０.１％ＢＳＡ
を含有するＨａｎｋｓ平衡塩溶液(Sigma H8264)
ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイ用のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商標)−６４７抗ｃＡＭＰ抗体：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ(ｐＨ７.８)塩溶液、０.９％塩化ナトリウム、０.１％ＢＳＡ、０.０５％アジ化ナトリウム(保存剤)中に調製した、色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商標)−６４７で標識されたｃＡＭＰ特異的抗体
ＬＡＮＣＥ(登録商標)検出混合物
ダルベッコの改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)(Invitrogen)
Ｌ−グルタミン不含ＭＥＭ非必須アミノ酸(Invitrogen)
ＣＸＣＬ１３誘発Ｃａ２＋放出アッセイ培地：
１０％(ｖ／ｖ)熱不活化ウシ胎児血清(ＦＢＳ)(Invitrogen)
１％(ｖ／ｖ)Ｌ−グルタミン不含ＭＥＭ非必須アミノ酸(Invitrogen)
を含有するダルベッコの改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)
ＣＸＣＬ１３誘発Ｃａ２＋放出アッセイ用の色素付加溶液
ＣＸＣＬ１３誘発Ｃａ２＋放出アッセイ用のＦｌｕｏ−４ ＮＷ色素混合物
ＦＬＩＰＲバッファー：
１２５ｍＭ ＮａＣｌ
５ｍＭ ＫＣｌ
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
１.５ｍＭ ＣａＣｌ２
３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
２.５ｍＭプロベネシド(４−(ジプロピルスルファモイル)安息香酸)５ｍＭグルコース
１％(ｖ／ｖ)熱不活化ＦＢＳ
Ｂ３００.１９ ｈＣＸＣＲ５細胞：ヒトＣＸＣＲ５で安定トランスフェクトされたマウスプレＢ細胞系統
Ｂ３００.１９ ｈＣＸＣＲ５細胞を用いた走化性アッセイ用の培養培地：１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)；１％ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグルタミン(ＰＳＧ)；１％ピルビン酸ナトリウム；１.５μｇ／ｍｌピューロマイシン(puramycin)および０.１％２−β−メルカプトエタノールを含有する(ＲＰＭＩ−１６４０ Sigma、カタログ番号Ｒ０８８３)
方法
ＣＸＣＬ１３受容体リガンド結合アッセイ(ＦＭＡＴ)
ＣＸＣＬ１３受容体リガンド結合アッセイは、Microvolume Assay Technology (FMAT)を用いて、ビオチニル化ヒトＣＸＣＬ１３(Almac)とＢ３００.１９細胞(Almac)上で過剰発現されたＣＸＣＲ５受容体の間の相互作用を評価する(Dietz et al 1996, Miraglia et al 1999, Mellentin-Michelotti et al. 1999)。このアッセイはＣＸＣＬ１３：ＣＸＣＲ５相互作用の阻害に関して粗ｓｃＦｖ周辺質抽出物または精製ｓｃＦｖをスクリーニングするために使用可能である。
選択の産物は、２００ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ７.４、０.５Ｍスクロース中に調製した希釈粗ｓｃＦｖ含有周辺質抽出物としてスクリーニングした。サンプルおよび試薬の希釈は全て、０.０２５％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)および０.０１％アジ化ナトリウムを含有するＨａｎｋｓ平衡塩溶液(Sigma H8264)で行った。希釈サンプル(２０μＬ)を、３８４ウェルの底が透明な非結合表面プレート(Costar 3655)にて、１ｎＭビオチニル化ヒトＣＸＣＬ１３、２５ｎｇ／ｍＬストレプトアビジンＦＭＡＴ−ブルー(Applied Biosystems 4362492)およびＢ３００.１９ ＣＸＣＲ５細胞(４０００細胞／ウェル)とともに総アッセイ量５０μＬで、室温で２時間インキュベートした。全結合対照および非特異的結合(ＮＳＢ)対照を、それぞれアッセイバッファーまたは最終アッセイ濃度３ｎＭの抗ヒトＣＸＣＬ１３モノクローナル抗体(R&D Systems MAB801)を用いて設定した。プレートをApplied Biosystems Cellular Detection System 8200で読み取り、Wang Goldmanアルゴリズムを用い、ＦＬ１＜１６００、サイズ＜１５およびカラー比率＜０.４のゲートの開閉でデータを分析した。
式１(式中、ＮＳＢ ＦＬ１合計は非特異的結合対照ウェルの平均値であり、全結合ＦＬ１合計は全結合対照ウェルの平均値である)を用い、ＦＬ１合計データから特異的結合％を求めた。
Figure 2010519280
ＨＴＲＦ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイ
細胞の３’、５’サイクリックアデノシン一リン酸(ｃＡＭＰ)レベルは、アデノシン三リン酸(ＡＴＰ)からｃＡＭＰおよびピロリン酸塩への変換を触媒するアデニリルシクラーゼ酵素ファミリーの活性化によって上昇する。ＣＸＣＬ１３とそのＧタンパク質共役受容体ＣＸＣＲ５との結合はアデニリルシクラーゼ活性のダウンレギュレーションをもたらし、ゆえにアデニリルシクラーゼを阻害するＧタンパク質サブユニットＧαｉの放出を介して細胞ｃＡＭＰレベルの低下をもたらし得る。
本発明者らは、細胞ＡＭＰレベルの測定のためにＨＴＲＦ(登録商標)(均質時間分解蛍光)ｃＡＭＰアッセイキット(CisBio International 62AM4PEC)を用いる。ＣＸＣＬ１３ ＨＴＲＦ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイでは、ＣＸＣＲ５を安定発現するＣＨＯ Ｇｑｉ５細胞におけるＣＸＣＬ１３により媒介されるｃＡＭＰレベルの低下が評価される。
ＣＸＣＬ１３応答がＨＴＲＦ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイキットの直線的検出範囲に確実に入るように、アデニリルシクラーゼアクチベーターである水溶性フォルスコリン誘導体ＮＫＨ４７７(Tocris Cookson 1603)によるこれらの細胞の同時刺激を行う。
このアッセイは、ＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞における、ＣＸＣＬ１３により媒介される細胞ｃＡＭＰレベルの調節を阻害するｓｃＦｖの能力を決定するために使用可能である。
ＳｃＦｖサンプル、試薬およびＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞は、特に断りのない限り、アッセイ培地(０.５ｍＭ３−イソブチル−１−メチルキサンチン(Sigma I7018)、１％非必須アミノ酸(Gibco 11140)および０.１％ＢＳＡを含有する最小必須培地(Gibco 31095))で調製した。ＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞を組織培養フラスコから採取し、アッセイ培地に１.２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。ｃＡＭＰ−ＸＬ６６５および抗ｃＡＭＰユウロピウムクリプテートは、製造者(CisBio International)の説明書に従い、蒸留水で再構成した。
ＳｃＦｖを、３８４ウェル低容量プレート(Costar 3676)にて、室温で３０分、４ｎＭヒト(配列番号１４)またはカニクイザル(配列番号１６)ＣＸＣＬ１３(ＭＥＬ細胞由来)とともにプレインキュベートした。５μｌのプレインキュベートサンプルをアッセイプレート(Costar 3676)に移した後、２.５μｌのＮＫＨ４７７と２.５μＬのＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞懸濁液を加え、最終的な反応量を、０.５μＭのＮＫＨ４７７と３０００細胞／ウェルを含有する１０μｌとした。各プレートを以下の対照：ＮＫＨ４７７対照(０.５μＭのＮＫＨ４７７を含むＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞)、ＣＸＣＬ１３対照(２ｎＭ ＣＸＣＬ１３、０.５μＭ ＮＫＨ４７７およびＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞)、基本ｃＡＭＰ対照(ＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞のみ)および陰性対照(アッセイ培地のみ)を含むように設定した。また、アッセイで用いた濃度がＥＣ５０〜ＥＣ８５の範囲、ゆえにＨＴＲＦ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイキットの直線的検出範囲に確実に入るように、実験ごとにＣＸＣＬ１３およびＮＫＨ４７７の用量調節(titlation)を行った。細胞を加えた後、プレートを室温で３０分インキュベートし、その後、５μｌのｃＡＭＰ−ＸＬ６６５溶液を加えることで反応を停止させた。その後、陰性対照ウェルに５μｌのコンジュゲート溶解バッファーを、または他の全てのウェルに５μｌの抗ｃＡＭＰユウロピウムクリプテート溶液を加えた。
アッセイプレートを室温で２時間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー(Perkin Elmer)を用い、発光波長６２０ｎｍおよび６６５ｎｍで時間分解蛍光を読み取った。
各サンプルのΔＦ％値を算出することによりデータを分析した。ΔＦ％は式２(式中、ＣＸＣＬ１３対照ΔＦ％はＣＸＣＬ１３対照ウェルの平均値であり、ＮＫＨ４７７対照ΔＦ％はＮＫＨ４７７対照ウェルの平均値である)に従って求めた。
Figure 2010519280
次に、％ΔＦ値を用い、式３に記載のように阻害率％を算出した。
Figure 2010519280
このアッセイにおいてＣ５０値により評価されるようなクローン効力を確立するためにｓｃＦｖ濃度の用量調節を用いた。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用い、４パラメーターロジスティック式(式４)を用いた曲線の当てはめによって求めた。
Figure 2010519280
 Ｘは、濃度の対数である。Ｙは阻害率％である。
ＣＸＣＬ１３ ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイ
