KR20090114464A

KR20090114464A - 모노클로날 항-ｃｘｃｌ１３ 항체

Info

Publication number: KR20090114464A
Application number: KR1020097019548A
Authority: KR
Inventors: 웬디 바커; 피너 앤 키예스
Original assignee: 아스트라제네카 아베; 메디뮨 리미티드
Priority date: 2007-02-21
Filing date: 2008-02-20
Publication date: 2009-11-03
Also published as: UY30932A1; ECSP099572A; BRPI0807631A2; AU2008217581A1; TW200846369A; IL200168A0; US20100086942A1; MX2009008608A; AR065433A1; WO2008102123A1; JP2010519280A; PE20090161A1; US20080199481A1; CA2677878A1; US8182811B2; CN101636413A; EP2129691A1

Abstract

본 발명은 CXCL13에 대한 결합 요소, 특히 항체 분자에 관한 것이다. 결합 요소는 관절염 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염을 비롯하여 CXCL13과 연관된 질환의 치료에 유용하다.

CXCL13, 결합 요소, 항체 분자, 관절염 질환, 류마티스성 관절염, 치료

Description

모노클로날 항-ＣＸＣＬ１３ 항체 {MONOCLONAL ANTI-CXCL13 ANTIBODIES}

본 발명은 CXCL13에 대한 결합 요소, 특히 항체 분자에 관한 것이다. 결합 요소는 관절염 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염을 포함하여 CXCL13과 연관된 질환의 치료에 유용하다.

CXCL13은 나이브 (naive) B 세포를 이차 림프계 기관의 여포 내로 유도하는, 효능있는 B 세포 화학 유인 물질이고, 이차 림프계 기관의 B 세포 풍부 영역 내의 여포성 수지상 세포 (FDC) 및 간질 세포에 의해 구성적으로 발현된다. CXCL13은 B 세포-유인성 케모킨 1 (BCA-1)로도 알려져 있다. CXCL13은 그의 수용체 CXCR5를 통해 신호를 전달한다. CXCR5는 7개의 트랜스멤브레인에 걸치는 G 단백질 커플링된 (coupled) 수용체이고, 클래스 1 GPCR 패밀리의 CXC-케모킨 수용체 서브패밀리의 요소이다. CXCR5는 말초 혈액 및 편도 B 세포를 포함하여 나이브 및 활성화된 B 세포 상에서 높은 수준으로 발현된다. 이는 또한 이차 림프양 조직 내의 활성화된 말초 혈액 CD4+ T 세포의 서브세트 및 대부분의 CD4+ 세포 상에서도 발현된다. CXCL13은 CXCR5에 대해 알려진 유일한 리간드이다.

CXCL13은 말초 림프계 기관의 발달시에 일정 기능을 수행한다. 예를 들어, 문헌 (Ansel et al [1])은 CXCL13이 결핍된 마우스에서 말초 림프절 발달이 심하게 결여됨을 보여주었다. CXCL13은 여포 내로 동원된 나이브 B 세포 상에서 막 림프독소 α1β2 발현을 유도하고, 이는 FDC의 성숙을 촉진하고 CXCL13 생산을 보다 향상시킨다 [1]. T 세포-의존성 항원으로 면역처리된 CXCL13-결핍 마우스는 림프절 및 비장에서 배 중심 (germinal centre)을 형성하지만, 이들은 작고, 불규칙한 구조를 갖고, 이러한 사실은 CXCL13이 여포 내의 B 세포의 동원 및 정확한 배치를 위해 필요함을 시사한다 [1].

또한, CXCL13은 선천성 면역에서 일정한 기능을 수행하고; CXCL13-결핍 마우스에는 복강 및 흉강 B1 세포 모두가 결여되고, 체강 세균 항원에 대한 천연 항체의 생산에 결함이 있다 (Ansel, KM. et al. Immunity, 16: 67-76, 2002).

본원의 다른 부분에서 논의되는 바와 같은 다양한 질환에 CXCL13이 관련된다는 증거가 존재한다.

CXCL13 결합 요소는 당업계에 보고된 바 있다. 예를 들어, MAB801은 시판되는 쥐 항-인간 CXCL13 모노클로날 항체 (알&디 시스템즈 (R&D Systems): MAB801)이다. MAB470은 래트 항-마우스 CXCL13 모노클로날 항체이다.

적절하게 설계된 선택 기술 및 분석을 이용하여, 본 발명자들은 그의 표적 수용체 CXCR5에 대한 CXCL13의 결합을 억제하는, CXCL13에 대한 결합 요소를 개발하였다.

본 발명의 결합 요소는 표적 수용체인 CXCR5에 대한 CXCL13의 결합을 억제한다. 결합의 억제는 직접적인 억제일 수 있다.

CXCL13-결합 요소로도 언급되는 CXCL13에 대한 결합 요소가 본원에서 설명된다. 결합 요소는 인간 CXCL13 및 비-인간 영장류 CXCL13, 예를 들어 사이노몰거스 CXCL13에 결합하여 중화시킬 수 있다. 비-인간 CXCL13은 인간 이외의 다른 종에서 자연에서 발생하는 CXCL13의 동족체 (ortholog)를 의미한다.

본 발명의 결합 요소는 통상 예를 들어 CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CXCL10 및/또는 CXCL12를 포함하는 케모킨의 CXC 패밀리의 다른 요소에 비해 CXCL13에 대해 특이적이고, 따라서 CXCL13에 선택적으로 결합한다. 이것은 예를 들어 경쟁 분석으로 결정되거나 입증될 수 있다. 예를 들어, 적합한 분석은 본원의 실시예 2.5에서 설명된다.

결합 요소는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 CXCR5에 대한 CXCL13의 결합 억제에 유용하고, 본원의 다른 부분에서 상세하게 설명되는 바와 같이 CXCL13과 연관된 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염의 치료를 위해 사용될 수 있다.

아래에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명에 따른 결합 요소는 높은 효능으로 CXCL13을 중화시키는 것으로 밝혀졌다. 중화는 CXCL13의 생물학적 활성의 억제를 의미한다. 본 발명의 결합 요소는 CXCL13의 하나 이상의 활성을 중화할 수 있다. 억제된 생물학적 활성은 일반적으로 결합 파트너에 대한 CXCL13 결합이다. 예를 들어, 억제된 생물학적 활성은 CXCR5에 대한 CXCL13의 결합일 수 있다.

본 발명에 따르면, 인간 또는 비-인간 CXCL13의 CXCR5에 대한 결합이 억제될 수 있다. 예를 들어, 결합 요소는 비-인간 영장류, 예를 들어 사이노몰거스, CXCL13의 CXCR5에 대한 결합을 억제할 수 있다. CXCR5는 인간 또는 비-인간, 예를 들어 비-인간 영장류, 예를 들어 사이노몰거스, 또는 마우스 CXCR5일 수 있다. 한 측면에서, CXCR5는 CXCL13과 동일한 종에서 유래한 것이다. 일반적으로, CXCR5는 인간 CXCR5이다.

CXCR5에 대한 CXCL13 결합의 중화는 예를 들어 CXCR5 신호전달-매개 활성의 함수로서 측정할 수 있고, 이것은 CXCR5에 대한 CXCL13 결합이 상기 활성을 자극하기 때문이다.

CXCR5는 G-단백질 커플링된 수용체이기 때문에, 활성은 G-단백질 커플링된 수용체와 연관된 활성일 수 있다.

예를 들어, CXCR5에 대한 CXCL13의 결합은 아데닐릴 시클라제 활성의 하향조절 및 아데닐릴 시클라제를 억제하는, G-단백질 서브유닛 Gαi의 방출을 통한 세포내 cAMP 수준의 감소를 야기할 수 있다. 따라서, 적합한 분석은 결합 요소의 부재 하에 발생하는 세포내 cAMP 수준 감소의 억제를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 즉, 본원에서 언급되는 cAMP 분석은 세포내 cAMP 수준의 CXCL13 매개 감소의 억제 (본 발명의 결합 요소에 의한)를 측정한다. 일반적으로, cAMP 분석에 사용되는 세포는 아데닐 시클라제 활성제, 예를 들어 NKH477로 동시 자극된다. 상기 분석에 사용하기 위한 적합한 세포가 본원에서 설명된다.

적합한 (세포내) cAMP 분석은 균일한 분석 포맷으로 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 및 시간차 형광 (TRF)을 조합한 분석 (본원에서 TRF/FRET cAMP 분석으로 언급됨)을 포함한다. TRF/FRET cAMP 분석의 예는 HTRF® (균질 시간차 형광) cAMP 분석 (시스바이오 인터내셔날 (CisBio International)) (예를 들어 [Gabriel D et al, (2003) Assay and Drug Development Technologies 1(2): 291-303] 참조) 및 LANCE® cAMP 분석 (퍼킨 엘머 (Perkin Elmer)) (예를 들어 [Hemmila et al (1999) J Biomol Screen 4(6): 303-308] 참조)을 포함한다.

FRET는 공여자-형광단과 적합한 수용자 형광단 (FRET 공여자-수용자 쌍) 사이의 여기 에너지의 비방사성 에너지 전달을 의미한다. 일반적으로, 분석 성분은 표지된 cAMP (추적자 (tracer) cAMP); 및 표지된 cAMP 특이적 항체를 포함한다. 각각의 추적자 cAMP 및 항체는 공여자-수용자 쌍의 하나의 요소로 표지된다. 항체가 추적자 cAMP에 결합할 때, FRET가 발생하고, 수용자에 의해 방출된 신호가 TRF에 의해 결정된다. 샘플 내의 유리 cAMP는 항체에 결합하기 위해 추적자 cAMP와 경쟁하고, FRET 신호를 저하시킨다. 따라서, 분석은 수용자에 의해 방출된 신호를 결정하는 것을 포함한다.

바람직하게는, 분석은 분석에서 착색 화합물의 존재를 상쇄하는 비율 측정치를 제공하기 위한 내부 대조군으로서 공여자와 수용자 모두의 특이적 신호를 결정하는 것을 포함한다.

이 분석에서, 공여자 수용자 쌍은 일반적으로 공여자가 약 337 내지 340 nm의 광에 의해 여기되도록 한다. 일반적으로, 공여자와 수용자 사이의 FRET 후에, 수용자는 약 665 nm에서 신호를 방출한다 (시간차일 수 있음). 예를 들어, XL665 (HTRF® cAMP 분석에서의 수용자)와 Alexa Fluor®-647 염료 (LANCE® cAMP 분석에서의 수용자) 모두는 665 nm에서 형광 신호를 방출한다. 공여자는 예를 들어 약 615 내지 620 nm에서 신호를 방출할 수 있다.

수용자는 예를 들어 적색 흡수 형광 염료, 특히 친수성 적색 흡수 염료일 수 있다 (Buschmann et al, Bioconjugate Chem. 2003, 14: 195-204). 적색 흡수 형광 염료는 예를 들어 LANCE® cAMP 분석에 사용되는 것과 같은 Alexa Fluor®-647 (퍼킨 엘머)일 수 있다.

공여자-수용자 쌍의 예는 예를 들어 HTRF® cAMP 분석에서 사용되는 유로퓸 크립테이트 (공여자)/XL665 (수용자), 및 예를 들어 LANCE® cAMP 분석에서 사용되는 유로퓸 킬레이트 (공여자)/Alexa Fluor®-647염료 (수용자)를 포함한다.

추적자 cAMP 또는 항체는 공여자 또는 수용자로 표지될 수 있다. 따라서, 분석은 (공여자 표지-추적자 cAMP) 및 (수용자 표지-cAMP 특이적 항체)의 사용, 또는 (수용자 표지-추적자 cAMP) 및 (공여자 표지-cAMP 특이적 항체)의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 분석은 예를 들어 HTRF® 분석에서와 같이 XL665-cAMP 및 유로퓸 크립테이트-항-cAMP 모노클로날 항체의 사용을 포함할 수 있다. 분석은 예를 들어 LANCE® 분석에서와 같이 유로퓸 킬레이트-표지된 cAMP 및 Alexa Fluor®-647염료 표지된 cAMP 항체의 사용을 포함할 수 있다.

TRF/FRET 분석에서 형광 신호는 TRF에 의해 결정된다.

TRF/FRET cAMP 분석은 아데닐릴 시클라제 활성제인 NKH477를 사용한 CH0qi5 CXCR5 세포의 동시 자극시에 세포내 cAMP 수준의 CXCL13 매개 감소의 억제를 분석하기 위해 사용될 수 있다.

일반적으로, HTRF® 분석에서, 서로 결합할 수 있는 거대분자들은 표지되는데, 하나는 유로퓸 (Eu3+) 크립테이트 (공여자)로, 다른 하나는 제2 형광 표지인 XL665 (또는 XLent) (안정한 가교결합된 알로피코시아닌)로 표지된다. 분자가 서로 결합하고, 여기시에 (337 nm에서), FRET가 발생하고, XL665가 665 nm에서 특이적인 오래 지속되는 형광을 재방출한다. 분석에서, 공여자 (620 nm에서)와 수용자 (665 nm에서) 모두의 특이적 신호를, 분석에서 착색 화합물의 존재를 상쇄하는 비율 측정치를 제공하는 내부 대조군으로서 측정한다.

HTRF® cAMP 분석은 일반적으로 XL665-cAMP (추적자 cAMP), 유로퓸 크립테이트-항-cAMP 모노클로날 항체와 cAMP를 함유하는 샘플을 혼합하는 것; 337 nm의 광을 인가하는 것 (이에 의해 유로퓸 크립테이트 공여자를 여기시킴); TRF에 의해 620 nm (공여자) 및 665 nm (수용자)에서의 형광 신호를 결정하는 것; 및 발생한 FRET의 척도로서 신호 665 nm/620 nm의 비를 결정하는 것을 포함한다. 샘플로부터의 임의의 유리 cAMP는 유로퓸 크립테이트-항-cAMP 모노클로날 항체에 대한 결합을 위해 XL665-cAMP (추적자 cAMP)와 경쟁한다. 최대 FRET는 샘플이 임의의 cAMP를 함유하지 않을 때 발생하고, FRET 신호는 샘플 cAMP가 증가하면서 감소한다.

따라서, HTRF® 기술은 방출된 신호의 스펙트럼 특성에 대해 (특허된 비율 보정) 및 시간차 검출 방식 (예를 들어 자가 형광의 제거) 하에 작용할, 형광에 의해 제시된 가능성을 이용한다. 이 기술은 균일하고, 이것은 샘플 및 검출 시약이 플레이트에서 함께 혼합되고, 적합한 플레이트 판독기로 판독될 수 있음을 의미한다 (소위 "혼합 및 판독" 프로토콜).

LANCE® cAMP 분석은 TRF 및 FRET, 및 청색 염료와 연관된 화합물 간섭 없이 FRET 분석을 허용하는 적색-전환된 (red-shifted) Alexa® Fluor 염료 (퍼킨 엘머)의 사용을 조합한다.

LANCE® cAMP 분석은 일반적으로 유로퓸/스트렙타비딘-비오틴/cAMP 추적자의 유로퓸-킬레이트, Alexa Fluor®-647-표지된 cAMP 특이적 항체와 cAMP를 함유하는 샘플을 혼합하는 것; 340 nm의 광을 인가하는 것 (이에 의해 유로퓸 공여자를 여기시킴); 및 발생한 FRET의 척도로서 TRF에 의해 665 nm (수용자)에서의 형광 신호를 결정하는 것을 포함한다. 킬레이트로부터의 잔류 에너지는 615 nm의 광을 생성시킨다. 샘플로부터의 임의의 유리 cAMP는 Alexa®-표지된-항-cAMP 모노클로날 항체에 결합하기 위해 유로퓸 표지된-cAMP (추적자 cAMP)와 경쟁한다. 최대 FRET는 샘플이 임의의 cAMP를 함유하지 않을 때 발생하고, FRET 신호는 샘플 cAMP가 증가하면서 감소한다.

적합한 표준물질을 사용하여 분석을 조정할 수 있다.

분석 프로토콜 및 상기 분석의 성능의 예를 본원의 물질 및 방법 섹션에서 상세하게 설명한다.

CXCR5에 대한 CXCL13 결합의 중화를 결정하기 위해 분석될 수 있는 다른 CXCR5 신호전달-매개 활성은 CXCL13 유도 칼슘 방출이다. 일반적으로, 결합 요소는 CXCR5 및 G-단백질 Gqi5를 발현하는 세포에서 CXCL13 유도 칼슘 방출의 억제 효과에 대해 분석된다. 상기 세포를 CXCL13으로 자극하면, 세포내 저장기로부터의 방출 및 세포외 배지로부터의 유입을 유도함으로써 농도 의존적 방식으로 세포질 Ca² ⁺을 증가시킨다. 이것은 형광 영상화 플레이트 판독기 (Fluorescence Imaging Plate Reader; FLIPR)로 칼슘 감수성 염료를 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기 분석의 하나는 Gqi5 및 인간 CXCR5로 형질감염된 인간 CXCL13 및 CHO 세포주를 사용한다.

cAMP 분석 및 Ca² ⁺ 방출 분석은 CXCR5 및 Gαi 서브유닛을 함유하는 G 단백질 Gqi5를 발현하는 포유동물 세포주, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 CHO K1 세포를 사용하여 시험관 내에서 수행할 수 있다. 적합한 세포주는 CXCR5 및 Gqi5를 코딩하는 핵산으로 세포를 형질감염시켜 생산할 수 있다.

CXCL13은 효능있는 B 세포 화학 유인 물질이다. CXCL13은 나이브 및 활성화된 B 세포 상에서, 및 활성화된 T 세포의 서브세트 상에서 높은 수준으로 발현되는 CXCR5 수용체를 통해 신호를 전달한다. 따라서, CXCR5에 대한 CXCL13 결합의 중화를 결정하기 위해서 분석될 수 있는 다른 활성은 CXCR5를 발현하는 B 세포에서의 CXCL13 유도 화학주성이다.

분석에서 B 세포는 비-일차 B 세포이다. 상기 분석의 하나는 인간 재조합 CXCR5로 형질감염된 쥐 프리-B (pre-B) 세포주 (B300.19 hCXCR5 세포)를 사용한다.

별법으로, 일차 B 세포를 사용할 수 있다. 상기 분석의 하나는 쥐 비장으로부터 단리된 혼합된 림프구 집단을 사용한다.

따라서, 적합한 분석, 예를 들어 cAMP, 칼슘 방출 및 B 세포 화학주성 분석은 아래에서 설명하는 바와 같이 CXCR5에 대한 CXCL13의 결합을 억제하는 결합 요소의 효능을 계산하기 위해 사용될 수 있다. 상기 분석은 CXCR5에 대한 CXCL13 결합을 중화하기 위한 결합 요소의 효능을 계산하기 위해 사용될 수 있다. 중화 효능은 CXCR5 신호전달-매개 활성의 함수로서 계산된다. 분석은 세포내 cAMP 수준의 감소; 세포내 칼슘 수준의 증가; 또는 B 세포 화학주성을 야기하는 유도된 CXCL13을 중화하는 효능을 측정할 수 있다.

생물학적 활성의 억제는 부분적이거나 완전한 억제일 수 있다. 결합 요소는 결합 요소 부재시의 활성의 100％, 또는 적어도 95％, 적어도 90％, 적어도 85％, 적어도 80％, 적어도 75％, 적어도 70％, 적어도 60％, 또는 적어도 50％까지 CXCL13의 생물학적 활성을 억제할 수 있다.

결합 요소의 중화 효능을 결정할 수 있다. 효능은 달리 나타내지 않으면 보통 IC₅₀ 값 (nM)으로 표현된다. 기능적 분석에서, IC₅₀은 생물학적 반응을 그의 최대치의 50％까지 저하시키는 결합 요소의 농도이다. 리간드-결합 연구에서, IC₅₀은 수용체 결합을 최대의 특이적 결합 수준의 50％까지 저하시키는 농도이다. IC₅₀은 최대의 생물학적 반응 ％를 결합 요소 농도의 로그의 함수로서 플로팅하고, IC₅₀ 값을 생성시키기 위해 S자형 함수를 데이타에 피팅하기 위한 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 Prism (그래프패드 (GraphPad))를 사용하여 계산할 수 있다. 효능은 당업자에게 공지되고/되거나 본원에서 설명되거나 언급되는 하나 이상의 분석을 사용하여 결정하거나 측정될 수 있다.

본원에서 설명되는 분석, 예를 들어 cAMP, 칼슘 방출 또는 B 세포 화학주성 분석에서 결합 요소에 의한 CXCL13 활성의 중화는 결합 요소가 CXCL13에 결합하여 CXCR5에 대한 CXCL13의 결합을 억제함을 나타낸다. 결합 요소의 CXCL13에 대한 결합을 결정하기 위해 사용될 수 있는 다른 방법은 ELISA, 웨스턴 블로팅 (Western blotting), 면역침전, 친화도 크로마토그래피 및 생화학적 분석을 포함한다.

제1 종 (예를 들어 인간)의 CXCL13을 사용하는 분석에서 계산된 결합 요소의 중화 효능은 두 종의 CXCL13에 대한 결합 요소의 교차반응성 정도를 평가하기 위해서 제2의 종 (예를 들어 사이노몰거스 원숭이와 같은 비-인간 영장류)의 CXCL13을 사용하는 동일한 분석에서의 결합 요소의 중화 효능과 비교할 수 있다. 별법으로, 교차반응성은 본원의 다른 부분에서 보다 상세하게 설명되는 경쟁 결합 분석에서 평가할 수 있다.

본 발명의 결합 요소는 CXCR5에 대한 사이노몰거스 CXCL13의 결합을 중화하는 효능의 10배 이내인, CXCR5에 대한 인간 CXCL13의 결합을 중화하는 효능을 가질 수 있다. 효능은 예를 들어 각각 인간 및 사이노몰거스 CXCL13을 사용하여 cAMP 분석 (예를 들어 TRF-FRET 분석, 예를 들어 LANCE® cAMP 분석)에서 또는 B 세포 화학주성 분석에서 측정할 수 있다. 인간 CXCL13을 사용한 cAMP 분석, 예를 들어 LANCE® cAMP 분석에서의 효능은 예를 들어 사이노몰거스 CXCL13을 사용한 cAMP 분석과 10-, 5-, 4-, 3- 또는 2-배 이하의 차이가 있을 수 있다. cAMP 분석에서의 효능은 2 nM의 인간 또는 사이노몰거스 CXCL13의 최종 농도에 대해 결정된다. 인간 CXCL13 및 사이노몰거스 CXCL13을 사용한 LANCE® cAMP 분석에서 얻은 데이타의 예를 표 2 및 5에 제시한다.

본 발명의 결합 요소는 사이노몰거스 CXCL13보다 인간 CXCL13에 더 강력하게 결합할 수 있다. 결합 요소의 인간 CXCL13에 대한 결합 강도는 예를 들어 경쟁 결합 분석으로 측정시에 사이노몰거스 CXCL13에 대한 결합 강도보다 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2-배 이하로 더 클 수 있다. 예를 들어, 결합 강도는 사이노몰거스 CXCL13에 대해서보다 인간 CXCL13에 대해 4-배 이하로 더 클 수 있다. 인간 및 사이노몰거스 CXCL13을 사용한 경쟁 분석에서 얻은 데이타의 예를 표 8에 제시한다.

본 발명의 결합 요소는 본원에서 설명되는 인간 CXCL13 cAMP 분석에서 2 nM의 최종 농도의 CXCL13을 사용할 때 중화 효능 또는 IC₅₀이 약 12 nM 이하일 수 있다. IC₅₀은 예를 들어 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 nM 이하, 예를 들어 5 nM 이하일 수 있다. 결합 요소는 본원에서 설명되는 임의의 형태, 예를 들어, IgG 또는 scFv 또는 임의의 다른 적합한 형태일 수 있다.

본 발명의 결합 요소는 본원에서 설명되는 사이노몰거스 CXCL13 cAMP 분석에서 2 nM의 최종 농도의 CXCL13을 사용할 때 중화 효능 또는 IC₅₀이 약 12 nM 이하일 수 있다. IC₅₀은 예를 들어 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 nM 이하, 예를 들어 3 nM 이하일 수 있다. 결합 요소는 본원에서 설명되는 임의의 형태, 예를 들어, IgG 또는 scFv 또는 임의의 다른 적합한 형태일 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 결합 요소는 인간 CXCL13 HTRF® cAMP 분석에서 2 nM의 최종 농도의 CXCL13을 사용할 때 중화 효능 또는 IC₅₀이 약 12 nM 이하일 수 있다. IC₅₀은 예를 들어 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 nM 이하, 예를 들어 5 nM 이하일 수 있다. 인간 CXCL13 HTRF® cAMP 분석에서 얻은 데이타의 예를 표 1에 제시한다.

예를 들어, 본 발명의 결합 요소는 사이노몰거스 CXCL13 HTRF® cAMP 분석에서 2 nM의 최종 농도의 CXCL13을 사용할 때 중화 효능 또는 IC₅₀이 약 12 nM 이하일 수 있다. IC₅₀은 예를 들어 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 nM 이하, 예를 들어 3 nM 이하일 수 있다. 사이노몰거스 CXCL13 HTRF® cAMP 분석에서 얻은 데이타의 예를 표 1에 제시한다.

한 예에서, 예를 들어 분석되는 결합 요소가 IgG 형태인 경우에, 결합 요소는 본원에서 설명되는 인간 CXCL13 cAMP 분석에서 2 nM의 최종 농도의 CXCL13을 사용할 때 중화 효능 또는 IC₅₀이 약 5 nM 이하일 수 있다. IC₅₀은 예를 들어 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.9, 1.7, 1.5, 1.3, 1.1, 1.0, 0.9, 0.7 또는 0.5 nM 이하, 예를 들어 1.4 nM 이하 또는 1.6 nM 이하일 수 있다.

한 예에서, 예를 들어 분석되는 결합 요소가 IgG 형태인 경우에, 결합 요소는 본원에서 설명되는 사이노몰거스 CXCL13 cAMP 분석에서 2 nM의 최종 농도의 CXCL13을 사용할 때 중화 효능 또는 IC₅₀이 약 5 nM 이하일 수 있다. IC₅₀은 예를 들어 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5, 0.4 또는 0.2 nM 이하, 예를 들어 0.3 nM 이하일 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 결합 요소는 인간 CXCL13 LANCE® cAMP 분석에서 2 nM의 최종 농도의 CXCL13을 사용할 때 중화 효능 또는 IC₅₀이 약 5 nM 이하일 수 있다. IC₅₀은 예를 들어 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.9, 1.7, 1.5, 1.3, 1.1, 1.0, 0.9, 0.7 또는 0.5 nM 이하, 예를 들어 1.4 nM 이하, 또는 1.6 nM 이하일 수 있다. 인간 CXCL13 LANCE® cAMP 분석에서 얻은 데이타의 예를 표 2 및 5에 제시한다.

예를 들어, 본 발명의 결합 요소는 사이노몰거스 CXCL13 LANCE® cAMP 분석에서 2 nM의 최종 농도의 CXCL13을 사용할 때 중화 효능 또는 IC₅₀이 약 5 nM 이하일 수 있다. IC₅₀은 예를 들어 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5, 0.4 또는 0.2 nM 이하, 예를 들어 0.3 nM 이하일 수 있다. 사이노몰거스 CXCL13 LANCE® cAMP 분석에서 얻은 데이타의 예를 표 2 및 5에 제시한다.

본 발명의 결합 요소는 인간 CXCL13 칼슘 방출 분석에서 100 nM의 최종 농도의 CXCL13을 사용할 때 중화 효능 또는 IC₅₀이 약 40 nM 이하일 수 있다. IC₅₀은 예를 들어 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 또는 2 nM 이하일 수 있다. 인간 CXCL13 칼슘 방출 분석에서 얻은 데이타의 예를 표 4 및 7에 제시한다.

본 발명의 결합 요소는 인간 CXCL13 B 세포 화학주성 분석에서 약 ED80 반응을 유도하는 최종 농도의 인간 CXCL13 및 인간 재조합 CXCR5로 형질감염된 비-일차 B 세포주를 사용할 때 중화 효능 또는 IC₅₀이 12 nM 이하일 수 있다. IC₅₀은 예를 들어 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 1.5 nM 이하일 수 있다. 일반적으로, 분석은 인간 재조합 CXCR5로 형질감염된 B 세포주, 예를 들어 쥐 프리-B 세포주, 예를 들어 인간 재조합 CXCR5를 발현하는 B300.19 세포를 사용한다. 인간 CXCL13 B 세포 화학주성 분석에서 얻은 데이타의 예를 표 3 및 6에 제시한다.

본 발명의 결합 요소는 사이노몰거스 CXCL13 B 세포 화학주성 분석에서 약 ED80 반응을 유도하는 최종 농도의 사이노몰거스 CXCL13 및 인간 재조합 CXCR5로 형질감염된 비-일차 B 세포주를 사용할 때 중화 효능 또는 IC₅₀이 10 nM 이하일 수 있다. IC₅₀은 예를 들어 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 nM 이하일 수 있다. 일반적으로, 분석은 인간 재조합 CXCR5로 형질감염된 B 세포주, 예를 들어 쥐 프리-B 세포주, 예를 들어 재조합 CXCR5를 발현하는 B300.19 세포를 사용한다. 사이노몰거스 CXCL13 B 세포 화학주성 분석에서 얻은 데이타의 예를 표 6에 제시한다.

본 발명의 결합 요소는 인간 CXCL13 일차 세포 화학주성 분석에서 약 ED80 반응을 유도하는 최종 농도의 인간 CXCL13 및 혼합된 림프구 집단을 사용할 때 중화 효능 또는 IC₅₀이 40 nM 이하일 수 있다. IC₅₀은 예를 들어 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4 또는 2 nM 이하일 수 있다. 일반적으로, 분석은 마우스 비장으로부터 새로 단리된 일차 림프구 집단을 사용한다. 인간 CXCL13 및 쥐 일차 림프구를 사용하는 인간 CXCL13 일차 세포 화학주성 분석에서 얻은 데이타의 예를 표 12에 제시한다.

CXCR13에 대한 CXCR13 결합 요소의 결합 동역학 및 친화도 (평형 해리 상수 K_D로 표현됨)는 예를 들어 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어 바이아코어 (BIAcore)를 사용하여 결정할 수 있다. 본 발명의 결합 요소는 보통 인간 CXCR13에 대한 친화도가 400 pM 미만, 예를 들어 380, 360, 340, 320, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 또는 50 pM 미만이다. 사이노몰거스 CXCR13에 대한 친화도는 보통 인간 CXCR13에 대한 친화도와 유사하다. 바이아코어를 사용하여 인간 CXCR13 및 사이노몰거스 CXCL13에 대해 얻은 데이타의 예를 10 및 11에 제시한다.

본 발명의 결합 요소의 인간 CXCL13 및 cyno CXCL13에 대한 친화도는 150 pM 미만일 수 있다.

결합 동역학 및 친화도는 결합 요소를 포함하는 표면 상에 인간 또는 cyno CXCL13을 유동시킴으로써 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정할 수 있다.

일반적으로, 달리 특정되지 않으면, 상기 분석에 대해 설명된 중화 효능은 본원에서 설명되는 바와 같이 임의의 형태로 분석되는 결합 요소에 적용될 수 있다. 예를 들어, 효능은 본원에서 설명되는 임의의 항체 단편을 포함하는 항체 분자에 적용될 수 있다.

인간 CXCL13의 글리코실화된 및 비글리코실화된 형태는 CXCL13이 포유동물 세포주 (MEL 세포)에서 재조합 방식으로 발현될 때 얻었다. 생산된 대부분의 인간 CXCL13은 비글리코실화되었지만, 글리코실화된 형태를 함유하는 보다 작은 분획은 발현 규모를 확대하여 얻을 수 있다. MEL 세포에서 발현된 사이노몰거스 CXCL13은 글리코실화되었다. 글리코실화된 및 비글리코실화된 인간 CXCL13에 대한 항체 1의 효능은 본원에서 설명되는 B 세포 화학주성 분석에서 측정될 때 10배 이내의 차이가 있었고, 효능이 동일한 것으로 간주될 수 있다. 비글리코실화된 인간 CXCL13, 글리코실화된 인간 CXCL13 및 글리코실화된 사이노몰거스 CXCL13에 대한 예시적인 효능 데이타를 실시예 2.3의 표 6에 제시한다. 내인성 CXCL13이 글리코실화될 수 있고, 따라서 글리코실화된 인간 CXCL13은 인간 치료를 위한 치료 표적 항원을 제시할 수 있기 때문에, 글리코실화된 인간 CXCL13에 대한 결합은 본 발명의 결합 요소의 잇점을 나타낼 수 있다.

본원에서 설명되는 분석에서, 재조합 CXCL13, 예를 들어 인간 CXCL13은 비글리코실화된 또는 글리코실화된 형태로 사용될 수 있다. 본 발명자들의 데이타는 본 발명의 결합 요소가 글리코실화에 의해 영향받지 않은 CXCL13의 구역 내의 에피토프에 결합할 수 있음을 나타낸다 (실시예 2.3 및 표 6 참조). 따라서, 인간 CXCL13에 대해 본원에서 설명되는 분석에서의 결합 요소 효능은 비글리코실화된 인간 CXCL13과 글리코실화된 인간 CXCL13 모두에 대해 적용될 수 있다.

본 발명의 결합 요소는 본원에서 설명되는 분석, 예를 들어 B 세포 화학주성 분석에서 글리코실화된 인간 CXCL13에 비해 비글리코실화된 인간 CXCL13에 대해 10-, 5-, 4-, 3-, 2.5-, 또는 2배 이하로 더 큰 효능을 가질 수 있다. 물론, 글리코실화된 인간 CXCL13에 대한 효능이 비글리코실화된 인간 CXCL13에 대한 효능보다 더 클 수 있다.

글리코실화된 인간 CXCL13에 대한 본 발명의 결합 요소의 효능은 비글리코실화된 인간 CXCL13에 대한 효능과 유사하거나 동일할 수 있다. 예를 들어, 효능은 본원에서 설명되는 경쟁 결합 분석, cAMP 분석, 칼슘 방출 분석 또는 B 세포 화학주성 분석에서 측정할 때 10-, 5-, 4-, 3-, 2.5-, 또는 2배 이하의 차이가 있을 수 있다.

