KR20100014790A - Ｉｇｅ 분자에 대한 결합 멤버 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IgE에 대한 결합 멤버, 특히 항체 분자에 관한 것이다. 결합 멤버는 특히, 알레르기 및 천식을 비롯한 IgE에 의해 매개되는 질환의 치료에 유용하다.
IgE, 결합 멤버, 항체, 알레르기, 천식, 제약 조성물

Description

ＩＧＥ 분자에 대한 결합 멤버 {BINDING MEMBERS FOR IGE MOLECULES}
본 발명은 IgE에 대한 결합 멤버, 특히 항체 분자에 관한 것이다. 결합 멤버는 특히 알레르기 및 천식을 포함하여 IgE에 의해 매개되는 질환의 치료에 유용하다.
IgE는 면역글로불린 부류의 멤버이고, 알레르기 반응, 예를 들어 천식, 음식 알레르기, 제1형 과민증 및 동염 (sinus inflammation)을 매개한다.
IgE는 B-세포에 의해 B-세포의 표면 상에 발현된다. 간단히 설명하면, IgE는 짧은 막-결합 구역을 통해 성숙 IgE 분자에 연결된 막횡단 도메인에 의해 B-세포막에 앵커링된다. 또한, IgE는 저 친화도 IgE 수용체 (CD23으로도 알려진 FcεRII)를 통해 B-세포, 단핵구, 호산구 및 혈소판에 그의 Fc 구역을 통해 결합될 수 있다. 알레르겐에 노출될 때, 알레르겐-특이적 IgE를 생산하는 B-세포는 복제에 의해 증폭된다. 이어서, 알레르겐-특이적 IgE는 B-세포에 의해 순환계로 방출되고, 여기서 IgE는 FcεRII를 통해 B-세포에 의해, 및 고 친화도 수용체 (FcεRI)를 통해 비만세포 및 호염기구에 의해 결합된다. 이에 의해, 상기 비만세포 및 호염기구는 알레르겐에 대해 감작화된다. 알레르겐에 대한 후속 노출은 비만세포 및 호염기구 상의 FcεRI를 가교결합시켜, 히스타민 및 임상적 과민증 및 아나필락시 스 (anaphylaxis)의 원인이 되는 다른 인자의 방출을 활성화시킨다.
FcεRII를 동시에 억제하거나 억제하지 않으면서 FcεRI에 대한 결합 및 FcεRI을 통한 기능적 활성을 억제하는 결합 멤버는 IgE-매개된 질병 상태, 예를 들어 알레르기 및 천식 억제에 유용하다.
FcεRI 및 FcεRII는 IgE 불변 (Fc) 도메인 내의 인식 부위(들)에 결합하는 것으로 일반적으로 이해된다. 상기 인식 부위를 확인하기 위해 다양한 연구가 수행되었다. 예를 들어, IgE 분자의 특정 부분에 대응하는 펩티드가 IgE-수용체 결합의 경쟁 억제제로서 ([Burt et al., Eur. J. Immun, 17:437-440 [1987]]; [Helm et al., Nature, 331:180-183 [1988]]; [Helm et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:9465-9469 [1989]]; [Vercelli et al., Nature, 338:649-651 [1989]]; [Nio et al., Peptide Chemistry, 203-208 [1990]]), 또는 IgE-수용체 상호작용을 차단할 수 있는 항-IgE 항체를 유도하기 위해서 ([Burt et al., Molec. Immun. 24:379-389 [1987]]; [Robertson et al., Molec. Immun., 25:103-113 [1988]]; [Baniyash et al., Molec. Immun. 25:705-711 [1988]]) 사용되었다.
보다 최근에는, 졸레어(Xolair)® (오말리주맙)가 생산되어 천식 환자 치료를 위해 시판되었다. 졸레어®는 인간 IgE에 선택적으로 결합하여 적어도 비만세포 및 호염기구 표면 상의 FcεRI에 대한 IgE의 결합을 저하시키는 인간화 IgG1k 모노클로날 항체이다. FcεRI-보유 세포 상의 표면 결합된 IgE를 감소시킴으로써, 졸레어®는 알레르기 반응 매개자의 방출 정도를 다소 저하시킨다. 졸레어®는 국제 특허 출원 공개 WO 93/04173 및 WO 97/04807에 개시되어 있다.
그러나, 상기 유망한 치료 전략을 개선시키기 위해, IgE에 대한 다른 결합 멤버, 예를 들어 졸레어®보다 더 높은 친화도 및/또는 효능을 갖는 결합 멤버가 필요하다.
<발명의 개요>
본 발명자들은 적절하게 설계된 선별 기술 및 분석을 이용하여, FcεRII를 동시에 억제하거나 억제하지 않으면서 FcεRI (비만세포 상에 존재하는 고-친화도 IgE 수용체)에 대한 결합 및 FcεRI을 통한 기능적 활성을 억제하는 결합 멤버를 개발하였다.
본 발명의 결합 멤버는 FcεRII를 동시에 억제하거나 억제하지 않으면서 FcεRI에 대한 결합 및 FcεRI을 통한 기능적 활성을 억제한다. 결합 억제는 예를 들어 IgE를 중화시킴으로써 직접 억제하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 결합 멤버는 일반적으로 인간 IgE를, 예를 들어 RBL-ER51 칼슘 신호전달 분석에 의해 결정되는 바와 같이 약 10 nM 미만의 IC50으로 중화시킨다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 결합 멤버는 인간 IgE를, 예를 들어 RBL-ER51 칼슘 신호전달 분석에 의해 결정되는 바와 같이 약 1 nM 미만, 또는 약 0.5 nM 미만, 또는 약 0.2 nM 미만의 IC50으로 중화시킨다.
또한, 본 발명의 결합 멤버는 인간 이외의 다른 종에서 자연 발생하는 IgE 오르토로그 (ortholog)를 의미하는 비-인간 IgE에 결합하여 이를 중화시킬 수 있다.
본 발명의 결합 멤버는 보통 다른 면역글로불린보다 IgE에 특이적이고, IgE에 선택적으로 결합한다. 상기 선택성은 예를 들어 표준 경쟁 분석으로 결정되거나 입증될 수 있다.
결합 멤버는 IgE5에 의해 매개되는 질환, 특히 알레르기 및 천식의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
결합 멤버는 포유동물에서 순환하는 유리 IgE의 감소에 유용하고, 생체 내에서 또는 시험관 내에서 알레르겐-유도 비만세포 탈과립화의 억제에 유용하다.
결합 멤버는 또한 생체 내에서 또는 시험관 내에서 FcεRII에 결합된 IgE에 의해 매개되는 생물학적 반응을 동시에 억제하거나 억제하지 않으면서 FcεRI에 결합된 IgE에 의해 매개되는 생물학적 반응을 억제하는데 유용하다.
또한, 본 발명의 결합 멤버는 관심있는 샘플, 예를 들어 천식 또는 알레르기 환자로부터 얻은 샘플에서 IgE의 존재 또는 양, 또는 알레르겐-특이적 IgE의 존재 또는 양을 검출하기 위한 것과 같은 진단상 유용성을 갖는다.
결합 멤버에 의해 결합된 잔기의 서열을 결정하기 위해 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 펩티드-결합 스캔, 예를 들어 본원의 다른 부분에서 상세하게 설명되는 PEPSCAN-기반 효소 연관 면역흡착 분석 (ELISA)을 사용할 수 있다. 펩티드-결합 스캔, 예를 들어 펩스캔 시스템즈 (PEPSCAN Systems)에서 제공되는 종류에서, 항원으로부터 유도된 짧은 중복 펩티드가 결합 멤버에 대한 결합에 대해 체계적으로 스크리닝된다. 펩티드는 펩티드를 배열하기 위해 지지체 표면에 공유결합에 의해 커플링될 수 있다. 펩티드는 선형 또는 속박된 (constrained) 입 체형태일 수 있다. 속박된 입체형태는 펩티드 서열의 각 말단부에 말단 Cys 잔기를 갖는 펩티드를 사용하여 생성시킬 수 있다. Cys 잔기는 펩티드가 루프형 입체형태로 유지되도록 지지체 표면에 직접 또는 간접적으로 공유결합에 의해 커플링될 수 있다. 따라서, 이 방법에 사용되는 펩티드는 항원 단편에 대응하는 펩티드 서열의 각 말단에 부가된 Cys 잔기를 가질 수 있다. 또한, Cys 잔기가 펩티드 서열의 가운데에 또는 가운데 근처에 추가로 위치하는 이중 루프형 펩티드도 사용될 수 있다. Cys 잔기는, 펩티드가 중앙 Cys 잔기의 각 측면에 하나의 루프가 존재하는 이중 루프형 입체형태를 형성하도록 지지체 표면에 직접 또는 간접적으로 공유결합에 의해 커플링될 수 있다. 펩티드는 합성에 의해 생성될 수 있고, 따라서 Cys 잔기는 IgE 서열에서 자연발생하지 않지만 목적하는 위치에서 공학적으로 처리될 수 있다. 임의로, 선형 및 속박된 펩티드 모두가 펩티드-결합 분석에서 스크리닝될 수 있다. 펩티드-결합 스캔은 결합 멤버가 결합하는 펩티드의 세트를 (예를 들어 ELISA를 사용하여) 확인하고, 결합 멤버에 의해 결합된 잔기의 풋프린트 (footprint)를 결정하기 위해서 펩티드를 정렬하는 것을 수반할 수 있고, 여기서 펩티드는 IgE의 단편 (예를 들어 IgE의 약 5, 10 또는 15개의 인접하는 잔기의 펩티드)에 대응하는 아미노산 서열을 갖고, 풋프린트는 중복 펩티드에 공통적인 잔기를 포함한다.
별법으로 또는 추가로, 펩티드-결합 스캔 방법은 적어도 제시된 신호:노이즈 비로 결합 멤버가 결합하는 펩티드의 확인을 수반할 수 있다. 결합의 결정에 적합한 펩티드-결합 스캔 방법에 대한 상세한 내용은 당업계에 알려져 있다. 당업계에 공지되어 있고 항체에 의해 결합되는 잔기의 결정, 및/또는 펩티드-결합 스캔 결과의 확인에 사용될 수 있는 다른 방법은 부위 지정 돌연변이 유발, 수소 중수소 교환, 질량분광법, NMR, 및 X-선 결정술을 포함한다.
본 발명의 결합 멤버는 IgE 변이체에 대한 결합 및/또는 중화가 가능하거나 가능하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명의 결합 멤버는 FcεRII를 동시에 억제하거나 억제하지 않으면서 IgE 변이체의 FcεRI에 대한 결합을 억제할 수 있거나 억제할 수 없다.
예를 들어 단리된 펩티드 단편 또는 이를 포함하는 폴리펩티드로서 IgE의 선형 에피토프 서열이 본 발명의 결합 멤버의 확인, 생성, 단리 및/또는 시험을 위해 사용될 수 있다.
아래에서 보다 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명에 따른 결합 멤버는 높은 효능으로 IgE를 중화시키는 것으로 밝혀졌다. 중화는 IgE의 생물학적 활성의 억제를 의미한다. 본 발명의 결합 멤버는 IgE의 하나 이상의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있지만, 일반적으로 FcεRII에 대한 결합을 동시에 억제하거나 억제하지 않으면서 FcεRI에 대한 IgE 결합을 억제할 수 있다.
FcεRII를 동시에 억제하거나 억제하지 않으면서 FcεRI에 대한 IgE 결합을 중화시키는 것은 수용체의 생물학적 활성, 예를 들어 알레르겐-유도 비만세포 탈과립화의 함수로서 임의로 측정될 수 있다.
본 발명의 결합 멤버에 의한 IgE의 중화 측정에 적합한 분석은 예를 들어 리간드 수용체 생화학적 분석 및 표면 플라즈몬 공명 (SPR) (예를 들어, BIACORE)을 포함한다.
생물학적 활성의 억제는 부분적이거나 완전한 억제일 수 있다. 결합 멤버는 결합 멤버 부재시의 활성의 100％, 또는 별법으로 적어도 95％, 적어도 90％, 적어도 85％, 적어도 80％, 적어도 75％, 적어도 70％, 적어도 60％, 또는 적어도 50％까지 IgE 생물학적 활성, 예를 들어 수용체 결합 또는 비만세포 탈과립화를 억제할 수 있다.
결합 멤버의 중화 효능은 달리 나타내지 않으면 보통 IC50 값 (nM)으로 표현된다. 기능적 분석에서, IC50은 생물학적 반응을 그의 최대치의 50％까지 저하시키는 결합 멤버의 농도이다. 리간드-결합 연구에서, IC50은 수용체 결합을 최대의 특이적 결합 수준의 50％까지 저하시키는 농도이다. IC50은 최대의 생물학적 반응률(％)을 결합 멤버 농도의 로그의 함수로서 플로팅하고, IC50 값을 생성시키기 위해 S자형 함수를 데이타에 피팅하기 위한 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 Prism (GraphPad)를 사용하여 계산할 수 있다. 효능은 당업자에게 공지되고/되거나 본원에서 설명되거나 언급되는 하나 이상의 분석을 사용하여 결정하거나 측정될 수 있다.
결합 멤버의 중화 효능은 기하평균 (geomean)으로서 표현될 수 있다. 본원에서 사용되는 기하평균 (기하 평균 (geometric mean)으로도 알려짐)은 밑수 10인 수로 다시 전환되는, 데이타 세트의 로그 값의 평균을 의미한다. 이것은 적어도 2 개의 측정치, 예를 들어 적어도 2, 바람직하게는 적어도 5, 보다 바람직하게는 적어도 10개의 반복 측정치를 필요로 한다. 당업자는 반복 측정치가 많을수록 기하평균 값이 더 정확할 것임을 이해할 것이다. 반복 측정치의 선택은 당업자의 판단에 의할 수 있다.
본원에서 설명되는 분석에서 결합 멤버에 의한 IgE 활성의 중화는 결합 멤버가 IgE에 결합하여 이를 중화시킴을 나타낸다. 결합 멤버의 IgE에 대한 결합을 결정하기 위해 사용될 수 있는 다른 방법은 ELISA, 웨스턴 블로팅 (Western blotting), 면역침전, 친화도 크로마토그래피 및 생화학적 분석을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 면역글로불린 E에 특이적인 단리된 결합 멤버가 제공되고, 혈청 내의 면역글로불린 E에 대한 상기 결합 멤버의 결합에 대한 IC50은 졸레어™보다 적어도 10배, 또는 별법으로 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 75배, 적어도 100배, 적어도 125배, 적어도 150배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배 또는 적어도 500배 더 낮다.
제1 종 (예를 들어 인간)의 IgE를 사용하는 분석에서 계산된 결합 멤버의 중화 효능은 두 종의 IgE에 대한 결합 멤버의 교차반응성 정도를 평가하기 위해서 유사한 조건 하에서 제2의 종 (예를 들어 사이노몰거스 원숭이)의 IgE를 사용하는 유사한 분석에서의 결합 멤버의 중화 효능과 비교할 수 있다. 별법으로, 교차반응성은 본원의 다른 부분에서 보다 상세하게 설명되는 경쟁 결합 분석에서 평가할 수 있다.
본 발명의 결합 멤버는 인간 이외의 다른 종의 IgE를 사용하는 유사한 분석에서보다 인간 IgE 결합 또는 생물학적 분석에서 더 큰 중화 효능을 가질 수 있다. 따라서, 인간 IgE를 사용하는 분석에서 결합 멤버의 중화 효능은 인간 이외의 다른 종의 IgE를 사용하는 유사한 분석에서보다 더 클 수 있다. 인간 IgE 결합 또는 생물학적 분석에서의 효능은 예를 들어 사이노몰거스 원숭이의 IgE를 사용하는 유사한 분석에서보다 약 5배 더 클 수 있거나, 또는 또다른 실시태양에서, 약 15 또는 20배 더 클 수 있다. 보다 구체적으로, 인간 RBL-ER51 칼슘 신호전달 분석에서의 효능은 25 ng/ml의 인간 IgE의 농도에 대해 결정되고, 유사한 조건 하에서 100 ng/ml의 사이노몰거스 IgE를 사용한 효능과 비교할 수 있다. 인간 IgE 및 사이노몰거스 IgE를 사용하는 유사한 RBL-ER51 칼슘 신호전달 분석에서 얻은 데이타의 예를 표 2b에 제시한다.
본 발명의 결합 멤버는 다른 종의 IgE보다 인간 IgE에 대해 더 강한 친화도를 가질 수 있다. 인간 IgE에 대한 결합 멤버의 친화도는 예를 들어 사이노몰거스 원숭이 IgE보다 약 5 또는 10배 더 강하거나, 또는 또다른 실시태양에서, 약 100배 더 강할 수 있다. 인간과 사이노몰거스 원숭이 IgE 모두에 대해 얻은 데이타의 예를 표 2a 및 b에 제시한다.
본 발명의 결합 멤버는 예를 들어 RBL-ER51 칼슘 신호전달 분석에서 25 ng/ml 농도의 인간 IgE를 사용할 때 IgE-중화 효능 또는 IC50이 약 10 nM 이하일 수 있다. 별법으로, IC50은 약 3 nM 미만이다. 다른 실시태양에서, IC50은 약 1 nM 미 만, 또는 약 0.5 nM 미만, 또는 약 0.2 nM 미만이다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 면역글로불린 E에 특이적인 단리된 결합 멤버가 제공되고, RBL-ER51 세포에서 25 ng/ml IgE에 의해 유도되는 칼슘 신호전달의 억제에 대한 결합 멤버의 IC50 기하평균은 1 nM 미만, 또는 별법으로 0.6 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.4 nM 미만, 0.3 nM 미만, 0.2 nM 미만 또는 0.1 nM 미만이다.
인간 IgE에 대한 IgE-결합 멤버의 결합 동역학 및 친화도 (평형 해리 상수 KD로 표현됨)는 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 (BIACORE)을 사용하여 결정할 수 있다. 본 발명의 결합 멤버는 보통 인간 IgE에 대한 친화도 (KD)가 약 10 nM 미만이고, 일부 실시태양에서, 약 5 nM 미만, 다른 실시태양에서, 2 nM 미만이다. 사이노몰거스 원숭이 IgE에 대한 친화도는 보통 약 20 nM 미만, 일부 실시태양에서, KD는 약 10 nM 미만이다.
많은 방법이 그의 항원에 대한 항체의 결합 친화도 측정에 이용가능하고, 상기 방법의 하나는 KinExA이다. KinExA (Kinetic Exclusion Assay)는 항원/항체 상호작용에 대한 평형 해리 상수, 및 회합 및 해리 속도 상수를 측정할 수 있는 범용 면역분석 플랫폼 (기본적으로 유동 분광형광계)이다. KinExA는 평형이 달성된 후에 수행되기 때문에, 다가 항원/mAb 상호작용의 KD 측정에 사용하기 위한 유용한 기술이다. IgE 분자에 대한 항체의 결합은 다가 항원에 대한 결합의 예이다. KinExA는, 다가 항원이 1 초과의 항체 및 1 초과의 항원을 포함하는 항체 및 항원의 다량체가 형성됨을 의미하는 경우에 특히 적절하다. 상기 복잡한 상호작용 모 델에서, 정확한 KD 추정이 어려울 수 있다. KinExA 방법은 문헌 [Drake et al (2004) Analytical Biochemistry 328, 35-43]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. KinExA 방법에 의해 측정되는 바와 같이, 항체 11의 KD는 6.3 pM로서, 353 pM인 졸레어™의 KD보다 상당히 더 작다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, KinExA 방법을 사용하여 측정된 KD가 300 pM 이하인, 면역글로불린 E에 특이적인 단리된 결합 멤버가 제공된다. 별법으로, KD는 200 pM 이하, 100 pM 이하, 50 pM 이하, 20 pM 이하 또는 10 pM 이하이다.
생체 내의 내인성 IgE는 글리코실화될 수 있고, 따라서 글리코실화된 인간 IgE는 인간 치료를 위한 치료 표적이다. 세균에서 유도되고 글리코실화되지 않을 수 있는 재조합 인간 IgE가 본원에서 설명되는 분석에 사용될 수 있지만, 본 발명의 결합 멤버는 글리코실화된 인간 IgE, 예를 들어 골수종 세포주, 예를 들어 U266.B1에 의해 생산된 IgE에 결합할 수 있다. 이것은 글리코실화된 인간 IgE가 생체 내에서 인간에게 적용하기 위한 표적 항원이기 때문에 본 발명의 결합 멤버의 유의한 잇점을 나타낸다.
본 발명의 결합 멤버는 항체 분자, 바람직하게는 인간 항체 분자 또는 인간화 항체 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 항체 분자는 모노클로날 항체이다.
항원 결합 부위는 일반적으로 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 6개의 표 면 폴리펩티드 루프에 의해 형성된 항원 결합 계면과 함께 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 면역글로불린 도메인에 의해 형성된다. 프레임워크 구역 (FR)과 함께, 각각의 VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 각각의 VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) 내에 3개의 CDR이 존재한다.
본 발명의 결합 멤버는 보통 항체 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 본 발명의 VH 도메인은 HCDR의 세트를 포함하고, VL 도메인은 LCDR의 세트를 포함한다. 항체 분자는 VH CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인 및 프레임워크를 포함할 수 있다. 항체 분자는 별법으로 또는 추가로 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 VL 도메인 및 프레임워크를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 항체 VH 도메인 (서열 2, 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 288, 300, 및 306) 및 항체 VL 도메인 (서열 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378 및 380) 및 CDR (서열 3-5, 8-10, 13-15, 18-20, 23-25, 28-30, 33-35, 38-40, 43-45, 48-50, 53-55, 58-60, 63-65, 68-70, 73-75, 78-80, 83-85, 88-90, 93-95, 98-100, 103-105, 108-110, 113-115, 118-120, 123-125, 128-130, 133-135, 138-140, 143-145, 148-150, 153-155, 158-160, 163-165, 168-170, 173-175, 178-180, 183-185, 188-190, 193-195, 198-200, 203-205, 208-210, 213-215, 218-220, 223-225, 228-230, 233-235, 238-240, 243-245, 248-250, 253-255, 258-260, 263-265, 268-270, 273-275, 278-280, 283-285, 296- 298, 289-291, 296-298, 301-303, 307-309, 및 314-316)의 예를 본원의 일부를 구성하는 첨부하는 서열 목록에 제시한다 (또한, 표 3a 참조). 추가의 CDR을 아래 설명 및 표 1에 개시한다. 본원에 개시된 모든 VH 및 VL 서열, CDR 서열, CDR의 세트 및 HCDR의 세트 및 LCDR의 세트는 본 발명의 측면 및 실시태양을 나타낸다.
본원에서 설명되는 바와 같이, "CDR의 세트"는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 따라서, HCDR의 세트는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 나타내고, LCDR의 세트는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 나타낸다. 달리 언급되지 않으면, "CDR의 세트"는 HCDR 및 LCDR을 포함한다.
별법으로, 본 발명의 결합 멤버는 보통 하나 이상의 CDR, 예를 들어 아래에서 논의되는 바와 같은 비-항체 단백질 스캐폴드 내의 CDR의 세트에 의해 제공되는 항원 결합 부위를 비-항체 분자 내에 포함할 수 있다.
본원에서 설명되는 바와 같이, 표 1에 제시된 CDR 서열의 세트를 갖는 모 항체 분자를 단리하였다 (항체 1 참조). 최적 공정을 통해, 본 발명자들은 CDR 서열이 모 CDR 서열로부터 유도되고 표 1에 나타낸 위치에서 변형을 갖는, 2-28로 번호를 매긴 일군의 항체 클론을 생성시켰다. 따라서, 예를 들어, 항체 2는 모 HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 갖고, 카바트 (Kabat) 잔기 96이 S로 대체되고, 카바트 잔기 97이 L로 대체되고, 카바트 잔기 99가 S로 대체되고, 카바트 잔기 100이 A로 대체된 모 HCDR3 서열을 갖는다는 것을 표 1로부터 알 수 있다.
HCDR1이 서열 3 (카바트 잔기 31-35)이고, HCDR2가 서열 4 (카바트 잔기 50-65)이고, HCDR3이 서열 5 (카바트 잔기 95-102)이고, LCDR1이 서열 8 (카바트 잔기 24-34)이고, LCDR2가 서열 9 (카바트 잔기 50-56)이고, LCDR3이 서열 10 (카바트 잔기 89-97)인, 표 1에 제시된 바와 같은 CDR의 모 세트를 포함하는 결합 멤버 (항체 1)가 본원에서 설명된다. 또한, 본 발명에 따른 결합 멤버는 하나 이상의 CDR이 하나 이상의 아미노산 부가, 치환, 결실, 및/또는 삽입을 갖는, 표 1에 제시된 모 결합 멤버일 수 있다. 일부 실시태양에서, 결합 멤버는 항체 11의 모 서열에 비해 1 내지 10개의 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 CDR의 세트를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 항체 11에 비해 1 내지 10개의 치환이 존재한다. 또다른 실시태양에서, 항체 1의 모 서열에 비해 1 내지 11개의 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입이 존재한다. 또다른 실시태양에서, 항체 1에 비해 1 내지 10개의 치환이 존재한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 결합 멤버는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고; 여기서 HCDR3은 임의로 1 내지 5개의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 서열 5의 아미노산 서열을 갖고; LCDR3은 임의로 1 내지 6개의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 서열 10의 아미노산 서열을 갖는다. 상기 실시태양에서, HCDR1은 서열 3의 아미노산 서열을 가질 수 있고; HCDR2는 서열 4의 아미노산 서열을 가질 수 있고; LCDR1은 서열 8의 아미노산 서열을 가질 수 있고; LCDR2는 서열 9의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 별법으로, HCDR1, HCDR2, LCDR1, 및 LCDR2은 또한 총괄하여 모 서열 (항체 1)에 비해 하나 이상의 아미노산 부가, 치환, 결실, 및/또는 삽입, 예를 들어 1 내지 10개의 치환을 가질 수 있다.
본 발명의 결합 멤버는 본원에서 설명되는 CDR의 하나 또는 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합 멤버는 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1; 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2; 서열 5, 15, 25, 65, 75, 85, 95, 145, 155, 175, 및 255로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR3; 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1; 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2; 및 서열 10, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 및 280으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함할 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 결합 멤버 또는 VH 도메인은 하나 이상의 다음 치환이 존재하는 모 HCDR3 (서열 5)를 포함한다:
S, M, 또는 T로 대체된 카바트 잔기 96;
L 또는 G로 대체된 카바트 잔기 97;
K로 대체된 카바트 잔기 98;
S, W, A, T, 또는 E로 대체된 카바트 잔기 99;
A 또는 I로 대체된 카바트 잔기 100.
일부 실시태양에서, 결합 멤버, 또는 그의 VL 도메인은 카바트 잔기 94가 T, R, D, P, E, N, H, Q, 또는 A로 대체된 모 LCDR3 (서열 10)을 포함할 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 결합 멤버 또는 VL 도메인은 하나 이상의 다음 치환이 존재하는 모 LCDR3 (서열 10)을 포함한다:
T, R, D, P, E, N, H, Q, 또는 A로 대체된 카바트 잔기 94;
T, K, S, I, G, H, M, F, R, N, K 또는 Q로 대체된 카바트 잔기 95;
L, H, D, G, R, N, Q, K 또는 E로 대체된 카바트 잔기 95A;
T, H, S, Y, L 또는 N으로 대체된 카바트 잔기 95B;
G 또는 A로 대체된 카바트 잔기 96;
P, S 또는 G로 대체된 카바트 잔기 97.
한 실시태양에서, 본 발명은 HCDR1이 서열 103의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2가 서열 104의 아미노산 서열을 갖고, HCDR3이 서열 105의 아미노산 서열을 갖고, LCDR1이 서열 108의 아미노산 서열을 갖고, LCDR2가 서열 109의 아미노산 서열을 갖고, LCDR3이 서열 110의 아미노산 서열을 갖는 결합 멤버이다. 예를 들어, 표 1의 항체 11을 참고한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 인간 IgE에 결합하기 위해 본 발명의 항체, 예를 들어 표 1의 항체 11과 경쟁할 수 있는 결합 멤버, 예를 들어 항체 분자이고, 상기 결합 멤버는 본원에서 설명되는 분석에서 약 1 nM 미만의 IC50으로, 또는 약 0.5 nM 미만의 IC50으로 인간 IgE를 중화시킨다. 일부 실시태양에서, IC50은 약 0.2 nM 미만이다.
본 발명은 항체 1 내지 28 중 임의의 항체의 HCDR1 및/또는 HCDR2 및/또는 HCDR3 및/또는 항체 1 내지 28 중 임의의 항체의 LCDR1 및/또는 LCDR2 및/또는 LCDR3, 예를 들어 표 1에 제시된 항체 1 내지 28 중 임의의 항체의 CDR의 세트를 포함하는 결합 멤버를 제공한다. 결합 멤버는 상기 항체 중의 하나의 항체의 VH CDR의 세트를 포함할 수 있다. 임의로, 결합 멤버는 또한 상기 항체 중의 하나의 항체의 VL CDR의 세트를 포함할 수 있고, VL CDR은 VH CDR과 동일하거나 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 항체 1 내지 28 중 임의의 항체의 HCDR의 세트를 포함하는 VH 도메인, 및/또는 항체 1 내지 28 중 임의의 항체의 LCDR의 세트를 포함하는 VL 도메인도 본 발명에서 제공된다.
일반적으로, VH 도메인은 VL 도메인과 쌍을 이루어 항체 항원 결합 부위를 제공하지만, 아래에서 논의되는 바와 같이 항원 결합을 위해 VH 또는 VL 도메인이 단독으로 사용될 수 있다. 항체 1 VH 도메인 (표 1 참조)은 항체 1 VL 도메인과 쌍을 이루어, 항체 1 VH 및 VL 도메인을 모두 포함하는 항체 항원 결합 부위가 형성된다. 본원에서 개시되는 다른 VH 및 VL 도메인에 대한 유사한 실시태양이 제공된다. 다른 실시태양에서, 항체 1 VH는 항체 1 VL 이외의 다른 VL 도메인과 쌍을 이룬다. 경쇄 뒤섞임 (promiscuity)은 당업계에 잘 확립되어 있다. 다시, 본원에서 개시되는 다른 VH 및 VL 도메인에 대한 유사한 실시태양이 본 발명에서 제공된다. 따라서, 모 항체 또는 항체 2 내지 28 중의 임의의 항체의 VH가 모 항체 또는 항체 2 내지 28 중의 임의의 항체의 VL과 쌍을 이룰 수 있다.
결합 멤버는 H 및/또는 L CDR의 개시된 세트 내에 20, 16, 10, 또는 9개 이하, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 부가, 치환, 결실, 및/또는 삽입이 존재하는, 모 항체 또는 항체 2 내지 28 중의 임의의 항체의 H 및/또는 L CDR의 세트를 포함할 수 있다. 별법으로, 결합 멤버는 H 및/또는 L CDR의 개시된 세트 내에 20, 16, 10, 또는 9개 이하, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환이 존재하는, 모 항체 또는 항체 2 내지 28 중의 임의의 항체의 H 및/또는 L CDR의 세트를 포함할 수 있다. 상기 변형은 CDR의 세트 내의 임의의 잔기에서 만들어질 수 있다. 예를 들어, 변형은 표 1에 제시된 항체 2 내지 28 중의 임의의 항체에서 변형된 위치에서 이루어질 수 있다. 따라서, 하나 이상의 변형은 다음 잔기에서 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다: HCDR 내의 카바트 잔기 96, 97, 98, 99, 및 100; 및 LCDR 내의 카바트 잔기 94, 95, 95A, 95B, 96, 및 97.
결합 멤버는 항체 프레임워크 내에 하나 이상의 CDR, 예를 들어 CDR의 세트를 갖는 항체 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체의 하나 이상의 CDR 또는 CDR의 세트는 프레임워크 (예를 들어 인간 프레임워크)에 그라프팅 (grafting)되어 항체 분자를 제공할 수 있다. 프레임워크 구역은 인간 생식세포 유전자 서열에서 유도되거나, 또는 비-생식세포에서 유도 (germlining)될 수 있다. 따라서, 프레임워크는 생식세포에서 유도될 수 있고, 여기서 프레임워크 내의 하나 이상의 잔기는 가장 유사한 인간 생식세포 프레임워크 내의 동등한 위치에서 잔기를 일치시키도록 변경된다. 따라서, 본 발명의 결합 멤버는 인간 생식세포 프레임워크, 예를 들어 인간 생식세포 IgG VH 프레임워크에 HCDR의 세트를 포함하는 VH 도메인을 갖는 단리된 인간 항체 분자일 수 있다. 또한, 결합 멤버는 예를 들어 인간 생식세포 IgG VL 프레임워크에 LCDR의 세트를 포함하는 VL 도메인을 갖는다.
VH 및/또는 VL 프레임워크 잔기는 예를 들어 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여 본원에서 논의되고 예시된 바와 같이 변형될 수 있다. 본 발명에 따른 VH 또는 VL 도메인, 또는 상기 VL 도메인을 포함하는 결합 멤버는 바람직하게는 표 3 의 항체의 VH 및/또는 VL 도메인 서열을 갖는다.
비-생식세포에서 유도된 항체 분자는 생식세포에서 유도된 항체 분자에 비해 동일한 CDR을 갖지만, 프레임워크는 상이하다. 생식세포에서 유도된 항체는 상기 항체에 대해 본원에서 제시된 VH 및 VL 도메인 서열의 프레임워크 구역을 생식세포에서 유도함으로써 생산될 수 있다.
본 발명의 결합 멤버는, IgE에 결합하고 본원에 개시된 VH 및/또는 VL 도메인, CDR 예를 들어 HCDR3, 및/또는 CDR의 세트와 같은 결합 멤버를 포함하는 임의의 결합 멤버와 경쟁하는 것일 수 있다. 결합 멤버 사이의 경쟁은 예를 들어 ELISA를 사용하여 및/또는 동일한 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합하는 결합 멤버의 확인을 가능하게 하기 위해 특이적인 리포터 분자를 하나 이상의 다른 비태깅된 결합 멤버의 존재 하에 검출될 수 있는 하나의 결합 멤버에 태깅함으로써 시험관 내에서 쉽게 분석할 수 있다. 상기 방법은 당업자에게 알려져 있고, 본원에서 보다 상세하게 설명된다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면은 인간 IgE에 대한 결합을 위해 항체 분자, 예를 들어 특히 모 항체 또는 항체 1 내지 28 중 임의의 항체의 VH 및/또는 VL 도메인, CDR, 예를 들어 HCDR3 또는 CDR의 세트를 포함하는 항체 분자와 경쟁하는 인간 항체 항원 결합 부위를 포함하는 결합 멤버를 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명의 결합 멤버는 표 1의 항체 11과 경쟁한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 IgE의 특이적인 구역에 결합하는 결합 멤버를 제공한다. 예를 들어, 결합은 예를 들어 X-선 결정술을 사용하여 결정할 수 있는, 예를 들어 결합 멤버:IgE 복합체의 구조에서 결합 멤버와 IgE의 잔기 사이의 특이 적인 상호작용을 검출하거나 관찰함으로써 결정할 수 있다. X-선 결정술을 사용하여 결정된 인간 IgE Cε3-Cε4 도메인에 결합된 항체 11의 구조는 결정 내의 IgE와 항체 11 Fab의 두가지의 상호작용을 연구할 기회를 제공하였다. IgE는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄가 존재하기 때문에 2가 항원이다. X-선 결정학 연구는 에피토프에 결합된 Fab가 2개의 IgE 중쇄에 걸쳐 존재함을 보여주었다.
제1 상호작용은 항체 11의 상호작용 부위가 한 IgE 중쇄의 잔기 Glu390 내지 Asn394 및 당 모이어티 (moiety) GlcNAc1 및 Man6 및 다른 IgE 중쇄 내의 Leu340, Arg342, Ala428 내지 Thr434, Thr436, Ser437 및 Glu472 및 당 모이어티 Man 5를 포함함을 나타내었다.
본 발명의 한 실시태양에서, 면역글로불린 E에 특이적인 단리된 결합 멤버가 제공되고, 상기 결합 멤버는 제1 IgE 중쇄 내의 잔기 Glu390 내지 Asn394 및 제2 IgE 중쇄 내의 Leu340, Arg342, Ala428 내지 Thr434, Thr436, Ser437 및 Glu472를 포함하는 면역글로불린 E 내의 에피토프에 결합하고, 추가의 실시태양에서, 상기 에피토프는 제1 IgE 중쇄 내의 당 모이어티 GlcNAc1 및 Man6 및 제2 IgE 중쇄 내의 당 모이어티 Man 5를 추가로 포함한다.