ＣＸＣＬ１３ ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイの原理は、細胞ｃＡＭＰレベルがＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイキット(Perkin Elmer AD0263)を用いて測定されること以外は、ＣＸＣＬ１３ ＨＴＲＦ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイに関して概略を示したものに匹敵する。このＣＸＣＬ１３ ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイは、ＮＫＨ４７７で同時刺激した際のＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞において、ＣＸＣＬ１３により媒介されるｃＡＭＰレベルの低下の阻害に関するＩｇＧの効力を決定するために使用可能である。
希釈は全て、特に断りのない限り、アッセイ培地(５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４、０.５ｍＭ３−イソブチル−１−メチルキサンチン(Sigma I7018)および０.１％ＢＳＡを含有するＨａｎｋｓ平衡塩溶液(Sigma H8264))で行った。ＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞を組織培養フラスコから採取し、アッセイ培地に１.２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。この細胞懸濁液にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商標)−６４７抗ｃＡＭＰ抗体を１：１００希釈で加えた。１：２２５０希釈したユウロピウム−Ｗ８０４４ストレプトアビジンと１：７５０倍希釈したビオチン−ｃＡＭＰを含有するＬＡＮＣＥ(登録商標)検出混合物を製造者の説明書に従い、使用の少なくとも１５分前に調製した。ユウロピウム−Ｗ８０４４はＤＣＡ(ジクロロトリアジニル)反応腕を備えたユウロピウムキレートである。
ＩｇＧサンプルを、３８４ウェル低容量プレート(Costar 3676)にて、室温で１時間、４ｎＭのヒト(配列番号１４)またはカニクイザル(配列番号１６)ＣＸＣＬ１３(ＭＥＬ細胞由来)および２μＭのＮＫＨ４７７(Tocris Cookson 1603)とともにプレインキュベートした。５μＬのプレインキュベートサンプルを白色のＰｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ３８４ウェルアッセイプレート(Perkin Elmer Cat no. 6008280)に移した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商標)−６４７抗ｃＡＭＰ抗体／ＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞懸濁液(５μＬ)を加え、最終的な反応量を、１μＭのＮＫＨ４７７、３０００のＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞／ウェルおよび１：２００希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商標)−６４７抗ｃＡＭＰ抗体を含有する１０μｌとした。各プレートを以下の対照：ＮＫＨ４７７対照(ＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商標)−６４７抗ｃＡＭＰ抗体および１μＭのＮＫＨ４７７)およびＣＸＣＬ１３対照(２ｎＭ ＣＸＣＬ１３、１μＭ ＮＫＨ４７７およびＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商標)−６４７抗ｃＡＭＰ抗体)を含むように設定した。また、アッセイで用いた濃度がＥＣ５０〜ＥＣ８５の範囲、ゆえにＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイキットの直線的検出範囲に確実に入るように、実験ごとにＣＸＣＬ１３およびＮＫＨ４７７の用量調節を行った。細胞懸濁液を加えた後、プレートを室温で３０分インキュベートし、その後、全てのアッセイウェルに１０μｌのＬＡＮＣＥ(登録商標)検出混合物を加えることで反応を停止させた。プレートを室温で３時間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー(Perkin Elmer)を用い、波長６６５ｎｍでの発光を測定した。
６６５ｎｍの発光データを用い、式７(式中、ＣＸＣＬ１３対照６６５ｎｍ発光はＣＸＣＬ１３対照ウェルの平均値であり、ＮＫＨ４７７対照６６５ｎｍ発光はＮＫＨ４７７対照ウェルの平均値である)に記載のように阻害率％を算出した。
Figure 2010519280
ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用い、４パラメーターロジスティック式を用いた曲線の当てはめによって求めた(式４参照)。
ＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５ ｃ４.４ ＣＸＣＬ１３誘発Ｃａ２＋放出アッセイ
ＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５ ｃ４.４細胞を９６ウェルの、壁面が黒い、ポリ−Ｄ−リシン処理した組織培養アッセイプレート(ＢＤ)に１×１０５細胞／ウェルで播種した。次に、細胞を加湿雰囲気、３７℃、５％ＣＯ２下、１００μＬのアッセイ培地(ダルベッコの改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)(Invitrogen)、１０％(ｖ／ｖ)熱不活化ウシ胎児血清(ＦＢＳ)(Invitrogen)、１％(ｖ／ｖ)のＬ−グルタミン不含ＭＥＭ−非必須アミノ酸(Invitrogen))中で一晩培養した。
市販のキット(Ｆｌｕｏ−４ノンウォッシュカルシウムアッセイキットＦ３６２０６、Molecular Probes)を用い、下記のようにノンウォッシュＦＬＩＰＲプロトコールを用いた。Ｆｌｕｏ−４ ＮＷ色素混合物の１本のバイアルに１０ｍｌのアッセイバッファー(１Ｘ Ｈａｎｋｓ平衡塩溶液中２０ｍＭのＨＥＰＥＳ)および１００μｌのプロベネシド保存溶液(アッセイバッファー中２５０ｍＭ)を加えることで色素添加溶液を製造した。細胞から培地を吸引し、７０μｌ／ウェルの色素添加溶液を加え、３７℃で３０分、次いで室温で３０分インキュベートした。このインキュベーション中、ＦＬＩＰＲバッファー(１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１.５ｍＭ ＣａＣｌ２、３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２.５ｍＭプロベネシド、５ｍＭグルコースおよび１％(ｖ／ｖ)熱不活化ＦＢＳ)中で精製ＩｇＧの用量調節を行い、またＦＬＩＰＲバッファー中、３７℃で３０分、ＣＸＣＬ１３(終濃度１００ｎＭ)とともにプレインキュベートした。
インキュベーション後、ＣＸＣＬ１３／ＩｇＧの用量調節に対する標識細胞の応答を蛍光測定イメージングプレートリーダーシステム(ＦＬＩＰＲ)で測定した。細胞内カルシウム感受性色素の蛍光を、ｘ１２０秒の読み取り時間で４７０〜４９５ｎｍ励起フィルターおよび５１５〜５７５ｎｍ発光フィルターを用いてアッセイした。
各ウェルの最大ピークの高さをＥｘｃｅｌ(Microsoft)にエクスポートすることによりデータを分析した。阻害剤の不在下でＣＸＣＬ１３に対する応答を用い、阻害剤データを、ＣＸＣＬ１３により誘発される細胞内Ｃａ２＋に対してノーマライズし、アッセイバッファー単独に対する応答を差し引いた。Ｐｒｉｓｍ(GraphPad)でさらなる分析を行い、データをＩｇＧのｌｏｇ濃度に対する対照応答のパーセンテージとしてプロットした。Ｐｒｉｓｍ曲線当てはめソフトウエア(Graphpad)を用いてＩＣ５０値を算出した。
ＣＸＣＬ１３蛍光結合免疫吸着アッセイ(ＦＬＩＳＡ)
ＣＸＣＬ１３ ＦＬＩＳＡは、蛍光微量アッセイ技術(Dietz et al 1996, Swartzman et al 1999)を用い、ストレプトアビジンビーズに結合させたビオチニル化ヒトＣＸＣＬ１３(Almac)とＩｇＧ形式のＣＸＣＬ１３結合要素の間の相互作用を評価する。このアッセイは、競合アッセイ形式で関連のケモカインファミリー要素と比較した場合のビオチニル化ヒトＣＸＣＬ１３に対するＩｇＧの特異性を決定するために使用可能である。
サンプルおよび試薬をアッセイバッファー(０.１％ＢＳＡ、０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０および０.０１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水)で希釈した。０.２５ｎＭのビオチニル化ＣＸＣＬ１３(Almac)を室温で１時間、０.００４％ｗ／ｖの６〜８μｍストレプトアビジンコーティングポリスチレン粒子(Spherotec SVP-60-5)とともにプレインキュベートした。次に、これらのビーズを３０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを元の容量のアッセイバッファーに再懸濁させて０.００４％ｗ／ｖビーズ／ビオチニル化ヒトＣＸＣＬ１３混合物とした。１０μＬの競合因子、アッセイバッファー(全結合対照)または過剰量のヒトＣＸＣＬ１３(非特異的結合(ＮＳＢ)対照)を３８４ウェルの底が透明な非結合表面アッセイプレート(Costar 3655)に加えた。次に、１０μＬの５ｎＭヤギ抗ヒト(Ｈ＋Ｌ)Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商標)−６４７(Invitrogen A21445)、１０μＬの０.３１ｎＭ 抗体１(生殖系列化されたＩｇＧ)および２０μＬのビーズ／ビオチニル化ＣＸＣＬ１３混合物を加え、これらのプレートを室温で４時間インキュベートした。ＦＬ１シグナルをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ細胞検出システム８２００で読み取った。Ｗａｎｇ Ｇｏｌｄｍａｎアルゴリズムを用い、サイズ３〜１２、カラー比率＜０.４、最小数２０のゲートの開閉でデータを分析した。
これらのＦＬ１データから、式８(式中、ＮＳＢ ＦＬ１は非特異的結合対照ウェルの平均値であり、全結合ＦＬ１は全結合対照ウェルの平均値である)を用い、特異的結合％を求めた。
Figure 2010519280
ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用い、４パラメーターロジスティック式を用いた曲線の当てはめにより求めた(式４参照)。
抗体１(生殖系列化されたＩｇＧ)のヒトおよびカニクイザルＣＸＣＬ１３との相互作用のＢＩＡｃｏｒｅ評価
試薬：
ＣＸＣＬ１３
ヒトＣＸＣＬ１３(ＭＥＬ細胞により発現)
０.１ｍｇ／ｍＬ、推定平均分子量９,６９４.５３Ｄａ、１０.３１μＭ
