JP7041272B2 - プロバイオティクスおよびＩｇＥへの結合親和性を有するポリペプチドを含む組成物およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、アレルギー性疾患を治療または予防するための組成物に関する。

食物アレルギーは、非病原性食物抗原(アレルゲン）に対する免疫抵抗の低下によって引き起こされる病気である。この疾患は、食事制限により生活の質を低下させる可能性があり、急性および慢性のアナフィラキシーが発症した場合には生命を脅かす可能性がある。アレルギー性鼻炎やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患とそのような食物アレルギーは、工業化および西洋化された現代社会で高率で広がっている。さらに、重度のアレルギー反応であるアナフィラキシーの発症も増加している。これらの免疫疾患は生活の質を著しく損ない、それに応じて社会経済的コストが急増している。したがって、そのような病気を克服するための対策が切実に必要とされている。

食物アレルギー性疾患は、IgE媒介または非IgE媒介の免疫応答を介して発症する可能性があるが、IgE媒介食物アレルギーが最も一般的である。IgEを介した食物アレルギーでは、アレルゲンはIgEに結合し、アレルゲンが結合したIgEは、肥満細胞や好塩基球などのエフェクター細胞上の高親和性IgE Fc受容体をクロスリンクし、それによってエフェクター細胞の活性化を誘導する。エフェクター細胞が活性化された場合、モジュレーターが放出され、それにより即時過敏症を引き起こす。食物アレルギー性疾患に加えて、ほとんどのアレルギー性疾患は免疫グロブリンE(IgE）による過度の免疫応答によって引き起こされる。IgEは、通常非常に低い濃度で血清中に存在する抗体である。IgEは、無害な抗原によっても生成される。特に刺激を与えずにIgEの数を増加させる場合、アレルギー疾患を引き起こす可能性がある。IgEの異常に増加した数は、肥満細胞、好塩基球などの表面に発現する高親和性IgE Fc受容体(FcγRI）に結合する可能性がある。

IgEとIgE Fc受容体の間のこのような結合により、肥満細胞または好塩基球が、ヒスタミン、ロイコトリエン、プロスタグランジン、ブラジキニン、および血小板活性化因子などの化学伝達物質を放出する。肥満細胞または好塩基球によるこれらの化学伝達物質の放出は、アレルギー症状を引き起こす。特に、IgEとFcεRIが互いに結合している場合、アレルギー症状の悪化が見られる場合がある。FcεRI発現細胞は、アレルギー患者において増加することが知られている。

アレルギー疾患を治療するために、アレルゲンの回避、抗アレルギー薬の投与、身体におけるIgE合成の調節、および抗IgE抗体の開発など、さまざまな方法が提案されている。しかしながら、そのような方法には、アレルギーの根本原因を治療できない、薬効が不十分である、および深刻な副作用が発生するなど、多くの欠点がある。

一方、アレルギー性疾患の治療や改善を目的として、乳酸菌などの微生物を利用する方法が検討されている。そのような健康に良い微生物はプロバイオティクスと称される。しかしながら、アレルギー阻害などの免疫制御のためのプロバイオティクスを発見および評価する手法はまだ確立されていない。特に、プロバイオティクスの根本的な作用機序に関する研究は不十分であり、ほとんどの研究はインビトロで行われている。言い換えれば、プロバイオティクスは経口摂取されるが、これまでの研究のほとんどは細胞株を用いたインビトロ実験に焦点を当てており、これらの実験方法は、ヒトがプロバイオティクスを摂取した場合に示される可能性がある機能に関する研究の代替を提供できないという大きな欠点を有する。

さらに、免疫グロブリン組成物は、アレルギー性疾患を治療するために研究されてきている。そのような組成物は、アレルギーおよび喘息などのIgE媒介障害の治療に有用であると報告されている(KR10-1783272B1）。特に、IgE抗体のFc部分を標的とするオマリズマブ(商品名：Xolair）は、難治性の重症喘息および難治性蕁麻疹の治療薬として開発および使用されている。しかしながら、効果を維持するためにはオマリズマブの大量投与が必要である。このように、オマリズマブはコスト負担が高く、血管浮腫やアナフィラキシー反応などの副作用があることが報告されている(The Journal of Clinical Investigation、Volume 99、Number 5、March 1997、915-925)。

オマリズマブが副作用を引き起こす根本的なメカニズムはまだ特定されていないが、オマリズマブがIgG1抗体であることを期待することができる。マウスモデルを対象とする研究では、多数の抗原特異的IgG1抗体が、抗原に富む環境でのFcγRIII、低親和性IgG受容体、および血小板活性化因子を介して受動全身性アナフィラキシー(PSA）を誘発することができることが示された。さらに、このようなIgGを介したアナフィラキシーは、FcεRIシグナル伝達の欠如により、著しく起こる。そのため、アレルギー性疾患で高IgEを示す患者にオマリズマブを大量に注射する場合、受動全身性アナフィラキシーが引き起こされる可能性がある。最近、ヒトで発現される低親和性IgG受容体であるFcγRIIAもIgG媒介アナフィラキシーと関連していると報告されている。さらに、市販後の研究では、アレルギー性肉芽腫性血管炎や特発性重症血小板減少症などの異常反応が報告されている。

アレルギー性疾患について多くの研究が行われてきたが、アレルギー性疾患を劇的に改善する方法はこれまで開発されていない。本発明の目的は、そのようなアレルギー性疾患を治療または予防するための組成物を提供することである。

本発明の1つの態様によれば、有効成分として、プロバイオティクスおよびIgEへの結合能を有するポリペプチドを含む組成物が提供される。

1つの態様では、有効成分として該組成物を含む、アレルギー性疾患を治療または予防するための医薬組成物が提供される。さらにもう1つの態様では、有効成分として該組成物を含む、アレルギー症状を改善または緩和するための健康機能性食品組成物が提供される。

さらになおもう1つの態様では、プロバイオティクスを含む第一の組成物およびIgEへの結合能を有するポリペプチドを含む第二の組成物を含む、アレルギー性疾患を治療または予防するためのキットが提供される。

発明の有利な効果
本発明によれば、有効成分としてプロバイオティクスおよびIgEへの結合能を有するポリペプチドを含む組成物は、インビボでアレルギーを改善する優れた効果を発揮する。したがって、該組成物は、重度のアレルギー性疾患を治療または予防するための医薬組成物として使用することができる。さらに、本発明の組成物が経口免疫療法に適用できるという観点から、該組成物は、食物アレルギーに対してより効果的であり、副作用を減少させるだけでなく、IgE媒介性アレルギーに苦しむ子供を治療するためにも理想的である。したがって、該組成物は、アレルギー症状を改善または緩和するための健康機能性食品として使用することができる。