제2 상호작용은 항체 11의 상호작용 부위가 제1 IgE 중쇄 내의 잔기 Glu390, Gln392 내지 Asn394 및 당 모이어티 GlcNAc1 및 Man6 및 제2 IgE 중쇄 내의 Leu340, Arg342, Ala428 내지 Thr434, Thr436, Ser437 및 Glu472를 포함함을 나타내었다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 면역글로불린 E에 특이적인 단리된 결합 멤 버가 제공되고, 상기 결합 멤버는 제1 IgE 중쇄 내의 잔기 Glu390, Gln392 내지 Asn394 및 제2 IgE 중쇄 내의 Leu340, Arg342, Ala428 내지 Thr434, Thr436, Ser437 및 Glu472를 포함하는 면역글로불린 E 내의 에피토프에 결합하고, 추가의 실시태양에서, 상기 에피토프는 제1 IgE 중쇄 내의 당 모이어티 GlcNAc1 및 Man6을 추가로 포함한다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 면역글로불린 E에 특이적인 단리된 결합 멤버가 제공되고, 상기 결합 멤버는 제1 IgE 중쇄 내의 잔기 Glu390, Gln392 내지 Asn393 및 제2 IgE 중쇄 내의 Leu340, Arg342, Ala428 내지 Thr434, Thr436, Ser437 및 Glu472를 포함하는 면역글로불린 E 내의 에피토프에 결합하고, 추가의 실시태양에서, 상기 에피토프는 제1 IgE 중쇄 내의 당 모이어티 GlcNAc1 및 Man6을 추가로 포함한다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 제1 IgE 중쇄로부터의 성분 및 제2 IgE 중쇄로부터의 성분을 포함하는 에피토프에 결합하는, 면역글로불린 E에 특이적인 단리된 결합 멤버가 제공된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 인간 IgE에 결합하기 위해 항체 항원 결합 부위와 경쟁하는 인간 항체 항원 결합 부위를 포함하는 결합 멤버를 제공하고, 여기서 항체 항원 결합 부위는 VH 도메인 및 VL 도메인으로 이루어지고, VH 및 VL 도메인은 본원에 개시된 모 항체 (항체 1), 또는 항체 2 내지 28 중의 임의의 항체의 CDR의 세트를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 멤버, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 예를 들어, 서열 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191, 201, 211, 221, 231, 241, 251, 261, 271, 281, 287, 299, 및 305는 본 발명의 예시적인 VH 도메인을 코딩하고, 서열 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377 및 379는 본 발명의 예시적인 VL 도메인을 코딩한다. 또한, 본 발명은 상기 결합 멤버, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 생산하는 조건 하에서 상기 핵산을 발현시키고, 결합 멤버를 단리하거나 정제함으로써 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 결합 멤버, VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 제조 방법을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 본원에 개시된 VH CDR 또는 VL CDR 서열을 코딩하는, 일반적으로 단리된 핵산을 제공한다.
다른 측면은 본 발명의 핵산을 함유하거나 본 발명의 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 결합 멤버를 함유하는 조성물, 및 요법에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법을 포함하는, IgE의 억제 및/또는 중화 방법에서의 그의 용도를 제공한다.
예를 들어, 본 발명에 따른 결합 멤버는 인간 또는 동물 신체 (예를 들어, 인간 환자)에서, 또는 시험관 내에서 생물학적 반응, 질병, 질환, 또는 병태의 치료 및/또는 예방 방법에 사용되거나, 또는 진단 방법에 사용될 수 있다.
치료 및/또는 예방 방법은 IgE를 측정가능하게 중화시키기에 충분한 양의 본 발명의 결합 멤버를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 치료가능한 병태는 IgE가 기능하는 임의의 병태, 예를 들어 알레르기 및 천식을 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 측면을 아래에서 보다 상세하게 설명한다.
본원에서 사용되는 "및/또는"은 2개의 제시된 특징 또는 성분이 각각 다른 특징 또는 성분과 함께 존재하거나 또는 다른 특징 또는 성분이 배제된 상태로 존재함을 구체적으로 나타내는 것으로서 이해되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 마치 그 각각이 본원에 개별적으로 제시된 것처럼 각각 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B를 구체적으로 나타내는 것으로서 이해되어야 한다.
IgE는 면역글로불린 E이다. 인간 IgE 불변 구역의 아미노산 서열은 공개적으로 입수가능하다. 일부 실시태양에서, IgE는 인간 또는 사이노몰거스 원숭이 IgE일 수 있다. 본원의 다른 부분에서 설명되는 바와 같이, IgE는 재조합체일 수 있고/있거나 글리코실화된 또는 비글리코실화될 수 있다. IgE는 예를 들어 U266.B1 세포에서 글리코실화된 형태로 생체 내에서 천연적으로 발현된다. 또한, 글리코실화된 IgE는 재조합 시스템에서 발현될 수도 있다.
결합 멤버는 일반적으로 서로 결합하는 한쌍의 분자의 한 멤버를 의미한다. 결합쌍의 멤버는 자연에서 유도되거나 또는 완전히 또는 부분적으로 합성에 의해 생산될 수 있다. 분자쌍의 한 멤버는 그 분자쌍의 다른 멤버에 결합하고 다른 멤버의 특정 공간적 및 극성 구조에 상보성인, 그의 표면 상의 영역 또는 공간을 갖 는다. 결합쌍 종류의 예는 항원-항체, 비오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 효소-기질이다. 본 발명은 일반적으로 항원-항체 종류의 반응과 관련이 있다.
결합 멤버는 보통 항원 결합 부위를 갖는 분자를 포함한다. 예를 들어, 결합 멤버는 항체 분자 또는 항원 결합 부위를 포함하는 비-항체 단백질일 수 있다.
항원 결합 부위는 비-항체 단백질 스캐폴드, 예를 들어 피브로넥틴 또는 시토크롬 B 등 상에 CDR을 배열하거나 [1, 2, 3], 또는 목적하는 표적에 대한 결합 특이성을 부여하기 위해서 단백질 스캐폴드 내의 루프의 아미노산 잔기를 무작위화시키거나 돌연변이시킴으로써 제공될 수 있다. 단백질 내의 신규한 결합 부위를 공학처리하기 위한 스캐폴드는 문헌에서 상세하게 논의되었다 (Nygren et al. [3]). 항체 모방체에 대한 단백질 스캐폴드는 그 전부가 본원에 참고로 포함된 WO/0034784에 개시되어 있고, 여기서 발명자들은 적어도 하나의 무작위화된 루프를 갖는 피브로넥틴 타입 III 도메인을 포함하는 단백질 (항체 모방체)을 설명하였다. 하나 이상의 CDR, 예를 들어 HCDR의 세트를 그 내부에 그라프팅하기 위한 적합한 스캐폴드는 면역글로불린 유전자 거대부류의 임의의 도메인 멤버에 의해 제공될 수 있다. 스캐폴드는 인간 또는 비-인간 단백질일 수 있다. 비-항체 단백질 스캐폴드의 잇점은 적어도 몇몇의 항체 분자보다 더 작고/작거나 제조가 더 용이한 항원 결합 부위를 스캐폴드 분자에 제공할 수 있다는 점이다. 결합 멤버의 작은 크기는 유용한 생리학적 특성, 예를 들어 세포에 도입되거나, 조직에 깊이 투과되거나 다른 구조 내의 표적에 도달하거나 또는 표적 항원의 단백질 공간 내에 결합하는 능 력을 부여할 수 있다. 비-항체 단백질 스캐폴드에 항원 결합 부위를 이용하는 것은 문헌에 기재되어 있다 (Wess, 2004 [4]). 루프 또는 루프들의 아미노산 서열이 표적 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 생성시키기 위해 특이적으로 또는 무작위하게 돌연변이된, 안정한 백본 및 하나 이상의 가변 루프를 갖는 단백질이 일반적이다. 상기 단백질은 에스. 아우레우스 (S. aureus)의 단백질 A의 IgG-결합 도메인, 트랜스페린, 테트라넥틴, 피브로넥틴 (예를 들어 10번째 피브로넥틴 타입 III 도메인), 리포칼린 및 감마-결정 및 다른 Affilin™ 스캐폴드 (실 프로테인즈 (Scil Proteins))를 포함한다. 다른 방안의 예는 분자내 디술피드 결합을 갖는 작은 단백질인 시클로티드계의 합성 "마이크로바디 (Microbody)", 마이크로단백질 (Microprotein) (Versabodies™, 아뮤닉스 (Amunix)) 및 안키린 반복 단백질 (DARPins, 몰레큘라 파트너스 (Molecular Partners))을 포함한다. 또한, 상기 단백질은 작은, 공학적으로 처리된 단백질 도메인, 예를 들어 면역-도메인을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 공개 2003082630 및 2003157561 참조). 면역-도메인은 항체의 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유한다.
항체 서열 및/또는 항원 결합 부위에 추가로, 본 발명에 따른 결합 멤버는 예를 들어 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어 폴딩된 도메인을 형성하거나, 또는 항원에 결합하는 능력 이외의 다른 기능적 특성을 분자에 부여하는 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 결합 멤버는 검출가능한 표지를 가질 수 있거나, 또는 독소 또는 표적화 모이어티 또는 효소에 (예를 들어, 펩티딜 결합 또는 링커를 통해) 컨쥬게이팅될 수 있다. 예를 들어, 결합 멤버는 촉매 부위 (예를 들어 효소 도메인 내의) 및 항원 결합 부위를 포함할 수 있고, 여기서 항원 결합 부위는 항원에 결합하여 촉매 부위를 항원에 표적화시킨다. 촉매 부위는 항원의 생물학적 기능을, 예를 들어 절단에 의해 억제할 수 있다.
CDR은 비-항체 스캐폴드에 의해 담지될 수 있지만, 본 발명의 CDR 또는 CDR의 세트를 담지하기 위한 구조체는 일반적으로 CDR 또는 CDR의 세트가 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 자연 발생 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR 또는 CDR의 세트에 대응하는 위치에 위치하는 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 그의 실질적인 부분일 것이다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 문헌 ([Kabat, et al., 1987 [5]], 및 임의의 인터넷 검색 엔진을 사용하여 "카바트"로 찾을 수 있는 그의 최신 개정판)에 따라 결정할 수 있다.
CDR 구역 또는 CDR은 문헌 (Kabat et al. 1991 [6] 및 및 추후 편집본)에 의해 규정된 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 초가변 구역을 나타내고자 한 것이다. 항체는 일반적으로 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함한다. 용어 CDR(들)은 상황에 따라 상기 구역의 하나, 또는 항원 또는 항체가 인식하는 에피토프에 대한 항체의 친화도에 의한 결합을 책임지는 대다수의 아미노산 잔기를 포함하는 상기 구역의 일부 또는 심지어 전체를 나타내기 위해 본원에서 사용된다.
6개의 짧은 CDR 서열 중에서, 중쇄의 제3 CDR (HCDR3)은 보다 큰 크기 가변성 (본질적으로 그를 생성시키는 유전자의 정렬 메카니즘에 의한 보다 큰 다양성)을 갖는다. 이것은 알려진 가장 긴 크기가 26개 아미노산이지만, 2개의 아미노산만큼 짧을 수 있다. 또한, CDR 길이는 기초를 이루는 특정 프레임워크에 의해 수 용될 수 있는 길이에 따라 상이할 수 있다. 기능적으로, HCDR3은 항체의 특이성 결정시에 일정 역할을 수행한다 [참고문헌 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 참조]. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 표 3a으로부터 선택되는 HCDR3 서열을 포함하는 단리된 결합 멤버가 제공된다.
항체 분자는 천연 면역글로불린 또는 부분적으로 또는 완전히 합성에 의해 생산된 면역글로불린을 의미한다. 또한, 이것은 항체 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포괄한다. 본 발명이 천연 형태의 항체에 관한 것이 아님을 이해하여야 한다. 즉, 항체는 천연 환경에 존재하지 않지만, 천연 공급원으로부터 단리되거나 정제에 의해 얻거나, 또는 유전자 재조합에 의해, 또는 화학적 합성, 예를 들어 비천연 아미노산을 사용한 변형에 의해 얻는다. 항체 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb 및 Fd와 같은 분자를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어 Fab2, Fab3, 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody) 및 미니바디 (minibody)를 포함하여 하나 이상의 항체 항원 결합 부위를 포함하는 다양한 다른 항체 분자가 공학적으로 처리되었다. 항체 분자 및 그의 제조 및 사용 방법이 문헌 [15]에 기재되어 있다.
모노클로날 및 다른 항체를 사용하고, 표적 항원에 결합하는 다른 항체 또는 키메라 (chimera) 분자를 생산하기 위해 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 상기 기술은 면역글로불린 가변 구역, 또는 항체의 CDR을 코딩하는 DNA를, 상이한 면역 글로불린의 불변 구역, 또는 불변 구역 + 프레임워크 구역에 도입하는 것을 수반할 수 있다 (예를 들어, EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400, 및 후속 문헌 참조). 하이브리도마 또는 항체를 생산하는 다른 세포에는 유전자 돌연변이 또는 다른 변화가 적용될 수 있고, 이것은 생산된 항체의 결합 특이성을 변경시키거나 변경시키지 않을 수 있다.
항체는 많은 방식으로 변경될 수 있기 때문에, 용어 "항체 분자"는 항원에 대한 요구되는 특이성 및/또는 결합을 갖는, 항체 항원 결합 부위를 갖는 임의의 결합 멤버 또는 물질을 포괄하는 것으로서 간주되어야 한다. 따라서, 이 용어는 천연 또는 완전히 또는 부분적으로 합성된, 항체 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함하는 항체 단편 및 유도체를 포괄한다. 다른 폴리펩티드 (예를 들어, 다른 종으로부터 유도되거나 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는)에 융합된 항체 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 분자가 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023, 및 후속 문헌에 기재되어 있다.
항체의 공학 처리 분야에서 이용가능한 추가의 기술을 사용하여 인간 및 인간화 항체를 단리할 수 있다. 예를 들어, 인간 하이브리도마는 문헌 (Kontermann & Dubel [16])에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 결합 멤버 생성을 위해 확립된 다른 기술인 파지 디스플레이가 많은 간행물, 예를 들어 문헌 (Kontermann & Dubel [16]) 및 WO92/01047 (아래에서 추가로 논의됨), 및 미국 특허 US 5,969,108, US,5,565,332, US 5,733,743, US 5,858,657, US 5,871,907, US 5,872,215, US 5,885,793, US 5,962,255, US 6,140,471, US 6,172,197, US 6,225,447, US 6,291,650, US 6,492,160 및 US 6,521,404에 상세하게 기재되어 있다.
마우스 면역계의 다른 성분을 무손상 상태로 유지하면서 마우스 항체 유전자가 불활성화되고 인간 항체 유전자로 기능적으로 대체된 트랜스제닉 (transgenic) 마우스가 인간 항체를 단리하기 위해 사용될 수 있다 [17]. 인간화 항체는 예를 들어 WO91/09967, US 5,585,089, EP592106, US 5,565,332 및 WO93/17105에 개시되어 있는 것과 같은, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 또한, WO2004/006955에는 비-인간 항체의 가변 구역의 CDR 서열에 대한 정규 (canonical) CDR 구조 유형을 인간 항체 서열의 라이브러리, 예를 들어 생식세포 항체 유전자 세그먼트로부터 대응하는 CDR에 대한 정규 CDR 구조 유형과 비교함으로써, 인간 항체 유전자로부터 가변 구역 프레임워크 서열을 선택하는 것을 기초로 하여 항체를 인간화하는 방법이 기재되어 있다. 비-인간 CDR과 유사한 정규 CDR 구조 유형을 갖는 인간 항체 가변 구역은 인간 프레임워크 서열이 그로부터 선택되는 인간 항체 서열의 서브세트를 형성한다. 서브세트 멤버는 인간과 비-인간 CDR 서열 사이의 아미노산 유사성에 의해 추가로 평가될 수 있다. WO2004/006955의 방법에서, 선택된 서브세트 멤버 인간 프레임워크를 사용하여 인간 CDR 서열을 비-인간 CDR 대응물로 기능적으로 대체한 키메라 항체를 제조하기 위한 프레임워크 서열을 제공함으로써, 비-인간 항체와 인간 항체 사이의 프레임워크 서열을 비교할 필요 없이 고 친화도 및 저 면역원성의 인간화 항체를 제공하기 위해 가장 우수한 인간 서열이 선택된다. 또한, 상기 방법에 따라 제조된 키메라 항체가 개시된다.
합성 항체 분자는 예를 들어 문헌 (Knappik et al. [18] 또는 Krebs et al. [19])에 기재된 바와 같이 합성되어 적합한 발현 벡터 내에 조립된 올리고뉴클레오티드에 의해 생성된 유전자로부터의 발현에 의해 생성될 수 있다.
전체 항체의 단편이 결합 항원의 기능을 수행할 수 있음이 밝혀졌다. 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, 불변 경쇄 도메인 (CL) 및 불변 중쇄 도메인 1 (CH1) 도메인으로 구성된 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb 단편 [20, 21, 22]; (v) 단리된 CDR 구역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 2개의 도메인이 회합하여 항원 결합 부위를 형성하도록 허용하는 펩티드 링커에 의해 연결된 단일쇄 Fv 분자 (scFv) [23, 24]; (viii) 이중특이적 단일쇄 Fv 이량체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제조된 "디아바디", 다가 또는 다중특이적 단편 (WO94/13804; [25])이다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디술피드 다리의 도입에 의해 안정화될 수 있다 [26]. CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디도 제조할 수 있다 [27]. 결합 단편의 다른 예는 항체 힌지 구역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하여 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 몇개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이한 Fab', 및 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab' 단편인 Fab'-SH이다.
본 발명의 항체 단편은 모 항체 분자 또는 항체 분자 1 내지 28 중의 임의의 항체 분자로부터 출발하여, 효소, 예를 들어 펩신 또는 파파인에 의한 소화 및/또는 화학적 환원에 의한 디술피드 다리의 절단에 의한 것과 같은 방법에 의해 얻을 수 있다. 다른 방법에서, 본 발명에 포함되는 항체 단편은 당업자에게 공지된 유전자 재조합 기술에 의해 또는 예를 들어 자동 펩티드 합성기, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) 등과 같은 회사에 의해 공급되는 것에 의한 펩티드 합성에 의해 또는 핵산 합성 및 발현에 의해 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 기능성 항체 단편은 그의 반감기가 화학적 변형, 특히 PEG화에 의해, 또는 리포좀 내로의 도입에 의해 증가되는 임의의 기능성 단편을 포함한다.
dAb (도메인 항체)는 항체의 작은 단량체 항원 결합 단편, 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 구역이다 [22]. VH dAb는 카멜리드 (camelid) (예를 들어 낙타, 라마)에서 자연 발생하고, 카멜리드를 표적 항원으로 면역처리하고, 항원-특이적 B 세포를 단리하고, 개별적인 B 세포로부터 dAb 유전자를 직접 클로닝함으로써 생산될 수 있다. 또한, dAb는 세포 배양에서 생산될 수도 있다. 그의 작은 크기, 우수한 용해도 및 온도 안정성 때문에, dAb는 특히 생리학적으로 유용하고 선택 및 친화도 성숙에 적합하다. 카멜리드 VH dAb가 "나노바디™"의 명칭 하에 치료 용도를 위해 개발되고 있다. 본 발명의 결합 멤버는 실질적으로 본원에서 제시된 VH 또는 VL 도메인, 또는 실질적으로 본원에서 제시된 CDR의 세트를 포함하는 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 dAb일 수 있다.
이중특이적 또는 2기능성 항체는 2개의 상이한 가변 구역이 동일한 분자에서 조합된, 2차적으로 생성된 모노클로날 항체이다 [28]. 그의 용도는 새로운 효과기 기능을 보충하거나 또는 종양 세포 표면 상의 몇개의 분자를 표적화하는 그의 능력에 의해 진단 분야 및 치료 분야 모두에서 입증되었다. 이중특이적 항체가 사용되어야 하는 경우에, 이들은 다양한 방식으로 제조될 수 있고 [29], 예를 들어 화학적으로 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있는 종래의 이중특이적 항체일 수 있거나, 또는 상기한 임의의 이중특이적 항체 단편일 수 있다. 상기 항체는 화학적 방법 [30, 31] 또는 체세포 (somatic) 방법 [32, 33]에 의해, 그러나 우선적으로 이종이량체화 (heterodimerization)를 강제하여 탐색하는 항체의 정제 공정을 용이하게 할 수 있는 유전공학 기술 [34]에 의해 얻을 수 있다. 이중특이적 항체의 예는 특이성이 상이한 2개의 항체의 결합 도메인이 사용되고 짧은 가요성 펩티드를 통해 직접 연결될 수 있는 BiTE™ 기술의 항체를 포함한다. 이것은 2개의 항체를 짧은 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 조합한다. 디아바디 및 scFv는 Fc 구역 없이 가변 도메인만을 사용하여 제조될 수 있고, 잠재적으로 항-개별특이형 반응의 효과를 저하시킬 수 있다.
이중특이적 항체는 전체 IgG, 이중특이적 Fab'2, Fab'PEG, 디아바디 또는 이중특이적 scFv로서 제조할 수 있다. 또한, 2개의 이중특이적 항체는 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 연결되어 4가 항체를 형성할 수 있다.
또한, 이중특이적 전체 항체와 달리, 이중특이적 디아바디는 특히 이. 콜라 이 (E. coli)에서 쉽게 제조되어 발현될 수 있기 때문에 유용할 수 있다. 적절한 결합 특이성의 디아바디 (및 많은 다른 폴리펩티드, 예를 들어 항체 단편)는 라이브러리로부터 파지 디스플레이 (WO94/13804)를 사용하여 쉽게 선택될 수 있다. 예를 들어 IgE에 대해 작용하는 특이성을 갖는 디아바디의 한 아암 (arm)이 일정하게 유지되어야 할 경우에, 다른 아암이 변경되고 적절한 특이성의 항체가 선택되는 라이브러리가 제조될 수 있다. 이중특이적 전체 항체는 문헌 (Ridgeway et al., 1996 [35])에 기재된 바와 같은 다른 공학적 방법에 의해 제조될 수 있다.
IgE에 대해 작용하는 항체를 얻기 위한 다양한 방법이 당업계에서 이용가능하다. 항체는 모노클로날 항체, 특히 인간, 쥐, 키메라 또는 인간화 항체 기원의 모노클로날 항체일 수 있고, 당업자에게 공지된 표준 방법에 따라 얻을 수 있다.
일반적으로, 특히 뮤린 기원의 모노클로날 항체 또는 그의 기능성 단편의 제조를 위해, 특히 매뉴얼 ("Antibodies" [36])에 기재된 기술 또는 문헌 (Koehler and Milstein [37])에 기재된 하이브리도마로부터의 제조 기술을 참고할 수 있다.
모노클로날 항체는 예를 들어 IgE, 또는 상기 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 그의 단편의 하나에 대해 면역처리된 동물 세포로부터 얻을 수 있다. 적합한 단편 및 펩티드 또는 이를 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 동물을 면역처리함으로써 IgE에 대해 작용하는 항체를 생성시킬 수 있다. 상기 IgE, 또는 그의 단편의 하나는 특히 통상적인 실행 방법에 따라, IgE 또는 그의 단편을 코딩하는 cDNA 서열에 함유된 핵산 서열로 출발하는 유전자 재조합에 의해, IgE 및/또는 그의 단편의 펩티드 서열에 포함된 아미노산의 서열로부터 출발하는 펩티드 합성에 의해 생산될 수 있다.
모노클로날 항체는 예를 들어 IgE 또는 상기 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 그의 단편의 하나가 그 위에 사전에 고정된 친화도 컬럼에서 정제될 수 있다. 보다 특히, 모노클로날 항체는 단백질 A 및/또는 G에 대한 크로마토그래피에 의해 정제된 후, 잔류 단백질 오염물 및 DNA 및 LPS 자체를 제거하기 위해 이온-교환 크로마토그래피를 수행할 수 있거나 하지 않을 수 있고, 이어서 이량체 또는 다른 다량체의 존재에 의한 잠재적인 응집체를 제거하기 위해 세파로스 겔에 대한 배제 크로마토그래피를 수행할 수 있거나 하지 않을 수 있다. 한 실시태양에서, 상기 전체 기술은 동시에 또는 연속적으로 사용될 수 있다.
항원 결합 부위는 표적 항원의 전부 또는 일부에 결합하고 상보성인 분자의 일부이다. 항체 분자에서, 항원 결합 부위는 항체 항원 결합 부위로 언급되고, 표적 항원의 전부 또는 일부에 결합하고 상보성인 항체 부분을 포함한다. 항원이 큰 경우, 항체는 에피토프로 불리는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있다. 항체 항원 결합 부위는 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 항체 항원 결합 부위는 항체 경쇄 가변 구역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 구역 (VH)을 포함할 수 있다.
"단리된"은 본 발명의 결합 멤버, 또는 상기 결합 멤버를 코딩하는 핵산이 일반적으로 본 발명에 따른 상태임을 의미한다. 따라서, 예를 들어 그의 자연 환경으로부터 실질적으로 순수한 또는 균질한 형태로 단리 및/또는 정제된, 또는 핵산의 경우에 요구되는 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 이외의 다른 기원 의 핵산 또는 유전자가 존재하지 않거나 실질적으로 존재하지 않는, 결합 멤버, VH 및/또는 VL 도메인, 및 본 발명에 따른 코딩 핵산 분자 및 벡터가 제공될 수 있다. 단리된 멤버 및 단리된 핵산에는 자연에서 함께 회합되는 물질, 예를 들어 자연 환경, 또는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 실시되는 재조합 DNA 기술에 의해 그들이 제조되는 환경 (예를 들어, 세포 배양액)에서 함께 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 존재하지 않거나 또는 실질적으로 존재하지 않을 것이다. 멤버 및 핵산은 희석제 또는 어쥬번트 (adjuvant)와 함께 제제화될 수 있고, 실제 목적을 위해 계속 단리될 수 있다 - 예를 들어, 멤버는 면역분석에 사용하기 위한 미량역가판의 코팅에 사용될 경우 보통 젤라틴 또는 다른 담체와 혼합될 것이거나, 또는 진단 또는 요법에 사용될 때 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 혼합될 것이다. 결합 멤버는 자연상태에서 또는 이종성 진핵세포 (예를 들어 CHO 또는 NSO (ECACC 85110503) 세포)의 시스템에 의해 글리코실화될 수 있거나, 또는 (예를 들어, 원핵세포 내에서의 발현에 의해 생산될 경우) 비글리코실화될 수 있다.
또한, 항-IgE 항체 분자를 포함하는 이종성 제제도 본 발명의 일부를 형성한다. 예를 들어, 상기 제제는 상이한 글리코실화 수준 및/또는 유도체화된 아미노산, 예를 들어 피로글루탐산 잔기를 형성하는 N-말단 글루탐산의 고리화를 갖는 전장 중쇄 및 C-말단 라이신이 결여된 중쇄를 갖는 항체의 혼합물일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 구문 "실질적으로 제시된 바와 같은"은 본원에서 설명되는 결합 멤버의 VH 또는 VL 도메인의 관련 CDR의 특성(들)이, 그 서열이 본원에서 제시된 특정 구역과 동일하거나 매우 유사함을 나타낸다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 하나 이상의 가변 도메인의 특정 구역(들)에 대해서 구문 "매우 유사한"은 1 내지 약 6개, 예를 들어 1 내지 5개, 예를 들어 1 내지 3개, 또는 1 또는 2개, 또는 3 또는 4개의 아미노산 치환이 CDR 및/또는 VH 또는 VL 도메인에 형성될 수 있음을 고려한 것이다.
상기에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 결합 멤버는 IgE의 생물학적 활성을 조정하고 중화시킬 수 있다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 본 발명의 IgE-결합 멤버는 중화 효능을 위해 최적화될 수 있다. 일반적으로, 효능 최적화는 선택된 결합 멤버의 서열 (보통 항체의 가변 도메인 서열)을 돌연변이시켜 결합 멤버의 라이브러리를 생성시킨 후, 효능에 대해 분석하고, 보다 효능이 큰 결합 멤버를 선택하는 것을 수반한다. 이와 같이 선택된 "효능-최적화된" 결합 멤버는 그로부터 라이브러리가 생성된 결합 멤버보다 더 큰 효능을 갖는 경향이 있다. 그럼에도 불구하고, 높은 효능의 결합 멤버는 또한 최적화를 실시하지 않고도 얻을 수 있고, 예를 들어 높은 효능의 결합 멤버는 초기 스크리닝, 예를 들어 생화학적 중화 분석으로부터 직접 얻을 수 있다. "효능 최적화된" 결합 멤버는 특정 활성 또는 하류 (downstream) 기능의 중화에 대한 최적화된 효능을 갖는 결합 멤버를 의미한다. 분석 및 효능은 본원의 다른 부분에서 보다 상세하게 설명된다. 본 발명은 효능-최적화된 결합 멤버와 비-최적화된 결합 멤버를 모두 제공하고, 또한 선택된 결합 멤버로부터 효능 최적화를 위한 방법도 제공한다. 따라서, 본 발명을 통해 당업자는 높은 효능을 갖는 결합 멤버를 생성시킬 수 있다.
효능 최적화를 사용하여 제시된 결합 멤버로부터 보다 효능이 큰 결합 멤버를 생성시킬 수 있지만, 효능 최적화를 수행하지 않은 경우에도 높은 효능의 결합 멤버를 얻을 수 있음을 유의하여야 한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 멤버의 라이브러리와 상기 항원을 접촉시키고, 상기 항원에 결합할 수 있는 라이브러리의 하나 이상의 결합 멤버를 선택하는 것을 포함하는, 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 멤버를 얻는 방법을 제공한다.
라이브러리는 입자 또는 분자 복합체, 예를 들어 복제가능한 유전자 패키지, 예를 들어 효모, 세균 또는 박테리오파지 (예를 들어 T7) 입자, 바이러스, 세포 또는 공유, 리보좀 또는 다른 시험관 내 디스플레이 시스템 상에 디스플레이될 수 있고, 각각의 입자 또는 분자 복합체는 그 위에 디스플레이되는 항체 VH 가변 도메인 및 임의로 존재할 경우 디스플레이되는 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 함유한다. 파지 디스플레이는 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함된 WO 92/01047 및 예를 들어 미국 특허 US 5,969,108, US 5,565,332, US 5,733,743, US 5,858,657, US 5,871,907, US 5,872,215, US 5,885,793, US 5,962,255, US 6,140,471, US 6,172,197, US 6,225,447, US 6,291,650, US 6,492,160 및 US 6,521,404에 기재되어 있다.
항원에 결합할 수 있고 박테리오파지 또는 다른 라이브러리 입자 또는 분자 복합체 상에 디스플레이되는 결합 멤버의 선택 후에, 선택된 결합 멤버를 디스플레이하는 박테리오파지 또는 다른 입자 또는 분자 복합체로부터 핵산을 얻을 수 있다. 상기 핵산은 상기 선택된 결합 멤버를 디스플레이하는 박테리오파지 또는 다른 입자 또는 분자 복합체로부터 얻은 핵산의 서열과 함께 핵산의 발현에 의한 결합 멤버 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인의 후속 생산에 사용될 수 있다.
상기 VH 도메인을 포함하는 결합 멤버처럼, 상기 선택된 결합 멤버의 항체 VH 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 항체 VH 가변 도메인이 단리된 형태로 제공될 수 있다.
IgE에 결합하는 능력, 및 예를 들어 IgE에 결합하기 위해 모 항체 분자 또는 항체 분자 2 내지 28 (예를 들어 scFv 포맷 및/또는 IgG 포맷, 예를 들어 IgG1)과 경쟁하는 능력을 추가로 시험할 수 있다. 본원의 다른 부분에서 추가로논의되는 바와 같이, IgE를 중화시키는 능력을 시험할 수 있다.
본 발명에 따른 결합 멤버는 모 또는 다른 항체 분자, 예를 들어 scFv, 또는 항체 2 내지 28 중의 하나의 항체, 예를 들어 IgG1의 친화도로 또는 더 우수한 친화도로 IgE에 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 결합 멤버는 모 또는 다른 항체 분자, 항체 2 내지 28 중의 하나의 항체, 예를 들어 scFv, 또는 IgG1의 효능으로 또는 더 우수한 효능으로 IgE의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있다.
상이한 결합 멤버의 결합 친화도 및 중화 효능은 적절한 조건 하에 비교될 수 있다.
아미노산 서열이 본원에서 제시되고 IgE에 대한 결합 멤버에 사용될 수 있는 것을 포함하는, 본 발명의 VH 및 VL 도메인 및 CDR의 변이체는 서열 변경 또는 돌연변이 방법에 의해 얻을 수 있고, 목적하는 특성을 갖는 항원 결합 멤버를 스크리닝할 수 있다. 목적하는 특성의 예는 다음을 포함하고, 이로 제한되지 않는다:
- 항원에 특이적인 공지의 항체에 비해 항원에 대한 결합 친화도의 증가
- 활성이 알려진 경우 항원에 특이적인 공지의 항체에 비해 항원 활성의 중화 증가
- 특이적인 몰비에서 항원에 대해 공지의 항체 또는 리간드와 경쟁하는 특정한 능력
- 복합체를 면역침전시키는 능력
- 특정 에피토프에 결합하는 능력
o 선형 에피토프, 예를 들어 본원에서 설명되는 펩티드-결합 스캔을 사용하여 확인된 펩티드 서열, 예를 들어 선형 및/또는 속박된 입체형태로 스크리닝된 펩티드
o 비-연속적인 잔기에 의해 형성된 입체형태 에피토프
- IgE, 또는 하류의 분자의 새로운 생물학적 활성을 조정하는 능력.
상기 방법도 본원에서 제공된다.
본원에 개시된 항체 분자의 변이체가 생산되어 본 발명에 사용될 수 있다. 다변량 데이타 분석 기술을 구조/특성-활성 관계에 적용할 때 선도적인 전산 화학을 따라 [38], 항체의 정량적 활성-특성 관계는 공지의 수학적 기술, 예를 들어 통계적인 회귀, 패턴 인식 및 분류를 사용하여 유도될 수 있다 [39, 40, 41, 42, 43, 44]. 항체의 특성은 항체 서열의 실험 및 이론 모델 (예를 들어, 가능성 있는 접촉 잔기 또는 계산된 물리화학적 특성의 분석), 기능성 구조 및 3차원 구조로부터 유도될 수 있고, 상기 특성은 개별적으로 및 서로 조합하여 고려될 수 있다.
VH 도메인 및 VL 도메인으로 이루어진 항체 항원 결합 부위는 일반적으로 폴리펩티드의 6개의 루프, 즉 경쇄 가변 도메인 (VL)으로부터의 3개 및 중쇄 가변 도메인 (VH)으로부터의 3개에 의해 형성된다. 공지의 원자 구조의 항체에 대한 분석은 항체 결합 부위의 서열과 3차원 구조 사이의 관계를 규명하였다 [45, 46]. 상기 관계는 VH 도메인 내의 제3 구역 (루프)을 제외하고, 결합 부위 루프가 소수의 주요-사슬 입체형태, 즉 정규 구조 중의 하나를 갖는다는 것을 의미한다. 특정 루프에 형성된 정규 구조는 그의 크기 및 루프 내와 프레임워크 구역 내의 중요 부위에 특정 잔기의 존재에 의해 결정되는 것으로 밝혀졌다 [45, 46].
서열-구조 관계에 대한 상기 연구는 그의 CDR 루프의 3차원 구조 유지에 중요하고 따라서 결합 특이성을 유지하는, 미지의 3차원 구조가 아니라 공지 서열의 항체 내의 잔기의 예측을 위해 사용될 수 있다. 상기 예측은 선도적인 최적화 실험의 결과에 대해 예측치를 비교함으로써 뒷받침될 수 있다. 구조적 방식에서, 임의의 자유롭게 이용가능하거나 시판되는 패키지, 예를 들어 WAM [48]을 사용하여 항체 분자 [47]에 대한 모델을 생성시킬 수 있다. 이어서, 단백질 가시화 및 분석 소프트웨어 패키지, 예를 들어 Insight II (액셀리스, 인크. (Accelrys, Inc.)) 또는 Deep View [49]를 사용하여 CDR 내의 각각의 위치에서 가능한 치환을 평가할 수 있다. 이어서, 활성에 대해 최소의 또는 유익한 효과를 가질 것으로 보이는 치환을 형성하기 위해 상기 정보를 사용할 수 있다.
CDR, 항체 VH 또는 VL 도메인 및/또는 결합 멤버의 아미노산 서열 내에 치환을 형성하기 위해 필요한 기술은 일반적으로 당업계에서 이용가능하다. 활성에 대해 최소의 또는 유익한 효과를 가질 것으로 예측되거나 예측될 수 없는 치환이 존재하는 변이체 서열을 제조하고, IgE에 대한 결합 및/또는 중화 능력 및/또는 임의의 다른 목적하는 특성에 대해 시험할 수 있다.
그의 서열이 본원에 구체적으로 개시된 임의의 VH 및 VL 도메인의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체를 논의되는 바와 같이 본 발명에 따라 사용할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 표 3 및 첨부된 서열 목록에 제시된 항체 1 내지 28 중 임의의 항체의 VH 도메인, 또는 표 1에 제시된 HCDR (예를 들어, HCDR1, HCDR2, 또는 HCDR3)과 적어도 약 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 약 99％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체 분자이다. 또한, 항체 분자는 항체 1 내지 28 중 임의의 항체의 VL 도메인, 또는 표 1에 제시된 LCDR (예를 들어, LCDR1, LCDR2, 또는 LCDR3)과 적어도 약 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 약 99％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 임의로 포함할 수 있다. 두 아미노산 서열의 동일성 ％를 계산하기 위해 사용될 수 있는 알고리즘은 예를 들어 BLAST [50], FASTA [51], 또는 예를 들어 디폴트 파라미터를 사용하는 Smith-Waterman 알고리즘 [52]을 포함한다.
특정 변이체는 하나 이상의 아미노산 서열 변경 (아미노산 잔기의 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입)을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 변이체는 약 20 미만의 상기 변경을 갖는다.