본 발명의 결합 요소는 항체 분자, 예를 들어 인간 항체 분자를 포함할 수 있다. 결합 요소는 보통 항체 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 결합 요소의 VH 및 VL 도메인은 또한 본 발명의 일부로서 제공된다. 각각의 VH 및 VL 도메인 내에 상보성 결정 구역 ("CDR"), 및 프레임워크 구역 ("FR")이 존재한다. VH 도메인은 HCDR의 세트를 포함하고, VL 도메인은 LCDR의 세트를 포함한다. 항체 분자는 VH CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인 및 프레임워크를 포함할 수 있다. 항체 분자는 다른 방식으로 또는 추가로 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 VL 도메인 및 프레임워크를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 항체 VH 및 VL 도메인 및 CDR의 예는 본원의 일부를 구성하는 첨부하는 서열 목록에 제시한다. 본원에 개시된 모든 VH 및 VL 서열, CDR 서열, CDR 세트 및 HCDR의 세트 및 LCDR의 세트가 본 발명의 측면 및 실시태양을 나타낸다. 본원에서 설명되는 바와 같이, "CDR 세트"는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 따라서, HCDR의 세트는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 나타내고, LCDR의 세트는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 나타낸다. 달리 언급되지 않으면, "CDR 세트"는 HCDR 및 LCDR을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 결합 요소는 모노클로날 항체이다.

본 발명의 결합 요소는 보통 하나 이상의 CDR, 예를 들어 아래에서 논의되는 바와 같은 비-항체 단백질 스캐폴드 (scaffold) 내의 CDR 세트에 의해 제공되는 항원 결합 부위를 비-항체 분자 내에 포함할 수 있다.

실시예에서 보다 상세하게 설명하는 바와 같이, 본 발명자들은 항체 1로 명명한 항체 분자를 단리하였다. 본원에서 설명되는 항체 1은 항체 1 CDR 세트를 갖는 항체를 의미한다. 항체 1의 서열은 첨부하는 서열 목록에 제시되고, 여기서 다음 서열이 다음 순서로 제시된다: VH 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 1); VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 2); VH CDR1 아미노산 서열 (서열 3); VH CDR2 아미노산 서열 (서열 4); VH CDR3 아미노산 서열 (서열 5); VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 6); VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 7); VL CDR1 아미노산 서열 (서열 8); VL CDR2 아미노산 서열 (서열 9); VL CDR3 아미노산 서열 (서열 10).

본 발명의 결합 요소는 본원에서 설명되는 하나 이상의 CDR, 예를 들어 CDR3, 및 또한 임의로 CDR 세트를 형성하기 위한 CDR1 및 CDR2를 포함할 수 있다. CDR 또는 CDR 세트는 항체 1의 CDR 또는 CDR 세트일 수 있거나, 또는 본원에서 설명되는 그의 변이체일 수 있다.

본 발명은 항체 1의 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3 및/또는 항체 1의 LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3, 예를 들어 항체 1 CDR 세트를 포함하는 결합 요소를 제공한다. 결합 요소는 항체 1의 VH CDR 세트를 포함할 수 있다. 임의로, 결합 요소는 또한 항체 1의 VL CDR 세트를 포함할 수 있고, VL CDR은 VH CDR과 동일하거나 상이한 항체로부터 유래한 것일 수 있다. 항체 1의 HLCDR 세트를 포함하는 VH 도메인, 및/또는 항체 1의 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인도 본 발명에서 제공된다.

일반적으로, VH 도메인은 VL 도메인과 쌍을 이루어 항체 항원 결합 부위를 제공하지만, 아래에서 추가로 논의되는 바와 같이 항원 결합을 위해 VH 또는 VL 도메인이 단독으로 사용될 수 있다. 항체 1 VH 도메인은 항체 1 VL 도메인과 쌍을 이루어, 항체 1 VH 및 VL 도메인을 모두 포함하는 항체 항원 결합 부위가 형성된다. 다른 실시태양에서, 항체 1 VH는 항체 1 VL 이외의 다른 VL 도메인과 쌍을 이룬다. 경쇄 뒤섞임 (promiscuity)은 당업계에 잘 확립되어 있다. 따라서, 항체 1의 VH는 항체 1의 또는 다른 항체의 VL과 쌍을 이룰 수 있다.

결합 요소는 H 및/또는 L CDR의 개시된 세트 내에 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 존재하는, 항체 1의 H 및/또는 L CDR 세트를 포함할 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실일 수 있다. 따라서, 예를 들어, H 및/또는 L CDR 세트 내에 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 돌연변이, 예를 들어 치환이 존재할 수 있다. 예를 들어, HCDR3에 1개 또는 5, 4, 3 또는 2개 이하의 돌연변이, 예를 들어 치환이 존재할 수 있고/있거나 LCDR3에 1개 또는 5, 4, 3 또는 2개 이하의 돌연변이, 예를 들어 치환이 존재할 수 있다.

결합 요소는 항체 프레임워크 내에 하나 이상의 CDR, 예를 들어 CDR 세트를 갖는 항체 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체의 하나 이상의 CDR 또는 CDR 세트는 프레임워크 (예를 들어 인간 프레임워크)에 그라프팅 (grafting)되어 항체 분자를 제공할 수 있다. 프레임워크 구역은 인간 생식세포 유전자 서열에서 유래된 것일 수 있다. 따라서, 프레임워크는 생식세포에서 유래 (germlining)될 수 있고, 여기서 프레임워크 내의 하나 이상의 잔기는 가장 유사한 인간 생식세포 프레임워크 내의 동등한 위치에서 잔기를 일치시키도록 변경된다. 본 발명의 결합 요소는 인간 생식세포 프레임워크, 예를 들어 인간 생식세포 프레임워크에 HCDR의 세트를 포함하는 VH 도메인, 예를 들어 인간 VH3-23을 갖는 단리된 인간 항체 분자일 수 있다. 또한, 결합 요소는 통상 예를 들어 인간 생식세포 프레임워크, 예를 들어 VK1 L12에 LCDR의 세트를 포함하는 VL 도메인을 갖는다. 생식세포에서 유래된 VH 또는 VL 도메인은 하나 이상의 베니어 (Vernier) 잔기가 생식세포에서 유래될 수 있거나 유도되지 않을 수 있다.

비-생식세포에서 유래된 항체 분자는 생식세포에서 유래된 항체 분자에 비해 동일한 CDR을 갖지만, 프레임워크는 상이하다. 첨부하는 서열 목록에서 제시된 항체 1의 항체 서열은 생식세포에서 유래된 것이다. 본원의 실시예에서 설명되는 바와 같이, 단리된 항체 1 VH 및 VL 도메인의 생식세포에서의 유도는 VH 도메인에 Q1E, V5L, R16G, V23A, G24A, H39Q, G83R 및 R105Q의 돌연변이를; VL 도메인에 I15V, A58V 및 D70E의 돌연변이를 생성시키는 것을 수반한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명에 따른 VH 도메인 (상기 VH 도메인을 포함하는 결합 요소 포함)은 상기 VH 돌연변이의 1개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 8개 모두가 회복된 서열 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, VH 도메인은 서열 2의 위치 30, 97 및 98에서 치환되지 않는다. 이와 유사하게, 본 발명에 따른 VL 도메인은 상기 VL 돌연변이의 1개, 2개 또는 3개 모두가 회복된 서열 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, VL 도메인은 서열 7의 위치 2에서 치환되지 않는다.

한 측면에서, 본 발명의 결합 요소는 (i) 서열 2의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 프레임워크 구역에 하나 이상의 아미노산 변경 (예를 들어 치환) (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 치환)이 존재하는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (ii) 서열 7의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 프레임워크 구역에 하나 이상의 아미노산 변경 (예를 들어 치환) (예를 들어 1, 2 또는 3개의 치환)이 존재하는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 상기 측면의 한 실시태양에서, 결합 요소 (예를 들어 IgG)의 VH 도메인은 서열 2의 위치 30, 97 및 98 중의 하나 또는 전부에서 치환되지 않고, VL 도메인은 서열 7의 위치 2에서 치환되지 않는다. VH 도메인은 서열 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 또는 G30S; T97A; R98K의 아미노산 치환 중의 하나 이상 (예를 들어 1, 2 또는 전부)이 존재하는 서열 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VL 도메인은 서열 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 또는 아미노산 치환 T2Ile가 존재하는 서열 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

항체 1에 대해 본원에서 제공되는 데이타는 생식세포에서 유래된 형태 및/또는 비-생식세포에서 유래된 포맷에 대해 제시되는 것이고, 이것은 적절하게 경우에 따라 표시된다. 생식세포에서 유래된 형태에서 시험된 항체에서, 비-생식세포에서 유래된 형태와 비교할 때 매우 유사한 데이타가 얻어졌다.

항체 1의 카파 VL 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 제시된 3' cgt 코돈, 및 대응하는 아르기닌 잔기가 상기 항체의 발현된 scFv 및 IgG 서열에 포함되었다. 서열의 C 말단 아르기닌 잔기는 카바트 잔기 108에 대응한다. 상기 잔기 및 그의 코딩 삼중자 (triplet) cgt의 기원은 아래에서 설명된다.

IgG의 경쇄를 발현하기 위해서, VL 도메인을 코딩하는 제1 엑손, CL 도메인을 코딩하는 제2 엑손, 및 제1 엑손과 제2 엑손을 분리하는 인트론을 포함하는, 항체 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제시되었다. 정상적인 환경 하에서, 제1 엑손의 3' 말단과 제2 엑손의 5' 말단을 연결하는 인트론은 세포의 mRNA 처리 기구에 의해 스플라이싱된다. 따라서, 상기 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA가 RNA로서 발현될 때, 제1 및 제2 엑손은 함께 스플라이싱되었다. 스플라이싱된 RNA의 번역은 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 생성시킨다. 스플라이싱 후에, 카바트 잔기 108의 Arg은 VL 도메인 프레임워크 4 서열의 마지막 염기 (c) 및 CL 도메인의 처음 2개의 염기 (gt)에 의해 코딩된다.

카바트 잔기 108의 아르기닌 잔기는 항체 분자의 VL 도메인의 C 말단 잔기로 간주될 수 있다.

본 발명의 결합 요소는, (i) CXCL13에 결합하고, (ii) 본원에 개시된 결합 요소, VH 및/또는 VL 도메인, CDR, 예를 들어 HCDR3, 및/또는 CDR 세트를 포함하는 임의의 결합 요소와 CXCL13에 대한 결합을 위해 경쟁하는 것일 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 서열 11의 scFv 항체 분자와 결합을 위해 경쟁하는 결합 요소를 제공한다. 서열 11의 서열은 링커 서열 (Gly120 내지 Ser134)에 의해 서열 7의 VL 도메인에 연결된 서열 2의 VH 도메인에 대응한다. 결합 요소는 항체 1의 CDR 또는 CDR 세트, 또는 본원의 다른 부분에서 설명되는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 결합 요소는 항체 분자, 예를 들어 IgG (예를 들어 IgG1) 또는 본원의 다른 부분에서 설명되는 scFv일 수 있다.

결합 요소는 경쟁 분석에서 완전한 또는 부분적인 경쟁을 보일 수 있다. 예를 들어, 결합 요소는 경쟁 분석에서 CXCL13에 대한 결합을 위해, 예를 들어 서열 11의 서열을 갖는 항체 scFv 분자와 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 또는 100％의 경쟁을 보일 수 있다.

결합 요소 사이의 경쟁은 예를 들어 ELISA를 사용하여 및/또는 동일한 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합하는 결합 요소의 확인을 가능하게 하기 위해 특이적인 리포터 분자를 하나 이상의 다른 비태깅된 결합 요소의 존재 하에 검출될 수 있는 하나의 결합 요소에 태깅함으로써 시험관 내에서 쉽게 분석할 수 있다. 상기 방법은 당업자에게 알려져 있고, 본원에서 보다 상세하게 설명된다. 예를 들어, cAMP 분석과 관련하여 본원에서 설명되는 TRF-FRET 기술을 사용하는 에피토프 경쟁 분석 (TRF-FRET 에피토프 경쟁 분석), 예를 들어 HTRF® 에피토프 경쟁 분석을 사용할 수 있다.

HTRF® 기술은 cAMP 분석과 관련하여 본원에서 설명된다. HTRF® 에피토프 경쟁 분석은 일반적으로 XL665-표지된 CXCL13, 유로퓸 크립테이트-표지된 참조 항체 (예를 들어, 서열 11의 scFv 항체 분자) 및 시험 결합 요소를 혼합하는 것; 337 nm의 광을 인가하는 것 (이에 의해 유로퓸 크립테이트 공여자를 여기시킴); TRF에 의해 620 nm (공여자) 및 665 nm (수용자)에서의 형광 신호를 결정하는 것; 및 발생한 FRET의 척도로서 신호 665 nm/620 nm의 비를 결정하는 것을 포함한다. CXCL13에 대한 결합을 위해 참조 항체와 경쟁하는 시험 결합 요소, 예를 들어 IgG 또는 ScFv 항체 분자는 발생하는 FRET를 감소시킨다. 상기 분석 방법의 상세한 내용이 실시예에서 제시된다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면은 CXCL13에 대한 결합을 위해 항체 분자, 예를 들어 특히 항체 1의 VH 및/또는 VL 도메인, CDR, 예를 들어 HCDR3, 또는 CDR 세트를 포함하는 항체 분자와 경쟁하는 인간 항체 항원 결합 부위를 포함하는 결합 요소를 제공한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 CXCL13에 결합하기 위해 항체 항원 결합 부위와 경쟁하는 인간 항체 항원 결합 부위를 포함하는 결합 요소를 제공하고, 여기서 항체 항원 결합 부위는 VH 도메인 및 VL 도메인으로 이루어지고, VH 및 VL 도메인은 본원에 개시된 항체 1 CDR 세트를 포함한다.

본 발명의 결합 요소는 인간 CXCL13의 에피토프에 결합할 수 있고, 상기 에피토프는 성숙 인간 IL-17A의 위치 31-42의 서열 Ile-Leu-Pro-Arg-Gly-Asn-Gly-Cys-Pro-Arg-Lys-Glu (서열 20) 중의 적어도 하나의 잔기를 포함한다. 결합 요소는 예를 들어 서열 20의 1, 2, 3, 4, 5개 또는 5개 초과의 잔기에 결합할 수 있다. 본 발명의 결합 요소는 서열 20 이외에 인간 CXCL13의 다른 구역에도 결합할 수 있다.

결합 요소에 의해 결합되는 잔기의 서열을 결정하기 위해 임의의 적합한 방법, 예를 들어 수소-중수소 교환, 부위 지정 돌연변이 유발, 질량분광법, NMR, 및 X-선 결정술을 사용할 수 있다.

펩티드 아미드 수소 교환은 단백질 연구에 사용하기 위한, 문헌에 매우 잘 설명된 방법이다 (Englander, S.W. et al. Methods Enzymol. 232:26-42, 1994). 보다 최근에는, 이 방법은 양성자를 교환할 수 있는 중수소 표지된 단백질을 사용하기 위해 추가로 개발되었고, 이것은 전체 단백질에 걸친 교환 속도를 측정하기 위해 질량분광법과 연계되었다 (Pantazatos, D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 101(3):751-756, 2004). 상기 수소/중수소 교환 속도 (H/D 교환)는 단백질의 일부가 다른 분자에 대한 결합에 관련될 때 교환 속도가 유의하게 느려지도록 하는 용매에 대한 접근성에 의해 유의하게 변경될 수 있다. 이 방법은 항체와의 상호작용에 관련되는 단백질의 구역을 매핑 (mapping)하기 위해 사용되었고, 본원의 실시예 7에 상세히 설명되는 바와 같이 본 발명의 항체에 대한 결합에 관련되는 CXCL13의 구역을 조사하기 위해 사용되었다. 질량분광법은 결합 요소와 접촉하는 인간 CXCL13의 구역을 확인하기 위해 H/D 교환과 함께 사용되었다. 예를 들어, 서열 20 내의 잔기에 대한 H/D 교환은 인간 CXCL13이 본 발명의 결합 요소에 결합될 때 유의하게 저하됨을 입증할 수 있다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 요소, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산, 및 상기 결합 요소, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 생산하는 조건 하에서 상기 핵산을 발현시키는 것, 및 발현 산물을 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 결합 요소, VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 측면은 본원에 개시된 VH CDR 또는 VL CDR 서열을 코딩하는, 일반적으로 단리된 핵산을 제공한다.

다른 측면은 본 발명의 핵산을 함유하거나 본 발명의 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 결합 요소를 함유하는 조성물, 및 요법에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법을 포함하는, CXCL13의 억제 및/또는 중화 방법에서의 그의 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 결합 요소는 환자에게 유효량의 본 발명의 결합 요소를 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물 신체 (예를 들어, 인간 환자)에서 질병 또는 질환의 치료 (예방 목적의 치료를 포함할 수 있음) 또는 진단 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 치료가능한 병태는 본원의 다른 부분에서 설명되는 바와 같이 CXCL13가 기능하는 임의의 병태를 포함한다.

본 발명의 이들 및 다른 측면을 아래에서 보다 상세하게 설명한다.

본원에서 사용되는 "및/또는"은 2개의 제시된 특징 또는 성분이 각각 다른 특징 또는 성분과 함께 존재하거나 또는 다른 특징 또는 성분이 배제된 상태로 존재함을 구체적으로 나타내는 것으로서 이해되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 마치 그 각각이 본원에 개별적으로 제시된 것처럼 각각 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B를 구체적으로 나타내는 것으로서 이해되어야 한다.

CXCL13

CXCL13은 케모킨 (C-X-C 모티프) 리간드 13이다. 전장 인간 CXCL13의 서열은 기탁 번호 NP_006410 (서열 12)로 기탁되었다. 전장 아미노산 서열은 생체 내에서 절단되어 성숙 형태를 생성시키는 22개 잔기의 N-말단 펩티드를 포함한다. 성숙 CXCL13은 서열 13의 아미노산을 갖는다. 성숙 CXCL13은 치료 및 진단 적용을 위한 생체 내 표적 항원이고, 본원에서 인간 CXCL13에 대한 언급은 달리 특정되지 않으면 성숙 CXCL13을 지칭하는 것이다.

본원에서 설명되는 특정 분석 및 실험을 위해, 인간 CXCL13을 MEL 세포주에서 발현시켰다. MEL 세포로부터 발현된 인간 CXCL13은 C-말단에서 말단절단되고, 그의 아미노산 서열은 서열 14이다. 따라서, 서열 14는 본원에서 설명되는 분석에서 사용되는 MEL-발현 인간 CXCL13이다. 비-말단절단된 성숙 CXCL13 (서열 13)도 분석에 사용하기 적합하고, 말단절단이 수득되는 결과에 영향을 주는 것으로 생각되지 않는다.

비오티닐화된 인간 CXCL13이 본원에서 설명되는 일부 분석에 사용되었다. 상기 CXCL13은 합성에 의해 생산되었고, 대부분의 C 말단 라이신 잔기에 비오틴을 갖는 서열 13의 성숙 CXCL13 서열을 갖는다.

일부 실시태양에서, CXCL13은 사이노몰거스 CXCL13일 수 있다. 본원에서 실험을 위해 MEL 세포로부터 발현될 때, 사이노몰거스 CXCL13은 5개의 아미노산이 C-말단에서 말단절단되었고, 서열 16의 아미노산 서열을 갖는다.

비말단절단된 성숙 사이노몰거스 CXCL13의 제안된 서열은 서열 15이다. 제시된 바와 같이, 비말단절단된 전장 cyno 서열은 인간 및 붉은털원숭이 (rhesus) CXCL13에 대해 C-말단에 위치하는 KRKIP를 포함하는 것으로 제안된다. 이것은 인간 CXCL13이 말단절단될 때 성숙 인간 CXCL13으로부터 제거되는 구역에, 클로닝에 사용된 붉은털원숭이 프라이머가 어닐링되도록 설계되었기 때문인 것으로 가정된다.

또한, 비-말단절단된 성숙 CXCL13 (서열 15)도 분석에 사용하기 적합하고, 말단절단이 수득되는 결과에 영향을 주는 것으로 생각되지 않는다.

본원의 다른 부분에서 설명되는 바와 같이, CXCL13은 재조합체일 수 있고/있거나 글리코실화 또는 비글리코실화될 수 있다. 글리코실화된 및/또는 비글리코실화된 CXCL13은 재조합 시스템, 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포주, 쥐 세포주, 예를 들어 MEL 세포, 또는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현될 수 있다.

CXCR5

CXCR5는 본원의 다른 부분에서 설명되는 CXCL13에 대한 수용체이다. 인간 CXCR5는 2개의 이소형으로 존재한다. CXCR5 이소형 1의 아미노산 서열은 기탁 번호 NP_001707로 기탁되었고, 본원에서 서열 17로 제시된다. CXCR5 이소형 2의 아미노산 서열은 기탁 번호 NP_116743으로 기탁되었고, 본원에서 서열 18로 제시된다. 이소형 2는 N-말단에서 45개의 아미노산이 말단절단된다. 따라서, 이소형 2에는 변이체 1의 번역 개시 코돈 및 세포외 도메인이 결여되고, 리간드에 결합하지 않고 기능을 보이지 않을 것이다.

서열 17의 인간 CXCR5의 이소형 1을 본원의 실험에 사용하였다. 따라서, 본원에서 언급되는 CXCR5는 달리 나타내지 않으면 인간 이소형 1이다.

본원에서 언급되는 CXCR5는 문맥에서 표시되는 바와 같이 인간 또는 비-인간 CXCR5일 수 있다. 예를 들어, 인간 CXCL13 또는 비-인간 CXCL13을 사용하는 중화 분석에서, 적절한 종으로부터의 CXCR5가 선택될 수 있다. 적절한 종은 인간 또는 비-인간 CXCR5일 수 있고, 여기서 결합 파트너는 동일한 종으로부터의 인간 또는 비-인간 CXCL13이다. 별법으로, 인간 또는 비-인간 CXCL13은 상이한 종으로부터의 인간 또는 비-인간 CXCL5와 함께 분석에 사용될 수 있고, 여기서 인간 또는 비-인간 CXCL13은 교차반응하는 것으로 알려진 것이다.

결합 요소

결합 요소는 서로 결합하는 한쌍의 분자의 한 요소를 의미한다. 결합쌍의 요소는 자연에서 유도되거나 또는 완전히 또는 부분적으로 합성에 의해 생산될 수 있다. 분자쌍의 한 요소는 그 분자쌍의 다른 요소에 결합하고 다른 요소의 특정 공간적 및 극성 구조에 상보성인, 그의 표면 상의 영역 또는 공간을 갖는다. 결합쌍 종류의 예는 항원-항체, 비오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 효소-기질이다. 본 발명은 일반적으로 항원-항체 종류의 반응과 관련이 있다.

결합 요소는 보통 항원 결합 부위를 갖는 분자를 포함한다. 예를 들어, 결합 요소는 항체 분자 또는 항원 결합 부위를 포함하는 비-항체 단백질일 수 있다.

항원 결합 부위는 비-항체 단백질 스캐폴드, 예를 들어 피브로넥틴 또는 시토크롬 B 등 상에 CDR을 배열하거나 [2, 3, 4], 또는 목적하는 표적에 대한 결합 특이성을 부여하기 위해서 단백질 스캐폴드 내의 루프의 아미노산 잔기를 랜덤화시키거나 돌연변이시킴으로써 제공될 수 있다. 단백질 내의 신규한 결합 부위를 공학처리하기 위한 스캐폴드는 문헌에서 상세하게 논의되었다 (Nygren et al. [4]). 항체 모방체 (mimic)에 대한 단백질 스캐폴드는 그 전부가 본원에 참고로 포함된 WO/0034784에 개시되어 있고, 여기서 발명자들은 적어도 하나의 랜덤화된 루프를 갖는 피브로넥틴 타입 III 도메인을 포함하는 단백질 (항체 모방체)을 설명하였다. 하나 이상의 CDR, 예를 들어 HCDR의 세트를 그 내부에 그라프팅하기 위한 적합한 스캐폴드는 면역글로불린 유전자 수퍼패밀리의 임의의 도메인 요소에 의해 제공될 수 있다. 스캐폴드는 인간 또는 비-인간 단백질일 수 있다. 비-항체 단백질 스캐폴드의 잇점은 적어도 몇몇의 항체 분자보다 더 작고/작거나 제조가 더 용이한 항원 결합 부위를 스캐폴드 분자에 제공할 수 있다는 점이다. 결합 요소의 작은 크기는 유용한 생리학적 특성, 예를 들어 세포에 도입되거나, 조직에 깊이 투과되거나 다른 구조 내의 표적에 도달하거나 또는 표적 항원의 단백질 공간 내에 결합하는 능력을 부여할 수 있다. 비-항체 단백질 스캐폴드에 항원 결합 부위를 이용하는 것은 문헌에 기재되어 있다 (Wess, 2004 [5]). 루프 또는 루프들의 아미노산 서열이 표적 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 생성시키기 위해 특이적으로 또는 랜덤하게 돌연변이된, 안정한 백본 및 하나 이상의 가변 루프를 갖는 단백질이 일반적이다. 상기 단백질은 에스. 아우레우스 (S. aureus)의 단백질 A의 IgG-결합 도메인, 트랜스페린, 테트라넥틴, 피브로넥틴 (예를 들어 10번째 피브로넥틴 타입 III 도메인), 리포칼린 및 감마-결정 및 다른 Affilin™ 스캐폴드 (실 프로테인즈 (Scil Proteins))를 포함한다. 다른 방안의 예는 분자내 디술피드 결합을 갖는 작은 단백질인 시클로티드계의 합성 "마이크로바디 (Microbody)", 마이크로단백질 (Microprotein) (Versabodies™, 아뮤닉스 (Amunix)) 및 안키린 반복 단백질 (DARPins, 몰레큘라 파트너스 (Molecular Partners))을 포함한다.

항체 서열 및/또는 항원 결합 부위에 추가로, 본 발명에 따른 결합 요소는 예를 들어 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어 폴딩된 도메인을 형성하거나, 또는 항원에 결합하는 능력 이외의 다른 기능적 특성을 분자에 부여하는 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 결합 요소는 검출가능한 표지를 가질 수 있거나, 또는 독소 또는 표적화 모이어티 또는 효소에 (예를 들어, 펩티딜 결합 또는 링커를 통해) 컨쥬게이팅될 수 있다. 예를 들어, 결합 요소는 촉매 부위 (예를 들어 효소 도메인 내의) 및 항원 결합 부위를 포함할 수 있고, 여기서 항원 결합 부위는 항원에 결합하여 촉매 부위를 항원에 표적화시킨다. 촉매 부위는 항원의 생물학적 기능을, 예를 들어 절단에 의해 억제할 수 있다.

CDR은 비-항체 스캐폴드에 의해 담지될 수 있지만, 본 발명의 CDR 또는 CDR 세트를 담지하기 위한 구조체는 일반적으로 CDR 또는 CDR 세트가 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 자연 발생 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR 또는 CDR 세트에 대응하는 위치에 위치하는 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 그의 실질적인 부분일 것이다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 문헌 ([Kabat, et al., 1987] [6] 및 그의 최신 개정판)에 따라 결정할 수 있다. 상기 데이타베이스에 문의하기 위한 많은 학술적인 및 상업적인 온-라인 (on-line) 사이트를 이용할 수 있다. 예를 들어, 참고문헌 [7] 및 현재 웹사이트 주소가 http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html인 관련 온-라인 사이트를 참고한다.

CDR 구역 또는 CDR은 문헌 (Kabat et al. 1991 [8] 및 및 추후 편집본)에 의해 규정된 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 초가변 구역을 나타내고자 한 것이다. 항체는 일반적으로 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함한다. 용어 CDR(들)은 상황에 따라 상기 구역의 하나, 또는 항원 또는 항체가 인식하는 에피토프에 대한 항체의 친화도에 의한 결합을 책임지는 대다수의 아미노산 잔기를 포함하는 상기 구역의 일부 또는 심지어 전체를 나타내기 위해 본원에서 사용된다.

6개의 짧은 CDR 서열 중에서, 중쇄의 제3 CDR (HCDR3)은 보다 큰 크기 가변성 (본질적으로 그를 생성시키는 유전자의 정렬 메카니즘에 의한 보다 큰 다양성)을 갖는다. 이것은 알려진 가장 긴 크기가 26개 아미노산이지만, 2개의 아미노산만큼 짧을 수 있다. 또한, CDR 길이는 기초를 이루는 특정 프레임워크에 의해 수용될 수 있는 길이에 따라 상이할 수 있다. 기능적으로, HCDR3은 항체의 특이성 결정시에 일정 역할을 수행한다 [9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16].

항체 분자

항체 분자는 천연 면역글로불린 또는 부분적으로 또는 완전히 합성에 의해 생산된 면역글로불린을 의미한다. 또한, 이것은 항체 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포괄한다. 본 발명이 천연 형태의 항체에 관한 것이 아님을 이해하여야 한다. 즉, 항체는 천연 환경에 존재하지 않지만, 천연 공급원으로부터 단리되거나 정제에 의해 얻거나, 또는 유전자 재조합에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 얻고, 아래에서 설명되는 바와 같이 추후에 비천연 아미노산을 함유할 수 있다. 항체 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb 및 Fd와 같은 분자를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어 Fab₂, Fab₃, 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody) 및 미니바디 (minibody)를 포함하여 하나 이상의 항체 항원 결합 부위를 포함하는 다양한 다른 항체 분자가 공학적으로 처리되었다. 항체 분자 및 그의 제조 및 사용 방법이 문헌 [17]에 기재되어 있다.

모노클로날 및 다른 항체를 사용하고, 표적 항원에 결합하는 다른 항체 또는 키메라 (chimera) 분자를 생산하기 위해 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 상기 기술은 면역글로불린 가변 구역, 또는 항체의 CDR을 코딩하는 DNA를, 상이한 면역글로불린의 불변 구역, 또는 불변 구역 + 프레임워크 구역에 도입하는 것을 수반할 수 있다 (예를 들어, EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400, 및 후속 문헌 참조). 하이브리도마 또는 항체를 생산하는 다른 세포에는 유전자 돌연변이 또는 다른 변화가 적용될 수 있고, 이것은 생산된 항체의 결합 특이성을 변경시키거나 변경시키지 않을 수 있다.

항체는 많은 방식으로 변경될 수 있기 때문에, 용어 "항체 분자"는 항원에 대한 요구되는 특이성 및/또는 결합을 갖는, 항체 항원 결합 부위가 존재하는 임의의 결합 요소 또는 물질을 포괄하는 것으로서 간주되어야 한다. 따라서, 이 용어는 천연 또는 완전히 또는 부분적으로 합성된, 항체 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함하는 항체 단편 및 유도체를 포괄한다. 다른 폴리펩티드 (예를 들어, 다른 종으로부터 유도되거나 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는)에 융합된 항체 항원 결합 부위 또는 동등물을 포함하는 키메라 분자가 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023, 및 후속 문헌에 기재되어 있다.

항체의 공학 처리 분야에서 이용가능한 추가의 기술을 사용하여 인간 및 인간화 항체를 단리할 수 있다. 예를 들어, 인간 하이브리도마는 문헌 (Kontermann & Dubel [18])에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 결합 요소 생성을 위해 확립된 다른 기술인 파지 디스플레이가 많은 간행물, 예를 들어 문헌 (Kontermann & Dubel [18]) 및 WO92/01047 (아래에서 추가로 논의됨), 및 미국 특허 US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404에 상세하게 기재되어 있다.

마우스 면역계의 다른 성분을 무손상 상태로 유지하면서 마우스 항체 유전자가 불활성화되고 인간 항체 유전자로 기능적으로 대체된 트랜스제닉 (transgenic) 마우스가 인간 항체를 단리하기 위해 사용될 수 있다 [19]. 인간화 항체는 예를 들어 WO91/09967, US 5,585,089, EP592106, US 5,565,332 및 WO93/17105에 개시되어 있는 것과 같은, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 또한, WO2004/006955에는 비-인간 항체의 가변 구역의 CDR 서열에 대한 정규 (canonical) CDR 구조 유형을 인간 항체 서열의 라이브러리, 예를 들어 생식세포 항체 유전자 세그먼트로부터 대응하는 CDR에 대한 정규 CDR 구조 유형과 비교함으로써, 인간 항체 유전자로부터 가변 구역 프레임워크 서열을 선택하는 것을 기초로 하여 항체를 인간화하는 방법이 기재되어 있다. 비-인간 CDR과 유사한 정규 CDR 구조 유형을 갖는 인간 항체 가변 구역은 인간 프레임워크 서열이 그로부터 선택되는 인간 항체 서열의 서브세트를 형성한다. 서브세트 요소는 인간과 비-인간 CDR 서열 사이의 아미노산 유사성에 의해 추가로 평가될 수 있다. WO2004/006955의 방법에서, 선택된 서브세트 요소 인간 프레임워크를 사용하여 인간 CDR 서열을 비-인간 CDR 대응물로 기능적으로 대체한 키메라 항체를 제조하기 위한 프레임워크 서열을 제공함으로써, 비-인간 항체와 인간 항체 사이의 프레임워크 서열을 비교할 필요 없이 고 친화도 및 저 면역원성의 인간화 항체를 제공하기 위해 가장 우수한 인간 서열이 선택된다. 또한, 상기 방법에 따라 제조된 키메라 항체가 개시된다.

합성 항체 분자는 예를 들어 문헌 (Knappik et al. [20] 또는 Krebs et al. [21])에 기재된 바와 같이 합성되어 적합한 발현 벡터 내에 조립된 올리고뉴클레오티드에 의해 생성된 유전자로부터의 발현에 의해 생성될 수 있다.

전체 항체의 단편이 결합 항원의 기능을 수행할 수 있음이 밝혀졌다. 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb 단편 [22, 23, 24]; (v) 단리된 CDR 구역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 2개의 도메인이 회합하여 항원 결합 부위를 형성하도록 허용하는 펩티드 링커에 의해 연결된 단일쇄 Fv 분자 (scFv) [25, 26]; (viii) 이중특이적 단일쇄 Fv 이량체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제조된 "디아바디", 다가 또는 다중특이적 단편 (WO94/13804; [27])이다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디술피드 브릿지의 도입에 의해 안정화될 수 있다 [28]. CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디도 제조할 수 있다 [29]. 결합 단편의 다른 예는 항체 힌지 구역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하여 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 몇개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이한 Fab', 및 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab' 단편인 Fab'-SH이다.

본 발명의 항체 단편은 항체 분자 1로부터 출발하여, 효소, 예를 들어 펩신 또는 파파인에 의한 소화 및/또는 화학적 환원에 의한 디술피드 브릿지의 절단에 의한 것과 같은 방법에 의해 얻을 수 있다. 다른 방법에서, 본 발명에 포함되는 항체 단편은 당업자에게 공지된 유전자 재조합 기술에 의해 또는 예를 들어 자동 펩티드 합성기, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) 등과 같은 회사에 의해 공급되는 것에 의한 펩티드 합성에 의해 또는 핵산 합성 및 발현에 의해 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 기능성 항체 단편은 그의 반감기가 화학적 변형, 특히 PEG화에 의해, 또는 리포좀 내로의 도입에 의해 증가되는 임의의 기능성 단편을 포함한다.

dAb (도메인 항체)는 항체의 작은 단량체 항원 결합 단편, 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 구역이다 [24]. VH dAb는 카멜리드 (camelid) (예를 들어 낙타, 라마)에서 자연 발생하고, 카멜리드를 표적 항원으로 면역처리하고, 항원-특이적 B 세포를 단리하고, 개별적인 B 세포로부터 dAb 유전자를 직접 클로닝함으로써 생산될 수 있다. 또한, dAb는 세포 배양에서 생산될 수도 있다. 그의 작은 크기, 우수한 용해도 및 온도 안정성 때문에, dAb는 특히 생리학적으로 유용하고 선택 및 친화도 성숙에 적합하다. 카멜리드 VH dAb가 "나노바디™"의 명칭 하에 치료 용도를 위해 개발되고 있다. 본 발명의 결합 요소는 실질적으로 본원에서 제시된 VH 또는 VL 도메인, 또는 실질적으로 본원에서 제시된 CDR 세트를 포함하는 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 dAb일 수 있다.