本発明のポリペプチド二量体の1つの実施態様(IgE_TRAP)を形成する単量体の構成の概略図を示す。IgE_TRAPの実施態様は、ヒトFcεRIα(FcεRIα細胞外ドメインの26番目のアミノ酸から205番目のアミノ酸の領域、180 aa）からヒトIgD/IgG4ハイブリッドFc(245アミノ酸）までの425個のアミノ酸で構成することができる。IgD/IgG4ハイブリッドFcには、FcRn結合部位(右の斜線）があるが、FcγRおよびC1q(左の斜線）の結合部位はない。ここで、IgDは、133番目のアミノ酸から170番目のアミノ酸の領域(38 aa）であり、IgG4は、121番目のアミノ酸から327番目のアミノ酸の領域(207 aa）である。 IgE_TRAPホモ二量体の3次元構造モデルを示す。この構造は、FcεRIα細胞外ドメイン(青）、IgDヒンジ(黄色）、およびIgG4 Fc(緑）を示す。 各細胞株において産生されたIgEへの結合能を有するポリペプチドについてのSDS-PAGE結果を示す(図3A)。ここでは、還元条件および非還元条件の両方でトランケート型が生成されないことがわかる(図3Aおよび3B）。 図4は、各細胞株で産生されたIgEへの結合能を有するポリペプチドのシアル酸含有量の増加を同定するために行われた等電点電気泳動(GEL-IEF）実験の結果を示す。シアル酸トランスフェラーゼ遺伝子の導入により負に帯電したシアル酸の含有量が増加するので、主要等電点(pI）が低下したタンパク質の含有量が増加する。このことから、シアル酸転移酵素の添加により酸性タンパク質の含有量が増加することがわかる。 本発明の実施態様によるポリペプチド二量体タンパク質(IgE_TRAP)の非還元型および還元型についてのSDS-PAGE結果を示す。特に、二量体は、「Input」に対応する培養上清中でも高純度であることがわかる。 非還元および還元条件下でIgE_TRAPのSDS-PAGE分析を行うことによって得られた結果を示す。 オマリズマブのIgEへの結合能を示すグラフである。グラフは、オマリズマブを固定化し、処置されたIgE濃度に応じてその結合能を分析したことによって得られた結果を示す。ヒトIgEとオマリズマブ間の相互作用を、表面プラズモン共鳴(SPR）を用いて分析し、各分子の結合親和性を計算した。 本発明の実施態様によるポリペプチド二量体タンパク質(IgE_TRAP)のIgEへの結合能を示すグラフを示す。グラフは、IgE_TRAPを固定化し、処置されたIgE濃度に応じてその結合能を分析した結果を示す。ヒトIgEとIgE_TRAPの間の相互作用を、表面プラズモン共鳴(SPR）を用いて分析し、各分子の結合親和性を計算した。 バイオレイヤー干渉法(BLI）アッセイを用いて、本発明の1つの実施態様である二量体タンパク質(IgE_TRAP）およびオマリズマブと、IgG受容体FcγRI(図9）、FcγRIIA(図10）、FcγRIIB(図11）、FcγRIIIA(図12）、およびFcγRIIIB(図13）との相互作用を同定することによって得られた結果を示す。 IgE_TRAPとIgG受容体の間、およびオマリズマブとIgG受容体の間の結合容量を定量することによって得られたグラフを示す。 本発明の実施態様によるポリペプチド二量体タンパク質(IgE_TRAP）の濃度に応じた、マウス由来肥満細胞の活性に対する阻害能力を示すグラフである。 本発明の実施態様によるポリペプチド二量体タンパク質(IgE_TRAP）およびゾレア(Xolair）(オマリズマブ）の濃度に応じた、ヒトFcεRI発現マウス由来肥満細胞の活性に対する阻害活性間の比較を示すグラフである。 食物アレルギー誘発性疾患モデルにおける、本発明の実施態様によるポリペプチド二量体タンパク質の効力を示す。 食物アレルギー誘発、ならびにIgE_TRAP、B.ロンガム、および併用療法のための実験スケジュールを示す。i.p.、腹腔内；i.g.、胃内。 アレルギー誘発性下痢症状を阻害するための、IgE_TRAP、B.ロンガム、および併用療法の効力を示す。n＝16～18マウス/グループ、OVA vs OVA＋IgE_TRAP：*P＜.05、OVA vs OVA＋B.ロンガム＋IgE_TRAP、およびOVA vs PBS：***P＜.0001 B.ロンガムが、IgE_TRAPの治療効果を改善することを同定するための実験計画を示す。具体的には、食物アレルギー誘発、ならびにIgE_TRAPとB.ロンガムの単剤投与または併用投与のための実験計画を示す。i.p.、腹腔内；i.g.、胃内。 食物アレルギー誘発性疾患モデルにおける、用量の増加に応じた、プロバイオティクスおよびIgEへの結合能を有するポリペプチド二量体タンパク質(IgE_TRAP）の併用投与の効果を同定することによって得られたグラフである。食物アレルギー性下痢を阻害するための、IgE_TRAP、B.ロンガム、およびそれらの組み合わせの効果が示される。n＝14マウス/グループ、OVA vs OVA＋B.ロンガム＋IgE_TRAP(20μg)、OVA vs OVA＋B.ロンガム＋IgE_TRAP(200μg)、およびOVA vs PBS：**P＜.001 食物アレルギー誘発性疾患モデルにおいて、IgE_TRAP、B.ロンガム、およびそれらの組み合わせの投与時における、各実験群から得られた血清中の肥満細胞プロテアーゼ1(MCPT-1）レベルを、ELISAを用いて分析することによって得られた結果を示す。 食物アレルギー誘発性疾患モデルにおいて、IgE_TRAP、B.ロンガム、およびそれらの組み合わせの投与時における、各実験グループから得られた血清中の総IgE(遊離IgEおよびIgE-IgE_TRAP複合体）レベルを、ELISAを用いて測定することによって得られた結果を示す。n＝16～18マウス/グループ、OVA vs OVA＋IgE_TRAP、OVA vs OVA＋B.ロンガム＋IgE_TRAP、およびOVA vs PBS：***P＜.0001 食物アレルギー誘発性疾患モデルにおいて、IgE_TRAP、B.ロンガム、およびそれらの組み合わせの投与時における、各実験グループから得られた血清中の遊離IgEレベルを、ELISAを用いて測定することによって得られた結果を示す。n＝16～18マウス/グループ、OVA vs OVA＋IgE_TRAP、OVA vs OVA＋B.ロンガム＋IgE_TRAP、およびOVA vs PBS：***P＜.0001 食物アレルギー誘発性疾患モデルにおいて、IgE_TRAP、B.ロンガム、およびそれらの組み合わせの投与時における、各実験群での肥満細胞増殖および杯細胞増殖に対する阻害効果を同定することによって得られた結果を示す。各実験グループで、空腸の代表的なパラフィン切片において肥満細胞を染色する(赤）ことによって得られた結果を示す(倍率400x）。空腸を拡大すると、肥満細胞(赤）がはっきりと示される。 図23において肥満細胞を400倍に拡大し、肥満細胞を同定することによって得られた結果を示す。n＝10～12マウス/グループ、OVA vs B.ロンガム、およびOVA vs IgE_TRAP：**P＜.001、OVA vs OVA＋B.ロンガム＋IgE_TRAP、およびOVA vs PBS：***P＜.0001 食物アレルギー誘発性疾患モデルにおいて、IgE_TRAP、B.ロンガム、およびそれらの組み合わせの投与時における、各実験群での肥満細胞増殖および杯細胞増殖に対する阻害効果を同定することによって得られた結果を示す。各実験グループで、空腸の代表的なパラフィン切片において杯細胞を染色することによって得られた結果を示す(紫、倍率400x）。 図25における絨毛クリプトユニット(VCU）から杯細胞をランダムに選択し、10個のVCUをカウントすることによって得られた結果を示す。n＝5～6マウス/グループ、OVA vs B.ロンガム、およびOVA vs IgE_TRAP：*P＜.05、OVA vs OVA＋B.ロンガム＋IgE_TRAP、およびOVA vs PBS：***P＜.0001 B.ロンガムおよびIgE_TRAPの併用療法によって引き起こされる、食物アレルギー阻害のメカニズムの概略図を示す。摂取された食物アレルゲンは、エフェクター細胞上の高親和性IgE Fc受容体(FcεRI）にIgEが結合することによって、エフェクター細胞(肥満細胞および好塩基球）の活性化を誘発する。活性化されたエフェクター細胞はモジュレーターを放出し、それによって即時型過敏反応が引き起こされる。B.ロンガムは、細胞外小胞(EV）の分泌を介して肥満細胞のアポトーシスを誘発し、肥満細胞の数を減少させる。一方、IgE_TRAPは、エフェクター細胞上のFcεRIへのIgEの結合をブロックし、エフェクター細胞の活性化と増殖を阻害することができる。B.ロンガムおよびIgE_TRAPの併用投与により、食物アレルギー症状と杯細胞過形成を効果的に緩和することが可能になる。 B.ロンガムおよびIgE_TRAPの投与後の腸組織におけるIL-33発現の変化を同定することによって得られたグラフを示す。B.ロンガムおよびIgE_TRAPの投与は、食物アレルギーモデルマウスの空腸におけるIL-33 mRNAの発現を減少させた。n＝16～18マウス/グループ、OVA vs OVA＋B.ロンガム＋IgE_TRAP：*P＜.05 IgE_TRAPおよびL.カゼイの腹腔内注射後の下痢の頻度を同定することによって得られたグラフを示す。n＝7～10マウス/グループ IgE_TRAPおよびLc.ラクチスの腹腔内注射後の下痢の頻度を同定することによって得られたグラフを示す。 IgE_TRAPおよびS.サーモフィルスの腹腔内注射後の下痢の頻度を同定することによって得られたグラフを示す。 IgE_TRAPおよびL.ラムノサスの腹腔内注射後の下痢の頻度を同定することによって得られたグラフを示す。 IgE_TRAPおよびL.ロイテリの腹腔内注射後の下痢の頻度を同定することによって得られたグラフを示す。 IgE_TRAPおよびL.ファーメンタムの腹腔内注射後の下痢の頻度を同定することによって得られたグラフを示す。 正常マウスにIgE_TRAPを経口投与し、次に、マウスの血清に吸着されたIgE_TRAPを同定することによって得られたグラフである。

発明の詳細な記載
本発明の1つの態様では、有効成分として、プロバイオティクスおよびIgEへの結合能を有するポリペプチドを含む組成物が提供される。

本明細書で使用される場合、「プロバイオティクス」という用語は、適量摂取した場合に人体に対して有利な微生物を総称し、人体に対して有益な細菌であることを示す。プロバイオティクスは、乳酸菌またはビフィドバクテリウムである。乳酸菌とは、糖を発酵させて乳酸を生成する細菌を総称する。大部分の腸内有益細菌は、乳酸菌として分類され、乳酸菌は、糖を分解することができ、糖の50%以上が乳酸として生産される。

乳酸菌は、ラクトバチルス、ラクトコッカス、エンテロコッカス、およびストレプトコッカスからなる群から選択されるいずれか1つでありうる。具体的には、ラクトバチルスは、L.アシドフィルス、L.カゼイ、L.ガセリ、L.デルブルエッキイー ssp. ブルガリクス、L.ヘルベティカス、L.ファーメンタム、L.パラカゼイ、L.プランタラム、L.ロイテリ、L.ラムノサス、L.ペントーサス、およびL.サリバリウスからなる群から選択されるいずれか1つでありうる。さらに、ラクトコッカスは、Lc.ラクチスであってもよく、およびストレプトコッカスは、S.サーモフィルスであってもよい。さらに、ビフィドバクテリウムは、B.ビフィダム、B.ブレベ、B.ロンガム、およびB.アニマリス ssp. ラクチスからなる群から選択されるいずれか1つでありうる。

好ましくは、プロバイオティクスは、ラクトバチルス・カゼイまたはビフィドバクテリウム・ロンガムであってもよい。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガムは受託番号KACC91563(KR10-1778734B1）でありうる。特に、KACC 91563株はアレルギー反応における重要な細胞である肥満細胞を標的としており、アレルギーを治療する乳酸菌として利用することができる。通常、プロバイオティクスは、生菌の形で使用することができ、生菌は、凍結乾燥した形態で使用することができる。また、プロバイオティクスは、死菌の形態で使用されてもよい。

本明細書で使用される場合、「IgEへの結合能を有するポリペプチド」という用語は、IgEに結合することができるポリペプチドを意味する。本明細書で使用される場合、「IgE」という用語は、免疫グロブリンEとして知られる抗体タンパク質を意味する。IgEは、肥満細胞、血液好塩基球などへの親和性を有する。さらに、IgE抗体とそれに対応する抗原(アレルゲン）との反応により炎症反応が起こる。さらに、IgEはアナフィラキシーを引き起こす抗体であることが知られている。

具体的には、IgEへの結合能を有するポリペプチドは、抗IgE抗体、IgE Fc受容体、IgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン、IgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインフラグメントのフラグメント、およびIgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインまたはそのフラグメントなどの組換えタンパク質のいずれか1つでありうる。

ここで、抗IgE抗体とは、IgEを抗原として認識し、IgEに結合することができる抗体を意味する。ここで、抗IgE抗体のフラグメントは、該フラグメントがIgEに結合することができる限り、Fab、scFv、F(ab)²、およびFvからなる群から選択されるいずれであってもよい。抗体フラグメントとは、抗原との結合により、細胞または補体へ刺激を伝達する機能(エフェクター機能）を果たす結晶化可能領域(Fc領域）を除く、抗原結合ドメインを意味する。抗IgE抗体の実施態様は、オマリズマブでありうる。

本明細書で使用される場合、「IgE Fc受容体」という用語は、Fcε受容体とも称され、IgEのFc部分に結合する。受容体には2つのタイプがある。IgE Fcに高い親和性を持つ受容体は、Fcε受容体I(FcεRI）と称される。IgE Fcに対する親和性が低い受容体は、Fcε受容体II(FcεRII）と称される。FcεRIは、肥満細胞および好塩基球で発現される。FcεRIに結合したIgE抗体が多価抗原で架橋される場合、肥満細胞および好塩基球で脱顆粒が起こり、それによってヒスタミンなどのさまざまな化学伝達物質が放出される。この放出は、即時型アレルギー反応をもたらす。

FcεRIは、ジスルフィド結合で連結された1つのα鎖、1つのβ鎖、および2つのγ鎖で構成される膜タンパク質である。これらの鎖のうち、IgEが結合する部分はα鎖(FcεRIα）であり、FcεRIαのサイズは、約60 kDaである。FcεRIαは、細胞膜内に存在する疎水性ドメインと細胞膜外に存在する親水性ドメインで構成される。特に、IgEは、α鎖の細胞外ドメインに結合する。

具体的には、IgE Fc受容体のアルファサブユニットは、NP_001992.1に記載されているアミノ酸配列を有することができる。さらに、IgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン(FcεRIaECD）は、配列番号：1のアミノ酸配列を有することができる。本明細書において、IgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインは、フラグメントまたは変異体がIgEに結合することができる限り、IgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインのフラグメントまたは変異体でありうる。