６ｎＭへの希釈は、６,８６９μＬのＨＢＳ−ＥＰ中４μＬであった。
カニクイザルＣＸＣＬ１３(ＭＥＬ細胞により発現)
０.６ｍｇ／ｍＬを０.３ｍｇ／ｍＬに希釈、推定平均分子量９,６７０Ｄａ、３１.０２μＭ)。６ｎＭへの希釈は、２０,６７８μＬのＨＢＳ−ＥＰ中４μＬであった。
免疫グロブリン
抗体１(生殖系列化)
４.４２ｍｇ／ｍＬ(実施例３ａの場合)；１.０６ｍｇ／ｍＬ(実施例３ｂの場合)
例３ａの方法論
チップの製造に関しては実施例３ａを参照
各実験サイクルに関して(オリエンテーション１)、Ｆｃ２タンパク質Ｇ’表面を用い、抗体１(生殖系列化ＩｇＧ１)の０.５μＬ／ｍＬ ＨＢＳ−ＥＰ溶液を２分間、５μＬ／分で用量調節を行うことにより、２４０−３８５ＲＵの抗体１(生殖系列化ＩｇＧ１)を捕捉させた。
次に、ＨＢＳ−ＥＰバッファー中、ヒトまたはカニクイザルＣＸＣＬ１３のいずれかの特定の希釈溶液(ヒトＣＸＣＬ１３では０.２５、０.３１２５、０.５０、０.６２５、１.０、１.２５、２.５、５.０、１０.０および２０.０ｎＭ、またはカニクイザルＣＸＣＬ１３では０.１２５、０.２５、０.５０、１.０、２.０、５.０、１０.０、２０.０および４０.０ｎＭ)をチップ表面に流速１００μＬ／分で流した(結合時間２.５分、１０分解離、２０μＬの１０ｍＭグリシンｐＨ１.７５パルス、次いで２０μＬの１０ｍＭグリシンｐＨ１.５０のパルスで再生)。ブランク注入はＨＢＳ−ＥＰ単独で行った。溶液は全て、ポリプロピレン中で製造および保存した。
実施例３ｂの方法論
抗体を１０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ４.５で１.０μｇ／ｍＬに希釈した。標準的なアミン結合化学(アミンカップリングキットＢＲ−１０００−５０を使用)を用い、ＣＭ３チップ(BIAcore、ＢＲ−１００５−４１、ロット：１１６０１００ 有効起源２００７年４月)上にブランク(Ｆｃ１)および５００ＲＵ表面のＩｇＧを作出した。用いた洗浄溶液はグリシンｐＨ２.０であった。
チップ表面上のヒトおよびカニクイザルＣＸＣＬ１３の流動
各ＣＸＣＬ１３の希釈系(０.１０、０.２０、０.３０、０.４０、０.５０および０.６０ｎＭ)をＨＢＳ−ＥＰバッファーで構築し、全てのフローセルに３０μＬ／分で流した(結合時間４分、１０分解離、１０ｍＭのグリシンｐＨ２.０ ２０μＬの２回のパルスで再生)。ブランク注入は同じバッファーで行った。溶液は全て、ポリプロピレン中で製造および保存した。
ｓｃＦｖからＩｇＧ１への再フォーマット
それぞれ完全な抗体重鎖および軽鎖を発現するベクターにＶＨおよびＶＬドメインをサブクローニングすることにより、クローンをｓｃＦｖからＩｇＧ形式へ変換した。このＶＨドメインを、哺乳類細胞で完全なＩｇＧ１重鎖を発現させるために、ヒト重鎖定常ドメインおよび調節エレメントを含むベクター(ｐＥＵ１５.１)にクローニングした。同様に、ＶＬドメインを、哺乳類細胞で完全なＩｇＧ軽鎖を発現させるために、ヒト軽鎖定常ドメインおよび調節エレメントを含むベクターにクローニングした(κ軽鎖にはｐＥＵ３.４、λ軽鎖にはｐＥＵ４.４)。重鎖および軽鎖の発現のためのベクターは初めにPersic et al, 1997に記載されている。ベクターは、ベクターのエピソーム複製が可能なように操作されている。
ＩｇＧを得るために、重鎖および軽鎖ＩｇＧ発現ベクターをＥＢＮＡ−ＨＥＫ２９３哺乳類細胞にトランスフェクトした。ＩｇＧが発現され、血清不含培地に分泌された。採取物をプールし、精製前に濾過した。ＩｇＧは、Ａタンパク質クロマトグラフィーを用いて精製した。培養上清を適当なサイズのセラミックＡタンパク質のカラム(BioSepra)にのせ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、２５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄した。結合したＩｇＧを、０.１Ｍクエン酸ナトリウム(ｐＨ３.０)を用いてカラムから溶出させ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ９.０)を加えることで中和した。Ｎａｐ１０カラム(Amersham, #17-0854-02)を用い、溶出材料のバッファーをＰＢＳと交換し、ＩｇＧ濃度を、ＩｇＧのアミノ酸配列に基づく吸光係数を用い、分光光度滴に測定した(Mach 1992)。精製されたＩｇＧの凝集または分解を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
ＨＴＲＦ(登録商標)エピトープ競合アッセイ
ＨＴＲＦ(登録商標)エピトープ競合アッセイは、ビオチニル化ＣＸＣＬ１３との結合に関しての結合要素間の競合を決定するために使用可能である。本アッセイで試験される抗体分子は例えばｓｃＦｖ形式またはＩｇＧ形式であり得る。
ＨＴＲＦ(登録商標)技術の原理は本明細書に記載されている通りである。
ＣＸＣＬ１３との結合に関して配列番号１１のアミノ酸配列を有する抗体ｓｃＦｖ分子と競合する結合要素の能力を決定するためのＨＴＲＦ(登録商標)エピトープ競合アッセイでは、クリプテート標識ＳｃＦｖ(配列番号１１)、ビオチニル化ヒトＣＸＣＬ１３およびストレプトアビジンＸＬｅｎｔ(至適化された条件下で結合された、ＸＬ６６５と架橋したストレプトアビジン)の間でＦＲＥＴ複合体が形成される。クリプテート標識ＳｃＦｖと同じ(または可能性としては重複する)エピトープを認識するＳｃＦｖまたはＩｇＧはビオチニル化ＣＸＣＬ１３との結合に関して競合し、従って、アッセイシグナルを低減する。
サンプルおよび試薬の希釈は全て、アッセイバッファー(リン酸緩衝生理食塩水、０.１％ＢＳＡ、０.４Ｍフッ化カリウム)で行う。ビオチニル化ヒトＣＸＣＬ１３(AlmacAlmac)およびストレプトアビジン−ＸＬｅｎｔ(CisBio International 611SAXLB)を室温で３０分プレインキュベートする。１０μＬのサンプル(ｓｃＦｖまたはＩｇＧ)、アッセイバッファー(全結合対照)または最終アッセイ濃度の５０倍の非標識ＩｇＧ(非特異的結合(ＮＳＢ)を定義するため)を３８４低容量プレート(Costar 3676)に加えた後、５μＬのプレインキュベートビオチニル化ＣＸＣＬ１３／ストレプトアビジンＸＬｅｎｔミックスを加える。プレートを室温で１時間インキュベートし、その後、５μＬのクリプテート標識ＳｃＦｖを加える。プレートを室温で３時間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー(Perkin Elmer)を用い、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍの発光波長で時間分解蛍光を測定する。
適当なアッセイシグナルを与える各試薬の濃度を確立するため、ＣＸＣＬ１３、ストレプトアビジン−ＸＬｅｎｔおよびクリプテート標識ＩｇＧの至適濃度の用量調節を行うことができる。
各サンプルのΔＦ％値を算出することによりデータを分析する(式５参照)。
Figure 2010519280
次に、ΔＦ％値を用い、式６(式中、ＮＳＢΔＦ％は非特異的結合対照ウェルの平均値であり、全結合ΔＦ％は全結合対照ウェルの平均値である)に記載されているように特異的結合％を算出する。
Figure 2010519280
ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用い、４パラメーターロジスティック式を用いた曲線の当てはめによって求めた(式４参照)。
Figure 2010519280
 Ｘは、濃度の対数である。Ｙは阻害率％である。
Ｂ３００.１９ ｈＣＸＣＲ５細胞ＣＸＣＬ１３により駆動される走化性アッセイ
アッセイを行う前に少なくとも２日間、１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)；１％ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグルタミン(ＰＳＧ)；１％ピルビン酸ナトリウム；１.５μｇ／ｍｌピューロマイシン(puramycin)および０.１％２−β−メルカプトエタノールを含有する)培養培地(ＲＰＭＩ−１６４０ Sigma、カタログ番号Ｒ０８８３)を用い、加湿雰囲気、３７℃、５％ＣＯ２下で、５×１０５細胞／ｍｌに調整した。アッセイ当日、Ｂ３００.１９ ｈＣＸＣＲ５細胞を計数し、６×１０６細胞／ｍｌに調整した後、回転沈降させ、バッファー(ＲＰＭＩ−１６４０(Sigma カタログ番号Ｒ０８８３)＋０.３５％ＢＳＡ(Sigma カタログ番号Ａ２１５３))で１回洗浄した。
アッセイバッファー中でＩｇＧの用量調節を行った。これらのＩｇＧを、加湿雰囲気、３７℃、５％ＣＯ２下で３０分、ＥＤ８０濃度のＣＸＣＬ１３とともにプレインキュベートした。
このインキュベーション期間の後、３１μｌ／ウェルのプレインキュベートＣＸＣＬ１３およびＩｇＧを、気泡を避けるためにリバースピペッティングを用いて、走化性プレート(Receptor Technologies、カタログ番号１０６−５)の下のチャンバーに移した。次に、各コーナーを仕切っている壁面にメンブランフィルターを適用した。その後、５０μｌのＢ３００.１９ ｈＣＸＣＲ５細胞(６×１０６細胞／ｍｌ)を、この走化性フィルターの上のチャンバーの円形の領域に分注した。走化性プレートに蓋をし、加湿雰囲気(３７℃、５％ＣＯ２)下で２時間インキュベートした。
２時間のインキュベーション後、これらのプレートをインキュベーターから取り出し、フィルター表面から余分な細胞を除去するために洗浄した。これは膜表面にＰＢＳを注ぎ、ぐことによって行い、細胞スクレーパー(Corning、カタログ番号３０１１)を用いて余分な細胞／ＰＢＳを全て除去することで行った。次に、この走化性プレートを、フィルターをそのままにして１５００ｒｐｍで１０分遠心分離した。
回転後、フィルターメンブランを取り出し、走化性プレートの下のチャンバーの内容物を、８０μｌ／ウェルのアッセイバッファーおよび１５μｌ／ウェルの溶解バッファー(Ｈ２Ｏ＋９％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ)を含有する９６ウェルポリスチレン平底プレート(Corning、カタログ番号３５９８)(酵素プレート)に移した。このプレートを加湿雰囲気(３７℃、５％ＣＯ２)下で１時間インキュベートした。
次に、各プレートに対して、細胞溶解の際に放出された安定なサイトゾル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ)を測定する非放射性細胞傷害性アッセイを行った。このアッセイは細胞数の定量的測定を提供する。ＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞傷害性アッセイ(Promega カタログ番号Ｇ１７８０)は下記の試薬からなる：５バイアルの基質混合物；６０ｍｌのアッセイバッファー；２５μｌのＬＤＨ陽性対照(使用しない)；３ｍｌの溶解溶液(１０倍)(使用しない)；６５ｍｌの停止溶液(１Ｍ酢酸)；１プロトコール。ＬＤＨ測定のためにアッセイバッファーを解凍し、１２ｍｌを取り出し、使用しないものはすぐに−２０℃で保存した。アッセイバッファーを解凍するには３７℃の水浴を用いればよい。１２ｍｌのアッセイバッファーを室温まで温めた(遮光し続ける)。１２ｍｌの室温アッセイバッファーを１本の基質混合物に加えた。これを逆転させ、穏やかに振盪して基質混合物を溶解させた。