변경은 하나 이상의 프레임워크 구역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 이루어질 수 있다. 변경은 보통 기능을 상실시키지 않고, 따라서 이와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합 멤버는 IgE에 대한 결합 및/또는 중화능을 유지할 수 있다. 상기 결합 멤버는 예를 들어 본원에서 설명되는 분석에서 측정된 바와 같이 변경이 발생하지 않은 결합 멤버와 동일한 정량적 결합 및/또는 중화능을 유지할 수 있다. 이와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합 멤버는 IgE에 대한 개선된 결합 및/또는 중화능을 가질 수 있다.
변경은 하나 이상의 아미노산 잔기(들)를 비-자연 발생 또는 비-표준 아미노산으로 교체하거나, 하나 이상의 아미노산 잔기를 비-자연 발생 또는 비-표준 형태로 변형시키거나, 또는 하나 이상의 비-자연 발생 또는 비-표준 아미노산을 서열 내에 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 서열에서 변경의 수 및 위치의 예는 본원의 다른 부분에서 설명된다. 자연 발생하는 아미노산은 표준 단문자 코드에 의해 G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E로 확인되는 20개의 "표준" L-아미노산을 포함한다. 비-표준 아미노산은 폴리펩티드 백본 내로 도입되거나 또는 존재하는 아미노산 잔기의 변형에 의해 발생할 수 있는 임의의 다른 잔기를 포함한다. 비-표준 아미노산은 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산일 수 있다. 몇개의 자연 발생하는 비-표준 아미노산, 예를 들어 4-히드록시프롤린, 5-히드록시라이신, 3-메틸히스티딘, N-아세틸세린 등이 당업계에 공지되어 있다 [53]. N-알파 위치에서 유도체화된 이들 아미노산 잔기는 아미노산 서열의 N-말단에만 위치할 것이다. 통상, 본 발명에서 아미노산은 L-아미노산이지만, D-아미노산일 수도 있다. 따라서, 변경은 L-아미노산을 D-아미노산으로 변경하거나 대체하는 것을 포함한다. 또한, 아미노산의 메틸화, 아세틸화 및/또는 인산화 형태가 알려져 있고, 본 발명에서 아미노산에 상기 변형을 적용할 수 있다.
본 발명의 항체 도메인 및 결합 멤버의 아미노산 서열은 상기한 비-자연 발생 또는 비-표준 아미노산을 포함할 수 있다. 비-표준 아미노산 (예를 들어 D-아미노산)은 아미노산 서열의 합성 동안, 또는 아미노산 서열의 합성 후에 "본래의" 표준 아미노산의 변형 또는 대체에 의해 아미노산 서열 내에 도입될 수 있다.
비-표준 및/또는 비-자연 발생 아미노산을 사용하면, 구조적 및 기능적 다양성이 증가하고, 따라서 본 발명의 결합 멤버에서 목적하는 IgE-결합 및 중화 특성을 달성하기 위한 가능성을 증가시킬 수 있다. 추가로, D-아미노산 및 유사체는 동물, 예를 들어 인간에게 투여한 후에 L-아미노산을 갖는 폴리펩티드의 생체 내 분해 때문에 표준 L-아미노산에 비해 더 우수한 약동학적 프로필을 갖는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 CDR-유래 서열을 보유하는 신규한 VH 또는 VL 구역은 전체 가변 도메인 내에 돌연변이를 생성시키기 위해서 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위한 돌연변이 유발을 사용하여 생성시킬 수 있다. 상기 기술은 문헌 (Gram et al. [54])에 기재되어 있고, 여기서 오류 빈발 (error-prone) PCR이 사용되었다. 일부 실시태양에서, 1 또는 2개의 아미노산이 전체 가변 도메인 또는 CDR의 세트 내에서 치환된다.
사용될 수 있는 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 구역에 대한 돌연변이 유발을 유도하는 것이다. 상기 기술은 문헌 ([Barbas et al. [55]] 및 [Schier et al. [56]])에 개시되어 있다.
상기한 모든 기술은 당업계에 공지되어 있고, 당업자는 당업계에 통상적인 방법을 사용하여 본 발명의 결합 멤버를 제공하기 위해 상기 기술을 사용할 수 있을 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 본원에서 제시된 VH 도메인의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 삽입을 제공하고, 임의로 이와 같이 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하고, 임의로 하나 이상의 목적하는 특성, 예를 들어 IgE 활성의 중화능을 갖는, IgE에 대한 결합 멤버 또는 항체 항원 결합 부위를 확인하기 위해 VH 도메인 또는 VH/VL 조합체 또는 조합체들을 시험하는 것을 포함하는, IgE에 대한 항체 항원 결합 부위를 얻는 방법을 제공한다. 상기 VL 도메인은 실질적으로 본원에서 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본원에 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체를 하나 이상의 VH 도메인과 조합하는 유사한 방법이 사용될 수 있다.
상기에서 알 수 있는 바와 같이, 실질적으로 본원에서 제시된 CDR 아미노산 서열은 인간 항체 가변 도메인 또는 그의 실질적인 부분 내의 CDR로서 보유될 수 있다. 실질적으로 본원에서 제시된 HCDR3 서열은 본 발명의 실시태양을 나타내고, 각각의 이들 서열은 인간 중쇄 가변 도메인 또는 그의 실질적인 부분 내의 HCDR3으로서 보유될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 가변 도메인은 임의의 생식세포 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 얻거나 유도될 수 있거나, 또는 공지의 인간 가변 도메인의 컨센서스 (consensus) 또는 실제 서열을 기초로 한 합성 가변 도메인일 수 있다. 가변 도메인은 비-인간 항체로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 CDR 서열 (예를 들어 CDR3)은 재조합 DNA 기술을 사용하여 CDR (예를 들어 CDR3)이 결여된 가변 도메인의 레퍼토리 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Marks et al. [57])은 가변 도메인 영역의 5' 말단에서 또는 5' 말단에 인접하여 작용하는 컨센서스 프라이머가 CDR3이 결여된 VH 가변 도메인의 레퍼토리를 제공하기 위해서 인간 VH 유전자의 제3 프레임워크 구역의 컨센서스 프라이머와 함께 사용되는, 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 생산하는 방법을 기재하고 있다. 상기 문헌은 상기 레퍼토리가 특정 항체의 CDR3과 조합될 수 있는 방법을 또한 설명하고 있다. 유사한 기술을 사용하여, 본 발명의 CDR3-유래 서열은 CDR3이 결여된 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리로 셔플링될 수 있고, 셔플링된 완전한 VH 또는 VL 도메인은 동족 (cognate) VL 또는 VH 도메인과 조합되어 본 발명의 결합 멤버를 제공할 수 있다. 이어서, 레퍼토리는 적합한 숙주 시스템, 예를 들어 그 전부가 본원에 참고로 포함된 WO92/01047, 또는 임의의 후속 문헌, 예를 들어 문헌 (Kay, Winter & McCafferty [58])의 파지 디스플레이 시스템에서 디스플레이되어, 적합한 결합 멤버를 선택할 수 있다. 레퍼토리는 104 개 이상의 개별적인 멤버, 예를 들어 적어도 105, 적어도 106, 적어도 107, 적어도 108, 적어도 109 또는 적어도 1010 개 또는 이보다 많은 멤버로 구성될 수 있다. 다른 적합한 숙주 시스템은 효모 디스플레이, 세균 디스플레이, T7 디스플레이, 바이러스 디스플레이, 세포 디스플레이, 리보좀 디스플레이 및 공유 디스플레이를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
IgE 항원에 대한 결합 멤버의 제조 방법이 제공되고, 이 방법은
(a) 대체되는 CDR3을 포함하거나 CDR3 코딩 구역이 결여된, VH 도메인을 코딩하는 핵산의 출발 레퍼토리를 제공하고;
(b) VH CDR3에 대해 실질적으로 본원에서 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 공여 핵산과 상기 레퍼토리를 조합하여 상기 공여 핵산을 레퍼토리 내의 CDR3 구역 내로 삽입함으로써, VH 도메인을 코딩하는 핵산의 생성물 레퍼토리를 제공하고;
(c) 상기 생성물 레퍼토리의 핵산을 발현시키고;
(d) IgE에 대한 결합 멤버를 선택하고;
(e) 상기 결합 멤버 또는 이를 코딩하는 핵산을 회수하는 것
을 포함한다.
다시, 본 발명의 VL CDR3이, 대체되는 CDR3을 포함하거나 CDR3 코딩 구역이 결여된 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 레퍼토리와 조합되는 유사한 방법을 사용할 수 있다.
유사하게, 하나 이상의, 또는 3개의 모든 CDR이 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리 내로 그라프팅될 수 있고, 후속적으로 IgE에 대한 결합 멤버 또는 결합 멤버들에 대해 스크리닝된다.
예를 들어, 하나 이상의 모 항체 또는 항체 2 내지 28의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 또는 모 항체 또는 항체 2 내지 28의 HCDR의 세트가 사용될 수 있고/있거나 하나 이상의 모 항체 또는 항체 2 내지 28의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 또는 모 항체 또는 항체 2 내지 28의 LCDR의 세트가 사용될 수 있다.
유사하게, 본원에 개시된 다른 VH 및 VL 도메인, CDR의 세트 및 HCDR의 세트 및/또는 LCDR의 세트가 사용될 수 있다.
면역글로불린 가변 도메인의 실질적인 부분은 그 사이에 존재하는 프레임워크 구역과 함께 적어도 3개의 CDR 구역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 부분은 제1 및 제4 프레임워크 구역의 어느 하나 또는 둘 모두의 적어도 약 50％를 포함할 수 있고, 상기 50％는 제1 프레임워크 구역의 C-말단 50％ 및 제4 프레임워크 구역의 N-말단 50％이다. 가변 도메인의 실질적인 부분의 N-말단 또는 C-말단부의 추가의 잔기는 자연 발생하는 가변 도메인 구역과 보통 회합하지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 본 발명의 결합 멤버에는, 클로닝 또는 다른 조작 단계를 용이하게 하기 위해 도입된 링커에 의해 코딩되는 N- 또는 C-말단 잔기가 도입될 수 있다. 다른 조작 단계는 항체 불변 구역, 다른 가변 도메인 (예를 들어, 디아바디의 생산시에) 또는 본원의 다른 부분에서 보다 상세하게 논의되는 검출가능한/기능적 표지를 포함하는 추가의 단백질 서열에 본 발명의 가변 도메인을 연결하기 위한 링커의 도입을 포함한다.
본 발명의 일부 측면에서, 결합 멤버가 한쌍의 VH 및 VL 도메인을 포함하지만, VH 또는 VL 도메인 서열을 기재로 한 단일 결합 도메인이 본 발명의 추가의 측면을 형성한다. 단일 면역글로불린 도메인, 특히 VH 도메인이 특이적인 방식으로 표적 항원에 결합할 수 있다고 알려져 있다. 예를 들어, 상기 dAb에 대한 논의를 참고한다.
단일 결합 도메인의 경우에, 이 도메인은 IgE에 결합할 수 있는, 2개의 도메인으로 구성된 결합 멤버를 형성할 수 있는 상보성 도메인의 스크리닝에 사용될 수 있다. 이것은 H 또는 L 사슬 클론을 함유하는 개별 콜로니를 사용하여 다른 사슬 (L 또는 H)을 코딩하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키고, 생성되는 2-사슬 결합 멤버를 참고문헌에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 따라 선택하는, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 WO92/01047에 개시되어 있는, 소위 계층 이중 조합 (hierarchical dual combinatorial) 방법을 사용하여 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있다. 또한, 이 기술은 문헌 (Marks et al, 상기 문헌)에도 개시되어 있다.
본 발명의 결합 멤버는 항체 불변 구역 또는 그의 일부, 예를 들어 인간 항체 불변 구역 또는 그의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 인간 Cκ 또는 Cλ 사슬을 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 대해 그의 C-말단부에서 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인을 기재로 하는 결합 멤버는 임의의 항체 이소형, 예를 들어 IgG, IgA, IgE 및 IgM 및 임의의 이소형 서브클래스, 특히 IgG1 및 IgG2로부터 유도된 면역글로불린 중쇄의 전부 또는 일부 (예를 들어 CH1 도메인)에 대해 그의 C-말단부에서 부착될 수 있다. IgG1이 그의 제조 용이성 및 안정성, 예를 들어, 반감기 때문에 유리하다. 상기 특성을 갖고 가변 구역을 안정화시키는 임의의 합성 또는 다른 불변 구역 변이체도 본 발명에 유용할 수 있다.
본 발명의 결합 멤버는 검출가능한 또는 기능적 표지로 표지될 수 있다. 따라서, 결합 멤버 또는 항체 분자는 검출가능한 및/또는 정량가능한 신호를 얻기 위해 면역컨쥬게이트의 형태로 존재할 수 있다. 면역컨쥬게이트는 검출가능한 또는 기능적 표지와 컨쥬게이팅된 본 발명의 항체 분자를 포함할 수 있다. 표지는 형광 물질, 방사성 표지, 효소, 화학발광 물질 또는 감광제를 포함하고, 이로 제한되지 않는 신호를 생성하거나 신호 생성을 유도할 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 따라서, 결합은 형광 또는 발광, 방사성, 효소 활성 또는 흡광도를 검출함으로써 검출 및/또는 측정될 수 있다.
적합한 표지는 예를 들어 다음을 포함하고, 이로 제한되지 않는다:
- 효소, 예를 들어 알칼린 포스파타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 ("G6PDH"), 알파-D-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코스 아밀라제, 탄산 안히드라제, 아세틸콜린에스테라제, 리소자임, 말레이트 데히드로게나제 및 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제;
- 염료;
- 형광 표지 또는 형광 물질, 예를 들어 플루오레세인 및 그의 유도체, 형광 색소, 로다민 화합물 및 유도체, GFP ("Green Fluorescent Protein"), 단실, 움벨리페론, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 및 플루오레스카민; 형광단, 예를 들어 란타니드 크립테이트 및 킬레이트, 예를 들어 유로퓸 등 (퍼킨 엘머 (Perkin Elmer) 및 씨아이에스 바이오 인터내셔날 (CIS Bio International)),
- 화학발광 표지 또는 화학발광 물질, 예를 들어 이소루미놀, 루미놀 및 디옥세탄;
- 생체발광 표지, 예를 들어 루시퍼라제 및 루시페린;
- 민감제;
- 보조효소;
- 효소 기질;
- 방사성 표지, 예를 들어 브롬77, 탄소14, 코발트57, 불소8, 갈륨67, 갈륨 68, 수소3 (3중 수소), 인듐111, 인듐 113m, 요오드123m, 요오드125, 요오드126, 요오드131, 요오드133, 수은107, 수은203, 인32, 레늄99m, 레늄101, 레늄105, 루테늄95, 루테늄97, 루테늄103, 루테늄105, 스칸듐47, 셀레늄75, 황35, 테크네튬99, 테크네튬99m, 텔루륨121m, 텔루륨122m, 텔루륨125m, 툴륨165, 툴륨167, 툴륨168, 이트륨199 및 본원에서 언급되는 다른 방사성 표지 (이로 제한되지 않음);
- 입자, 예를 들어 라텍스 또는 탄소 입자; 금속 졸 (metal sol); 크리스탈라이트; 리포좀; 염료, 촉매 또는 다른 검출가능한 기로 추가로 표지될 수 있는 세포 등;
- 분자, 예를 들어 비오틴, 디곡시게닌 또는 5-브로모데옥시우리딘;
- 독소 모이어티, 예를 들어 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소 (PE 또는 그의 세포독성 단편 또는 돌연변이체), 디프테리아 독소 또는 그의 세포독성 단편 또는 돌연변이체, 보툴리눔 독소 A, B, C, D, E 또는 F, 리신 또는 그의 세포독성 단편, 예를 들어 리신 A, 아브린 또는 그의 세포독성 단편, 사포린 또는 그의 세포독성 단편, 억새풀 (pokeweed) 항바이러스 독소 또는 그의 세포독성 단편 및 브리오딘 1 또는 그의 세포독성 단편으로 이루어진 군 중에서 선택되는 독소 모이어티.
적합한 효소 및 보조효소는 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 ([Litman, et al., US 4,275,149], 및 [Boguslaski, et al., US4318980])에 개시되어 있다. 적합한 형광 물질 및 화학발광 물질은 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 (Litman, et al., US4275149)에 개시되어 있다. 표지는 추가로 화학적 모이어티, 예를 들어 특이적인 동족의 검출가능한 모이어티, 예를 들어 표지된 아비딘 또는 스트렙타비딘에 대한 결합을 통해 검출될 수 있는 비오틴을 포함한다. 검출가능한 표지는 당업계에 공지된 통상적인 화학을 사용하여 본 발명의 항체에 부착시킬 수 있다.
면역컨쥬게이트 또는 그의 기능성 단편은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들은 효소 또는 형광 표지에 직접 또는 스페이서기 또는 연결기, 예를 들어 폴리알데히드, 예를 들어 글루타르알데히드, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌-트리아민펜타아세트산 (DPTA)을 통해, 또는 치료 컨쥬게이트에 대해 상기 언급한 것과 같은 커플링제의 존재 하에 커플링될 수 있다. 플루오레세인 유형의 표지를 함유하는 컨쥬게이트는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조될 수 있다.
치료 방사성 동위원소를 항체에 직접 또는 킬레이팅제, 예를 들어 상기한 EDTA, DTPA를 통해 커플링시키기 위한 당업자에게 공지된 방법을 진단에 사용될 수 있는 방사성 원소에 대해 사용할 수 있다. 또한, 클로라민 T 방법 [59]에 의해 나트륨125를 사용하여 또는 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 (Crockford et al, US4424200)의 기술에 의해 테크네튬99m을 사용하여 또는 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 (Hnatowich, US 4,479,930)에 기재된 바와 같이 DTPA를 통한 부착에 의해 표지를 수행할 수 있다.
표지가 외부 수단에 의해, 예를 들어 육안 검사, 전자기 조사, 열 및 화학물질 시약에 의해 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 많은 방법이 존재한다. 또한, 표지는 본 발명의 항체에 결합하는 다른 결합 멤버, 또는 지지체에 결합될 수 있다.
표지는 직접 신호를 생성시킬 수 있고, 따라서, 신호 생성을 위해 추가의 성분이 필요하지 않다. 많은 유기 분자, 예를 들어 형광 물질은 자외선 및 가시광선을 흡수할 수 있고, 여기서 광 흡수는 에너지를 상기 분자에 전달하여 분자를 여기된 에너지 상태로 만든다. 이어서, 흡수된 에너지는 제2 파장에서의 광 방출에 의해 방산된다. 또한, 상기 제2 파장 방출은 에너지를 표지된 수용 분자로 전달하고, 생성되는 에너지는 광 방출, 예를 들어 형광 공명 에너지 전달 (FRET)에 의해 수용 분자로부터 방산된다. 직접 신호를 생성시키는 다른 표지는 방사성 동위원소 및 염료를 포함한다.
별법으로, 표지는 신호를 생성시키는 다른 성분을 필요로 할 수 있고, 신호 생성 시스템은 측정가능한 신호를 생성시키는데 필요한 모든 성분을 포함할 것이고, 이는 기질, 보조효소, 인핸서, 추가의 효소, 효소 산물과 반응하는 물질, 촉매, 활성제, 보조인자, 억제제, 스캐빈저 (scavenger), 금속 이온 및 신호 생성 물질의 결합에 필요한 특이적 결합 물질을 포함할 수 있다. 적합한 신호 생성 시스템에 대한 상세한 논의는 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 (Ullman, et al. US 5,185,243)에서 볼 수 있다.
본 발명은 본원에서 제공되는 결합 멤버의 IgE에 대한 결합을 유발하거나 허용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 알 수 있는 바와 같이, 상기 결합은 예를 들어 결합 멤버 또는 코딩 핵산을 인간 또는 동물 (예를 들어, 포유동물)에게 투여한 후에 생체 내에서 발생할 수 있거나, 또는 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블로팅, 면역세포화학, 면역침전, 친화도 크로마토그래피, 및 생화학적 또는 세포 기반 분석에서 시험관 내에서 발생할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 결합 멤버와 IgE 사이의 복합체는 특히 효소 연관 면역분석, 방사선 분석, 형광 면역분석, 화학발광 분석, 면역블롯 분석, 측면 유동 분석, 응집 분석 및 입자 기반 분석에 의해 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 예를 들어 생체센서 시스템에서 본 발명에 따른 결합 멤버를 사용하여 항원의 수준을 직접 측정하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 (i) 상기 결합 멤버를 IgE에 노출시키고, (ii) 상기 결합 멤버의 IgE에 대한 결합을 검출하는 것을 포함하고, 결합이 본원에서 설명되는 임의의 방법 또는 검출가능한 표지를 사용하는 검출되는 것인, IgE에 대한 결합의 검출 및/또는 측정 방법을 포함한다. 상기 및 본원에서 설명되는 임의의 다른 결합 검출 방법은 방법을 수행하는 사람에 의해 직접, 예를 들어 검출가능한 표지를 가시적으로 관찰함으로써 해석될 수 있다. 별법으로, 상기 방법, 또는 본원에서 설명되는 임의의 다른 결합 검출 방법은 자가방사선 촬영, 사진, 컴퓨터 출력 정보, 유동 세포 측정 보고서, 그래프, 차트, 결과를 포함하는 시험관 또는 용기 또는 웰, 또는 방법의 결과에 대한 임의의 다른 가시적인 또는 물리적인 표시물의 형태로 보고서를 작성할 수 있다.
IgE에 대한 결합 멤버의 결합의 양을 결정할 수 있다. 정량은 시험 샘플 내의 항원의 양에 관련될 수 있고, 이것은 진단을 위한 것일 수 있다. 예를 들어 본원에서 언급되는 질병 또는 질환 및/또는 비정상적인 IgE 생산, 발현 및/또는 활성을 수반하는 임의의 다른 질병 또는 질환에 대해 환자를 스크리닝할 때, IgE 결합에 대한 스크리닝 및/또는 그의 정량이 유용할 수 있다.
본 발명의 진단 방법은 (i) 대상으로부터 조직 또는 유체 샘플을 얻고, (ii) 상기 조직 또는 유체 샘플을 본 발명의 하나 이상의 결합 멤버에 노출시키고; (iii) 결합된 IgE를 대조군 샘플과 비교하여 검출하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 대조군에 비해 IgE 결합량의 증가는 IgE 생산, 발현 또는 활성의 비정상적인 수준을 나타낼 수 있다. 시험되는 조직 또는 유체 샘플은 혈액, 혈청, 소변, 생검 물질, 종양, 또는 비정상적인 IgE 수준을 갖는 것으로 의심되는 임의의 조직을 포함한다. 또한, 비정상적인 IgE 수준 또는 활성에 대해 양성으로 시험된 대상은 본원에서 개시되는 치료 방법으로부터 도움을 받을 수 있다.
본 발명의 진단 방법은 고정된 항원을 통해 결합 멤버와 IgE의 복합체를 포획하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원은 관심있는 샘플에서 항원-특이적 IgE를 포획하기 위한 측면 스트립 (lateral strip) 분석에서 고정될 수 있다.
당업자는 본원에 개시된 방법에 비추어, 그의 선호도 및 일반적인 지식에 따라 항원에 대한 결합 멤버의 결합을 결정하기 위한 적합한 방식을 선택할 수 있다.
샘플 내의 결합 멤버의 반응성은 임의의 적절한 수단에 의해 결정할 수 있다. 방사성 면역분석 (RIA)이 하나의 가능한 방법이다. 방사성 표지된 항원을 비표지된 항원 (시험 샘플)과 혼합하고, 결합 멤버에 결합시킨다. 결합된 항원은 비결합된 항원과 물리적으로 분리되고, 결합 멤버에 결합된 방사성 항원의 양이 결정된다. 항원이 시험 샘플 내에 많이 존재할수록 보다 적은 방사성 항원이 결합 멤버에 결합할 것이다. 또한, 경쟁 결합 분석은 리포터 분자에 연결된 항원 또는 유사체를 사용하여 비-방사성 항원과 함께 사용될 수 있다. 리포터 분자는 스펙트럼에 의해 단리된 흡수 또는 방출 특성을 갖는 형광 색소, 형광 또는 레이저 염료일 수 있다. 적합한 형광 색소는 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린 및 텍사스 레드 (Texas Red), 및 란타니드 킬레이트 및 크립테이트를 포함한다. 적합한 발색 염료는 디아미노벤지딘을 포함한다.
다른 리포터는 거대분자 콜로이드 입자 또는 입자 물질, 예를 들어 착색, 자성 또는 상자성 라텍스 비드, 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 가시적으로 관찰되도록, 전기적으로 검출되도록 또는 다른 방식으로 기록되도록 할 수 있는 생물학적으로 또는 화학적으로 활성인 물질을 포함한다. 상기 분자는 예를 들어 발색 또는 변색 또는 전기적 특성의 변화를 야기하는 반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 이들은 분자적으로 여기되어, 에너지 상태의 전자 전이에 의해 특징적인 스펙트럼 흡수 또는 방출이 일어날 수 있다. 이들은 생체센서와 함께 사용되는 화학적 물질 (entity)을 포함할 수 있다. 비오틴/아비딘 또는 비오틴/스트렙타비딘 및 알칼린 포스파타제 검출 시스템을 사용할 수 있다.
개별적 결합 멤버-리포터 컨쥬게이트에 의해 생성된 신호는 샘플 (정상 및 시험) 내의 관련된 결합 멤버 결합에 대한 정량가능한 절대적인 또는 상대적인 데이타를 유도하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 임의의 측면 또는 실시태양에 따른 결합 멤버를 포함하는 키트가 본 발명의 한 측면으로서 제공된다. 키트에서, 결합 멤버는 예를 들어 아래에서 추가로 설명되는 바와 같이 샘플 내에서의 그의 반응성이 결정되도록 표지될 수 있다. 추가의 결합 멤버가 고체 지지체에 부착되거나 부착되지 않을 수 있다. 키트의 성분은 일반적으로 멸균되고, 멸균 바이알 또는 다른 용기 내에 보관된다. 키트는 결합 멤버가 유용한 진단 분석 또는 다른 방법에 사용될 수 있다. 키트는 방법, 예를 들어 본 발명에 따른 방법에서 성분의 사용에 대한 사용설명서를 포함할 수 있다. 상기 방법을 돕거나 그 수행을 가능하게 하는 보조 물질이 본 발명의 키트 내에 포함될 수 있다. 보조 물질은 제1 결합 멤버에 결합하고 검출가능한 표지 (예를 들어, 형광 표지, 방사성 동위원소 또는 효소)에 컨쥬게이팅된 제2의 상이한 결합 멤버를 포함한다. 또한, 항체-기반 키트는 면역침전 수행을 위한 비드를 포함할 수 있다. 키트의 각각의 성분은 일반적으로 그 자체의 적합한 용기 내에 존재한다. 따라서, 상기 키트는 일반적으로 각각의 결합 멤버에 대한 적합한 별개의 용기를 포함한다. 또한, 키트는 분석 수행으로부터 얻은 데이타의 분석 및 해석을 위한 분석 및 방법을 수행하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 경쟁 분석에서 항원 수준을 측정하기 위한 상기 결합 멤버의 용도, 즉 경쟁 분석에서 본 발명에서 제공되는 결합 멤버를 사용함으로써 샘플 내의 항원의 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 이것은 비결합된 항원으로부터 결합된 항원의 물리적 분리가 필요하지 않을 수 있다. 물리적 또는 광학적 변화가 결합시에 발생하도록 리포터 분자를 결합 멤버에 연결시킬 수도 있다. 리포터 분자는 정량가능한 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 생성시킬 수 있다. 리포터 분자의 연결은 직접 또는 공유 결합을 통해, 예를 들어 펩티드 결합을 통해 또는 비-공유 결합을 통해 간접적으로 이루어질 수 있다. 펩티드 결합을 통한 연결은 항체 및 리포터 분자를 코딩하는 유전자 융합체의 재조합 발현에 의해 발생할 수 있다.
다양한 측면 및 실시태양에서, 본 발명은 본원에서 규정된 임의의 결합 멤버, 예를 들어 IgG1 포맷의 모 항체 또는 항체 2 내지 28 중의 임의의 항체와 IgE에 대한 결합을 위해 경쟁하는 결합 멤버로 확장된다. 결합 멤버 사이의 경쟁은 동일한 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합하는 결합 멤버의 확인이 가능하도록, 예를 들어 다른 비태깅된 결합 멤버(들)의 존재 하에 검출될 수 있는 하나의 결합 멤버에 특이적인 리포터 분자를 태깅함으로써 시험관 내에서 쉽게 분석될 수 있다. 경쟁은 IgE가 플레이트에 고정되고 태깅 또는 표지된 제1 결합 멤버를 하나 이상의 다른 비태깅 또는 비표지된 결합 멤버와 함께 플레이트에 첨가하는, 예를 들어 ELISA를 사용하여 결정할 수 있다. 태깅된 결합 멤버와 경쟁하는 비태깅된 결합 멤버의 존재는 태깅된 결합 멤버에 의해 방출되는 신호의 감소에 의해 관찰된다.
예를 들어, 본 발명은 (i) IgE를 지지체에 고정시키고, (ii) 상기 고정된 IgE를 적어도 하나의 태깅 또는 표지된 본 발명에 따른 결합 멤버 및 하나 이상의 비태깅 또는 비표지된 시험 결합 화합물과 동시에 또는 순차적으로 접촉시키고, (iii) 태깅된 결합 멤버로부터 결합된 태그의 양의 감소를 관찰함으로써 새로운 IgE 결합 화합물을 확인하는 것을 포함하는, IgE 결합 화합물의 확인 방법을 포함한다. 상기 방법은 다중웰 또는 어레이 포맷을 사용하여 초고속 방식으로 수행할 수 있다. 또한, 상기 분석은 용액으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 U.S. 5,814,468을 참고한다. 상기 설명한 바와 같이, 결합의 검출은 방법을 수행하는 사람에 의해 직접, 예를 들어 검출가능한 표지 또는 그의 존재의 감소를 가시적으로 관찰함으로써 해석될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 결합 방법은 자가방사선 촬영, 사진, 컴퓨터 출력 정보, 유동 세포 측정 보고서, 그래프, 차트, 결과를 포함하는 시험관 또는 용기 또는 웰, 또는 방법의 결과에 대한 임의의 다른 가시적인 또는 물리적인 표시물의 형태로 보고서를 작성할 수 있다.
또한, 경쟁 분석이 에피토프 매핑 (mapping)에 사용될 수 있다. 한 예에서, 에피토프 매핑은 임의로 최적화된 중화 및/또는 조정 특성을 가질 수 있는 IgE-결합 멤버에 의해 결합된 에피토프를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 상기 에피토프는 선형 또는 입체형태일 수 있다. 입체형태 에피토프는 IgE의 적어도 2개의 상이한 단편을 포함할 수 있고, 상기 단편은, IgE의 억제제, 예를 들어 IgE-결합 멤버에 의해 인식되는 입체형태 에피토프를 형성하기 위해 IgE가 그의 3차 또는 4차 구조로 폴딩될 때 서로 근접하여 위치한다. 경쟁을 시험할 때, 항원의 펩티드 단편, 특히 관심있는 에피토프를 포함하거나 본질적으로 상기 에피토프로 이루어지는 펩티드가 사용될 수 있다. 어느 한 말단에 에피토프 서열 및 하나 이상의 아미노산을 갖는 펩티드가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 결합 멤버는, 항원에 대한 그의 결합이 제시된 서열과 함께 또는 이 서열을 포함하는 펩티드에 의해 억제되는 것일 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 결합 멤버를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명은 상기 규정된 바와 같은 본 발명의 CDR 또는 CDR의 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원 결합 부위 또는 항체 분자, 예를 들어 scFv 또는 IgG1을 코딩하는 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기한 바와 같은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구성체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기한 바와 같은 하나 이상의 구성체를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 본원에서 제시되는 임의의 CDR 또는 CDR의 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원 결합 부위 또는 항체 분자, 예를 들어 scFv 또는 IgG1을 코딩하는 핵산 자체가, 그의 코딩 핵산으로부터의 발현을 포함하는 코딩 산물의 생산 방법과 함께 본 발명의 측면을 형성한다. 발현은 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건 하에 배양함으로써 편리하게 달성할 수 있다. 발현에 의한 생산 후에, VH 또는 VL 도메인, 또는 결합 멤버는 임의의 적합한 기술을 사용하여 단리 및/또는 정제된 후, 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 본원에서 제시된 뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 특정 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하고, 문맥상 달리 필요로 하지 않으면 U가 T를 대신한 특정 서열을 갖는 RNA 분자를 포함한다.
또다른 측면은 항체 VH 가변 도메인의 생산 방법을 제공하고, 이 방법은 코딩 핵산으로부터 발현의 유도를 포함한다. 상기 방법은 상기 항체 VH 가변 도메인의 생산을 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
VL 가변 도메인, 및 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는 결합 멤버의 생산을 위한 유사한 방법이 본 발명의 추가의 측면으로서 제공된다.
생산 방법은 생성물의 단리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다. 생산 방법은 생성물을 적어도 하나의 추가의 성분, 예를 들어 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물로 제제화하는 것을 포함할 수 있다.
다양한 상이한 숙주 세포에서 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템이 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포는 세균, 포유동물 세포, 식물 세포, 사상 진균, 효모 및 바큘로바이러스 시스템 및 트랜스제닉 식물 및 동물을 포함한다. 원핵세포에서 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에 잘 확립되어 있다. 검토를 위해, 예를 들어 문헌 (Plueckthun [60])을 참고한다. 통상적인 세균 숙주는 이. 콜라이이다.
또한, 배양시에 진핵세포에서의 발현은 결합 멤버 생산을 위한 선택 사항으로서 당업자가 이용할 수 있다 [61, 62, 63]. 이종성 폴리펩티드의 발현을 위해 당업계에서 이용가능한 포유동물 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, NSO 마우스 흑색종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 및 많은 다른 세포를 포함한다.
적절한 조절 서열, 예를 들어 프로모터 서열, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절한 다른 서열을 함유하는 적합한 벡터를 선택하거나 제작할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 예를 들어 파지미드, 또는 바이러스, 예를 들어 적절한 파지일 수 있다 [64]. 예를 들어 핵산 구성체의 제조, 돌연변이 유발, 서열 결정, DNA의 세포 내로의 도입 및 유전자 발현, 및 단백질의 분석에서 핵산 조작을 위한 많은 공지의 기술 및 프로토콜이 문헌 (Ausubel et al. [65])에 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 추가의 측면은 본원에 개시된 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 시험관 내에 존재할 수 있고, 배양될 수 있다. 상기 숙주 세포는 생체 내에 존재할 수 있다. 숙주 세포의 생체내 존재는 본 발명의 결합 멤버의 "인트라바디 (intrabody)" 또는 세포내 항체로서의 발현을 가능하게 할 수 있다. 인트라바디는 유전자 요법을 위해 사용될 수 있다.
추가의 측면은 본 발명의 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 도입은 임의의 이용가능한 기술을 사용할 수 있다. 진핵세포의 경우, 적합한 기술은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포좀-매개된 형질감염 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예를 들어 우두를 사용한 형질도입, 또는 곤충 세포의 경우 바큘로바이러스를 포함할 수 있다. 숙주 세포, 특히 진핵세포 내로의 핵산의 도입은 바이러스 또는 플라스미드 기반 시스템을 사용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피좀 상태로 유지되거나 또는 숙주 세포 내로 또는 인공 염색체 내로 통합될 수 있다. 통합은 단일 또는 다중 로커스에서 하나 이상의 카피의 무작위한 또는 표적화된 통합일 수 있다. 세균 세포의 경우, 적합한 기술은 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다.
도입 후에, 예를 들어 유전자의 발현을 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양함으로써 핵산으로부터의 발현을 유도하거나 허용할 수 있다. 발현 산물의 정제는 당업자에게 공지된 방법에 의해 달성할 수 있다.
본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈 (예를 들어 염색체) 내로 통합될 수 있다. 통합은 표준 기술에 따라 게놈과의 재조합을 촉진시키는 서열을 포함시킴으로써 촉진될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 결합 멤버 또는 폴리펩티드를 발현하기 위해서 발현 시스템에 상기한 구성체를 사용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 결합 멤버는 인간 또는 동물 대상, 특히 인간에서 진단 또는 치료 방법에 사용될 수 있다. IgE에 대한 결합 멤버는 IgE에 의해 매개되는 생물학적 효과라는 특징을 갖는 질환, 특히 알레르기 및 천식의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합 멤버는 알레르기성 비염, 알레르기성 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 초과민 (anaphylactic) 반응, 음식 알레르기, 두드러기, 염증성 장 질병, 호산구 위장관염, 약물 유발성 발진, 알레르기성 안질환, 또는 알레르기성 결막염의 치료에 사용될 수 있다.
IgE에 대한 결합 멤버는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 알레르겐-유도 비만세포 탈과립화를 억제하고, 생체 내에서 또는 시험관 내에서 FcεR1-매개된 생물학적 반응을 감소시키고, 인간 또는 동물 환자에서 순환 IgE를 감소시키기 위해서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 포유동물에게 본 발명의 결합 멤버, 예를 들어 항체, VH 도메인, 또는 VL 도메인을 IgE 중화에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 알레르겐-유도 비만세포 탈과립화를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 FcεRI 및/또는 FcεRII를 발현하는 세포를 IgE의 존재 하에 본 발명의 결합 멤버, 예를 들어 항체, VH 도메인, 또는 VL 도메인과 접촉시키는 것을 포함하는, FcεRII-매개된 생물학적 반응을 동시에 감소시키거나 감소시키지 않으면서 FcεRI-생물학적 반응을 감소시키는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 FcεRI 및/또는 FcεRII를 발현하는 세포를 IgE의 존재 하에 본 발명의 결합 멤버, 예를 들어 항체, VH 도메인, 또는 VL 도메인과 접촉시키는 것을 포함하는, FcεRII-매개된 생물학적 반응을 동시에 감소시키거나 감소시키지 않으면서 FcεRI-매개된 생물학적 반응을 감소시키는 방법을 추가로 제공한다.