変異体の生成は、その方法がFcεRIのα鎖の機能を変更しない限り、野生型FcεRIaECD(細胞外ドメイン）において1つ以上のタンパク質を置換、欠失、または追加する方法によって、達成することができる。このようなさまざまなタンパク質またはペプチドは、配列番号：1のアミノ酸配列と、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一でありうる。さらに、配列番号：1のFcεRIaECDは、配列番号：5の配列を有するポリヌクレオチドによってコードされてもよい。

したがって、IgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン自体またはIgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインのフラグメントを、IgEへの結合能を有するポリペプチドとして使用することができる。細胞外ドメインのフラグメントの実施態様は、IgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインのN末端にあるアミノ酸の一部が欠失した形態であってもよい。1つの実施態様では、細胞外ドメインのフラグメントは、N末端の1～30個のアミノ酸が欠失したものであってもよい。さらに、細胞外ドメインのフラグメントは、N末端の5～25個のアミノ酸が欠失したものであってもよい。さらに、細胞外ドメインのフラグメントは、N末端の1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸が欠失した形態であってもよい。さらに、細胞外ドメインのフラグメントの実施態様は、IgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインのC末端にあるアミノ酸の一部が欠失した形態であってもよい。1つの実施態様では、細胞外ドメインのフラグメントは、C末端の1～30個のアミノ酸が欠失したものであってもよい。さらに、細胞外ドメインのフラグメントは、C末端の5～25個のアミノ酸が欠失したものであってもよい。さらに、細胞外ドメインのフラグメントは、C末端の1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸が欠失した形態であってもよい。さらに、細胞外ドメインのフラグメントの実施態様は、IgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインのN末端およびC末端にあるアミノ酸の一部が欠失した形態であってもよい。1つの実施態様では、細胞外ドメインのフラグメントは、それぞれ、N末端およびC末端の1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸が欠失した形態であってもよい。

しかしながら、野生型IgE受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン、またはそのフラグメントは、体内での持続性が不十分である。これを改善するために、IgE受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン、またはそのフラグメントは、さまざまな方法を介して改変することができる。改変方法の実施態様として、それにポリエチレングリコール(PEG）を結合させてもよい。改変方法の別の実施態様として、それに免疫グロブリンのFc領域を結合させてもよい。ここでは、免疫グロブリンFcの天然型に加えて、改変Fc領域を使用することができる。

さらに、本明細書で使用される場合、「改変されたFc領域」という用語は、抗体のFc部分の一部が改変されている領域を意味する。ここで、「Fc領域」とは、免疫グロブリンの重鎖定常領域2(CH2）と重鎖定常領域3(CH3）を含むタンパク質を示し、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域ならびに軽鎖定常領域を(CH1)含まない。特に、改変Fc領域とは、Fc領域の一部のアミノ酸を置換するか、または異なるタイプのFc領域を組み合わせることによって得られる領域を意味する。具体的には、改変Fc領域は、配列番号：2のアミノ酸配列を有してもよい。さらに、配列番号：2の改変Fc領域は、配列番号：6の配列を有するポリヌクレオチドによってコードされてもよい。

さらに、本発明の改変Fc領域は、天然型と比較して糖鎖が増加、または天然型と比較して糖鎖が減少した、天然型の糖鎖を有する形態であってもよく、あるいは糖鎖が除去されている形態であってもよい。免疫グロブリンFc糖鎖は、化学的方法、酵素的方法、および微生物を用いる遺伝子工学的方法などの従来の方法によって改変することができる。

ここで、本発明の改変Fc領域は、FcγRまたはC1qに対する結合部位がないために抗体依存性細胞傷害(ADCC）および補体依存性細胞傷害(CDC）機能を欠く領域であってもよい。

さらに、FcεRIα-ECDまたはそのフラグメントは、リンカーを介して野生型Fcまたは改変Fc領域に連結することができる。リンカーは、20～60個の連続したアミノ酸、25～50個の連続したアミノ酸、または30～40個のアミノ酸から構成されてもよい。1つの実施態様では、リンカーは、以下に示すように30または49個のアミノ酸で構成されてもよい。また、リンカーは少なくとも1つのシステインを含むことができる。具体的には、リンカーは1つ、2つ、または3つのシステインを含むことができる。好ましくは、リンカーは、1つのシステインを含む。1つの実施態様では、リンカーはIgD抗体に由来するヒンジ領域であってもよい。さらに、リンカーは、IgD抗体のヒンジ領域を改変することによって得られるヒンジ変異体であってもよい。ヒンジ変異体は、タンパク質生産プロセス中のトランケート型の生成を最小限にするために、IgD抗体のヒンジ配列の一部を改変することによって得ることができる。

1つの実施態様では、ヒンジは、以下の配列を含みうる：
Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro(配列番号：17)、ここで、Xaa1は、LysまたはGlyであってもよく、およびXaa2は、Glu、Gly、またはSerであってもよい。具体的には、リンカーは、配列番号：3および配列番号：19のアミノ酸配列を有することができ、それによって、タンパク質生産プロセス中のトランケート型の生成を最小限にする。

もう1つの実施態様では、ヒンジは、以下の配列を含みうる：
Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro(配列番号：18)、ここで、Xaa3は、LysまたはGlyであってもよく、およびXaa4は、Glu、Gly、またはSerであってもよい。具体的には、リンカーは、配列番号：4のアミノ酸配列を有することができ、それによって、タンパク質生産プロセス中のトランケート型の生成を最小限にする。

特に、配列番号：4のアミノ酸配列を有するリンカーでは、Thrの少なくとも1つがグリコシル化されてもよい。具体的には、配列番号：18のアミノ酸のうち、13、14、18、および19番目が、グリコシル化されてもよい。好ましくは、4つのアミノ酸すべてをグリコシル化することができる。ここで、グリコシル化は、O-グリコシル化であってもよい。

本発明のIgEに対する結合能を有するポリペプチドの実施態様であるIgE_TRAPは、FcεRIα細胞外ドメインとIgD/IgG4ハイブリッドFcドメインのFc融合タンパク質を意味する。IgE Fc受容体FcεRは、α鎖、β鎖、および2つの同一のジスルフィド結合γ鎖で構成される。FcεRIβおよびFcεRIγには、細胞外ドメインがない。しかしながら、FcεRIαは、2つの細胞外免疫グロブリン関連ドメインを有し、IgE結合に関与する。したがって、より安全で効果的なIgE阻害剤を調製するために、ヒトFcεRIα細胞外ドメインをヒトIgD/IgG4ハイブリッドFcドメインに連結し(図1および2）、IgE_TRAPを調製した。オマリズマブとは異なって、IgE_TRAPはIgG受容体に結合せず、IgG媒介アナフィラキシーのリスクを低下させる可能性がある(図9～13）。さらに、IgE_TRAPは、オマリズマブより69倍高い、IgEに対する親和性を有する。したがって、IgE_TRAPは、食物アレルギーの治療薬としてオマリズマブよりも安全で効果的である。

IgEへの結合能を有するポリペプチドは、エフェクター細胞上のFcεRIαとIgEの間の結合をブロックする働きをする。ヒトIgD/IgG4ハイブリッドFcには、IgDの上部CH2ドメインとIgG4の最後のCH2およびCH3ドメインが含まれ、FcγRまたはC1qの結合部位はない(図1）。しかしながら、このハイブリッドFcは新生児Fc受容体の結合部位を有することができる(図1）。さらに、ホモ二量体型のIgE_TRAPの理論分子量は約97.6 kDaである。しかしながら、実際の分子量は、グリコシル化により、約150 kDaである(図6）。

本発明の実施態様によるIgEへの結合能を有するポリペプチド二量体タンパク質は、従来使用されている抗IgE抗体と比較して優れた安全性および体内持続性を有するだけでなく、従来の抗IgE抗体であるオマリズマブよりも約70倍高いIgEへの結合能を有するために、IgEにも非常に強く結合し、それによって投与サイクルを延長することができる。さらに、本発明によるポリペプチド二量体タンパク質は、単一の標的としてIgE単独を有し、Fcガンマ受容体に結合せず、したがって抗体依存性細胞毒性(ADCC）および補体依存性細胞毒性(CDC）機能を欠く、改変されたFcを適用することによって得られる物質である。したがって、IgG1 Fc領域を含む従来の抗IgE抗体とは異なって、ポリペプチド二量体タンパク質は、Fcガンマ受容体に結合せず、したがって、肥満細胞の表面のFcガンマ受容体に結合することによって引き起こされるメディエーターの放出を阻害することができる。したがって、本発明のIgEに対する結合能を有するポリペプチドは、肥満細胞上のIgG1とFcガンマ受容体IIIの間の結合によって引き起こされうるアナフィラキシーの発生などの重度の副作用を最小限にすることができる。したがって、本発明によるポリペプチド二量体タンパク質は、従来の抗IgE抗体を含む治療薬と交代することができる新しい医薬組成物として利用することができる。

さらに、本発明によって提供されるIgEへの結合能を有するポリペプチドの実施態様は、単量体の形態であってもよい。特に、使用するリンカーにシステインが存在しない場合、ポリペプチドは単量体の形であってもよい。

さらに、本発明により提供される、IgEへの結合能を有するポリペプチドの実施態様は、ポリペプチド二量体であってもよい。ここで、上記のように、ポリペプチド二量体は、2つの単量体が互いに結合し、各単量体は、IgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインと改変Fc領域との間の結合によって得られる。ポリペプチド二量体は、リンカー部位に存在するシステインによって同じ2つの単量体が互いに結合している形態であってもよい。さらに、ポリペプチド二量体は、2つの異なる単量体が互いに結合した形態であってもよい。たとえば、2つの単量体が互いに異なる場合、ポリペプチド二量体は、1つの単量体がIgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインを含み、他の単量体が IgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインのフラグメントをふくむ形態であってもよい。ここで、単量体の実施態様は、配列番号：20、配列番号：21、または配列番号：22のアミノ酸配列を有してもよい。

本発明のもう1つの態様では、有効成分として、プロバイオティクスおよびIgEへの結合能を有するポリペプチドを含有する組成物を含む、アレルギー性疾患を治療または予防するための医薬組成物が提供される。

プロバイオティクスおよびIgEへの結合能を有するポリペプチドは上記の通りである。組成物中のプロバイオティクスおよびIgEへの結合能を有するポリペプチドの混合量は、適宜決定されうる。1つの実施態様では、組成物中のプロバイオティクスは、1 x 10⁵ cfu～1 x 10¹² cfuで含まれてもよい。あるいは、組成物中のプロバイオティクスは、1 x 10⁶ cfu～1 x 10¹¹ cfu、1 x 10⁷ cfu～1 x 10¹⁰ cfu、または1 x 10⁹ cfu～5 x 10⁹ cfuの量で含まれてもよい。さらに、IgEへの結合能を有するポリペプチドは、0.1μg～5mg、0.5μg～1mg、1μg～500μg、10μg～400μg、or 200μg～300μgの量で含まれてもよいが、これらに限定されない。さらに、組成物中のプロバイオティクスおよびIgEへの結合能を有するポリペプチドの混合比は、適宜変更することができる。