ボトル１本で９６ウェルプレート２枚に十分な基質を供給できる。この基質は、一度再懸濁させると、強い直射光から遮光し、すぐに使用しなければならない。５０μｌの再構成基質混合物を、走化性アッセイプレートから移した溶解サンプルの入った酵素アッセイプレートの各ウェルに加えた。このプレートをホイルまたは不透明な箱で覆って遮光し、室温で３０分インキュベートした。５０μｌの停止溶液を各ウェルに加えた。大きな気泡があればシリンジの針で割り、停止溶液を加えてから１時間以内に４９０または４９２ｎｍで吸光度を記録した。
データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４に読み込み、このソフトウエアで、作成された用量応答曲線に基づきＩＣ５０値を求めた。
ヒト扁桃(Tonisillar)Ｂ細胞ＣＸＣＬ１３により駆動される走化性アッセイ
ヒト扁桃は、所内倫理委員会の承認の下、患者から扁桃切除術後に得た。サンプルは、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン(１０,０００単位／ｍｌ)＋ストレプトマイシン(１０ｍｇ／ｍｌ)＋グルタミン(２００ｍＭ)溶液(Sigma：Ｇ１１４６)(終濃度１００単位／ｍｌのペニシリン＋０.１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン＋２ｍＭのグルタミン溶液)、１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン(Sigma：Ｇ１５２２)、０.１％βメルカプトエタノール(Gibco：３１３５０−０１０)、１％ピルビン酸ナトリウム(Sigma：Ｓ８６３６)、１％非必須アミノ酸(Gibco：１１１４０−０３５)を含有するＲＰＭＩ−１６４０(Sigma：Ｒ０８８３)培地中で輸送した。
細胞解離シーブ(６０メッシュ)(Sigma：ＣＤ１)を用い、扁桃組織から一次扁桃Ｂ細胞を単離した。次に、細胞懸濁液を３００ｇ(１５００ｒｐｍ)で５分の遠心分離により洗浄した。上清を廃棄し、細胞ペレットを全量２０ｍｌの冷組織培養培地に再懸濁させた。この細胞懸濁液を２０ｍｌのフィコール・ハイパーク(Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ)(Axis Shields：１１１４５４４)で溶解させ、２０００ｒｐｍで１５分遠心分離して、死細胞、細胞残渣および赤血球を除去した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐと組織培養培地の境界にある細胞をプラスチック製のパスツールピペットで取り出し、１５ｍｌの遠沈管に移した。この細胞懸濁液を冷組織培養培地で１５ｍｌの容量にし、１５００ｒｐｍで５分遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを１０ｍｌの冷組織培養培地に再懸濁させた。ｃｏｕｌｔｅｒ ｃｏｕｎｔｅｒを用いて生存細胞の計数を行った。細胞を５×１０６細胞／ｍｌの濃度に調整し、一晩、１μｇ／ｍｌのＬＰＳとともにおよそ２０時間培養した。
インキュベーション後、扁桃細胞を１×１０７細胞／ｍｌに調整し、その後、回転沈降させ、バッファー(ＲＰＭＩ−１６４０(Sigma カタログ番号Ｒ０８８３)＋０.３５％ＢＳＡ(Sigma カタログ番号Ａ２１５３))で１回洗浄した。
次に、Ｂ３００.１９ ｈＣＸＣＲ５細胞に関して従前に記載されている通りに走化性アッセイを行った。
ＥＬＩＳＡにおける天然ｈＣＸＣＬ１３と抗体１(生殖系列化ＩｇＧ１)との結合
所内倫理委員会の承認の下、全血をヘパリン処理済み容器に採取した。５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ試験管中へｓｔｒｉｐｅｔｔｅを用い、当量のＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐを注ぎ、血液をゆっくり溶解させた。これらの試験管を室温下、２０００ｒｐｍで２５分、ブレーキをかけずに回転させた。
パスツールピペットを用いてリンパ球層を取り出し、新しいＦｉｓｈｅｒ ５０ｍｌ試験管に移した。次に、これらの細胞を予温したＲＰＭＩ−１６４０(Sigma：Ｒ０８８３)培地で洗浄した。その後、細胞を、１５００ｒｐｍで１０分、ブレーキをかけながら遠心分離を行うことにより洗浄した。上清を廃棄した後、細胞を、ＲＰＭＩを用い、１５００ｒｐｍで１０分、ブレーキをかけながら遠心分離を行うことによりさらに２回洗浄した。最終洗浄のため、ペレットを５０ｍｌのＲＰＭＩに再懸濁させ、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて計数するために２００μｌのサンプルを取り出した。
最終洗浄の後、細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン(１０,０００単位／ｍｌ)＋ストレプトマイシン(１０ｍｇ／ｍｌ)＋グルタミン(２００ｍＭ)溶液(Sigma：Ｇ１１４６)(終濃度１００単位／ｍｌのペニシリン＋０.１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン＋２ｍＭのグルタミン)を含有する適当量の培養培地(ＲＰＭＩ−１６４０(Sigma：Ｒ０８８３)培地に再懸濁させ、細胞濃度を３.３×１０６細胞／ｍｌとした。
次に、細胞を６ウェルのポリスチレン組織培養プレートに３ｍｌ／ウェルで分注した。これにより最終細胞数がおよそ１×１０７細胞／ウェルとなった。６日の刺激のためにできる限り多くのプレートを設定した。
その後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３〜４時間インキュベートした。このインキュベーション中、他の細胞集団は懸濁したまま、単球はウェルの底に接着していなければならない。
インキュベーション後、非接着Ｔ細胞を含有する３ｍｌの培養培地を各ウェルから静かに抜き取り、各ウェルの底に接着した単球を残して排出した。各プレートの各ウェルに、３ｍｌの新鮮な培養培地を加えた。下記の刺激薬を加えた：ヒトＭ−ＣＳＦ(R&D Systems：２１６−ＭＣ−０２５)(終濃度５０ｎｇ／ｍｌ)＋ヒトＩＬ−４(R&D Systems：２０４−ＭＣ−０２５)(終濃度２５ｎｇ／ｍｌ)。
１つのウェルを、培地のみを含む対照として刺激無しで残した。
３７℃、５％ＣＯ２下で６日の刺激の後、刺激した全てのウェルにＬＰＳを終濃度１μｇ／ｍｌとなるように一晩加えた。一晩ＬＰＳで刺激した後、ｓｔｒｉｐｅｔｔｅを用いて各ウェルから上清を取り出した。全ての上清をプールした後、１５ｍｌの試験管に分注した(１０ｍｌ／試験管)。ＥＬＩＳＡによる定量のためにエッペンドルフ管に〜５００μｌを採取した。ＥＬＩＳＡによるＣＸＣＬ１３の定量は製造者の説明書に従って行った(R&D systems: Quantikine Human CXCL13/BLC/BCA-1 Immunoassay.カタログ番号：ＤＣＸ１３０)。
次に、天然ＣＸＣＬ１３を含有する上清を陽イオン交換樹脂で精製し、ＰＢＳに対して透析し、ＥＬＩＳＡにより再定量した。
天然ＣＸＣＬ１３と抗体１(生殖系列化されたＩｇＧ１)の結合を示すため、ｍａｘｉ−ｓｏｒｐ ｈｉｇｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ９６ウェルプレートをＣＡＺ−１０４０(５μｇ／ｍｌ ２００μｌ／ウェル)でコーティングした。また、ＥＬＩＳＡキット内にも、不特定抗ＣＸＣＬ−１３抗体でコーティングしたプレートが供給されていた。次に、精製天然ＣＸＣＬ１３を抗体１コーティングプレートとキットで供給されているプレートの双方に加えた。ＥＬＩＳＡは製造者の説明書に従って行った(R&D systems: Quantikine Human CXCL13/BLC/BCA-1 Immunoassay.カタログ番号：ＤＣＸ１３０)。
抗体１は天然ＣＸＣＬ１３および組換えＣＸＣＬ１３(キットで提供されている標品)の双方に結合し、このアッセイにおいて同濃度のリガンドは同等のシグナルを与えた。
結合要素によるＣＸＣＬ−１３のＨ／Ｄ交換率の摂動
ＣＸＣＬ１３は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ.ＨＣｌ ｐＨ７.４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、０.５ｍｇ／ｍｌで用いた。抗体はＰＢＳ(１.５４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２.７１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１５５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７.２)中、１０.６ｍｇ／ｍｌで用いた。製造者の説明書に従い、抗体をＰＯＲＯＳ ＡＬ樹脂(Applied Biosystems)と結合させ、１００μｌのカラムを調製し、これを１℃に維持した。
このカラムを、７５％Ｄ２Ｏで調製した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ.ＨＣｌ ｐＨ７.５、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄した。ＣＸＣＬ１３を、７５％Ｄ２Ｏで調製したバッファーで０.１２５ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、抗体カラムに注入する前に１５０、５００、１５００および５０００秒インキュベートした。このカラムをＨ２Ｏ中０.２ｍｌのバッファーですぐに洗浄した後、同じ時間インキュベートした(すなわち、１５０秒間Ｄ２Ｏに交換したサンプルは１５０秒Ｈ２Ｏに戻し、５００秒、１５００秒および５０００秒のサンプルも同様にした)。種々の時点で、まず８０μｌ、そして４０μｌの０.８％ギ酸を注入することにより溶出させた。後の４０μｌを回収し、２０μｌの２Ｍ尿素、１Ｍ ＴＣＥＰ ｐＨ３(１℃)を加えた。混合物全体を、タンパク質をペプチドに消化するためにペプシンを含む１００μｌカラムに注入し、これらのペプチドを、１２〜２８.５％のアセトニトリル勾配を用いるｒｐＨＰＬＣにより分離し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱエレクトロスプレー質量分析計およびＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑ−ＴＯＦ質量分析計の双方で質量を求めた。ＳＥＱＵＥＳＴソフトウエアプログラム(Thermo Finnigan San Jose, CA)を用いて親ペプチドイオンの配列を同定した。