이중특이적 또는 2기능성 항체는 2개의 상이한 가변 구역이 동일한 분자에서 조합된, 2차적으로 생성된 모노클로날 항체이다 [30]. 그의 용도는 새로운 효과기 기능을 보충하거나 또는 종양 세포 표면 상의 몇개의 분자를 표적화하는 그의 능력에 의해 진단 분야 및 치료 분야 모두에서 입증되었다. 이중특이적 항체가 사용되어야 하는 경우에, 이들은 다양한 방식으로 제조될 수 있고 [31], 예를 들어 화학적으로 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있는 종래의 이중특이적 항체일 수 있거나, 또는 상기한 임의의 이중특이적 항체 단편일 수 있다. 상기 항체는 화학적 방법 [32, 33] 또는 체세포 (somatic) 방법 [34, 35]에 의해, 그러나 우선적으로 이종이량체화 (heterodimerization)를 강제하여 탐색하는 항체의 정제 공정을 용이하게 할 수 있는 유전공학 기술 [36]에 의해 얻을 수 있다. 이중특이적 항체의 예는 특이성이 상이한 2개의 항체의 결합 도메인이 사용되고 짧은 가요성 펩티드를 통해 직접 연결될 수 있는 BiTE™ 기술의 항체를 포함한다. 이것은 2개의 항체를 짧은 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 조합한다. 디아바디 및 scFv는 Fc 구역 없이 가변 도메인만을 사용하여 제조될 수 있고, 잠재적으로 항-개별특이형 반응의 효과를 저하시킬 수 있다.

이중특이적 항체는 전체 IgG, 이중특이적 Fab'2, Fab'PEG, 디아바디 또는 이중특이적 scFv로서 제조할 수 있다. 또한, 2개의 이중특이적 항체는 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 연결되어 4가 항체를 형성할 수 있다. 또한, 이중특이적 전체 항체와 달리, 이중특이적 디아바디는 특히 이. 콜라이 (E. coli)에서 쉽게 제조되어 발현될 수 있기 때문에 유용할 수 있다. 적절한 결합 특이성의 디아바디 (및 많은 다른 폴리펩티드, 예를 들어 항체 단편)는 라이브러리로부터 파지 디스플레이 (WO94/13804)를 사용하여 쉽게 선택될 수 있다. 예를 들어 CXCL13에 대해 작용하는 특이성을 갖는 디아바디의 한 아암 (arm)이 일정하게 유지되어야 할 경우에, 다른 아암이 변경되고 적절한 특이성의 항체가 선택되는 라이브러리가 제조될 수 있다. 이중특이적 전체 항체는 문헌 (Ridgeway et al., 1996 [37])에 기재된 바와 같은 다른 공학적 방법에 의해 제조될 수 있다.

CXCL13에 대해 작용하는 항체를 얻기 위한 다양한 방법이 당업계에서 이용가능하다. 항체는 모노클로날 항체, 특히 인간, 쥐, 키메라 또는 인간화 항체 기원의 모노클로날 항체일 수 있고, 당업자에게 공지된 표준 방법에 따라 얻을 수 있다.

일반적으로, 특히 쥐 기원의 모노클로날 항체 또는 그의 기능성 단편의 제조를 위해, 특히 매뉴얼 ("Antibodies" [38])에 기재된 기술 또는 문헌 (Koehler and Milstein [39])에 기재된 하이브리도마로부터의 제조 기술을 참고할 수 있다.

모노클로날 항체는 예를 들어 CXCL13, 또는 상기 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 그의 단편의 하나에 대해 면역처리된 동물 세포로부터 얻을 수 있다. 적합한 단편 및 펩티드 또는 이를 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 동물을 면역처리함으로써 CXCL13에 대해 작용하는 항체를 생성시킬 수 있다. 상기 CXCL13, 또는 그의 단편의 하나는 특히 통상적인 실행 방법에 따라, CXCL13 또는 그의 단편을 코딩하는 cDNA 서열에 함유된 핵산 서열로 출발하는 유전자 재조합에 의해, CXCL13 및/또는 그의 단편의 펩티드 서열에 포함된 아미노산의 서열로부터 출발하는 펩티드 합성에 의해 생산될 수 있다.

모노클로날 항체는 예를 들어 CXCL13 또는 상기 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 그의 단편의 하나가 그 위에 사전에 고정된 친화도 컬럼에서 정제될 수 있다. 보다 특히, 모노클로날 항체는 단백질 A 및/또는 G에 대한 크로마토그래피에 의해 정제된 후, 잔류 단백질 오염물 및 DNA 및 LPS 자체를 제거하기 위해 이온-교환 크로마토그래피를 수행할 수 있거나 하지 않을 수 있고, 이어서 이량체 또는 다른 다량체의 존재에 의한 잠재적인 응집체를 제거하기 위해 세파로스 겔에 대한 배제 크로마토그래피를 수행할 수 있거나 하지 않을 수 있다. 한 실시태양에서, 상기 전체 기술은 동시에 또는 연속적으로 사용될 수 있다.

항원 결합 부위

항원 결합 부위는 표적 항원의 전부 또는 일부에 결합하고 상보성인 분자의 일부이다. 항체 분자에서, 항원 결합 부위는 항체 항원 결합 부위로 언급되고, 표적 항원의 전부 또는 일부에 결합하고 상보성인 항체 부분을 포함한다. 항원이 큰 경우, 항체는 에피토프로 불리는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있다. 항체 항원 결합 부위는 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 항체 항원 결합 부위는 항체 경쇄 가변 구역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 구역 (VH)을 포함할 수 있다.

단리

"단리된"은 본 발명의 결합 요소, 또는 상기 결합 요소를 코딩하는 핵산이 일반적으로 본 발명에 따른 상태임을 의미한다. 따라서, 예를 들어 그의 자연 환경으로부터 실질적으로 순수한 또는 균질한 형태로 단리 및/또는 정제된, 또는 핵산의 경우에 요구되는 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 이외의 다른 기원의 핵산 또는 유전자가 존재하지 않거나 실질적으로 존재하지 않는, 결합 요소, VH 및/또는 VL 도메인, 및 본 발명에 따른 코딩 핵산 분자 및 벡터가 제공될 수 있다. 단리된 요소 및 단리된 핵산에는 자연에서 함께 회합되는 물질, 예를 들어 자연 환경, 또는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 실시되는 재조합 DNA 기술에 의해 그들이 제조되는 환경 (예를 들어, 세포 배양액)에서 함께 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 존재하지 않거나 또는 실질적으로 존재하지 않을 것이다. 요소 및 핵산은 희석제 또는 어쥬번트 (adjuvant)와 함께 제제화될 수 있고, 실제 목적을 위해 계속 단리될 수 있다 - 예를 들어, 요소는 면역분석에 사용하기 위한 미량역가 플레이트의 코팅에 사용될 경우 보통 젤라틴 또는 다른 담체와 혼합될 것이거나, 또는 진단 또는 요법에 사용될 때 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 혼합될 것이다. 결합 요소는 자연상태에서 또는 이종성 진핵세포 (예를 들어 CHO 또는 NSO (ECACC 85110503) 세포)의 시스템에 의해 글리코실화될 수 있거나, 또는 (예를 들어, 원핵세포 내에서의 발현에 의해 생산될 경우) 비글리코실화될 수 있다.

또한, 항-CXCL13 항체 분자를 포함하는 이종성 제제도 본 발명의 일부를 형성한다. 예를 들어, 상기 제제는 상이한 글리코실화 수준 및/또는 유도체화된 아미노산, 예를 들어 피로글루탐산 잔기를 형성하는 N-말단 글루탐산의 고리화를 갖는 전장 중쇄 및 C-말단 라이신이 결여된 중쇄를 갖는 항체의 혼합물일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 구문 "실질적으로 제시된 바와 같은"은 본원에서 설명되는 결합 요소의 VH 또는 VL 도메인의 관련 CDR의 특성(들)이, 그 서열이 본원에서 제시된 특정 구역과 동일하거나 매우 유사함을 나타낸다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 하나 이상의 가변 도메인의 특정 구역(들)에 대해서 구문 "매우 유사한"은 1 내지 5개, 예를 들어 1 내지 4개, 예를 들어 1 내지 3개, 또는 1 또는 2개, 또는 3 또는 4개의 아미노산 치환이 CDR 및/또는 VH 또는 VL 도메인에 형성될 수 있음을 고려한 것이다.

상기에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 결합 요소는 CXCL13의 생물학적 활성을 조정하고 중화시킬 수 있다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 본 발명의 CXCL13-결합 요소는 중화 효능을 추가로 개선시키기 위해 효능 최적화될 수 있다. 일반적으로, 효능 최적화는 선택된 결합 요소의 서열 (보통 항체의 가변 도메인 서열)을 돌연변이시켜 결합 요소의 라이브러리를 생성시킨 후, 효능에 대해 분석하고, 보다 효능이 큰 결합 요소를 선택하는 것을 수반한다. 이와 같이 선택된 "효능-최적화된" 결합 요소는 그로부터 라이브러리가 생성된 결합 요소보다 더 큰 효능을 갖는 경향이 있다.

그럼에도 불구하고, 높은 효능의 결합 요소는 또한 최적화를 실시하지 않고도 얻을 수 있다. 본원에서 입증되는 바와 같이, 높은 효능의 결합 요소는 초기 스크리닝, 예를 들어 생화학적 중화 분석으로부터 직접 얻을 수 있다.

"효능 최적화된" 결합 요소는 CXCL13의 특정 활성 또는 하류 (downstream) 기능의 중화를 위한 최적화된 효능을 갖는 결합 요소를 의미한다. 분석 및 효능은 본원의 다른 부분에서 보다 상세하게 설명된다.

본 발명은 효능-최적화된 결합 요소와 비-최적화된 결합 요소를 모두 제공하고, 또한 선택된 결합 요소로부터 효능 최적화를 위한 방법도 제공한다. 따라서, 본 발명을 통해 당업자는 높은 효능을 갖는 결합 요소를 생성시킬 수 있다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 요소의 라이브러리와 상기 항원을 접촉시키는 것, 및 상기 항원에 결합할 수 있는 라이브러리의 하나 이상의 결합 요소를 선택하는 것을 포함하는, 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 요소를 얻는 방법을 제공한다.

라이브러리는 입자 또는 분자 복합체, 예를 들어 복제가능한 유전자 패키지, 예를 들어 효모, 세균 또는 박테리오파지 (예를 들어 T7) 입자, 바이러스, 세포 또는 공유, 리보좀 또는 다른 시험관 내 디스플레이 시스템 상에 디스플레이될 수 있고, 각각의 입자 또는 분자 복합체는 그 위에 디스플레이되는 항체 VH 가변 도메인 및 임의로 존재할 경우 디스플레이되는 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 함유한다. 파지 디스플레이는 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함된 WO 92/01047 및 예를 들어 미국 특허 US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 및 US6521404에 기재되어 있다.

항원에 결합할 수 있고 박테리오파지 또는 다른 라이브러리 입자 또는 분자 복합체 상에 디스플레이되는 결합 요소의 선택 후에, 선택된 결합 요소를 디스플레이하는 박테리오파지 또는 다른 입자 또는 분자 복합체로부터 핵산을 얻을 수 있다. 상기 핵산은 상기 선택된 결합 요소를 디스플레이하는 박테리오파지 또는 다른 입자 또는 분자 복합체로부터 얻은 핵산의 서열과 함께 핵산의 발현에 의한 결합 요소 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인의 후속 생산에 사용될 수 있다.

상기 VH 도메인을 포함하는 결합 요소처럼, 상기 선택된 결합 요소의 항체 VH 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 항체 VH 가변 도메인이 단리된 형태로 제공될 수 있다.

CXCL13에 결합하는 능력을 추가로 시험할 수 있고, CXCL13에 결합하기 위해 결합 요소, 예를 들어 항체 1 (예를 들어 scFv 포맷 및/또는 IgG 포맷, 예를 들어 IgG1)과 경쟁하는 능력을 결정할 수 있다. 본원의 다른 부분에서 추가로 논의되는 바와 같이, CXCL13을 중화시키는 능력을 시험할 수 있다.

본 발명에 따른 결합 요소는 항체 1, 예를 들어 scFv 또는 IgG1의 친화도로, 또는 더 우수한 친화도로 CXCL13에 결합할 수 있다.

본 발명에 따른 결합 요소는 항체 1, 예를 들어 scFv, 또는 IgG1의 효능으로 또는 더 우수한 효능으로 CXCL13의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있다.

상이한 결합 요소의 결합 친화도 및 중화 효능은 적절한 조건 하에 비교될 수 있다.

아미노산 서열이 본원에서 제시되고 CXCL13에 대한 결합 요소에 사용될 수 있는 것을 포함하는, 본 발명의 VH 및 VL 도메인 및 CDR의 변이체는 서열 변경 또는 돌연변이 방법에 의해 얻을 수 있고, 목적하는 특성을 갖는 항원 결합 요소를 스크리닝할 수 있다. 목적하는 특성의 예는 다음을 포함하고, 이로 제한되지 않는다:

- 항원에 특이적인 공지의 항체에 비해 항원에 대한 결합 친화도의 증가

- 활성이 알려진 경우 항원에 특이적인 공지의 항체에 비해 항원 활성의 중화 증가

- 특이적인 몰비에서 항원에 대해 공지의 항체 또는 리간드와 경쟁하는 특정한 능력

- 복합체를 면역침전시키는 능력

- 특정 에피토프에 결합하는 능력

o 선형 에피토프, 예를 들어 본원에서 설명되는 펩티드-결합 스캔을 사용하여 확인된 펩티드 서열, 예를 들어 선형 및/또는 속박된 입체형태로 스크리닝된 펩티드

o 비-연속적인 잔기에 의해 형성된 입체형태 에피토프

- CXCL13, 또는 하류의 분자의 새로운 생물학적 활성을 조정하는 능력.

상기 방법도 본원에서 제공된다.

본원에 개시된 항체 분자의 변이체가 생산되어 본 발명에 사용될 수 있다. 다변량 데이타 분석 기술을 구조/특성-활성 관계에 적용할 때 선도적인 전산 화학을 따라 [40], 항체의 정량적 활성-특성 관계는 공지의 수학적 기술, 예를 들어 통계적인 회귀, 패턴 인식 및 분류를 사용하여 유도될 수 있다 [41, 42, 43, 44, 45, 46]. 항체의 특성은 항체 서열의 실험 및 이론 모델 (예를 들어, 가능성 있는 접촉 잔기 또는 계산된 물리화학적 특성의 분석), 기능성 구조 및 3차원 구조로부터 유도될 수 있고, 상기 특성은 개별적으로 및 서로 조합하여 고려될 수 있다.

VH 도메인 및 VL 도메인으로 이루어진 항체 항원 결합 부위는 일반적으로 폴리펩티드의 6개의 루프, 즉 경쇄 가변 도메인 (VL)으로부터의 3개 및 중쇄 가변 도메인 (VH)으로부터의 3개에 의해 형성된다. 공지의 원자 구조의 항체에 대한 분석은 항체 결합 부위의 서열과 3차원 구조 사이의 관계를 규명하였다 [47, 48]. 상기 관계는 VH 도메인 내의 제3 구역 (루프)을 제외하고, 결합 부위 루프가 소수의 주요-사슬 입체형태, 즉 정규 구조 중의 하나를 갖는다는 것을 의미한다. 특정 루프에 형성된 정규 구조는 그의 크기 및 루프 내와 프레임워크 구역 내의 중요 부위에 특정 잔기의 존재에 의해 결정되는 것으로 밝혀졌다 [47, 48].

서열-구조 관계에 대한 상기 연구는 그의 CDR 루프의 3차원 구조 유지에 중요하고 따라서 결합 특이성을 유지하는, 미지의 3차원 구조가 아니라 공지 서열의 항체 내의 잔기의 예측을 위해 사용될 수 있다. 상기 예측은 선도적인 최적화 실험의 결과에 대해 예측치를 비교함으로써 뒷받침될 수 있다. 구조적 방식에서, 임의의 자유롭게 이용가능하거나 시판되는 패키지, 예를 들어 WAM [50]을 사용하여 항체 분자 [49]에 대한 모델을 생성시킬 수 있다. 이어서, 단백질 가시화 및 분석 소프트웨어 패키지, 예를 들어 Insight II (액셀리스, 인크. (Accelrys, Inc.)) 또는 Deep View [51]를 사용하여 CDR 내의 각각의 위치에서 가능한 치환을 평가할 수 있다. 이어서, 활성에 대해 최소의 또는 유익한 효과를 가질 것으로 보이는 치환을 형성하기 위해 상기 정보를 사용할 수 있다.

CDR, 항체 VH 또는 VL 도메인 및/또는 결합 요소의 아미노산 서열 내에 치환을 형성하기 위해 필요한 기술은 일반적으로 당업계에서 이용가능하다. 활성에 대해 최소의 또는 유익한 효과를 가질 것으로 예측되거나 예측될 수 없는 치환이 존재하는 변이체 서열을 제조하고, CXCL13에 대한 결합 및/또는 중화능 및/또는 임의의 다른 목적하는 특성에 대해 시험할 수 있다.

그의 서열이 본원에 구체적으로 개시된 임의의 VH 및 VL 도메인의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체를 논의되는 바와 같이 본 발명에 따라 사용할 수 있다.

본 발명의 추가의 측면은 첨부된 서열 목록에 제시된 항체 1의 VH 도메인과 적어도 약 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 약 99％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및/또는 첨부된 서열 목록에 제시된 항체 1의 VL 도메인과 적어도 약 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 약 99％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체 분자이다. 두 아미노산 서열의 동일성 ％를 계산하기 위해 사용될 수 있는 알고리즘은 예를 들어 BLAST [52], FASTA [53], 또는 예를 들어 디폴트 파라미터를 사용하는 Smith-Waterman 알고리즘 [54]을 포함한다.

VH 도메인, VL 도메인 및/또는 CDR 또는 CDR 세트의 특정 변이체는 하나 이상의 아미노산 서열 변경 (아미노산 잔기의 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입)을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 변이체는 약 20개 미만, 예를 들어 약 15개 미만, 예를 들어 약 10개 미만, 예를 들어 약 5개 미만, 예를 들어 5, 4, 3, 2 또는 1개의 변경을 포함할 수 있다.

변경은 하나 이상의 프레임워크 구역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 이루어질 수 있다. 변경은 보통 기능을 상실시키지 않고, 따라서 이와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합 요소는 CXCL13에 대한 결합 및/또는 중화능을 유지할 수 있다. 상기 결합 요소는 예를 들어 본원에서 설명되는 분석에서 측정된 바와 같이 변경이 발생하지 않은 결합 요소와 동일한 정량적 결합 및/또는 중화능을 유지할 수 있다. 이와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합 요소는 CXCL13에 대한 개선된 결합 및/또는 중화능을 가질 수 있다.

변경은 하나 이상의 아미노산 잔기를 비-자연 발생 또는 비-표준 아미노산으로 교체하거나, 하나 이상의 아미노산 잔기를 비-자연 발생 또는 비-표준 형태로 변형시키거나, 또는 하나 이상의 비-자연 발생 또는 비-표준 아미노산을 서열 내에 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 서열에서 변경의 수 및 위치의 예는 본원의 다른 부분에서 설명된다. 자연 발생하는 아미노산은 표준 단문자 코드에 의해 G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E로 확인되는 20개의 "표준" L-아미노산을 포함한다. 비-표준 아미노산은 폴리펩티드 백본 내로 도입되거나 또는 존재하는 아미노산 잔기의 변형에 의해 발생할 수 있는 임의의 다른 잔기를 포함한다. 비-표준 아미노산은 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산일 수 있다. 몇개의 자연 발생하는 비-표준 아미노산, 예를 들어 4-히드록시프롤린, 5-히드록시라이신, 3-메틸히스티딘, N-아세틸세린 등이 당업계에 공지되어 있다 [55]. N-알파 위치에서 유도체화된 이들 아미노산 잔기는 아미노산 서열의 N-말단에만 위치할 것이다. 통상, 본 발명에서 아미노산은 L-아미노산이지만, D-아미노산일 수도 있다. 따라서, 변경은 L-아미노산을 D-아미노산으로 변경하거나 대체하는 것을 포함한다. 또한, 아미노산의 메틸화, 아세틸화 및/또는 인산화 형태가 알려져 있고, 본 발명에서 아미노산에 상기 변형을 적용할 수 있다.

본 발명의 항체 도메인 및 결합 요소의 아미노산 서열은 상기한 비-자연 발생 또는 비-표준 아미노산을 포함할 수 있다. 비-표준 아미노산 (예를 들어 D-아미노산)은 아미노산 서열의 합성 동안, 또는 아미노산 서열의 합성 후에 "본래의" 표준 아미노산의 변형 또는 대체에 의해 아미노산 서열 내에 도입될 수 있다.

비-표준 및/또는 비-자연 발생 아미노산을 사용하면, 구조적 및 기능적 다양성이 증가하고, 따라서 본 발명의 결합 요소에서 목적하는 CXCL13-결합 및 중화 특성을 달성하기 위한 가능성을 증가시킬 수 있다. 추가로, D-아미노산 및 유사체는 동물, 예를 들어 인간에게 투여한 후에 L-아미노산을 갖는 폴리펩티드의 생체 내 분해 때문에 표준 L-아미노산에 비해 상이한 약동학적 프로필을 갖는 것으로 밝혀졌고, 이것은 D-아미노산이 일부의 생체내 적용에 유리함을 의미한다.

본 발명의 CDR-유래 서열을 보유하는 신규한 VH 또는 VL 구역은 전체 가변 도메인 내에 돌연변이를 생성시키기 위해서 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 랜덤 돌연변이 유발을 사용하여 생성시킬 수 있다. 상기 기술은 문헌 (Gram et al. [56])에 기재되어 있고, 여기서 오류 빈발 (error-prone) PCR이 사용되었다. 일부 실시태양에서, 1 또는 2개의 아미노산이 전체 가변 도메인 또는 CDR 세트 내에서 치환된다.

사용될 수 있는 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 구역에 대한 돌연변이 유발을 유도하는 것이다. 상기 기술은 문헌 ([Barbas et al. [57]] 및 [Schier et al. [58]])에 개시되어 있다.

상기한 모든 기술은 당업계에 공지되어 있고, 당업자는 당업계에 통상적인 방법을 사용하여 본 발명의 결합 요소를 제공하기 위해 상기 기술을 사용할 수 있을 것이다.

본 발명의 추가의 측면은 본원에서 제시된 VH 도메인 세트의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 삽입을 제공하는 것, 임의로는 이와 같이 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하는 것, 및 임의로는 하나 이상의 목적하는 특성, 예를 들어 CXCL13 활성의 중화능을 갖는, CXCL13에 대한 결합 요소 또는 항체 항원 결합 부위를 확인하기 위해 VH 도메인 또는 VH/VL 조합체 또는 조합체들을 시험하는 것을 포함하는, CXCL13에 대한 항체 항원 결합 부위를 얻는 방법을 제공한다. 상기 VL 도메인은 실질적으로 본원에서 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본원에 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체를 하나 이상의 VH 도메인과 조합하는 유사한 방법이 사용될 수 있다.

상기에서 알 수 있는 바와 같이, 실질적으로 본원에서 제시된 CDR 아미노산 서열은 인간 항체 가변 도메인 또는 그의 실질적인 부분 내의 CDR로서 보유될 수 있다. 실질적으로 본원에서 제시된 HCDR3 서열은 본 발명의 실시태양을 나타내고, 각각의 이들 서열은 인간 중쇄 가변 도메인 또는 그의 실질적인 부분 내의 HCDR3으로서 보유될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 가변 도메인은 임의의 생식세포 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 얻거나 유도될 수 있거나, 또는 공지의 인간 가변 도메인의 컨센서스 (consensus) 또는 실제 서열을 기초로 한 합성 가변 도메인일 수 있다. 가변 도메인은 비-인간 항체로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 CDR 서열 (예를 들어 CDR3)은 재조합 DNA 기술을 사용하여 CDR (예를 들어 CDR3)이 결여된 가변 도메인의 레퍼토리 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Marks et al. [59])은 가변 도메인 영역의 5' 말단에서 또는 5' 말단에 인접하여 작용하는 컨센서스 프라이머가 CDR3이 결여된 VH 가변 도메인의 레퍼토리를 제공하기 위해서 인간 VH 유전자의 제3 프레임워크 구역의 컨센서스 프라이머와 함께 사용되는, 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 생산하는 방법을 기재하고 있다. 상기 문헌은 상기 레퍼토리가 특정 항체의 CDR3과 조합될 수 있는 방법을 또한 설명하고 있다. 유사한 기술을 사용하여, 본 발명의 CDR3-유래 서열은 CDR3이 결여된 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리로 셔플링될 수 있고, 셔플링된 완전한 VH 또는 VL 도메인은 동족 (cognate) VL 또는 VH 도메인과 조합되어 본 발명의 결합 요소를 제공할 수 있다. 이어서, 레퍼토리는 적합한 숙주 시스템, 예를 들어 그 전부가 본원에 참고로 포함된 WO92/01047, 또는 임의의 후속 문헌, 예를 들어 문헌 (Kay, Winter & McCafferty [60])의 파지 디스플레이 시스템에서 디스플레이되어, 적합한 결합 요소를 선택할 수 있다. 레퍼토리는 10⁴ 개 이상의 개별적인 요소, 예를 들어 적어도 10⁵, 적어도 10⁶, 적어도 10⁷, 적어도 10⁸, 적어도 10⁹ 또는 적어도 10¹⁰ 개 또는 이보다 많은 요소로 구성될 수 있다. 다른 적합한 숙주 시스템은 효모 디스플레이, 세균 디스플레이, T7 디스플레이, 바이러스 디스플레이, 세포 디스플레이, 리보좀 디스플레이 및 공유 디스플레이를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

CXCL13 항원에 대한 결합 요소의 제조 방법이 제공되고, 이 방법은

(a) 대체되는 CDR3을 포함하거나 CDR3 코딩 구역이 결여된, VH 도메인을 코딩하는 핵산의 출발 레퍼토리를 제공하는 것;

(b) VH CDR3에 대해 실질적으로 본원에서 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 공여 핵산과 상기 레퍼토리를 조합하여 상기 공여 핵산을 레퍼토리 내의 CDR3 구역 내로 삽입함으로써, VH 도메인을 코딩하는 핵산의 생성물 레퍼토리를 제공하는 것;

(c) 상기 생성물 레퍼토리의 핵산을 발현시키는 것;

(d) CXCL13에 대한 결합 요소를 선택하는 것; 및

(e) 상기 결합 요소 또는 이를 코딩하는 핵산을 회수하는 것

을 포함한다.

다시, 본 발명의 VL CDR3이, 대체되는 CDR3을 포함하거나 CDR3 코딩 구역이 결여된 VL 도메인을 코딩하는 핵산의 레퍼토리와 조합되는 유사한 방법을 사용할 수 있다.

이와 유사하게, 하나 이상의, 또는 3개의 모든 CDR이 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리 내로 그라프팅될 수 있고, 이것은 후속적으로 CXCL13에 대한 결합 요소 또는 결합 요소들에 대해 스크리닝된다.

예를 들어, 하나 이상의 항체 1의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 또는 항체 1의 HLCDR 세트가 사용될 수 있고/있거나 하나 이상의 항체 1의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 또는 항체 1의 LCDR 세트가 사용될 수 있다.

이와 유사하게, 본원에 개시된 다른 VH 및 VL 도메인, CDR 세트 및 HCDR 세트 및/또는 LCDR 세트가 사용될 수 있다.

면역글로불린 가변 도메인의 실질적인 부분은 그 사이에 존재하는 프레임워크 구역과 함께 적어도 3개의 CDR 구역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 부분은 제1 및 제4 프레임워크 구역의 어느 하나 또는 둘 모두의 적어도 약 50％를 포함할 수 있고, 상기 50％는 제1 프레임워크 구역의 C-말단 50％ 및 제4 프레임워크 구역의 N-말단 50％이다. 가변 도메인의 실질적인 부분의 N-말단 또는 C-말단부의 추가의 잔기는 자연 발생하는 가변 도메인 구역과 보통 회합하지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 본 발명의 결합 요소에는, 클로닝 또는 다른 조작 단계를 용이하게 하기 위해 도입된 링커에 의해 코딩되는 N- 또는 C-말단 잔기가 도입될 수 있다. 다른 조작 단계는 항체 불변 구역, 다른 가변 도메인 (예를 들어, 디아바디의 생산시에) 또는 본원의 다른 부분에서 보다 상세하게 논의되는 검출가능한/기능적 표지를 포함하는 추가의 단백질 서열에 본 발명의 가변 도메인을 연결하기 위한 링커의 도입을 포함한다.

본 발명의 일부 측면에서, 결합 요소가 한쌍의 VH 및 VL 도메인을 포함하지만, VH 또는 VL 도메인 서열을 기재로 한 단일 결합 도메인이 본 발명의 추가의 측면을 형성한다. 단일 면역글로불린 도메인, 특히 VH 도메인이 특이적인 방식으로 표적 항원에 결합할 수 있다고 알려져 있다. 예를 들어, 상기 dAb에 대한 논의를 참고한다.

단일 결합 도메인의 경우에, 이 도메인은 CXCL13에 결합할 수 있는, 2개의 도메인으로 구성된 결합 요소를 형성할 수 있는 상보성 도메인의 스크리닝에 사용될 수 있다. 이것은 H 또는 L 사슬 클론을 함유하는 개별 콜로니를 사용하여 다른 사슬 (L 또는 H)을 코딩하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키고, 생성되는 2-사슬 결합 요소를 참고문헌에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 따라 선택하는, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 WO92/01047에 개시되어 있는, 소위 계층 이중 조합 (hierarchical dual combinatorial) 방법을 사용하여 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있다. 또한, 이 기술은 문헌 (Marks et al, 상기 문헌)에도 개시되어 있다.

본 발명의 결합 요소는 항체 불변 구역 또는 그의 일부, 예를 들어 인간 항체 불변 구역 또는 그의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 인간 Cκ 또는 Cλ 사슬을 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 대해 그의 C-말단부에서 부착될 수 있다. 이와 유사하게, VH 도메인을 기재로 하는 결합 요소는 임의의 항체 이소형, 예를 들어 IgG, IgA, CXCL13 및 IgM 및 임의의 이소형 서브클래스, 특히 IgG1 및 IgG4로부터 유도된 면역글로불린 중쇄의 전부 또는 일부 (예를 들어 CH1 도메인)에 대해 그의 C-말단부에서 부착될 수 있다. IgG1이 그의 효과기 기능 및 제조 용이성 때문에 유리하다. 상기 특성을 갖고 가변 구역을 안정화시키는 임의의 합성 또는 다른 불변 구역 변이체도 본 발명에 유용할 수 있다.

본 발명의 결합 요소는 검출가능한 또는 기능적 표지로 표지될 수 있다. 따라서, 결합 요소 또는 항체 분자는 검출가능한 및/또는 정량가능한 신호를 얻기 위해 면역컨쥬게이트의 형태로 존재할 수 있다. 면역컨쥬게이트는 검출가능한 또는 기능적 표지와 컨쥬게이팅된 본 발명의 항체 분자를 포함할 수 있다. 표지는 형광 물질, 방사성 표지, 효소, 화학발광 물질 또는 감광제를 포함하고, 이로 제한되지 않는 신호를 생성하거나 신호 생성을 유도할 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 따라서, 결합은 형광 또는 발광, 방사성, 효소 활성 또는 흡광도를 검출함으로써 검출 및/또는 측정될 수 있다.

적합한 표지는 예를 들어 다음을 포함하고, 이로 제한되지 않는다:

- 효소, 예를 들어 알칼린 포스파타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 ("G6PDH"), 알파-D-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코스 아밀라제, 탄산 안히드라제, 아세틸콜린에스테라제, 리소자임, 말레이트 데히드로게나제 및 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제;

- 염료;

- 형광 표지 또는 형광 물질, 예를 들어 플루오레세인 및 그의 유도체, 형광 색소, 로다민 화합물 및 유도체, GFP ("초록 형광 단백질"), 단실, 움벨리페론, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 및 플루오레스카민; 형광단, 예를 들어 란타니드 크립테이트 및 킬레이트, 예를 들어 유로퓸 등 (퍼킨 엘머 및 시스바이오 인터내셔날),

- 화학발광 표지 또는 화학발광 물질, 예를 들어 이소루미놀, 루미놀 및 디옥세탄;

- 생체발광 표지, 예를 들어 루시퍼라제 및 루시페린;

- 민감제;

- 보조효소;

- 효소 기질;

- 방사성 표지, 예를 들어 브롬77, 탄소14, 코발트57, 불소8, 갈륨67, 갈륨 68, 수소3 (3중 수소), 인듐111, 인듐 113m, 요오드123m, 요오드125, 요오드126, 요오드131, 요오드133, 수은107, 수은203, 인32, 레늄99m, 레늄101, 레늄105, 루테늄95, 루테늄97, 루테늄103, 루테늄105, 스칸듐47, 셀레늄75, 황35, 테크네튬99, 테크네튬99m, 텔루륨121m, 텔루륨122m, 텔루륨125m, 툴륨165, 툴륨167, 툴륨168, 이트륨199 및 본원에서 언급되는 다른 방사성 표지 (이로 제한되지 않음);

- 입자, 예를 들어 라텍스 또는 탄소 입자; 금속 졸 (metal sol); 크리스탈라이트; 리포좀; 염료, 촉매 또는 다른 검출가능한 기로 추가로 표지될 수 있는 세포 등;

- 분자, 예를 들어 비오틴, 디곡시게닌 또는 5-브로모데옥시우리딘;

- 독소 모이어티, 예를 들어 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소 (PE 또는 그의 세포독성 단편 또는 돌연변이체), 디프테리아 독소 또는 그의 세포독성 단편 또는 돌연변이체, 보툴리눔 독소 A, B, C, D, E 또는 F, 리신 또는 그의 세포독성 단편, 예를 들어 리신 A, 아브린 또는 그의 세포독성 단편, 사포린 또는 그의 세포독성 단편, 억새풀 (pokeweed) 항바이러스 독소 또는 그의 세포독성 단편 및 브리오딘 1 또는 그의 세포독성 단편으로 이루어진 군 중에서 선택되는 독소 모이어티.