本明細書では、「アレルギー性疾患」は、肥満細胞の脱顆粒などの肥満細胞の活性化を介したアレルギー反応によって引き起こされる病的症状を意味する。そのようなアレルギー性疾患として、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、アナフィラキシー、蕁麻疹、掻痒、昆虫アレルギー、慢性特発性蕁麻疹、薬物アレルギーなどが挙げられる。特に、アレルギー性疾患は、IgEを介するものでありうる。

本発明の1つの実施態様では、FcεRIα細胞外ドメインを含むIgEへの結合能を有するポリペプチドは、IgEとのその結合を通して、エフェクター細胞上のFcεRIへのIgEの結合をブロックし、したがって、IgE_TRAPと称されうる。さらに、B.ロンガムは、IgE_TRAPの治療効果を改善することができ、治療に必要なIgE_TRAPの用量を著しく減少させうることが確認された。

本発明のアレルギー性疾患を治療または予防するための組成物において、有効成分は、用途、製剤、配合目的などに応じて、有効成分が抗アレルギー作用発揮し得る限り、任意の量(有効量）で含有されうる。有効成分の典型的な有効量は、組成物の総重量に基づいて、0.001重量%～20.0重量%の範囲内で決定されうる。ここで、「有効量」は、抗アレルギー効果を誘発することができる有効成分の量を示す。そのような有効量は、当業者の通常の技術の範囲内で実験的に決定されうる。

ここで、医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。薬学的に許容される担体については、担体が患者への送達に適した非毒性物質である限り、任意の担体が使用されうる。蒸留水、アルコール、脂肪、ワックス、および不活性固体が担体として含まれうる。薬理学的に許容されるアジュバント(緩衝剤および分散剤）も、医薬組成物に含まれてもよい。特に、プロバイオティクスおよびIgEへの結合能を有するポリペプチドが、製剤中でのそれらの安定性を維持することができる限り、任意の薬学的に許容される製剤を使用することができる。

具体的には、本発明の医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学的に許容される担体を含み、および当該技術分野で公知の従来の方法によって、投与経路に応じて経口または非経口製剤にされうる。ここで、「薬学的に許容される」という用語は、適用される(処方される）対象が、有効成分の活性を阻害することなく適応することができるよりも高い毒性を有さないことを意味する。

本発明の医薬組成物を経口製剤にする場合、医薬組成物は、当該技術分野で公知の方法に従って、適切な担体とともに、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、懸濁液、およびウエハーなどの製剤にすることができる。ここで、適切な薬学的に許容される担体の例として、ラクトース、グルコース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、およびキシリトールなどの糖；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、および小麦デンプンなどのデンプン；セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース；ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、麦芽、ゼラチン、タルク、ポリオール、植物油などを挙げることができる。製剤化する場合、必要に応じて、充填剤(filler)、増量剤(extender)、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの、希釈剤および/または賦形剤を配合することにより製剤化することができる。

本発明の医薬組成物を非経口製剤とする場合、当該技術分野で知られる方法に従って、医薬組成物は、適切な担体とともに、注射剤、経皮吸収剤、経鼻吸入剤、および坐剤、担体と合わせて製剤化されうる。注射剤に調製する場合、滅菌水；エタノール；グリセロール、プロピレングリコールなどのポリオール；またはそれらの混合物を、適切な担体として使用することができる。担体としては、リンガー液などの等張液、トリエタノールアミンを含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS）、注射用滅菌水、および5%ブドウ糖などが好ましく用いられる。

医薬組成物の製剤化は当該技術分野で公知であり、具体的には、Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.、1995)などを参照することができる。該文献は、本明細書の一部と見なされる。

本発明の医薬組成物の好ましい1日投与量は、患者の身体状態、体重、性別、年齢、疾患の重症度、または投与経路に応じて、0.01μg/kg～10 g/kg、および好ましくは、0.01mg/kg～1 g/kgの範囲である。投与は、1日1回または数回行うことができる。そのような投与量は、決して、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

本発明の組成物を適用(処方）することができる対象は、哺乳動物およびヒトであり、ヒトが特に好ましい。本発明の抗アレルギー用組成物は、抗アレルギー作用を高め、かつ強化する目的で、有効成分以外に、安全性が既に確認されており、抗アレルギー作用があることが知られている化合物または天然エキスをさらに含んでもよい。ここで、医薬組成物は、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)KACC 91563から単離された細胞外小胞体をさらに含みうる。

本発明のさらに別の態様では、有効成分として、プロバイオティクスおよびIgEへの結合能を有するポリペプチドを含む組成物を含む,アレルギー症状を改善または緩和するための健康機能性食品組成物が提供される。ここで、該食品組成物は、有効成分として、ビフィドバクテリウム・ロンガムKACC 91563から単離された細胞外小胞体をさらに含みうる。

一方、本発明の食品組成物は、食品学的に(sitologically)許容される担体をさらに含んでもよい。さらに、食品組成物は、他の食品または食品成分と一緒に使用されてもよく、および従来の方法に従って適切に使用されてもよい。有効成分の混合量は、その使用目的(予防、健康、または治療処置）に応じて適宜決定することができる。

食品の種類は特に限定されない。食品の例として、肉、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー、スナック、菓子、アイスクリームなどの乳製品、各種スープ、飲料、お茶、飲料、酒類、および ビタミン複合体が挙げられる。従来の意味でのすべての機能性健康食品が包含される。

上記の物質が追加される可能性のある食品は、製造時に通常追加される成分を含み、成分の例として、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、香味剤、および調味料が挙げられる。上記の炭水化物は、典型的な糖、たとえば、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、マルトースおよびスクロースなどの二糖類、ならびにデキストリンおよびシクロデキストリンなどの多糖類、ならびにキシリトール、ソルビトール、およびエリスリトールなどの糖アルコールである。香味剤として、タウマチンおよびステビア治療などの天然香料、サッカリンおよびアスパルテームなどの合成香料などを使用することができる。

たとえば、本発明の食品組成物を飲料として調製する場合、本発明の組成物に加えて、クエン酸、液体果糖、糖、ブドウ糖、酢酸、リンゴ酸、果汁、エキスなどをさらに含有してもよい。

上記に加え、本発明の組成物は、さまざまな栄養素、ビタミン、電解質、香料、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド増粘剤、pH調整剤、安定剤、保存料、グリセリン、アルコール、炭酸飲料等に使用される炭酸化剤などを含むことができる。さらに、本発明の組成物は、果汁飲料および野菜飲料の製造のために果肉を含んでもよい。これらの成分は、単独で、または混合して使用することができる。

さらに、本発明の食品組成物は、製造および流通された時点で施行規則に準拠する限り、法的または機能的分類における任意の製品カテゴリーに属しうる。たとえば、食品組成物は、健康機能性食品法に基づく健康機能性食品であるか、または食品衛生法(食品医薬品局から通知される食品の規格および仕様）の食品コードにおける各食品のタイプに応じて、菓子、豆、茶、飲料、特定用途食品などに該当する。本発明の食品組成物に含まれうる他の食品添加物に関しては、食品衛生法による食品コードまたは食品添加物コードを参照することができる。

本発明のさらに別の態様では、プロバイオティクスを含む第一の組成物；およびIgEへの結合能を有するポリペプチドを含む第二の組成物を含む、アレルギー性疾患を治療または予防するためのキットが提供される。ここで、第二の組成物は、皮下または静脈内投与用の組成物でありうる。

本発明のさらに別の態様では、プロバイオティクスを投与するステップ；およびIgEへの結合能を有するポリペプチド投与するステップを含む、アレルギー性疾患を治療または予防するための方法が提供される。

プロバイオティクスは、上記の通りであり、経口投与することができる。ここで、IgEへの結合能を有するポリペプチドは、経口投与されてもよく、非経口投与されてもよい。ここで、非経口投与は、皮下投与、静脈内投与、粘膜投与などの方法により行うことができる。

マウスの食物アレルギーモデルでは、IgE_TRAPが、遊離IgEレベルを低下させるだけでなく、肥満細胞の数も減少させることにより、食物アレルギー症状が緩和されることが示されている(図21～26）。IgE_TRAPによって引き起こされる肥満細胞の数の減少は、IgEが肥満細胞の生存率を増加させることによって肥満細胞の数を増加させるという事実に起因すると予想される。さらに、小腸における杯細胞の過剰増殖は、IgE_TRAPおよびB.ロンガム単独の投与によって有意に阻害され、併用投与時にはさらに阻害された(図23～26）。IL-13などのTh2サイトカインは杯細胞の過剰増殖を誘発することが知られているので、IgE_TRAP、B.ロンガム、およびそれらの組み合わせが、小腸におけるTh2サイトカインのための環境を緩和することが予想される。このための支持として、IgE_TRAPおよびB.ロンガムは、2型自然リンパ球(ILC2）を活性化することによって、小腸においてIL-13分泌の促進に関与するIL-33のmRNA発現を減少させる傾向を示した；そして、それらの組み合わせは、IL-33の発現をより効果的な方法で有意に減少させた(図28）。さらに、IL-33は、IgE活性化肥満細胞から分泌されるだけでなく、肥満細胞の脱顆粒の促進にも関与する。したがって、IL-33は、食物アレルギーの重症度と密接な相関関係を有する。このことは、IgE_TRAPおよびB.ロンガムが、さまざまなメカニズムによって食物アレルギー症状を改善できることを示唆する。

以前に、B.ロンガムは、肥満細胞のアポトーシスを誘発し、食物アレルギー症状を改善すると報告されており、これは本発明者らの結果と一致する。しかしながら、食物アレルギーの治療のためのB.ロンガムの毎日の投与は、IgE_TRAP単独の投与よりも効果が低かった。しかしながら、B.ロンガムは、IgE_TRAP(図18）の治療効果を著しく改善し、およびB.ロンガムと組み合わせて使用されたIgE_TRAPは、10倍高い用量でのIgE_TRAP単独の投与によって得られる治療効果と同様の効果を示した(図19B）。さらに、一部の腸内細菌が、Treg細胞を増加させるか、またはIgEおよびTh2サイトカインのレベルを減少させることによって、アレルギー性疾患を改善することができることが報告されている。したがって、B.ロンガムに加えて、他のプロバイオティクスが、IgE_TRAPの治療効果を改善することができると期待されている。実際に、各種のプロバイオティクスとIgE_TRAPの併用投与時に高い治療効果が発揮されることが確認された(図29～34）。

本発明のさらに別の態様では、個体に、IgEへの結合能を有するポリペプチドおよびプロバイオティクスを組み合わせて投与するステップを含む、アレルギー性疾患を治療または予防するための方法が提供される。個体は、哺乳動物、好ましくはヒトでありうる。ここで、投与は、経口的または非経口で行うことができる。ここで、IgEへの結合能を有するポリペプチドおよびプロバイオティクスを経口投与に適した製剤に調製することができる。さらに、非経口投与は、皮下投与、静脈内投与、粘膜投与、および筋肉内投与などの方法によって行われうる。
発明の詳細な記載