ＣＸＣＬ１３の種々の部分の交換率に対する抗体の効果は、ＣＸＣＬ１３をまずバッファーを含有するＨ２Ｏで０.１２５ｍｇ／ｍｌに希釈した後、Ｈ２Ｏ中に調製した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ.ＨＣｌ ｐＨ７.５、１５０ｍＭ ＮａＣｌで予め洗浄したカラムに注入したこと以外は、本質的に上記の通りに調べた。結合後、Ｈ２Ｏ中に調製した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ.ＨＣｌ ｐＨ７.５、１５０ｍＭ ＮａＣｌでカラムを洗浄し、その後、７５％ Ｄ２Ｏ中に調製した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ.ＨＣｌ ｐＨ７.５、１５０ｍＭ ＮａＣｌとともに１５０、５００、１５００および５０００秒インキュベートした後、Ｈ２Ｏに戻し、上記のように処理した。
実施例１：抗体の主要な単離
ヒトＣＸＣＬ１３のオープンリーディングフレームのＰＣＲのため、鋳型としてヒト脾臓ｃＤＮＡを用いた。これを、ＭＥＬ細胞の安定トランスフェクションのための哺乳類発現ベクター(ｐＥＶ３)にクローニングした。ＣＸＣＬ１３発現の最も高いクローンＭＥＬ細胞系統を、市販の抗ＣＸＣＬ１３抗体を用いた細胞培養上清のウエスタンブロットにより同定した。このタンパク質を発現するＭＥＬ細胞の培養培地から、ｐＨ６に調整した後に陽イオン交換カラムにのせることにより、組換えＣＸＣＬ１３を精製した。ＣＸＣＬ１３を、１Ｍ ＮａＣｌを含有するｐＨ６のＭＥＳバッファーで溶出させた。サンプルをそのままＲｅｓｏｕｒｃｅ ｒｐｃカラムにのせ、０.１％ＴＦＡ中９０％アセトニトリルまでの勾配で溶出させた。ＣＸＣＬ１３を含有する画分をプールし、濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムでのクロマトグラフィーにより精製し、＞９５％純度の材料を得た。この精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣＭＳにより分析したところ、９６９０Ｄａの分子量を有することが示された。
１.１ ｓｃＦｖファージディスプレーライブラリーからの選択
繊維状ファージＭ１３に基づくファージミドベクターにクローニングされた大きな単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)ヒト抗体ライブラリーを選択に用いた(Vaughan 1996, Hutchings 2001)。このファージディスプレーライブラリーから、本質的に従前に記載されているように(Vaughan 1996)化学的に合成されたビオチニル化ヒトＣＸＣＬ１３(Almac)に対する一連の選択サイクルを用い、抗ＣＸＣＬ１３特異的ｓｃＦｖ抗体を単離した。要するに、ＰＢＳ−Ｍａｒｖｅｌ(３％ｗ／ｖ)中の精製ファージを溶液中のビオチニル化ヒトＣＸＣＬ１３と１時間結合させた。次に、抗原と結合したＳｃＦｖ−ファージを、製造者の推奨に従い、ストレプトアビジンコーティング常磁性ビーズ(Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(登録商標)Ｍ−２８０)に捕捉させた。結合していないファージ粒子を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ(０.１％ｖ／ｖ)およびＰＢＳを用いた一連の洗浄サイクルにより除去した。結合したファージ粒子を溶出させ、細菌に感染させ、次回の選択のために救済した(Vaughan 1996)。
２回の選択から得られた典型数の個々のクローンを９６ウェルプレートで増殖させた。ＳｃＦｖは細菌の周辺質で発現させ、ビオチニル化ヒトＣＸＣＬ１３(Almac)とＢ３００.１９ ｈＣＸＣＲ５細胞で発現させたその受容体ＣＸＣＲ５との結合を阻害するそれらの能力に関し、蛍光微量アッセイ技術(ＦＭＡＴ)を用いてスクリーニングした。このアッセイにおいてＣＸＣＬ１３：ＣＸＣＲ５相互作用に対して粗ｐｅｒｉｐｒｅｐサンプルとして有意な阻害作用を示したＳｃＦｖについてＤＮＡ配列決定を行った(Vaughan 1996, Osbourn 1996)。
ユニークなｓｃＦｖを再び細菌で発現させ、アフィニティークロマトグラフィー(Bannister 2006に記載の通り)により精製した。ＩＣ５０値は、精製ｓｃＦｖの希釈系をヒトおよびカニクイザル(ｃｙｎｏ)非ヒト霊長類ＣＸＣＬ１３(双方ともＭＥＬ細胞由来)に対するＨＴＲＦ ｃＡＭＰ(３’,５’サイクリックアデノシン一リン酸)アッセイで試験することにより求めた。
１.２ 機能活性の決定 ＣＸＣＬ１３で刺激したサイクリックＡＭＰ形成の阻害
ＣＸＣＬ１３ ＨＴＲＦ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイでは、アデニリルシクラーゼアクチベーターＮＫＨ４７７(０.５μＭ)によるＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞の同時刺激の際の、ＣＸＣＬ１３により媒介されるｃＡＭＰレベルの低下の主要なｓｃＦｖによる阻害を評価した。最終反応濃度２ｎＭヒトＣＸＣＬ１３(ＭＥＬ細胞由来)または２ｎＭカニクイザルＣＸＣＬ１３(ＭＥＬ細胞由来)に対するＩＣ５０値を求めた(表１参照)。このアッセイ法の詳細については、「アッセイ材料および方法」の節を参照。
Figure 2010519280
 表１ ＨＴＲＦ(登録商標)ＣＸＣＬ１３ ｃＡＭＰアッセイにおけるヒトＣＸＣＬ１３(平均ＩＣ５０±標準偏差、ｎの数)またはカニクイザルＣＸＣＬ１３(ｎ＝１のデータのみ)に対する抗体１ ｓｃＦｖ(非生殖系列化)の効力の例
１.３ ＬＡＮＣＥ(登録商標)ＣＸＣＬ１３ ｃＡＭＰアッセイにおけるＩｇＧの効力
ＩｇＧ１に再フォーマットされたクローン(材料および方法を参照)の活性をＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイで測定した。このアッセイの原理は、細胞ｃＡＭＰレベルの測定にＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイキット(Perkin Elmer)を用いること以外は、ＨＴＲＦ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイの原理に相当する。このアッセイ方法の詳細については、「アッセイ材料および方法」の節を参照。ＣＸＣＬ１３ ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイでは、ＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞をアデニリルシクラーゼアクチベーターＮＫＨ４７７(１μＭ)で同時刺激した際の、ＭＥＬ細胞由来ＣＸＣＬ１３(２ｎＭヒトＣＸＣＬ１３または２ｎＭ ｃｙｎｏ ＣＸＣＬ１３)により媒介される培地ｃＡＭＰレベルの低下のＩｇＧ阻害に対するアッセイＩＣ５０値を求めた(例えば、データ例は表２を参照)。
Figure 2010519280
 表２ ＬＡＮＣＥ(登録商標)ＣＸＣＬ１３ ｃＡＭＰアッセイにおけるＭＥＬ細胞由来ヒトＣＸＣＬ１３(平均ＩＣ５０±標準偏差、ｎの数)またはカニクイザルＣＸＣＬ１３(ｎ＝６のデータ)に対する抗体１ ＩｇＧ(非生殖系列化)の効力の例
１.４ 組換えＣＸＣＲ５を発現するＢ３００.１９細胞におけるＣＸＣＬ１３により誘発される走化性の阻害
走化性アッセイにおいてヒト組換えＣＸＣＲ５でトランスフェクトされたマウスプレＢ細胞系統Ｂ３００.１９ ｈＣＸＣＲ５細胞を用い、ＩｇＧを試験した。およそＥＤ８０の応答を与える非グリコシル化ヒトＣＸＣＬ１３の濃度(１２.３２ｎＭ)に対してＩｇＧの用量調節を行った。下表は抗体１ ＩｇＧ(非生殖系列化)のＩＣ５０値(ｎＭ)±ＳＥＭを示す。どのＩｇＧも少なくとも３回試験した。
Figure 2010519280
 表３ Ｂ３００.１９ ｈＣＸＣＲ５走化性アッセイにおける抗体１ ＩｇＧ(非生殖系列化)のＩＣ５０値(ｎＭ)±ＳＥＭの例
１.５ ＣＸＣＬ１３により誘発されるカルシウム放出の阻害
ＣＸＣＬ１３により誘発されるカルシウム放出に対するＩｇＧ活性を、Ｇタンパク質Ｇｑｉ５およびヒトＣＸＣＲ５でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系統を用いて評価した。これらの細胞をヒトＣＸＣＬ１３で刺激すると、細胞内貯蔵庫からの放出と細胞外培地からの流入が誘発されることで、濃度依存的に細胞質Ｃａ２＋の増加が起こる。これは蛍光イメージングプレートリーダー(ＦＬＩＰＲ)にてカルシウム感受性色素を用いて測定することができる。このアッセイでは、それらのＩＣ５０値で測定されるような、抗ＣＸＣＬ１３ ＩｇＧの阻害活性を１００ｎＭのヒトＣＸＣＬ１３(ＭＥＬ細胞由来)に対して測定した。抗体１(非生殖系列化)に関して得られたＩｇＧ効力を表４に示す。全てのアッセイに陽性アッセイ対照を含めた。アッセイ方法に関するさらなる詳細は「アッセイ材料および方法」を参照。
Figure 2010519280
 表４ ＣＸＣＬ１３により媒介されるＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５ Ｃａ２＋放出アッセイにおける抗体１ ＩｇＧ(非生殖系列化)の効力(平均ＩＣ５０±標準偏差)
実施例２： 抗体の生殖系列化
２.１ 抗体の生殖系列化
抗ＣＸＣＬ１３抗体のＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列をＶＢＡＳＥデータベース(Tomlinson 1997)の既知のヒト生殖細胞系配列に対してアラインし、配列類似性により最も近い生殖細胞系を同定した。抗体１のＶＨドメインに関しては、これはＶＨ３−２３であった。ＶＬドメインに関しては、これはＶＫ１ Ｌ１２であった。変化しなかったバーニヤ(Vernier)残基(Foote 1992)を考慮しなければ、ＶＬドメインのフレームワーク領域には８つの変異、ＶＨドメインには３つの変異が存在し、これらは全て、適当な突然変異誘発プライマーを用いた標準的な部位特異的突然変異誘発技術により示された生殖細胞系配列に復帰し、生殖系列化されたＩｇＧ１が形成された(ＶＨではＱ１Ｅ、Ｖ５Ｌ、Ｒ１６Ｇ、Ｖ２３Ａ、Ｇ２４Ａ、Ｈ３９Ｑ、Ｇ８３ＲおよびＲ１０５Ｑ、ＶＬではＩ１５Ｖ、Ａ５８ＶおよびＤ７０Ｅ)。
２.２ ＬＡＮＣＥ(登録商標)ｃＡＭＰアッセイにおける生殖系列化された抗体１ ＩｇＧの効力
ＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５細胞におけるヒトまたはカニクイザルＣＸＣＬ１３(ＭＥＬ細胞由来)のｃＡＭＰレベル調節の阻害に関する、生殖系列化された抗体１ ＩｇＧと親(非生殖系列化)抗体１ ＩｇＧの効力を、第１.３節に概略が示されているＬＡＮＣＥ(登録商標)ＣＸＣＬ１３ ｃＡＭＰアッセイを用いて比較した。ＩＣ５０値を表５に示す。
Figure 2010519280