적합한 효소 및 보조효소는 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 ([Litman, et al., US 4,275,149], 및 [Boguslaski, et al., US4318980])에 개시되어 있다. 적합한 형광 물질 및 화학발광 물질은 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 (Litman, et al., US4275149)에 개시되어 있다. 표지는 추가로 화학적 모이어티, 예를 들어 특이적인 동족의 검출가능한 모이어티, 예를 들어 표지된 아비딘 또는 스트렙타비딘에 대한 결합을 통해 검출될 수 있는 비오틴을 포함한다. 검출가능한 표지는 당업계에 공지된 통상적인 화학을 사용하여 본 발명의 항체에 부착시킬 수 있다.

면역컨쥬게이트 또는 그의 기능성 단편은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들은 효소 또는 형광 표지에 직접 또는 스페이서기 또는 연결기, 예를 들어 폴리알데히드, 예를 들어 글루타르알데히드, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌-트리아민펜타아세트산 (DPTA)을 통해, 또는 치료 컨쥬게이트에 대해 상기 언급한 것과 같은 커플링제의 존재 하에 커플링될 수 있다. 플루오레세인 유형의 표지를 함유하는 컨쥬게이트는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조될 수 있다.

치료 방사성 동위원소를 항체에 직접 또는 킬레이팅제, 예를 들어 상기한 EDTA, DTPA를 통해 커플링시키기 위한 당업자에게 공지된 방법을 진단에 사용될 수 있는 방사성 원소에 대해 사용할 수 있다. 또한, 클로라민 T 방법 [61]에 의해 나트륨125를 사용하여 또는 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 (Crockford et al, US4424200)의 기술에 의해 테크네튬99m을 사용하여 또는 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 (Hnatowich, US 4479930)에 기재된 바와 같이 DTPA를 통한 부착에 의해 표지를 수행할 수 있다.

표지가 외부 수단에 의해, 예를 들어 육안 검사, 전자기 조사, 열 및 화학물질 시약에 의해 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 많은 방법이 존재한다. 또한, 표지는 본 발명의 항체에 결합하는 다른 결합 요소, 또는 지지체에 결합될 수 있다.

표지는 직접 신호를 생성시킬 수 있고, 따라서, 신호 생성을 위해 추가의 성분이 필요하지 않다. 많은 유기 분자, 예를 들어 형광 물질은 자외선 및 가시광선을 흡수할 수 있고, 여기서 광 흡수는 에너지를 상기 분자에 전달하여 분자를 여기된 에너지 상태로 만든다. 이어서, 흡수된 에너지는 제2 파장에서의 광 방출에 의해 방산된다. 또한, 상기 제2 파장 방출은 에너지를 표지된 수용 분자로 전달하고, 생성되는 에너지는 광 방출, 예를 들어 형광 공명 에너지 전달 (FRET)에 의해 수용 분자로부터 방산된다. 직접 신호를 생성시키는 다른 표지는 방사성 동위원소 및 염료를 포함한다.

별법으로, 표지는 신호를 생성시키는 다른 성분을 필요로 할 수 있고, 신호 생성 시스템은 측정가능한 신호를 생성시키는데 필요한 모든 성분을 포함할 것이고, 이는 기질, 보조효소, 인핸서, 추가의 효소, 효소 산물과 반응하는 물질, 촉매, 활성제, 보조인자, 억제제, 스캐빈저 (scavenger), 금속 이온 및 신호 생성 물질의 결합에 필요한 특이적 결합 물질을 포함할 수 있다. 적합한 신호 생성 시스템에 대한 상세한 논의는 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 (Ullman, et al. US 5185243)에서 볼 수 있다.

본 발명은 본원에서 제공되는 결합 요소의 CXCL13에 대한 결합을 유발하거나 허용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 알 수 있는 바와 같이, 상기 결합은 예를 들어 결합 요소 또는 결합 요소를 코딩하는 핵산을 투여한 후에 생체 내에서 발생할 수 있거나, 또는 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블로팅, 면역세포화학, 면역침전, 친화도 크로마토그래피, 및 생화학적 또는 세포 기반 분석, 예를 들어 cAMP, 칼슘 방출 또는 B 세포 화학주성 분석에서 시험관 내에서 발생할 수 있다.

또한, 본 발명은 예를 들어 바이오센서 시스템에서 본 발명에 따른 결합 요소를 사용하여 항원의 수준을 직접 측정하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 (i) 상기 결합 요소를 CXCL13에 노출시키는 것, 및 (ii) 상기 결합 요소의 CXCL13에 대한 결합을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 결합은 본원에서 설명되는 임의의 방법 또는 검출가능한 표지를 사용하여 검출되는 것인, CXCL13에 대한 결합의 검출 및/또는 측정 방법을 포함한다. 상기 및 본원에서 설명되는 임의의 다른 결합 검출 방법은 방법을 수행하는 사람에 의해 직접, 예를 들어 검출가능한 표지를 가시적으로 관찰함으로써 해석될 수 있다. 별법으로, 상기 방법, 또는 본원에서 설명되는 임의의 다른 결합 검출 방법은 자가방사선 촬영, 사진, 컴퓨터 출력 정보, 유동 셀 (flow cell) 측정 보고서, 그래프, 차트, 결과를 포함하는 시험관 또는 용기 또는 웰, 또는 방법의 결과에 대한 임의의 다른 가시적인 또는 물리적인 표시물의 형태로 보고서를 작성할 수 있다.

CXCL13에 대한 결합 요소의 결합의 양을 결정할 수 있다. 정량은 시험 샘플 내의 항원의 양에 관련될 수 있고, 이것은 진단을 위한 것일 수 있다. 예를 들어 본원에서 언급되는 질병 또는 질환 및/또는 비정상적인 CXCL13 생산, 발현 및/또는 활성을 수반하는 임의의 다른 질병 또는 질환에 대해 환자를 스크리닝할 때, CXCL13 결합에 대한 스크리닝 및/또는 그의 정량이 유용할 수 있다.

많은 질병이 CXCL13의 수준 증가가 연관되어 있다. CXCL13 수준은 본원의 다른 부분에서 설명되는 바와 같은 각종 질환, 예를 들어, 염증성 및/또는 자가면역 질병의 유용한 진단 및/또는 예후 지표이다. 예를 들어, 혈청 또는 활막액과 같은 샘플 내의 CXCL13의 수준 상승은 류마티스성 관절염의 예측 인자로서 사용될 수 있다.

본 발명의 진단 방법은 (i) 대상으로부터 조직 또는 유체 샘플을 얻는 것, (ii) 상기 조직 또는 유체 샘플을 본 발명의 하나 이상의 결합 요소에 노출시키는 것; 및 (iii) 결합된 CXCL13을 대조군 샘플과 비교하여 검출하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 대조군에 비해 CXCL13 결합량의 증가는 CXCL13 발현 또는 활성의 비정상적인 수준을 나타낼 수 있다. 시험되는 조직 또는 유체 샘플은 혈액, 혈청, 소변, 생검 물질, 종양, 또는 비정상적인 CXCL13 수준을 갖는 것으로 의심되는 임의의 조직을 포함한다. 또한, 비정상적인 CXCL13 수준 또는 활성에 대해 양성으로 시험된 대상은 본원에서 개시되는 치료 방법으로부터 도움을 받을 수 있다.

당업자는 본원에 개시된 방법에 비추어, 그의 선호도 및 일반적인 지식에 따라 항원에 대한 결합 요소의 결합을 결정하기 위한 적합한 방식을 선택할 수 있다.

샘플 내의 결합 요소의 반응성은 임의의 적절한 수단에 의해 결정할 수 있다. 방사성 면역분석 (RIA)이 하나의 가능한 방법이다. 방사성 표지된 항원을 비표지된 항원 (시험 샘플)과 혼합하고, 결합 요소에 결합시킨다. 결합된 항원은 비결합된 항원과 물리적으로 분리되고, 결합 요소에 결합된 방사성 항원의 양이 결정된다. 항원이 시험 샘플 내에 많이 존재할수록 보다 적은 방사성 항원이 결합 요소에 결합할 것이다. 또한, 경쟁 결합 분석은 리포터 분자에 연결된 항원 또는 유사체를 사용하여 비방사성 항원과 함께 사용될 수 있다. 리포터 분자는 스펙트럼에 의해 단리된 흡수 또는 방출 특성을 갖는 형광 색소, 형광 또는 레이저 염료일 수 있다. 적합한 형광 색소는 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린 및 텍사스 레드 (Texas Red), 및 란타니드 킬레이트 및 크립테이트를 포함한다. 적합한 발색 염료는 디아미노벤지딘을 포함한다.

다른 리포터는 거대분자 콜로이드 입자 또는 입자 물질, 예를 들어 착색, 자성 또는 상자성 라텍스 비드, 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 가시적으로 관찰되도록, 전기적으로 검출되도록 또는 다른 방식으로 기록되도록 할 수 있는 생물학적으로 또는 화학적으로 활성인 물질을 포함한다. 상기 분자는 예를 들어 발색 또는 변색 또는 전기적 특성의 변화를 야기하는 반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 이들은 분자적으로 여기되어, 에너지 상태의 전자 전이에 의해 특징적인 스펙트럼 흡수 또는 방출이 일어날 수 있다. 이들은 바이오센서와 함께 사용되는 화학적 물질 (entity)을 포함할 수 있다. 비오틴/아비딘 또는 비오틴/스트렙타비딘 및 알칼린 포스파타제 검출 시스템을 사용할 수 있다.

개별적인 결합 요소-리포터 컨쥬게이트에 의해 생성된 신호는 샘플 (정상 및 시험) 내의 관련된 결합 요소 결합에 대한 정량가능한 절대적인 또는 상대적인 데이타를 유도하기 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 임의의 측면 또는 실시태양에 따른 결합 요소를 포함하는 키트가 본 발명의 한 측면으로서 제공된다. 키트에서, 결합 요소는 예를 들어 아래에서 추가로 설명되는 바와 같이 샘플 내에서의 그의 반응성이 결정되도록 표지될 수 있다. 추가의 결합 요소가 고체 지지체에 부착되거나 부착되지 않을 수 있다. 키트의 성분은 일반적으로 멸균되고, 멸균 바이알 또는 다른 용기 내에 보관된다. 키트는 결합 요소가 유용한 진단 분석 또는 다른 방법에 사용될 수 있다. 키트는 방법, 예를 들어 본 발명에 따른 방법에서 성분의 사용에 대한 사용설명서를 포함할 수 있다. 상기 방법을 돕거나 그 수행을 가능하게 하는 보조 물질이 본 발명의 키트 내에 포함될 수 있다. 보조 물질은 제1 결합 요소에 결합하고 검출가능한 표지 (예를 들어, 형광 표지, 방사성 동위원소 또는 효소)에 컨쥬게이팅된 제2의 상이한 결합 요소를 포함한다. 또한, 항체-기반 키트는 면역침전 수행을 위한 비드를 포함할 수 있다. 키트의 각각의 성분은 일반적으로 그 자체의 적합한 용기 내에 존재한다. 따라서, 상기 키트는 일반적으로 각각의 결합 요소에 대한 적합한 별개의 용기를 포함한다. 또한, 키트는 분석 수행으로부터 얻은 데이타의 분석 및 해석을 위한 분석 및 방법을 수행하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 경쟁 분석에서 항원 수준을 측정하기 위한 상기 결합 요소의 용도, 즉 경쟁 분석에서 본 발명에서 제공되는 결합 요소를 사용함으로써 샘플 내의 항원의 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 이것은 비결합된 항원으로부터 결합된 항원의 물리적 분리가 필요하지 않을 수 있다. 물리적 또는 광학적 변화가 결합시에 발생하도록 리포터 분자를 결합 요소에 연결시킬 수도 있다. 리포터 분자는 정량될 수 있는 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 생성시킬 수 있다. 리포터 분자의 연결은 직접 또는 공유 결합을 통해, 예를 들어 펩티드 결합을 통해 또는 비-공유 결합을 통해 간접적으로 이루어질 수 있다. 펩티드 결합을 통한 연결은 항체 및 리포터 분자를 코딩하는 유전자 융합체의 재조합 발현에 의해 발생할 수 있다.

다양한 측면 및 실시태양에서, 본 발명은 본원에서 규정된 임의의 결합 요소, 예를 들어 IgG1 포맷의 항체 1과 CXCL13, 예를 들어 인간 CXCL13에 대한 결합을 위해 경쟁하는 결합 요소로 확장된다. 결합 요소 사이의 경쟁은 동일한 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합하는 결합 요소의 확인이 가능하도록, 예를 들어 다른 비태깅된 결합 요소(들)의 존재 하에 검출될 수 있는 하나의 결합 요소에 특이적인 리포터 분자를 태깅함으로써 시험관 내에서 쉽게 분석될 수 있다. 경쟁은 CXCL13가 플레이트에 고정되고 태깅 또는 표지된 제1 결합 요소를 하나 이상의 다른 비태깅 또는 비표지된 결합 요소와 함께 플레이트에 첨가하는, 예를 들어 ELISA를 사용하여 결정할 수 있다. 태깅된 결합 요소와 경쟁하는 비태깅된 결합 요소의 존재는 태깅된 결합 요소에 의해 방출되는 신호의 감소에 의해 관찰된다. 한 예에서, HTRF® 에피토프 경쟁 분석이 사용될 수 있다.

예를 들어, 본 발명은 (i) CXCL13을 지지체에 고정시키는 것, (ii) 상기 고정된 CXCL13을 적어도 하나의 태깅 또는 표지된 본 발명에 따른 결합 요소 및 하나 이상의 비태깅 또는 비표지된 시험 결합 화합물과 동시에 또는 순차적으로 접촉시키는 것, 및 (iii) 태깅된 결합 요소로부터 결합된 태그의 양의 감소를 관찰함으로써 새로운 CXCL13 결합 화합물을 확인하는 것을 포함하는, CXCL13 결합 화합물의 확인 방법을 포함한다. 상기 방법은 다중웰 또는 어레이 포맷을 사용하여 초고속 방식으로 수행할 수 있다. 또한, 상기 분석은 용액으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 U.S. 5,814,468을 참고한다. 상기 설명한 바와 같이, 결합의 검출은 방법을 수행하는 사람에 의해 직접, 예를 들어 검출가능한 표지 또는 그의 존재의 감소를 가시적으로 관찰함으로써 해석될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 결합 방법은 자가방사선 촬영, 사진, 컴퓨터 출력 정보, 유동 셀 측정 보고서, 그래프, 차트, 결과를 포함하는 시험관 또는 용기 또는 웰, 또는 방법의 결과에 대한 임의의 다른 가시적인 또는 물리적인 표시물의 형태로 보고서를 작성할 수 있다.

또한, 경쟁 분석이 에피토프 매핑에 사용될 수 있다. 한 예에서, 에피토프 매핑은 임의로 최적화된 중화 및/또는 조정 특성을 가질 수 있는 CXCL13 결합 요소에 의해 결합된 에피토프를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 상기 에피토프는 선형 또는 입체형태일 수 있다. 입체형태 에피토프는 CXCL13의 적어도 2개의 상이한 단편을 포함할 수 있고, 상기 단편은, CXCL13의 억제제, 예를 들어 CXCL13-결합 요소에 의해 인식되는 입체형태 에피토프를 형성하기 위해 CXCL13이 그의 3차 또는 4차 구조로 폴딩될 때 서로 근접하여 위치한다. 경쟁을 시험할 때, 항원의 펩티드 단편, 특히 관심있는 에피토프를 포함하거나 본질적으로 상기 에피토프로 이루어지는 펩티드가 사용될 수 있다. 어느 한 말단에 에피토프 서열 및 하나 이상의 아미노산을 갖는 펩티드가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 결합 요소는, 항원에 대한 그의 결합이 제시된 서열과 함께 또는 이 서열을 포함하는 펩티드에 의해 억제되는 것일 수 있다.

본 발명은 추가로 본 발명의 결합 요소를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 상기 규정된 바와 같은 본 발명의 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원 결합 부위 또는 항체 분자, 예를 들어 scFv 또는 IgG1을 코딩하는 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기한 바와 같은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구성체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기한 바와 같은 하나 이상의 구성체를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 본원에서 제시되는 임의의 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원 결합 부위 또는 항체 분자, 예를 들어 scFv 또는 IgG1을 코딩하는 핵산 자체가, 그의 코딩 핵산으로부터의 발현을 포함하는 코딩 산물의 생산 방법과 함께 본 발명의 측면을 형성한다. 발현은 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건 하에 배양함으로써 편리하게 달성할 수 있다. 발현에 의한 생산 후에, VH 또는 VL 도메인, 또는 결합 요소는 임의의 적합한 기술을 사용하여 단리 및/또는 정제된 후, 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 본원에서 제시된 뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 특정 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하고, 문맥상 달리 필요로 하지 않으면 U가 T를 대신한 특정 서열을 갖는 RNA 분자를 포함한다.

또다른 측면은 항체 VH 가변 도메인의 생산 방법을 제공하고, 이 방법은 코딩 핵산으로부터 발현의 유도를 포함한다. 상기 방법은 상기 항체 VH 가변 도메인의 생산을 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.

VL 가변 도메인, 및 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는 결합 요소의 생산을 위한 유사한 방법이 본 발명의 추가의 측면으로서 제공된다.

생산 방법은 생성물의 단리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다. 생산 방법은 생성물을 적어도 하나의 추가의 성분, 예를 들어 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물로 제제화하는 것을 포함할 수 있다.

다양한 상이한 숙주 세포에서 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템이 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포는 세균, 포유동물 세포, 식물 세포, 사상 진균, 효모 및 바큘로바이러스 시스템 및 트랜스제닉 식물 및 동물을 포함한다. 원핵세포에서 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에 잘 확립되어 있다. 검토를 위해, 예를 들어 문헌 (Plueckthun [62])을 참고한다. 통상적인 세균 숙주는 이. 콜라이이다.

또한, 배양시에 진핵세포에서의 발현은 결합 요소 생산을 위한 선택 사항으로서 당업자가 이용할 수 있다 [63, 64, 65]. 이종성 폴리펩티드의 발현을 위해 당업계에서 이용가능한 포유동물 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, NSO 마우스 흑색종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 및 많은 다른 세포를 포함한다.

적절한 조절 서열, 예를 들어 프로모터 서열, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절한 다른 서열을 함유하는 적합한 벡터를 선택하거나 제작할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 예를 들어 파지미드, 또는 바이러스, 예를 들어 적절한 파지일 수 있다 [66]. 예를 들어 핵산 구성체의 제조, 돌연변이 유발, 서열 결정, DNA의 세포 내로의 도입 및 유전자 발현, 및 단백질의 분석에서 핵산 조작을 위한 많은 공지의 기술 및 프로토콜이 문헌 (Ausubel et al. [67])에 상세하게 기재되어 있다.

본 발명의 추가의 측면은 본원에 개시된 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 시험관 내에 존재할 수 있고, 배양될 수 있다. 상기 숙주 세포는 생체 내에 존재할 수 있다. 숙주 세포의 생체내 존재는 본 발명의 결합 요소의 "인트라바디 (intrabody)" 또는 세포내 항체로서의 발현을 가능하게 할 수 있다. 인트라바디는 유전자 요법을 위해 사용될 수 있다.

추가의 측면은 본 발명의 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 도입은 임의의 이용가능한 기술을 사용할 수 있다. 진핵세포의 경우, 적합한 기술은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포좀-매개 형질감염 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예를 들어 우두를 사용한 형질도입, 또는 곤충 세포의 경우 바큘로바이러스를 포함할 수 있다. 숙주 세포, 특히 진핵세포 내로의 핵산의 도입은 바이러스 또는 플라스미드 기반 시스템을 사용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피좀 상태로 유지되거나 또는 숙주 세포 내로 또는 인공 염색체 내로 통합될 수 있다. 통합은 단일 또는 다중 로커스에서 하나 이상의 카피의 랜덤한 또는 표적화된 통합일 수 있다. 세균 세포의 경우, 적합한 기술은 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다.

도입 후에, 예를 들어 유전자의 발현을 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양함으로써 핵산으로부터의 발현을 유도하거나 허용할 수 있다. 발현 산물의 정제는 당업자에게 공지된 방법에 의해 달성할 수 있다.

본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈 (예를 들어 염색체) 내로 통합될 수 있다. 통합은 표준 기술에 따라 게놈과의 재조합을 촉진시키는 서열을 포함시킴으로써 촉진될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 결합 요소 또는 폴리펩티드를 발현하기 위해서 발현 시스템에 상기한 구성체를 사용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 결합 요소는 인간 또는 동물 대상, 특히 인간에서 진단 또는 치료 방법에 사용될 수 있다. CXCL13에 대한 결합 요소는 CXCL13과 연관된 질환, 예를 들어 비정상적인 CXCL13 발현 및/또는 활성과 연관된 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본원의 다른 부분에서 논의되는 바와 같은 다양한 질환에서 CXCL13의 연관성에 대한 증거가 존재한다. 본 발명의 결합 요소는 CXCR5에 대한 CXCL13의 결합을 억제하여 CXCR5에 대한 CXCL13 결합에 의해 매개되는 질병 또는 질환의 치료에 사용될 수 있다. CXCL13과 연관되는 질환은 그의 수용체 CXCR5에 대한 CXCL13 결합에 의해 야기되고/야기되거나 악화되는 질환을 포함한다. 본 발명의 측면은 질환의 하나 이상의 증상 및/또는 원인을 완화 또는 개선시킴으로써 상기 질환을 치료하는 것에 관한 것이다.

CXCL13에 대한 결합 요소는 관절염성 활막 (arthritic synovium)에서 발견되는 것과 같은 림프양 여포, 예를 들어 이소성 림프양 여포의 비정상적인 형성 및/또는 발생을 억제하거나 저하시키기 위해 사용될 수 있다. 결합 요소는 여포에 대한 B 세포 및/또는 수지상 세포 및/또는 여포성 B 헬퍼 (helper) T 세포의 CXCL13-CXCR5 신호전달 매개 동원 (recruitment)의 억제 또는 저하; 및/또는 여포성 B 세포에 의한 면역글로불린 생산의 저하; 및/또는 시토킨의 여포성 B 세포 생산 및/또는 T 세포의 활성화의 감소를 야기할 수 있다. 또한, 결합 요소는 비정상적인 뼈 및/또는 연골 파괴를 억제하거나 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

따라서, 결합 요소는 비정상적인 또는 이소성 림프양 여포와 연관된 질병 또는 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다. 이소성 림프양 여포와 연관된 질환은 류마티스성 관절염, 쇼그렌 (Sjogrens) 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 자가면역 갑상선 질병 (예를 들어 그레이브 (Grave) 병, 하시모토 (Hashimoto) 갑상선염), 만성 감염, 예를 들어 라임 신경보렐리아증 (Lyme Neuroborreliosis) 및 퀼티 (Quilty) 효과를 특징을 하는 급성 심장 거부반응을 포함한다.

예를 들어, 염증성 관절염성 활막은 일반적으로 배 중심을 함유하는 이소성 림프양 여포; 염증성 세포 침윤; 자가항체 및 시토킨의 B 세포 생산; T 세포의 B 세포 활성화; 및/또는 뼈 및 연골 파괴를 특징으로 한다. 결합 요소는 본원에서 설명되는 이소성 여포를 붕괴시켜 B 세포 자가항체 생산 및/또는 활막 염증을 억제할 수 있다. 따라서, 결합 요소는 관절염 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염 (RA), 및/또는 골관절염의 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 결합 요소는 뼈 및/또는 관절 질병 또는 질환, 특히 뼈 및/또는 연골의 파괴 및/또는 재형성 (remodelling), 예를 들어 뼈 또는 연골의 비정상적인 갱신 (turnover)과 연관된 질병 또는 질환의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 결합 요소는 류마티스성 관절염 및/또는 골관절염의 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 결합 요소는 림프구 (예를 들어 B 및/또는 T 세포) 화학주성을 억제하기 위해 사용될 수 있고, 림프구 화학주성과 연관된 질환, 예를 들어 바이러스 감염 (예를 들어 HIV 감염) 및 백혈병 (예를 들어 T-세포 계열 급성 림프구성 백혈병 및 B-세포 계열 급성 및 만성 림프구성 백혈병)의 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 결합 요소는 림프종의 증식을 억제하기 위해 사용될 수 있고, 따라서 림프종 증식과 연관된 질환, 예를 들어 백혈병 (예를 들어 T-세포 계열 급성 림프구성 백혈병 및 B-세포 계열 급성 및 만성 림프구성 백혈병)의 치료에 사용될 수 있다.

CXCL13에 대한 결합 요소는 본원에서 설명되는 바와 같은 림프양 여포, 예를 들어 이소성 림프양 여포의 비정상적인 형성 및/또는 발생의 억제, 비정상적인 뼈 및/또는 연골 파괴 및/또는 재형성의 억제, 및/또는 림프구의 화학주성 및/또는 림프종의 증식의 억제를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 유효량의 하나 이상의 본 발명의 결합 요소를 단독으로 또는 림프양 여포, 예를 들어 이소성 림프양 여포의 비정상적인 형성 및/또는 발생, 비정상적인 뼈 및/또는 연골 파괴 및/또는 재형성, 및/또는 림프구의 화학주성 및/또는 림프종의 증식이 억제되도록 당업계에 공지되거나 본원에서 설명되는 다른 적절한 의약과 조합된 치료 요법으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 림프양 여포, 예를 들어 이소성 림프양 여포의 비정상적인 형성 및/또는 발생의 억제, 비정상적인 뼈 및/또는 연골 파괴 및/또는 재형성의 억제, 및/또는 림프구의 화학주성 및/또는 림프종의 증식의 억제 방법을 제공한다.

본 발명의 결합 요소는 예를 들어 정상 수준과 관련하여 CXCL13의 수준이 변경된, 예를 들어 상승된 CXCL13과 연관된 질병 또는 질환의 진단에 사용될 수 있다. 결합 요소는 예를 들어 류마티스성 관절염, 쇼그렌 증후군, HIV, 중증 근무력증, 혈관면역모세포성 T-세포 림프종 및 전염성 해면 뇌병증 (TSE)을 비롯하여 본원에서 설명되는 하나 이상의 질병 또는 질환의 진단에 사용될 수 있다.

특정 질환에 CXCL13이 관련된다는 증거는 아래에서 및 본원의 다른 부분에서 설명된다. 또한, 본원에서 제시되는 데이타는 추가로 본 발명의 결합 요소가 질환의 예방적 처리 및 중증도의 저하를 포함하여 상기 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 유효량의 하나 이상의 본 발명의 결합 요소를 단독으로 또는 본원에서 언급되는 임의의 질환의 적어도 하나의 증상의 중증도가 저하되도록 당업계에 공지되거나 본원에서 설명되는 다른 적절한 의약과 조합된 치료 요법으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 본원에서 언급되는 임의의 질환의 적어도 하나의 증상을 치료하거나 중증도를 저하시키는 방법을 제공한다.

말초 림프계 기관의 발생 및 선천 면역에서 CXCL13의 역할에 대한 증거는 본원의 다른 부분에서 부분적으로 설명된다.

상기한 내용 이외에, 일련의 증거들은 인간의 류마티스성 관절염 (RA)의 발병기전에서 CXCL13의 역할을 보여준다. 예를 들어, CXCL13 mRNA 및 단백질의 발현은 RA 활막에서 상승하고 [68], RA 활막 내의 CXCL13 단백질의 수준과 질병 중증도 사이에 정적 (positive) 상관관계가 존재한다 [69]. 또한, 본 발명자들은 CXCL13의 수준 상승이 RA 환자의 혈청 및 활막액에서 측정됨을 발견하였고, 이것은 본 발명의 결합 요소가 본원에서 설명되는 바와 같이 RA의 진단 방법에 사용될 수 있음을 나타낸다.

염증성 활액은 염증성 세포 침윤, 및 림프양 조직과 유사한 조직화된 림프구 응집체의 존재를 특징으로 한다. 상기 이소성 림프양 구조는 FDC, 및 고내피 세정맥 (HEV)을 포함하는 배 중심의 특징부를 함유한다. 배 중심은 혈장 세포로의 B 세포 분화 및 류마티스 인자와 같은 고친화도 항체의 생성을 지지하는 미세환경을 제공한다 [70]. RA 활막 내의 CXCL13 단백질은 배 중심 [69] 내의 FDC 및 세포 침윤물 내의 포식세포에 면역편재된다 (immunolocalised) [71]. RA 병소에서, CXCL13은 이소성 림프양 여포 형성 및 배 중심 반응의 발생의 강력한 예측자이다 (Takemura, S. et al. J. Immunol. 167: 1072-1080, 2001).

RA에서 CXCL13의 역할은 또한 질병의 동물 모델로부터의 생체내 증거에 의해 지지된다. CXCL13 중화 항체의 예방적 투여량은 관절염성 관절 내로의 염증성 세포 침윤의 감소 및 연골 및 뼈 침식도의 감소와 함께 마우스에서 콜라겐 유발된 관절염 (CIA)의 질병 중증도를 저하시킨다 [72]. CIA 모델에서, 항-CXCL13 항체로 치료된 마우스의 비장과 관절 내의 여포는 매우 적은 배 중심을 함유하고, 배 중심은 대조군 마우스보다 크기가 작다 [72].

다른 연구는 CXCR5가 결핍된 마우스가 어쥬번트-유발된 관절염 (AIA) 모델에서 활막 염증 및 관절 파괴의 감소와 함께 중증도가 덜한 증상을 나타냄을 보여주었다 (Hartmann, S. et al, European Congress on Immunology, abstract 2672, 2006). 또한, 조직화된 배 중심의 형성, 항-항원 항체의 수준 및 항원 유발 T 세포 증식 반응이 상기 연구에서 저하되었다.

또한, 뼈 및 연골 갱신에서의 CXCL13의 역할도 배양된 연골세포 및 골모세포로부터의 시험관내 증거에 의해 입증되었다. CXCR5는 골관절염 (OA) 환자의 관절 연골로부터 단리된 연골세포 상에서 발현된다. 배양 조건에서의 상기 연골세포를 CXCL13으로 처리하면, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP) 및 카텝신 B의 방출 및 증식이 유도된다 [73]. 또한, CXCL13은 OA 환자로부터 유도된 배양된 골모세포의 증식 및 인터루킨-1 (IL-I) mRNA의 발현을 유도한다 [74]. 또한, 배양된 골모세포로부터 CXCL13의 기초적 분비는 IL-1 처리에 의해 향상될 수 있다 [75]. 관절 수술을 받은 RA 환자로부터 채취한 뼈 샘플에서, CXCL13 단백질은 림프양 신생이라는 특징을 갖는 골수 내의 단핵 세포 응집체에 면역편재된다 [76].

CXCR5 수용체는 여포성 B 헬퍼 T 세포 (T_FH)로 명명된, B 세포 헬퍼 기능을 갖는 기억 T 세포의 서브세트 상에서 발현된다. CXCL13은 인간 편도로부터 단리된 CXCR5-발현 T_FH 세포의 화학주성을 유도하지만 [77], 이차 림프계 기관에서, CXCR5-양성 T_FH 세포는 이들이 면역글로불린 생산을 지지하는 B 세포 여포 및 배 중심에 편재한다 [78]. 배 중심으로부터 새로 단리된 T_FH 세포는 낮은 수준의 CXCL13을 분비하지만, 이것은 TCR 및 CD28을 통한 자극 후에 유의하게 상승한다 (Kim, CH. et al. Blood, 104: 1952-1960, 2004).

CXCR5를 발현하고 CXCL13에 반응하여 림프양 여포에 편재하는 수지상 세포의 서브세트가 확인되었다 [79]. 이 반응은 여포성 간질 세포에 의한 CXCL13의 발현을 자극하고 CXCR5-양성 세포를 여포 내로 동원하기 위해 필요한 화학주성 구배를 확립하는 B 세포-유래의 막 결합된 림프독소에 의존한다.

B 세포 이동의 억제는 임상에서 전례가 없지만, RA 환자에서 B 세포 고갈 요법의 효능에 대한 임상 전례가 존재한다 [80]. 키메라 항-CD20 모노클로날 항체를 사용한 B 세포 고갈은 단일 치료 과정 후에 수개월 내지 수년에 걸친 지속적인 질병 완화 기간을 경험하는 환자에서 효과적이고, 잘 허용된다. 임상 경과가 혈청 자가항체의 치료전 수준으로의 복귀와 밀접하게 관련되기 때문에, 자가항체 수준의 감소는 B 세포 고갈의 성공을 위한 중요한 메카니즘이다 [81]. 자가항체 생산 이외에, B 세포는 시토킨 생산 및 항원 제시를 통한 T 세포의 활성화를 통해 RA 진행에 기여하는 것으로 생각된다.

CXCL13 중화에 의한 B 세포 이동의 억제는 RA 치료를 위한 새로운 방법을 제시한다. CXCL13 중화는 RA 활막에서 이소성 여포 및 배 중심 반응의 붕괴를 통해 자가항체 생산 및 활막 염증을 모두 억제하는 능력을 갖는다. 또한, CXCL13 중화는 직접 및 간접 메카니즘에 의해 뼈 및 연골 파괴를 억제함으로써 추가의 잇점을 제공할 수 있다.

CXCL13의 수준 상승은 HIV에서 설명된 바 있다 (Widney, DP. et al. J. Int. Cyt. Res. 25: 702-706, 2005). 또한, 전염성 해면 뇌병증 (TSE)에 대한 대리 마커로서 CXCL13의 사용도 보고된 바 있다 (EP1703282A1).