以下、本発明を以下の実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は、本発明を例示することのみを意図しており、本発明の範囲はそれらのみに限定されない。

材料および方法
IgE _TRAP のための細胞株構築およびその精製
IgE_TRAPのヌクレオチド配列は、FcεRIα細胞外ドメインのC末端(26番目から205番目）をIgD/IgG4ハイブリッドFcドメイン(IgD、133番目から170番目；IgG4、121番目から327番目）のN末端に連結させることによって構築された。該タンパク質は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣DG44細胞において発現された。IgE_TRAPを、HiTrap rProtein A FFカラム(GE Healthcare）を用いて精製し、その純度を還元および非還元条件下のSDS-PAGEで確認した。

3D構造モデリング
IgE_TRAPの構造モデルを、WinCootを使用して設計し、Protein Data BankのFcεRIα(PDB受託番号1F6A）およびIgD/IgG4 Fc(PDB受託番号1ADQ）に関する情報に基づいてPyMOLソフトウェアを用いて構築された。

表面プラズモン共鳴(SPR）アッセイ
SPRアッセイを、ProteOn XPR36(Bio-Rad）装置を使用して行った。動態解析を使用して、オマリズマブおよびIgE_TRAPのヒトIgE(Calbiochem）への結合の程度を同定した。酢酸緩衝液(pH5.5）中の850応答単位(RU）のオマリズマブおよび酢酸緩衝液(pH4.0）中の500 RUのIgE_TRAPを、ProteOn(商標)GLCセンサーチップ(Bio-Rad）に固定化した。Tween-20を含むPBSをランニング緩衝液として用い、流速を30μl/分に設定した。各データセットのグラフを、ProteOn Managerソフトウェア(Bio-Rad）を用いて分析した。

バイオレイヤー干渉法(BLI）アッセイ
IgE_TRAPおよびオマリズマブのIgG受容体への結合の程度を、Octet RED384システム(Pall ForteBio、CA、USA）を使用して同定した。300mM酢酸緩衝液(pH5）中で希釈されたFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、およびFcγRIIIB組換えタンパク質(R＆D Systems Inc.、5μg/ml）を、400mM EDCおよび10mMスルホ-NHSの組み合わせによって活性化さたれたAmine Reactive 2 Generation(AR2G）バイオセンサーに固定化した。次に、さまざまな濃度のIgE_TRAPおよびオマリズマブとの会合およびそれらからの解離を、それぞれ300秒間測定した。ここで、使用した動態緩衝液は、0.1％Tween-20および1％ウシ血清を含むPBSであり、すべての実験を、30℃にてサンプルプレートシェーカーを1,000rpmの速度で使用して行なった。

β-ヘキソサミニダーゼ放出アッセイ
骨髄由来肥満細胞(BMMC）を、10%熱不活化FBS、10ng/mLマウスIL-3(PeproTech, Inc.）、および50ng/mLマウスSCF(PeproTech, Inc.）を含むRPMI中、37℃にて培養した。分析前に、1μg/mLの抗ジニトロフェニルIgE(Sigma-Aldrich）およびさまざまな濃度のIgE_TRAPを室温にて30分間インキュベートした。骨髄由来肥満細胞を、抗ジニトロフェニルIgE(Sigma-Aldrich）およびIgE_TRAPの混合物中で37℃にて30分間インキュベートし、それに0.1μg/mlの抗ジニトロフェニルIgEを加えた。結果物を再度37℃にて30分間インキュベートした。培養上清を回収し、3mM p-ニトロフェニル-N-アセチル-β-D-グルコサミニドとともに37℃にて20分間インキュベートした。0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH10）を加えて反応を停止し、405nmにて吸光度を測定した。放出されたβ-ヘキソサミニダーゼの比率を、0.1%Triton X-100で溶解したBMMCの全細胞内含有量との比較によって計算した。

食物アレルギー誘発およびB.ロンガムの投与
0日目と14日目に、OVA(グレードV；Sigma-Aldrich）50μgおよび硫酸アルミニウムカリウムアジュバント(Sigma-Aldrich）1mgをマウスの腹腔内に投与した。14日後、マウスに50mgのOVA(グレードIII；Sigma-Aldrich）を2日間隔で5回経口投与した。マウスは、OVAの経口投与前に約4～5時間絶食させた。下痢の発生を、OVA接種後1時間までマウスを監視することによって評価した。B.ロンガムを凍結乾燥し、粉末マウス飼料と3×10⁹ cfu/gで混合した。マウスは、飼料に自由にアクセスさせた。鮮度を保つために、B.ロンガムと混合したマウスの餌を2～3日ごとに交換した。

組織学
小腸の空腸を4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋してブロックを作製した。次に、パラフィン切片スライドを作製した。スライドを脱パラフィンし、肥満細胞をナフトールAS-Dクロロ酢酸エステラーゼキット(Sigma-Aldrich）で染色した。杯細胞については、スライドを過ヨウ素酸シッフ染色キット(ScyTek Laboratories, Inc.）で染色した。染色したスライドの画像を、Pannoramic MIDI(3D HISTECH Ltd.）を使用して撮影した。

ELISA
製造者のプロトコルに従って、マウス総IgE ELISAキット(BioLegend）およびMCPT-1 ELISAキット(Invitrogen）を使用して、マウス血清中のIgEおよびMCPT-1の総濃度を測定した。遊離IgEを測定するために、プレートを1mg/mLのIgE_TRAPでコーティングし、4℃にて一晩反応させた。残りの分析を、マウス総IgE ELISAキットの製造者のプロトコルに従って行った。

統計分析
すべてのデータの統計分析は、GraphPad Prism 5ソフトウェア(GraphPad Software Inc.）を使用して行なった。下痢発生を計算するために、ログ-ランク(Mantel-Cox）アッセイを用いるカプラン-マイヤー生存曲線分析を用いた。ニューマン-コイルスの多重比較検定を用いる一元配置分散分析を用いて、検定の有意差を同定した。

I．IgE _TRAP の調製および特性評価
実施例1：FcεRIα-ECDおよび改変Fc領域を含むポリペプチドの調製
IgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン(FcεRIα-ECD）のC末端改変ポリペプチドを、米国特許第7,867,491号に開示された方法に従って調製した。

まず、配列番号：1のアミノ酸配列および配列番号：2の改変免疫グロブリンFcを有するFcεRIのα鎖の細胞外ドメインを含む融合タンパク質を調製した。具体的には、それぞれ、配列番号：19のヒンジ配列番号：3のヒンジ、および配列番号：4のヒンジを介して連結された、タンパク質(FcεRIαECD-Fc1）、タンパク質(FcεRIαECD-Fc2）、およびタンパク質(FcεR1αECD-Fc3）を発現させるために、各タンパク質をコードする遺伝子を連結して得られたカセットをpAD15ベクター(Genexin, Inc.）にクローニングして、FcεRIαECD-Fcタンパク質発現ベクターを構築した。次に、各発現ベクターをCHO DG44細胞(Dr. Chasin、コロンビア大学、USAから入手)に形質導入した。

ここで、細胞株への形質導入時に、α-2,6-シアル酸トランスフェラーゼ遺伝子をpCI Hygroベクター(Invitrogen）にクローニングすることによって得られた発現ベクターを同時に形質導入して、シアル酸が加えられたFcεRIαECD-Fc2STおよびFcεRIαECD-Fc3STタンパク質を発現することができる細胞株を別々に調製した。

一次スクリーニング手順として、5-ヒドロキシトリプタミン(HT）フリー10% dFBS培地(Gibco、USA、30067-334）、MEMα培地(Gibco、12561、USA、Cat No. 12561-049）およびHT+培地(Gibco、USA、11067-030）を用いて、HT選択を行った。次に、メトトレキサート(MTX）増幅を、HT選択クローンを使用して行って、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR）システムを使用して生産性を増幅した。

MTX増幅の完了後、生産性の評価を目的として、細胞安定化のために約1～5回継代培養を行った。その後、MTX増幅細胞の単位生産性評価を行った。結果を下の表1に示す。

[表1]

表1に示すように、FcεRIαECD-Fc3細胞株は、2μMにおけるメトトレキサート増幅後、16.9μg/10⁶細胞の生産性を示した。一方、2,6-シアル酸トランスフェラーゼと同時形質導入されたFcεRIαECD-Fc3細胞株(FcεRIαECD-Fc3ST）は、1μMでのメトトレキサート増幅後、17.5μg/10⁶細胞の生産性を示した。さらに、FcεRIαECD-Fc2細胞株は、0.5μMでのメトトレキサート増幅条件下で20.9μg/10⁶細胞の生産性を示した。さらに、2,6-シアル酸トランスフェラーゼで同時形質導入されたFcεRIαECD-Fc2細胞株(FcεRIαECD-Fc2ST）は、0.1μMでのメトトレキサート増幅後、25.1μg/10⁶細胞の生産性を示した。すなわち、0.1μMでのメトトレキサート増幅条件下で選択された2,6-シアル酸トランスフェラーゼと同時トランスフェクトされたFcεRIαECD-Fc2細胞株が、最も優れた生産性を示すことが確認された。

実施例2：FcεRIα ECD融合タンパク質の精製およびその純度の同定
上記実施例1で選択された細胞株のうち、i）FcεRIαECD-Fc3、ii）FcεRIαECD-Fc3ST、およびiii）FcεRIαECD-Fc2STを、回分培養法によって、60mlスケールで培養した。得られる培養物を、プロテインAアフィニティーカラムを使用して精製し、次に、精製したタンパク質をSDS-PAGEおよびサイズ排除HPLC(SE-HPLC）に付して、タンパク質の純度を同定した。

図3Aおよび3Bに示すように、SE-HPLC法によって精製されたそれぞれのタンパク質はすべて、93%以上の純度を有することが確認された。さらに、SDS-PAGE分析の結果として、非還元および還元条件下で、それぞれ約150 kDaおよび約75 kDaのサイズを有するタンパク質が検出されることが確認された(図3A、レーン1～6）。このことから、Fc結合FcεRIαECDが二量体を形成することがわかった。さらに、SDS-PAGEの結果では、トランケート型などの不純物は観察されなかった。特に、解凍/冷凍プロセスの後でも(図3A、レーン7～9）、すべてのタンパク質の純度が93％以上であり、不純物がないことが確認された。ここで、シアル酸トランスフェラーゼ導入後のタンパク質中のシアル酸含量を同定するために、以下の試験条件でGel-IEFを行った。このことから、シアル酸含量の増加により、酸性タンパク質の含量が増加することが確認された。

[表2]