 表５ ＬＡＮＣＥ(登録商標)ＣＸＣＬ１３ ｃＡＭＰアッセイにおけるヒトまたはカニクイザルＣＸＣＬ１３に対する生殖系列化された抗体１ ＩｇＧおよび親抗体１ ＩｇＧの効力(平均ＩＣ５０±標準偏差、ｎの数)
本アッセイにおいて親抗体１ ＩｇＧと生殖系列化された抗体１ ＩｇＧは匹敵する活性を示した。
２.３ Ｂ３００.１９ ｈＣＸＣＲ５細胞を用いた走化性アッセイにおける生殖系列化された抗体１ ＩｇＧの効力
完全に生殖系列化された抗体１ ＩｇＧを、Ｂ３００.１９ ｈＣＸＣＲ５細胞を用いた走化性アッセイで試験した。ＥＤ８０濃度の非グリコシル化およびグリコシル化ヒトおよびグリコシル化Ｃｙｎｏ ＣＸＣＬ１３に対してＩｇＧの用量調節を行った。結果を下表６にＩＣ５０値(ｎＭ)±ＳＥＭとして示す。ＩｇＧは少なくとも３回試験した。
Figure 2010519280
 表６ Ｂ３００.１９ ｈＣＸＣＲ５走化性アッセイにおける生殖系列化された抗体１ ＩｇＧのＩＣ５０値(ｎＭ)±ＳＥＭの例
２.４ 生殖系列化された抗体１ ＩｇＧによる、ＣＸＣＬ１３により誘発されたカルシウム放出の阻害
生殖系列化された抗体１ ＩｇＧと親(非生殖系列化)抗体１ ＩｇＧの効力を、第１.５節に概略が示されているＦＬＩＰＲアッセイで比較した。
Figure 2010519280
 表７ ＣＸＣＬ１３により誘発されるＣＨＯ Ｇｑｉ５ ｈＣＸＣＲ５ ｃ４.４ Ｃａ２＋放出アッセイにおけるＩｇＧ効力の例(平均ＩＣ５０±標準偏差、ｎの数)
２.５ ヒトＣＸＣＬ１３に対する生殖系列化された抗体１ ＩｇＧの特異性
ケモカインＣＸＣファミリーの他の要素よりもヒトＣＸＣＬ１３(ＭＥＬ細胞由来)に対しての、生殖系列化された抗体１ ＩｇＧ１の特異性を、ＣＸＣＬ１３ ＦＬＩＳＡ(蛍光結合免疫吸着アッセイ)を用いて調べた。このアッセイでは、ケモカインＣＸＣＬ３(R&D Systems)、ＣＸＣＬ５(R&D Systems)、ＣＸＣＬ６(R&D Systems)、ＣＸＣＬ８(R&D Systems)、ＣＸＣＬ１０(R&D Systems)およびＣＸＣＬ１２(Peprotech)を、生殖系列化された抗体１ ＩｇＧ１との結合に関する、ストレプトアビジンビーズに固定されたビオチニル化ヒトＣＸＣＬ１３(Almac)との競合について試験した。ビオチニル化ヒトＣＸＣＬ１３抗体結合相互作用は、蛍光微量アッセイ技術(詳細については「アッセイ材料および方法」を参照)を用い、蛍光タグを付けた抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。結果を表８に示す。標準的なケモカイン名(Zlotnik and Yoshie, 2000)をそれらの最もよく用いられる名称とともに示す。
Figure 2010519280
 表８ ビオチニル化ヒトＣＸＣＬ１３と生殖系列化された抗体１ ＩｇＧ１との結合のケモカイン阻害の例(ｎ＝１のデータのみ)
ヒトＣＸＣＬ１３およびカニクイザルＣＸＣＬ１３は、生殖系列化された抗体１ ＩｇＧ１との結合に関してビオチニル化ヒトＣＸＣＬ１３と競合した。試験した他のケモカインで、濃度１μＭまでのビオチニル化ヒトＣＸＣＬ１３抗体１ ＩｇＧ結合相互作用の阻害を示したものはなかった。
実施例３ａ： ヒトおよびｃｙｎｏ ＣＸＣＬ１３に対する抗体の親和性
３.１ ＢＩＡｃｏｒｅ測定による抗体親和性の決定
動態結合パラメーターの決定は、本質的にKarlsson et al, 1991が記載しているように、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００オプティカルバイオセンサー(BIAcore AB, Upsalla, Sweden)を用いた表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)により行った。また、アッセイ材料および方法の節も参照。
オリエンテーション１
標準的なアミン結合化学を用い、ノーマライズされたＣＭ５チップ(BIAcore、ＢＲ−１０００−１４)のフローセル(Ｆｃ)１および２にそれぞれブランクおよびＧ’タンパク質(Sigma Ｐ４６８９)の２６５ＲＵ表面を作出した。このＦｃ２ Ｇ’タンパク質表面を用い、２４０−３８５ＲＵ抗体１(生殖系列化されたＩｇＧ１)を捕捉した。
Figure 2010519280
 表９
次に、ヒトおよびカニクイザルＣＸＣＬ１３の希釈液(ＨＢＳ−ＥＰバッファー中)をチップ表面に流速１００μＬ／分で流した。
大量輸送を制限した１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルの、Ｆｃ ２−１データへの当てはめ
当てはめ条件(ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３.２で実施)：
ダブルブランクを差し引いた(ＩｇＧフローセルデータからブランクフローセルを差し引き、残りのデータセットからブランク注入(０.０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０.００５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０、ＨＢＳ−ＥＰ)を差し引いた)。バルクＲＩの関与を全てゼロにローカル設定した。
大量輸送を制限した１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒモデル、ＨＢＳ−ＥＰの差し引き、ＲＩのゼロ設定を用い、０.２５〜２０ｎＭヒトＣＸＣＬ１３曲線(１０濃度)に基づき次のパラメーターを得た。
Figure 2010519280
 表１０ａ
Figure 2010519280
 表１０ｂ
大量輸送を制限した１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒモデル、ＨＢＳ−ＥＰの差し引き、ＲＩのゼロ設定を用い、０.１２５〜４０ｎＭ ｃｙｎｏ ＣＸＣＬ１３曲線(１２および９濃度)に基づき次のパラメーターを得た。
Figure 2010519280
 表１１
Figure 2010519280
 表１１ｂ
ｃｙｎｏ ＣＸＣＬ１３を抗体１(生殖系列化)に当てはめると、ヒトＣＸＣＬ１３に極めて類似するＫＤ値が得られ、これは各変異体に対する親和性が極めて類似していることを示唆する。
オリエンテーション２
標準的なアミン結合化学を用い、ノーマライズされたＣＭ５チップ(BIAcore、ＢＲ−１０００−１４)のフローセルにブランク(ＦＣ１)ならびにＦｃ２および３にそれぞれストレプトアビジン(Ｐｅｒｂｉｏ／Ｐｉｅｒｃｅ ２１１２５)の２２８および３０３ＲＵ表面を作出した。このＦｃ３ストレプトアビジン表面を用い、Ｃ末端付近でビオチニル化された２８ＲＵヒトＣＸＣＬ１３(Almac注文合成)を捕捉した。
次に、サイズ排除クロマトグラフィーで単量体化した抗体１のＦａｂフラグメントの希釈液(ＨＢＳ−ＥＰバッファー中に希釈)をチップ表面に流速３０μＬ／分で流した。
１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルの、Ｆｃ ３−１データへの当てはめ
当てはめ条件(ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３.２で実施)：
ダブルブランクを差し引いた(ＩｇＧフローセルデータからブランクフローセルを差し引き、残りのデータセットからブランク注入(０.０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０.００５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０、ＨＢＳ−ＥＰ)を差し引いた)。バルクＲＩの関与を全てゼロにローカル設定した。
大量輸送を制限した１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒモデル、ＨＢＳ−ＥＰの差し引き、ＲＩのゼロ設定を用い、０.０６５〜２.１０５ｎＭの抗体１(生殖系列化されたＩｇＧ１)Ｆａｂ曲線(６濃度)に基づき次のパラメーターを得た。
Figure 2010519280
 表１３
実施例３ｂ： ヒトＣＸＣＬ１３に対する抗体の親和性
実施例３ａに示されているより包括的なデータの前に、下記のように、低濃度の拡散ＣＸＣＬ−１３を用い、最初の親和性データ(ｎ＝１)を求めた。アッセイ材料および方法の節も参照。
３.１ｂ ＢＩＡｃｏｒｅ測定による抗体親和性の決定
動態結合パラメーターの決定は、本質的にKarlsson et al, 1991が記載しているように、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００オプティカルバイオセンサー(BIAcore AB, Upsalla, Sweden)を用いた表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)により行った。
標準的なアミン結合化学を用い、ＣＭ３チップ(BIAcore、ＢＲ−１００５−４１)上に、ブランク(Ｆｃ１)および１０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ４.５に希釈した、抗体１(生殖系列化されたＩｇＧ１)の５００ＲＵ表面を作出した。
Figure 2010519280
 表１４
次に、ヒトおよびカニクイザルＣＸＣＬ１３の希釈液をチップ表面に流した。
Ｌａｎｇｍｕｉｒの、Ｆｃ ２−１および３−１データへの当てはめ
当てはめ条件(ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３.２で実施)：
ダブルブランクを差し引いた(ＩｇＧフローセルデータからブランクフローセルを差し引き、残りのデータセットからブランク注入(０.０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０.００５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０、ＨＢＳ−ＥＰ)を差し引いた)。バルクＲＩの関与を全てゼロにローカル設定した。
１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒモデル、ＨＢＳ−ＥＰの差し引き、ＲＩのゼロ設定を用い、０.１０〜０.６０ｎＭのヒトＣＸＣＬ１３曲線に基づき以下のパラメーターを得た。
Figure 2010519280
 表１５
１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒモデル、ＨＢＳ−ＥＰの差し引き、ＲＩのゼロ設定を用い、０.１０〜０.６０ｎＭのｃｙｎｏ ＣＸＣＬ１３曲線に基づき、各ＩｇＧに対して以下のパラメーターを得た。
Figure 2010519280
 表１６
実施例４： 一次Ｂ細胞のＣＸＣＬ１３により誘発される走化性の阻害
４.１ マウス脾臓から単離された一次リンパ球のＣＸＣＬ１３により誘発される走化性の阻害
マウス脾臓から一次リンパ球を新しく単離し、一晩ＬＰＳで培養した。次に、これらの細胞を、市販のマウスＣＸＣＬ１３(R&D Systems)またはヒトＣＸＣＬ１３(ＭＥＬ細胞由来)のいずれかで刺激した走化性アッセイに用いた。抗体１ ＩｇＧ(非生殖系列化)のＩＣ５０データ(ｎＭ)を下表１２に示す(ｎ＝１およびｎ＝２のデータのみ)。