시험 세포를 본 발명의 결합 멤버와 시험관 내에서 접촉시킬 때, 대조군 세포(들)이 또한 양성 대조군 (예를 들어, 결합 멤버를 함유하지 않는 반응) 및/또는 음성 대조군 (예를 들어, IgE 및/또는 항원을 함유하지 않는 반응)으로 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 결합 멤버를 FcεRI- 및/또는 FcεRII-매개된 생물학적 반응을 보이는 포유동물에게 투여함으로써 세포가 결합 멤버에 의해 생체 내에서 접촉할 때, 본 발명의 결합 멤버는 IgE 중화에 충분한 양으로 투여된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 결합 멤버, 예를 들어 항체, VH 도메인, 또는 VL 도메인을 순환하는 유리 IgE의 중화 및 감소에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 포유동물, 예를 들어 인간에서 순환 IgE를 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 결합 멤버는 알레르기성 비염, 알레르기성 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 초과민 반응, 음식 알레르기, 두드러기, 염증성 장 질병, 호산구 위장관염, 약물 유발성 발진, 알레르기성 안질환, 비결막염, 알레르기성 결막염, 기관지 천식, 기도 과민반응, 화장품 알레르기, 약물 유발 알레르기, 약물 유발 과민성 증후군, 금속 알레르기, 직업성 과민성 폐렴, 만성 과민성 폐렴, 냉과민증 (cold hypersensitivity), 기생충 감염 유발 과민증, 라텍스 알레르기 및 고초열 중의 임의의 하나 이상의 질병 또는 질환 (이로 제한되지 않음)의 진단 또는 치료에 사용될 수 있다.
IgE의 결합 및 중화에 대해 본원에서 제시되는 데이타는 본 발명의 결합 멤버가 질환의 심도 감소를 포함하여 상기 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 그를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 하나 이상의 결합 멤버를 단독으로 또는 임의의 상기 질환의 적어도 하나의 증상의 심도가 감소되도록 당업계에 알려져 있거나 본원에 기재된 다른 적절한 의약과의 조합 치료법으로 투여하는 것을 포함하는, 본원에서 언급되는 임의의 질환의 적어도 하나의 증상을 치료하거나 심도를 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 결합 멤버는 적절한 동물 및 질병의 동물 모델, 특히 원숭이에서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 결합 멤버는 IgE, 예를 들어 IgE 생산, 발현 및/또는 활성, 특히 비정상적인 생산, 발현 또는 활성을 수반하는 질병 또는 질환의 치료에서 치료제로서 유용하다. 치료 방법은 유효량의 본 발명의 결합 멤버를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있고, 이에 의해 IgE의 생산, 발현 및/또는 활성이 감소하다. 치료 방법은 (i) 예를 들어 상기한 진단 방법을 사용하여 증가된 IgE 수준 또는 활성을 보이는 환자를 확인하고, (ii) 유효량의 본 발명의 결합 멤버를 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 IgE의 증가된 생산, 발현 및/또는 활성이 감소한다. 다른 치료 방법은 (i) IgE 수준의 명백한 증가를 보이지는 않지만 본 발명의 결합 멤버의 투여로부터 도움을 받는 것으로 생각되는 환자를 확인하고, (ii) 유효량의 본 발명의 결합 멤버를 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 유효량은 반드시 질병 또는 질환을 치료하기 위해서는 아니지만, 치료되는 특정 질병 또는 질환의 적어도 하나의 증상의 심도를 감소 또는 완화시키기 위해 IgE의 증가된 생산, 발현 및/또는 활성을 감소시키는 양이다.
또한, 본 발명은 IgE의 적어도 하나의 효과가 길항되도록 유효량의 하나 이상의 본 발명의 결합 멤버와 접촉시키거나 결합 멤버를 투여하는 것을 포함하는, IgE의 적어도 하나의 효과를 길항하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 길항될 수 있는 IgE의 효과는 FcεRI 및/또는 FcεRII에 의해 매개되는 생물학적 반응, 및 상기 결합 반응의 결과로서 발생하는 임의의 하류의 효과를 포함한다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면은 본원에서 논의되는 바와 같이 IgE와 관련되거나 IgE에 의해 매개되는 질환 치료용 의약의 제조를 위한, 본 발명의 단리된 결합 멤버, 예를 들어 항체, VH 도메인 또는 VL 도메인의 용도를 제공한다. 상기 의약 또는 제약 조성물의 용도 또는 제조 방법은 제약상 허용되는 부형제로 결합 멤버를 제제화하는 것을 포함한다.
제약상 허용되는 부형제는 예를 들어 활성 화합물(들)의 투여 용이성, 체내에서 그의 수명 및/또는 그의 효능의 증가, 그의 용액 내 용해도의 증가 또는 그의 보존 측면의 개선을 가능하게 하는, 2차 반응을 유발하지 않으면서 제약 조성물 내로 도입되는 화합물 또는 화합물의 조합물일 수 있다. 상기 제약상 허용되는 비히클은 공지되어 있고, 선택된 활성 화합물(들)의 특성 및 투여 방식에 따라 당업자에 의해 적용될 것이다.
본 발명의 결합 멤버는 대체로 결합 멤버 이외에 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있는 제약 조성물의 형태로 투여될 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한, 본 발명에 따른 제약 조성물은 활성 성분 이외에, 제약상 허용되는 부형제, 담체, 버퍼, 안정화제 또는 당업자에게 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 상기 물질은 비-독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 하다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 아래에서 논의되는 바와 같이 경구, 흡입, 기관내, 국소, 베지클내 (intravesicular) 또는 주사에 의한 투여일 수 있는 투여 경로에 따라 결정될 것이다.
또한, 예를 들어 단일 도메인 항체 분자 (예를 들어 "나노바디스 (nanobodies)™") 등과 같은 경구 투여용 제약 조성물이 본 발명에서 고려된다. 상기 경구 제제는 정제, 캡슐, 분말, 액체 또는 반고체 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체, 예를 들어 젤라틴 또는 어쥬번트를 포함할 수 있다. 액체 제약 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예를 들어 물, 석유, 동물 또는 식물유, 광유 또는 합성 오일을 포함한다. 생리적 염수 용액, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액 또는 글리콜, 예를 들어 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥내 주사, 또는 질병 부위의 주사를 위해, 활성 성분은 발열원이 존재하지 않고, 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수성 용액의 형태일 것이다. 당업자는 예를 들어 등장성 비히클, 예를 들어 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 링거 젖산 주사액 (Lactated Ringer's Injection)을 사용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 버퍼, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레졸시놀; 시클로헥사놀; 3'-펜타놀 및 m-크레졸); 낮은 분자량 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및(또는) 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하여, 보존제, 안정화제, 버퍼, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 사용될 수 있다.
본 발명의 결합 멤버는 분자의 물리화학적 특성 및 전달 경로에 따라 액체, 반고체 또는 고체 형태로 제제화될 수 있다. 제제는 부형제, 또는 부형제의 조합물, 예를 들어 당, 아미노산 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 액체 제제는 광범위한 항체 농도 및 pH를 포함할 수 있다. 고체 제제는 예를 들어 동결건조, 분무 건조, 또는 초임계 유체 기술에 의한 건조에 의해 생산될 수 있다. 항-IgE의 제제는 의도하는 전달 경로에 따라 결정될 것이다. 예를 들어, 폐 전달을 위한 제제는 흡입시에 폐부 깊숙이 투과하도록 보장하는 물리적 특성을 갖는 입자로 구성될 수 있고; 국소 제제 (예를 들어 피부, 예를 들어 피부 상처 치료를 위한)는 약물이 작용 부위에 잔류하는 시간을 연장시키는 점도 조정제를 포함할 수 있다. 결합 멤버는 신속한 방출에 대해 결합 멤버를 보호하는 담체로, 예를 들어 서방성 제제, 예를 들어 임플란트, 경피 패치 및 미세캡슐화 (microencapsulated) 전달 시스템으로 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안히드라이드 (polyanhydride), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 상기 제제의 제조를 위한 많은 방법이 당업자에게 알려져 있다 [66].
항-IgE 처리제는 경구 (예를 들어 단일 도메인 항체 분자 (예를 들어 "나노바디스™")), 주사 (예를 들어, 피하, 관절내, 정맥내, 복강내, 동맥내 또는 근내), 흡입, 기관내, 베지클내 경로 (방광 내로의 점적 주입), 또는 국소 (예를 들어 안내, 비내, 직장, 피부 상처 내) 경로에 의해 투여될 수 있다. 처리제는 특히 결합 멤버의 감소하는 용량을 사용하는 펄스 주입에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로는 처리제의 물리화학적 특성, 질병에 대한 특수한 고려 사항 또는 효능 최적화 또는 부작용 최소화를 위한 요건에 의해 결정될 수 있다. 특정 투여 경로의 하나는 정맥내 경로이다. 본 발명의 제약 조성물의 다른 투여 경로는 피하 경로이다. 항-IgE 처리제가 임상에서 사용하는 것으로 제한되지 않음이 고려된다. 따라서, 무바늘 (needle-free) 기기를 사용한 피하 주사도 유리할 수 있다. 정맥내 제제의 예는 다음을 포함한다:
제제 (1)은 단리된 본 발명의 결합 멤버 (임의로 10, 50, 100 또는 150 mg/ml의 상기 결합 멤버, 예를 들어 항체), 50 mM 아세트산나트륨, 100 mM NaCl (pH 5.5)을 포함한다.
제제 (2)는 단리된 본 발명의 결합 멤버 (임의로 10, 50, 100 또는 150 mg/ml의 상기 결합 멤버, 예를 들어, 항체), 20 mM 숙시네이트, 105 mM NaCl, 10 mM 아르기닌 (pH 6.00)을 포함한다.
조성물은 단독으로 또는 다른 처리제와 조합되어 치료되는 병태에 따라 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
IgE에 대한 결합 멤버는 추가의 의약 성분과 함께 조합 요법제의 일부로서 사용될 수 있다. 조합 치료제, 특히 항-IgE 결합 멤버와 하나 이상의 다른 약물의 조합물이 유의한 상승 효과를 제공하기 위해 사용될 수 있다. IgE에 대한 결합 멤버는 본원에 나열된 하나 이상의 병태의 치료를 위해 다른 치료제 또는 치료제들과 동시에 또는 순차적으로 또는 조합 제제로서 투여될 수 있다.
본 발명의 결합 멤버는 천식 및 알레르기성 질환, 또는 IgE 매개 효과를 수반하는 다른 질환에 대한 다른 이용가능한 치료제와 함께 제제화 및/또는 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 결합 멤버는 다음 물질 중 하나 이상과 조합되거나 부가되어 제공될 수 있다:
- 시토킨 또는 시토킨 기능의 아고니스트 또는 길항제 (예를 들어, 시토킨 신호전달 경로에 대해 작용하는 물질, 예를 들어 SOCS 시스템의 조정자), 예를 들어 알파-, 베타- 및/또는 감마-인터페론; 인슐린 유사 성장 인자 타입 I (IGF-I), 그의 수용체 및 관련 결합 단백질; 인터루킨 (IL), 예를 들어 하나 이상의 IL-1 내지 -33, 및/또는 인터루킨 길항제 또는 억제제, 예를 들어 아나킨라; 인터루킨 부류 멤버의 수용체의 억제제 또는 상기 수용체의 특이적인 서브유닛의 억제제, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 억제제, 예를 들어 항-TNF 모노클로날 항체 (예를 들어 인플릭시맙, 아달리무맙 및/또는 CDP-870) 및/또는 TNF 수용체 길항제, 예를 들어 면역글로불린 분자 (예를 들어 에타네르셉트) 및/또는 저분자량 물질, 예를 들어 펜톡시필린;
- B 세포의 조정자, 예를 들어 B-림프구 (예를 들어 CD20 (리툭시맙) 또는 MRA-aIL16R) 또는 T-림프구를 표적으로 하는 모노클로날 항체 (예를 들어 CTLA4-Ig, HuMax II-15 또는 아바타셉트);
- 파골세포 활성을 억제하는 조정자, 예를 들어 RANKL에 대한 항체; 케모킨 또는 케모킨 수용체 기능의 조정자, 예를 들어 CCR1, CCR2, CCR2A, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10 및 CCR11의 길항제 (C-C 부류의 경우); CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4 및 CXCR5 및 CXCR6 (C-X-C 부류의 경우) 및 C-X3-C 부류의 경우 CX3CR1;
- 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP), 즉, 하나 이상의 스트로멜리신, 콜라게나제 및 젤라티나제 및 아그레카나제, 특히 콜라게나제-1 (MMP-1), 콜라게나제-2 (MMP-8), 콜라게나제-3 (MMP-13), 스트로멜리신-1 (MMP-3), 스트로멜리신-2 (MMP-10) 및/또는 스트로멜리신-3 (MMP-11) 및/또는 MMP-9 및/또는 MMP-12의 억제제, 예를 들어 독시사이클린과 같은 물질;
- 류코트리엔 생합성 억제제, 5-리폭시게나제 (5-LO) 억제제 또는 5-리폭시게나제 활성화 단백질 (FLAP) 길항제, 예를 들어 질류톤; ABT-761; 펜류톤; 테폭살린; 애보트 (Abbott)-79175; 애보트-85761; N-(5-치환)-티오펜-2-알킬술폰아미드; 2,6-디-t-부틸페놀히드라존; 메톡시테트리히드로피란, 예를 들어 Zeneca ZD-2138; 화합물 SB-210661; 피리디닐-치환 2-시아노나프탈렌 화합물, 예를 들어 L-739,010; 2-시아노퀴놀린 화합물, 예를 들어 L-746,530; 인돌 및/또는 퀴놀린 화합물, 예를 들어 MK-591, MK-886 및/또는 BAY x 1005;
- 류코트리엔 (LT) B4, LTC4, LTD4, 및 LTE4에 대한 수용체 길항제: 페노티아진-3-1s, 예를 들어 L-651,392; 아미디노 화합물, 예를 들어 CGS-25019c; 벤즈옥살아민, 예를 들어 온타졸라스트; 벤젠 카르복시미다미드, 예를 들어 BIIL 284/260; 및 화합물, 예를 들어 자피르루카스트, 아블루카스트, 몬텔루카스트, 프란루카스트, 베르루카스트 (MK-679), RG-12525, Ro-245913, 아라루카스트 (CGP 45715A) 및 BAY x 7195로 이루어지는 군 중에서 선택됨;
- 포스포디에스테라제 (PDE) 억제제, 예를 들어 메틸잔타닌, 예를 들어 테오필린 및/또는 아미노필린; 및/또는 선택적인 PDE 동종효소 억제제, 예를 들어 PDE4 억제제 및/또는 이소형 PDE4D의 억제제 및/또는 PDE5의 억제제;
- 히스타민 타입 1 수용체 길항제, 예를 들어 세티리진, 로라타딘, 데슬로라타딘, 펙소페나딘, 아크리바스틴, 테르페나딘, 아스테미졸, 아젤라스틴, 레보카바스틴, 클로르페니라민, 프로메타진, 시클리진 및/또는 미졸라스틴 (일반적으로 경구, 국소 또는 비경구적으로 적용됨);
- 양성자 펌프 억제제 (예를 들어 오메프라졸) 또는 위보호성 히스타민 타입 2 수용체 길항제;
- 히스타민 타입 4 수용체의 길항제;
- 알파-1/알파-2 아드레날린수용체 아고니스트 혈관수축제 교감신경 유사 작용제, 예를 들어 프로필헥세드린, 페닐에프린, 페닐프로판올아민, 에페드린, 슈도에페드린, 나파졸린 염산염, 옥시메타졸린 염산염, 테트라히드로졸린 염산염, 자일로메타졸린 염산염, 트라마졸린 염산염 및 에틸노르에피네프린 염산염;
- 항콜린제, 예를 들어 무스카린 수용체 (M1, M2, 및 M3) 길항제, 예를 들어 아트로핀, 히오신, 글리코피롤레이트, 이프라트로퓸 브로마이드, 티오트로퓸 브로마이드, 옥시트로퓸 브로마이드, 피렌제핀 및 텔렌제핀;
- 베타-아드레날린수용체 아고니스트 (베타 수용체 서브타입 1-4 포함), 예를 들어 이소프레날린, 살부타몰, 포르모테롤, 살메테롤, 테르부탈린, 오르시프레날린, 비톨테롤 메실레이트 및/또는 피르부테롤, 예를 들어 그의 키랄 에난티오머;
- 크로몬, 예를 들어 나트륨 크로모글리케이트 및/또는 네도크로밀 나트륨;
- 글루코코르티코이드, 예를 들어 플루니솔리드, 트리암시놀론 아세토니드, 베클로메탄손 디프로피오네이트, 부데소니드, 플루티카손 프로피오네이트, 시클레소니드, 및/또는 모메타손 푸로에이트;
- 핵 호르몬 수용체를 조정하는 물질, 예를 들어 PPAR;
- 면역글로불린 (Ig) 또는 Ig 제제 또는 Ig 기능을 조정하는 길항제 또는 항체, 예를 들어 본 발명의 결합 멤버와 동일하거나 상이한 에피토프에 결합하는 항-IgE;
- 다른 전신 또는 국소 적용 소염제, 예를 들어 탈리도미드 또는 그의 유도체, 레티노이드, 디프라놀 및/또는 칼시포트리올;
- 아미노살리실레이트 및 술파피리딘, 예를 들어 술파살라진, 메살라진, 발살라지드 및 올살라진의 조합물; 및 면역조정제, 예를 들어 티오퓨린; 및 코르티코스테로이드, 예를 들어 부데소니드;
- 항균제, 예를 들어 페니실린 유도체, 테트라사이클린, 마크롤리드, 베타-락탐, 플루오로퀴놀론, 메트로니다졸 및/또는 흡입 아미노글리코시드; 및/또는 항바이러스제, 예를 들어 아시클로비르, 팜시클로비르, 발라시클로비르, 간시클로비르, 시도포비르; 아만타딘, 리만타딘; 리바비린; 자나마비르 및/또는 오셀타마비르; 프로테아제 억제제, 예를 들어 인디나비르, 넬피나비르, 리토나비르 및/또는 사퀴나비르; 뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 예를 들어 디다노신, 라미부딘, 스타부딘, 잘시타빈, 지도부딘; 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 예를 들어 네비라핀, 에파비렌즈;
- 심혈관제, 예를 들어 칼슘 채널 차단제, 베타-아드레날린수용체 차단제, 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제, 안지오텐신-2 수용체 길항제; 지질강하제, 예를 들어 스타틴 및/또는 피브레이트; 혈액 세포 형태의 조정자, 예를 들어 펜톡시필린; 혈전용해제 및/또는 항응고제, 예를 들어 혈소판 응집 억제제;
- CNS제, 예를 들어 항우울제 (예를 들어 세르트랄린), 항-파킨슨 증후군 약물 (예를 들어 데프레닐, L-도파, 로피니롤, 프라미펙솔; MAOB 억제제, 예를 들어 셀레긴 및 라사길린; comP 억제제, 예를 들어 타스마르; A-2 억제제, 도파민 재흡수 억제제, NMDA 길항제, 니코틴 아고니스트, 도파민 아고니스트 및/또는 신경세포 산화질소 합성효소의 억제제) 및 항-알쯔하이머 약물, 예를 들어 도네페질, 리바스티그민, 타크린, COX-2 억제제, 프로펜토필린 또는 메트리포네이트;
- 급성 및 만성 통증 치료제, 예를 들어 중추 또는 말초 작용 진통제, 예를 들어 아편 유사체 또는 유도체, 카르바마제핀, 페니토인, 발프로산나트륨, 아미트립틸린 또는 다른 항우울제, 파라세타몰, 또는 비-스테로이드성 소염제;
- 비경구 또는 국소 적용 (흡입 포함) 국소 마취제, 예를 들어 리그로카인 또는 그의 유사체;
- 항-골다공증제, 예를 들어 호르몬제, 예를 들어 랄록시펜, 또는 비포스포네이트, 예를 들어 알렌드로네이트;
- (i) 트립타제 억제제; (ii) 혈소판 활성화 인자 (PAF) 길항제; (iii) 인터루킨 전환 효소 (ICE) 억제제; (iv) IMPDH 억제제; (v) 부착 분자 억제제, 예를 들어 VLA-4 길항제; (vi) 카텝신; (vii) 키나제 억제제, 예를 들어 티로신 키나제의 억제제 (예를 들어 Btk, Itk, Jak3 MAP; 억제제의 예는 게피티닙, 이마티닙 메실레이트를 포함할 수 있다), 세린/트레오닌 키나제 (예를 들어 MAP 키나제의 억제제, 예를 들어 p38, JNK, 단백질 키나제 A, B 및 C 및 IKK), 또는 세포 주기 조절에 관련된 키나제 (예를 들어 사이클린 의존성 키나제); (viii) 글루코스-6 포스페이트 데히드로게나제 억제제; (ix) 키닌-B1 및/또는 B2-수용체 길항제; (x) 항-통풍제, 예를 들어 콜히친; (xi) 잔틴 옥시다제 억제제, 예를 들어 알로푸리놀; (xii) 요산배설제, 예를 들어 프로베네시드, 술핀피라존, 및/또는 벤즈브로마론; (xiii) 성장 호르몬 분비촉진제; (xiv) 전환 성장 인자 (TGFβ); (xv) 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); (xvi) 섬유모세포 성장 인자, 예를 들어 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF); (xvii) 과립구 포식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF); (xviii) 캡사이신 크림; (xix) 타키키닌 NK1 및/또는 NK3 수용체 길항제, 예를 들어 NKP-608C, SB-233412 (탈네탄트) 및/또는 D-4418; (xx) 엘라스타제 억제제, 예를 들어 UT-77 및/또는 ZD-0892; (xxi) TNF-알파 전환 효소 억제제 (TACE); (xxii) 유도 산화질소 합성효소 (iNOS) 억제제 또는 (xxiii) TH2 세포 상에 발현되는 화학유인물질 수용체-상동성 분자 (예를 들어, CRTH2 길항제); (xxiv) P38의 억제제; (xxv) Toll-유사 수용체 (TLR)의 기능 조정제 및 (xxvi) 퓨린성 수용체의 활성 조정제, 예를 들어 P2X7; (xxvii) 전사 인자 활성화 억제제, 예를 들어 NFkB, API, 및/또는 STATS.
억제제는 특이적일 수 있거나 또는 혼합된 억제제, 예를 들어 1 초과의 분자 (예를 들어 수용체) 또는 상기 언급한 분자 클래스를 표적으로 하는 억제제일 수 있다.
또한, 결합 멤버는 화학요법제, 예를 들어 티로신 키나제 억제제와 함께 동시 투여되거나 또는 면역컨쥬게이트의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 상기 항체의 단편은 재조합 메카니즘 또는 생화학적 커플링, 이어서 상기한 항체의 특이성을 IgE가 관련되는 활성에 관여하는 다른 분자를 인식할 수 있는 다른 항체의 특이성과 연결시켜 얻은 이중특이적 항체에 사용될 수 있다.
염증성 질병, 예를 들어 류마티스 관절염, 골관절염, 천식, 알레르기성 비염, 만성 폐쇄성 폐 질병 (COPD), 또는 건선의 치료를 위해, 본 발명의 결합 멤버는 하나 이상의 물질, 예를 들어 비스테로이드성 소염제 (이하 NSAID), 예를 들어 비-선택적인 시클로옥시게나제 (COX)-1/COX-2 억제제 (국소 또는 전신 적용 여부와 무관함), 예를 들어 피록시캄, 디클로페낙, 프로피온산, 예를 들어 나프록센, 플루르비프로펜, 페노프로펜, 케토프로펜 및 이부프로펜, 페나메이트, 예를 들어 메페남산, 인도메타신, 술린닥, 아자프로파존, 피라졸론, 예를 들어 페닐부타존, 살리실레이트, 예를 들어 아스피린); 선택적인 COX-2 억제제 (예를 들어 멜록시캄, 셀레콕시브, 로페콕시브, 발데콕시브, 루마로콕시브, 파레콕시브 및 에토리콕시브); 시클로-옥시게나제 억제성 산화질소 공여체 (CINOD); 글루코코르티코스테로이드 (국소, 경구, 근내, 정맥내 또는 관절내 경로에 의해 투여되는지 여부와 무관); 메토트렉세이트, 레플루노미드; 히드록시클로로퀸, d-페니실라민, 아우라노핀 또는 다른 비경구 또는 경구 금 제제; 진통제; 디아세레인; 관절내 치료제, 예를 들어 히알루론산 유도체; 및 영양 보충제, 예를 들어 글루코사민과 조합될 수 있다.
본 발명의 결합 멤버 및 하나 이상의 상기 추가의 의약 성분이 의약의 제조에 사용될 수 있다. 의약은 개체에게 별개로 투여하거나 또는 조합 투여를 위한 것일 수 있고, 따라서 조합 제제로서 또는 별개의 제제로서 결합 멤버 및 추가의 성분을 포함할 수 있다. 별개의 제제는 별개의 순차적인 투여 또는 동시 투여를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있고, 상이한 경로, 예를 들어 경구 및 비경구 투여에 의한 성분의 투여를 가능하게 한다.
본 발명에 따라 제공되는 조성물은 포유동물에게 투여될 수 있다. 투여는 보통 "치료 유효량"으로 이루어지고, 이것은 환자에게 잇점을 주기에 충분한 양이다. 적어도 상기 잇점은 적어도 하나의 증상의 개선일 수 있다. 투여되는 실제량 및 투여 속도 및 시간 경로는 치료되는 질병의 특성 및 심도, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 조성물의 전달 부위, 결합 멤버의 종류, 투여 방법, 투여 스케쥴 및 제약 실무자에게 공지된 다른 요인에 따라 결정될 것이다. 치료 처방, 예를 들어 용량 결정 등은 일반적인 개업의 및 다른 의사의 책임 하에 결정되고, 증상의 심도 및/또는 치료되는 질병의 경과에 의해 결정될 수 있다. 항체의 적절한 투여량은 당업계에 공지되어 있다 [67, 68]. 본원에서 또는 문헌 [Physician's Desk Reference (2003)]에서 투여되는 의약의 종류에 적절한 것으로 제시된 특정 용량이 사용될 수 있다. 본 발명의 결합 멤버의 치료 유효량 또는 적합한 투여량은 그의 시험관 내 활성 및 동물 모델에서의 생체 내 활성을 비교하여 결정할 수 있다. 마우스 및 다른 시험 동물에서 효과적인 용량을 인간에게 외삽하기 위한 방법이 공지되어 있다. 정확한 투여량은 항체가 진단, 예방 또는 치료용인지의 여부, 치료되는 영역의 크기 및 위치, 항체 (예를 들어 전체 항체, 단편 또는 디아바디)의 정확한 특성 및 항체에 부차되는 임의의 검출가능한 표지 또는 다른 분자의 특성을 포함하는 많은 요인에 따라 결정될 것이다. 전형적인 항체 투여량은 전신 투여를 위해 100 ㎍ 내지 1 g, 국소 투여를 위해 1 ㎍ 내지 1 mg일 것이다. 초기에 보다 많은 로딩 투여량을 투여한 후, 1회 이상의 더 적은 투여량을 투여할 수 있다. 일반적으로, 항체는 전체 항체, 예를 들어 IgG1 이소형, IgG2 이소형, IgG3 이소형 또는 IgG4 이소형일 것이다. 이것은 성인 환자의 1회 치료를 위한 투여량으로서, 아동 및 유아에 대해 비례에 따라 조정될 수 있고, 또한 분자량에 비례하여 다른 항체 포맷에 대해서도 조정될 수 있다. 치료는 의사의 판단에 따라 1일, 1주 2회, 1주 또는 1개월 간격으로 반복될 수 있다. 치료는 피하 투여를 위해 2 내지 4주마다, 정맥내 투여를 위해 4 내지 8주마다 시행될 수 있다. 치료는 주기적일 수 있고, 투여 사이의 기간은 약 2주 이상, 예를 들어 약 3주 이상, 약 4주 이상 또는 약 1개월일 수 있다. 치료는 수술 전 및/또는 후에 시행될 수 있고/있거나, 투여되거나 수술에 의한 해부학상 치료 부위에 직접 적용될 수 있다.
<표 및 도면의 간단한 설명>
표 1은 각각의 항체 1-28의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 나열한 것이다.
표 2a는 수용체-리간드 결합 HTRF® 분석으로 시험할 때 표적화된 돌연변이 유발 라이브러리로부터 확인된 클론의 예시적인 효능을 보여준다. 표 2b는 SPR (BIACORE)를 사용하여 측정한, 인간 IgE 및 사이노몰거스 원숭이 IgE에 대한 본 발명의 예시적 결합 멤버의 결합 친화도 (KD)를 보여준다. 표 2b는 RBL-ER51 칼슘 신호전달 분석 (4시간 동안, 25 ng/ml의 인간 또는 100 ng/ml의 사이노몰거스 원숭이 IgE를 사용)에서 본 발명의 예시적 결합 멤버의 효능 (IC50으로 표현)을 추가로 보여준다.
표 3a는 서열 번호가 표 3a에 제시된 것에 대응하는 첨부 서열 목록에 제시된 본 발명의 예시적인 결합 멤버의 서열을 보여준다.
표 3b는 서열 번호가 표 3b에 제시된 것에 대응하는 첨부 서열 목록에 제시된, 본 발명의 예시적인 결합 멤버의 VL DNA 및 VL 아미노산 서열을 보여준다.
표 4는 생식세포에서 유도된 항체에 대해 BIAcore를 사용한 예시적 결합 친화도 계산 및 RBL-ER51 칼슘 신호전달 분석을 사용한 효능 측정치를 보여준다.
표 5는 상호작용 1에 대한 x-선 결정학 연구에서 IgE Cε3-Cε4와 항체 11 Fab 사이의 직접적인 상호작용을 보여준다.
표 6은 상호작용 2에 대한 x-선 결정학 연구에서 IgE Cε3-Cε4와 항체 11 Fab 사이의 직접적인 상호작용을 보여준다.
표 7은 x-선 결정학 연구로부터 결정 파라미터 및 X-선 데이타 처리 및 정교화 통계 처리를 보여준다.
표 8은 안전성 연구에서 요약한 연구 디자인을 보여준다 (실시예 8).
도 1은 실시예 2.7에 관한 것으로서, x-축 상에 로그 (log)로 표현된 항체의 몰 농도를, y축 상에 RBL-ER51 칼슘 신호전달 분석에서의 피크 높이를 보여준다. 빈 정사각형은 항체 11에 관련되고, 십자 기호는 관련되지 않은 IgG1 대조군 항체에 관련되고, 역삼각형은 항-IgE 가교결합 항체 (바이오소스 (Biosource))에 관련된다. 빈 정사각형 및 십자 기호는 이 도면에서 서로 중첩된다.
도 2는 사이노몰거스 Cε3-4 FLAG His10의 서열을 보여준다.
도 3은 인간 항-에스트라디올 scFv (D12_VH) 및 사이노몰거스 IgHE 유전자 반수체의 하나 (cyIgHE TQ)를 코딩하는 가변 중쇄의 서열을 보여준다.
도 4는 인간 항-에스트라디올 scFv (D12_VH) 및 사이노몰거스 IgHE 유전자 반수체의 하나 (cyIgHE ME)를 코딩하는 가변 중쇄의 서열을 보여준다.
도 5는 인간 항-에스트라디올 scFv (D12_VL) 및 사이노몰거스 람다 불변 구역 유전자 cyIGLC 4의 가변 경쇄의 서열 (서열 범위: 1 내지 708)을 보여준다.
도 6은 인간 항-에스트라디올 scFv (D12_VL)의 가변 경쇄 및 사이노몰거스 람다 불변 구역 유전자 D12_VL cyIGLC 7을 보여준다.
도 7은 실시예 3에 관한 것으로서, 차단 항-IgE로 처리하지 않은 B 세포에서 최대 IgE 발현의 억제 비율을 보여주고, 여기서 x축은 항체 11의 농도 (nM)이고, y축은 억제 비율이다. 상부의 그래프는 항체 11에, 하부의 그래프는 대조군 항체에 관한 것이다.
도 8은 실시예 4에 관한 것으로서, β-헥소사미니다제의 총 방출의 억제 비율 ± SEM을 보여주고, 여기서 x축은 항체 11의 농도 (nM)이고, y축은 억제 비율이다. 상부의 그래프는 항체 11에, 하부의 그래프는 대조군 항체에 관한 것이다.
도 9는 실시예 5에 관한 것이다. 이 도면은 항-IgE 항체인 항체 11의 농도를 증가시키면서 인간 혈청에서 결합된 IgE의 비율을 보여준다. x-축은 항체 11의 농도 (마이크로그램/ml)를 나타내고, y축은 결합된 IgE의 양을 분석된 유리 IgE의 비율로서 보여주고, 총 IgE의 함수로서 플로팅된다.
도 10은 실시예 7에 관한 것으로서, a) IgE Cε3-Cε4 이량체의 리본 표현 형태 - 2개의 단량체는 IgE1 및 IgE2로 표시되고, 2개의 항체 11 Fab 분자와 상호작용한다. Asn394에서의 글리코실화는 구-막대 (ball-and-stick) 모델로 제시된다; 및 b) Fab 단편으로부터 IgE에 대한 대부분의 상호작용이 중쇄에 의해 제시됨을 보여주는, 위에서 아래로 조망하는 90도 회전도를 보여준다. 이 도면은 프로그램 PyMOL (델라노 사이언티픽 엘엘씨 (DeLano Scientific LLC, 미국 캘리포니아주 산 카를로스)을 사용하여 작성하였다.
도 11은 실시예 7에 관한 것으로서, IgE의 위치 Asn394에서의 글리코실화를 보여준다.
도 12는 실시예 8에 관한 것으로서, 사이노몰거스 원숭이에서 1 mg/kg (1일), 30 mg/kg (8일), 및 100 mg/kg (16일 이후) 투여 후에 항체 11 IgG1, 항체 11 IgG2 및 E48의 평균 독성동태 (toxicokinetic) 프로필을 보여준다. 오차 막대는 표준편차를 나타낸다. y-축은 항체의 혈청 농도이고, x축은 제1 투여 후의 시간 (일)이다. 1군 (항체 11 IgG1)은 충전된 원으로 제시되고, 2군 (항체 11 IgG2)은 빈 삼각형으로 제시되고, 3군 (상이한 항-IgE 분자 E48)은 충전된 정사각형으로 제시된다.
도 13은 실시예 8에 관한 것으로서, 항체 11 IgG1, 항체 11 IgG2 및 E48 (1일에 1 mg/kg, 8일에 30 mg/kg, 및 16일 이후에 100 mg/kg)을 매주 투여한 사이노몰거스 원숭이의 평균 유리 IgE 프로필을 보여준다. 오차 막대는 표준편차이다. y-축은 IgE 농도 (ng/ml)이고, x축은 시간 (일)이다. 1군 (항체 11 IgG1)은 충전된 원으로 제시되고, 2군 (항체 11 IgG2)은 빈 삼각형으로 제시되고, 3군 (상이한 항-IgE 분자 E48)은 충전된 정사각형으로 제시된다.
도 14는 실시예 8에 관한 것으로서, 1군 (항체 11 처리군)의 동물로부터의 혈장 농도에 대해 2회의 투여전 값의 평균으로부터의 변화율로서 표현한 혈소판 수치 (x109/L)의 그래프를 보여준다. 이 그래프는 혈소판에 대해 유의한 효과를 보이지 않은 3개의 군에 걸쳐서 다른 16마리의 동물을 대표하는 것이다. x-축은 시간을 나타내고, 왼쪽 y축은 평균 수준의 전처리로부터의 변화율로서의 혈소판 수준이고, 우측 y-축은 항-IgE 항체의 농도 (nmol/L)이다. 닫힌 정사각형은 혈소판 농도를 나타내고, 충전된 다이아몬드는 항-IgE 항체의 농도를 나타낸다. 닫힌 삼각형은 항-IgE 항체의 투여량 (mg/kg)을 나타낸다.
도 15는 실시예 8에 관한 것으로서, 29일에 혈소판 수치의 일시적인 유의한 하락 (기준선의 35％ 미만)을 보인 1군 (항체 11 IgG1 처리군)의 동물로부터의 혈장 농도에 대해 2회의 투여전 값의 평균으로부터의 변화율로서 표현한 혈소판 수치 (x109/L)의 그래프를 보여준다. x-축은 시간을 나타내고, 왼쪽 y축은 평균 수준의 전처리로부터의 변화율로서의 혈소판 수준이고, 우측 y-축은 항-IgE 항체의 농도 (nmol/L)이다. 닫힌 정사각형은 혈소판 농도를 나타내고, 충전된 다이아몬드는 항-IgE 항체의 농도를 나타낸다. 닫힌 삼각형은 항-IgE 항체의 투여량 (mg/kg)을 나타낸다.