精製収率の再現性を確認するために、FcεRIαECD-Fc2ST細胞株を1 Lフラスコ中、250mLスケールにて回分培養し、プロテインAアフィニティーカラムを使用して精製した。続いて、培養上清および精製生成物を、4%～15% TGX^TMゲル(Bio-Rad Laboratories, Inc.）上で、Tris-Glycine SDS(TGS）緩衝液および200 Vの条件にて30分間動作させ、次に、SDS PAGE分析に付した。結果として、第一段階の精製のみでも非常に高純度(98％以上）のタンパク質が精製され、培養上清中でも非常に高純度のタンパク質が発現することが確認された。これは、問題の細胞株において発現したFcεRIαECD-Fcタンパク質を医薬品へと発展させる際に、プロセス開発ステップを簡略化することができることを示し、結果として、医薬品の開発コストが大幅に削減される可能性が高い。

実験例1：FcεRIαECD融合タンパク質のIgEへの結合能の同定
IgEへの結合能は、上記の実施例2の方法で精製された4つのタンパク質、i）FcεRIαECD-Fc2、ii）FcεRIαECD-Fc2ST、iii）FcεRIαECD-Fc3、およびiv）FcεRIαECD-Fc3ST、ならびに市販の抗IgE抗体、オマリズマブ(商品名：ゾレア）について比較的に測定された。具体的には、Protein GLCセンサーチップ(Bio-Rad Laboratories, Inc.）のチャネル上にIgEをコーティングし、さまざまな濃度のオマリズマブまたは各FceR1αECD-Fcタンパク質を30μl/分の速度で流すことによって、IgEへの結合能を測定した。

実験は、再生緩衝液として25mM NaOHを使用してゼロベースを同定し、次に、上記のステップを繰り返すことによって行われた。その後、タンパク質結合アナライザー(ProteOn XPR36、Bio-Rad Laboratories, Inc.、USA）を使用して結合曲線を特定した。結果を表3、および図7と8に示す。図8におけるIgE_TRAPは、FceR1αECD-Fc2STを意味し、これは、本発明のIgEへの結合能を有するポリペプチドの実施態様である。

[表3]

表3に示すように、本発明の実施態様によるポリペプチド二量体の会合速度(ka）値は、オマリズマブのそれよりも1.5～2.0倍低いと測定された。すなわち、IgE以外の物質へのその結合能は、オマリズマブのそれよりも1.5倍～2.0倍低いことがわかった。さらに、本発明の実施態様によるポリペプチド二量体の解離速度(kd）値は、オマリズマブのそれよりも40～106倍高いと測定された。さらに、図7および図8に示すように、オマリズマブは、結合後一定期間が経過するとIgEへの結合が失われるが、本発明のFcεRIαECD融合タンパク質のポリペプチド二量体は、一旦結合すると、ポリペプチド二量体がIgEから分離されないことを確認することができた。すなわち、本発明のポリペプチド二量体は、IgEから容易に分離されず、オマリズマブよりも結合状態を維持する能力がはるかに優れていることがわかる。結果として、本発明の実施態様によるポリペプチド二量体は、オマリズマブよりも22～69倍高い平衡解離定数(KD <kd/ka>)の値を有することがわかった。

このことから、本発明のFcεRIαECD融合タンパク質は、オマリズマブと比較してIgEへの結合能が著しく増大していることがわかる。特に、シアル酸を添加したFcεRIαECD-Fc2(FcεRIαECD-Fc2ST）は、オマリズマブより69倍高い最高のIgE結合能力を示すことが確認された。特に、FceR1αECD-Fc2STの場合、IgE_TRAPの会合速度(Ka）および解離速度(Kd）は、それぞれオマリズマブの約1.5倍および94.5倍低かった(図7および8、ならびに表4）。IgEがFcεRIαから非常にゆっくりと解離することが以前に報告されている。IgE_TRAPも非常にゆっくりと解離することが確認された(図8）。結果として、IgE_TRAPのヒトIgEへの結合能は、オマリズマブより69倍高かった(図8および表4）。

[表4]

実験例2：IgE _TRAP のIgGを介したIgG受容体への結合能の同定
IgE_TRAPは、IgG媒介アナフィラキシーに関連する低親和性IgG受容体に結合しない。オマリズマブの主要な副作用であるアナフィラキシーは、低親和性IgG受容体への結合の可能性によって引き起こされると予想されたので、BLIアッセイを使用して、オマリズマブをコントロールとして使用しながら、IgE_TRAPのIgG受容体への結合能を確認した。具体的には、IgE_TRAPおよびオマリズマブのIgG受容体への結合の程度を、Octet RED384システム(Pall ForteBio、CA、USA）を使用して同定した。

300mM酢酸緩衝液(pH5）中で希釈されたFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、およびFcγRIIIB組換えタンパク質(R＆D Systems Inc.、5μg/ml）を、400mM EDCおよび10mMスルホ-NHSの組み合わせによって活性化さたれたAmine Reactive 2 Generation(AR2G）バイオセンサーに固定化した。次に、さまざまな濃度のIgE_TRAPおよびオマリズマブとの会合およびそれらからの解離を、それぞれ300秒間測定した。ここで、使用した動態緩衝液は、0.1％Tween-20および1％ウシ血清を含むPBSであり、すべての実験を、30℃にてサンプルプレートシェーカーを1,000rpmの速度で使用して行なった。

予想通り、オマリズマブは、高親和性IgG受容体であるFcγRI、ならびにFcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、およびFcγRIIIBなどの低親和性IgG受容体に対して有意な結合能を示した(図9～14）。このことは、オマリズマブとは異なって、IgE_TRAPは、FcγRIIAおよびFcγRIIIなどのIgG受容体に結合できず、したがって、IgG媒介アナフィラキシーを誘発するリスクが非常に低いことを意味する(図9～14）。オマリズマブおよびIgE_TRAPのIgG受容体への結合能を定量化し、図14に示した。

実験例3：マウス骨髄由来肥満細胞におけるβ-ヘキソサミニダーゼアッセイによるFcεRIα ECD融合タンパク質の活性の同定
本発明のFcεRIαECD融合タンパク質のインビトロ活性分析のためにベータ-ヘキソサミニダーゼアッセイを行った。具体的には、本発明の実施態様によるFcεRIαECD-Fc2タンパク質を、各濃度でマウスIgE(1μg/mL)と混合し、室温(20℃）にて30分間インキュベートして、サンプルを調製した。肥満細胞活性化のための培養中のマウス骨髄由来肥満細胞を、ハンクス平衡塩類溶液(HBSS）緩衝液で洗浄して、培地を除去し、細胞数を測定した。次に、5×10⁵個の細胞が40μLのHBSS緩衝液に注入されるように調整した。

次に、プレインキュベーションで調製したサンプル溶液50μLを活性化肥満細胞に加えた。次に、結果物を5%CO₂インキュベーターで37℃にて30分間インキュベートした。その後、外来抗原であるDNP(2,4-ジニトロフェノール、100ng/mL）を10μLずつ添加した後、5%CO₂中、37℃にて30分間インキュベートし、次に、30μLの上清を分離した。分離した上清30μLと基質(4-ニトロフェニルN-アセチル-β-D-グルコサミニド、5.84mM）30μLとを十分に混合し、次に、5%CO₂中、37℃にて20分間インキュベートした。次に、停止溶液として140μLの0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH10）を加えて反応を停止した。その後、405 nmで吸光度を測定して、活性化肥満細胞において外来抗原によって分泌されたβ-ヘキソサミニダーゼの分泌量を確認した。結果を図15Aに示す。

IgE_TRAPは、1μg/mlのマウスIgEの存在下で、用量依存的に、0.45μg/mlのIC₅₀(50%の阻害効果を示すのに必要な薬物濃度）で肥満細胞の脱顆粒を阻害した(図15A）。IgE_TRAPは、IgE：IgE_TRAPの分子比0.79において骨髄由来肥満細胞の脱顆粒を完全に阻害した(表5）。

[表5]

具体的には、図15Aに示すように、本発明の実施態様のポリペプチド二量体は、濃度がマウスIgEの半分(0.5μg/mL）の場合、約49.4%の肥満細胞阻害率を示し、マウスIgEと同濃度(1μg/mL）の場合、約99.4%の肥満細胞阻害率を示した。すなわち、本発明のFceRIa-ECDポリペプチド二量体によって、骨髄由来肥満細胞のIgE誘発性活性が大きく阻害されることがわかる。

実験例4：ヒトFcεRI発現骨髄由来肥満細胞におけるβ-ヘキソサミニダーゼアッセイを用いたFcεRIα ECD融合タンパク質と抗ヒトIgE抗体の活性の比較
β-ヘキソサミニダーゼアッセイを行い、インビトロ活性分析によりゾレアと比較したFcεRIαECD融合タンパク質の優位性を確認した。それぞれの薬剤、FcεRIαECD-Fc2ST(IgE_TRAP）およびゾレアを各濃度にて調製し、次に、ヒトIgE(1μg/mL）と混合した。次に、室温にて30分間インキュベーションを行った。薬物のプレインキュベーション中に、ヒトFcεRI遺伝子を導入し、マウスFcεRI遺伝子が除去されたマウス骨髄由来の肥満細胞およびマウス骨髄から分化した肥満細胞を調製した。調製した肥満細胞をHBSS緩衝液で洗浄し、次に、5×10⁵個の細胞を60μLのHBSS緩衝液に注入した。プレインキュベートしたサンプル20μLを、調製した肥満細胞に加え、5% CO₂インキュベーター中、37℃にて30分間インキュベートした。

続いて、20μLの抗ヒトIgE抗体(BioLegend、カタログNo.325502、0.5μg/mL）を加えて、外来抗原に対する同様の反応を誘発し、次に、結果物を5%CO₂インキュベーター中、37℃にて30分間再度インキュベートした。続いて、4℃にて1,500rpmで、遠心分離した後、上清30μLを分離した。分離した上清30μLと基質(4-ニトロフェニルN-アセチル-β-グルコサミニド、5.84mM）30μLを十分に混合し、5%CO₂インキュベーター中、37℃にて25分間インキュベートした。次に、140μLの0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH10）を加えて反応を停止した。

続いて、405 nmで吸光度を測定して、分泌されたβ-ヘキソサミニダーゼの相対量を比較し、各薬物濃度に応じた細胞阻害効果を確認した。結果を図15Bに示す。図15Bに示すように、FcεRIαECD融合タンパク質のIC₅₀は、約11.16ng/mL、およびゾレアタンパク質のIC₅₀は、約649.8ng/mLであると測定された。したがって、FcεRIαECD融合タンパク質は、ゾレアよりも58倍高い肥満細胞活性阻害能力を有することが確認された。

実験例5：FcεRIαECD融合タンパク質のインビボアッセイ：食物アレルギーモデル
50μgのオボアルブミン(OVA）および1mgのミョウバンをBalb/cマウス(Orientbio Inc.）に14日間隔で2回腹腔内投与して、感作を誘発した。その後、28、30、32、34、および36日目に50mgのOVAを合計5回経口投与して、腸内で食物アレルギーを誘発した。