본 발명의 결합 요소는 다음 중 임의의 질환의 치료에 사용될 수 있다:

1. 호흡기도: 기도의 폐쇄 질병, 예를 들어: 천식, 예를 들어 기관지, 알레르기, 내인, 외인, 운동-유발, 약물-유발 (예를 들어 아스피린 및 NSAID-유발) 및 먼지-유발 천식 (간헐적 및 지속적 것 모두와 모든 중증도의 것) 및 기도 과민-반응성의 다른 원인; 만성 폐쇄 폐병 (COPD); 기관지염, 예를 들어 감염성 및 호산구성 기관지염; 폐기종; 기관지확장증; 낭성 섬유증; 사르코이드증; 농부 폐 및 관련 질병; 과민성 폐렴; 폐 섬유증, 예를 들어 잠복성 섬유화 폐포염, 특발 간질성 폐렴, 항신생물 요법 및 만성 감염, 예를 들어 결핵 및 아스페르길로스증 및 다른 진균 감염에 합병된 섬유증; 폐 이식의 합병증; 폐 혈관계의 혈관염성 및 혈전성 질환, 및 폐 고혈압; 진해 활성, 예를 들어 기도의 염증성 및 분비성 병태와 연관된 만성 기침, 및 의원성 (iatrogenic) 기침의 치료; 급성 및 만성 비염, 예를 들어 약물성 비염 및 혈관운동 비염; 통년 및 계절성 알레르기 비염, 예를 들어 신경성 비염 (건초열); 코 폴립증; 급성 바이러스 감염, 예를 들어 감기, 및 호흡기 세포융합 바이러스, 인플루엔자, 코로나바이러스 (예를 들어 SARS) 및 아데노바이러스로 인한 감염;

2. 뼈 및 관절: 골관절염/골관절증과 연관되거나 이를 포함하는 관절염 (예를 들어, 선천성 고관절 형성이상에 1차적 및 2차적인 것 모두); 경추 및 요추 척추염과 허리 및 목 통증; 류마티스성 관절염 및 스틸 (Still) 병; 음성혈청 척추관절병증, 예를 들어 강직 척추염, 건선 관절염, 반응성 관절염 및 미분화 척추관절병증; 패혈성 관절염 및 다른 감염-관련 관절병증과 뼈 질환, 예를 들어 결핵, 예를 들어 포츠 (Potts) 병 및 폰셋 (Poncet) 증후군; 급성 및 만성 결정-유발된 활막염, 예를 들어 요산염 통풍, 피로인산칼슘 침착 질병, 및 칼슘 아파타이트 관련 건, 점액낭 및 활막 염증; 베체트 (Behcet) 병; 1차 및 2차 쇼그렌 증후군; 전신 경화증 및 제한된 공피증; 전신 홍반성 루푸스, 혼합형 결합 조직 질병, 및 미분화 결합 조직 질병; 염증성 근육병증, 예를 들어 피부근육염 및 다발근육염; 류마티스성 다발근육통; 연소성 관절염, 예를 들어 어떠한 관절 분포든 특발 염증성 관절염 및 연관 증후군, 및 류마티스열 및 그의 전신 합병증; 혈관병증, 예를 들어 거대 세포 동맥염, 다카야수 (Takayasu) 동맥염, 처그-스트라우스 (Churg-Strauss) 증후군, 결절성 다발동맥염, 현미경적 다발동맥염, 및 바이러스 감염, 과민 반응, 한랭글로불린 및 파라단백질과 연관된 혈관병증; 허리 통증; 가족성 지중해열, 머클-웰스 (Muckle-Wells) 증후군, 및 가족성 아일랜드인열, 키쿠치 (Kikuchi) 병; 약물-유발 관절통, 건염 및 근육병증;

3. 상해 [예를 들어 스포츠 상해] 또는 질병으로 인한 근골격계 질환의 통증 및 결합 조직 재형성: 관절염 (예를 들어 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍 또는 결정성 관절병증), 다른 관절 질병 (예를 들어 추간판 퇴행 또는 턱관절 관절 퇴행), 뼈 재형성 질병 (예를 들어 골다공증, 파제트 (Paget) 병 또는 뼈괴사), 다발연골염, 공피증, 혼합형 결합 조직 질환, 척추관절병증 또는 치주 질병 (예를 들어 치주염);

4. 피부: 건선, 아토피 피부염, 접촉 피부염 또는 다른 습진성 피부병, 및 지연형 과민 반응; 식물성- 및 광-피부염; 지루성 피부염, 포진상 피부염, 편평 태선, 경화위축성 태선, 괴저 농피증, 피부 사르코이드증, 원판형 홍반 루푸스, 천포창, 유사천포창, 수포성 표피박리증, 두드러기, 혈관부종, 혈관병증, 중독 홍반, 피부 호산구증가증, 원형 탈모증, 남성형 대머리, 스위트 (Sweet) 증후군, 웨버-크리스찬 (Weber-Christian) 증후군, 다형 홍반; 연조직염 (감염성 및 비-감염성 모두); 지방층염; 피부 림프종, 비-흑색종 피부암 및 다른 형성이상 병변; 약물-유발 질환, 예를 들어 고정 약물 발진;

5. 눈: 안검염; 결막염, 예를 들어 통년 및 봄철 알레르기 결막염; 홍채염; 앞 및 뒤 포도막염; 맥락막염; 자가면역; 망막을 해치는 퇴행 또는 염증성 질환; 안염, 예를 들어 교감성 안염; 사르코이드증; 바이러스, 진균 및 세균을 포함한 감염;

6. 위장관: 설염, 치은염, 치주염; 식도염, 예를 들어 역류성; 호산구성 위장관염, 비만세포증, 크론 (Crohn) 병, 대장염, 예를 들어 궤양 대장염, 직장염, 항문소양증; 복강 질병, 과민성 장 증후군, 및 장으로부터 멀리 영향을 미칠 수 있는 음식-관련 알레르기 (예를 들어 편두통, 비염 또는 습진);

7. 복부: 간염, 예를 들어 자가면역성, 알콜성 및 바이러스성; 간의 섬유증 및 경화증; 담낭염; 췌장염 (급성 및 만성 모두);

8. 비뇨생식기: 신장염, 예를 들어 간질성 및 사구체신장염; 신 증후군; 방광염, 예를 들어 급성 및 만성 (간질성) 방광염 및 허너 (Hunner) 궤양; 급성 및 만성 요도염, 전립선염, 부고환염, 난소염 및 자궁관염; 외음부-질염; 페로니 (Peyronie) 병; 발기 기능장애 (남성 및 여성 모두);

9. 동종이식 거부: 예를 들어, 신장, 심장, 간, 폐, 골수, 피부 또는 각막의 이식 후 또는 수혈 후 급성 및 만성; 또는 만성 이식편 대 숙주 질병;

10. CNS: 알츠하이머 (Alzheimer) 병 및 다른 치매성 질환, 예를 들어 CJD 및 nvCJD; 아밀로이드증; 다발성 경화증 및 다른 탈수초 증후군; 대뇌 죽상경화증 및 혈관염; 관자 동맥염; 중증 근무력증; 급성 및 만성 통증 (중추 또는 말초 기원의 급성, 간헐적 또는 지속적), 예를 들어 내장 통증, 두통, 편두통, 삼차 신경통, 비전형 안면 통증, 관절 및 뼈 통증, 암 및 종양 침습으로 발생하는 통증, 신경병 통증 증후군, 예를 들어 당뇨, 포진후, 및 HIV-연관 신경병증; 신경사르코이드증; 악성, 감염성 또는 자가면역 과정의 중추 및 말초 신경계 합병증;

11. 다른 자가면역 및 알레르기 질환, 예를 들어 하시모토 갑상선염, 그레이브 병, 애디슨 (Addison) 병, 당뇨병, 특발 혈소판감소 자색반, 호산구성 근막염, 과다IgE 증후군, 항인지질 증후군;

12. 염증성 또는 면역학적 성분을 갖는 다른 질환; 예를 들어, 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS), 나병, 세자리 (Sezary) 증후군, 및 부신생물 증후군;

13. 심혈관: 관상 및 말초 순환을 해치는 죽상경화증; 심장막염; 심근염, 염증성 및 자가면역 심근병증, 예를 들어 심근 사르코이드증; 허혈 재관류 손상; 심내막염, 판막염, 및 대동맥염, 예를 들어 감염성 (예를 들어 매독성); 혈관병증; 근위 및 말초 정맥의 질환, 예를 들어 정맥염 및 혈전증, 예를 들어 심부 정맥 혈전증, 및 정맥류의 합병증;

14. 종양학: 일반적인 암, 예를 들어 전립선, 유방, 폐, 난소, 췌장, 창자 및 결장, 위, 피부 및 뇌 종양, 및 골수 (예를 들어, 백혈병) 및 림프증식계에 영향을 미치는 악성 종양, 예를 들어 호지킨 (Hodgkin) 및 비-호지킨 림프종의 치료; 예를 들어 전이성 질병과 종양 재발 및 부신생물 증후군의 예방 및 치료; 및

15. 위장관: 복강 질병, 직장염, 호산구성 위장관염, 비만세포증, 크론 병, 궤양 대장염, 현미경적 대장염, 미정 대장염, 과민성 장 질환, 과민성 장 증후군, 비-염증성 설사, 장으로부터 멀리 영향을 미치는 음식-관련 알레르기, 예를 들어, 편두통, 비염 및 습진.

본 발명의 결합 요소는 동물 또는 질병의 동물 모델, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그, 원숭이, 물고기, 개, 소, 염소, 말 등에서 사용될 수 있다. CXCL13/CXCR5 신호전달계를 포함하는 동물 모델은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 류마티스성 관절염의 동물 모델, 예를 들어 CIA, AIA 및 연쇄구균 세포벽 (SCW) 모델이 공지되어 있다. MS의 동물 모델은 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) 마우스 모델이다. SLE의 마우스 모델은 MRL/lpr 마우스 모델 및 NZB x NZW F₁ (BWF₁) 마우스 모델을 포함한다.

따라서, 본 발명의 결합 요소는 CXCL13, 예를 들어 CXCL13 발현 및/또는 활성, 특히 비정상적인 발현/활성을 수반하는 질병 또는 질환의 치료에서 치료제로서 유용하다. 치료 방법은 유효량의 본 발명의 결합 요소를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있고, 이에 의해 CXCL13의 비정상적인 발현 및/또는 활성이 감소한다. 치료 방법은 (i) 예를 들어 상기한 진단 방법을 사용하여 비정상적인 CXCL13 수준 또는 활성을 보이는 환자를 확인하고, (ii) 유효량의 본 발명의 결합 요소를 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 CXCL13의 비정상적인 발현 및/또는 활성이 감소한다. 본 발명에 따른 유효량은 반드시 질병 또는 질환을 치료하기 위해서는 아니지만, 치료되는 특정 질병 또는 질환의 적어도 하나의 증상의 중증도를 감소 또는 완화시키기 위해 CXCL13의 비정상적인 발현 및/또는 활성을 감소시키는 양이다.

또한, 본 발명은 CXCL13의 적어도 하나의 효과가 길항되도록 유효량의 하나 이상의 본 발명의 결합 요소와 접촉시키거나 결합 요소를 투여하는 것을 포함하는, CXCL13의 적어도 하나의 효과를 길항하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 길항될 수 있는 CXCL13의 효과는 CXCR5에 대한 결합, 및 상기 결합 반응의 결과로서 발생하는 임의의 하류의 효과를 포함한다. 따라서, 본 발명의 결합 요소는 CXCL13-CXCR5 신호전달, 특히 비정상적인 CXCL13-CXCR5 신호전달을 수반하는 질병 또는 질환의 치료시의 치료제로서 유용하다.

따라서, 본 발명의 다른 측면은 제시되는 결합 요소의 투여를 포함하는 치료 방법, 상기 결합 요소를 포함하는 제약 조성물, 및 투여를 위한 의약의 제조에서, 예를 들어 결합 요소를 제약상 허용되는 부형제와 함께 제제화하는 것을 포함하는 의약 또는 제약 조성물의 제조 방법에서 상기 결합 요소의 용도를 제공한다.

제약상 허용되는 부형제는 예를 들어 활성 화합물(들)의 투여 용이성, 체내에서 그의 수명 및/또는 그의 효능의 증가, 그의 용액 내 용해도의 증가 또는 그의 보존 측면의 개선을 가능하게 하는, 2차 반응을 유발하지 않으면서 제약 조성물 내로 도입되는 화합물 또는 화합물의 조합물일 수 있다. 상기 제약상 허용되는 비히클은 공지되어 있고, 선택된 활성 화합물(들)의 특성 및 투여 방식의 함수로서 당업자에 의해 적용될 것이다.

본 발명의 결합 요소는 대체로 결합 요소 이외에 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있는 제약 조성물의 형태로 투여될 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한, 본 발명에 따른 제약 조성물은 활성 성분 이외에, 제약상 허용되는 부형제, 담체, 버퍼, 안정화제 또는 당업자에게 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 상기 물질은 비-독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 하다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 아래에서 논의되는 바와 같이 경구, 흡입, 기관내, 국소, 소낭내 (intravesicular) 또는 주사에 의한 투여일 수 있는 투여 경로에 따라 결정될 것이다.

또한, 예를 들어 단일 도메인 항체 분자 (예를 들어 "나노바디스 (nanobodies)™") 등과 같은 경구 투여용 제약 조성물이 본 발명에서 고려된다. 상기 경구 제제는 정제, 캡슐, 분말, 액체 또는 반고체 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체, 예를 들어 젤라틴 또는 어쥬번트를 포함할 수 있다. 액체 제약 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예를 들어 물, 석유, 동물 또는 식물유, 광유 또는 합성 오일을 포함한다. 생리적 염수 용액, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액 또는 글리콜, 예를 들어 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.

정맥내 주사, 또는 질병 부위의 주사를 위해, 활성 성분은 발열원이 존재하지 않고, 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수성 용액의 형태일 것이다. 당업자는 예를 들어 등장성 비히클, 예를 들어 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 유산 첨가 링거 주사액 (Lactated Ringer's Injection)을 사용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 버퍼, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레졸시놀; 시클로헥사놀; 3'-펜타놀 및 m-크레졸); 낮은 분자량 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하여, 보존제, 안정화제, 버퍼, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 사용될 수 있다.

본 발명의 결합 요소는 분자의 물리화학적 특성 및 전달 경로에 따라 액체, 반고체 또는 고체 형태로 제제화될 수 있다. 제제는 부형제, 또는 부형제의 조합물, 예를 들어 당, 아미노산 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 액체 제제는 광범위한 항체 농도 및 pH를 포함할 수 있다. 고체 제제는 예를 들어 동결건조, 분무 건조, 또는 초임계 유체 기술에 의한 건조에 의해 생산될 수 있다. 항-CXCL13의 제제는 의도하는 전달 경로에 따라 결정될 것이다. 예를 들어, 폐 전달을 위한 제제는 흡입시에 폐부 깊숙이 투과하도록 보장하는 물리적 특성을 갖는 입자로 구성될 수 있고; 국소 제제 (예를 들어 상처, 예를 들어 피부 상처 치료를 위한)는 약물이 작용 부위에 잔류하는 시간을 연장시키는 점도 조정제를 포함할 수 있다. 결합 요소는 신속한 방출에 대해 결합 요소를 보호하는 담체로, 예를 들어 서방성 제제, 예를 들어 임플란트, 경피 패치 및 미세캡슐화 (microencapsulated) 전달 시스템으로 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안히드라이드 (polyanhydride), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 상기 제제의 제조를 위한 많은 방법이 당업자에게 알려져 있다 [82].

항-CXCL13 처리제는 경구 (예를 들어 단일 도메인 항체 분자 (예를 들어 "나노바디스™")), 주사 (예를 들어, 피하, 관절내, 정맥내, 복강내, 동맥내 또는 근내), 흡입, 기관내, 소낭내 경로 (방광 내로의 점적 주입), 또는 국소 (예를 들어 안내, 비내, 직장, 피부 상처 내) 경로에 의해 투여될 수 있다. 처리제는 특히 결합 요소의 감소하는 용량을 사용하는 펄스 주입에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로는 처리제의 물리화학적 특성, 질병에 대한 특수한 고려 사항 또는 효능 최적화 또는 부작용 최소화를 위한 요건에 의해 결정될 수 있다. 특정 투여 경로의 하나는 정맥내 경로이다. 본 발명의 제약 조성물의 다른 투여 경로는 피하 경로이다. 항-CXCL13 처리제가 임상에서 사용하는 것으로 제한되지 않음이 고려된다. 따라서, 무바늘 (needle-free) 기기를 사용한 피하 주사도 유리할 수 있다. 정맥내 제제의 예는 다음을 포함한다:

조성물은 단독으로 또는 다른 처리제와 조합되어 치료되는 병태에 따라 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

CXCL13에 대한 결합 요소는 추가의 의약 성분과 함께 조합 요법제의 일부로서 사용될 수 있다. 조합 치료제, 특히 항-CXCL13 결합 요소와 하나 이상의 다른 약물의 조합물이 유의한 상승 효과를 제공하기 위해 사용될 수 있다. CXCL13에 대한 결합 요소는 본원에 나열된 하나 이상의 병태의 치료를 위해 다른 치료제 또는 치료제들과 동시에 또는 순차적으로 또는 조합 제제로서 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 결합 요소는 다음 물질 중의 하나 이상과 조합되거나 부가되어 제공될 수 있다:

- 시토킨 또는 시토킨 기능의 아고니스트 또는 길항제 (예를 들어, 시토킨 신호전달 경로에 대해 작용하는 물질, 예를 들어 SOCS 시스템의 조정자), 예를 들어 알파-, 베타- 및/또는 감마-인터페론; 인슐린 유사 성장 인자 타입 I (IGF-I), 그의 수용체 및 관련 결합 단백질; 인터루킨 (IL), 예를 들어 하나 이상의 IL-1 내지 -33, 및/또는 인터루킨 길항제 또는 억제제, 예를 들어 아나킨라; 인터루킨 패밀리 요소의 수용체의 억제제 또는 상기 수용체의 특이적인 서브유닛의 억제제, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 억제제, 예를 들어 항-TNF 모노클로날 항체 (예를 들어 인플릭시맙, 아달리무맙 및/또는 CDP-870) 및/또는 TNF 수용체 길항제, 예를 들어 면역글로불린 분자 (예를 들어 에타네르셉트) 및/또는 저분자량 물질, 예를 들어 펜톡시필린;

- B 세포의 조정자, 예를 들어 B-림프구 (예를 들어 CD20 (리툭시맙), MRA-aIL16R 또는 벨리무맙) 또는 T-림프구를 표적으로 하는 모노클로날 항체 (예를 들어 CTLA4-Ig (아바타셉트), HuMax II-15);

- B 세포 활성화, 성숙 또는 생존의 조정자 (예를 들어 아타시셉트);

- 면역 기능의 조정자, 예를 들어 림프독소 LIGHT 경로의 길항제 (예를 들어 LTBR-Fc)

- 파골세포 활성을 억제하는 조정자, 예를 들어 RANKL에 대한 항체;

- 케모킨 또는 케모킨 수용체 기능의 조정자, 예를 들어 CCR1, CCR2, CCR2A, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10 및 CCR11의 길항제 (C-C 패밀리의 경우); CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4 및 CXCR5 및 CXCR6 (C-X-C 패밀리의 경우) 및 C-X₃-C 패밀리의 경우 CX₃CR1;

- 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP), 즉, 하나 이상의 스트로멜리신, 콜라게나제 및 젤라티나제 및 아그레카나제, 특히 콜라게나제-1 (MMP-1), 콜라게나제-2 (MMP-8), 콜라게나제-3 (MMP-13), 스트로멜리신-1 (MMP-3), 스트로멜리신-2 (MMP-10) 및/또는 스트로멜리신-3 (MMP-11) 및/또는 MMP-9 및/또는 MMP-12의 억제제, 예를 들어 독시사이클린과 같은 물질;

- 류코트리엔 생합성 억제제, 5-리폭시게나제 (5-LO) 억제제 또는 5-리폭시게나제 활성화 단백질 (FLAP) 길항제, 예를 들어 질류톤; ABT-761; 펜류톤; 테폭살린; 애보트 (Abbott)-79175; 애보트-85761; N-(5-치환)-티오펜-2-알킬술폰아미드; 2,6-디-t-부틸페놀히드라존; 메톡시테트리히드로피란, 예를 들어 Zeneca ZD-2138; 화합물 SB-210661; 피리디닐-치환 2-시아노나프탈렌 화합물, 예를 들어 L-739,010; 2-시아노퀴놀린 화합물, 예를 들어 L-746,530; 인돌 및/또는 퀴놀린 화합물, 예를 들어 MK-591, MK-886 및/또는 BAY x 1005;

- 류코트리엔 (LT) B4, LTC4, LTD4, 및 LTE4에 대한 수용체 길항제: 페노티아진-3-1s, 예를 들어 L-651,392; 아미디노 화합물, 예를 들어 CGS-25019c; 벤즈옥살아민, 예를 들어 온타졸라스트; 벤젠 카르복시미다미드, 예를 들어 BIIL 284/260; 및 화합물, 예를 들어 자피르루카스트, 아블루카스트, 몬텔루카스트, 프란루카스트, 베르루카스트 (MK-679), RG-12525, Ro-245913, 아라루카스트 (CGP 45715A) 및 BAY x 7195로 이루어지는 군 중에서 선택됨;

- 포스포디에스테라제 (PDE) 억제제, 예를 들어 메틸잔타닌, 예를 들어 테오필린 및/또는 아미노필린; 및/또는 선택적인 PDE 동종효소 억제제, 예를 들어 PDE4 억제제 및/또는 이소형 PDE4D의 억제제 및/또는 PDE5의 억제제;

- 히스타민 타입 1 수용체 길항제, 예를 들어 세티리진, 로라타딘, 데슬로라타딘, 펙소페나딘, 아크리바스틴, 테르페나딘, 아스테미졸, 아젤라스틴, 레보카바스틴, 클로르페니라민, 프로메타진, 시클리진 및/또는 미졸라스틴 (일반적으로 경구, 국소 또는 비경구적으로 적용됨);

- 양성자 펌프 억제제 (예를 들어 오메프라졸) 또는 위보호성 히스타민 타입 2 수용체 길항제;

- 히스타민 타입 4 수용체의 길항제;

- 알파-1/알파-2 아드레날린수용체 아고니스트 혈관수축제 교감신경 유사 작용제, 예를 들어 프로필헥세드린, 페닐에프린, 페닐프로판올아민, 에페드린, 슈도에페드린, 나파졸린 염산염, 옥시메타졸린 염산염, 테트라히드로졸린 염산염, 자일로메타졸린 염산염, 트라마졸린 염산염 및 에틸노르에피네프린 염산염;

- 항콜린작용제, 예를 들어 무스카린 수용체 (M1, M2, 및 M3) 길항제, 예를 들어 아트로핀, 히오신, 글리코피롤레이트, 이프라트로퓸 브로마이드, 티오트로퓸 브로마이드, 옥시트로퓸 브로마이드, 피렌제핀 및 텔렌제핀;

- 베타-아드레날린수용체 아고니스트 (베타 수용체 서브타입 1-4 포함), 예를 들어 이소프레날린, 살부타몰, 포르모테롤, 살메테롤, 테르부탈린, 오르시프레날린, 비톨테롤 메실레이트 및/또는 피르부테롤, 예를 들어 그의 키랄 에난티오머;

- 크로몬, 예를 들어 나트륨 크로모글리케이트 및/또는 네도크로밀 나트륨;

- 글루코코르티코이드, 예를 들어 플루니솔리드, 트리암시놀론 아세토니드, 베클로메탄손 디프로피오네이트, 부데소니드, 플루티카손 프로피오네이트, 시클레소니드, 및/또는 모메타손 푸로에이트;

- 핵 호르몬 수용체를 조정하는 물질, 예를 들어 PPAR;

- 면역글로불린 (Ig) 또는 Ig 제제 또는 Ig 기능을 조정하는 길항제 또는 항체, 예를 들어 항-IgE 항체 (예를 들어 오말리주맙);

- 다른 전신 또는 국소 적용 소염제, 예를 들어 탈리도미드 또는 그의 유도체, 레티노이드, 디프라놀 및/또는 칼시포트리올;

- 아미노살리실레이트 및 술파피리딘, 예를 들어 술파살라진, 메살라진, 발살라지드 및 올살라진의 조합물; 및 면역조정제, 예를 들어 티오퓨린; 및 코르티코스테로이드, 예를 들어 부데소니드;

- 항균제, 예를 들어 페니실린 유도체, 테트라사이클린, 마크롤리드, 베타-락탐, 플루오로퀴놀론, 메트로니다졸 및/또는 흡입 아미노글리코시드; 및/또는 항바이러스제, 예를 들어 아시클로비르, 팜시클로비르, 발라시클로비르, 간시클로비르, 시도포비르; 아만타딘, 리만타딘; 리바비린; 자나마비르 및/또는 오셀타마비르; 프로테아제 억제제, 예를 들어 인디나비르, 넬피나비르, 리토나비르 및/또는 사퀴나비르; 뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 예를 들어 디다노신, 라미부딘, 스타부딘, 잘시타빈, 지도부딘; 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 예를 들어 네비라핀, 에파비렌즈;

- 심혈관제, 예를 들어 칼슘 채널 차단제, 베타-아드레날린수용체 차단제, 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제, 안지오텐신-2 수용체 길항제; 지질강하제, 예를 들어 스타틴 및/또는 피브레이트; 혈액 세포 형태의 조정자, 예를 들어 펜톡시필린; 혈전용해제 및/또는 항응고제, 예를 들어 혈소판 응집 억제제;

- CNS제, 예를 들어 항우울제 (예를 들어 세르트랄린), 항-파킨슨 증후군 약물 (예를 들어 데프레닐, L-도파, 로피니롤, 프라미펙솔; MAOB 억제제, 예를 들어 셀레긴 및 라사길린; comP 억제제, 예를 들어 타스마르; A-2 억제제, 도파민 재흡수 억제제, NMDA 길항제, 니코틴 아고니스트, 도파민 아고니스트 및/또는 신경세포 산화질소 합성효소의 억제제) 및 항-알쯔하이머 약물, 예를 들어 도네페질, 리바스티그민, 타크린, COX-2 억제제, 프로펜토필린 또는 메트리포네이트;

- 급성 및 만성 통증 치료제, 예를 들어 중추 또는 말초 작용 진통제, 예를 들어 아편 유사체 또는 유도체, 카르바마제핀, 페니토인, 발프로산나트륨, 아미트립틸린 또는 다른 항우울제, 파라세타몰, 또는 비-스테로이드성 소염제;

- 비경구 또는 국소 적용 (흡입 포함) 국소 마취제, 예를 들어 리그로카인 또는 그의 유사체;

- 항-골다공증제, 예를 들어 호르몬제, 예를 들어 랄록시펜, 또는 비포스포네이트, 예를 들어 알렌드로네이트;

- (i) 트립타제 억제제; (ii) 혈소판 활성화 인자 (PAF) 길항제; (iii) 인터루킨 전환 효소 (ICE) 억제제; (iv) IMPDH 억제제; (v) 부착 분자 억제제, 예를 들어 VLA-4 길항제; (vi) 카텝신; (vii) 키나제 억제제, 예를 들어 티로신 키나제의 억제제 (예를 들어 Btk, Itk, Jak3 MAP; 억제제의 예는 게피티닙, 이마티닙 메실레이트를 포함할 수 있다), 세린/트레오닌 키나제 (예를 들어 MAP 키나제의 억제제, 예를 들어 p38, JNK, 단백질 키나제 A, B 및 C 및 IKK), 또는 세포 주기 조절에 관련된 키나제 (예를 들어 사이클린 의존성 키나제); (viii) 글루코스-6 포스페이트 데히드로게나제 억제제; (ix) 키닌-B₁ 및/또는 B₂-수용체 길항제; (x) 항-통풍제, 예를 들어 콜히친; (xi) 잔틴 옥시다제 억제제, 예를 들어 알로푸리놀; (xii) 요산배설제, 예를 들어 프로베네시드, 술핀피라존, 및/또는 벤즈브로마론; (xiii) 성장 호르몬 분비촉진제; (xiv) 전환 성장 인자 (TGFβ); (xv) 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); (xvi) 섬유모세포 성장 인자, 예를 들어 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF); (xvii) 과립구 포식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF); (xviii) 캡사이신 크림; (xix) 타키키닌 NK₁ 및/또는 NK₃ 수용체 길항제, 예를 들어 NKP-608C, SB-233412 (탈네탄트) 및/또는 D-4418; (xx) 엘라스타제 억제제, 예를 들어 UT-77 및/또는 ZD-0892; (xxi) TNF-알파 전환 효소 억제제 (TACE); (xxii) 유도 산화질소 합성효소 (iNOS) 억제제 또는 (xxiii) TH2 세포 상에 발현되는 화학유인물질 수용체-상동성 분자 (예를 들어, CRTH2 길항제); (xxiv) P38의 억제제; (xxv) Toll-유사 수용체 (TLR)의 기능 조정제 및 (xxvi) 퓨린성 수용체의 활성 조정제, 예를 들어 P2X7; (xxvii) 전사 인자 활성화 억제제, 예를 들어 NFkB, API, 및/또는 STATS.

억제제는 특이적일 수 있거나 또는 혼합된 억제제, 예를 들어 2 이상의 분자 (예를 들어 수용체) 또는 상기 언급한 분자 클래스를 표적으로 하는 억제제일 수 있다.

또한, 결합 요소는 화학요법제, 또는 다른 티로신 키나제 억제제와 함께 동시 투여되거나 또는 면역컨쥬게이트의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 상기 항체의 단편은 재조합 메카니즘 또는 생화학적 커플링, 이어서 상기한 항체의 특이성을 CXCL13이 관련되는 활성에 관여하는 다른 분자를 인식할 수 있는 다른 항체의 특이성과 연결시켜 얻은 이중특이적 항체에 사용될 수 있다.

염증성 질병, 예를 들어 류마티스 관절염, 골관절염, 천식, 알레르기성 비염, 만성 폐쇄성 폐 질병 (COPD), 또는 건선의 치료를 위해, 본 발명의 결합 요소는 하나 이상의 물질, 예를 들어 비스테로이드성 소염제 (이하 NSAID), 예를 들어 비-선택적인 시클로옥시게나제 (COX)-1/COX-2 억제제 (국소 또는 전신 적용 여부와 무관함), 예를 들어 피록시캄, 디클로페낙, 프로피온산, 예를 들어 나프록센, 플루르비프로펜, 페노프로펜, 케토프로펜 및 이부프로펜, 페나메이트, 예를 들어 메페남산, 인도메타신, 술린닥, 아자프로파존, 피라졸론, 예를 들어 페닐부타존, 살리실레이트, 예를 들어 아스피린); 선택적인 COX-2 억제제 (예를 들어 멜록시캄, 셀레콕시브, 로페콕시브, 발데콕시브, 루마로콕시브, 파레콕시브 및 에토리콕시브); 시클로-옥시게나제 억제성 산화질소 공여체 (CINOD); 글루코코르티코스테로이드 (국소, 경구, 근내, 정맥내 또는 관절내 경로에 의해 투여되는지 여부와 무관); 메토트렉세이트, 레플루노미드; 히드록시클로로퀸, d-페니실라민, 아우라노핀 또는 다른 비경구 또는 경구 금 제제; 진통제; 디아세레인; 관절내 치료제, 예를 들어 히알루론산 유도체; 및 영양 보충제, 예를 들어 글루코사민과 조합될 수 있다.

본 발명의 결합 요소는 또한 암의 치료를 위해 기존의 치료제와 조합되어 사용될 수 있다. 조합되어 사용될 적합한 치료제는

(i) 종양의학에서 사용되는 바와 같은 항증식/항신생물 약물 및 그의 조합물, 예를 들어 글리벡 (Gleevec) (이마티닙 메실레이트), 알킬화제 (예를 들어 시스플라틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 질소 머스타드, 멜팔란, 클로람부실, 부술판 및 니트로소우레아); 항대사물질 (예를 들어 항엽산제, 예를 들어 플루오로피리미딘, 예를 들어 5-플루오로우라실 및 테가푸르, 랄티트렉세드, 메토트렉세이트, 시토신 아라비노시드, 히드록시우레아, 겜시타빈 및 파클리탁셀); 항종양 항생제 (예를 들어 안트라사이클린, 예를 들어 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 닥티노마이신 및 미쓰라마이신); 항유사분열제 (예를 들어 빈카 알칼로이드, 예를 들어 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈, 및 탁소이드, 예를 들어 탁솔 및 탁소테레); 및 토포이소머라제 억제제 (예를 들어 에피포도필로톡신, 예를 들어 에토포시드 및 테니포시드, 암사크린, 토포테칸 및 캄토테신);

(ii) 세포증식억제제, 예를 들어 항에스트로겐 (예를 들어 타목시펜, 토레미펜, 랄록시펜, 드로록시펜 및 요독시펜), 에스트로겐 수용체 하향 조절제 (예를 들어 풀베스트란트), 항안드로젠 (예를 들어 비카룰타미드, 플루타미드, 닐루타미드 및 시프로테론 아세테이트), LHRH 길항제 또는 LHRH 아고니스트 (예를 들어 고세렐린, 류프롤렐린 및 부세렐린), 프로게스토겐 (예를 들어 메게스트롤 아세테이트), 아로마타제 억제제 (예를 들어 아나스트로졸, 레트로졸, 보라졸 및 엑세메스탄) 및 5α-리덕타제의 억제제, 예를 들어 피나스테리드;

(iii) 암 세포 침습을 억제하는 물질 (예를 들어 메탈로프로테이나제 억제제, 예를 들어 마리마스타트, 및 유로키나제 플라스미노겐 활성제 수용체 기능의 억제제);

(iv) 성장 인자 기능의 억제제, 예를 들어 성장 인자 항체, 성장 인자 수용체 항체를 포함하는 억제제 (예를 들어 항-erbb2 항체 트라스투주맙 및 항-erbb1 항체 세툭시맙 [C225]), 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 티로신 키나제 억제제 및 세린/트레오닌 키나제 억제제, 예를 들어 표피 성장 인자 패밀리의 억제제 (예를 들어 EGFR 패밀리 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시) 퀴나졸린-4-아민 (게피티닙, AZD1839), N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시) 퀴나졸린-4-아민 (에를로티닙, OSI-774) 및 6-아크릴아미도-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-(3-모르폴리노프로폭시) 퀴나졸린-4-아민 (CI 1033)), 예를 들어 혈소판-유래 성장 인자 패밀리의 억제제 및 예를 들어 간세포 성장 인자 패밀리의 억제제;

(v) 항혈관신생제, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자의 효과를 억제하는 물질 (예를 들어 항-혈관 내피 세포 성장 인자 항체 베바치주맙, 국제 특허 출원 WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 및 WO 98/13354 (각각 그 전문이 본원에 포함됨)에 개시된 것과 같은 화합물 및 다른 기전으로 작용하는 화합물 (예를 들어 리노마이드, 인테그린 αvβ3 기능의 억제제 및 안지오스타틴);

(vi) 혈관 손상제, 예를 들어 콤브레타스타틴 A4 및 국제 특허 출원 WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 및 WO 02/08213 (각각 그 전문이 본원에 포함됨)에 개시된 화합물;

(vii) 안티센스 요법, 예를 들어 상기 나열된 표적에 대한 요법, 예를 들어 ISIS 2503, 항-ras 안티센스;

(viii) 유전자 요법 방법, 예를 들어 비정상 유전자, 예를 들어 비정상 p53 또는 비정상 BRCA1 또는 BRCA2를 교체하는 방법, GDEPT (유전자 지정 효소 전구약물 요법) 방법, 예를 들어 시토신 데아미나제, 티미딘 키나제 또는 세균 니트로리덕타제 효소를 사용하는 방법, 및 화학요법 또는 방사선요법에 대한 환자 내성을 증가시키는 방법, 예를 들어 다제-약물 내성 유전자 요법; 및

(ix) 면역요법 방법, 예를 들어 환자 종양 세포의 면역원성을 증가시키는 생체외 및 생체내 방법, 예를 들어 시토킨, 예를 들어 인터루킨 2, 인터루킨 4 또는 과립구 포식세포 콜로니 자극 인자를 사용하는 형질감염, T-세포 부반응 (anergy)을 감소시키는 방법, 형질감염된 면역 세포, 예를 들어 시토킨-형질감염된 수지상 세포를 사용하는 방법, 시토킨-형질감염된 종양 세포주를 사용하는 방법 및 항-개별특이형 항체를 사용하는 방법을 포함한다.