도 16은 실시예 9에 관한 것으로서, IgE/FcεRI-매개된 세포독성의 항체 11 억제를 보여준다. x축은 항체 11의 몰 농도이고, y축은 세포독성 비율이다. 그래프에서, 빈 삼각형 및 속이 찬 원은 Mov18 IgE 실험에 관한 것으로서, 빈 삼각형은 이소형 대조군이고, 속이 찬 원은 항체 11이고, 그래프에서, 진한 빈 삼각형 (그래프의 우측의 점 아래에 감춰짐) 및 빈 원은 NIP IgE 대조군에 관한 것으로서, 빈 진한 삼각형은 이소형 대조군이고, 빈 원은 항체 11이다.
도 17은 실시예 9에 관한 것으로서, IgE/CD23-매개된 포식작용의 항체 11 억제를 보여준다. x축은 항체 11의 몰 농도이고, y축은 포식작용 비율이다. 그래프에서, 삼각형 및 속이 찬 원은 Mov18 IgE 실험에 관한 것으로서, 빈 삼각형은 이소형 대조군이고, 속이 찬 원은 항체 11이고, 그래프에서, 진한 빈 삼각형 및 빈 원은 NIP IgE 대조군에 관한 것으로서, 빈 진한 삼각형은 이소형 대조군이고, 빈 원은 항체 11이다.
섬유상 파지 M13을 기재로 하는 파지미드 벡터 내로 클로닝된 나이브 (naive) 인간 단일쇄 Fv (scFv) 파지 디스플레이 라이브러리를 선별에 사용하였다 [69, 70]).
항-IgE 특이적인 scFv 항체는 재조합 인간 IgE에 대한 일련의 선별 사이클을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리하였다.
선별된 scFv 항체는 인간 IgE에 대한 결합 및/또는 효능에 대해 최적화되고, IgG 항체로서 재편된다.
서열
본 발명의 예시적 결합 멤버의 서열을 첨부된 서열 목록에 제시하고, 여기서 서열 번호는 하기 표 3a에 제시된 것과 대응하고, 여기서
i) 항체 번호 다음에 GL이 올 경우, 예를 들어 8GL의 경우, 이것은 하나 이 상의 잔기가 생식세포 입체형태로 다시 돌연변이된 항체를 의미하고, 일반적으로 GL이 사용될 경우, 활성을 평가할 수 있을 정도로 상실하지 않으면서 생식세포로 다시 돌연변이될 수 있는 모든 비-생식세포 잔기는 생식세포에서 유도된 것이고;
ii) 항체 번호 다음에 PGL이 올 경우, 예를 들어 11PGL의 경우, 이것은 하나 이상의 잔기가 생식세포 입체형태로 다시 돌연변이된 항체를 의미하고, 일반적으로 PGL이 사용될 경우, GL보다 더 많은 잔기가 생식세포로 다시 돌연변이되지만, 비-생식세포에서 유도된 것보다 활성의 일부 상실을 야기한다.
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Figure 112009049721163-PCT00003
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Figure 112009049721163-PCT00010
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가출원 (US 가출원 60/901304)과 함께 제출된 서열 목록에서, VL DNA 및 대응하는 VL 아미노산에 대해 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에서 제시된 3' ggt 코돈, 및 대응하는 글라이신 잔기의 서열이 상기 항체의 표현된 scFv 및 IgG 서열에 포함되었다. 서열의 C 말단 글라이신 잔기는 카바트 잔기 108에 대응한다. 이 말단 글라이신은 VL 서열의 일부가 아니고, 표 3a에 나열된 서열로부터 제거되었다. 가출원의 VL DNA 및 VL 아미노산에 대한 서열이 서열 목록과 함께 포함되고, 하기 표 3b에 나열된다. 상기 잔기 및 그의 코딩 삼중자 (triplet) ggt는 아래에서 설명된다.
IgG의 경쇄를 표현하기 위해서, VL 도메인을 코딩하는 제1 엑손, CL 도메인을 코딩하는 제2 엑손, 및 제1 엑손과 제2 엑손을 분리하는 인트론을 포함하는, 항체 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제시되었다. 정상적인 환경 하에서, 제1 엑손의 3' 말단과 제2 엑손의 5' 말단을 연결하는 인트론은 세포의 mRNA 처리 기구에 의해 스플라이싱된다. 따라서, 상기 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA가 RNA로서 발현될 때, 제1 및 제2 엑손은 함께 스플라이싱되었다. 스플라이싱된 RNA의 번역은 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 생성시킨다. 스플라이싱 후에, 카바트 잔기 108의 Gly는 VL 도메인 프레임워크 4 서열의 마지막 염기 (g) 및 CL 도메인의 처음 2개의 염기 (gt)에 의해 코딩된다.
따라서, 카바트 잔기 108의 글라이신 잔기가 가출원에서 VL 서열의 서열 목록에 포함되었지만, 상기한 바와 같이 이는 항체 분자의 VL 도메인의 C 말단 잔기로 간주되지 않아야 하고, 표 3a에서 서열 목록으로부터 제거되었다.
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Figure 112009049721163-PCT00014
Figure 112009049721163-PCT00015
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Figure 112009049721163-PCT00017
가출원의 서열 목록에서, 항체 29 - 34로 나열된 서열은 표 3a에 항체 8GL, 8PGL, 11GL 및 11PGL로 나열된다. 상기 항체의 일부는 공통적인 VL 도메인을 공유하고, 그 결과 가출원에서 제공된 서열 목록 내의 일부 서열 번호가 비어 있다. 항체의 정확한 조성은 다음과 같다:
항체 29는 8GL VH 도메인에 대응한다.
항체 30은 8PGL VH 도메인에 대응한다.
항체 31은 8GL 및 8PGL에 의해 공유되는 VL 도메인에 대응한다.
항체 32는 11GL VH 도메인에 대응한다.
항체 33은 11PGL VH 도메인에 대응한다.
항체 34는 11GL 및 11PGL에 의해 공유되는 VL 도메인에 대응한다.
서열 286, 292, 293, 304, 310 및 311은 비어 있다. 이것은 표 3a에서 정정되었다.
이제 본 발명을 하기 비제한적인 실시예에 의해 예시할 것이다.
실시예 1. 초기 단리
1.1 선별
섬유상 파지 M13을 기재로 하는 파지미드 벡터 내로 클로닝된 나이브 인간 단일쇄 Fv (scFv) 파지 디스플레이 라이브러리를 선별을 위해 사용하였다 ([Vaughan et al., Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996)], [Hutchings, Antibody Engineering, R.Kontermann and S. Dubel, Editors. 2001], [Springer Laboratory Manuals, Berlin. P93]). 항-IgE 특이적인 scFv 항체를 본질적으로 이전에 문헌 [Vaughan et al., Nature Biotechnology 14:309-314 (1996)]에 기재된 바와 같이 혈장 정제된 인간 IgEκ (칼바이오켐 (Calbiochem)) 또는 혈장 정제된 인간 IgEλ (바이오디자인 (Biodesign))에 대한 일련의 선별 사이클을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리하였다. 간단히 설명하면, 패닝 (panning) 선별을 위해, PBS (둘베코 (Dulbecco)의 PBS (pH 7.4)) 중의 인간 IgE를 Maxisorp 미량역가판 (Nunc)의 웰 상에 4℃에서 밤새 흡착시켰다. 웰을 PBS로 세척한 후, 1시간 동안 PBS-Marvel (3％ w/v)로 세척하였다. PBS-Marvel (3％ w/v) 중의 정제된 파지를 웰에 첨가하고, 코팅된 항원에 1시간 동안에 결합시켰다. 비결합 파지는 PBS-Tween (0.1％ v/v) 및 PBS를 사용하는 일련의 세척 사이클에 의해 제거하였다. 결합된 파지 입자를 용출시키고, 세균 내로 감염시키고, 후속 선별 라운드를 위해 구제하였다 (Vaughan et al., Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996)). 카파 및 람다 형태의 IgE를 사용하여 다른 선별 라운드를 수행하였다.
1.2 비정제된 scFv 에 의한, Fc ε RI 에 대한 IgE 결합의 억제
제2 선별 라운드로부터의 대표적인 수의 개별적인 scFv를 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. ScFv를 세균 주변세포질에서 발현시키고, 균질한 FRET (형광 공명 에너지 전달) 기반 인간 IgE/인간 FcεRI-결합 분석에서 그의 억제 활성에 대해 스크리닝하였다. 상기 분석에서, 샘플 유로퓸 킬레이트 (Europium Chelate) (퍼킨 엘머 1244-302)로 표지된 인간 IgE (칼바이오켐 401152)에 대한 결합을 위해 인간 FcεRI-Fc (자체 개발한 NS0 세포에서 생산됨)와 경쟁하였다. 상세한 분석 방법은 물질 및 방법 섹션에 제시된다.
1.3 정제된 scFv 에 의한, Fc ε RI 에 대한 IgE 결합의 억제
비정제된 주변세포질 추출물로서 IgE:FcεRI 상호작용에 대한 유의한 억제 효과를 보인 ScFv의 DNA 서열을 결정하였다 ([Vaughan et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 309-314], [Osbourn 1996; Immunotechnology. 2, 181-196]). 특유한 scFv를 다시 세균 내에서 발현시키고, 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (문헌 [Bannister et al (2006) Biotechnology and bioengineering, 94. 931-937] 참조). 상기 샘플의 효능은 유로퓸 킬레이트 (퍼킨 엘머 1244-302)로 표지된 인간 IgE (칼바이오켐 401152)에 대한 결합을 위해 정제된 제제의 일련의 희석물을 FcεRI (자체 개발한 NS0 세포에서 생산됨)에 대해 경쟁시켜 결정하였다. 정제된 scFv 제제, 예를 들어 항체 1은 IgE-FcεRI 상호작용을 억제할 수 있었다. 상세한 프로토콜은 물질 및 방법 섹션에 제시되었다.
1.4 scFv 의 IgG1 로의 재편재
VH 및 VL 도메인을 각각 전체 항체 중쇄 및 경쇄를 발현하는 벡터 내로 서브-클로닝함으로써 클론을 scFv로부터 IgG 포맷으로 전환시켰다. VH 도메인은 각각 포유동물 세포에서 전체 IgG1 또는 IgG2 중쇄를 발현하기 위해서 인간 중쇄 불변 도메인 및 조절 요소를 함유하는 벡터 (pEU15.1 또는 pEU9.2) 내로 클로닝하였다. 이와 유사하게, VL 도메인은 포유동물 세포에서 전체 IgG 경쇄를 발현하기 위해서 조절 요소와 함께, 인간 카파 경쇄의 발현을 위해 벡터 pEU3.4 내로 또는 인간 람다 경쇄 불변 도메인의 발현을 위해 pEU4.4 내로 클로닝되었다. 중쇄 및 경쇄의 발현을 위한 벡터는 본래 문헌 [Persic, L., et al. (1997) Gene 187, 9-18]에 기재되었다. 캠브리지 안티바디 테크놀로지 (Cambridge Antibody Technology) 벡터는 EBNA1 단백질과 조합되어 플라스미드의 에피좀 (episomal) 복제를 가능하게 하는 EBV OriP 성분을 포함하도록 공학적으로 처리되었다. IgG를 얻기 위해, 경쇄 및 경쇄 IgG 발현 벡터를 EBNA-HEK293 포유동물 세포 내로 형질감염시켰다. IgG가 발현되고, 배지 내로 분비되었다. 수확물을 모으고 여과한 후 정제하였다. 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 IgG를 정제하였다. 배양 상등액을 Ceramic 단백질 A 컬럼 (바이오세프라 (BioSepra)) 상에 로딩하고, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 250 mM NaCl로 세척하였다. 결합된 IgG를 0.1 M 시트르산나트륨 (pH 3.0)을 사용하여 컬럼으로부터 용출시키고, Tris-HCl (pH 9.0)의 첨가에 의해 중화시켰다. 용출된 물질을 Nap 10 컬럼 (아머샴 (Amersham), #17-0854-02)을 사용하여 PBS 내로 버퍼 교환하고, IgG의 농도를 IgG의 아미노산 서열을 기초로 한 흡광 계수 (extinction coefficient)를 사용한 분광광도 분석으로 결정하였다 (Mach et al Anal. Biochem. 200(1): 20-26, 1992). 정제된 IgG를 SEC-HPLC 및 SDS-PAGE에 의해 응집 또는 분해에 대해 분석하였다.
1.5 정제된 scFv 및 IgG 에 의한 RBL - ER51 세포에서 칼슘 신호전달의 억제
FcεRI를 통해 매개되는 인간 IgE 생물활성에 대한 정제된 scFv 및 IgG 제제의 중화 효능을 RBL-ER51 칼슘-신호전달 분석을 이용하여 평가하였다. RBL-2H3 세포 (래트 호염기구성 세포주)는 인간 FcεRI (RBL-ER51 세포)로 안정하게 형질감염되었다. 세포 부근의 유리 IgE는 세포 표면 상의 FcεRI에 결합하고, 수용체-결합된 IgE의 후속적인 가교결합은 형광측정 영상화 플레이트 판독기 (FLIPR)를 이용하여 검출될 수 있는 칼슘 이동을 야기한다. 상세한 프로토콜은 물질 및 방법 섹션에 제시된다.
항체 1의 정제된 scFv 제제는 시험된 최대 농도에서 RBL-ER51 세포의 IgE 유도된 칼슘 신호전달을 억제할 수 있었다. 정제된 IgG로서 시험할 때, 항체 1에 대한 IC50은 34 nM인 것으로 계산되었다.
1.6 DELFIA ® 에피토프 경쟁 분석에서 항체의 선택성 및 종 교차반응성
항체의 IgE 및 구조상 관련된 분자인 IgA, IgM, IgD 및 IgG에 대한 종 교차반응성 및 선택성을 DELFIA® 에피토프 경쟁 분석을 사용하여 확립하였다. 분석은 각각의 고정된 항-IgE 항체에 결합하는 비오티닐화된 IgE (혈장 정제됨, 바이오디자인 인터내셔날 (BIODESIGN International))의 억제를 측정함으로써 상대적인 교차반응성을 결정한다.
정제된 IgA, IgM, IgD, 및 IgG (모두 칼바이오켐)의 적정액을 분석에서 IC50 값에 의해 측정되는 바와 같은 각각의 구조상 관련된 단백질에 대한 특이성 프로필을 확립하기 위해 각각의 분석에서 시험하였다.
사이노몰거스 IgE Cε3-Cε4 도메인 (자체 개발한 HEK-EBNA 유래), 인간 IgE Cε3-Cε4 도메인 (자체 개발한 HEK-EBNA 유래) 및 인간 IgE 람다 (바이오디자인 인터내셔날)를 포함하는 IgE 종의 적정액을 항체의 종 교차반응성을 확립하기 위해 각각의 분석에서 시험하였다. 인간 및 사이노몰거스 IgE Cε3-Cε4 도메인과 함께 전장 인간 IgEλ는 억제 곡선을 생성하였다. 임의의 구조상 관련된 단백질에 대해 억제가 관찰되지 않았다. 이들 데이타는 항체 1이 인간 IgEλ, 즉 IgE의 Cε3-Cε4 도메인에 결합하고 사이노몰거스 IgE에 교차반응성임을 입증한다. 그러나, 항체 1은 IgE에 대한 대부분의 관련된 임의의 인간 단백질에 결합하지 않는다. 상세한 프로토콜은 물질 및 방법 섹션에 제시된다.
1.7 정제된 IgG 에 의한 CD23 에 대한 IgE 결합의 억제
IM9 세포 (인간 B 세포주)는 기초 조건 하에 CD23을 발현하지만 FcεRI를 발현하지 않는 것으로 나타났다. IgE는 IM9 세포의 표면 상의 CD23에 결합한다. 이어서, CD23-결합된 IgE는 항-IgE-피코에리트린 (칼태그 (Caltag))에 결합하고, 유동 세포 측정 (FACSCalibur, 비디 바이오사이언시스 (BD Biosciences))에 의해 검출할 수 있다.
항체를 IgE/CD23 상호작용의 억제에 대해 평가하였다. 상기 절차에 대한 상세한 프로토콜은 물질 및 방법 섹션에 제시된다. 간단히 설명하면, 시험 IgG의 적정물을 IgE와 혼합한 후, IM9 세포와 함께 인큐베이션하였다. 1시간 인큐베이션 후, 세포를 세척하고, 결합된 IgE를 항-IgE-피코에리트린 (칼태그)을 사용하여 검출하였다. 항체 1은 IgE/CD23 상호작용을 16 nM의 IC50 (n=3)으로 억제하였다.
1.8 Fc ε RI - 결합된 IgE 의 가교결합
항체를 RBL-ER51 칼슘-신호전달 분석을 이용하여 FcεRI-결합된 IgE에 가교결합할 가능성에 대해 평가하였다. 물질 및 방법 섹션에 설명된 RBL-ER51 세포에 IgE를 로딩하였다. 항체를 IgE-로딩된 세포와 함께 인큐베이션하고, 칼슘 반응을 자극하는 그들의 능력에 대해 평가하였다. 항체 1은 검출가능한 칼슘 반응을 유도할 수 없었다.
실시예 2. 항체 최적화
2.1 표적화된 돌연변이 유발에 의한 모 클론의 최적화
친화도-기반 파지 디스플레이 선별을 이용하는 표적화된 돌연변이 유발 방법을 사용하여 항체 1을 최적화하였다. 표적화된 돌연변이 유발 방식을 위해, 초기 클론으로부터 유도된 큰 scFv 파지 라이브러리를, 문헌 [Clackson and Lowman 2004 (A Practical Approach, 2004. Oxford University Press)]에 설명된 바와 같이 가변 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 3 (CDR3)의 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이 유발에 의해 생성시켰다.
IgE에 대한 보다 높은 친화도를 갖는 변이체를 선택하기 위해 라이브러리를 친화도-기반 파지 디스플레이 선별에 적용하였다. 그 결과, 이들은 IgE 결합 FcεR1에 대해 개선된 억제 활성을 보였다. 선별은 본질적으로 이전에 문헌에 설명된 바와 같이 수행하였다 (Thompson 1996; Journal of Molecular Biology. 256. 77-88). 간단히 설명하면, scFv 파지 입자를 용액 내에서 비오티닐화된 인간 IgEλ (문헌 [Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167]에서 유도되고 자체적으로 변형된 U266)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 항원에 결합된 ScFv-파지는 제조사의 권고에 따라 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드 (Dynabeads® M280) 상에 포획하였다. 이어서, 선택된 scFv-파지 입자를 이전에 설명된 바와 같이 구제하고 (Vaughan et al., Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996)), 선별 과정을 감소하는 농도의 생체-인간 IgE (5 라운드에 걸쳐 250 nM에서 25 pM으로)의 존재 하에 반복하였다.
5 라운드의 선별 종료시에, VH 및 VL 무작위화 라이브러리는 재조합되어, 무작위하게 페어링된, 개별적으로 무작위화된 VH 및 VL 서열을 클론이 함유하는 단일 라이브러리를 형성하였다. 이어서, 감소하는 농도의 생체-인간 IgE (추가의 3 라운드에 걸쳐 100 pM에서 1 pM로)의 존재 하에 이전에 설명된 바와 같이 선별을 계속하였다.
2.2 항체- 리간드 생화학적 분석을 사용하여 표적화된 돌연변이 유발로부터 개선된 클론의 확인
표적화된 돌연변이 유발 선별 결과물로부터의 ScFv를 세균 주변세포질에서 발현시키고, 항-인간-IgE (실시예 1에서 단리된 항체 1)에 결합하는 유로퓸 크립테이트 (씨아이에스 바이오 인터내셔날 62EUSPEA)로 표지된 인간 IgE (U266-유래됨 [Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])의 억제에 대해 에피토프 경쟁 HTRF® (균질 시간차 형광) 분석 포맷으로 스크리닝하였다. 상세한 분석 방법은 물질 및 방법 섹션에서 제시된다. 유의한 억제 효과를 보인 ScFv의 DNA 서열을 결정하고, 특유한 scFv를 정제된 제제로 제조하였다.
2.3 정제된 scFv 에 의한 Fc ε RI 에 대한 IgE 결합의 억제
정제된 scFv를 인간 FcεR1-Fc (자체 개발한 NS0 세포에서 생산됨)에 결합하는 유로퓸 크립테이트 (씨아이에스 바이오 인터내셔날 62EUSPEA)로 표지된 인간 IgE (U266-유래됨 [Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167]) 또는 cyno IgE (재조합, 물질 및 방법 참조)의 억제에 대해 수용체-리간드 결합 HTRF® (균질 시간차 형광) 분석 포맷으로 시험하였다. 예시적인 scFv 효능 데이타는 표 2a에 포함된다.
Figure 112009049721163-PCT00018
2.4 정제된 IgG 에 의한 RBL - ER51 세포에서 칼슘 신호전달의 억제
IgG로서의 재편재 후에, 최적화된 클론의 효능을 변형된 RBL-ER51 칼슘 신호전달 분석을 사용하여 결정하였다. 상기 분석은 보다 효능있는 항체의 검출을 위해 감도를 개선시키기 위해 초기 단리 동안 사용된 방법으로부터 변용한 것이다. 상세한 프로토콜은 물질 및 방법 섹션에 제시된다. 인간 및 사이노몰거스 IgE에 대한 IC50 효능 데이타를 표 2b에 제시한다.
Figure 112009049721163-PCT00019
Figure 112009049721163-PCT00020
2.5. 생식세포에서의 유도
최적화된 항-IgE 항체의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 VBASE 데이타베이스의 공지의 인간 생식세포 서열에 대해 정렬시키고 (Tomlinson 1997; Journal of Molecular biology. 224. 487-499), 가장 가까운 생식세포를 서열 유사성에 의해 확인하였다. 항체 1 계통 (lineage)의 VH 도메인의 경우, 가장 가까운 생식세포는 Vh1 DP-3 (1-f)이었다. VL 도메인의 경우에는 Vλ1 DPL8 (1e)이었다.
변경되지 않은 상태의 베니어 (Vernier) 잔기 (Foote & Winter 1992)를 고려하지 않을 때, VH 도메인의 프레임워크에 생식세포로부터 10개의 변경이 존재하고, 항체 1의 VL 도메인에 2개의 변경이 존재하였다. VH 도메인의 변경 중 5개 및 VL 도메인의 2개의 변경을, 인간 항체와 동일하게 일치시키기 위해 가장 가까운 생식세포 서열로 복귀시켰다. VH 도메인의 카바트 번호 1, 20, 82a, 83 및 89에서의 변경은 효능을 유지시키기 위해 변경되지 않은 상태로 유지되었다 (항체 8 GL 및 항체 11 GL). 상기 아미노산 잔기의 생식세포에서의 유도를, 적절한 돌연변이 유발 프라이머를 사용하는 표준 부위 지정 돌연변이 유발 기술을 이용하여 수행하였다. 이어서, 친화도 또는 효능에서 감소가 없었음을 확인하기 위해 생식세포에서 유도된 IgG를 재평가하였다. 생식세포에서 유도된 (GL) 항체에 대한 예시적인 친화도 및 효능을 표 4에 제시한다.
Figure 112009049721163-PCT00021
2.6 정제된 IgG 에 의한 CD23 에 대한 IgE 결합의 억제
일부의 최적화된 항체를 이전에 설명된 바와 같은 IM9 결합 분석을 사용하여 IgE/CD23 상호작용의 억제에 대해 평가하였다. 상기 시스템에서 시험된 항체는 IgE/CD23 상호작용을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 항체 8 및 항체 11의 IC50 값은 각각 16.5 nM 및 23 nM이었다.
2.7 Fc ε RI - 결합된 IgE 의 가교결합
일부의 최적화된 항체를 RBL-ER51 칼슘-신호전달 분석을 이용하여 FcεRI-결합된 IgE에 가교결합할 가능성에 대해 평가하였다. 물질 및 방법에 설명된 RBL-ER51 세포에 IgE를 최대로 로딩하였다. 최적화된 항체를 IgE-로딩된 세포와 함께 인큐베이션하고, 칼슘 반응을 자극하는 그의 능력에 대한 평가하였다. 신호전달은 검출되지 않았다 (도 1).
2.8. DELFIA ® 에피토프 경쟁 분석에서 최적화된 항체의 선택성 및 종 교차반응성
선도 항체의 선택성 및 종 교차반응성을 이전에 설명된 바와 같이 DELFIA® 에피토프 경쟁 분석을 이용하여 재평가하였다 (섹션 1.6 및 물질 및 방법 참조).
분석에서 IC50 값에 의해 측정되는 바와 같은 각각의 구조상 관련된 단백질에 대한 특이성 프로필을 확립하기 위해, 정제된 IgA, IgM, IgD, 및 IgG (모두 칼바이오켐)의 적정액을 각각의 분석에서 시험하였다.
인간 IgEλ (U266 유래), 인간 IgEκ (칼바이오켐), 사이노몰거스 IgE Cε3-Cε4 도메인 (자체 개발한 HEK-EBNA 유래) 및 인간 IgE Cε3-Cε4 도메인 (자체 개발한 HEK-EBNA 유래)을 포함하는 IgE 종의 적정액을 항체의 종 교차반응성을 확립하기 위해 각각의 분석에서 시험하였다. 전장 인간 IgEλ 및 κ는 인간 및 사이노몰거스 IgE Cε3-Cε4 도메인과 함께 억제 곡선을 생성하였다. 임의의 구조상 관련된 인간 단백질 (IgA, IgM, IgD 및 IgG)에 대해 억제가 관찰되지 않았다. 이들 데이타는 시험된 항체 패널이 인간 IgEλ 및 κ, IgE의 Cε3-Cε4 도메인에 결합하고, 사이노몰거스 IgE에 교차-반응성임을 입증한다. 그러나, 항체는 IgE에 가장 관련되는 단백질에 결합하지 않는다.
2.9 BIAcore 를 사용하는, 최적화된 클론에 대한 친화도 데이타의 결합 친화도 계산
인간 및 사이노몰거스 IgE에 대한 대표적인 수의 클론의 정제된 IgG 샘플의 결합 친화도를 본질적으로 문헌 [Karlsson et al 1991; Journal of Immunological Methods 145 (1-2) 229-240]에 설명된 바와 같이 BIAcore 2000 생체센서 (BIAcore AB)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정하였다. 간단히 설명하면, 단백질 G' (시그마 알드리치 (Sigma Aldrich, 스웨덴 스톡홀름), P4689)를 표준 아민 커플링 시약을 사용하여 제조자 (BIAcore)의 지시에 따라 CM5 센서 칩의 표면에 공유 결합을 통해 커플링시켰다. 상기 단백질 G' 표면은 50 RU의 표면 밀도를 제공하도록 Fc 도메인을 통해 정제된 항-IgE 항체를 포획하기 위해 사용되었다. HBS-EP 버퍼 (BIAcore AB) 내에 125 nM 내지 7.6 nM의 농도 범위로 제조된 인간 IgEλ 또는 사이노몰거스 IgE를 센서 칩 표면 위로 통과시켰다. 표면을 각각의 항체 주사 사이에 10 mM 글라이신 (pH 1.75)을 사용하여 재생하였다.
생성되는 센서그램을 BIA 평가 3.1 소프트웨어를 이용하여 평가하고, 2가 분석물 모델에 피팅하여 상대적인 결합 데이타를 제공하였다.
시험된 IgG에 대한 예시적인 친화도를 표 2b 및 표 4에 제시한다.
물질 및 방법 - 실시예 1 및 2
비정제된 scFv 에 의한 Fc ε RI 에 대한 IgE 결합의 억제
선별 결과물을 인간 FcεRI-Fc (자체 개발한 NS0 세포에서 생산됨)에 결합하는 유로퓸 킬레이트 (퍼킨 엘머 1244-302)로 표지된 인간 IgE (칼바이오켐 401152)의 억제에 대해, 수용체-리간드 결합 균질 FRET (형광 공명 에너지 전달) 기반 분석 포맷으로 스크리닝하였다.
초기 단리 동안 결과물을 50 mM MOPS 버퍼 (pH 7.4), 0.5 mM EDTA 및 0.5 M 소르비톨 내에 제조된, 비정제된 scFv를 함유하는 희석되지 않은, 주변세포질 추출물로서 스크리닝하였다
15 ㎕의 비정제된 scFv 샘플을 384 웰 분석 플레이트 (퍼킨 엘머 6006280)에 첨가하였다. 이어서, 15 ㎕의 11 nM 인간 FcεRI-Fc (260 kDa의 MW에 기초함), XL665로 표지된 15 ㎕의 40 nM 항-인간 Fc IgG (씨아이에스 바이오 인터내셔날 61HFCXLA), 및 이어서 15 ㎕의 0.75 nM 유로퓸 표지된 인간 IgE를 첨가하였다. 비-특이적 대조 결합은 300 nM 인간 IgE (칼바이오켐)를 사용하여 규정하였다. 모든 희석은 250 mM 염화나트륨 및 0.05％ Tween20을 함유하는 50 mM Tris-HCl (pH 7.8) (분석 버퍼) 내에서 수행하였다.
이어서, 분석 플레이트를 1.5시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, VICTOR2 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머)를 사용하여 순차적으로 615 nm 및 665 nm 방출 파장에서 시간차 형광을 판독하였다.
데이타를 VICTOR2 소프트웨어에 의해 표준화하여 초당 계수 (CPS)를 계산하였다. 후속적으로, CPS 값을 사용하여 식 1에 기재된 바와 같이 특이적 결합 ％를 계산하였다.
<식 1>
특이적 결합 ％ = [(샘플의 CPS - 비-특이적 결합 대조군의 CPS)/(총 결합 대조군 - 비-특이적 결합 대조군의 CPS)] X 100
정제된 scFv 에 의한 Fc ε RI 에 대한 IgE 결합의 억제
스크리닝으로부터 확인된 양성 클론으로부터 정제된 scFv를 인간 FcεR1-Fc (자체 개발한 NS0 세포에서 생산됨)에 결합하는 유로퓸 킬레이트 (퍼킨 엘머 1244-302)로 표지된 인간 IgE (칼바이오켐 401152)의 억제에 대해 수용체-리간드 결합 균질 FRET (형광 공명 에너지 전달) 기반 분석 포맷으로 시험하였다.
분석에서 IC50 값에 의해 측정되는 바와 같은 scFv 효능을 확립하기 위해 scFv 농도의 적정액을 사용하였다. 15 ㎕의 정제된 scFv 샘플의 적정액을 384 웰 분석 플레이트 (퍼킨 엘머 6006280)에 첨가하였다. 이어서, 15 ㎕의 11 nM 인간 FcεRI-Fc (260 kDa의 MW을 기초로 함), XL665로 표지된 15 ㎕의 40 nM 항-인간 Fc IgG (씨아이에스 바이오 인터내셔날 61HFCXLA), 및 이어서 15 ㎕의 0.75 nM 유로퓸 표지된 인간 IgE를 첨가하였다. 비-특이적 대조 결합은 300 nM 인간 IgE (칼바이오켐)를 사용하여 규정하였다. 모든 희석은 250 mM 염화나트륨 및 0.05％ Tween20을 함유하는 50 mM Tris-HCl (pH 7.8) (분석 버퍼) 내에서 수행하였다.
이어서, 분석 플레이트를 1.5시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, VICTOR2 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머)를 사용하여 순차적으로 615 nm 및 665 nm 방출 파장에서 시간차 형광을 판독하였다.
데이타를 VICTOR2 소프트웨어에 의해 표준화하여 초당 계수 (CPS)를 계산하였다. 후속적으로, CPS 값을 사용하여 식 1에 기재된 바와 같이 특이적 결합 ％를 계산하였다.
<식 1>
특이적 결합 ％ = [(샘플의 CPS - 비-특이적 결합 대조군의 CPS)/(총 결합 대조군 - 비-특이적 결합 대조군의 CPS)] X 100
IC50 값은 4-파라미터 로지스틱 (logistic) 식 (식 2)을 사용하여 곡선 피팅함으로써 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.
<식 2>
Y=기부 + (상부-기부)/(1+10(( LogEC50 -X)*기울기))
X는 농도의 로그이다. Y는 특이적 결합이다.
Y는 기부에서 출발하여 S자 형상으로 상부로 움직인다.
인간 Fc ε RI ( RBL - ER51 세포)로 안정하게 형질감염된 RBL -2 H3 세포에서 정제된 scFv 및 IgG 에 의한 칼슘 신호전달의 억제
FcεRI을 통해 매개된 인간 IgE 생물활성에 대한 정제된 scFv 및 IgG 제제의 중화 효능을 RBL-ER51 칼슘-신호전달 분석을 이용하여 평가하였다. 인간 FcεRI을 인간 말초혈 림프구로부터 pcDNA3.1 벡터 내로 클로닝하고, 표준 전기천공 방법을 이용하여 RBL-2H3 세포 (래트 호염기구 세포주) 내로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 제한 희석에 의해 클로닝하고, 표면 FcεRI 발현에 대해 분석하였다. 생성되는 RBL-ER51 세포를 안정한 수용체 발현을 유지하기 위해 G418을 함유하는 배지 (인비트로겐 (Invitrogen) 10131-027) 내에 유지하였다. 세포 부근에서 유리 IgE는 FcεRI에 결합하고, 수용체-결합된 IgE의 후속적인 가교결합은 형광측정 영상화 플레이트 판독기 (FLIPR)를 사용하여 검출될 수 있는 칼슘 이동을 유발한다.
RBL-ER51 세포를 5x104/100 ㎕/웰로 배양 배지 [9％ v/v 열 불활성화되지 않은 FBS (인비트로겐 10100-147) 및 400 ㎍/mL G418 (인비트로겐 10131-027)을 함유하는 DMEM (인비트로겐 41966)] 내에 96 웰 흑색 벽의 평저 조직 배양-처리된 플레이트 (코스타 (Costar)) 내로 접종하고, 37℃, 5％ CO2에서 18-24시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후에, 배지를 흡인하여 세포 단층을 무손상으로 유지하고, 100 ㎕/웰의 FLU0-4AM 로딩 버퍼 [0.1％ FBS, 20 mM HEPES, 2.5 mM 프로베니시드 및 2 ㎍/mL FLUO-4AM (테프 랩스 (Teff Labs))를 함유하는 DMEM]로 1-2시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 교체하였다. 로딩 버퍼를 흡인하고, 세포를 200 ㎕/웰의 PBS로 3회 세척하였다. 최종 세척액을 흡인하고, 70 ㎕/웰의 FLIPR 버퍼 [125 mM NaCl2, 5 nM KCl, 1 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2, 30 mM Hepes, 2.5 mM 프로베니시드, 5 mM 글루코스, 0.01％ v/v FCS]로 교체하였다. 플레이트를 37℃, 5％ CO2에서 5-45분 동안 인큐베이션하였다.
정제된 scFv 또는 IgG의 시험 용액 (2중으로)을 V자형 바닥 플레이트 (그라이너 (Greiner))에서 FLIPR 버퍼 내에 목적하는 농도로 희석하였다. IgE에 대해 생성되지 않은 비관련 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. IgE (칼바이오켐 또는 U266-유래 [Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])를 FLIPR 버퍼 내에서 제조하고, 적절한 시험 항체와 혼합하여 40 ㎕/웰의 총 부피 내에 3.33 ㎍/mL의 최종 IgE 농도를 제공하였다. 분석에 사용된 IgE의 농도는 최종 분석 농도에서 최대 칼슘 반응의 약 80％를 제공하는 투여량으로서 선택하였다. 모든 샘플을 30 min 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 30 ㎕의 IgE/항체 혼합물을 상기 제조된 염료-로딩된 세포에 전달하였다. 분석 플레이트를 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하여 유리 IgE를 RBL-ER51 세포에 결합시켰다.
가교결합하는 항-IgE의 첨가 후에 칼슘 이동을 측정하기 위해, FLIPR (몰레큘라 디바이시즈 (Molecular Devices))을 제조자의 지시에 따라 적합한 노출에 대해 보정하였다. FLIPR 버퍼 내에 희석시킨 항-IgE (바이오소스 AHI0501)를 분석 플레이트에 10 ㎍/mL의 최종 농도로 첨가하였다. FLUO-4AM 염료의 형광을 80회의 측정치에 대해 1초 간격으로, 이어서 40회의 측정치에 대해 8초 간격으로 기록하였다. 각각의 웰로부터의 피크 반응을 익스포팅(exporting)한 후, Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이타를 분석하였다.
RBL - ER51 세포에서 항- IgE 가교결합의 측정
FcεRI-결합된 IgE를 가교결합시키는 정제된 IgG의 능력을 측정하기 위해, RBL-ER51 세포를 제조하고 억제 분석에서 설명된 바와 같이 염료-로딩하였다. 세포를 FLIPR 버퍼 내에 희석된 100 ㎕의 1 ㎍/mL 인간 IgE (칼바이오켐 또는 U266-유래 [Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167]) 내에서 10분 동안 인큐베이션하여 IgE가 세포 표면 상의 FcεRI에 결합하도록 하였다. 분석에서 사용된 IgE의 농도는 최대 칼슘 반응의 약 80％를 제공하는 투여량으로서 선택하였다. 가교결합하는 항-IgE의 첨가 후에 칼슘 이동을 측정하기 위해, FLIPR (몰레큘라 디바이시즈)을 제조자의 지시에 따라 적합한 노출에 대해 보정하였다. FLIPR 버퍼 내에 적절한 농도로 희석시킨 30 ㎕의 시험 항체를 IgE 로딩된 분석 플레이트에 첨가하였다. 항-IgE (바이오소스 AHI0501)를 양성 대조군으로서 사용하였다. FLUO-4AM 염료 (테프 랩스)의 형광을 80회의 측정치에 대해 1초 간격으로, 이어서 40회의 측정치에 대해 8초 간격으로 기록하였다. 각각의 웰로부터의 피크 반응을 익스포팅하고, Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이타를 분석하였다.