OVAを2回経口投与した後、すなわち、31日目に、マウスを、それぞれ7匹のマウスを含む3つのグループに分けた。3つの分割グループは、以下の通りである：高濃度(200μg）のFcεRIαECD-Fc2ST融合タンパク質を投与される第一のグループ、低濃度(20μg）のFcεRIαECD-Fc2ST融合タンパク質を投与される第二のグループ、および何も投与されない第三のグループ。OVAを経口投与しながら、食物アレルギー誘発による下痢が発生しているかどうかを確認した。37日目にマウスを犠牲にし、各グループに属するマウスについて、小腸の肥満細胞の数、血中のIgE濃度、および血中の肥満細胞脱顆粒の酵素(肥満細胞プロテアーゼ1(MCPT-1））の濃度を分析した。

図16に示すように、高濃度のポリペプチド二量体であるFcεRIαECD-Fc2STを投与されたグループに属するマウスは、何も投与されないグループに属するマウスと比較して、濃度依存的に食物アレルギーを緩和する効果を示すことが確認された。

II．IgEへの結合能を有するポリペプチドおよびプロバイオティクスの組み合わせの調製、ならびにその効果の確認
実施例3：プロバイオティクスの培養および投与
L.カゼイ(ラクトバチルス・カゼイ；KACC 12413)、Lc.ラクチス(ラクトコッカス・ラクチス；KACC 13877)、L.ファーメンタム(ラクトバチルス・ファーメンタム；KACC 11441)、およびL.ラムノサス(ラクトバチルス・ラムノサス；KACC 11953)を、MRSブロスまたはブレインハートインフュージョン(BHI)培地上でインキュベートし、37℃インキュベーター(N-Biotek カタログ# NB201L)中、24時間培養した。L.ロイテリ(ラクトバチルス・ロイテリ；KACC 11452)およびS.サーモフィルス(ストレプトコッカス・サーモフィルス；KACC 11857)を、それらの好気性を考慮して、振とうインキュベーター中、37℃および50rpmにて24時間培養した。

培養したプロバイオティクスを、10%スキムミルクおよび10%スクロースを含む凍結乾燥培地に溶解し、凍結乾燥機(Labcono）を使用して凍結乾燥した。次に、結果物を粉末状にした。完成したプロバイオティクスについて、グラムあたりに存在するコロニー形成単位(cfu）を段階希釈で測定した。

凍結乾燥されたプロバイオティクスを、実験中に2～3日間隔で経口ゾンデを使用して、マウスあたり1×10⁹～2.5×10⁹cfuで継続的に与えた。ネガティブコントロールには、等量の凍結乾燥培地を与えた。

実施例4：プロバイオティクスおよびIgEへの結合能を有するポリペプチドを含む組成物の調製
実施例1で得られたIgEへの結合能を有するポリペプチドおよび実施例3で得られたプロバイオティクスを混合して、アレルギー治療用組成物を調製した。

実験例6：アレルギーの改善におけるFcεRIα-Fc融合タンパク質の効果の確認
50μgのオボアルブミン(OVA）および1mgのミョウバンをBalb/cマウス(Orientbio Inc.）に14日間隔で2回腹腔内投与して、感作を誘発した。その後、28、30、32、34、および36日目に50mgのOVAを合計5回経口投与して、腸内で食物アレルギーを誘発した。食物アレルギーを誘発したマウスを、それぞれ7匹のマウスを含む5つのグループに分けた。5つの分割グループは、以下の通りである：高濃度(200μg）のFcεRIαECD組換えタンパク質を投与される第一のグループ、低濃度(20μg）のFcεRIαECD組換えタンパク質を投与される第二のグループ、高濃度(200μg）のFcεRIαECD組換えタンパク質＋B.ロンガムを投与される第三のグループ、低濃度(20μg）のFcεRIαECD組換えタンパク質＋B.ロンガムを投与される第四のグループ、および何も投与されない第五のグループ。

OVAを経口投与しながら、食物アレルギー誘発による下痢が発生しているかどうかを確認した。37日目にマウスを犠牲にし、各グループに属するマウスについて、小腸の肥満細胞の数、血中のIgE濃度、および血中の肥満細胞脱顆粒による酵素(肥満細胞プロテアーゼ1(MCPT-1））の濃度を分析した。図19Bに示すように、FcεRIαECD ポリペプチド二量体およびB.ロンガムの組み合わせを投与されたグループに属するマウスは、何も投与されないグループに属するマウスと比較して、食物アレルギーを緩和する効果を示すことがわかった。

実験例7：アレルギー改善におけるIgE _TRAP およびプロバイオティクスの併用投与の効果の確認
食物アレルギーにおけるIgE_TRAPの影響を評価するために、BALB/cマウスに用量依存性急性下痢を誘発して、アレルゲン誘発性食物アレルギーのマウスモデルを作成した。具体的には、実験例6と同様に実験を行ったが、FcεRIαECD組換えタンパク質であるIgE_TRAPは、100μg/頭で投与された。さらに、プロバイオティクスB.ロンガムを凍結乾燥し、粉末マウス飼料と3×10⁹cfu/gで混合した。マウスは、飼料に自由にアクセスできた。鮮度を維持するために、B.ロンガムと混合したマウスの飼料は、2～3日ごとに交換した。その結果、以下の表6および図18に示すように、プロバイオティクスB.ロンガムおよびFcεRIαECDポリペプチド二量体であるIgE_TRAPを同時に投与された実験グループでは、優れたアレルギー緩和効果が見出された。

[表6]

このモデルを使用して、本発明者らは、IgE_TRAP単独の投与が下痢の発生を効果的に減少させることを見出し、そして、本発明者らは、B.ロンガムと組み合わせたIgE_TRAPの投与がIgE_TRAP単独の投与と比較して、下痢の発生を著しく減少させることを確認した(図18）。B.ロンガムが肥満細胞の数を減少させ、アポトーシスにより食物アレルギー症状を緩和することが報告されている。しかしながら、IgE_TRAPの腹腔内注射を受けたグループは、B.ロンガムを毎日投与されたグループよりも優れた治療効果を示した(図18）。興味深いことに、濃度を10分の1に減少させたIgE_TRAPを使用した場合でも、IgE_TRAPおよびB.ロンガムの併用療法は、IgE_TRAP単独療法と同様の効果を示した(図19B）。

実験例8：IgE _TRAP およびB.ロンガムの併用投与時の効果の確認：MCPT-1およびIgEレベル
さらに、血清MCPT-1のレベルを測定して、肥満細胞の脱顆粒を確認した。IgE_TRAPおよびB.ロンガムの単独投与はMCPT-1のレベルを低下させなかったが、IgE_TRAPおよびB.ロンガムの組み合わせはMCPT-1のレベルを有意に低下させた(図20）。したがって、B.ロンガムおよびIgE_TRAPが協力して肥満細胞の脱顆粒を阻害することがわかる。食物アレルギーのマウスモデルでは、IgEを低下させる治療薬の有効性を調査するために、ELISAを使用して、血清中の総IgEおよび遊離IgEのレベルを分析した。IgE_TRAP、およびIgE_TRAPとB.ロンガムの組み合わせにより、総IgEのレベルはわずかに増加した(図21）。しかしながら、IgE_TRAP、およびIgE_TRAPとB.ロンガムの組み合わせにより、遊離IgEのレベルは大幅に低下した(図22）。対照的に、B.ロンガム単独の投与は、総IgEおよび遊離IgEのレベルに影響を与えなかった(図21および22）。したがって、IgE_TRAPおよびB.ロンガムはいくつかの方法で食物アレルギー症状を緩和し、この組み合わせが食物アレルギーに対して効果的な治療効果を発揮する可能性があることを示唆する。

実験例9：肥満細胞および杯細胞過形成の数に対するIgE _TRAP およびB.ロンガムの組み合わせの阻害効果の確認
IgE_TRAPおよびB.ロンガム、およびそれらの組み合わせが肥満細胞の数を減少させるかどうかを調査するために、クロロ酢酸エステラーゼ活性を使用して肥満細胞を染色した。その結果、IgE_TRAPおよびB.ロンガム単独の投与により、肥満細胞の数が大幅に減少し、両者の組み合わせは、より効果的であることが示された(図23および24）。B.ロンガムの結果は、以前に報告されたものと一致することがわかる。Th2サイトカイン環境によって誘発される杯細胞過形成が、IgE_TRAP、B.ロンガム、およびそれらの併用療法によって阻害されうるかどうかについて調査を行った。予想通り、食物アレルギーマウスの小腸の杯細胞のサイズが大きくなること、および細胞数の増加に伴って過形成が起こることが確認された(図25および26）。

IgE_TRAPおよびB.ロンガムの投与により杯細胞のサイズおよび数が著しく減少し、IgE_TRAPおよびB.ロンガムを組み合わせて投与した場合にこの効果がより大きくなることが確認された(図25および26）。さらに、IL-33のmRNA発現が、IgE_TRAPおよびB.ロンガムによって減少する傾向が見られ、およびこの効果は、併用で投与された場合に有意に大きくなった(図28）。これらの結果は、IgE_TRAPおよびB.ロンガムが、腸の肥満細胞の数および杯細胞過形成を有意に阻害し、併用投与された場合にさらに改善された効果を示すことを示す。

実験例10：マウスへのIgE _TRAP の経口投与後の血清中のIgE _TRAP の存在の同定
IgE_TRAP(300μg）をマウスに経口投与し、2時間後、眼窩後採血によって血清を採取した。室温で30分間反応させた後、4℃および1300rpmにて15分間遠心して上清(血清）を得た。96ウェルの免疫プレートを抗FcεRI抗体(Abcam、ab54411）でコーティングし、4℃にて一晩反応させた。プレートを洗浄緩衝液(0.05％Tween-20を含むPBS）で洗浄し、次に、ブロッキング緩衝液(1％ウシ血清アルブミンを含むPBS）をそれに添加した。プレートを1時間反応させた。プレートを洗浄緩衝液で再度洗浄し、標準サンプルおよび希釈したマウス血清サンプルをプレートに加えた。プレートを2時間反応させ、洗浄緩衝液で再度洗浄した。抗ヒトIgG4 Fc抗体(Abcam、ab99823）を加え、プレートを1時間反応させた。プレートを洗浄緩衝液で再度洗浄し、TMB基質(Supmodics）を加えた。遮光しながら20分間反応させた後、反応停止液(1M H₂SO₄）を加えて反応を停止した。濃度値を、波長を450 nmに設定することによってマイクロプレートリーダー(Epochマイクロプレート分光光度計）で測定した。結果として、正常マウスの血清においてIgE_TRAPが検出された(図35）。これらの結果から、IgE_TRAPタンパク質を経口投与した場合、粘膜内のFcRnとの結合を介してIgE_TRAPタンパク質が血清中に送達され、治療効果を発揮することができることがわかる。