본 발명의 결합 요소 및 하나 이상의 상기 추가의 의약 성분이 의약의 제조에 사용될 수 있다. 의약은 개체에게 별개로 투여하거나 또는 조합 투여를 위한 것일 수 있고, 따라서 조합 제제로서 또는 별개의 제제로서 결합 요소 및 추가의 성분을 포함할 수 있다. 별개의 제제는 별개의 순차적인 투여 또는 동시 투여를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있고, 상이한 경로, 예를 들어 경구 및 비경구 투여에 의한 성분의 투여를 가능하게 한다.

본 발명에 따라 제공되는 조성물은 포유동물에게 투여될 수 있다. 투여는 보통 "치료 유효량"으로 이루어지고, 이것은 환자에게 잇점을 주기에 충분한 양이다. 적어도 상기 잇점은 적어도 하나의 증상의 개선일 수 있다. 투여되는 실제량 및 투여 속도 및 시간 경로는 치료되는 질병의 특성 및 중증도, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 조성물의 전달 부위, 결합 요소의 종류, 투여 방법, 투여 스케쥴 및 제약 실무자에게 공지된 다른 요인에 따라 결정될 것이다. 치료 처방, 예를 들어 용량 결정 등은 일반적인 개업의 및 다른 의사의 책임 하에 결정되고, 증상의 중증도 및/또는 치료되는 질병의 경과에 의해 결정될 수 있다. 항체의 적절한 투여량은 당업계에 공지되어 있다 [83, 84]. 본원에서 또는 문헌 [Physician's Desk Reference (2003)]에서 투여되는 의약의 종류에 적절한 것으로 제시된 특정 용량이 사용될 수 있다. 본 발명의 결합 요소의 치료 유효량 또는 적합한 투여량은 그의 시험관 내 활성 및 동물 모델에서의 생체 내 활성을 비교하여 결정할 수 있다. 마우스 및 다른 시험 동물에서 효과적인 용량을 인간에게 외삽하기 위한 방법이 공지되어 있다. 정확한 투여량은 항체가 진단, 예방 또는 치료용인지의 여부, 치료되는 영역의 크기 및 위치, 항체 (예를 들어 전체 항체, 단편 또는 디아바디)의 정확한 특성 및 항체에 부착되는 임의의 검출가능한 표지 또는 다른 분자의 특성을 포함하는 많은 요인에 따라 결정될 것이다. 전형적인 항체 투여량은 전신 투여를 위해 100 ㎍ 내지 1 g, 국소 투여를 위해 1 ㎍ 내지 1 mg일 것이다. 초기에 보다 많은 로딩 투여량을 투여한 후, 1회 이상의 더 적은 투여량을 투여할 수 있다. 일반적으로, 항체는 전체 항체, 예를 들어 IgG1 이소형일 것이다. 이것은 성인 환자의 1회 치료를 위한 투여량으로서, 아동 및 유아에 대해 비례에 따라 조정될 수 있고, 또한 분자량에 비례하여 다른 항체 포맷에 대해서도 조정될 수 있다. 치료는 의사의 판단에 따라 1일, 1주 2회, 1주 또는 1개월 간격으로 반복될 수 있다. 치료는 피하 투여를 위해 2 내지 4주마다, 정맥내 투여를 위해 4 내지 8주마다 시행될 수 있다. 치료는 주기적일 수 있고, 투여 사이의 기간은 약 2주 이상, 예를 들어 약 3주 이상, 약 4주 이상 또는 약 1개월일 수 있다. 치료는 수술 전 및/또는 후에 시행될 수 있고/있거나, 투여되거나 또는 수술에 의한 해부학상 치료 부위에 직접 적용될 수 있다.

본 발명의 결합 요소는 본원에서 기재되는 바와 같이 샘플 내의 CXCL13의 수준을 결정하기 위해서 생체 외에서 사용될 수 있다. 상기 방법은 일반적으로 샘플을 결합 요소의 CXCL13에 대한 결합을 허용하는 조건 하에서 본 발명의 결합 요소와 접촉시키고, 샘플 내의 결합된 CXCL13의 수준을 측정하는 것을 포함한다. CXCL13의 수준은 적합한 표준물 또는 대조물과 비교될 수 있다.

이 방법은 그로부터 샘플을 얻은 개체에서 질병 또는 병태의 진단 또는 예후 예측을 위해 사용될 수 있고, 여기서 CXCL13 수준이 그에 대한 예측인자이다. 예를 들어, 방법은 류마티스성 관절염에서 질병 중증도의 진단 또는 예후 예측을 위해 사용될 수 있고, 상기 방법은 류마티스성 관절염으로 고통받거나 고통받을 것으로 의심되는 개체로부터 얻은 적합한 샘플, 예를 들어 혈청 또는 활막액 샘플 내의 CXCL13의 수준을 결정하는 것을 포함한다. 대조군 샘플에 비해 CXCL13 수준의 상승은 질병이 존재함을 나타내고, CXCL13 수준과 질병 중증도 사이에 정적 상관관계가 존재한다.

분석 물질 및 방법

물질

CHO Gqi5 세포: G 단백질 Gqi5 (서열 19)를 발현하는 CHO K1 세포.

CHO Gqi5 hCXCR5 세포 또는 CHO Gqi5 hCXCR5 c4.4 세포; 인간 CXCR5 (서열 17)를 안정하게 발현하는 CHO Gqi5 세포.

최소 필수 배지 (깁코 (Gibco) 31095)

1％ 비필수 아미노산 (깁코 11140)

HTRF®cAMP 분석을 위한 분석 배지: 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴 (시그마 (Sigma) I7018), 1％ 비필수 아미노산 (깁코 11140), 0.1％ BSA를 함유하는 최소 필수 배지 (깁코 31095)

HTRF 분석을 위한 CAMP-XL665 용액: XL665 (알로피코시아닌 염료, 80 kD 크기, cAMP에 직접 커플링됨)을 포함하는 용액.

HTRF cAMP 분석을 위한 컨쥬게이트 용해 버퍼

HTRF 분석을 위한 항-cAMP 유로퓸 크립테이트 용액

행크 (Hanks) 균형 염 용액 (시그마 H8264)

LANCE® cAMP 분석을 위한 분석 배지: 5 mM HEPES (pH 7.4), 0.5 mM 3-이소 부틸-1-메틸잔틴 (시그마 I7018), 0.1％ BSA를 함유하는 행크 균형 염 용액 (시그마 H8264).

LANCE® cAMP 분석을 위한 Alexa Fluor®-647 항-cAMP 항체: 50 mM Tris HCl (pH 7.8) 염 용액, 0.9％ 염화나트륨, 0.1％ BSA, 0.05％ 나트륨 아지드 (방부제) 내에 제형화된 염료 Alexa Fluor®-647로 표지된 cAMP 특이적 항체.

LANCE® 검출 믹스 (mix)

둘베코 (Dulbecco) 변형 이글 (Eagle) 배지 (DMEM) (인비트로겐 (Invitrogen))

L-글루타민이 없는 MEM-비-필수 아미노산 (인비트로겐)

CXCL13 유도된 Ca² ⁺ 방출 분석 배지: 10％ (v/v) 열 불활성화된 태소 혈청 (FBS) (인비트로겐), 1％ (v/v) MEM-L-글루타민이 없는 비-필수 아미노산 (인비트로겐)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM).

CXCL13 유도된 Ca² ⁺ 방출 분석을 위한 염료-로딩 용액

CXCL13 유도된 Ca² ⁺ 방출 분석을 위한 Fluo-4 NW 염료 믹스

FLIPR 버퍼:

125 mM NaCl

5 mM KCl

1 mM MgCl₂

1.5 mM CaCl₂

30 mM Hepes

2.5 mM 프로베네시드 (4-(디프로필술파모일) 벤조산)

5 mM 글루코스

1％ (v/v) 열-불활성화된 FBS.

B300.19 hCXCRS 세포: 인간 CXCR5로 안정하게 형질감염된 쥐 프리-B 세포주

B300.19 hCXCR5 세포를 사용하는 화학주성 분석을 위한 배양 배지: 10％ 태소 혈청 (FCS); 1％ 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민 (PSG); 1％ 피루브산나트륨; 1.5 ㎍/ml 푸라마이신 및 0.1％ 2-β-머캅토에탄올을 함유하는 RPMI-1640 (시그마, Cat# R0883).

방법

CXCL13 수용체- 리간드 결합 분석 ( FMAT )

CXCL13 수용체 리간드 결합 분석에서는 형광 미세부피 분석 기술 (FMAT)을 사용하여 비오티닐화된 인간 CXCL13 (알맥 (Almac))과 B300.19 세포 (알맥) 상에 과다발현된 CXCR5 수용체 사이의 상호작용을 측정한다 ([Dietz et al 1996], [Miraglia et al 1999], [Mellentin-Michelotti et al. 1999]). 상기 분석은 CXCL13: CXCR5 상호작용의 억제에 대해 조질 scFv 주변세포질 추출물 또는 정제된 scFv를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.

선택 결과물을 200 mM Tris 버퍼 (pH 7.4), 0.5 M 수크로스 내에 제조된 희 석된 조질 scFv-함유 주변세포질 추출물로서 스크리닝하였다. 샘플 및 시약의 모든 희석은 0.025％ 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.01％ 나트륨 아지드를 함유하는 행크 균형 염 용액 (시그마 H8264) 내에서 수행하였다. 희석된 샘플 (20 ㎕)을 1 nM 비오티닐화된-인간 CXCL13, 25 ng/mL 스트렙타비딘 FMAT-Blue (어플라이드 바이오시스템즈 4362492) 및 B300.19 CXCR5 세포 (4000 세포/웰)와 함께 2시간 동안 실온에서 50 ㎕의 총 분석 부피로 투명한 바닥의 384 웰 비-결합 표면 플레이트 (코스타르 (Costar) 3655) 내에서 인큐베이션하였다. 총 결합 및 비-특이적 결합 (NSB) 대조군은 각각 분석 버퍼 또는 3 nM 최종 분석 농도의 항-인간 CXCL13 모노클로날 항체 (알&디 시스템즈 MAB801)를 사용하여 설정하였다. 플레이트를 어플라이드 바이오시스템즈 세포 검출 시스템 8200 상에서 판독하고, 데이타를 FL1 <1600, 크기 <15 및 색상비 <0.4의 게이팅을 사용하는 왕 골드먼 (Wang Goldman) 알고리즘을 이용하여 분석하였다.

％ 특이적 결합은 총 FL1 데이타로부터 식 1을 이용하여 결정하였고, 여기서 NSB FL1 합계는 비특이적 결합 대조 웰의 평균값이고, 총 결합 FL1 합계는 총 결합 대조 웰의 평균값이다.

식 1:

％ 특이적 결합 = [(샘플 FL1 합계 - NSB FL1 합계)/(총 결합 FL1 합계 - NSB FL1 합계)] X 100

HTRF ® cAMP 분석

세포 내의 3',5' 시클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP) 수준은 아데노신 트리포스페이트 (ATP)의 cAMP 및 피로포스페이트로의 전환을 촉매하는 아데닐릴 시클라제 효소의 패밀리의 활성화를 통해 상승한다. CXCL13이 그의 G-단백질 커플링된 수용체 CXCR5에 결합하면 아데닐릴 시클라제 활성의 하향 조절을 일으켜, 아데닐릴 시클라제를 억제하는 G-단백질 서브유닛 G_αi의 방출을 통해 세포내 cAMP 수준을 감소시킬 수 있다.

본 발명자들은 세포내 cAMP 수준의 결정을 위해 HTRF® (균질 시간차 형광) cAMP 분석 키트 (시스바이오 인터내셔날 62AM4PEC)를 사용하였다. CXCL13 HTRF® cAMP 분석에서, CXCR5를 안정하게 발현하는 CHO Gqi5 세포에서 cAMP 수준에서 CXCL13 매개된 감소가 측정된다.

CXCL13 반응이 HTRF® cAMP 분석 키트의 검출의 직선 범위 내에 있도록 하기 위해 아데닐릴 시클라제 활성제, NKH477 (토크리스 쿡슨 (Tocris Cookson) 1603) (수용성 포르스콜린 유도체)를 사용하는 세포의 동시-자극을 수행한다.

상기 분석은 CHO Gqi5 hCXCR5 세포에서 세포내 cAMP 수준의 CXCL13 매개된 조정의 억제에 대한 scFv의 효능을 결정하기 위해 사용될 수 있다.

ScFv 샘플, 시약 및 CHO Gqi5 hCXCR5 세포는 달리 언급하지 않으면 분석 배지 (0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴 (시그마 I7018), 1％ 비필수 아미노산 (깁코 11140) 및 0.1％ BSA를 함유하는 최소 필수 배지 (깁코 31095)) 내에 제조하였다. CHO Gqi5 hCXCR5 세포를 조직 배양 플라스크로부터 수확하고, 1.2 X 10⁶ 세포/ml로 분석 배지 내에 재현탁하였다. cAMP-XL665 및 항-cAMP 유로퓸 크립테이트를 제조 사의 지시 (시스바이오 인터내셔날)에 따라 증류수 내에 재구성하였다.

ScFv를 4 nM 인간 (서열 14) 또는 사이노몰거스 (서열 16) CXCL13 (MEL 세포 유래됨)와 함께 30분 동안 실온에서 384 웰 저부피 플레이트 (코스타르 3676) 내에서 예비-인큐베이션하였다. 5 ㎕의 예비-인큐베이션된 샘플을 분석 플레이트 (코스타르 3676)로 옮긴 후, 2.5 ㎕ NKH477 및 2.5 ㎕ CHO Gqi5 hCXCR5 세포 현탁액을 첨가하여 0.5 μM NKH477 및 3000 세포/웰을 함유하는 10 ㎕의 최종 반응 부피를 제공하였다. 각각의 플레이트는 다음 대조물을 사용하여 설정하였다: NKH477 대조물 (0.5 μM NKH477을 함유하는 CHO Gqi5 hCXCR5 세포), CXCL13 대조물 (2 nM CXCL13, 0.5 μM NKH477 및 CHO Gqi5 hCXCR5 세포), 기초 cAMP 대조물 (CHO Gqi5 hCXCR5 세포만) 및 음성 대조물 (분석 배지 단독). 분석에서 사용된 농도가 EC₅₀-EC₈₅ 범위 내에, 따라서 HTRF® cAMP 분석 키트의 검출의 직선 범위 내에 있도록 하기 위해 CXCL13 및 NKH477 적정을 또한 각 실험에서 실행하였다. 세포를 첨가한 후에, 플레이트를 30분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 5 ㎕ cAMP-XL665 용액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이 후에 5 ㎕ 컨쥬게이트 용해 버퍼를 음성 대조 웰에 첨가하거나, 5 ㎕ 항-cAMP 유로퓸 크립테이트 용액을 다른 모든 웰에 첨가하였다.

분석 플레이트를 2시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, Envision 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머)를 사용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서 시간차 형광을 판독하였다.

데이타는 각 샘플에 대한 Delta F％ 값을 계산함으로써 분석하였다. Delta F％는 식 2에 따라 결정하였고, 여기서 CXCL13 대조 Delta F％는 CXCL13 대조 웰의 평균값이고, NKH477 대조 Delta F％는 NKH477 대조 웰의 평균값이다.

식 2:

Delta F％ = {[(샘플 665 nm/620 nm 비 값) - (음성 대조 665 nm/620 nm 비 값)]/(음성 대조 665 nm/620 nm 비 값)} X 100

％ Delta F 값을 후속적으로 식 3에 기재된 바와 같이 ％ 억제를 계산하기 위해 사용하였다.

식 3:

％ 억제 = [(샘플 Delta F％ - CXCL13 대조 Delta F％)/(NKH477 대조 Delta F％ - CXCL13 대조 Delta F％)] X 100

분석에서 IC₅₀ 값에 의해 측정된 바와 같이 클론 효능을 확립하기 위해 scFv 농도의 적정을 사용하였다. IC₅₀ 값은 4-파라미터 로지스틱 (logistic) 식 (식 4)을 사용하는 곡선 피팅에 의해 그래프패드 Prism 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.

식 4:

Y = 기부 + (상부-기부)/(1+10⁽⁽ ^LogEC50 ^{-X)*기울기)})

X는 농도의 로그이다. Y는 ％ 억제이다.

CXCL13 LANCE ® cAMP 분석

CXCL13 LANCE® cAMP 분석의 원리는 CXCL13 HTRF® cAMP 분석에 대해 개략한 바와 유사하지만, 세포내 cAMP 수준은 LANCE® cAMP 분석 키트 (퍼킨 엘머 AD0263)를 사용하여 측정한다. CXCL13 LANCE® cAMP 분석은 NKH477을 사용하는 동시-자극 시에 CHO Gqi5 hCXCR5 세포에서 cAMP 수준의 CXCL13 매개된 감소의 억제에 대한 IgG의 효능을 결정하기 위해 사용될 수 있다.

모든 희석은 달리 언급하지 않으면 분석 배지 (5 mM HEPES (pH 7.4), 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴 (시그마 I7018) 및 0.1％ BSA를 함유하는 행크 균형 염 용액 (시그마 H8264)) 내에서 수행하였다. CHO Gqi5 hCXCR5 세포를 조직 배양 플라스크로부터 수확하고, 1.2X10⁶ 세포/ml로 분석 배지 내에 재현탁하였다. Alexa Fluor®-647 항-cAMP 항체를 세포 현탁액에 1:100의 희석으로 첨가하였다. 1:2250 희석된 유로퓸-W8044 스트렙타비딘 및 1:750배 희석된 비오틴-cAMP를 함유하는 LANCE® 검출 믹스를 제조사의 지시에 따라 적어도 사용 15분 전에 제조하였다. 유로퓸-W8044는 DCA (디클로로트리아지닐) 반응성 아암 (arm)을 갖는 유로퓸 킬레이트이다.

IgG 샘플을 4 nM 인간 (서열 14) 또는 사이노몰거스 (서열 16) CXCL13 (MEL 세포 유래됨) 및 2 μM NKH477 (토크리스 쿡슨 1603)과 함께 1시간 동안 실온에서 384 웰 저부피 플레이트 (코스타르 3676) 내에서 예비-인큐베이션하였다. 5 ㎕의 예비-인큐베이션된 샘플을 백색 Proxiplate Plus 384 웰 분석 플레이트 (퍼킨 엘머 Cat no. 6008280)에 옮겼다. Alexa Fluor®-647 항-cAMP 항체/CHO Gqi5 hCXCR5 세 포 현탁액 (5 ㎕)을 첨가하여 1 μM NKH477, 3000 CHO Gqi5 hCXCR5 세포/웰 및 1:200 희석된 Alexa Fluor®-647 항-cAMP 항체를 함유하는 10 ㎕의 최종 반응 부피를 제공하였다. 각각의 플레이트는 다음 대조물을 사용하여 설정하였다: NKH477 대조물 (CHO Gqi5 hCXCR5 세포/Alexa Fluor®-647 항-cAMP 항체 및 1 μM NKH477) 및 CXCL13 대조물 (2 nM CXCL13, 1 μM NKH477 및 CHO Gqi5 hCXCR5 세포/Alexa Fluor®-647 항-cAMP 항체). 분석에 사용된 농도가 EC₅₀-EC₈₅ 범위 내에, 따라서 LANCE® cAMP 분석 키트의 검출의 직선 범위 내에 있도록 하기 위해 CXCL13 및 NKH477 적정을 또한 각 실험에서 실행하였다. 세포 현탁액을 첨가한 후에, 플레이트를 30분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 모든 분석 웰에 10 ㎕ LANCE® 검출 믹스를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 플레이트를 3시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, Envision 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머)를 사용하여 665 nm 파장에서 방출을 결정하였다.

665 nm 방출 데이타를 사용하여 식 7에 기재된 바와 같이 ％ 억제를 계산하였고, 여기서 CXCL13 대조 665 nm 방출은 CXCL13 대조 웰의 평균값이고, NKH477 대조 665 nm 방출은 NKH477 대조 웰의 평균값이다.

식 7:

％ 억제 = [(샘플 665 nm 방출 - CXCL13 대조 665 nm 방출)/(NKH477 대조 665 nm 방출 - CXCL13 대조 665 nm 방출)] X 100

IC₅₀ 값은 4-파라미터 로지스틱 식 (식 4)을 사용하는 곡선 피팅에 의해 그 래프패드 Prism 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.

CHO Gqi5 hCXCR5 c4 .4 CXCL13 유도된 Ca2 + 방출 분석

CHO Gqi5 hCXCR5 c4.4 세포를 96-웰 흑색 벽의 폴리-D-라이신 처리된 조직 배양 분석 플레이트 (BD) 내에 1x10⁵ 세포/웰로 접종하였다. 이어서, 세포를 100 ㎕ 분석 배지 (둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (인비트로겐), 10％ (v/v) 열 불활성화된 태소 혈청 (FBS) (인비트로겐), 1％ (v/v) MEM-L-글루타민이 없는 비-필수 아미노산 (인비트로겐)) 내에서 가습 분위기 내에서 37℃ 및 5％ CO₂에서 밤새 배양하였다.

비-세척 FLIPR 프로토콜은 시판되는 키트 (Fluo-4 비-세척 칼슘 분석 키트 F36206, 몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes))를 이용하여 다음과 같이 사용하였다. 염료-로딩 용액은 10 ml의 분석 버퍼 (1X 행크 균형 염 용액 중 20 mM HEPES) 및 100 ㎕ 프로베네시드 원액 용액 (분석 버퍼 중 250 mM)을 Fluo-4 NW 염료 믹스의 단일 바이알에 첨가하여 제조하였다. 배지를 세포로부터 흡인시키고, 70 ㎕/웰의 염료-로딩 용액을 첨가하고 37℃에서 30분 동안, 이어서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 기간 동안, 정제된 IgG의 적정액을 FLIPR 버퍼 (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1.5 mM CaCl₂, 30 mM Hepes, 2.5 mM 프로베네시드, 5 mM 글루코스 및 1％ (v/v) 열-불활성화된 FBS) 내에 제조하고, CXCL13 (100 nM 최종 농도)와 함께 또한 FLIPR 버퍼 내에서 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.

인큐베이션 후에, CXCL13/IgG 적정에 대한 표지된 세포의 반응을 형광 영상화 플레이트 판독기 (FLIPR) 시스템에서 측정하였다. 세포내 칼슘-감수성 염료의 형광을 x 120초의 판독 기간에 걸쳐 470 내지 495 nm 여기 필터 및 515 내지 575 nm 방출 필터를 사용하여 분석하였다.

데이타는 각각의 웰에 대한 최대 피크 높이를 Excel (마이크로소프트 (Microsoft))에 전송하여 분석하였다. 억제제 데이타를 억제제의 부재 하에 CXCL13에 대한 반응을 이용하고 분석 버퍼 단독에 대한 반응을 공제함으로써 CXCL13-유도된 세포내 Ca² ⁺의 백분율에 표준화하였다. 추가의 분석을 Prism (그래프패드)에서 수행하였고, 여기서 데이타를 IgG의 로그 농도에 대한 대조 반응의 백분율로서 플로팅하였다. IC₅₀ 값은 Prism 곡선 피팅 소프트웨어 (그래프패드)를 사용하여 계산하였다.

CXCL13 형광-연결 면역흡착 분석 ( FLISA )

CXCL13 FLISA는 형광 미세부피 분석 기술 ([Dietz et al 1996], [Swartzman et al 1999])을 사용하여 IgG 포맷에서 스트렙타비딘 비드에 커플링된 비오티닐화된 인간 CXCL13 (알맥)과 CXCL13 결합 요소 사이의 상호작용을 측정한다. 상기 분석은 경쟁 분석 포맷에서 관련된 케모킨 패밀리 요소에 비한 비오티닐화된-인간 CXCL13에 대한 IgG의 특이성을 결정하기 위해 사용될 수 있다.

샘플 및 시약을 분석 버퍼 (0.1％ BSA, 0.1％ Tween-20 및 0.01％ 나트륨 아지드를 함유하는 포스페이트 완충 염수) 내에 희석하였다. 0.25 nM 비오티닐화된 CXCL13 (알맥)을 0.004％ w/v 6-8 ㎛ 스트렙타비딘 코팅된 폴리스티렌 입자 (스페로텍 (Spherotec) SVP-60-5)와 함께 1시간 동안 실온에서 예비-인큐베이션하였다. 이어서, 비드를 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 폐기하고, 펠렛을 원래 부피의 분석 버퍼에 재현탁시켜 0.004％ w/v 비드/비오티닐화된 인간CXCL13 믹스를 제공하였다. 10 ㎕ 경쟁물질, 분석 버퍼 (총 결합 대조군) 또는 과잉의 인간 CXCL13 (비특이적 결합 (NSB) 대조군)을 투명한 바닥의 384 웰 비-결합 표면 분석 플레이트 (코스타르 3655)에 첨가하였다. 이어서, 10 ㎕ 5 nM 염소 항-인간 (H+L) Alexa Fluor®-647 (인비트로겐 A21445), 10 ㎕의 0.31 nM 항체 1 (생식세포에서 유래된 IgG) 및 20 ㎕ 비드/비오티닐화된 CXCL13 믹스를 첨가하고, 플레이트를 4시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. FL1 신호를 어플라이드 바이오시스템즈 세포 검출 시스템 8200 상에서 판독하였다. 데이타를 크기 3-12, 색상비 <0.4, 최소 계수 20의 게이팅을 사용하는 왕 골드먼 알고리즘을 이용하여 분석하였다.

％ 특이적 결합은 식 8을 사용하여 FL1 데이타로부터 결정하였고, 여기서 NSB FL1은 비특이적 결합 대조 웰의 평균값이고, 총 결합 FL1은 총 결합 대조 웰의 평균값이다.

식 8:

％ 특이적 결합 = [(샘플 FL1 - NSB FL1)/(총 결합 FL1 - NSB FL1)] X 100

IC₅₀ 값은 4-파라미터 로지스틱 식 (식 4)을 사용하는 그래프패드 Prism 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.

인간 및 사이노몰거스 CXCL13 과 항체 1 (생식세포에서 유래된 IgG ) 상호작용의 바 이아코어 측정

시약:

CXCL13

인간 CXCL13 (MEL 세포 발현됨)

0.1 mg/mL, 예상 평균 질량 9,694.53 Da, 10.31 μM.

6 nM로의 희석은 6,869 ㎕의 HBS-EP 중에 4 ㎕이었음.

사이노몰거스 CXCL13 (MEL 세포 발현됨)

0.3 mg/mL로 희석된 0.6 mg/mL, 예상 평균 질량 9,670 Da, 31.02 μM. 6 nM로의 희석은 20,678 ㎕의 HBS-EP 중 4 ㎕이었음.

면역글로불린

항체 1 (생식세포에서 유래됨)

4.42 mg/mL (실시예 3a에 대해); 1.06 mg/mL (실시예 3b에 대해)

실시예 3a에 대한 방법

칩 제조에 대해서는 실시예 3a 참조.

각각의 실험 사이클 (오리엔테이션 (orientation) 1)에 대해, 항체 1 (생식세포에서 유래된 IgG₁)의 0.5 ㎕/mL HBS-EP 용액을 5 ㎕/min에서 2분 동안 적정함으로써 Fc 2 단백질 G' 표면을 사용하여 240-385 RUs 항체 1 (생식세포에서 유래된 IgG₁)을 포획하였다.

이어서, HBS-EP 버퍼 중의 인간 또는 사이노몰거스 CXCL13의 명시된 희석액 (인간 CXCL13에 대해 0.25, 0.3125, 0.50, 0.625, 1.0, 1.25, 2.5, 5.0, 10.0 및 20.0 nM, 또는 사이노몰거스 CXCL13에 대해 0.125, 0.25, 0.50, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 20.0 및 40.0 nM)을 칩 표면 위로 100 ㎕/min의 유속으로 유동시켰다 (2.5분의 결합 시간, 10분 동안 분리, 및 10 mM 글라이신 (pH 1.75)의 20 ㎕ 펄스에 이어, 10 mM 글라이신 (pH 1.50)의 20 ㎕ 펄스를 사용하는 재생). 블랭크 (blank) 주입액은 HBS-EP 만을 사용하여 제조하였다. 모든 용액은 폴리프로필렌 내에 제조하고 저장하였다.

실시예 3b에 대한 방법

항체를 10 mM 아세테이트 버퍼 (pH 4.5) 중에 1.0 ㎍/mL로 희석하였다. 표준 아민 연결기 화학 (아민 커플링 키트 BR-1000-50을 사용하는)을 이용하여 CM3 칩 (바이아코어, BR-1005-41, 로트: 1160100, 만기 '07년 4월) 상에 블랭크 (Fc 1) 및 IgG의 500 RU 표면을 생성하였다. 사용된 세척 용액은 글라이신 (pH 2.0)이었다.

칩 표면 위로 인간 및 사이노몰거스 CXCL13의 유동.

각각의 CXCL13의 일련의 희석액 (0.10, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50 및 0.60 nM)를 HBS-EP 버퍼 내에 구성하고, 모든 유동 셀 위로 30 ㎕/min로 유동시켰다 (4분의 결합 시간, 10분 동안 분리, 및 10 mM 글라이신 (pH 2.0)의 2회의 20 ㎕ 펄스를 사용하는 재생). 블랭크 주입액은 동일한 버퍼로 제조하였다. 모든 용액은 폴리프로필렌 내에 제조하고 저장하였다.

IgG ₁ 에 대한 scFv 의 재포맷팅 ( reformatting )

클론을 V_H 및 V_L 도메인을 각각 전체 항체 중쇄 및 경쇄를 발현하는 벡터 내로 서브클로닝함으로써 scFv로부터 IgG 포맷으로 전환시켰다. V_H 도메인을 인간 중쇄 불변 도메인 및 포유동물 세포 내에서 전체 IgG₁ 중쇄를 발현시키기 위해 조절 요소를 함유하는 벡터 (pEU15.1) 내로 클로닝하였다. 이와 유사하게, V_L 도메인을 인간 경쇄 불변 도메인 및 포유동물 세포에서 전체 IgG 경쇄를 발현하기 위해 조절 요소의 발현을 위한 벡터 (카파 경쇄에 대해 pEU3.4, 람다에 대해 pEU4.4) 내로 클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄의 발현을 위한 벡터는 원래 문헌 [Persic et al, 1997]에 설명되었다. 벡터를 벡터의 에피솜 복제를 허용하도록 공학적으로 처리하였다.

IgG를 얻기 위해, 중쇄 및 경쇄 IgG 발현 벡터를 EBNA-HEK293 포유동물 세포 내로 형질감염시켰다. IgG가 발현되고 무혈청 배지 내로 분비되었다. 수확물을 모으고 여과한 후 정제하였다. IgG를 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 배양 현탁액을 세라믹 단백질 A (바이오세프라 (BioSepra))의 적절한 크기의 컬럼 상에 로딩하고 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 250 mM NaCl로 세척하였다. 결합된 IgG를 0.1 M 시트르산나트륨 (pH 3.0)을 사용하여 컬럼으로부터 용출하고, Tris-HCl (pH 9.0)을 첨가하여 중화시켰다. 용출된 물질을 Nap10 컬럼 (아머샴 (Amersham), #17-0854-02)을 사용하여 PBS로 버퍼 교환하고, IgG의 농도를 IgG의 아미노산 서열에 기반한 소광 계수를 이용하여 분광학적으로 결정하였다 (Mach 1992). 정제된 IgG를 SEC-HPLC를 사용하여 및 SDS-PAGE에 의해 응집 또는 분해에 대해 분석하였다.

HTRF® 에피토프 경쟁 분석

HTRF® 에피토프 경쟁 분석을 이용하여 비오티닐화된 CXCL13에 결합하기 위한 결합 요소들 사이의 경쟁을 결정할 수 있다. 본 분석에서 시험된 항체 분자는 예를 들어 scFv 또는 IgG 포맷으로 존재할 수 있다.

HTRF® 기술의 원리는 본원에 기재된 바와 같다.

서열 11의 아미노산 서열을 갖는 항체 scFv 분자를 사용하여 CXCL13에 대한 결합을 위해 경쟁하는 결합 요소의 능력을 결정하기 위한 HTRF® 에피토프 경쟁 분석에서, 크립테이트 표지된 ScFv (서열 11), 비오티닐화된 인간 CXCL13 및 스트렙타비딘 XLent (XL665와 가교결합된 스트렙타비딘, 최적화된 조건 하에 커플링됨) 사이에서 FRET 복합체가 형성된다. 크립테이트 표지된 ScFv와 동일한 (또는 가능하게는 겹치는) 에피토프를 인지하는 ScFv 또는 IgG는 비오티닐화된 CXCL13에 대한 결합에 대해 경쟁하여 분석 신호를 감소시킬 것이다.

샘플 및 시약의 모든 희석은 분석 버퍼 (포스페이트 완충 염수, 0.1％ BSA, 0.4 M 불화칼륨) 내에서 수행하였다. 비오티닐화된 인간 CXCL13 (알맥) 및 스트렙타비딘-XLent (시스바이오 인터내셔날 611SAXLB)을 실온에서 30분 동안 예비-인큐베이션하였다. 10 ㎕의 샘플 (scFv 또는 IgG), 분석 버퍼 (총 결합 대조군) 또는 50X 최종 분석 농도 비표지된 IgG (비-특이적 결합 (NSB)을 규정하기 위해)를 384 저부피 플레이트 (코스타르 3676)에 첨가한 후, 5 ㎕의 예비-인큐베이션된 비오티 닐화된 CXCL13/스트렙타비딘 XLent 믹스를 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 5 ㎕의 크립테이트 표지된 ScFv를 첨가하였다. 플레이트를 3시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, Envision 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머)를 사용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서 시간차 형광을 결정하였다.

적절한 분석 신호를 제공하는 각 시약의 농도를 확립하기 위해 최적 농도의 CXCL13, 스트렙타비딘-XLent 및 크립테이트 표지된 IgG를 적정할 수 있다.

데이타는 각 샘플에 대한 Delta F％ 값을 계산함으로써 분석한다 (식 5 참조).