Figure 2010519280
 表１２
実施例５： ヒト扁桃(Tonisillar)Ｂ細胞ＣＸＣＬ１３により駆動される走化性アッセイ
１.４ ヒト扁桃Ｂ細胞におけるＣＸＣＬ１３により誘発される走化性の阻害
ヒト扁桃から一次扁桃Ｂ細胞を新しく単離し、一晩ＬＰＳで培養した。次に、これらの細胞を、ＥＤ８０濃度(１００ｎＭ)のヒト非グリコシル化ＣＸＣＬ１３(ＡＢＬ−ＭＥＬ細胞由来)を用いる走化性アッセイに用いた。アッセイ方法の詳細については「アッセイ材料および方法」の節を参照。抗体１(生殖系列化されたＩｇＧ１)のＩＣ５０データ(ｎＭ)を表１７に示す(ｎ＝４のデータ)。
Figure 2010519280
 表１７
実施例６： ＥＬＩＳＡにおける天然ｈＣＸＣＬ１３と抗体１(生殖系列化されたＩｇＧ１)との結合
「アッセイ材料および方法」の節に示されているように、抗体１(生殖系列化されたＩｇＧ１)は天然ＣＸＣＬ１３および組換えＣＸＣＬ１３の双方と結合し、このアッセイにおいて同濃度のリガンドは同等のシグナルを与えた。
実施例７：抗体１(生殖系列化されたＩｇＧ１)によるＣＸＣＬ−１３のＨ／Ｄ交換率の摂動
最初の実験では、ＣＸＣＬ１３溶液中のＤ２Ｏと交換され、その後、カラムに固定された抗体１(ＩｇＧ１)と結合した。次に、それはＨ２Ｏ中で交換されたが、なお抗体カラムと結合し、その結果、復帰交換反応の際にエピトープが保護され、結果として、重陽子で標識された。第二の実験では、ＣＸＣＬ１３はまずカラム上の抗体１と結合され、次にＤ２Ｏで標識され、最後にＨ２Ｏ中で復帰交換されたが、なおカラムと結合し、結果として、重陽子で標識されたＣＸＣＬ１３の部分は無かった。次に、この２つの実験の間の質量の違いを測定した。この２つの実験の重陽子化レベルの違いは、抗体と結合した際の交換の遅延の尺度となる。このプロトコールの詳細な方法は「材料および方法」の節に示されている。
ＭＥＬ細胞で発現した、配列番号１４で示される配列を有するヒトＣＸＣＬ１３を本試験に用いた。
Ｈ／Ｄ交換率に最大の摂動を示した領域はヒトＣＸＣＬ−１３(配列番号２０)のアミノ酸３１〜４２の間であった。
ｐＨ７において、抗体の不在下でほぼ分子全体にわたって交換速度が極めて速くなり、極めて柔軟な構造が示唆される。抗体と結合すると、分子の中心核で交換が緩慢となった。これは、３１〜４２の主要な部位の他に、弱い結合で相互作用する他の部位が存在し得ることを示唆する。
表１８は、抗体１と結合した際の重陽子化および陽子への復帰交換と、抗体と結合した際の溶液中での重陽子化および陽子への復帰交換を比較して、重陽子化レベルの違いのパーセンテージを示す。４時点を平均した際に１０％を超える違いがあれば有意であるとみなした。残基の符番は配列番号１４に示されている配列による。
Figure 2010519280
 表１８
参照文献
上記のいずれかに引用されているものを含め、本明細書中のいずれかに引用されている参照文献は全て、あらゆる目的で、出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる。
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Claims (66)

  1. ＣＸＣＬ１３に対する単離された結合要素であって、ＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合を阻害し、ＣＸＣＬ１３との結合に関して、配列番号１１のアミノ酸配列を有する抗体ｓｃＦｖ分子と競合する結合要素。
  2. 配列番号５のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の結合要素。
  3. 抗体１のＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３(ここで、
    ＨＣＤＲ１は配列番号３のアミノ酸配列を有し；
    ＨＣＤＲ２は配列番号４のアミノ酸配列を有し；
    ＨＣＤＲ３は配列番号５のアミノ酸配列を有し；
    ＬＣＤＲ１は配列番号８のアミノ酸配列を有し；
    ＬＣＤＲ２は配列番号９のアミノ酸配列を有し；そして
    ＬＣＤＲ３は配列番号１０のアミノ酸配列を有すると定義される)
    を含むか、または１以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を有する抗体１のＣＤＲセットを含む、請求項１または請求項２に記載の単離された結合要素。
  4. ＣＸＣＬ１３に対する単離された結合要素であって、ＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合を阻害し、抗体１のＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３(ここで、
    ＨＣＤＲ１は配列番号３のアミノ酸配列を有し；
    ＨＣＤＲ２は配列番号４のアミノ酸配列を有し；
    ＨＣＤＲ３は配列番号５のアミノ酸配列を有し；
    ＬＣＤＲ１は配列番号８のアミノ酸配列を有し；
    ＬＣＤＲ２は配列番号９のアミノ酸配列を有し；そして
    ＬＣＤＲ３は配列番号１０のアミノ酸配列を有すると定義される)
    を含むか、または１以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を有する抗体１のＣＤＲセットを含む、結合要素。
  5. 抗体１のＣＤＲセットを含むか、または１または２個の置換を有する抗体１のＣＤＲセットを含む、請求項３または請求項４に記載の結合要素。
  6. 抗体１のＣＤＲセットを含む、請求項３または４に記載の結合要素。
  7. 抗体ＶＨドメインと抗体ＶＬドメインを含む抗体分子を含み、該抗体分子がＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、該ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびフレームワークを含み、該ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３およびフレームワークを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合要素。
  8. 前記抗体分子がｓｃＦｖである、請求項７に記載の結合要素。
  9. 前記抗体分子が抗体定常領域を含む、請求項７に記載の結合要素。
  10. 前記抗体分子がＩｇＧ１である、請求項９に記載の結合要素。
  11. 前記抗体分子がヒト生殖細胞系遺伝子セグメント配列のフレームワーク領域を含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の結合要素。
  12. 前記抗体ＶＨドメインがヒト生殖細胞系フレームワークＶＨ３−２３を含む、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の結合要素。
  13. 前記抗体ＶＨドメインが、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項７〜１２のいずれか一項に記載の結合要素。
  14. 前記抗体ＶＨドメインアミノ酸配列が配列番号２である、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の結合要素。
  15. 前記抗体ＶＬドメインがヒト生殖細胞系フレームワークＶＫ１ Ｌ１２を含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の結合要素。
  16. 前記抗体分子が、配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の結合要素。
  17. 前記ＶＬドメインアミノ酸配列が配列番号７である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の結合要素。
  18. 前記抗体ＶＨドメインアミノ酸配列が配列番号２であり、抗体ＶＬドメインアミノ酸配列が配列番号７である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の結合要素。
  19. 結合要素の、ヒトＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合を中和する効力が、結合要素の、カニクイザルＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合を中和する効力と１０倍までで異なり、
    結合要素の、ヒトＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合を中和する効力が、ｃＡＭＰアッセイにおいて２ｎＭ以下のヒトＣＸＣＬ１３濃度で測定されるＩＣ５０により表され、
    結合要素の、カニクイザルＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合を中和する効力が、ｃＡＭＰアッセイにおいて終濃度２ｎＭのカニクイザルＣＸＣＬ１３で測定されるＩＣ５０により表される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の結合要素。
  20. ヒトＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合を中和する効力が、カニクイザルＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合を中和する効力と５倍までで異なる、請求項１９に記載の結合要素。
  21. ヒトＣＸＣＬ１３ ｃＡＭＰアッセイにおいて終濃度２ｎＭのＣＸＣＬ１３で測定した際に１２ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の結合要素。
  22. ヒトＣＸＣＬ１３カルシウム放出アッセイにおいて測定した際に終濃度１００ｎＭのＣＸＣＬ１３で４０ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合要素。
  23. ヒトＣＸＣＬ１３ Ｂ細胞走化性アッセイにおいて、およそＥＤ８０の応答を与える終濃度のヒトＣＸＣＬ１３と非一次Ｂ細胞系統を用いた際に１２ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の結合要素。
  24. 表面プラズモン共鳴を用いて測定した際に４００ｐＭ未満の親和性でヒトＣＸＣＬ１３と結合する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の結合要素。
  25. 表面プラズモン共鳴を用いて測定した際に４００ｐＭ未満の親和性でカニクイザルＣＸＣＬ１３と結合する請求項１〜２４のいずれか一項に記載の結合要素。