DELFIA ® 에피토프 경쟁 분석에서 항체의 선택성 및 종 교차반응성
정제된 IgG를 PBS 내에서 96-웰 Maxisorp 미량역가판 (Nunc) 상으로, 특정 IgG에 대한 대략적인 그의 추정 KD에서 비오티닐화된 인간 IgE가 첨가될 때 유의한 신호를 제공하는 농도로 흡착시켰다. 과량의 IgG를 PBS-Tween (0.1％ v/v)으로 세척 제거하고, 웰을 PBS-Marvel (3％ w/v)로 1시간 동안 차단하였다. 각각의 다음 경쟁자의 계열 희석액을 비오티닐화된 인간 IgE와 각각의 IgG; 인간 IgE 람다 (U266 유래 [Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167]), 인간 IgE 카파 (칼바이오켐), 인간 IgE Cε3-Cε4 도메인 (자체 개발한 HEK-EBNA 유래), 사이노몰거스 IgE Cε3-Cε4 도메인 (자체 개발한 HEK-EBNA 유래), 인간 IgA, IgM, IgD 및 IgD (모두 칼바이오켐) 사이의 상호작용의 KD 값의 약 1000배의 농도에서 시작하여 PBS 내에 제조하였다. 상기 계열 희석액에, 동일 부피의 비오티닐화된 인간 IgE를 대략 KD의 농도로 첨가하였다 (약 1000:1의 경쟁자 항원:비오티닐화된 인간 IgE의 비에서 출발하는 계열을 생성시킴). 이어서, 이들 혼합물을 차단된 IgG 상으로 전달하고, 1시간 동안 평형화시켰다. 비결합된 항원은 PBS-Tween (0.1％ v/v)로 세척하여 제거하면서, 남아있는 비오티닐화된 인간 IgE를 스트렙타비딘-유로퓸3+ 컨쥬게이트 (DELFIA® 검출, 퍼킨 엘머)에 의해 검출하였다. 시간-분해 형광을 620 nm에서 EnVision 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머) 상에서 측정하였다.
형광 데이타는 Graphpad Prism 또는 Microsoft™ Excel 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
항체- 리간드 생화학적 분석을 사용하는 개선된 클론의 확인
선별 결과물을 항-인간 IgE 항체 (항체 1)에 결합하는, 유로퓸 크립테이트 (씨아이에스 바이오 인터내셔날 62EUSPEA)로 표지된 크립테이트 표지된 인간 IgE (U266-유래 [Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])의 억제에 대해 에피토프 경쟁 HTRF® (균질 시간차 형광) 분석 포맷으로 스크리닝하였다.
초기 최적화 동안, 선별 결과물을 50 mM MOPS 버퍼 (pH 7.4), 0.5 mM EDTA 및 0.5 M 소르비톨 내에 제조된, 비정제된 scFv를 함유하는 희석되지 않은 또는 희석된 주변세포질 추출물로서 스크리닝하였다.
4 nM 항-인간 IgE 항체를 XL665 (씨아이에스 바이오 인터내셔날 61HFCXLA)로 표지된 20 nM 항-인간 Fc IgG와 예비-혼합하였다. 10 ㎕의 비정제된 scFv 샘플을 384 웰 저부피 분석 플레이트 (코스타 3676)에 첨가하였다. 이어서, 5 ㎕의 항-인간 IgE 항체 항 Fc-XL665 혼합물 및 이어서 5 ㎕의 크립테이트 표지된 인간 IgE의 1/245 희석액 (약 2.3 nM 크립테이트 표지된 인간 IgE)을 첨가하였다. 비-특이적 대조 결합은 300 nM 인간 IgE (U266-유래됨 [Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])를 사용하여 규정하였다. 모든 희석은 0.4 M 플루오르화칼륨 및 0.1％ BSA를 함유하는 포스페이트 완충 염수 (PBS) (분석 버퍼) 내에서 수행하였다.
이어서, 분석 플레이트를 1000 rpm에서 실온에서 1분 동안 원심분리하고, 3시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, EnVision 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머)를 사용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서 시간차 형광을 판독하였다.
데이타를 각각의 샘플에 대한 ％ Delta F 값을 계산함으로써 분석하였다. Delta F는 식 1에 따라 결정하였다.
<식 1>
％ Delta F = [(샘플 665 nm/620 nm 비 값 - 비-특이적 대조군 665 nm/620 nm 비 값)/비-특이적 대조군 665 nm/620 nm 비 값] X 100
％ Delta F 값은 후속적으로 식 2에 기재된 바와 같이 특이적 결합 ％를 계산하기 위해 사용되었다.
<식 2>
특이적 결합 ％ = (샘플의 ％ Delta F/총 결합 대조군의 ％ Delta F) X 100
개선된 scFv (정제된)에 의한 Fc ε RI 에 대한 IgE 결합의 억제
정제된 scFv를 인간 FcεRI-Fc (자체 개발한 NS0 세포에서 생산됨)에 결합하는 유로퓸 크립테이트 (씨아이에스 바이오 인터내셔날 62EUSPEA)로 표지된 인간 IgE (U266-유래됨 [Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167]) 또는 cyno IgE (재조합, 물질 및 방법 참조)의 억제에 대해 수용체-리간드 결합 HTRF® (균질 시간차 형광) 분석 포맷으로 시험하였다.
분석에서 IC50 값에 의해 측정되는 바와 같은 scFv 효능을 확립하기 위해 scFv 농도의 적정액을 이용하였다. 1.9 nM 인간 FcεRI-Fc (260 kDa의 MW에 기초함)를 XL665로 표지된 20 nM 항-인간 Fc IgG (씨아이에스 바이오 인터내셔날 61HFCXLA)와 예비-혼합하였다. 10 ㎕의 정제된 scFv 샘플의 적정액을 384 웰 저부피 분석 플레이트 (코스타 3676)에 첨가하였다. 이어서, 5 ㎕의 FcεRI-Fc 항 Fc-XL665 혼합물, 및 이어서 5 ㎕의 크립테이트 표지된 인간 또는 cyno IgE의 1/197 희석액 (약 2.9 nM 크립테이트 표지된 인간 또는 cyno IgE)을 첨가하였다. 비-특이적 대조 결합은 300 nM의 인간 또는 사이노몰거스 IgE (자체 개발)를 사용하여 규정하였다. 모든 희석은 0.4 M 플루오르화칼륨 및 0.1％ BSA를 함유하는 포스페이트 완충 염수 (PBS) (분석 버퍼) 내에서 수행하였다.
이어서, 분석 플레이트를 1000 rpm에서 실온에서 1 min 동안 원심분리하고, 3 h 동안 실온에서 인큐베이션한 후, EnVision 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머)를 사용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서 시간차 형광을 판독하였다.
데이타를 각각의 샘플에 대한 ％ Delta F 값을 계산함으로써 분석하였다. Delta F를 하기 식 1에 따라 결정하였다.
<식 1>
％ Delta F = [(샘플 665 nm/620 nm 비 값 - 비-특이적 대조군 665 nm/620 nm 비 값)/비-특이적 대조군 665 nm/620 nm 비 값] X 100
％ Delta F 값은 후속적으로 하기 식 2에 기재된 바와 같이 특이적 결합 ％를 계산하기 위해 사용되었다.
<식 2>
특이적 결합 ％ = (샘플의 ％ Delta F/총 결합 대조군의 ％ Delta F) X 100
IC50 값은 4-파라미터 로지스틱 식 (식 3)을 사용하여 곡선 피팅함으로써 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.
<식 3>
Y=기부 + (상부-기부)/(1+10(( LogEC50 -X)*기울기))
X는 농도의 로그이다. Y는 특이적 결합이다.
Y는 기부에서 출발하여 S자 형상으로 상부로 움직인다.
RBL - ER51 칼슘 신호전달 분석에서 개선된 클론의 확인
개선된 항체로부터 정제된 IgG 제제의 중화 효능을 초기 단리에 대해 설명된 RBL-ER51 칼슘-신호전달 분석의 변형된 버전으로 평가하였다.
RBL-ER51 세포를 5x104/100 ㎕/웰로 배양 배지 [9％ v/v 열 불활성화되지 않은 FBS (인비트로겐 10100-147) 및 400 ㎍/mL G418 (인비트로겐 10131-027)를 함유하는 DMEM (인비트로겐 41966)] 내에 96 웰 흑색 벽의 평저 조직 배양-처리된 플레이트 (코스타) 내로 접종하고, 37℃, 5％ CO2에서 18-24시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후에, 배지를 흡인하고, 분석 배지 [9％ v/v 열 불활성화되지 않은 FBS (인비트로겐 10100-147), 400 ㎍/mL G418 (인비트로겐 10131-027) 및 1.6％ 페니실린/스트렙토마이신 (인비트로겐 15140-122)를 함유하는 DMEM (인비트로겐 41966)] 내의 시험 항체의 50 ㎕/웰 희석액 (6.67 nM 내지 1.33 pM)으로 교체한 후, 분석 배지 내에 희석된 IgE [인간 (U266-유래됨 [Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167]) 또는 사이노몰거스 (재조합, 물질 및 방법 참조)]를 첨가하여 각각 25 ng/mL 및 100 ng/ml의 최종 IgE 농도를 제공하였다. 분석 플레이트를 4시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 인큐베이션하였다.
이 시간 후에, 항체/IgE 혼합물을 흡인하여 세포 단층을 무손상 상태로 유지하고, 100 ㎕/웰의 FLUO-4AM 로딩 버퍼 [0.1％ FBS, 20 mM HEPES, 2.5 mM 프로베니시드 및 2 ㎍/mL FLUO-4AM (인비트로겐)를 함유하는 DMEM]로 1-2시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 교체하였다. 로딩 버퍼를 흡인하고, 세포를 200 ㎕/웰의 PBS로 3회 세척하였다. 최종 세척액을 흡인하고, 100 ㎕/웰의 FLIPR 버퍼 [125 mM NaCl2, 5 nM KCl, 1 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2, 30 mM Hepes, 2.5 mM 프로베니시드, 5 mM 글루코스, 0.01％ v/v FCS]로 교체하였다. 플레이트를 37℃, 5％ CO2에서 5-45분 동안 인큐베이션하였다.
가교결합하는 항-IgE 첨가 후에 칼슘 이동을 측정하기 위해, FLIPR (몰레큘라 디바이시즈)을 제조자의 지시에 따라 적합한 노출에 대해 보정하였다. FLIPR 버퍼 내에 희석된 항-IgE (바이오소스 AHI0501)를 분석 플레이트에 2.3 ㎍/mL (인간 IgE를 가교결합시키기 위해) 또는 20 ㎍/mL (사이노몰거스 IgE를 가교결합시키기 위해)의 최종 농도로 첨가하였다. FLUO-4AM 염료의 형광을 80회의 측정치에 대해 1초 간격으로, 이어서 40회의 측정치에 대해 3초 간격으로 기록하였다. 각각의 웰로부터의 피크 반응을 익스포팅한 후, Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이타를 분석하였다.
최적화된 항체에 의한 Fc ε RI - 결합된 IgE 의 가교결합의 측정
FcεRI-결합된 IgE를 가교결합시키는 정제된 IgG의 능력을 측정하기 위해, 개선된 항체의 평가를 위한 억제 분석에서 설명된 바와 같이 RBL-ER51 세포를 제조하였다. RBL-ER51 세포를 5x104/100 ㎕/웰로 배양 배지 [9％ v/v 열 불활성화되지 않은 FBS (인비트로겐 10100-147) 및 400 ㎍/mL G418 (인비트로겐 10131-027)를 함유하는 DMEM (인비트로겐 41966)] 내에 96 웰 흑색 벽의 평저 조직 배양-처리된 플레이트 (코스타) 내로 접종하고, 37℃, 5％ CO2에서 18-24시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후에, 배지를 흡인하고, 분석 배지 [9％ v/v 열 불활성화되지 않은 FBS (인비트로겐 10100-147), 400 ㎍/mL G418 (인비트로겐 10131-027) 및 1.6％ 페니실린/스트렙토마이신 (인비트로겐 15140-122)을 함유하는 DMEM (인비트로겐 41966)] 내에 1 ㎍/mL로 희석시킨 100 ㎕/웰의 인간 IgE (U266-유래 [Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])로 교체하였다. IgE 농도는 RBL-ER51 세포의 최대 로딩을 제공하도록 선택하였다. 분석 플레이트를 4시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 인큐베이션하였다.
이 시간 후에, IgE 용액을 흡인하여 세포 단층을 무손상 상태로 유지하고, 100 ㎕/웰의 FLUO-4AM 로딩 버퍼 [0.1％ FBS, 20 mM HEPES, 2.5 mM 프로베니시드 및 2 ㎍/mL FLUO-4AM (인비트로겐)를 함유하는 DMEM]로 1-2시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 교체하였다. 로딩 버퍼를 흡인하고, 세포를 200 ㎕/웰의 PBS로 3회 세척하였다. 최종 세척액을 흡인하고, 100 ㎕/웰의 FLIPR 버퍼 [125 mM NaCl2, 5 nM KCl, 1 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2, 30 mM Hepes, 2.5 mM 프로베니시드, 5 mM 글루코스, 0.01％ v/v FCS]로 교체하였다. 플레이트를 37℃, 5％ CO2에서 5-45분 동안 인큐베이션하였다.
가교결합하는 항-IgE (1.53 μM 내지 2.33 nM)의 첨가 후에 칼슘 이동을 측정하기 위해, FLIPR (몰레큘라 디바이시즈)을 제조자의 지시에 따라 적합한 노출에 대해 보정하였다. FLIPR 버퍼 내에 적절한 농도로 희석시킨 30 ㎕의 시험 항체를 분석 플레이트에 첨가하였다. 항-IgE (바이오소스 AHI0501)를 양성 대조군으로서 사용하였다. FLUO-4AM 염료 (인비트로겐)의 형광을 80회의 측정치에 대해 1초 간격으로, 이어서 40회의 측정치에 대해 3초 간격으로 기록하였다. 각각의 웰로부터의 피크 반응을 익스포팅한 후, Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이타를 분석하였다.
정제된 IgG 에 의한 IM9 세포 상의 CD23 에 대한 IgE 결합의 억제
항체를 IM9 세포 결합 분석을 이용하여 IgE/CD23 상호작용의 억제에 대해 평가하였다. IM9 세포 (인간 B 세포주)를 표준 조직 배양 절차를 사용하여 배양 배지 [RPMI 1640 글루타맥스 (glutamax) (인비트로겐 61870-010); 9％ v/v 열-불활성화된 FBS (인비트로겐 10100-147)] 내에 유지하였다. 최적화된 IgG를 시험하기 위해, IM9 세포를 CD23 발현을 상향-조절하기 위해 25 ng/ml 인간 IL-4 (페프로테크 (Peprotech), 200-04)로 3일 동안 37℃/5％ CO2에서 예비-처리하였다. IM9 세포를 수확하고, 유동 버퍼 [1％ 염소 혈청 (시그마 (Sigma)) 및 0.1％ BSA 분획 V (시그마)를 함유하는 PBS] 내에 1x106 세포/mL로 재현탁하였다. Fc 수용체 차단은 Fc 단편 (TEBU-bio)을 5 ㎍/mL의 최종 농도로 첨가하여 수행하였다. 상기 세포 현탁액을 100 ㎕/웰로 U자형 바닥 폴리프로필렌 플레이트 (그라이너) 내에 플레이팅하고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
항체 희석액 (667 nM 내지 1 nM)을 U자형 바닥 폴리프로필렌 플레이트 (그라이너) 내에서 제조하고, 10 ㎍/mL의 최종 IgE 농도로 30분 동안 실온에서 IgE (U266-유래됨 [Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])와 혼합하였다. 세포 플레이트를 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상등액을 흡인하여 세포 펠렛을 무손상으로 유지하였다. 세포를 100 ㎕/웰 항체/IgE 혼합물 내에 재현탁하고, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 플레이트를 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 항체/IgE 상등액을 흡인하였다. 세포를 200 ㎕/웰의 유동 버퍼 내에 재현탁시키고 상기한 바와 같이 원심분리하여 세척하였다.
세포 표면에 결합된 IgE는 1/30 v/v, 100 ㎕/웰로 희석된 항-IgE-피코에리트린 (칼태그)을 사용하여 검출하였다. 분석 플레이트를 얼음 상에서 20분 동안 암소에서 인큐베이션한 후, 상기 설명된 바와 같이 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고 2 x 200 ㎕의 유동 버퍼로 세척하였다. 세포를 100 ㎕ Cell Fix (비디 바이오사이언시즈 (BD biosciences)) 내에 재현탁시키고, FL2 염색을 검출하기 위해 FACSCalibur (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 분석하였다.
데이타는 CellQuest 소프트웨어 (비디 바이오사이언시스)을 사용하여 분석하였다. FL2 기하평균 형광을 익스포팅한 후, Microsoft Excel 및 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이타를 분석하였다.
FLAG His10 으로 C-말단 태깅된 인간 IgE Cε3-4의 생성
인간 IgE Cε3-4의 단편은 문헌 [Wurzburg et. al. (2000). Structure of Human IgE-Fc Cε3-C4 Reveals Conformation Flexibility in Antibody Effector Domains]에서 이전에 설명된 바와 같다. 뉴클레오티드 2135 - 2868을 포함하는 cDNA 단편 (GenBank 기탁 번호 J00222)을 IL13 자극된 인간 PBMC의 총 RNA로부터 RT-PCR을 사용하여 증폭시켰다. 상기 PCR 산물을 pCR2.1 TA (인비트로겐) 내로 클로닝하였다.
발현된 단백질의 분비를 허용하고 인프레임 (inframe) C-말단 FLAG 에피토프 및 폴리히스티딘 태그 (His10)를 포함하는 서열을 생성하기 위해, IgE Cε3-4 단편을 5' BssHII 부위, 및 3' FLAG 에피토프, 폴리히스티딘 태그 (His10) 및 XbaI 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시키고, 후속적으로 pEU8.2 벡터 내로 삽입하였다. 변형된 pEU8.2 벡터는 EF-1 프로모터, 뮤린 IgG1 리더 (leader) 펩티드에 대한 게놈 서열, EBNA-1 유전자 산물을 발현하는 세포주 (예를 들어 HEK293-EBNA 세포) 내로의 형질감염시에 에피좀 플라스미드 복제를 허용하는 oriP 복제 기점을 함유한다.
IMAC 크로마토그래피에 이어, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 이용하여 조건화된 배지로부터 단백질을 정제하였다.
FLAG His10 으로 C-말단 태깅된 사이노몰거스 IgE Cε3-4의 생성
사이노몰거스 IgE 불변 구역은 인간 IgHE (IgE의 중쇄) 로커스 (GenBank 기탁 J00222)의 뉴클레오티드 1174 - 2989를 포함하는 프라이머를 사용하여 게놈 DNA로부터 증폭된 PCR 산물의 직접 서열결정에 의해 결정하였다. 엑손을 인간 서열과의 상동성에 의해 확인하였고, 따라서, 사이노몰거스 IgE 중쇄 불변 구역에 대한 cDNA 서열을 예측하는 것이 가능하였다.
뮤린 IgG1 리더 펩티드, 사이노몰거스, Cε3-4 (도 2), 및 C-말단 FLAG 에피토프 및 폴리히스티딘 태그에 대한 서열을 코딩하는 cDNA를 합성하고 (DNA2.0), pDONR221 (인비트로겐) 내로 클로닝하였다. 이어서, LR Gateway® 반응 (인비트로겐)을 이용하여, EBNA-1 유전자 산물을 발현하는 세포주 (예를 들어 HEK293-EBNA 세포) 내로의 형질감염시에 에피좀 플라스미드 복제를 허용하는 pCEP4 벡터 (인비트로겐)로부터의 oriP 복제 기점의 삽입에 의해 변형된 발현 벡터 pDEST12.2 (인비트로겐)에 관심있는 유전자를 전달하였다.
IMAC 크로마토그래피, 이어서 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 조건화된 배지로부터 단백질을 정제하였다.
키메라 D12 가변 구역 및 사이노몰거스 IgE 불변 구역의 생성
인간 항-에스트라디올 scFv (D12_VH)를 코딩하는 가변 중쇄 구역 및 2개의 상이한 반수체 사이노몰거스 IgHE 유전자 (cyIGHE TQ 및 cyIGHE ME) 중 하나를 코딩하는 cDNA를 합성하고 (DNA2.0), pDONR221 (인비트로겐) 내로 클로닝하였다. 또한, 가변 경쇄 인간 항-에스트라디올 scFv (D12_VL) 및 2개의 사이노몰거스 람다 불변 구역 유전자 (cyIGLC4 및 cyIGLC7) 중 하나를 나타내는 cDNA를 합성하고 (DNA2.0), pDONR221 (인비트로겐) 내로 클로닝하였다.
이어서, LR Gateway® 반응 (인비트로겐)을 이용하여, EBNA-1 유전자 산물을 발현하는 세포주 (예를 들어 HEK293-EBNA 세포) 내로의 형질감염시에 에피좀 플라스미드 복제를 허용하는 pCEP4 벡터 (인비트로겐)로부터의 oriP 복제 기점의 삽입에 의해 변형된 발현 벡터 pDEST12.2 (인비트로겐)에 관심있는 유전자를 전달하였다.
HEK293 EBNA 세포로부터 발현된, 사이노몰거스 IgE Cε1-4에 융합된 인간 항-에스트라디올 scFv의 가변 중쇄 구역 (도 3 및 4), 및 사이노몰거스 람다 불변 구역에 융합된 인간 항-에스트라디올 scFv의 가변 경쇄 구역 (도 5 및 6)을 나타내는 재조합 키메라 IgE 단백질을 문헌 [Ikeyam et. al. (1986) Mol Immunol 23 p159-67]에 설명된 바와 같은 방법을 이용하여 정제하였다.
인간 FcεRI - Fc (자체 개발한 NS0 세포에서 생산됨)
뉴클레오티드 67-711 (GenBank 기탁 번호 NM_002001)를 포함하는 FcεRI를, 문헌 [Persic et al. (1997) Gene 187; 9-18]에 처음 설명된 pEU1.2로부터의 인간 IgG1 Fc의 게놈 구역의 상류에 클로닝하였다. 이를 pcDNA3.1 EcoRI - XbaI (서열 391 및 392) 내로 클로닝하였다. 재조합 융합 단백질 FcεRI_Fc의 발현은 NS0 세포를 pcDNA3.1 FcεRI_Fc 구성체로 안정하게 형질감염시켜 달성하였다. 안정한 발현은 G418을 사용한 선택, 제한 희석을 통한 클론의 단리 및 높은 발현 수준을 갖는 클론의 확인에 의해 확립되었다. 이어서, 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 이어, 예비 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 조건화된 배지로부터 FcεRI_Fc 융합 단백질을 정제하였다.
실시예 3: 인간 B 세포 - 세포내 IgE 의 억제
말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 인간 헤파린 처리된 전체 혈액으로부터 Ficoll-Paque 구배 (파마시아 (Pharmacia)) 상에서 원심분리에 의해 단리하였다. 후속적으로 PBMC 집단으로부터 자기 비드 (밀텐이 (Miltenyi))를 사용하는 양성 항-CD 19 선택을 이용하여 B 세포를 단리하였다. 세포가 자기 컬럼 위로 통과할 때 양성 및 음성 B 세포 분획을 모두 수집하였다. B 세포를 제외한 모든 PBMC 세포를 함유하는 음성 B 세포 분획으로부터의 세포를 증식을 방지하기 위해 미토마이신 C로 처리하였다. 세포를 50 ㎍/mL 미토마이신 C와 함께 30 min 동안 인큐베이션한 후, 조직 배양 배지 (글루타맥스 (깁코 (Gibco))/10％ FCS (깁코)/50 U/mL 페니실린/50 ㎍/mL 스트렙토마이신 (깁코)를 함유하는 RPMI 1640)로 세척하고, PBS와 함께 70 min 동안 추가로 인큐베이션한 후, 모든 미토마이신 C를 제거하기 위해 최종 세척하였다. B 세포의 분화를 유도하기 위해, 4 x 104 B 세포 및 B 세포 음성 분획으로부터의 9.2x105 세포를 96-웰 플레이트 내의 3.5 μM 베타-머캅토에탄올 (시그마) 및 20 ㎍/mL 트랜스페린 (케미콘 (Chemicon))을 보충한 조직 배양 배지 내에 플레이팅하고, 항-IgE 모노클로날 항체 또는 대조군 항체를 0.001-100 nM에서 30 min 동안 예비-인큐베이션한 후, 인간 인터루킨-4 (IL-4)를 10 ng/mL로 첨가하였다. 후속적으로 세포를 가습 CO2 인큐베이터 내에서 12-14일 동안 인큐베이션하였다. 제12-14일에, 플레이트를 잠깐 동안 원심분리하고, 상등액을 수집하고, 세포를 다음 프로토콜을 사용하여 세포내 IgE에 대해 염색하였다.
세포를 먼저 1％ 인간 혈청이 존재하는 PBS와 함께 10분 동안 인큐베이션하여, Fc 수용체 결합을 차단하였다. 이어서, 세포를 고정시키고, 얼음 상에서 Cytofix/Cytoperm 키트 (벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson))를 이용하여 투과가능하게 만들었다. 이어서, 세포를 세척한 후, 폴리클로날 토끼 항-인간 IgE-FITC 항체 (다코 (DAKO))를 1:6의 최종 희석율로 및 모노클로날 마우스 항-인간 CD19 - RPE/Cy5 항체 (다코)를 1:10의 최종 희석율로 첨가하였다. 잔류 항-IgE MAb (모노클로날 항체)로부터의 간섭을 피하기 위해 세포를 완전히 세척하는 것이 중요하다. 30 min 인큐베이션 후, 세포를 세척하고, 샘플을 FACS Calibur 상에서 HTS 96-웰 플레이트 로딩 (loader) 장치를 사용하여 분석하였다. 이어서, IgE를 동시발현하는 CD19+ 집단 내의 세포의 백분율을 기록하고, 세포내 IgE의 발현은 차단 항-IgE 모노클로날 항체로 처리하지 않은 세포에서 최대 IgE 발현의 억제율(％)로서 제시된다. 항체 11은 IgE 양성 세포의 유도를 1.6 nM의 IC50으로 억제하였다 (도 7 - 상부의 그래프). 동일한 포맷의 비관련 항체를 음성 대조군 (CAT-002)으로서 사용하였고, IgE 양성 B 세포의 유도를 억제하지 않았다 (도 7 - 하부의 그래프).
실시예 4: 비만 세포주 ( LAD2 ) - β- 헥소사미니다제 방출의 억제
LAD2 세포 [A. S. Kirshenbaum et al. Leukemia research 27 (2003)]를 0.25-0.6 x 106 세포/mL의 세포 밀도로 StemPro-34 영양 보충제, 2 mM L-글루타민 및 100 ng/mL 재조합 인간 줄기 세포 인자 (rhSCF, 알앤디 (R&D))를 보충한 무혈청 배지 (StemPro-34, 라이프 테크놀로지스 (Life Technologies)) 내에서 배양하였다.
β-헥소사미니다제 분석을 위해, 세포를 2.5 x 104 세포/웰의 밀도로 접종하고, 96-웰 폴리프로필렌 플레이트에서 차단 항-IgE MAb와 함께 0.0001-100 nM의 농도 범위에서 예비-인큐베이션하였다. 세포를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, IgE를 0.15 nM의 농도에서 첨가하고, 세포를 추가의 4시간 동안 인큐베이션하였다. IgE와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 버퍼로 세척하여 임의의 과량의 IgE를 제거하고, 후속적으로 LAD2 세포 상의 FcεR에 결합된 IgE를 αIgE (600 ㎍/mL 염소-항-인간 IgE, 시그마)와 30분 동안 37℃에서 가교결합시켰다. 인큐베이션을 냉 원심분리에 의해 중지시키고, 세포 상등액을 수집하고 96-웰 플레이트에 전달하였다. 문헌 [Smith J et al Biochem. J. (1997)323, 321-328]에 공개된 방법의 약간 변형된 버전을 이용하여 β-헥소사미니다제 함량을 분석하였다. 간단히 설명하면, 0.2 M 시트레이트-버퍼 (pH 4.5) 중의 2 mM p-니트로페닐-N-아세틸-D-글루코사미니드를 헥소사미니다제에 대한 기질로서 사용하였다. 반응을 1M Tris-버퍼 (pH 9.0)의 첨가에 의해 중지시켰다. 광 밀도를 분광광도 분석으로 405 nm (- 570 nm에서의 값)에서 Spectramax 판독기 (몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 측정하였다. β-헥소사미니다제의 방출을 억제하는 항-IgE MAb의 효과를 계산하고, 총 방출의 억제 백분율 ± SEM로서 제시하였다. 항체 11은 β-헥소사미니다제를 0.04 nM의 IC50으로 억제한 반면 (도 8 - 상부의 그래프), 동일한 포맷의 비관련 MAb (CAT-002)는 β-헥소사미니다제를 억제하지 않았다 (도 8 - 하부의 그래프).
실시예 5: ELISA 를 사용하는 혈청 내의 IgE 의 항- IgE 항체 결합
분석 설명
혈청 샘플을 인간 공여자로부터의 혈액 샘플로부터 제조하였다. 96 웰 ELISA 플레이트 (Nunc Maxisorp, No. 442404)를 PBS 내에 희석시킨 150 ㎕/웰의 1 ㎍/ml FcεRI-Fc-His로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션 후, 플레이트를 0.05％ Tween 20을 함유하는 PBS (PBST, Medicago 09-9401-100)로 3회 세척하였다. 배경 결합을 감소시키기 위해, 플레이트를 후속적으로 200 ㎕/웰의 차단 버퍼 (0.5％ BSA를 함유하는 PBS로 이루어지는)와 함께 인큐베이션하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 상기한 바와 같이 PBST로 3회 세척하였다. 샘플 (가변량의 항-IgE 항체, 항체 11을 함유하는 인간 혈청 또는 혈장) 및 표준품 (ImmunoCAP 총 IgE (인간) 캘리브레이터 (calibrator), 파디아 (Phadia, 스웨덴 웁살라))을 0.05％ Tween 20을 함유하는 PBS 내에 희석시키고, 분석 플레이트에 150 ㎕/웰의 부피로 적용할 때까지 얼음 상에서 유지하였다. 플레이트를 밀봉하고, 샘플을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 비결합된 샘플을 제거하기 위해, 플레이트를 상기한 바와 같이 PBST로 3회 세척하였다. 후속적으로, PBST에 희석된 0.25 ㎍/ml 농도의 150 ㎕/웰의 토끼 항-인간 IgE (DC1,30-1917-00, 420036-02, 841204, 9911302, 파디아)를, 결합된 인간 IgE를 검출하기 위해 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 다시 밀봉하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 비결합된 토끼 항-인간 IgE 항체를 제거하기 위해, 플레이트를 상기한 바와 같이 PBST로 3회 세척하였다. HRP-컨쥬게이팅된 2차 항체 (염소-항-토끼 IgG, HRP 컨쥬게이팅됨, 피어스 (Pierce), 0.8 mg/ml)를 사용하여 토끼 항-인간 IgE를 검출하였다. 컨쥬게이트를 PBST 내에 1:25000으로 희석하고, 웰 당 150 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 상기한 바와 같이 PBST로 3회 세척하였다. 이어서, TMB-기질 용액 (다코 기질-색소원 (Substrate-Chromogen), No. S1599)을 150 ㎕/웰로 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 150 ㎕/웰의 중지 용액 (2M H2SO4)을 첨가하여 반응을 중지시키고, 450 nm 흡광도를 Tecan SAFIRE 기구 상에서 판독한다.
IC50의 측정치는 분석에서 리간드 (즉, IgE)의 농도에 의존적이므로, 본 분석에서 IC50은 인간 혈청 샘플 내에 존재하는 IgE 리간드의 양에 따라 변할 것이다. 대표적인 실험에서, 항체 11의 IC50은 202 pM이었다 (도 9). 동일한 실험에서, 졸레어™의 IC50은 57 nM이었다.
실시예 6: IgE 와 정제된 IgG 사이의 복합체 형성의 측정
정제된 인간 IgE와 정제된 항-IgE IgG (항체 11) 사이에 형성된 면역 복합체의 특성화는 고성능 크기 배제 액체 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 또한, 온 라인 (on line) 다각 광 산란 (MALS)을 이용하여 복합체 크기를 추정하였다. 복합체는 IgE 및 IgG를 3개의 상이한 몰비 (각각 3:1, 1:1 및 1:3)에서 함께 둘베코의 PBS 내에서 18℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 형성하였다. 1:1 몰비에 대해, 각각의 단백질의 농도는 2.5 μM이었다. 보다 높은 비는 관련된 단백질의 농도를 7.5 μM로 증가시킴으로써 달성되었다. 이들 샘플을 직렬로 배열된 2개의 Bio-Sep-SEC-S 4000 컬럼 (300 x 7.8 mm) 상에서 분석하였다. 컬럼을 평형화시키고, 샘플을 둘베코의 PBS 내에서 1 ml/min의 유속으로 애질런트 (Agilent) HP1100 HPLC 시스템 상에서 분석하였다. 피크는 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 220 및 280 nm에서 검출되었고, 용출물을 또한 와이어트 테크놀로지스 (Wyatt Technologies) DAWN EOS (MALS) 및 옵티랩 (Optilab) rEX (굴절률) 검출기를 통해 통과시켰다.
1:1 몰비 샘플의 크로마토그래피는 완전히 분할되지 않은 이중 (doublet) 피크 (UV 흡수에 의해 검출된)를 제공하고, 13.88분 및 14.9분의 체류 시간에 상응하였다. 이들 체류 시간은 IgG와 IgE의 비-공유 복합체의 형성을 나타낸다. MALS 분석은 1,085 kDa (13.88min 피크) 및 702 kDa(14.9min 피크)의 분자 질량을 제공하였다. 이들 질량은 이종4량체 (예측 질량 674 kDa, 2IgE:2IgG) 및 이종6량체 (예측 질량 1010 kDa, 3IgE:3IgG)에 대응하는 복합체와 일치한다. 3:1 및 1:3 (IgE:IgG) 몰비 샘플 모두의 크로마토그래피 및 MALS 분석은 UV 흡수에 의해 검출가능한 이종4량체 및 이종6량체에 대응하는 피크를 보이면서 1:1 샘플에 유사한 프로필을 제공하였다. 샘플 내에 과량의 IgE 또는 IgG에 대응하는 추가의 피크가 검출되었다.
실시예 7: 생식세포에서 유도된 항체 11에 의해 결합된 에피토프의 결정
원자 해상도에서 단백질의 정밀한 3차원 구조를 결정하기 위한 X-선 결정술의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있고, 항체와 상호작용하는 단백질의 부분을 상세히 시각화하기 위해 사용되었다 ([Padavattan et al, 2007]; [Karpusas et el., 2001]). 이는 가장 결정적인 에피토프 매핑 기술이지만, 상당한 노력을 요구하고 충분한 품질의 결정을 얻을 수 있는 것에 의존적이고, 이는 다시 단백질 샘플의 순도 및 품질과 적절한 결정화 조건을 발견할 수 있는 전문 기술에 의존적이다. 일단 단백질-항체 복합체의 결정이 수득되면, 여기에 X-선을 조사하여 회절 패턴을 생성하고, 이는 정확한 원자 분포에 의존적이다. 회절 패턴은 결정학자가 분석하여 구조 내의 원자의 3차원 위치 좌표를 결정할 수 있다. 이는 단백질과 항체 사이의 상호작용 부위의 상세한 검사를 가능하게 한다.
7.1 IgE Cε3-Cε4 항체 복합체의 X-선 결정 구조 결정
구조 결정을 위해 IgE 도메인 Cε2-Cε3을 클로닝하고 발현시키고 정제하였다. 유사하게, IgE에 결합하도록 개발된 전체 항체 11의 소화 및 정제에 의해 Fab 단편을 제조하였다. 복합체를 혼합에 의해 형성하고, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하여 비-복합화된 IgE 도메인 및 Fab 분자를 제거하였다. 삼방정계 공간군 P3221에 속하는 IgE Cε3-Cε4/Fab 복합체의 결정을 얻었다. 이들은 ESRF (European Synchrotron Radiation Facility, 프랑스 그로노블)에서 분석하였다. 2.85 Å 해상도에 대한 완전 회절 데이타를 얻었다. 구조를 별개의 탐색 모델로서 Fab 단편의 가변 및 불변 부분을 사용하여 분자 치환 (Rossman, 1972)에 의해 해석함으로써, Fab 단편을 결정학적 비대칭 단위로 배향하고 배치시킬 수 있다. 총 3개의 Fab 단편이 비대칭 단위에서 확인되었다. 후속적으로, 3개의 IgE Cε3-Cε4 분자가 비대칭 단위 내에 놓일 수 있다. 각각의 IgE 이량체는 2개의 Fab 분자에 결합하고, 따라서 총 비대칭 단위 내에 1과 1/2의 완전 IgE/Fab 복합체를 포함한다.