식 5:

Delta F％ = {[(샘플 665 nm/620 nm 비) - (NSB 665 nm/620 nm 비)]/(NSB 665 nm/620 nm 비)} X 100

Delta F％ 값은 후속적으로 식 6에 기재된 바와 같이 ％ 특이적 결합을 계산하기 위해 사용하고, 여기서 NSB Delta F％는 비특이적 결합 대조 웰의 평균값이고, 총 결합 Delta F％은 총 결합 대조 웰의 평균값이다.

식 6:

％ 특이적 결합 = [(샘플 Delta F％ - NSB Delta F％)/(총 결합 Delta F％ - NSB Delta F％)] X 100

IC₅₀ 값은 4-파라미터 로지스틱 식 (식 4)을 사용하는 곡선 피팅에 의해 그래프패드 Prism 소프트웨어를 사용하여 결정한다.

식 4:

Y = 기부 + (상부-기부)/(1+10⁽⁽ ^LogEC50 ^{-X)*기울기)})

X는 농도의 로그이다. Y는 ％ 억제이다.

B300.19 hCXCR5 세포 CXCL13 유도 화학주성 분석

B300.19 hCXCR5 세포를 적어도 2일 동안 5x10⁵ 세포/ml로 조정한 후, 배양 배지 (10％ 태소 혈청 (FCS); 1％ 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민 (PSG); 1％ 피루브산나트륨; 1.5 ㎍/ml 푸라마이신 및 0.1％ 2-β-머캅토에탄올을 함유하는 RPMI-1640 시그마, Cat# R0883)를 사용하는 분석을 가습 분위기 내에서 37℃, 5％ CO₂에서 실행하였다. 분석일에, B300.19 hCXCR5 세포를 계수하고, 6x10⁵ 세포/ml로 조정한 후, 원심분리하고, 버퍼 (RPMI-1640 (시그마 Cat# R0883) + 0.35％ BSA (시그마 Cat# A2153)) 내에 1회 세척하였다.

IgG의 적정액을 분석 버퍼 내에 제조하였다. IgG를 ED80 농도의 CXCL13과 함께 30 min 동안 가습 분위기 내에서 37℃, 5％ CO₂에서 예비-인큐베이션하였다.

상기 인큐베이션 기간 후에, 31 ㎕/웰의 예비-인큐베이션된 CXCL13 및 IgG를 거품을 피하기 위해 역 피펫팅을 이용하여 화학주성 플레이트 (리셉터 테크놀로지스 (Receptor Technologies), Cat# 106-5)의 하부 챔버에 옮겼다. 이어서, 막 필터를 각 모서리를 고정하는 웰 상에 적용하였다. 이어서, 50 ㎕의 B300.19 hCXCR5 세포 (6x10⁶ 세포/ml)를 화학주성 필터의 상부 챔버 상의 원형 영역 내로 분배하였 다. 덮개를 화학주성 플레이트 위에 놓고, 가습 분위기 (37℃, 5％ CO₂) 내에서 2hr 동안 인큐베이션하였다.

2hr 인큐베이션 후에, 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고 세척하여 과잉의 세포를 필터 표면으로부터 제거하였다. 이는 PBS를 막 표면 위에 붓고, 세포 스크래퍼 (scraper) (코닝 (Corning), Cat# 3011)를 사용하여 모든 과잉의 세포/PBS를 제거함으로써 이루어졌다. 이어서, 화학주성 플레이트를 1500 rpm에서 10 min 동안 원심분리하여, 필터를 그 위에 위치시켰다.

원심분리 후에, 필터 막을 제거하고, 화학주성 플레이트의 하부 챔버의 내용물을 80 ㎕/웰의 분석 버퍼 및 15 ㎕/웰의 용해 버퍼 (H₂O + 9％ Triton-X)를 함유하는 96-웰 폴리스티렌 평저 플레이트 (코닝, Cat# 3598) (효소적 플레이트)에 옮겼다. 플레이트를 1 hr 동안 가습 분위기 (37℃, 5％ CO₂) 내에서 인큐베이션하였다.

이어서, 각각의 플레이트를 세포 용해 시에 방출된 락테이트 데히드로게나제 (LDH) (안정한 세포질 효소)를 측정하는 비-방사성 세포독성 분석으로 분석하였다. 분석은 세포수의 정량적 척도를 제공한다. CytoTox 96 비-방사성 세포독성 분석 (프로메가 (Promega) Cat# G1780)은 다음 시약으로 이루어진다: 5개 바이알 기질 믹스; 60 ml 분석 버퍼; 25 ㎕ LDH 양성 대조물 (사용되지 않음); 3 ml 용해 용액 (10X) (사용되지 않음); 65 ml 중지 용액 (1M 아세트산); 1 프로토콜. LDH 측정을 위해, 분석 버퍼를 해동하고; 12 ml을 제거하고, 사용되지 않은 부분은 즉시 -20℃ 에서 저장하였다. 37℃ 수조를 사용하여 분석 버퍼를 해동할 수 있다. 12 ml의 분석 버퍼를 실온으로 가온시켰다 (차광 보관함). 12 ml의 실온 분석 버퍼를 1병의 기질 믹스에 첨가하였다. 이를 뒤집고 부드럽게 진탕하여 기질 믹스를 용해시켰다.

1병은 2개의 96-웰 플레이트에 대한 충분한 기질을 제공할 것이다. 일단 재현탁되면, 기질은 강한 직사광으로부터 차단되고 즉시 사용되어야 한다. 50 ㎕의 재구성된 기질 믹스를 화학주성 분석 플레이트로부터 옮긴 용해된 샘플을 함유하는 효소적 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 차광하기 위해 호일 또는 불투명 박스로 덮고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 50 ㎕의 중지 용액을 각 웰에 첨가하였다. 임의의 큰 거품을 시린지 바늘을 사용하여 터뜨리고, 중지 용액 첨가 1시간 이내에 490 또는 492 nm에서 흡광도를 기록하였다.

데이타를 그래프패드 Prism 4에 로딩하였고, 상기 소프트웨어는 생성된 용량 반응 곡선에 기초하여 IC₅₀ 값을 생성하였다.

인간 편도 B 세포 CXCL13 유도 화학주성 분석

인간 편도를 지역 윤리 위원회의 승인 하에 환자로부터 편도절제 수술 후에 얻었다. 샘플을 10％ 태소 혈청, 1％ 페니실린 (10,000 단위/ml) + 스트렙토마이신 (10 mg/ml) + 글루타민 (200 mM) 용액 (시그마: G1146)을 함유하는 RPMI-1640 (시그마: R0883) 배지 내에 넣어 100 단위/ml 페니실린 + 0.1 mg/ml 스트렙토마이신 + 2 mM 글루타민 용액, 100 ㎍/ml 겐타마이신 (시그마: G1522), 0.1％ 베타 머 캅토에탄올 (깁코: 31350-010), 1％ 피루브산나트륨 (시그마: S8636), 1％ 비-필수 아미노산 (깁코: 11140-035)의 최종 농도를 제공하였다.

세포 분리체 (sieve) (60 메시 크기) (시그마: CD1)를 사용하여 편도 조직으로부터 1차 편도 B 세포를 단리하였다. 이어서, 세포 현탁액을 300 g (1500 rpm)에서 5분 동안 원심분리에 의해 세척하였다. 상등액을 폐기하고, 세포 펠렛을 총 20 ml의 냉 조직 배양 배지 내에 재현탁하였다. 세포 현탁액을 20 ml의 피콜 하이펙 (Ficoll hypaque) (Lymphoprep) (액시스 쉴즈 (Axis Shields): 1114544) 위로 적층시키고, 2000 rpm에서 15 min 동안 원심분리하여 죽은 세포, 세포 파편 및 적혈구를 제거하였다. Lymphoprep 및 조직 배양 배지의 계면에서 세포를 플라스틱 파스츄어 (pasteur) 피펫을 사용하여 제거하고 15 ml 원심분리관에 옮겼다. 세포 현탁액을 냉 조직 배양 배지로 15 ml 부피로 구성하고, 1500 rpm에서 5 min 동안 원심분리하였다. 상등액을 폐기하고, 세포 펠렛을 10 ml의 냉 조직 배양 배지 내에 재현탁하였다. 생활가능한 세포 계수는 콜터 계수기 (Coulter Counter)를 사용하여 수행한다. 세포를 5x10⁶ 세포/ml의 농도로 조정하고, 1 ㎍/ml LPS와 함께 약 20 hrs 동안 밤새 배양하였다. 인큐베이션 후에, 원심분리하고 버퍼 (RPMI-1640 (시그마 Cat# R0883) + 0.35％ BSA (시그마 Cat# A2153)) 내에서 1회 세척한 후 편도 세포를 1x10⁷ 세포/ml로 조정하였다. 이어서, 화학주성 분석을 B300.19 hCXCR5 세포에 대해 앞서 설명된 바와 같이 수행하였다.

ELISA 에서 항체 1 (생식세포에서 유래된 IgG ₁ )에 대한 천연 hCXCL13 의 결합

전혈을 지역 윤리 위원회의 승인 하에 헤파린처리 용기 내로 수집하였다. 혈액을 50 ml Falcon 튜브 내로 스트리펫 (stripette)을 사용하여 동일 부피의 Lymphoprep 위로 서서히 적층시켰다. 튜브를 2000 rpm에서 25 min 동안 실온에서 브레이크를 켜지 않고 원심분리하였다.

림프구 층을 파스츄어 피펫을 사용하여 제거하고, 새로운 Fisher 50 ml 튜브 내로 옮겼다. 이어서, 세포를 예비-가온한 RPMI-1640 (시그마: R0883) 배지로 세척하였다. 이어서, 브레이크를 작동시키고 1500 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 세척하였다. 상등액을 폐기한 후, 세포를 RPMI를 사용하여 브레이크를 작동시키고 1500 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 2회 더 세척하였다. 최종 세척을 위해, 펠랫을 50 ml의 RPMI 내에 재현탁하고, 200 ㎕ 샘플을 콜터 계수기를 사용한 계수를 위해 제거하였다.

최종 세척 후에, 세포를 적절한 양의 배양 배지 (100 단위/ml 페니실린 + 0.1 mg/ml 스트렙토마이신 + 2 mM 글루타민의 최종 농도를 제공하도록 10％ 태소 혈청, 1％ 페니실린 (10,000 단위/ml) + 스트렙토마이신 (10 mg/ml) + 글루타민 (200 mM) 용액 (시그마: G1146)을 함유하는 RPMI-1640 (시그마: R0883) 배지) 내에 재현탁하여 3.3x10⁵ 세포/ml의 세포 농도를 얻었다.

이어서, 세포를 6-웰 폴리스티렌 조직 배양 플레이트 내로 3 ml/웰로 분배하였다. 이는 약 1x10⁷ 세포/웰의 최종 세포수를 제공한다. 가능한 많은 플레이트를 6일 자극을 위해 설정하였다.

이어서, 플레이트를 37℃, 5％ CO₂에서 3-4시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 동안, 단핵구는 웰의 바닥에 고착되어, 다른 세포 집단이 현탁액 내에 남도록 해야 한다. 인큐베이션 후에, 3 ml의 비-부착성 세포를 함유하는 배양 배지를 각각의 웰에서 부드럽게 빼내고 폐기하여, 각각의 웰의 기부 상에 부착성 단핵구만을 남겼다. 각각의 플레이트의 각 웰에, 3 ml의 신선한 배양 배지를 첨가하였다. 다음 자극물질을 첨가하였다: 50 ng/ml의 최종 농도를 얻도록 인간 M-CSF (알&디 시스템즈: 216-MC-025) + 25 ng/ml의 최종 농도를 얻도록 인간 IL-4 (알&디 시스템즈: 204-MC-025). 1개의 웰을 대조군으로서 자극하지 않고 배지만을 함유하도록 남겨두었다.

6일 자극 후에, 37℃, 5％ CO₂에서, LPS를 모든 자극된 웰에 1 ㎍/ml의 최종 농도로 밤새 첨가하였다. LPS를 사용하여 밤새 자극한 후, 상등액을 스트리펫을 사용하여 각각의 웰에서 취하였다. 모든 상등액을 모은 후, 15 ml 튜브 (10 ml/튜브)로 분배하였다. 약 500 ㎕을 ELISA에 의해 정량을 위해 에펜도르프 튜브 내로 모았다. ELISA에 의한 CXCL13 정량은 제조사의 지시에 따라 수행하였다 (알&디 시스템즈: Quantikine 인간 CXCL13/BLC/BCA-1 면역분석. Cat. No. DCX130)

이어서, 천연 CXCL13을 함유하는 상등액을 양이온 교환 수지 상에서 정제하고, PBS 내로 투석하고, ELISA에 의해 재정량하였다.

항체 1 (생식세포에서 유래된 IgG₁)에 대한 천연 CXCL13의 결합을 보여주기 위해, 맥시-소프 (maxi-sorp) 고결합 96-웰 플레이트를 CAZ-1040 (5 ㎍/ml 200 ㎕/ 웰)로 코팅하였다. 또한, ELISA 키트 내에, 명시되지 않은 항-CXCL13 항체로 코팅된 플레이트가 제공된다. 이어서, 정제된 천연 CXCL13을 항체 1-코팅된 플레이트 및 키트에 제공된 플레이트 모두에 첨가하였다. 이어서, ELISA를 제조사의 지시에 따라 수행하였다 (알&디 시스템즈: Quantikine 인간 CXCL13/BLC/BCA-1 면역분석. Cat. No.: DCX130).

항체 1은 동등한 농도의 리간드가 분석에서 동등한 신호를 제공하면서 천연 CXCL13 및 재조합 CXCL13 (키트 내에 제공된 표준물) 모두에 결합한다.

결합 요소에 의한 CXCL13의 H/D 교환 속도의 교란

CXCL13은 50 mM TrisㆍHCl (pH 7.4), 150 mM NaCl 내에 0.5 mg/ml로 사용하였다. 항체는 PBS (1.54 mM KH₂PO₄, 2.71 mM Na₂HPO₄, 155 mM NaCl (pH 7.2)) 내에 10.6 mg/ml로 사용하였다. 항체를 POROS AL 수지 (어플라이드 바이오시스템즈)에 제조사의 지시에 따라 커플링시켜 100 ㎕ 컬럼을 제조하고, 1℃에서 유지하였다.

컬럼을 75％ D₂0 내에 제조된 50 mM TrisㆍHCl (pH 7.5), 150 mM NaCl 내에서 세척하였다. CXCL13을 75％ D₂O를 사용하여 제조한 버퍼 내에 0.125 mg/ml로 희석하고, 150, 500, 1500 및 5000s 동안 인큐베이션한 후, 항체 컬럼 상에 주입하였다. 컬럼을 H₂O 중의 0.2 ml 버퍼로 신속하게 세척한 후, 동일한 시간 동안 인큐베이션하였고, 즉, 150s 동안 D₂O로 교환된 샘플을 150s 동안 H₂O로 및 500, 1500 및 5000s에서의 샘플에 대해 유사하게 역 교환하였다. 상이한 시점에서 먼저 80 ㎕, 이어서 40 ㎕의 0.8％ 포름산을 주입함으로써 용출하였다. 2차로 용출시킨 40 ㎕을 수집하고, 20 ㎕의 2 M 우레아, 1 M TCEP (pH 3)을 1℃에서 첨가하였다. 전체 혼합물을 단백질을 펩티드로 소화시키도록 펩신을 함유하는 100 ㎕ 컬럼 상에 주입하고, 상기 펩티드를 12-28.5％의 아세토니트릴 구배를 사용하는 rpHPLC에 의해 분리시키고, 질량을 써모 피니간 (Thermo Finnigan) LCQ 전기분무 질량 분광계 및 마이크로매스 (Micromass) Q-TOF 질량 분광계 모두에서 결정하였다. SEQUEST 소프트웨어 프로그램 (써모 피니간 (Thermo Finnigan, 미국 캘리포니아주 산 호세))을 사용하여 모 펩티드 이온의 서열을 확인하였다.

CXCL13의 상이한 부분의 교환 속도에 대한 항체의 효과를 다음을 제외하고는 본질적으로 상기 설명한 바와 같이 결정하였다: CXCL13을 먼저 H₂O 함유 버퍼 내에 0.125 mg/ml로 희석한 후, H₂O 내에 제조된 50 mM TrisㆍHCl (pH 7.5), 150 mM NaCl로 예비-세척한 컬럼 상에 주입하였다. 결합 후, 컬럼을 H₂O 내에 제조된 50 mM TrisㆍHCl (pH 7.5), 150 mM NaCl로 세척한 후, 75％ D₂O 내에 제조된 50 mM TrisㆍHCl (pH 7.5), 150 mM NaCl 내에서 150, 500, 1500 및 5000s 동안 인큐베이션한 후, H₂O로 역 교환하고 상기한 바와 같이 처리하였다.

실시예 1: 항체의 초기 단리

인간 비장 cDNA를 인간 CXCL13의 개방 해독 프레임의 PCR을 위한 템플레이트로서 사용하였다. 이를 MEL 세포의 안정한 형질감염을 위해 포유동물 발현 벡터 (pEV3) 내로 클로닝하였다. 가장 고도로 CXCL13을 발현하는 클로날 (clonal) MEL 세포주는 시판되는 항-CXCL13 항체를 사용하여 세포 배양 상등액의 웨스턴 블롯 (western blot)에 의해 확인하였다. 재조합 CXCL13을, pH를 6으로 조정한 후 이를 양이온 교환 컬럼 상에 로딩함으로써 단백질을 발현하는 MEL 세포의 배양 배지로부터 정제하였다. CXCL13을 1 M NaCl을 함유하는 pH 6의 MES 버퍼에 용출시켰다. 샘플을 Resource rpc 컬럼에 직접 로딩하고, 0.1％ TFA 중의 90％ 이하의 아세토니트릴의 구배로 용출시켰다. CXCL13을 함유하는 분획을 모으고, 농축한 후, Superdex75 컬럼 상에서의 크로마토그래피에 의해 정제하여 순도가 >95％인 물질을 생성시켰다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE 및 LCMS에 의해 분석하였고, 질량이 9690 Da로 밝혀졌다.

1.1 scFv 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 선택

섬유상 파지 M13을 기재로 하는 파지미드 벡터 내로 클로닝된 큰 단일쇄 Fv (scFv) 인간 항체 라이브러리를 선택을 위해 사용하였다 ([Vaughan 1996], [Hutchings 2001]). 항-CXCL13 특이적 scFv 항체를 본질적으로 이전에 문헌 (Vaughan 1996)에 기재된 바와 같이 화학적으로 합성된 비오티닐화된 인간 CXCL13 (알맥)에 대한 일련의 선택 사이클을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리하였다. 간단히 설명하면, PBS-Marvel (3％ w/v) 중의 정제된 파지를 1 h 동안 용액 중의 비오티닐화된 인간 CXCL13에 결합시켰다. 이어서, 항원에 결합된 scFv-파지를 제조사의 권고에 따라 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드 (Dynabeads® M-280) 상에 포획하였다. 결합되지 않은 파지 입자는 PBS-Tween (0.1％ v/v) 및 PBS를 사용하여 일련의 세척 사이클에 의해 제거하였다. 결합된 파지 입자를 용출시키고, 세균 내로 감염시키고, 후속 선택 라운드를 위해 구조하였다 (Vaughan 1996).

제2 선택 라운드로부터의 대표적인 수의 개별 클론을 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. scFv를 세균 주변세포질에서 발현시키고, 형광 미세부피 분석 기술 (FMAT)을 사용하여 B300.19 hCXCR5 세포 상에 발현된 그의 수용체 CXCR5에 대한 비오티닐화된 인간 CXCL13 (알맥)의 결합을 억제하는 그의 능력에 대해 스크리닝하였다. 분석에서 CXCL13: CXCR5 상호작용에 대해 조질 페리프렙 (periprep) 샘플로서 유의한 억제 효과를 보인 scFv의 DNA 서열을 결정하였다 ([Vaughan 1996], [Osbourn 1996]).

특유한 scFv가 다시 세균에서 발현되었고, 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다 ([Bannister 2006]에 기재된 바와 같이). IC₅₀ 값은 HTRFV cAMP (3', 5' 시클릭 아데노신 모노포스페이트) 분석에서 정제된 scFv의 일련의 희석액을 인간 및 사이노몰거스 (cyno) 비-인간 영장류 CXCL13 (둘 모두 MEL 세포 유래됨)에 대해 시험함으로써 결정하였다.

1.2 기능적 활성의 결정. CXCL13 자극된 시클릭 AMP 형성의 억제

CXCL13 HTRF® cAMP 분석에서, CHO Gqi5 hCXCR5 세포를 아데닐릴 시클라제 활성제 NKH477 (0.5 μM)로 동시-자극할 때 cAMP 수준의 CXCL13 매개 감소의 초기 scFv에 의한 억제를 측정하였다. IC₅₀ 값은 2 nM 인간 CXCL13 (MEL 세포 유래됨) 또는 2 nM 사이노몰거스 CXCL13 (MEL 세포 유래됨)의 최종 반응 농도에 대해 결정하였다 (표 1 참조). 분석 방법의 상세한 내용에 대해서는, 섹션 "분석 물질 및 방법"을 참조한다.

HTRF® CXCL13 cAMP 분석에서 인간 CXCL13 (평균 IC₅₀ ± 표준 편차, n 수치) 또는 사이노몰거스 CXCL13 (n=1 데이타 단독)에 대한 항체 1 scFv (비-생식세포에서 유래됨) 효능의 예
클론명	인간 CXCL13 IC₅₀ nM ± SD (n 수치)	Cyno CXCL13 IC₅₀ nM (n=1)
항체 1 (비-생식세포에서 유래됨)	5 ± 1 (n=3)	3

1.3 LANCE ® CXCL13 cAMP 에서 IgG 의 효능

IgG₁에 대해 재포맷팅된 클론 (물질 및 방법 참조)의 활성을 LANCE® cAMP 분석으로 결정하였다. 상기 분석의 원리는 HTRF® cAMP 분석과 유사하지만, 세포내 cAMP 수준의 결정을 위해 LANCE® cAMP 분석 키트 (퍼킨 엘머)를 사용한다. 분석 방법의 상세한 내용에 대해서는, 섹션 "분석 물질 및 방법"을 참조한다. CXCL13 LANCE® cAMP 분석에서, CHO Gqi5 hCXCR5 세포를 아데닐릴 시클라제 활성제 NKH477 (1 μM)로 동시-자극할 때 cAMP 수준의 MEL 세포 유래된 CXCL13 (2 nM 인간 CXCL13 또는 2 nM cyno CXCL13) 매개 감소의 IgG 억제에 대한 IC₅₀ 값을 결정하였다 (예를 들어, 데이타는 표 2 참조).

LANCE® CXCL13 cAMP 분석에서 MEL 세포 유래된 인간 CXCL13 (평균 IC₅₀ ± 표준 편차, n 수치) 또는 사이노몰거스 CXCL13 (n=6 데이타)에 대한 항체 1 IgG (비-생식세포에서 유래됨) 효능의 예
클론명	인간 CXCL13 IC₅₀ nM ± SD (n 수치)	Cyno CXCL13 IC₅₀ nM ± SD (n 수치)
항체 1 (비-생식세포에서 유래된 IgG)	1.4 ± 0.5 (n=10)	0.3 ± 0.1 (n=6)

1.4 재조합 CXCR5 를 발현하는 B300.19 세포에서 CXCL13 유도 화학주성의 억제

인간 재조합 CXCR5로 형질감염시킨 쥐 프리-B 세포주인 B300.19 hCXCR5 세포를 사용하여 IgG를 화학주성 분석으로 시험하였다. IgG를 약 ED80 반응을 유도하는 비글리코실화된 인간 CXCL13의 농도 (12.32 nM)에 대해 적정하였다. 아래 표는 항체 1 IgG (비-생식세포에서 유래됨)에 대한 IC₅₀ 값 (nM) ± SEM을 보여준다. 각각의 IgG는 적어도 3회 시험하였다.

B300.19 hCXCR5 화학주성 분석에서 항체 1 IgG (비-생식세포에서 유래됨)에 대한 IC₅₀ 값 (nM) ± SEM의 예
IgG	IC₅₀ (nM±SEM)
	비글리코실화된 CXCL13
항체 1 (비-생식세포에서 유래됨)	5.26 ± 0.62

1.5 CXCL13 유도 칼슘 방출의 억제

CXCL13 유도 칼슘 방출에 대한 IgG 활성은 G-단백질 Gqi5 및 인간 CXCR5로 형질감염된 CHO 세포주를 사용하여 평가하였다. 상기 세포를 인간 CXCL13으로 자극하면, 세포내 저장기로부터의 방출 및 세포외 배지로부터의 유입을 유도함으로써 농도 의존적 방식으로 세포질 Ca² ⁺을 증가시킨다. 이것은 형광 영상화 플레이트 판독기 (FLIPR)로 칼슘 감수성 염료를 사용하여 측정할 수 있다. 이 분석에서, IC₅₀ 값으로 결정되는 항-CXCL13 IgG의 억제 활성을 100 nM 인간 CXCL13 (MEL 세포 유래됨)에 대해 결정하였다. 항체 1 (비-생식세포에서 유래됨)에 대해 얻어진 IgG 효능을 표 4에 제시한다. 양성 분석 대조군이 모든 분석에 포함되었다. 분석 방법의 상세한 내용에 대해서는, "분석 물질 및 방법"을 참조한다.

CXCL13 매개 CHO Gqi5 hCXCR5 Ca² ⁺ 방출 분석에서 항체 1 IgG (비-생식세포에서 유래됨) 효능 (평균 IC₅₀ ± 표준 편차)
클론명	IgG IC₅₀ nM (n=8)
항체 1 (비-생식세포에서 유래됨)	17.1 ± 11.2

실시예 2: 항체의 생식세포에서의 유도

2.1 항체의 생식세포에서의 유도

항-CXCL13 항체의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 VBASE 데이타베이스의 공지의 인간 생식세포 서열에 대해 정렬시키고 (Tomlinson 1997), 가장 가까운 생식세포를 서열 유사성에 의해 확인하였다. 항체 1의 VH 도메인의 경우, 가장 가까운 생식세포는 VH3-23이었다. VL 도메인의 경우에는, VK1 L12이었다. 변경되지 않은 상태의 베니어 잔기 (Foote & Winter 1992)를 고려하지 않을 때, VH 도메인의 프레임워크 구역에 8개의 변경이 존재하고, VL 도메인에 3개의 변경이 존재하였고, 이 모두는 생식세포에서 유래된 IgG₁을 형성하기 위해 적절한 돌연변이 유발 프라이머를 사용하는 표준 부위 지정 돌연변이 유발 기술에 의해 표시된 생식세포 서열 (VH 내의 Q1E, V5L, R16G, V23A, G24A, H39Q, G83R 및 R105Q 및 VL 내의 I15V, A58V 및 D70E)로 복귀시켰다.

2.2 LANCE ® cAMP 분석에서 생식세포에서 유래된 항체 1 IgG 의 효능

CHO Gqi5 hCXCR5 세포에서 cAMP 수준의 인간 또는 cyno CXCL13 (MEL 세포 유래됨) 조정의 억제에 대한 생식세포에서 유래된 및 모 (비-생식세포에서 유래됨) 항체 1 IgG의 효능을 섹션 1.3에 개략된 바와 같은 LANCE® CXCL13 cAMP 분석을 이용하여 비교하였다. IC₅₀ 값을 표 5에 제시한다.

LANCE® CXCL13 cAMP 분석에서 인간 또는 사이노몰거스 CXCL13 (평균 IC₅₀ ± 표준 편차, n 수치)에 대한 생식세포에서 유래된 및 모 항체 1 IgG의 효능
클론명	인간 CXCL13 IC₅₀ nM (n 수치)	Cyno CXCL13 IC₅₀ nM (n 수치)
모 항체 1	1.4 ± 0.5 (n=10)	0.3 ± 0.1 (n=6)
생식세포에서 유래된 항체 1	1.6 ± 0.3 (n=4)	0.3 ± 0.1 (n=4)

모 및 생식세포에서 유래된 항체 1 IgG는 상기 분석에서 유사한 활성을 보였다.

2.3 B300.19 hCXCR5 세포를 사용한 화학주성 분석에서 생식세포에서 유래된 항체 1 IgG 의 효능

완전히 생식세포에서 유래된 항체 1 IgG을 B300.19 hCXCR5 세포를 사용한 화학주성 분석으로 시험하였다. IgG를 비글리코실화된 및 글리코실화된 인간 및 글리코실화된 cyno CXCL13의 ED80 농도에 대해 적정하였다. 그 결과를 IC₅₀ 값 (nM) ± SEM으로서 아래 표 6에 제시한다. IgG를 적어도 3회 시험하였다.

B300.19 hCXCR5 화학주성 분석에서 생식세포에서 유래된 항체 1 IgG에 대한 IC₅₀ 값 (nM) ± SEM의 예
IgG	IC₅₀ nM ± SEM
	인간 CXCL13		cyno CXCL13
	비글리코실화	글리코실화	글리코실화
항체 1 (생식세포에서 유래됨)	6.22 ± 0.7	3.94 ± 1.5	4.53 ± 0.6

2.4 생식세포에서 유래된 항체 1 IgG 에 의한 CXCL13 유도 칼슘 방출의 억제

생식세포에서 유래된 및 모 (비-생식세포에서 유래됨) 항체 1 IgG의 효능을 섹션 1.5에 개략된 바와 같은 FLIPR 분석으로 비교하였다.

CXCL13 매개 CHO Gqi5 hCXCR5 c4.4 Ca² ⁺ 방출 분석에서 IgG 효능 (평균 IC₅₀ ± 표준 편차, n 수치)의 예
클론명	IgG IC₅₀ nM ± SD
모 항체 1	17.1 ± 11.2 (n=8)
생식세포에서 유래된 항체 1	10.4 ± 6.3 (n=7)

2.5 인간 CXCL13 에 대한 생식세포에서 유래된 항체 1 IgG 의 특이성

인간 CXCL13 (MEL 세포 유래됨)에 대한 생식세포에서 유래된 항체 1 IgG₁의 특이성을 CXCL13 FLISA (형광 연결 면역흡착 분석)을 사용하여 케모킨의 CXC 패밀리의 다른 요소와 비교하여 결정하였다. 상기 분석에서, 케모킨 CXCL3 (알&디 시스템즈), CXCL5 (알&디 시스템즈), CXCL6 (알&디 시스템즈), CXCL8 (알&디 시스템즈), CXCL10 (알&디 시스템즈) 및 CXCL12 (페프로테크 (Peprotech))를 생식세포에서 유래된 항체 1 IgG₁에 대한 결합을 위해 스트렙타비딘 비드 상에 고정된 비오티닐화된 인간 CXCL13 (알맥)과 경쟁하는 것에 대해 시험하였다. 비오티닐화된 인간 CXCL13 항체-결합 상호작용은 형광 미세부피 분석 기술을 사용하여 형광 태그가 부착된 항-인간 IgG 항체로 검출하였다 (상세한 내용은 "분석 물질 및 방법"을 참조한다). 그 결과를 표 8에 제시한다. 표준 케모킨 명칭 (Zlotnik and Yoshie, 2000)을 그의 가장 통상적으로 사용되는 동의어와 함께 제시한다.

생식세포에서 유래된 항체 1 IgG₁에 대한 비오티닐화된-인간 CXCL13 결합 (n=1 데이타 단독)의 케모킨 억제의 예
케모킨	비오티닐화된-인간 CXCL13에 대한 생식세포에서 유래된 항체 1 IgG₁의 결합의 억제 IC₅₀ (nM)
인간 CXCL13 (MEL 세포 유래됨)	0.2
cyno CXCL13 (MEL 세포 유래됨)	0.8
CXCL3 (GROγ)	>1 μM
CXCL5 (ENA-78)	>1 μM
CXCL6 (GCP-2)	>1 μM
CXCL8 (IL-8)	>1 μM
CXCL10 (IP1O)	>1 μM
CXCL12 (SDF-1α)	>1 μM

인간 CXCL13 및 사이노몰거스 CXCL13은 생식세포에서 유래된 항체 1 IgG₁에 대한 결합을 위해 비오티닐화된 인간 CXCL13과 경쟁하였다. 시험된 다른 어떠한 케모킨도 1 μM 이하의 농도에서 비오티닐화된 인간 CXCL13 항체 1 IgG 결합 상호작용의 억제를 보이지 않았다.

실시예 3a: 인간 및 cyno CXCL13 에 대한 항체의 친화도

3.1 바이아코어 측정에 의한 항체 친화도의 결정

동적 결합 파라미터의 결정은 본질적으로 문헌 [Karlsson et al, 1991]에 기재된 바와 같이 바이아코어 2000 광 바이오센서 (바이아코어 아베 (BIAcore AB, 스웨덴 웁살라))를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 수행하였다. 또한, 분석 물질 및 방법 섹션을 참조한다.

오리엔테이션 1.

표준 아민 연결기 화학을 이용하여 각각 표준화된 CM5 칩 (바이아코어, BR-1000-14)의 유동 셀 (Fc) 1 및 2 상에 블랭크 및 단백질 G' (시그마 P4689)의 265 RU 표면을 생성하였다. 상기 Fc 2 단백질 G' 표면을 사용하여 240-385 RU 항체 1 (생식세포에서 유래된 IgG₁)을 포획하였다.

유동 셀 (Fc)	리간드	반응 1 (결합된 RU)
1	블랭크 (HBS-EP)	n/a
2	단백질 G' (10 mM 아세테이트 버퍼 (pH 4.5) 중의 20 ㎍/mL로 희석)	265

이어서, 인간 및 사이노몰거스 CXCL13의 희석액 (HBS-EP 버퍼 중의)을 100 ㎕/min의 유속으로 칩 표면 위로 유동시켰다.

질량 수송 제한 모델을 사용하여 1:1 Langmuir 를 Fc 2-1 데이타에 피팅 ( fitting )한다

피팅 조건 (BIAevaluation 3.2로 수행):

이중 블랭크 공제 (IgG 유동 셀 데이타로부터 공제된 블랭크 유동 셀 및 블랭크 주입액 (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005％ v/v 계면활성제 P20, HBS-EP)을 데이타 세트의 나머지로부터 공제함). 벌크 (bulk) RI 공헌도 (contribution)를 국소적으로 (locally) 모두 0으로 설정하였다.