  26. ヒトＣＸＣＬ−１３のエピトープと結合し、該エピトープが成熟ヒトＩＬ−１７Ａの３１〜４２番の配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ(配列番号２０)の少なくとも１つの残基を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の結合要素。
  27. 請求項７〜２６のいずれか一項に記載の、抗体分子の単離されたＶＨドメイン。
  28. 請求項７〜２６のいずれか一項に記載の、抗体分子の単離されたＶＬドメイン。
  29. 請求項１〜２６のいずれか一項に記載の単離された結合要素と薬学上許容される賦形剤を含む組成物。
  30. 手術または療法によるヒトまたは動物の身体の処置方法に用いるための、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の単離された結合要素を含む組成物。
  31. ＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合の阻害に用いるための、請求項３０に記載の組成物。
  32. ＣＸＣＬ１３とＣＸＣＲ５との結合の阻害を目的とする薬剤の製造のための、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の単離された結合要素の使用。
  33. リンパ濾胞の異常な形成および／または発達の阻害に用いるための、請求項３１に記載の組成物または請求項３２に記載の使用。
  34. 骨および／または軟骨の破壊および／またはリモデリングの阻害に用いるための、請求項３１に記載の組成物または請求項３２に記載の使用。
  35. リンパ球の走化性および／またはリンパ腫の増殖の阻害に用いるための、請求項３１に記載の組成物または請求項３２に記載の使用。
  36. 関節リウマチ、変形性関節症、シェーグレン症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythmatosis)、自己免疫性甲状腺疾患、ライム神経ボレリア症、ＨＩＶ感染および／または白血病の処置に用いるための、請求項３１に記載の組成物または請求項３２に記載の使用。
  37. 関節リウマチの処置に用いるための、請求項３１に記載の組成物または請求項３２に記載の使用。
  38. 個体において異常なＣＸＣＬ１３発現および／またはＣＸＣＬ１３活性に関連する疾患を処置する方法であって、その個体に請求項１〜２６のいずれか一項に記載の結合要素を投与することを含む、方法。
  39. ＣＸＣＬ１３活性がＣＸＣＲ５と結合することである、請求項３８に記載の方法。
  40. 個体においてリンパ濾胞の異常な形成および／または発達を阻害することを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 個体において骨および／または軟骨の破壊および／またはリモデリングを阻害することを含む、請求項３９に記載の方法。
  42. 個体においてリンパ球の走化性および／またはリンパ腫の増殖を阻害することを含む、請求項３９に記載の方法。
  43. 疾患が関節リウマチ、変形性関節症、シェーグレン症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythmatosis)、自己免疫性甲状腺疾患、ライム神経ボレリア症、ＨＩＶ感染および／または白血病である、請求項３８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  44. 障害が関節リウマチである、請求項４３に記載の方法。
  45. 請求項１〜２８のいずれか一項に記載の、結合要素、または結合要素の単離されたＶＨもしくはＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
  46. in vitroにおいて請求項４５に記載の核酸で形質転換された宿主細胞。
  47. 結合要素または抗体ＶＨもしくはＶＬドメインを生産する方法であって、請求項４６に記載の宿主細胞を、結合要素または抗体ＶＨもしくはＶＬドメインの生産のための条件下で培養することを含む、方法。
  48. 結合要素、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを単離および／または精製することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記結合要素、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを、少なくとも１つの付加的成分を含む組成物へと処方することをさらに含む、請求項４７または請求項４８に記載の方法。
  50. ＣＸＣＬ１３に対する抗体抗原結合ドメインを生産する方法であって、
    ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む親ＶＨドメイン(該親ＶＨドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、抗体１のＨＣＤＲセットである)のアミノ酸配列における１以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または挿入によって、親ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを提供し、所望によりさらにこのようにした提供されたＶＨドメインと１以上のＶＬドメインを組み合わせて１以上のＶＨ／ＶＬ組合せを提供すること；および
    ＣＸＣＬ１３に対する抗体抗原結合ドメインを同定するために、親ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬ組合せを試験すること
    を含む、方法。
  51. 親ＶＨドメインが請求項２７に記載のＶＨドメインである、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記の１以上のＶＬドメインが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む親ＶＬドメイン(該親ＶＬドメインのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は抗体１ ＣＤＲのＶＬセットである)のアミノ酸配列における１以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または挿入により提供され、それぞれが親ＶＬドメインのアミノ酸配列変異体である１以上のＶＬドメインを生産する、請求項５０または請求項５１に記載の方法。
  53. 親ＶＬドメインが請求項２８に記載のＶＬドメインである、請求項５２に記載の方法。
  54. 親ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体である前記ＶＨドメインがＣＤＲ突然変異誘発により提供される、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. ＩｇＧ、ｓｃＦｖまたはＦａｂ抗体分子の成分としての抗体抗原結合ドメインを生産することをさらに含む、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  56. ＣＸＣＬ１３と結合する結合要素を生産する方法であって、
    ＶＨドメインをコードする出発核酸またはそれぞれＶＨドメインをコードする核酸の出発レパートリーを提供すること(該ＶＨドメインは被置換ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３を含むか、あるいはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３をコードする領域を欠くかのいずれかである)；
    該出発核酸または出発レパートリーと、抗体１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするか、または抗体１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３のアミノ酸配列の突然変異より作出されるドナー核酸(単数または複数)とを合わせ、その結果、該ドナー核酸(単数または複数)が、ＶＨドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを提供するように出発核酸または出発レパートリーのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域に挿入されること；
    該生成物レパートリーの核酸を発現させて、生成物ＶＨドメインを生産すること；
    所望により、該生成物ＶＨドメインと１以上のＶＬドメインを合わせること；
    生成物ＶＨドメインおよび所望によりＶＬドメインを含む、ＣＸＣＬ１３に対する結合要素を選択すること；および
    該結合要素またはそれをコードする核酸を回収すること
    を含む、方法。
  57. 前記ドナー核酸が前記ＨＣＤＲ１および／またはＨＣＤＲ２の突然変異により作出される、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ドナー核酸がＨＣＤＲ３の突然変異により作出される、請求項５６に記載の方法。
  59. 核酸のランダム突然変異によりドナー核酸を提供することを含む、請求項５６に記載の方法。
  60. 回収された結合要素内に含まれる生成物ＶＨドメインを抗体定常領域に結合させることをさらに含む、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 生成物ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むＩｇＧ、ｓｃＦｖまたはＦａｂ抗体分子を提供することを含む、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. ＣＸＣＬ１３と結合する抗体抗原結合ドメインまたは結合要素をＣＸＣＬ１３中和能に関して試験することをさらに含む、請求項５０〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. ＣＸＣＬ１３と結合してそれを中和する抗体分子を含む結合要素が得られる、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記抗体分子がｓｃＦｖである、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記抗体分子がＩｇＧである、請求項６３に記載の方法。
  66. 請求項５０〜６５のいずれか一項に記載の方法を用いて抗体分子を得ること、およびその抗体分子を少なくとも１つの付加的成分を含む組成物へと処方することを含む、抗体分子組成物の生産方法。
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