7.1.1 IgE Cε3-Cε4/항체 11 Fab 복합체의 전체적인 설명
결정 구조는 각각의 IgE Cε3-Cε4 이량체가 대칭 또는 근접 대칭 양식으로 2개의 Fab 단편에 결합됨을 보여준다 (도 10). 결정의 비대칭 단위는 1과 1/2의 IgE/Fab 복합체를 포함하므로, 불완전 복합체는 2배 축을 통해 이웃하는 비대칭 단위 내의 대칭 관련 파트너와 이량체를 형성한다.
IgE 이량체의 두 분자 (IgE1 및 IgE2로 칭함)는 항체 11의 Fab 단편과 상호작용한다. 대부분의 상호작용은 IgE1 및 IgE2 모두와 상호작용하는 Fab 중쇄에 의해 제공되는 반면, 경쇄는 단지 IgE1과만 상호작용하는 것으로 관찰되었다. 항원의 에피토프는 주로 도메인 Cε3 내에 놓이고, 도메인 Cε4 내의 힌지에 가까이 위치하는 하나의 아미노산이 에피토프에 기여한다.
결정의 비대칭 단위 내의 IgE Cε3-Cε4와 Fab 사이의 3개의 상호작용 부위는 매우 유사하다. 그러나, 정교화 (refinement) 후에, Fab 분자 중 하나가 다른 2개의 Fab 분자보다 상당히 덜 규칙적인 것이 분명하였다. 이는 결정 구조 내에 흔히 보이고, 특정 구역이 가요성(flexible)이고 결정 전체에 걸쳐서 상이한 배향을 채용하여 전자 밀도가 그다지 잘 규정되지 않는다는 사실에 의해 설명된다. 따라서, 상기 Fab 분자 및 그의 IgE Cε3-Cε4 분자와의 상호작용은 분석에서 고려되지 않았다.
IgE는 Fc 구역에서 잔기 Asn394에서 글리코실화되는 것으로 알려져 있다 (Wurzburg et al). 트립신 소화 후 질량분광법 분석에 의해 수행된 Fc 글리코실화의 특성화는 아마도 모두 만노스인 2, 3 또는 4개의 헥소스와 함께 코어 구조 Man3GlcNAc2로 구성된, Asn394에 결합된 3개의 상이한 글리칸 변이체를 보여주었다 (도 11). 실제로 3개의 모든 IgE Cε3 도메인에서 잔기 Asn394로부터, 연장된 전자 밀도가 이량체 내의 2개의 IgE 분자 사이의 공간 내로 돌출한다. 전자 밀도는 질량분광법 분석과 일치하게, 2개의 N-아세틸-글루코사민 (GlcNAc) 및 각각의 사슬에서 볼 수 있는 3 또는 4개의 만노스 단위가 존재하는 고 만노스 타입 구조를 제시한다. Man4에 커플링된, 코어 구조 외부의 하나의 헥소스인 Man6만이 전자 밀도에서 볼 수 있고, 이것은 남아있는 1-3 헥소스가 가요성임을 나타낸다.
7.1.2 에피토프 및 파라토프 ( paratope )의 설명
상기 결정 구조는 IgE Cε3-Cε4와 Fab 사이의 에피토프 상호작용을 원자 수준에서 상세하게 검사하는 것을 가능하게 한다. 설명하게 될 그의 불량하게 규정된 전자 밀도 지도 때문에 제3 Fab 분자를 제외하고, 2개의 독립적인 IgE/Fab 상호작용이 해석된 구조에 존재한다. 이들은 Cε 위치를 이용하여 계산된 0.31 Å의 2개의 동등한 Fab 가변 사슬 단편 사이에서 (superpose, CCP4 1994) 및 각각 0.82 및 0.96 Å의 동등한 IgE 단량체 사이에서의 근-평균-제곱 편차에 의해 매우 유사하게 나타난다. 상기 높은 유사성에서 불구하고, 2개의 상호작용은 따로 설명될 것이고, IgE/Fab1 및 IgE/Fab2로 지정될 것이다. 상호작용의 상세한 내용은 표 5 및 표 6에 제시되고, 여기서 잔기 번호는 사슬 표시 부호를 포함한다 (HC: Fab 중쇄, LC: Fab 경쇄, IgE1, IgE2). 항체 11의 아미노산 잔기의 넘버링은 카바트 시스템 (Kabat et al 1991)에 따른다. 거리는 CCP4 프로그램 CONTACT (CCP4, 1994)을 사용하여 얻었다.
두 상호작용은 항체 단편의 중쇄 및 경쇄 모두로부터의 상보성 결정 영역 (CDR), 프레임워크로부터의 잔기 (Fab의 CDR 외부의 구역) 및 IgE Cε3-Cε4 단량체에서 두 단량체로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 항체 경쇄는 IgE Cε3-Cε4 이량체에서 IgE1과 상호작용하는 한편, 경쇄는 두 단량체와 상호작용한다. 그러나, 대부분의 접촉은 중쇄와 항원의 단량체 IgE2 사이에 존재한다. 2개의 상호작용은 아래에 상세히 설명된다.
7.1.3 Fab1 과 IgE 사이의 상호작용인 상호작용 1의 상세한 설명
IgE Cε3-Cε4의 에피토프를 규정하는 상호작용 부위는 1100 Å2의 영역을 포함하고 (프로그램 areaimol을 사용하여 계산, 참고문헌 [CCP4, 1994] 참조), IgE1의 아미노산 잔기 Glu390 내지 Asn394 및 항원의 IgE2에서 Leu340, Arg342, Ala428 내지 Thr434, Thr436, Ser437 및 Glu472로 이루어진다. 또한, 당 모이어티 GlcNAc1, IgE1에서 Man6 및 IgE에서 Man5는 Fab 분자와 접촉한다. 당 모이어티를 포함하여 항원과 상호작용하는 중쇄로부터의 아미노산 잔기는 CDR1로부터의 Tyr32, CDR2로부터의 Asp53 및 Asn54, CDR3으로부터의 Val95, Met96, Ile100, Gly 100b, Gly100c, Asp101 및 Tyr102 및 프레임워크로부터의 Glu1, Lys23, Thr30, Ala71 내지 Arg77 및 Tyr79이다. Fab 경쇄로부터의 잔기는 CDR2로부터의 Asp50 및 Ser56, 및 프레임워크로부터의 Leu46 및 Tyr49이다. 상호작용은 비-극성 반 데어 발스 (van der Waals) 접촉 이외에 19개의 수소 결합을 포함한다.
7.1.4 Fab1 과 IgE 사이의 상호작용인 상호작용 2의 상세한 설명
IgE Cε3-Cε4의 에피토프를 규정하는 상호작용 부위는 1165 Å2의 영역을 포함하고 (프로그램 areaimol을 사용하여 계산, 참고문헌 [CCP4, 1994] 참조), IgE1의 아미노산 잔기 Glu390, Gln392 내지 Asn394 및 항원의 IgE2의 Leu340, Arg342, Ala428 내지 Thr434, Thr436, Ser437 및 Glu472로 이루어진다. 또한, 당 모이어티 GlcNAc1 및 IgE1에서의 Man6이 Fab 중쇄와 접촉한다. 당 모이어티를 포함하여 항원과 상호작용하는 중쇄로부터의 아미노산 잔기는 CDR1로부터의 Tyr32, CDR2로부터의 Pro52a, Asp53 및 Asn54, CDR3으로부터의 Val95, Met96, Ile100, Gly100b, Gly100c, Asp101 및 Tyr102 및 프레임워크로부터의 Glu1, Lys19, Lys23, Thr30, Ala71 내지 Ser75, Arg77 및 Tyr79이다. Fab 경쇄로부터의 잔기는 CDR2로부터의 Ser56 및 프레임워크로부터의 Tyr49이다. 상호작용은 비-극성 반 데어 발스 접촉 이외에 19개의 수소 결합을 포함한다.
Figure 112009049721163-PCT00022
Figure 112009049721163-PCT00023
Figure 112009049721163-PCT00024
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실험 7에 대한 물질 및 방법
IgE Cε3-Cε4의 과다발현
세포주 및 배양 배지
본 작업에서, 엡스타인 바아 (Epstein Barr) 바이러스 핵 항원-1 유전자를 안정하게 발현하는 원래의 부착성 세포주 HEK293-EBNA (인비트로겐 (Invitrogen, 스웨덴 스톡홀름))를 사용하였다. 세포를 현탁 성장에 적응시킨 후, 단계적인 배지 교체에 의해 DHI 배지 내로 전달하였다 (Davies et al. 2005). 사용된 DHI 배지는 Ca2 +이 존재하지 않는다는 점에서 원래의 배지와 약간 상이하였다. 적응 후에, 작용 세포 은행을 만들고, 두 세포주를 통상적으로 4 mM 글루타민, 2％ v/v 초저 IgG 태소 혈청, 250 ㎍/ml G418 (모두 인비트로겐 제품) 및 0.1％ w/v Pluronic F68 (시그마-알드리치)을 보충한 Ca2 + 미함유 DHI 배지 내에서 최대 20회의 계대배양으로 성장시켰다.
형질감염 절차
25 kDa의 선형 폴리에틸렌이민 (폴리사이언시즈 유럽 (Polysciences Europe, 독일 에펜하임))의 1 mg/ml 스톡 (stock) 용액을 물 중에 제조하고, pH를 7.0으로 조정하고, 멸균 여과하고, 사용할 때까지 소량의 분취액으로 -80℃에서 저장하였다. 형질감염 직전에 보충되지 않은 DHI 배지 내에 형질감염 부피의 1/10에 동등한 부피로 형질감염 칵테일 (cocktail)을 제조하였다. 형질감염 칵테일을 제조하기 위해, DHI 배지를 2개로 나누었다. 0.8 ㎍ DNA/ml (형질감염 부피)를 DHI 배지의 하나에 첨가하고, 다른 하나의 배지에는 2 ㎍ PEI/ml (형질감염 부피)를 첨가하였다. 2개의 용액을 잠깐 동안 진탕시키고 5분 동안 인큐베이션한 후, DNA 용액을 PEI 용액에 서서히 첨가하였다. 형질감염 칵테일을 20-30분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 파동형 생물반응기 (wave bioreactor) (웨이브 바이오테크 아게 (Wave Biotech AG, 스위스 타겔스방엔))에 첨가하였다. 형질감염 4시간 후에, 배양액을 보충된 DHI 배지 및 HypPep1510 (케리 바이오-사이언시즈 (Kerry Bio-Sciences, 네덜란드 알메르))에 0.3％ (w/v)의 최종 농도로 최종 생산 부피로 공급하였다.
배양액 접종
접종 배양액의 팽창을 위해, 세포를 회전식 진탕기 인큐베이터 (인포르스 아게 (Infors AG, 스위스 보트밍겐))에 배치된 5％ CO2 분위기 중에서 37℃에서 플라스틱 진탕병에서 성장시켰다. 세포를 통상적으로 분리 전에 약 2 x 106 세포/ml에 도달하도록 1주에 2회 계대배양하였다. 세포 밀도 및 생존능을 Cedex 자동 세포 계수기 (이노바티스 아게 (Innovatis AG, 독일 빌레펠트))를 사용하여 평가하였다. 파동형 배양을 위해, 실험 개시시에 세포가 로그 성장기에 있도록 보장하기 위해 세포를 형질감염 1일 전에 1x1O6 세포/ml로 분리하였다. 파동형 배양액을 직접 진탕기로부터 접종하였다. 모든 접종 배양액을 원심분리에 의해 농축시키고, 신선한 배양 배지 내에 재현탁시킨 후, 생물반응기에 첨가하였다.
파동형 배양
발현은 파동형 생물반응기 (웨이브 바이오테크 아게) 내에서 10 L의 작업 부피에서 수행하였다. 4.5 L의 보충된 DHI 배지 중의 1 x 106 세포/ml로 파동형 생물반응기에 접종하였다. 2시간 적응기 후에, 배양액을 0.5 L 형질감염 칵테일로 형질감염시켰다. 형질감염 4시간 후에, 배양액을 보충된 DHI 배지 및 HyPep1510에 0.3％ (w/v)의 최종 농도로 10 L의 총 부피로 공급하였다. 세포 밀도, 생존능 및 단백질 농도를 결정하기 위해 샘플을 매일 취하였다.
발현 벡터
C-말단 Flag 태그 및 10-히스티딘 태그를 갖는, 인간 IgE Cε3-Cε4를 발현하는 벡터는 문헌 [Persic et al. (1997)]에 기재된 벡터로부터 유래하였다. 시스템은 EF1-a 프로모터에 의해 조절된다.
IgE Cε3-Cε4의 정제
20 L의 세포 상등액을 5배 농축시키고, 10 kDa 분자량 컷오프 십자-흐름 (cross-flow) 막 (Pellicon 2, 밀리포어 (Millipore))을 사용하여 2xPBS (308 mM NaCl, 20 mM 포스페이트 (pH 7.4))로 투석 여과하였다. 배지를 30 mL Ni세파로스 (지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))와 2시간 동안 4℃에서 배치 결합시키고, 5 부피의 2xPBS로 세척하고, XK26 컬럼 내로 충전하였다. 이어서, 오염 단백질을 세척 제거하기 위해 컬럼을 5 컬럼 부피의 2xPBS 중의 40 mM 이미다졸로 세척하였다. 마지막으로 IgE를 2xPBS 중의 400 mM 이미다졸로 용출하였다. 풀 (pool)은 IgE를 고순도로 함유하였고, 약 4배 (~5 mg/mL로) 농축시킨 후, 전개 버퍼로서 사용된 2xPBS를 사용하여 Superdex 200 50/60 SEC-컬럼 (1200 mL, 지이 헬쓰케어) 위로 전개시켰다. 일부의 더 큰 단백질이 분리되었고, IgE가 주요 피크 내에서 발견되었다. 다른 2개의 분획에서는 오염 때문에 주요 피크 분획만을 모았다. 상기 단계는 샘플의 순도를 ~99％로 증가시켰다. 생산된 총량은 42 mg이고, 정제된 IgE는 농도가 2 mg/mL이었다.
IgE Cε3-Cε4의 글리코실화의 분석
트립신을 사용한 용액상 소화
2 x PBS 중의 인간 IgE 최소 도메인인 IgE Ce3-Ce4 (2 mg/ml) (조성 308 mM NaCl, 20 mM 포스페이트 (pH 7.4))를 25 mM NH4HCO3 내에서 100 ㎕ 트립신 (0.02 mg/ml)과 혼합하였다. 소화를 밤새 37℃에서 진행시키고, H2O 중 2 ㎕ 포름산 (67％)을 사용하여 중지시켰다.
나노- LC MS / MS :
LTQ-Orbitrap 질량분광계 (써모 (Thermo))에 연결된, ReproSil-Pur C18-AQ 3 ㎛ 다공성 입자로 충전된 융합 실리카 컬럼 (20 cm x 50 ㎛ 내경) 상에서 분석을 수행하였다. 8 ㎕ 샘플을 주사하고 (애질런트 자동샘플 주입기), 펩티드를 분리 전에 전치 컬럼 (precolumn) (4.5 cm x 100 ㎛ 내경)에 포획하였다. 0.1％ 포름산을 사용한 5분의 직선 전개 후에, 구배는 5-30 min 동안 10-50％ 아세토니트릴 (애질런트) (200 nl/min)이었고, 용출액을 방출기 첨단부로부터 전자분무하였다. 기구는 3가지의 가장 풍부한 다가 양성자화된 이온의 Orbitrap (FT-MS) 서베이 스캔 (survey scan)과 이온 트랩 (IT- MS/MS) 사이에서 서로 전환시키기 위해 데이타-의존 방식으로 작동하였다.
정적 전자분무 MS/MS:
당펩티드 단편의 하전 상태를 확인하기 위해서, 선택된 전구체를 1.6 kV에서 ESI 니들 (needle)을 사용하여 분석하고, 나노-LC 분석에서의 선형 이온 트랩과 달리 Orbitrap에서 단편화하고 검출하였다.
당펩티드 데이타 분석:
가능한 당펩티드의 계산된 MH+ 질량을 GlycoMod 툴을 사용하여 글리코실화의 존재에 대해 조사하였다 (http:expasy.org/tools/glycomod) (Cooper et al 2001). 단백질 서열 및 10 ppm의 질량 허용 오차 (mass tolerance)를 입력하였다. 모든 제안된 당펩티드를 글리칸 함유 단편의 존재에 대해 검토하였다.
항체 11 Fab의 생산
IgG 정제
MabSelect SuRe (지이 헬쓰케어) 단백질 A 크로마토그래피 매질을 사용하여 CHO-EBNA 일시적인 물질로부터 항체 11을 정제하였다. 단백질 A 용출물을 PD-1O 컬럼 (지이 헬쓰케어)을 사용하여 PBS (pH 7.2) 내로 버퍼 교환한 후, Millex-GP 시린지 팁 필터 (밀리포어)를 사용하여 0.22 ㎛로 여과하였다.
Fab 소화 및 정제
GIBCO PBS 내에 용해된 30 mM DL-시스테인 염산염의 소화 버퍼 (인비트로겐)를 제조하였다. 파파야 유액으로부터의 파파인 (시그마)을 소화 버퍼 내에 재구성하여 10 mg/mL 용액을 제공하고, 사용 전에 최소 30분 동안 실온에서 유지하였다. 시스테인을 항체 11 IgG에 첨가하여 30 mM 용액을 제공하고, 파파인을 1 mg 파파인 대 100 mg IgG의 비로 첨가하였다. 소화는 90분 후에 0.5M 요오도아세트아미드 (시그마)를 첨가하여 최종 소화 혼합물 내에 50 mM 요오도아세트아미드를 제공함으로써 종료하였다. Fab는 비-결합 방식으로 MabSelect SuRe (지이 헬쓰케어) 단백질 A 크로마토그래피 매질을 사용하여 소화 혼합물로부터 정제하였다. MabSelect SuRe 단계로부터의 Fab 분획을 PD-1O 컬럼 (지이 헬쓰케어)을 사용하여 50 mM 아세트산나트륨/100 mM NaCl (pH 5.5) 내로 버퍼 교환한 후, Amicon Ultra-15 5 kDa MWCO 원심분리 필터 장치 (밀리포어)를 사용하여 ~10 mg/mL로 농축하였다. Mustang Q 아크로디스크 (팔 (Pall))를 사용하여 최종 생성물을 추가로 정제한 후, Millex-GP 시린지 팁 필터 (밀리포어)를 사용하여 0.22 ㎛로 여과하였다.
IgE Cs3 -Cε4 항체 11 Fab 복합체의 생성.
버퍼 308 mM NaCl 및 20 mM 포스페이트 (pH 7.4) 내의 2 mg/mL의 IgE Cε3-Cε4를 함유하는 용액을 50 mM 아세트산나트륨, 100 mM NaCl (pH 5.5) 내의 10.6 mg/mL의 항체 11 Fab를 함유하는 용액과 각각 1 대 1.1의 IgE Fc3-4 동종이량체 및 항체 11 Fab 이종이량체의 화학양론적 비율로 혼합하였다. 혼합물을 얼음 내에 밤새 정치시킨 후, 20 mM Tris HCl (pH 7.6) 및 0.15 M NaCl 내에 평형화시킨 HiLoad Superdex200 16/60 컬럼 (지이 헬쓰케어) 상에서 겔 여과하였다. 복합체를 함유하는 주 피크를 수집하고, 10.4 mg/mL로 농축하여 결정화 실험에 사용하였다.
IgE Cε3-Cε4 항체 11 Fab 복합체의 결정화
소적 증기 확산 (drop vapour diffusion) 방법에 따라 결정화를 수행하였다. 소적은 동일 부피의 단백질 및 보유 용액 (150+150 nL)을 함유하였고, 80 ㎕의 보유 부피로 Crystal Quick 96 웰 플레이트 (그라이너 Bio-one) 내에 도입되었다. 복합체 결정은 4℃에서 2-3주에 걸쳐 100 mM MgCl2, 100 mM 시트르산나트륨 (pH 5.0) 및 15％ PEG 4000의 보유 용액과 함께 소적에서 성장하였다. 결정을 냉동보호제 용액 (100 mM MgCl2, 100 mM 시트르산나트륨 (pH 5.0) 및 100％ 글리세롤의 첨가에 의해 20％ 글리세롤로 만든 15％ PEG 4000) 내로 수확하고, 액체 질소 내에서 급속 냉각시켰다.
IgE Cε3-Cε4 항체 11 Fab 복합체의 데이타 수집 및 구조 해석
회절 데이타를 프랑스 그레노블 소재의 유럽 방사광 가속기 시설 (European Synchrotron Radiation Facility (ESRF))에서 빔 라인 (beam line) ID-29에서 단일 결정으로부터 수집하였다. 초기 데이타세트 (데이타 세트 1, 표 7)를 3 Å 해상도로 기록하고, 후속적인 보다 고 해상도 데이타세트는 2.85 Å 해상도로 수집하였고, 두 데이타세트는 모두 공간군 P3221에 속하였다. 데이타를 autoPROC (글로벌 페이싱 리미티드 (Global Phasing Limited GPhL, 영국 캠브리지))로 처리하였다. 데이타 처리에 의한 통계 분석이 표 7에 제시된다. 비대칭 단위는 3개의 Fab 분자 및 54％의 용매 함량에 대응하는 IgE Cε3-Cε4의 3개의 분자를 함유한다. 구조를 프로그램 PHASER를 사용하여 분자 치환 방법으로 해석하였다 ([Read 2001], [Storoni et al 2004], [McCoy et al 2005]). Fab 단편 및 IgE Fc 도메인에 대한 초기 모델은 이전에 보고된 구조 1AQK (Faber et al 1998) 및 1FP5 (Wurzburg et al 2000)로부터 생성하였다.
탐색 모델로서 전체 Fab의 사용은 가변 도메인과 불변 도메인 사이의 힌지 구역의 각도 변동 때문에 실패하였다. 대신에, 각각 가변 도메인 및 불변 도메인으로 구성된 2개의 별개의 탐색 모델을 만들어 PHASER의 초기 실행으로 확인하였다 ([Read 2001], [Storoni et al 2004], [McCoy et al 2005]). 이들은 나중에 완전 Fab 단편에 연결하였다. 총 2개의 Fab 단편 및 1개의 가변 도메인이 상기 방식으로 확인되었다. 분자 치환의 후속 실행은 3개의 IgE Cε3-Cε4 분자를 위치시켰고, 그 중 1개는 도메인 4만을 포함하도록 다시 절단해야 하였다. 이 단계에서, 보다 양호한 품질의 데이타를 수집하였고 (데이타세트 2, 표 7), 상기 모델을 프로그램 autoBUSTER (글로벌 페이싱 리미티드)를 사용하여 새로운 데이타에 대해 정교화하였다. 후속적으로, Fab 분자의 아미노산을, 그래프 형식의 프로그램 COOT (Emsley & Cowtan 2004)를 사용하여 항체 11의 정확한 서열로 수동으로 변경하였다. Refmac (CCP4 1994)으로 등방성 B 인자의 정교화를 사용하여 제2 라운드의 억제된 최대-가능성의 정교화 후에, 마지막 Fab 및 IgE 분자의 남아있는 도메인을 수동으로 전자 밀도에 대해 피팅하였다. 아미노산 잔기 Asn394로부터 IgE 분자들 사이의 공간 내로 돌출하는 연장된 전자 밀도의 2개의 추가의 측징부가 관찰되었다. 이는 글리코실화로서 해석되었고, 따라서 2개의 N-아세틸-글루코사민 및 3 내지 4개의 만노스 단위가 IgE 모델에 추가되었다. 추가의 라운드의 정교화는 TLS를 개별적인 도메인에, 비-결정학적 대칭성 (NCS) 억제를 IgE 분자에 대해 적용하는 autoBUSTER (글로벌 페이싱 리미티드) 또는 Refmac5 (Murshudov et al 1997)를 사용한 정교화가 그 사이에 실행되는, COOT (Emsley & Cowtan 2004)를 사용한 루프 구역의 수동적인 재건을 포함한다. Refmac5 (Murshudov et al 1997)에서 워터 피킹 옵션 (water picking option)을 사용하여 총 213회의 물을 안에 도입한 후, 수동 검사를 수행하였다. 최종 라운드의 정교화에서, NCS 억제를 해제하여 R=20.0％ 및 Rfree=27.0％인 최종 모델을 생성시켰다.
Figure 112009049721163-PCT00028
실시예 7에 인용된 참고문헌
Figure 112009049721163-PCT00029
Figure 112009049721163-PCT00030
실시예 8: 어린 ( juvenile ) 사이노몰거스 원숭이에서 혈소판수 감소를 유도하는, 생식세포에서 유도된 항- IgE mAb 의 일반적인 안전성 및 능력의 평가
혈소판 수를 감소시키는 본 발명의 항체 항-IgE mAb 항체 11 IgG1, 항체 11 IgG2 및 다른 항-IgE 항체 E48의 일반적인 안전성 및 상대적인 능력을 평가하기 위해 조사 (GLP에 따르지 않는) 연구를 어린 사이노몰거스 원숭이에서 수행하였다.
연구 목적은 1) 어린 사이노몰거스 원숭이에서 혈소판 계수/TCP의 감소 및 연관된 효과를 유도하는 3개의 후보 항-IgE mAb의 일반적인 안전성 및 상대적인 능력을 결정하고, 2) 원숭이에서 mAb에 대한 예비 약동학 파라미터를 결정하고, 3) 유리 IgE의 감소를 일으키는 3개의 후보 mAb의 능력을 평가하고 mAb 농도와 유리 IgE 수준 사이의 (PK/PD) 관계를 결정하기 위한 것이었다.
실시예 8에 대한 물질 및 방법
18마리의 목적하는 사육된 사이노몰거스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis))를 바이오컬쳐, 마우리티우스 (Bioculture, Mauritius)로부터 입수하였다. 동물은 투여 시작시에 63 내지 67주령이었다. 각각 3마리 수컷 및 3마리 암컷 원숭이를 포함하는 3개의 군에 걸쳐서 표준화되고 항체 11 IgG1 (1군), 항체 11 IgG2 (2군) 또는 E48 (3군)을 투여한 원숭이를 높은 IgE 수준 (U/ml)을 갖도록 예비-선택하였다 (100마리 동물의 보다 큰 풀로부터). 각각의 3개의 mAb는 50 mM 아세트산나트륨, 100 mM NaCl (pH 5.5) 내에 제형화하고, 1 mL/min의 속도로 느린 정맥내 주사 (동력화한 시린지/주입 펌프를 사용하는)에 의해 2 mL/kg의 투여량 부피로 동물에게 투여하였다. 동물에게 제1, 8, 16, 22 및 29일에 1 mg/kg, 30 mg/kg 및 100 mg/kg (x3)의 상승하는 투여량 수준으로 (표 8) 매주 1회 (5 주/5 투여량을 위해) 투여하였다. 항체 11 IgG1 및 항체 11 IgG2의 추가의 투여량을 제37일에 각각 1군 및 2군에 투여하였다. 2개의 최고 투여량 수준은 어린 사이노몰거스 원숭이에서 졸레어를 사용할 때 혈소판감소증 (TCP)을 일으키는 것으로 이전에 나타난 혈청 농도를 달성하는 것으로 예측되었다. 낮은 투여량은 유리 IgE 수준의 감소를 일으키는 mAb의 능력의 결정을 허용하는 것으로 예상된다.
Figure 112009049721163-PCT00031
동물을 제28일 투여량 후에 8주 동안 관찰하고, 임의의 독성학적 효과로부터 회복에 대해 검사하였다.
모든 동물을 아픈 징후 또는 명백한 독성에 대해 매일 관찰하고, 체중 및 음식 소비를 기록하였다. 또한, 각각의 동물에 대해 투여기 동안 매일 및 비-투여기 동안 적어도 매주 1회 상세한 신체 검사를 시행하였다. 모든 동물을 또한 각각의 투여 전에 및 투여 후 0.5, 2, 6, 24, 48 및 168시간에 관찰하였다.
표준 혈액학 파라미터 (혈소판 계수 포함; EDTA 내에 수집됨) 및 응고 파라미터 (시트르산삼나트륨 내에 수집됨)의 분석을 위한 혈액 샘플을 대퇴 정맥/동맥으로부터 처리 전에 2회 (제 -2 및 -1주) 취하였다. 혈소판 계수 및 표준 혈액학에 대한 추가의 샘플은 각각의 투여 발생 후 24시간 및 144시간에 (제2, 7, 9, 14, 17, 22, 23, 26, 30 및 35일; 1군 및 2군으로부터의 샘플은 제38 및 43일에서만) 및 8주 회복기 동안 2주마다 (제43, 57, 71 및 82일) 수집하였다. 응고에 대한 샘플은 각각의 투여 발생 후 144시간 (제7, 14, 22, 26 및 35일)에 및 회복기의 끝에 (제82일) 수집하였다. 응고에 대한 샘플은 또한 제57일에 수집하였다. 보체 활성화 (C3a, C3b 및 BB 단편)에 대한 혈액 샘플은 처리전 1회 (제 -1주) 및 처리기의 완료 후 약 24시간 (제30일)에 취하였다.
TK 분석을 위한 혈청 샘플은 모든 군에서 제1일에 투여 전에, 투여 후 0.5, 6, 12, 24, 48, 144시간에, 제8, 16, 22 및 29일 투여 후 0.5, 24 및 144시간에, 제29일 (3군 & 4군만)에 투여 후 336, 672, 1008, 1272시간에, 제37일 (1군 & 2군만)에 투여 후 0.5, 24, 144, 480, 816, 1080시간에 수집하였다. 샘플을 일반적 샌드위치 (sandwich) 면역분석 (mAb에 대해 비오티닐화된 인간 IgE 및 Alexa-647 표지된 뮤린 항-인간 IgG 검출 시약을 사용하는) 및 Gyrolab Bioaffy 플랫폼 (스트렙타비딘 비드 컬럼 포함)을 이용하여 mAb에 대해 분석하였다. IgE 분석을 위한 추가의 혈청 샘플은 제1일에 투여 전에, 투여 후 0.5, 6, 12, 24, 48, 144시간에, 제8, 16, 22 및 29일에 투여 후 0.5, 144시간에, 및 연구 종료시 (제82일)의 최종 투여 후 1272시간 (3군 & 4군) 또는 1080시간 (1군 & 2군)에 수집하였다. 샘플을 유리 IgE 포획을 위해 인간 IgG-FcεRIa 및 검출을 위해 토끼 항-인간 IgE (PCS-컨쥬게이트)를 사용하는 ImmunoCap 시스템 (파디아 아베 (Phadia AB))를 이용하는 면역분석에 의해 유리 IgE에 대해 분석하였다.
제85일에 동물의 희생 후에, 완전한 거시적 검사를 병리학자의 일반적인 감독하에 수행하고, 모든 병변을 기록하였다. 절대적 장기 중량 및 장기:체중 비를 결정하였다. 광범위한 장기로부터의 조직을 수집하고 동결 저장하였지만, 현미경 검사를 수행하지 않았다 (거시적 이상 또는 예정에 없는 사멸에 대한 것 제외, 아래 참조).
실시예 8에 대한 결과
일반적인 안전성 관찰
3개의 모든 mAb는 임상 상태 악화 및 체중 감소로 인해 스케줄에 앞서 부검실에 보내진 항체 11을 투여한 한 마리의 동물을 제외하고는 연구 기간 내내 아픈 임상 징후 없이 일반적으로 잘 허용되었다. 상기 동물은 회복기 늦게까지 상태가 악화되었고 이들 동물의 병리학 또는 혈액학 검토 동안 인지된 발견이 없으므로, 관찰된 효과는 mAb와 관련된 것으로 생각되지 않는다. 연변 또는 설사의 발생이 모든 군에 걸쳐 인지되었지만, 이들 발견은 투여량과 관련되지 않고, 모든 동물에서 또는 동일한 동물 내에서 모든 시점에서 보이지 않고, 투여기 및 회복기 동안 빈번하게 보이므로, 이들은 mAb와 관련되는 것 같지는 않다. 평균 체중 및 평균 체중 증가는 연구 기간 내내 각각의 군 내의 동물들에서 일부 개체 변이를 보였다. 그러나, 모든 동물은 처리기에 걸쳐 예상되는 바와 같이 체중이 증가하였고 (상기 논의한 1마리의 동물을 제외함), 군들 사이에 명백한 차이는 없었다. 임의의 군에서 절대적인 또는 상대적인 장기 중량에 대한 명백한 처리-관련 효과는 인지되지 않았다. 거시 병리학 및 미시 병리학 검사에서, mAb 처리의 효과를 제안할 발견은 제한된 범위의 검사된 조직에서 인지되지 않았다.
독성동태 ( TK ) 및 IgE 수준
본 연구에서 TK에서 성별 차이는 관찰되지 않았다. 일반적으로, 노출은 이들 3개의 mAb에 대해 유사하였고, 1-100 mg/kg 투여량 범위에서 투여량에 따라 직선형으로 나타났다. 항체 11 IgG1, 항체 11 IgG2 및 E48에 대한 평균 TK 프로필을 도 12에 도시한다. 최저 투여량 수준에서도 TK에 대한 명백한 IgE-하락 효과는 관찰되지 않았다. 이들 3개의 항체의 TK는 사이노몰거스 원숭이에서 인간 IgG에 대한 전형적인 것으로 나타났다.
마지막 100 mg/kg 투여량 후 평균 최대 관찰 농도 (Cmax)는 항체 11 IgG1, 항체 11 IgG2 및 E48에 대해 각각 18700, 15900 및 24000 nM이었다. 마지막 100 mg/kg 투여량 후 평균 종점 TK 반감기는 약 10-13일이었다. 이들 동물에서 영장류 항-인간 항체의 잠재적인 발달로 인한 감소된 TK 노출의 증거는 없었다.
사이노몰거스 원숭이에서 항체 11 IgG1, 항체 11 IgG2 및 E48을 다양한 투여량 수준으로 매주 투여한 후의 평균 유리 IgE 프로필을 도 13에 도시한다. 동물에게 첫 번째 투여량을 투여하기 전에 평균 기준선은 항체 11 IgG1, 항체 11 IgG2 및 E48 군에 대해 각각 514, 414 및 690 ng/mL이었다. 제1일에, 1 mg/kg 투여량은 투여 1시간 후 유리 IgE의 75-80％ 감소를 유도하였다. 1 mg/kg 투여량 후 적은 노출로 인해, 유리 IgE는 1주 내에 기준선 수준으로 되돌아 왔다. 보다 고투여량은 처리기 동안 유리 IgE의 일관된 억제를 일으켰다. 유리 IgE는 연구 종료시에 2개의 항체 11 군에 대해 기준선으로 되돌아온 반면, E48 군에서는 유리 IgE가 억제된 채로 유지되었다.
혈소판에 대한 효과
3개의 mAb (항체 11 IgG1, 항체 11 IgG2 또는 E48)는 모두 제29일에 단일 시점 (제28일에 세 번째 100 mg/kg 투여의 24시간 후)에서 혈소판이 감소한 (34.9％) 항체 11 IgG1을 투여한 단일 동물을 제외하고는 임의의 동물에서 임의의 시점에서 혈소판 계수의 유의한 감소를 유도하지 않았다. 제37일에 항체 11 IgG1 및 항체 11 IgG2의 4번째 투여량은 이들 2개의 군 내의 상기 또는 임의의 동물에서 임의의 추가의 혈소판 감소를 유도하지 않았다.
도 14는 1군 (항체 11 IgG1-처리된)의 동물로부터의 혈장 농도에 대한 2회의 투여전 값의 평균으로부터의 변화율로서 표현된 혈소판 수치 (x109/L)의 그래프를 보여준다. 이 그래프는 혈소판에 대해 유의한 효과를 보이지 않은 3개의 군에 걸쳐서 다른 16마리의 동물을 대표하는 것이다 [항체 11 동물에 대한 변화]. 도 15는 제29일에 혈소판 수치의 일시적인 유의한 하락 (기준선의 35％ 미만)을 보인 1군 (항체 11 IgG1-처리된)의 동물에 대한 동일한 그래프를 보여준다.
흥미롭게도, 제29일에 투여 후 혈소판 수치의 일시적인 하락을 보인 항체 11 IgG1-처리된 원숭이는 이 시점에 최고 Cmax 값 (29400 nmol/L)을 보였다 (그러나 노출 없음). 혈장 수준은 후속적으로 급격하게 떨어졌고, 혈소판 계수는 투여전 값으로 되돌아왔다. 이는 혈소판 수치의 감소를 야기하기 위해 혈장 농도의 보다 높은 역치가 요구될 수도 있다는 가능성을 암시한다. 그러나, 단일 E48-처리된 동물은 상응하는 혈소판 효과 없이 유사한 수준 (28500 nm/L)에 도달하였다 (도 14).
다른 혈액학적 효과.
혈소판 계수 (아래 참조)를 제외하고는, 대다수의 혈액학 파라미터 (헤모글로빈 농도, 충전 세포 부피, 평균 세포 부피, 평균 세포 헤모글로빈 농도, 적혈구 분포폭, 혈소판 크릿 (crit), 혈소판 분포폭, 적혈구 계수, 평균 세포 헤모글로빈, 헤모글로빈 분포폭, 평균 혈소판 부피, 세망세포 계수, 총 및 감별 백혈구 계수) 및 혈액 응고 파라미터 (프로트롬빈 시간, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간)에 대해 mAb 처리의 일관된 효과가 인지되지 않았다. 모든 군에서 세망세포수의 증가가 관찰되었지만, 변화는 투여량/노출과 관련되지 않고, 군 내에서 (군 내의 동물들은 투여전 값보다 더 높거나, 더 낮거나, 변화되지 않은 수준을 가졌다) 또는 동물 내에서 (동물 내의 값은 노출에 무관하게 시점들 사이에서 오르고 내린다) 일관되지 않고, 평행 대조군의 부재 하에, mAb 처리에 대한 관계는 이 시점에 충분히 결정될 수 없다. 임의의 그러한 변화는 일반적으로 회복기의 끝에 역전되었다. 보체 활성화 (C5a, C3a 또는 BB 단편)에 대한 유의한 처리-관련 효과가 눈에 띄지 않았다.