질량 수송 제한 모델을 사용하는 1:1 Langmuir, HBS-EP 공제 및 RI의 0 설정을 이용하여, 다음 파라미터를 0.25 - 20 nM 인간 CXCL13 곡선 (10개의 농도)을 기초로 하여 얻었다.

	ka (M^-1 s^-1)	kd (s^-1)	Rmax (RU)	K_D (M)	Chi²
238 RU 항체 1 (생식세포에서 유래)	2.13 e⁷	6.84 e^-4	37.2	3.22 e^-11	0.425
385 RU 항체 1 (생식세포에서 유래)	1.42 e⁷	7.15 e^-4	58.2	5.04 e^-11	0.529
347 RU 항체 1 (생식세포에서 유래)	1.76 e⁷	7.36 e^-4	52.9	4.17 e^-11	0.690

	ka (M^-1 s^-1)	kd (s^-1)	K_D (M)
3회 실험의 평균값	1.77 e⁷	7.12 e^-4	4.14 e^-11

질량 수송 제한 모델을 사용하는 1:1 Langmuir, HBS-EP 공제 및 RI의 0 설정을 이용하여, 다음 파라미터를 IgG에 대해 0.125 - 40 nM cyno CXCL13 곡선 (12개 및 9개의 농도)을 기초로 하여 얻었다.

	ka (M^-1 s^-1)	kd (s^-1)	Rmax (RU)	K_D (M)	Chi²
303 RU 항체 1 (생식세포에서 유래)	1.97 e⁷	6.50 e^-4	49.6	3.30 e^-11	1.35
296 RU 항체 1 (생식세포에서 유래)	2.05 e⁷	5.99 e^-4	47.2	2.91 e^-11	0.683

	ka (M^-1 s^-1)	kd (s^-1)	K_D (M)
2회 실험의 평균값	2.01 e⁷	6.25 e^-4	3.11 e^-11

항체 1 (생식세포에서 유래됨)에 대한 cyno CXCL13 피트는 인간 CXCL13과 매우 유사한 유사한 K_D 값을 제시하고, 이것은 각각의 변이체에 대한 친화도가 매우 유사함을 시사한다.

오리엔테이션 2.

표준 아민 연결기 화학을 이용하여 각각 표준화된 CM5 칩 (바이아코어, BR-1000-14)의 유동 셀 (Fc) 2 및 3 상에 블랭크 (Fc 1) 및 스트렙타비딘 (Perbio/Pierce 21125)의 228 및 303 RU 표면을 생성하였다. 상기 Fc 3 스트렙타비딘 표면을 사용하여 C-말단 근처에서 비오티닐화된 28 RU 인간 CXCL13 (알맥 주문 합성)을 포획하였다.

이어서, 항체 1의 크기 배제 크로마토그래피 단량체화된 Fab 단편의 희석액 (HBS-EP 버퍼 중에 희석됨)을 30 ㎕/min의 유속으로 칩 표면 위로 유동시켰다.

1:1 Langmuir 모델을 Fc 3-1 데이타에 피팅한다

피팅 조건 (BIAevaluation 3.2로 수행):

이중 블랭크 공제 (IgG 유동 셀 데이타로부터 공제된 블랭크 유동 셀 및 블랭크 주입액 (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005％ v/v 계면활성제 P20, HBS-EP)을 데이타 세트의 나머지로부터 공제함). 벌크 RI 공헌도를 국소적으로 모두 0으로 설정하였다.

질량 수송 제한 모델을 사용하는 1:1 Langmuir, HBS-EP 공제 및 RI의 0 설정을 이용하여, 다음 파라미터를 0.065 - 2.105 nM 항체 1 (생식세포에서 유래된 IgG₁) Fab 곡선 (6개의 농도)을 기초로 하여 얻었다.

	ka (M^-1 s^-1)	kd (s^-1)	Rmax (RU)	K_D (M)	Chi²
28 RU 인간 CXCL13	8.98 e⁶	1.66 e^-3	41.6	1.85 e^-10	0.394

실시예 3b: 인간 CXCL13 에 대한 항체의 친화도

실시예 3a에 제시된 보다 포괄적인 데이타 이전에, 초기의 친화도 데이타 (n=1)를 아래에서 설명하는 보다 낮은 범위의 CXCL13 농도를 사용하여 결정하였다. 또한, 분석 물질 및 방법 섹션 참조.

3.1b 바이아코어 측정에 의한 항체 친화도의 결정

동적 결합 파라미터의 결정은 본질적으로 문헌 [Karlsson et al, 1991]에 기재된 바와 같이 바이아코어 2000 광 바이오센서 (바이아코어 아베)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 수행하였다.

표준 아민 연결기 화학을 이용하여 CM3 칩 (바이아코어, BR-1005-41) 상에 블랭크 (Fc 1) 및 10 mM 아세테이트 버퍼 (pH 4.5) 중에 희석된 항체 1 (생식세포에서 유래된 IgG₁)의 500 RU 표면을 생성하였다.

유동 셀 (Fc)	리간드	반응 1 (결합된 RU)	목표치 (RU)
1	블랭크 (HBS-EP)	n/a	-
2	항체 1(생식세포에서 유래됨)	579.9	500

이어서, 인간 및 사이노몰거스 CXCL13의 희석액을 칩 표면 위로 유동시켰다.

Langmuir 를 Fc 2-1 및 3-1 데이타에 피팅한다

피팅 조건 (BIAevaluation 3.2로 수행):

이중 블랭크 공제 (IgG 유동 셀 데이타로부터 공제된 블랭크 유동 셀 및 블랭크 주입액 (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005％ v/v 계면활성제 P20, HBS-EP)을 데이타 세트의 나머지로부터 공제함). 벌크 RI 공헌도를 국소적으로 모두 0으로 설정하였다

1:1 Langmuir 모델, HBS-EP 공제 및 RI의 0 설정을 이용하여, 다음 파라미터를 0.10 - 0.60 nM 인간 CXCL13 곡선을 기초로 하여 얻었다.

	ka (M^-1 s^-1)	kd (s^-1)	Rmax (RU)	K_D (M)	Chi²
579 RU 항체 1 (생식세포에서 유래됨)	2.02 e⁶	5.24 e^-4	54.2	2.59 e^-10	0.183

1:1 Langmuir 모델, HBS-EP 공제 및 RI의 0 설정을 이용하여, 다음 파라미터를 각각의 IgG에 대해 0.10 - 0.60 nM cyno CXCL13 곡선을 기초로 하여 얻었다.

	ka (M^-1 s^-1)	kd (s^-1)	Rmax (RU)	K_D (M)	Chi²
579 RU 항체 1 (생식세포에서 유래됨)	3.63 e⁶	1.04 e^-4	38	2.85 e^-10	0.161

실시예 4: 일차 B 세포의 CXCL13 유도 화학주성의 억제

4.1 마우스 비장으로부터 단리된 일차 림프구의 CXCL13 유도 화학주성의 억제

일차 림프구를 마우스 비장으로부터 새로 단리하고, LPS와 함께 밤새 배양하였다. 이어서, 세포를 시판되는 쥐 CXCL13 (알&디 시스템즈) 또는 인간 CXCL13 (MEL 세포 유래됨)에 의해 자극된 화학주성 분석에서 사용하였다. 항체 1 IgG (비-생식세포에서 유래됨)에 대한 IC₅₀ 데이타 (nM)를 아래 표 12에 제시한다 (n=1 및 n=2 데이타 단독).

IgG	IC₅₀ (nM)
IgG	인간 CXCL13	마우스 CXCL13
항체 1 IgG (비-생식세포에서 유래됨)	29.76 (n=2) [27.3, n=1]	측정 불가

실시예 5: 인간 편도 B 세포 CXCL13 유도 화학주성 분석

1.4 인간 편도 B 세포에서 CXCL13 유도 화학주성의 억제

1차 편도 B 세포를 인간 편도로부터 새로 단리하고, LPS와 함께 밤새 배양하였다. 이어서, 세포를 ED80 농도 (100 nM)의 인간 비-글리코실화된 CXCL13 (ABL - MEL 세포 유래됨)을 사용하는 화학주성 분석에 사용하였다. 분석 방법의 상세한 내용은 "분석 물질 및 방법"을 참조한다. 항체 1 (생식세포에서 유래된 IgG₁)에 대한 IC₅₀ 데이타 (nM)를 표 17에 제시한다 (n=4 데이타).

IgG	항체 1 (생식세포에서 유래된 IgG₁)
IC₅₀ (nM)	9.59±1.6

실시예 6: ELISA 에서 항체 1 (생식세포에서 유래된 IgG ₁ )에 대한 천연 hCXCL13 의 결합

섹션 "분석 물질 및 방법"에 설명된 바와 같이, 항체 1 (생식세포에서 유래된 IgG₁)은 천연 CXCL13 및 재조합 CXCL13 모두에 결합하고, 동등한 농도의 리간드가 동등한 신호를 분석에서 제시한다.

실시예 7: 항체 1 (생식세포에서 유래된 IgG ₁ )에 의한 CXCL13의 H/D 교환 속도의 교란

제1 실험에서, CXCL13을 용액 내에서 D₂O로 교환한 후, 컬럼 상에 고정된 항체 1 (IgG1)에 결합시켰다. 이어서, 이를 항체 컬럼에 여전히 결합된 상태로 유지하면서 H₂O로 역 교환하여, 에피토프를 역 교환 반응 동안 보호하고, 이에 의해 중양자로 표지하였다. 제2 실험에서, CXCL13을 먼저 컬럼 상의 항체 1에 결합시킨 후, D₂O로 표지하고, 최종적으로 컬럼에 여전히 결합된 상태를 유지하면서 H₂O로 역 교환하여, 어떠한 CXCL13도 중양자로 표지되지 않도록 하였다. 이어서, 2개의 실험 사이의 펩티드의 질량의 차이를 결정하였다. 두 실험 사이의 중수소화 수준의 차이는 항체에 결합될 때 교환 지연의 척도이다. 상기 프로토콜에 대한 상세한 방법은 물질 및 방법 섹션에서 제시된다.

서열 14에 제시된 서열을 갖는, MEL 세포에서 발현된 인간 CXCL13을 상기 연구에 사용하였다.

H/D 교환 속도의 가장 큰 교란을 보인 구역은 인간 CXCL13의 아미노산 31-42 (서열 20) 사이에 존재하였다.

pH 7에서, 교환 속도는 항체의 부재 하에 거의 전체 분자에 걸쳐 매우 빠르고, 이것은 매우 유연한 구조를 제안한다. 교환은 항체에 결합될 때 분자의 중앙 코어에 걸쳐 느려졌다. 이것은 31-42의 주요한 부위 이외에, 결합이 보다 약한 상호작용의 다른 부위가 존재할 가능성이 있음을 시사한다.

표 18은 항체 1에 결합될 때의 중수소화 및 양성자로의 역 교환을 항체에 결합될 때 용액 중에서의 중수소화 및 양성자로의 역 교환과 비교하여 중수소화 수준의 차이 ％를 보여준다. 4개의 시점을 평균할 때 10％ 초과의 차이는 유의한 것으로 간주하였다. 잔기 넘버링은 서열 14에 제시된 서열에 따라 표시한다.

참고문헌

상기 인용된 것을 포함한 본원 명세서에 인용된 모든 참조문헌은 모든 점에서 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Barker, Wendy Keyes, Feenagh AstaZeneca AB MedImmune Limited <120> Compounds <130> 102532 <150> US60/890,888 <151> 2007-02-21 <150> US60/908,041 <151> 2007-03-26 <160> 20 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody1 <400> 1 gaggtgcagc tgctggagtc tgggggaggc ttggtgcagc caggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttggt aattcttgga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg agctgaggac acggctgtgt attactgtac gagagatctt 300 ccgggtatag cagtggctgg ttactggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcgagt 357 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody1 <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asn Ser 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Leu Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody1 <400> 3 Asn Ser Trp Met Ser 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody1 <400> 4 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody1 <400> 5 Asp Leu Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody1 <400> 6 gacacccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60 atcacctgcc gggccagtga gggtatttat cactggttgg cctggtatca gcagaagcca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctataag gcctctagtt tagccagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacaa tatagtaatt atccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagc tggagatcaa acgt 324 <210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody1 <400> 7 Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody1 <400> 8 Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody1 <400> 9 Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody1 <400> 10 Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 11 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 1 scFv amino acid sequence (VH followed by VL with linker sequence) <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asn Ser 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg His Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Leu Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Tyr Trp Gly Arg Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr 130 135 140 Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 145 150 155 160 Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 165 170 175 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala 180 185 190 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 195 200 205 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 210 215 220 Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 225 230 235 240 Lys Arg <210> 12 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Full length human CXCL13 amino acid sequence <400> 12 Met Lys Phe Ile Ser Thr Ser Leu Leu Leu Met Leu Leu Val Ser Ser 1 5 10 15 Leu Ser Pro Val Gln Gly Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg 20 25 30 Cys Arg Cys Val Gln Glu Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Asp Arg Ile Gln Ile Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu 50 55 60 Ile Ile Val Trp Lys Lys Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln 65 70 75 80 Ala Glu Trp Ile Gln Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Leu Pro Val Pro Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro 100 105 <210> 13 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Mature human CXCL13 amino acid sequence <400> 13 Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg Cys Arg Cys Val Gln Glu 1 5 10 15 Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile Asp Arg Ile Gln Ile Leu 20 25 30 Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu Ile Ile Val Trp Lys Lys 35 40 45 Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln Ala Glu Trp Ile Gln Arg 50 55 60 Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser Ser Thr Leu Pro Val Pro 65 70 75 80 Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro 85 <210> 14 <211> 82 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Mature human CXCL13 amino acid sequence with C terminal truncation <400> 14 Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg Cys Arg Cys Val Gln Glu 1 5 10 15 Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile Asp Arg Ile Gln Ile Leu 20 25 30 Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu Ile Ile Val Trp Lys Lys 35 40 45 Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln Ala Glu Trp Ile Gln Arg 50 55 60 Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser Ser Thr Leu Pro Val Pro 65 70 75 80 Val Phe <210> 15 <211> 87 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <223> Mature cynomolgus CXCL13 amino acid sequence <400> 15 Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr His Leu Arg Cys Arg Cys Val Gln Glu 1 5 10 15 Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile Asp Arg Ile Gln Ile Ser 20 25 30 Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu Ile Ile Val Trp Lys Lys 35 40 45 Asn Lys Ser Val Val Cys Val Asp Pro Gln Ala Glu Trp Ile Gln Arg 50 55 60 Ile Met Glu Met Leu Arg Lys Lys Ser Ser Ser Thr Pro Pro Val Pro 65 70 75 80 Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro 85 <210> 16 <211> 82 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <223> Mature cynomolgus CXCL13 amino acid sequence with C terminal truncation <400> 16 Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr His Leu Arg Cys Arg Cys Val Gln Glu 1 5 10 15 Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile Asp Arg Ile Gln Ile Ser 20 25 30 Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu Ile Ile Val Trp Lys Lys 35 40 45 Asn Lys Ser Val Val Cys Val Asp Pro Gln Ala Glu Trp Ile Gln Arg 50 55 60 Ile Met Glu Met Leu Arg Lys Lys Ser Ser Ser Thr Pro Pro Val Pro 65 70 75 80 Val Phe <210> 17 <211> 372 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human CXCR5 isoform 1 amino acid sequence <400> 17 Met Asn Tyr Pro Leu Thr Leu Glu Met Asp Leu Glu Asn Leu Glu Asp 1 5 10 15 Leu Phe Trp Glu Leu Asp Arg Leu Asp Asn Tyr Asn Asp Thr Ser Leu 20 25 30 Val Glu Asn His Leu Cys Pro Ala Thr Glu Gly Pro Leu Met Ala Ser 35 40 45 Phe Lys Ala Val Phe Val Pro Val Ala Tyr Ser Leu Ile Phe Leu Leu 50 55 60 Gly Val Ile Gly Asn Val Leu Val Leu Val Ile Leu Glu Arg His Arg 65 70 75 80 Gln Thr Arg Ser Ser Thr Glu Thr Phe Leu Phe His Leu Ala Val Ala 85 90 95 Asp Leu Leu Leu Val Phe Ile Leu Pro Phe Ala Val Ala Glu Gly Ser 100 105 110 Val Gly Trp Val Leu Gly Thr Phe Leu Cys Lys Thr Val Ile Ala Leu 115 120 125 His Lys Val Asn Phe Tyr Cys Ser Ser Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ala 130 135 140 Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val His Ala Tyr Arg His 145 150 155 160 Arg Arg Leu Leu Ser Ile His Ile Thr Cys Gly Thr Ile Trp Leu Val 165 170 175 Gly Phe Leu Leu Ala Leu Pro Glu Ile Leu Phe Ala Lys Val Ser Gln 180 185 190 Gly His His Asn Asn Ser Leu Pro Arg Cys Thr Phe Ser Gln Glu Asn 195 200 205 Gln Ala Glu Thr His Ala Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu Tyr His Val 210 215 220 Ala Gly Phe Leu Leu Pro Met Leu Val Met Gly Trp Cys Tyr Val Gly 225 230 235 240 Val Val His Arg Leu Arg Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln Arg Gln Lys 245 250 255 Ala Val Arg Val Ala Ile Leu Val Thr Ser Ile Phe Phe Leu Cys Trp 260 265 270 Ser Pro Tyr His Ile Val Ile Phe Leu Asp Thr Leu Ala Arg Leu Lys 275 280 285 Ala Val Asp Asn Thr Cys Lys Leu Asn Gly Ser Leu Pro Val Ala Ile 290 295 300 Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala His Cys Cys Leu Asn Pro Met 305 310 315 320 Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val Lys Phe Arg Ser Asp Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr Gly Pro Ala Ser Leu Cys Gln Leu Phe 340 345 350 Pro Ser Trp Arg Arg Ser Ser Leu Ser Glu Ser Glu Asn Ala Thr Ser 355 360 365 Leu Thr Thr Phe 370 <210> 18 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human CXCR5 isoform 2 amino acid sequence <400> 18 Met Ala Ser Phe Lys Ala Val Phe Val Pro Val Ala Tyr Ser Leu Ile 1 5 10 15 Phe Leu Leu Gly Val Ile Gly Asn Val Leu Val Leu Val Ile Leu Glu 20 25 30 Arg His Arg Gln Thr Arg Ser Ser Thr Glu Thr Phe Leu Phe His Leu 35 40 45 Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Val Phe Ile Leu Pro Phe Ala Val Ala 50 55 60 Glu Gly Ser Val Gly Trp Val Leu Gly Thr Phe Leu Cys Lys Thr Val 65 70 75 80 Ile Ala Leu His Lys Val Asn Phe Tyr Cys Ser Ser Leu Leu Leu Ala 85 90 95 Cys Ile Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val His Ala 100 105 110 Tyr Arg His Arg Arg Leu Leu Ser Ile His Ile Thr Cys Gly Thr Ile 115 120 125 Trp Leu Val Gly Phe Leu Leu Ala Leu Pro Glu Ile Leu Phe Ala Lys 130 135 140 Val Ser Gln Gly His His Asn Asn Ser Leu Pro Arg Cys Thr Phe Ser 145 150 155 160 Gln Glu Asn Gln Ala Glu Thr His Ala Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu 165 170 175 Tyr His Val Ala Gly Phe Leu Leu Pro Met Leu Val Met Gly Trp Cys 180 185 190 Tyr Val Gly Val Val His Arg Leu Arg Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln 195 200 205 Arg Gln Lys Ala Val Arg Val Ala Ile Leu Val Thr Ser Ile Phe Phe 210 215 220 Leu Cys Trp Ser Pro Tyr His Ile Val Ile Phe Leu Asp Thr Leu Ala 225 230 235 240 Arg Leu Lys Ala Val Asp Asn Thr Cys Lys Leu Asn Gly Ser Leu Pro 245 250 255 Val Ala Ile Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala His Cys Cys Leu 260 265 270 Asn Pro Met Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val Lys Phe Arg Ser Asp Leu 275 280 285 Ser Arg Leu Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr Gly Pro Ala Ser Leu Cys 290 295 300 Gln Leu Phe Pro Ser Trp Arg Arg Ser Ser Leu Ser Glu Ser Glu Asn 305 310 315 320 Ala Thr Ser Leu Thr Thr Phe 325 <210> 19 <211> 353 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> G protein Gqi5 amino acid sequence <400> 19 Met Ala Cys Cys Leu Ser Glu Glu Ala Lys Glu Ala Arg Arg Ile Asn 1 5 10 15 Asp Glu Ile Glu Arg Gln Leu Arg Arg Asp Lys Arg Asp Ala Arg Arg 20 25 30 Glu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Gly Thr Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr 35 40 45 Phe Ile Lys Gln Met Arg Ile Ile His Gly Ser Gly Tyr Ser Asp Glu 50 55 60 Asp Lys Arg Gly Phe Thr Lys Leu Val Tyr Gln Asn Ile Phe Thr Ala 65 70 75 80 Met Gln Ala Met Ile Arg Ala Met Asp Thr Leu Lys Ile Pro Tyr Lys 85 90 95 Tyr Glu His Asn Lys Ala His Ala Gln Leu Val Arg Glu Val Asp Val 100 105 110 Glu Lys Val Ser Ala Phe Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ala Ile Lys Ser 115 120 125 Leu Trp Asn Asp Pro Gly Ile Gln Glu Cys Tyr Asp Arg Arg Arg Glu 130 135 140 Tyr Gln Leu Ser Asp Ser Thr Lys Tyr Tyr Leu Asn Asp Leu Asp Arg 145 150 155 160 Val Ala Asp Pro Ser Tyr Leu Pro Thr Gln Gln Asp Val Leu Arg Val 165 170 175 Arg Val Pro Thr Thr Gly Ile Ile Glu Tyr Pro Phe Asp Leu Gln Ser 180 185 190 Val Ile Phe Arg Met Val Asp Val Gly Gly Gln Arg Ser Glu Arg Arg 195 200 205 Lys Trp Ile His Cys Phe Glu Asn Val Thr Ser Ile Met Phe Leu Val 210 215 220 Ala Leu Ser Glu Tyr Asp Gln Val Leu Val Glu Ser Asp Asn Glu Asn 225 230 235 240 Arg Met Glu Glu Ser Lys Ala Leu Phe Arg Thr Ile Ile Thr Tyr Pro 245 250 255 Trp Phe Gln Asn Ser Ser Val Ile Leu Phe Leu Asn Lys Lys Asp Leu 260 265 270 Leu Glu Glu Lys Ile Met Tyr Ser His Leu Val Asp Tyr Phe Pro Glu 275 280 285 Tyr Asp Gly Pro Gln Arg Asp Ala Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Leu 290 295 300 Lys Met Phe Val Asp Leu Asn Pro Asp Ser Asp Lys Ile Ile Tyr Ser 305 310 315 320 His Phe Thr Cys Ala Thr Asp Thr Glu Asn Ile Arg Phe Val Phe Ala 325 330 335 Ala Val Lys Asp Thr Ile Leu Gln Leu Asn Leu Lys Asp Gly Gly Leu 340 345 350 Phe <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human CXCL-13 peptide <400> 20 Ile Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu 1 5 10

Claims

CXCR5에 대한 CXCL13의 결합을 억제하며, CXCL13에 대한 결합에 대해 서열 11의 아미노산 서열을 갖는 항체 scFv 분자와 경쟁하는, CXCL13에 대한 단리된 결합 요소.
제1항에 있어서, 서열 5의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 결합 요소.
제1항 또는 제2항에 있어서, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 항체 1 CDR 세트를 포함하거나 또는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입이 존재하는 항체 1 CDR 세트를 포함하며, 여기서

HCDR1은 서열 3의 아미노산 서열을 갖고,

HCDR2는 서열 4의 아미노산 서열을 갖고,

HCDR3은 서열 5의 아미노산 서열을 갖고,

LCDR1은 서열 8의 아미노산 서열을 갖고,

LCDR2는 서열 9의 아미노산 서열을 갖고,

LCDR3은 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 것인 단리된 결합 요소.
CXCR5에 대한 CXCL13의 결합을 억제하며, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 항체 1 CDR 세트를 포함하거나 또는 하나 이상의 아미노산의 치 환, 결실 또는 삽입이 존재하는 항체 1 CDR 세트를 포함하고, 여기서

HCDR1은 서열 3의 아미노산 서열을 갖고,

HCDR2는 서열 4의 아미노산 서열을 갖고,

HCDR3은 서열 5의 아미노산 서열을 갖고,

LCDR1은 서열 8의 아미노산 서열을 갖고,

LCDR2는 서열 9의 아미노산 서열을 갖고,

LCDR3은 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 것인,

CXCL13에 대한 단리된 결합 요소.
제3항 또는 제4항에 있어서, 항체 1 CDR 세트를 포함하거나 또는 1 또는 2개의 치환이 존재하는 항체 1 CDR 세트를 포함하는 결합 요소.
제3항 또는 제4항에 있어서, 항체 1 CDR 세트를 포함하는 결합 요소.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 VH 도메인 및 항체 VL 도메인을 포함하는 항체 분자를 포함하며, 여기서 항체 분자는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하고, VH 도메인은 HCDR1, HCDR2, HCDR3 및 프레임워크를 포함하고, VL 도메인은 LCDR1, LCDR2, LCDR3 및 프레임워크를 포함하는 것인 결합 요소.
제7항에 있어서, 항체 분자가 scFv인 결합 요소.
제7항에 있어서, 항체 분자가 항체 불변 구역을 포함하는 것인 결합 요소.
제9항에 있어서, 항체 분자가 IgG1인 결합 요소.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 인간 생식세포 유전자 세그먼트 서열의 프레임워크 구역을 포함하는 것인 결합 요소.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 VH 도메인이 인간 생식세포 프레임워크 VH3-23을 포함하는 것인 결합 요소.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 VH 도메인이 서열 2와 적어도 90％의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 결합 요소.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 VH 도메인의 아미노산 서열이 서열 2인 결합 요소.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 VL 도메인이 인간 생식세포 프레임워크 VK1 L12를 포함하는 것인 결합 요소.
제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 서열 7과 적어도 90％의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 것인 결합 요소.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인의 아미노산 서열이 서열 7인 결합 요소.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 VH 도메인의 아미노산 서열이 서열 2이고, 항체 VL 도메인의 아미노산 서열이 서열 7인 결합 요소.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,

CXCR5에 대한 인간 CXCL13의 결합을 중화시키는 효능이 CXCR5에 대한 사이노몰거스 CXCL13의 결합을 중화시키는 효능과 10배 이하의 차이가 있으며, 여기서

CXCR5에 대한 인간 CXCL13의 결합을 중화시키는 효능은 2 nM 이하의 인간 CXCL13의 농도를 사용한 cAMP 분석으로 측정된 IC₅₀으로 제시되고,

CXCR5에 대한 사이노몰거스 CXCL13의 결합을 중화시키는 효능은 2 nM의 사이노몰거스 CXCL13의 최종 농도를 사용한 cAMP 분석으로 측정된 IC₅₀으로 제시되는 것인 결합 요소.
제19항에 있어서, CXCR5에 대한 인간 CXCL13의 결합을 중화시키는 효능이 CXCR5에 대한 사이노몰거스 CXCL13의 결합을 중화시키는 효능과 5배 이하의 차이가 있는 결합 요소.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 2 nM의 CXCL13의 최종 농도를 사용한 인간 CXCL13 cAMP 분석으로 측정시에 IC₅₀이 12 nM 이하인 결합 요소.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 100 nM의 CXCL13의 최종 농도를 사용한 인간 CXCL13 칼슘 방출 분석으로 측정시에 IC₅₀이 40 nM 이하인 결합 요소.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약 ED80 반응을 유도하는 최종 농도의 인간 CXCL13 및 비-일차 B 세포주를 사용하는 인간 CXCL13 B 세포 화학주성 분석에서 IC₅₀이 12 nM 이하인 결합 요소.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정시에 400 pM 미만의 친화도로 인간 CXCL13에 결합하는 결합 요소.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정시에 400 pM 미만의 친화도로 사이노몰거스 CXCL13에 결합하는 결합 요소.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙한 인간 IL-17A의 위치 31-42의 서열 Ile-Leu-Pro-Arg-Gly-Asn-Gly-Cys-Pro-Arg-Lys-Glu (서열 20) 중의 적어도 하나의 잔기를 포함하는 인간 CXCL13의 에피토프에 결합하는 결합 요소.
제7항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자의 단리된 VH 도메인.
제7항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자의 단리된 VL 도메인.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 단리된 결합 요소 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 단리된 결합 요소를 포함하는, 수술 또는 요법에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한 조성물.
제30항에 있어서, CXCR5에 대한 CXCL13의 결합의 억제에 사용하기 위한 조성물.
CXCR5에 대한 CXCL13의 결합을 억제하기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내 지 제26항 중 어느 한 항에 따른 단리된 결합 요소의 용도.
제31항 또는 제32항에 있어서, 림프양 여포의 비정상적인 형성 및/또는 발생의 억제에 사용하기 위한 조성물 또는 용도.
제31항 또는 제32항에 있어서, 뼈 및/또는 연골의 파괴 및/또는 재형성의 억제에 사용하기 위한 조성물 또는 용도.
제31항 또는 제32항에 있어서, 림프구의 화학주성 및/또는 림프종의 증식의 억제에 사용하기 위한 조성물 또는 용도.
제31항 또는 제32항에 있어서, 류마티스성 관절염, 골관절염, 쇼그렌 (Sjogrens) 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 전신 홍반성 루푸스, 자가면역 갑상선 질병, 라임 신경보렐리아증 (Lyme Neuroborreliosis), HIV 감염 및/또는 백혈병의 치료에 사용하기 위한 조성물 또는 용도.
제31항 또는 제32항에 있어서, 류마티스성 관절염의 치료에 사용하기 위한 조성물 또는 용도.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 결합 요소를 개체에게 투여하는 것 을 포함하는, 개체에서 비정상적인 CXCL13 발현 및/또는 CXCL13 활성과 연관된 질환의 치료 방법.
제38항에 있어서, CXCL13 활성이 CXCR5에 대한 결합인 방법.
제39항에 있어서, 개체에서 림프양 여포의 비정상적인 형성 및/또는 발생을 억제하는 것을 포함하는 방법.
제39항에 있어서, 개체에서 뼈 및/또는 연골의 파괴 및/또는 재형성을 억제하는 것을 포함하는 방법.
제39항에 있어서, 개체에서 림프구의 화학주성 및/또는 림프종의 증식을 억제하는 것을 포함하는 방법.
제38항 또는 제39항에 있어서, 질환이 류마티스성 관절염, 골관절염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 전신 홍반성 루푸스, 자가면역 갑상선 질병, 라임 신경보렐리아증, HIV 감염 및/또는 백혈병인 방법.
제43항에 있어서, 질환이 류마티스성 관절염인 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 결합 요소, 또는 결합 요소의 단리된 VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
제45항에 따른 핵산으로 시험관 내에서 형질전환된 숙주 세포.
제46항에 따른 숙주 세포를 결합 요소 또는 항체 VH 또는 VL 도메인의 생산을 위한 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 결합 요소 또는 항체 VH 또는 VL 도메인의 생산 방법.
제47항에 있어서, 결합 요소, VH 도메인 또는 VL 도메인의 단리 및/또는 정제를 더 포함하는 방법.
제47항 또는 제48항에 있어서, 결합 요소, VH 도메인 또는 VL 도메인을 적어도 하나의 추가의 성분을 포함하는 조성물로 제제화하는 것을 더 포함하는 방법.
항체 1의 HCDR 세트인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 모 VH 도메인의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산을 부가, 결실, 치환 또는 삽입하여 모 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하는 것,

임의로는 이와 같이 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하여 하나 이상의 VH/VL 조합체를 제공하는 것, 및

CXCL13에 대한 항체 항원 결합 도메인을 확인하기 위해 모 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 상기 VH 도메인 또는 VH/VL 조합체(들)을 시험하는 것

을 포함하는, CXCL13에 대한 항체 항원 결합 도메인의 제조 방법.
제50항에 있어서, 모 VH 도메인이 제27항에 따른 VH 도메인인 방법.
제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 하나 이상의 VL 도메인이 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 모 VL 도메인의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산을 부가, 결실, 치환 또는 삽입하여 제공되고, 여기서 모 VL 도메인의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은, 각각 모 VL 도메인의 아미노산 서열 변이체인 하나 이상의 VL 도메인을 생성시키는 항체 1 CDR의 VL 세트인 방법.
제52항에 있어서, 모 VL 도메인이 제28항에 따른 VL 도메인인 방법.
제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 모 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 상기 VH 도메인이 CDR 돌연변이 유발에 의해 제공되는 것인 방법.
제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 항원 결합 도메인을 IgG, scFv 또는 Fab 항체 분자의 성분으로서 제조하는 것을 더 포함하는 방법.
VH 도메인을 코딩하는 출발 핵산 또는 각각 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 출발 레퍼토리를 제공하는 것 (여기서, VH 도메인(들)은 대체되는 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3을 포함하거나 또는 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3 코딩 구역이 결여되어 있음);

상기 출발 핵산 또는 출발 레퍼토리를 항체 1의 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3의 아미노산 서열의 돌연변이를 코딩하거나 돌연변이에 의해 생산되는 공여 핵산(들)과 조합하여 상기 공여 핵산(들)을 출발 핵산 또는 출발 레퍼토리 내의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 구역 내로 삽입함으로써, VH 도메인을 코딩하는 핵산의 생성물 레퍼토리를 제공하는 것;

상기 생성물 레퍼토리의 핵산을 발현시켜 생성물 VH 도메인을 생산하는 것;

임의로는 상기 생성물 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하는 것;

생성물 VH 도메인 및 임의로는 VL 도메인을 포함하는, CXCL13에 대한 결합 요소를 선택하는 것; 및

상기 결합 요소 또는 이를 코딩하는 핵산을 회수하는 것

을 포함하는, CXCL13에 결합하는 결합 요소의 제조 방법.
제56항에 있어서, 공여 핵산이 상기 HCDR1 및/또는 HCDR2의 돌연변이에 의해 생산되는 것인 방법.
제56항에 있어서, 공여 핵산이 상기 HCDR3의 돌연변이에 의해 생산되는 것인 방법.
제56항에 있어서, 공여 핵산을 핵산의 랜덤 돌연변이에 의해 제공하는 것을 포함하는 방법.
제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 결합 요소 내에 포함된 생성물 VH 도메인을 항체 불변 구역에 부착시키는 것을 더 포함하는 방법.
제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 생성물 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 IgG, scFv 또는 Fab 항체 분자를 제공하는 것을 포함하는 방법.
제50항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, CXCL13에 결합하는 항체 항원 결합 도메인 또는 결합 요소를 CXCL13을 중화시키는 능력에 대해 시험하는 것을 더 포함하는 방법.
제62항에 있어서, CXCL13에 결합하여 이를 중화시키는 항체 분자를 포함하는 결합 요소가 얻어지는 것인 방법.
제63항에 있어서, 항체 분자가 scFv인 방법.
제63항에 있어서, 항체 분자가 IgG인 방법.
제50항 내지 제65항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 항체 분자를 얻는 것, 및 항체 분자를 적어도 하나의 추가의 성분을 포함하는 조성물로 제제화하는 것을 포함하는, 항체 분자 조성물의 제조 방법.