논의 및 결론
본 연구에서 항-IgE mAb인 항체 11 IgG1, 항체 11 IgG2 및 E48이 높은 반복 투여량 수준 (100 mg/kg까지)에서 어린 사이노몰거스 원숭이에게 투여될 때 유의한 불리한 독성학적 효과 없이 잘 허용되었음을 보여준다. 18마리의 원숭이 중 1마리만이 mAb의 혈장 농도가 거의 30000 nmol/L에 도달할 때 100 mg/kg 항체 11 IgG1을 투여한 후 단일 시점에서 혈소판 수치의 유의한 하락을 보였다. 본 연구에서 3개의 모든 mAb에서 도달된 혈장 Cmax 농도는 임상에서 도달될 것 (예를 들어 200 nmol/L)을 훨씬 초과하는 것으로 예상된다.
실시예 9: Fc ε RI 및 CD23 에 대한 IgE 효과의 기능적 억제.
FcεRI 및 CD23과 IgE의 상호작용을 기능적으로 억제하는 최적화된 항체 11의 능력을 문헌 [Bracher et al, Journal Immunol. Methods 2007 323:160-171]에서 채용된 IgE-매개된 세포 치사 분석으로 평가하였다. IL-4로 예비-처리한 U937 세포는 FcεRI 및 CD23을 모두 발현하는 것으로 나타났다. IGROV1 세포 상에 발현된 항원에 특이적인 IgE의 존재 하에 난소 종양 세포 IGROV1과 동시-배양시키면, U937 세포는 종양 세포를 치사시킬 수 있었다. 치사는 각각 U937 효과기 세포에 대한 FcεRI 및 CD23과 IgE의 상호작용을 통해 촉발되는 것으로 나타난 세포독성 및 포식작용 메카니즘 모두에 의해 매개되었다.
항체 11 및 이소형 대조군을 상기 분석으로 FcεRI 또는 CD23을 통한 IgE-매개된 치사의 억제에 대해 평가하였다. 상기 절차에 대한 상세한 프로토콜은 물질 및 방법에 제시된다. 간단히 설명하면, 시험 IgG의 적정액을 표적 특이적 (MOv18) 또는 비관련 (NIP) IgE와 혼합한 후, IL-4-자극된 U937 효과기 세포 및 표지된-IGROV1 표적 세포와 함께 인큐베이션하였다. 2.5시간 인큐베이션 후에, 세포를 세척하고, 항-CD89-피코에리트린 항체 (비디 바이오사이언시스) 및 요오드화프로피듐 (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes))으로 염색하였다. 세척한 후에, FACSCalibur 유동 세포계 (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 세포 형광을 분석하였다. 상기 형광 염료는 살아있는 세포를 세포독성에 의해 치사된 세포 및 포식작용에 의해 치사된 세포와 구분하기 위해 사용하였다. 이소형 대조군 항체와는 달리, 항체 11은 IgE/FcεRI-매개된 세포독성 (도 16) 및 IgE/CD23-매개된 포식작용 (도 17)을 모두 억제할 수 있었다.
물질 및 방법 - 실시예 9
항체를 U937 세포에 의한 IgE-매개된 IGROV1 종양 세포 치사의 억제에 대해 평가하였다. IGROV1 세포 (인간 난소 암종 세포주) 및 U937 세포 (인간 골수단핵구 세포주)를 표준 조직 배양 절차를 이용하여 배양 배지 [RPMI 1640, 10％ v/v FCS, 2 mM 글루타민, 5000 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 (모두 인비트로겐)] 내에 유지하였다. IGROV1 세포 상에 발현된 FBP (엽산 결합 단백질)에 대해 생성된 MOv18 IgE를 종양 특이적인 항체로서 사용하였다. NIP (합텐 4-히드록시-3-니트로-펜아세틸)-특이적 IgE를 대조의 비관련 항체로서 사용하였다. MOv18 및 NIP 항체를 문헌 [Gould et al, (1999) Eur. J. Immunol. 29:3527-3537]에 설명된 바와 같이 제조하였다.
CD23의 발현을 상향-조절하기 위해 U937 세포를 치사 실험 전에 4일 동안 10 ng/ml 재조합 인간 IL-4 (알앤디 시스템즈 (R&D Systems))로 예비-처리하였다. 치사 실험 전날에, IGROV1 표적 세포를 형광 염료 CFSE (카르복시-플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르, 몰레큘라 프로브스)로 표지하였다. 간단히 설명하면, 세포를 트립신으로 처리하고 (트립신/EDTA, 깁코), 배양 배지 내에서 세척하고, PBS 내에 50x106 세포/ml로 재현탁하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 10분 동안 0.01 mM에서 CFSE와 함께 인큐베이션하였다. 표지한 후, 세포를 빙냉 배양 배지 내에서 1회 세척한 후, 밤새 37℃, 5％ CO2에서 인큐베이션하였다.
항체 11의 억제 효과를 평가하기 위해, 항체 희석액을 12x75 mm 튜브 (Falcon, 비디 바이오사이언시스) 내에 제조하고, 2 ㎍의 MOv1 또는 NIP IgE를 80 ㎕의 최종 부피를 제공하도록 첨가하였다. 상기 혼합물을 세포 없이 30분 동안 인큐베이션하였다. IL-4-자극된 U937 세포를 배지 내에 1회 세척하고 1.33x106 세포/ml로 재현탁시켰다. CFSE-표지된 IGROV1 세포를 트립신처리하고, 배지 내에 1회 세척하고, 4x105 세포/ml로 재현탁하였다. 세포를 항체를 함유하는 튜브에 첨가하고 (U937 세포에 대해 120 ㎕ 및 IGROV1 세포에 대해 200 ㎕), 혼합하고, 2.5시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 빙냉 FACS 버퍼 (칼슘/마그네슘 비함유 PBS, 5％ 정상 염소 혈청) 내에서 세척하고, 25분 동안 항-CD89-피코에리트린 항체 (비디 바이오사이언시스, 10 ㎍/ml)와 함께 인큐베이션하여 U937 효과기 세포를 표지하였다. 세포를 빙냉 FACS 버퍼 내에서 1회 더 세척하고, 0.25 ㎍/ml 요오드화프로피듐 (몰레큘라 프로브스)를 첨가하여 죽은 세포를 염색하였다. 4℃에서 15분 후, 세포를 빙냉 FACS 버퍼 내에서 세척하고, 250 ㎕ 빙냉 FACS 버퍼 내에 재현탁시키고, 제조자의 지시에 따라 FACSCalibur 유동 세포계 (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 형광을 분석하였다. 관련된 단일 염색을 갖는 세포를 사용하여 검출 채널 (FL1, FL2 및 FL3)의 전압 및 보상을 조정하였다.
본 분석에 사용된 형광 염료의 조합은 상이한 세포 집단 [살아있는 효과기 세포 (피코에리트린 양성), 포식된 (phagocytosed) IGROV1 종양 세포 (피코에리트린 및 CFSE 양성), 살아있는 종양 세포 (CFSE 양성), 죽은 종양 세포 (CFSE 및 요오드화프로피듐 양성), 죽은 효과기 세포 (피코에리트린 및 요오드화프로피듐 양성)]의 게이팅 (gating)을 허용하였다. 이들 게이트를 사용하여 FcεRI-매개된 세포독성 (식 1) 및 CD23-매개된 포식작용 (식 2)에 의해 치사된 표적 세포의 백분율을 계산하였다.
<식 1>
％ 세포독성 = {[(R1SL 대조군 - R1) + R3]/R1SL} x 100
여기서,
R1 = CFSE 양성 종양 세포의 총 수
R3 = 치사되지만 무손상 상태의 종양 세포의 수 (단편화 또는 포식작용 없음).
R1SL 대조군 = 항체가 없는, 효과기 및 표적 세포의 3개의 대조 샘플의 평균 R1 (R1 자연적 손실 대조군).
<식 2>
％ 포식작용 = (R2/R1SL 대조군) x 100
여기서,
R2 = 효과기 세포에 의해 포식된 종양 세포의 수
R1SL 대조군 = 항체가 없는, 효과기 및 표적 세포의 3개의 대조 샘플의 평균 R1 (R1 자연적 손실 대조군).
참고문헌
상기 인용된 것을 포함하여 본 명세서에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 본원에 참고로 및 모든 목적을 위해 포함된다.
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SEQUENCE LISTING <110> AstraZeneca AB and Medimmune Ltd <120> BINDING MEMBERS FOR IgE MOLECULES Cochrane, Duncan Ericsson, Per-Olf Von Wachenfeldt, Karin Cohen, Suzanne Dobson, Claire Monk, Phillip <130> 102642-1 <140> US 60/901304 <141> 2007-02-15 <160> 392 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 1 <400> 1 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaaac ctggggccac agtgaaactc 60 tcctgcaagg tttatggata cattttcacc gactacaaca tttactgggt gcgccaggcc 120 cctggaaaag ggcttgagtg gatgggactt attgatcctg acaatggtga gacattttac 180 gcagagaagt tccagggcag agccaccatg accgcggaca cgtcttcaga cagagcctac 240 atggaattga ccagcctgac ctttgaggac acggccactt attattgtgc aacagtctta 300 catcggagac ttaagggggg ctatgactac tggggccggg gcaccctggt caccgtctcg 360 agt 363 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 1 <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15 Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Val Tyr Gly Tyr Ile Phe Thr Asp 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actcctcatc tatgataatt tcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cattgggctc 240 cagactgaag atgaggctga ttattattgc cagtcctatg acagccgggg cggccactcc 300 ccgttcggaa ccgggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336 <210> 37 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 4 <400> 37 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ile Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Arg 85 90 95 Gly Gly His Ser Pro Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 38 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 4 <400> 38 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> 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tcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cattgggctc 240 cagactgaag atgaggctga ttattattgc cagtcctatg acagcaccaa gcacacctcc 300 cccttcggaa ccgggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336 <210> 47 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 5 <400> 47 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ile Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Thr 85 90 95 Lys His Thr Ser Pro Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 5 <400> 48 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 5 10 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> 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ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cattgggctc 240 cagactgaag atgaggctga ttattattgc cagtcctatg acagcaccat gaggcacggg 300 ccgttcggaa ccgggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336 <210> 57 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 6 <400> 57 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ile Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Thr 85 90 95 Met Arg His Gly Pro Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 58 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 6 <400> 58 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 5 10 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 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tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cattgggctc 240 cagactgaag atgaggctga ttattattgc cagtcctatg acagccccac ccacacctcc 300 cccttcggaa ccgggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336 <210> 77 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 8 <400> 77 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ile Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Pro 85 90 95 Thr His Thr Ser Pro Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 78 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 8 <400> 78 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 5 10 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 8 <400> 79 Asp Asn Phe 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caagtctggc acctcagcct ccctggccat cattgggctc 240 cagactgaag atgaggctga ttattattgc cagtcctatg acagcccctc ctccacctcc 300 cccttcggaa ccgggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336 <210> 87 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 9 <400> 87 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ile Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Pro 85 90 95 Ser Ser Thr Ser Pro Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 88 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 9 <400> 88 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 5 10 <210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 9 <400> 89 Asp Asn Phe Asn Arg Pro 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caagtctggc acctcagcct ccctggccat cattgggctc 240 cagactgaag atgaggctga ttattattgc cagtcctatg acagccccac cctcacctcc 300 cccttcggaa ccgggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336 <210> 107 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 11 <400> 107 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ile Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Pro 85 90 95 Thr Leu Thr Ser Pro Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 108 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 11 <400> 108 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 5 10 <210> 109 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 11 <400> 109 Asp Asn Phe Asn 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ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cattgggctc 240 cagactgaag atgaggctga ttattattgc cagtcctatg acagccacca ccgccactcc 300 cccttcggaa ccgggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336 <210> 137 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 14 <400> 137 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ile Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser His 85 90 95 His Arg His Ser Pro Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 138 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 14 <400> 138 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 5 10 <210> 139 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 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tcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cattgggctc 240 cagactgaag atgaggctga ttattattgc cagtcctatg acagccacaa ggggtacggg 300 gggttcggaa ccgggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336 <210> 147 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 15 <400> 147 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ile Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser His 85 90 95 Lys Gly Tyr Gly Gly Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 148 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 15 <400> 148 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 5 10 <210> 149 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens 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tatgataatt tcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cattgggctc 240 cagactgaag atgaggctga ttattattgc cagtcctatg acagccgcca ccaccacgcg 300 ccgttcggaa ccgggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336 <210> 157 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 16 <400> 157 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ile Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Arg 85 90 95 His His His Ala Pro Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 158 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 16 <400> 158 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 5 10 <210> 159 <211> 7 <212> PRT <213> 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cagcccccaa actcctcatc tatgataatt tcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cattgggctc 240 cagactgaag atgaggctga ttattattgc cagtcctatg acagccagag ctccacctcc 300 cccttcggaa ccgggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336 <210> 167 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 17 <400> 167 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ile Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gln 85 90 95 Ser Ser Thr Ser Pro Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 168 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 17 <400> 168 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 5 10 <210> 169 <211> 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gtatcagcaa 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatgataatt tcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cattgggctc 240 cagactgaag atgaggctga ttattattgc cagtcctatg acagcacgtt gtcccactcc 300 cccttcggaa ccgggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336 <210> 187 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 19 <400> 187 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ile Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Thr 85 90 95 Leu Ser His Ser Pro Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 188 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 19 <400> 188 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp 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atgtacactg gtatcagcaa 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatgataatt tcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cattgggctc 240 cagactgaag atgaggctga ttattattgc cagtcctatg acagctccac gtcctcctcc 300 cccttcggaa ccgggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336 <210> 197 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 20 <400> 197 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ile Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Thr Ser Ser Ser Pro Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 198 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 20 <400> 198 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 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caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtatcagcaa 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatgataatt tcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cattgggctc 240 cagactgaag atgaggctga ttattattgc cagtcctatg acagcagcgg ggggtacgcg 300 ccgttcggaa ccgggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336 <210> 217 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 22 <400> 217 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ile Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Gly Gly Tyr Ala Pro Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 218 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 22 <400> 218 Thr Gly Ser Ser 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cgtctacaga cagagcctac 240 atggaattga gcagcctgag atttgaggac acggccgtgt attattgtgc aacagtgatg 300 gggaagtgga tcaagggggg ctatgactac tggggccggg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 306 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 11 VH PGL <400> 306 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Tyr Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Ile Tyr Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asp Pro Asp Asn Gly Glu Thr Phe Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Arg Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Val Met Gly Lys Trp Ile Lys Gly Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 307 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 11 VH PGL <400> 307 Asp Tyr Asn Ile Tyr 5 <210> 308 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 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sapiens <220> <223> Antibody 25 VL/DNA <400> 365 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtatcagcaa 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatgataatt tcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cattgggctc 240 cagactgaag atgaggctga ttattattgc cagtcctatg acagcaacca caagacctcc 300 cccttcggaa ccgggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 366 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 25 VL/amino acid <400> 366 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ile Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Asn 85 90 95 His Lys Thr Ser Pro Phe 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cgcaccatcc 180 aaggaaaccg tcaatcttac atggagcaga gcatcaggta agcctgttcc tcacatacct 240 gcaactgaaa aaaaacagca gaggaacggt actctcacgg tgactagtat ccttccggtg 300 gtcacccagg attggattga gggagagact taccagtgcc gggtcacaca ccctcacctg 360 ccgcgagcac tggtgcgctc catgacaaag acgtccgggc cacgcgcggc tcccgaggtg 420 tacgtttttg ccacccccga gaaactcgag agccgcgaca agcggacact tgcctgcctg 480 atcgagaact ttatgcctga agatatctct gttcagtggc tgcacagtga tgtgcaactt 540 cccgatgcac gccacagtgt tacccagccc aggaagacca aaggtagtgg cttcttcgtg 600 ttttcccgcc tcgaggtgac caaggcagaa tgggagcaaa aggatgaatt tatctgcaga 660 gcggtgcatg aagccgcgtc cccttcctgg atcgtacagc aggccgtcag tgtgaatcct 720 gggaaggact ataaggatga tgacgacaag gccgcacacc accatcacca tcatcatcac 780 catcactag 789 <210> 382 <211> 262 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <223> Cynomolgus Ce3-4 FLAG His10 protein <400> 382 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Ala Asp Pro Cys Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala 20 25 30 Tyr Leu 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gcagacaaag aggtcaacaa aacctttggc 720 gtctgctcca ggaacttcac cccacctacc gtgaagatct tacagtcatc ctgcgatgac 780 gacgggcact ttcccccgac catccagctc ctgtgcctca tctccgggta caccccaggg 840 gccatcaatg tcacctggct ggagaacggg caggtcatga aagtgaactc gcccacccct 900 cctgccacgc aggagggtga gctggcctcc acacaaagtg agttcaccct cgcccagaag 960 cactggctgt cggaccgcac ttacacctgc caggtcacct atcaaggtac cacctataac 1020 gacagcacca agaagtgtgc agattccaac ccgagagggg tgagtgccta cctaagccgg 1080 cccagcccgt ttgacctgtt catcagcaag tcgcccacga tcacctgtct ggtggtggac 1140 ctggcaccca gcaaggagac cgtgaacctg acctggtccc gggccagtgg gaagcctgtg 1200 ccccacatcc ccgcaacgga gaagaagcag cagcgcaatg gcacgttaac cgttacgtcc 1260 atcctgccgg tggtcaccca agactggatc gagggggaga cctaccagtg cagggtgacc 1320 cacccccacc tccccagggc cctcgtgcgg tccatgacca agaccagcgg cccgcgtgct 1380 gccccggaag tctatgtgtt tgcaacgcca gagaagctag agagccggga caagcgcacc 1440 ctcgcctgcc tgatccagaa cttcatgcct gaggacatat cggtgcagtg gctgcacagc 1500 gacgtgcagc tcccggacgc ccggcacagc gtgacgcagc 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Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile 355 360 365 Ser Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser 370 375 380 Lys Glu Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val 385 390 395 400 Pro His Ile Pro Ala Thr Glu Lys Lys Gln Gln Arg Asn Gly Thr Leu 405 410 415 Thr Val Thr Ser Ile Leu Pro Val Val Thr Gln Asp Trp Ile Glu Gly 420 425 430 Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu 435 440 445 Val Arg Ser Met Thr Lys Thr Ser Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val 450 455 460 Tyr Val Phe Ala Thr Pro Glu Lys Leu Glu Ser Arg Asp Lys Arg Thr 465 470 475 480 Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln 485 490 495 Trp Leu His Ser Asp Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Val Thr 500 505 510 Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu 515 520 525 Glu Val Thr Lys Ala Glu Trp Glu Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg 530 535 540 Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Trp Ile Val Gln Gln Ala Val 545 550 555 560 Ser Val Asn Pro Gly Lys 565 <210> 385 <211> 1701 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <220> <223> D12_VH cyIgHE ME nucleotide <400> 385 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggcgc gcactccgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggagtcac ctttagcagc catgccatga cctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggaatgggt ctcaggtatc agtggtagtg gtggtgacac ataccacgca 240 gactccgtga agggccggtt caccatctcc agggacaatt ccaagaacac ggtgtatctg 300 caaatgaaca gcctgcgagc cgaggacacg gccatatatt actgtgcgat tttaggagta 360 ctaaatggtt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc agcctccata 420 cagagcccct tcgtcttccc cttgatcccc tgctgcaaac acattgcctc caatgccacc 480 tccgtgaccc tgggctgcct ggccacgggc tacttcccgg agccggtgat ggtgacctgg 540 gacgcaggct ccctcaacag aagcactatg accttaccag ccaccacctt cacgccctcc 600 ggtcactatg ccaccatcag cttgctgacc gtctcgggtg cgtgggccaa ggagatgttc 660 acctgccatg tggtgcacac tccatcgtcc gcagacaaag aggtcaacaa aacctttggc 720 gtctgctcca ggaacttcac cccacctacc gtgaagatct tacagtcatc ctgcgatgac 780 gacgggcact ttcccccgac catccagctc ctgtgcctca tctccgggta caccccaggg 840 gccatcaatg tcacctggct ggagaacggg caggtcatga aagtgaactc gcccacccct 900 cctgccacgc aggagggtga gctggcctcc acacaaagtg agttcaccct cgcccagaag 960 cactggctgt cggaccgcac ttacacctgc caggtcacct atcaaggtac cacctataac 1020 gacagcacca agaagtgtgc agattccaac ccgagagggg tgagtgccta cctaagccgg 1080 cccagcccgt ttgacctgtt catcagcaag tcgcccacga tcacctgtct ggtggtggac 1140 ctggcaccca gcaaggagac cgtgaacctg acctggtccc gggccagtgg gaagcctgtg 1200 ccccacatcc ccgcaacgga gaagaagcag cagcgcaatg gcacgttaac cgttacgtcc 1260 atcctgccgg tggtcaccca agactggatc gagggggaga cctaccagtg cagggtgacc 1320 cacccccacc tccccagggc cctcgtgcgg tccatgacca agaccagcgg cccgcgtgct 1380 gccccggaag tctatgtgtt tgcaacgcca gagaagctag agagccggga caagcgcacc 1440 ctcgcctgcc tgatcgagaa cttcatgcct gaggacatat cggtgcagtg gctgcacagc 1500 gacgtgcagc tcccggacgc ccggcacagc gtgacgcagc cccgcaagac caagggctcc 1560 ggcttcttcg tcttcagccg cctggaggtg accaaggccg aatgggagca gaaagacgag 1620 ttcatctgcc gtgcagtcca tgaggcagcg agcccctcat ggatcgtcca gcaagcggtg 1680 tctgtaaatc ccggtaaatg a 1701 <210> 386 <211> 566 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <223> D12_VH cyIgHE ME protein <400> 386 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Phe 35 40 45 Ser Ser His Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asp Thr Tyr His Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Ile Leu Gly Val Leu Asn Gly Phe Asp Ile Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ile Gln Ser Pro Phe 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ile Pro Cys Cys Lys His Ile Ala Ser Asn Ala Thr 145 150 155 160 Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Ala Thr Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Met Val Thr Trp Asp Ala Gly Ser Leu Asn Arg Ser Thr Met Thr Leu 180 185 190 Pro Ala Thr Thr Phe Thr Pro Ser Gly His Tyr Ala Thr Ile Ser Leu 195 200 205 Leu Thr Val Ser Gly Ala Trp Ala Lys Glu Met Phe Thr Cys His Val 210 215 220 Val His Thr Pro Ser Ser Ala Asp Lys Glu Val Asn Lys Thr Phe Gly 225 230 235 240 Val Cys Ser Arg Asn Phe Thr Pro Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser 245 250 255 Ser Cys Asp Asp Asp Gly His Phe Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys 260 265 270 Leu Ile Ser Gly Tyr Thr Pro Gly Ala Ile Asn Val Thr Trp Leu Glu 275 280 285 Asn Gly Gln Val Met Lys Val Asn Ser Pro Thr Pro Pro Ala Thr Gln 290 295 300 Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln Ser Glu Phe Thr Leu Ala Gln Lys 305 310 315 320 His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly 325 330 335 Thr Thr Tyr Asn Asp Ser Thr Lys Lys Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg 340 345 350 Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile 355 360 365 Ser Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser 370 375 380 Lys Glu Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val 385 390 395 400 Pro His Ile Pro Ala Thr Glu Lys Lys Gln Gln Arg Asn Gly Thr Leu 405 410 415 Thr Val Thr Ser Ile Leu Pro Val Val Thr Gln Asp Trp Ile Glu Gly 420 425 430 Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu 435 440 445 Val Arg Ser Met Thr Lys Thr Ser Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val 450 455 460 Tyr Val Phe Ala Thr Pro Glu Lys Leu Glu Ser Arg Asp Lys Arg Thr 465 470 475 480 Leu Ala Cys Leu Ile Glu Asn Phe Met Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln 485 490 495 Trp Leu His Ser Asp Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Val Thr 500 505 510 Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu 515 520 525 Glu Val Thr Lys Ala Glu Trp Glu Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg 530 535 540 Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Trp Ile Val Gln Gln Ala Val 545 550 555 560 Ser Val Asn Pro Gly Lys 565 <210> 387 <211> 708 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <220> <223> D12_VL cyIgLC 4 nucleotide <400> 387 atgggttgga gttgtataat tctctttctg gtggctaccg ctaccggtgt gcactcccag 60 tcagctctga cgcaaccagc ttccgtttca gggagcccag ggcagagtat aaccatcagt 120 tgcactggca ctagctccga cgttggcgga tacaagtacg tatcttggta tcaacagcac 180 cccggaaaag ctcctaagct gatgattttc gaggtttcca acagacccag cggtgtacct 240 aatcggttct ctggctctaa atccgggaac actgcctcac tcaccatcag cggactgcag 300 gtggaagacg aggcggacta ttattgcagc tctctcacca gacgcgttac cgtcattttt 360 ggcggaggca ctaagctgac cgttctcggc caacctaaag ccgccccatc tgtgaccctt 420 tttcctccca gcagcgagga actgcaggcc aataaggcca ctctcgtgtg cctcatgtca 480 gacttttacc cagggatcct gaccgtgacc tggaaggccg acggaacccc catcacacag 540 ggcgtggaaa tgaccacgcc aagtaagcag tctaacaaca aatacgccgc atctagctac 600 ttgagcctga ccccagagca gtggcggagt cacaatagct acagctgcca agtgatgcac 660 gagggatcaa tcgtggagaa gactgttgct ccagccgagt gctcctaa 708 <210> 388 <211> 235 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <223> D12_VL cyIgLC 4 protein <400> 388 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser 20 25 30 Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val 35 40 45 Gly Gly Tyr Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Met Ile Phe Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Gly Leu Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Leu 100 105 110 Thr Arg Arg Val Thr Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 115 120 125 Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser 130 135 140 Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Met Ser 145 150 155 160 Asp Phe Tyr Pro Gly Ile Leu Thr Val Thr Trp Lys Ala Asp Gly Thr 165 170 175 Pro Ile Thr Gln Gly Val Glu Met Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn 180 185 190 Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp 195 200 205 Arg Ser His Asn Ser Tyr Ser Cys Gln Val Met His Glu Gly Ser Ile 210 215 220 Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 389 <211> 708 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <220> <223> D12_VL cyIgLC 7 nucleotide <400> 389 atgggttgga gttgtataat tctctttctg gtggctaccg ctaccggtgt gcactcccag 60 tcagctctga cgcaaccagc ttccgtttca gggagcccag ggcagagtat aaccatcagt 120 tgcactggca ctagctccga cgttggcgga tacaagtacg tatcttggta tcaacagcac 180 cccggaaaag ctcctaagct gatgattttc gaggtttcca acagacccag cggtgtacct 240 aatcggttct ctggctctaa atccgggaac actgcctcac tcaccatcag cggactgcag 300 gtggaagacg aggcggacta ttattgcagc tctctcacca gacgcgttac cgtcattttt 360 ggcgggggga ctaagctgac cgttctcggc caacctaaag ccgccccctc tgtgaccctt 420 tttcccccta gcagcgagga actgcaggcc aataaggcca ctctcgtgtg cctcatctca 480 gacttttacc caggggccgt ggaggtggcc tggaaggccg acggaagcgc cgtcaacgcg 540 ggcgtggaaa cgaccaagcc aagtaagcag tctaacaaca aatacgccgc atctagctac 600 ttgagcctga cctcagacca gtggaagagt cacaagagct acagctgcca agtgacacac 660 gagggatcaa ccgtggagaa gactgttgct ccaaccgagt gctcctaa 708 <210> 390 <211> 235 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <223> D12_VL cyIgLC 7 protein <400> 390 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser 20 25 30 Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val 35 40 45 Gly Gly Tyr Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Met Ile Phe Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Gly Leu Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Leu 100 105 110 Thr Arg Arg Val Thr Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 115 120 125 Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser 130 135 140 Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser 145 150 155 160 Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Glu Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser 165 170 175 Ala Val Asn Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn 180 185 190 Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Ser Asp Gln Trp 195 200 205 Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr 210 215 220 Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 391 <211> 1555 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> FceRI_Fc (NSO) nucleotide <400> 391 gaattcagca cagtaagcac caggagtcca tgaagaagat ggctcctgcc atggaatccc 60 ctactctact gtgtgtagcc ttactgttct tcgctccaga tggcgtgtta gcagtccctc 120 agaaacctaa ggtctccttg aaccctccat ggaatagaat atttaaagga gagaatgtga 180 ctcttacatg taatgggaac aatttctttg aagtcagttc caccaaatgg ttccacaatg 240 gcagcctttc agaagagaca aattcaagtt tgaatattgt gaatgccaaa tttgaagaca 300 gtggagaata caaatgtcag caccaacaag ttaatgagag tgaacctgtg tacctggaag 360 tcttcagtga ctggctgctc cttcaggcct ctgctgaggt ggtgatggag ggccagcccc 420 tcttcctcag gtgccatggt tggaggaact gggatgtgta caaggtgatc tattataagg 480 atggtgaagc tctcaagtac tggtatgaga accacaacat ctccattaca aatgccacag 540 ttgaagacag tggaacctac tactgtacgg gcaaagtgtg gcagctggac tatgagtctg 600 agcccctcaa cattactgta ataaaagctc ctcgagagaa gtactggcta gacaaaactc 660 acacatgccc accgtgccca ggtaagccag cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg 720 acaggtgccc tagggtagcc tgcatccagg gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc 780 acctccatct cttcctcagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 840 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 900 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 960 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1020 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1080 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg tgggacccgt 1140 ggggtgcgag ggccacatgg acagaggccg gctcggccca ccctctgccc tgagagtgac 1200 cgctgtacca acctctgtcc ctacagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc 1260 cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt 1320 ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa 1380 gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt 1440 ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct 1500 gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cttaagtccg ggaaaataat ctaga 1555 <210> 392 <211> 431 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> FceRI_Fc (NSO) protein <400> 392 Met Ala Pro Ala Met Glu Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu 1 5 10 15 Phe Phe Ala Pro Asp Gly Val Leu Ala Val Pro Gln Lys Pro Lys Val 20 25 30 Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr 35 40 45 Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp 50 55 60 Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile 65 70 75 80 Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln 85 90 95 Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp 100 105 110 Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gln Pro Leu 115 120 125 Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile 130 135 140 Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn 145 150 155 160 Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys 165 170 175 Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile 180 185 190 Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Asp Lys Thr His 195 200 205 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 210 215 220 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 225 230 235 240 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 245 250 255 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 260 265 270 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 275 280 285 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 290 295 300 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 305 310 315 320 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 325 330 335 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 340 345 350 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 355 360 365 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 370 375 380 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 385 390 395 400 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 405 410 415 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 420 425 430

Claims (25)

  1. RBL-ER51 세포에서 25 ng/ml IgE에 의해 유도되는 칼슘 신호전달의 억제에 대한 IC50 기하평균이 1 nM 미만인, 면역글로불린 E에 특이적인 단리된 결합 멤버.
  2. 제1항에 있어서, 칼슘 신호전달의 억제에 대한 IC50 기하평균이 0.1 nM 미만인 단리된 결합 멤버.
  3. 혈청 내의 면역글로불린 E로의 결합에 대한 IC50이 졸레어™ (Xolair™)보다 적어도 10배 더 낮은, 면역글로불린 E에 특이적인 단리된 결합 멤버.
  4. 제3항에 있어서, IC50이 졸레어™보다 적어도 50배 더 낮은 단리된 결합 멤버.
  5. HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 CDR의 세트를 포함하며,
    여기서 상기 CDR의 세트는 참조 CDR의 세트로부터 10개 이하의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고,
    HCDR1은 서열 103의 아미노산 서열을 갖고,
    HCDR2는 서열 104의 아미노산 서열을 갖고,
    HCDR3은 서열 105의 아미노산 서열을 갖고,
    LCDR1은 서열 108의 아미노산 서열을 갖고,
    LCDR2는 서열 109의 아미노산 서열을 갖고,
    LCDR3은 서열 110의 아미노산 서열을 갖는 것인,
    인간 면역글로불린 E에 특이적인 단리된 결합 멤버.
  6. 제5항에 있어서, 아미노산 치환이 6개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 것인, 인간 면역글로불린 E에 특이적인 단리된 결합 멤버.
  7. HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 CDR의 세트를 포함하며, 여기서 HCDR3은 서열 105의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 결합 멤버.
  8. 제5항에 있어서, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 CDR의 세트를 포함하며, 여기서
    HCDR1은 서열 103의 아미노산 서열을 갖고,
    HCDR2는 서열 104의 아미노산 서열을 갖고,
    HCDR3은 서열 105의 아미노산 서열을 갖고,
    LCDR1은 서열 108의 아미노산 서열을 갖고,
    LCDR2는 서열 109의 아미노산 서열을 갖고,
    LCDR3은 서열 110의 아미노산 서열을 갖는 것인
    단리된 결합 멤버.
  9. S, M 또는 T로 대체된 카바트 잔기 96;
    L 또는 G로 대체된 카바트 잔기 97;
    K로 대체된 카바트 잔기 98;
    S, W, A, T 또는 E로 대체된 카바트 잔기 99;
    A 또는 I로 대체된 카바트 잔기 100
    중 하나 이상의 치환이 존재하는 항체 1 HCDR3 (서열 5)을 포함하는 단리된 결합 멤버 또는 VH 도메인.
  10. T, R, D, P, E, N, H, Q 또는 A로 대체된 카바트 잔기 94;
    T, K, S, I, G, H, M, F, R, N, K 또는 Q로 대체된 카바트 잔기 95;
    L, H, D, G, R, N, Q, K 또는 E로 대체된 카바트 잔기 95A;
    T, H, S, Y, L 또는 N으로 대체된 카바트 잔기 95B;
    G 또는 A로 대체된 카바트 잔기 96;
    P, S 또는 G로 대체된 카바트 잔기 97
    중 하나 이상의 치환이 존재하는 항체 1 LCDR3 (서열 10)을 포함하는 단리된 결합 멤버 또는 VH 도메인.
  11. 제1 IgE 중쇄로부터의 성분 및 제2 IgE 중쇄로부터의 성분을 포함하는 에피 토프에 결합하는, 면역글로불린 E에 특이적인 단리된 결합 멤버.
  12. 제1 IgE 중쇄 내의 잔기 Glu390 내지 Asn394 및 제2 IgE 중쇄 내의 Leu340, Arg342, Ala428 내지 Thr434, Thr436, Ser437 및 Glu472를 포함하는 면역글로불린 E 내의 에피토프에 결합하는, 면역글로불린 E에 특이적인 단리된 결합 멤버.
  13. 제12항에 있어서, 에피토프가 제1 IgE 중쇄 내의 당 모이어티 GlcNAc1 및 Man6 및 제2 IgE 중쇄 내의 당 모이어티 Man 5를 추가로 포함하는 것인, 면역글로불린 E에 특이적인 단리된 결합 멤버.
  14. 제1 IgE 중쇄 내의 잔기 Glu390, Gln392 내지 Asn394 및 제2 IgE 중쇄 내의 Leu340, Arg342, Ala428 내지 Thr434, Thr436, Ser437 및 Glu472를 포함하는 면역글로불린 E 내의 에피토프에 결합하는, 면역글로불린 E에 특이적인 단리된 결합 멤버.
  15. 제14항에 있어서, 에피토프가 제1 IgE 중쇄 내의 당 모이어티 GlcNAc1 및 Man6을 추가로 포함하는 것인, 면역글로불린 E에 특이적인 단리된 결합 멤버.
  16. 제1항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 멤버가 모노클로날 항체인 결합 멤버.
  17. 제1항 내지 16항 중 어느 한 항에 따른 단리된 결합 멤버를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  18. 제17항에 따른 핵산 분자로 형질전환된 숙주 세포.
  19. 제18항에 따른 숙주 세포를 결합 멤버의 생산을 위한 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 제1항 내지 17항 중 어느 한 항에 따른 단리된 결합 멤버를 생산하는 방법.
  20. 제1항 내지 16항 중 어느 한 항에 따른 결합 멤버 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 제1항 내지 16항 중 어느 한 항에 따른 단리된 결합 멤버, 20 mM 숙시네이트, 105 mM NaCl, 10 mM 아르기닌 (pH 6.00)을 포함하는 제약 조성물.
  22. 제20항 또는 21항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 조성물.
  23. IgE와 연관된 질환을 치료하기 위한, 제22항에 따른 조성물의 용도.
  24. 질환이 알레르기, 천식 또는 기관지염 중 하나 이상인, 제20항 또는 21항에 따른 조성물의 용도.
  25. 질환이 알레르기성 비염, 알레르기성 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 초과민 반응, 음식 알레르기, 두드러기, 염증성 장 질병, 호산구 위장관염, 약물 유발성 발진, 알레르기성 안질환, 알레르기성 결막염, 기관지 천식, 기도 과민반응, 화장품 알레르기, 약물 유발 알레르기, 약물 유발 과민성 증후군, 금속 알레르기, 직업성 과민성 폐렴, 만성 과민성 폐렴, 냉과민증, 기생충 감염 유발 과민증, 라텍스 알레르기 및 고초열 중 하나 이상인, 제20항 또는 21항에 따른 조성물의 용도.
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