実験例11：食物アレルギーモデルにおけるIgE _TRAP およびさまざまなプロバイオティクスの併用投与による効果の確認
食物アレルギー対するIgE_TRAPおよびプロバイオティクスの効果を評価するために、BALB/cマウスに用量依存性急性下痢を誘発して、アレルゲン誘発性食物アレルギーのマウスモデルを作成した。
具体的には、実験例7と同様に実験を行ったが、FgεRIαECD組換えタンパク質であるIgE_TRAPは、図17の実験スケジュールのとおり、100μg/頭でマウスに腹腔内投与された。さらに、凍結乾燥されたプロバイオティクスを、実験中に2～3日間隔で経口ゾンデを使用して、マウスあたり1×10⁹～2.5×10⁹cfuで継続的に与え、ネガティブコントロールには、等量の凍結乾燥培地を与えた。

IgE_TRAPおよびL.カゼイの投与後の下痢の頻度を確認することによって得られた結果を図29に示す。IgE_TRAPおよびLc.ラクチスの投与後の下痢の頻度を確認することによって得られた結果を図30に示す。IgE_TRAPおよびS.サーモフィルスの投与後の下痢の頻度を確認することによって得られた結果を図31に示す。IgE_TRAPおよびL.ラムノサスの投与後の下痢の頻度を確認することによって得られた結果を図32に示す。IgE_TRAPおよびL.ロイテリの投与後の下痢の頻度を確認することによって得られた結果を図33に示す。IgE_TRAPおよびL.ファーメンタムの投与後の下痢の頻度を確認することによって得られた結果を図34に示す。

引用符号リスト
B.ロンガム：ビフィドバクテリウム・ロンガム
OIT：経口免疫療法
PSA：受動全身性アナフィラキシー
SPR：表面プラズモン共鳴
BLI：バイオレイヤー干渉法
BMMC：骨髄由来肥満細胞
cfu：コロニー形成単位
MCPT-1：肥満細胞 プロテアーゼ1
OVA：オボアルブミン
Treg細胞：制御性T細胞
Th2細胞：2型Ｔヘルパー細胞
ILC2：2型自然リンパ球

[配列表テキスト]

配列番号：1
VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ

配列番号：2
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配列番号：3
RNTGRGGEEK KGSKEKEEQE ERETKTPECP

配列番号：4
AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK GSKEKEEQEE RETKTPECP

配列番号：5
gtgccccaga agcccaaggt gagcctgaac cctccctgga acagaatctt caagggcgag aacgtgaccc tgacctgcaa cggcaacaac ttcttcgagg tgagcagcac caagtggttc cacaatggca gcctgagcga ggagaccaac agctccctga acatcgtgaa cgccaagttc gaggacagcg gcgagtacaa gtgccagcac cagcaggtga acgagagcga gcccgtgtac ctggaggtgt tcagcgactg gctgctgctg caggccagcg ccgaggtggt gatggagggc cagcccctgt tcctgagatg ccacggctgg agaaactggg acgtgtacaa ggtgatctac tacaaggatg gcgaggccct gaagtactgg tacgagaacc acaacatctc catcaccaac gccaccgtgg aggacagcgg cacctactac tgcacaggca aggtgtggca gctggactac gagagcgagc ccctgaacat caccgtgatc aaggctccca gagagaagta ctggctgcag

配列番号：6
tgcgtggtcg tggatgtgag ccaggaagat cccgaagtgc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagaag agcagttcaa ctccacctac agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaagg cctgcccagc tccatcgaga agaccatcag caaagccaaa ggccagccca gagaacccca ggtgtacacc ctgcctccca gccaggaaga gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggaaagca acggccagcc cgagaacaat tacaagacaa cccctcccgt gctggatagc gatggcagct tctttctgta cagcagactg accgtggaca agagcagatg gcaggaaggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgaa gccctgcaca accactacac ccagaagagc ctgtccctga gcctgggcaa g

配列番号：7
aggaacaccg gcagaggagg cgaggaaaag aaaggaagca aggagaagga ggagcaggag gaaagagaaa ccaagacccc cgagtgcccc agccacaccc agcccctggg cgtgttcctg ttccccccca agcccaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacc

配列番号：8
gcccagcccc aggccgaggg cagcctggct aaggccacca cagctcccgc caccaccagg aacaccggca gaggaggcga ggaaaagaaa ggaagcaagg agaaggagga gcaggaggaa agagaaacca agacccccga gtgccccagc cacacccagc ccctgggcgt gttcctgttc ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac c

配列番号：9
MDAMLRGLCC VLLLCGAVFV SPSHA

配列番号：10
atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgcc

配列番号：11
MDAMLRGLCC VLLLCGAVFV SPSHAVPQKP KVSLNPPWNR IFKGENVTLT CNGNNFFEVS STKWFHNGSL SEETNSSLNI VNAKFEDSGE YKCQHQQVNE SEPVYLEVFS DWLLLQASAE VVMEGQPLFL RCHGWRNWDV YKVIYYKDGE ALKYWYENHN ISITNATVED SGTYYCTGKV WQLDYESEPL NITVIKAPRE KYWLQRNTGR GGEEKKGSKE KEEQEERETK TPECPSHTQP LGVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLGK

配列番号：12
atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag aagtactggc tgcagaggaa caccggcaga ggaggcgagg aaaagaaagg aagcaaggag aaggaggagc aggaggaaag agaaaccaag acccccgagt gccccagcca cacccagccc ctgggcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc gaggtgacct gcgtggtcgt ggatgtgagc caggaagatc ccgaagtgca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagaaga gcagttcaac tccacctaca gagtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaaggc ctgcccagct ccatcgagaa gaccatcagc aaagccaaag gccagcccag agaaccccag gtgtacaccc tgcctcccag ccaggaagag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggaaagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagacaac ccctcccgtg ctggatagcg atggcagctt ctttctgtac agcagactga ccgtggacaa gagcagatgg caggaaggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgaag ccctgcacaa ccactacacc cagaagagcc tgtccctgag cctgggcaag

配列番号：13
MDAMLRGLCC VLLLCGAVFV SPSHAVPQKP KVSLNPPWNR IFKGENVTLT CNGNNFFEVS STKWFHNGSL SEETNSSLNI VNAKFEDSGE YKCQHQQVNE SEPVYLEVFS DWLLLQASAE VVMEGQPLFL RCHGWRNWDV YKVIYYKDGE ALKYWYENHN ISITNATVED SGTYYCTGKV WQLDYESEPL NITVIKAPRE KYWLQAQPQA EGSLAKATTA PATTRNTGRG GEEKKGSKEK EEQEERETKT PECPSHTQPL GVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK

配列番号：14
atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag aagtactggc tgcaggccca gccccaggcc gagggcagcc tggctaaggc caccacagct cccgccacca ccaggaacac cggcagagga ggcgaggaaa agaaaggaag caaggagaag gaggagcagg aggaaagaga aaccaagacc cccgagtgcc ccagccacac ccagcccctg ggcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag gtgacctgcg tggtcgtgga tgtgagccag gaagatcccg aagtgcagtt caactggtac gtggatggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaagagca gttcaactcc acctacagag tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtgtccaa caaaggcctg cccagctcca tcgagaagac catcagcaaa gccaaaggcc agcccagaga accccaggtg tacaccctgc ctcccagcca ggaagagatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg aaagcaacgg ccagcccgag aacaattaca agacaacccc tcccgtgctg gatagcgatg gcagcttctt tctgtacagc agactgaccg tggacaagag cagatggcag gaaggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaagccc tgcacaacca ctacacccag aagagcctgt ccctgagcct gggcaag

配列番号：15
MIHTNLKKKF SCCVLVFLLF AVICVWKEKK KGSYYDSFKL QTKEFQVLKS LGKLAMGSDS QSVSSSSTQD PHRGRQTLGS LRGLAKAKPE ASFQVWNKDS SSKNLIPRLQ KIWKNYLSMN KYKVSYKGPG PGIKFSAEAL RCHLRDHVNV SMVEVTDFPF NTSEWEGYLP KESIRTKAGP WGRCAVVSSA GSLKSSQLGR EIDDHDAVLR FNGAPTANFQ QDVGTKTTIR LMNSQLVTTE KRFLKDSLYN EGILIVWDPS VYHSDIPKWY QNPDYNFFNN YKTYRKLHPN QPFYILKPQM PWELWDILQE ISPEEIQPNP PSSGMLGIIImMTLCDQVDI YEFLPSKRKT DVCYYYQKFF DSACTMGAYH PLLYEKNLVK HLNQGTDEDI YLLGKATLPG FRTIHC

配列番号：16
atgatccaca ccaacctgaa gaagaagttc agctgctgcg tgctggtgtt cctgctgttc gccgtgatct gcgtgtggaa ggagaagaag aaaggcagct actacgacag cttcaagctg cagaccaagg agttccaggt gctgaagagc ctgggcaagc tggccatggg cagcgacagc cagagcgtgt ccagctcctc cacccaggat ccccacagag gcagacagac cctgggcagc ctgagaggcc tggccaaggc caagcccgag gccagcttcc aggtgtggaa caaggacagc agcagcaaga acctgatccc cagactgcag aagatctgga agaactacct gagcatgaac aagtacaagg tgagctacaa aggacccgga cccggcatca agttcagcgc cgaggccctg aggtgccacc tgagagacca cgtgaacgtg agcatggtgg aagtgaccga cttccccttc aacaccagcg agtgggaagg ctacctgccc aaggagagca tcaggaccaa ggctggcccc tggggcagat gcgccgtggt gagcagcgct ggcagcctga agagctccca gctgggcaga gagatcgacg accacgatgc cgtgctgagg ttcaatggcg ctcccaccgc caacttccag caggacgtgg gcaccaagac cacaatccgg ctgatgaaca gccagctggt gacaaccgag aagcggttcc tgaaggacag cctgtacaac gagggcatcc tgatcgtgtg ggatcccagc gtgtaccaca gcgacatccc caagtggtac cagaatcccg actacaactt cttcaacaac tacaagacct atagaaagct gcaccccaac cagcccttct acatcctgaa gccccagatg ccctgggagc tgtgggacat cctgcaggag atcagccctg aagagatcca gcccaaccct ccctccagcg gcatgctggg cattatcatc atgatgaccc tgtgcgacca ggtggacatc tacgagttcc tgcccagcaa gagaaagacc gacgtgtgct actactatca gaagttcttc gacagcgcct gcaccatggg cgcctaccac cccctgctgt acgagaagaa cctggtgaag cacctgaacc agggcaccga cgaggacatc tacctgctgg gcaaagccac cctgcccggc ttcagaacca tccactgc

配列番号：17
RNTGRGGEEK KXXKEKEEQE ERETKTPECP

配列番号：18
AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK XXKEKEEQEE RETKTPECP

配列番号：19
RNTGRGGEEK KKEKEKEEQE ERETKTPECP

配列番号：20
VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ RNTGRGGEEK KKEKEKEEQE ERETKTPECP SHTQPLGVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK

配列番号：21
VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ RNTGRGGEEK KGSKEKEEQE ERETKTPECP SHTQPLGVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK

配列番号：22
VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK GSKEKEEQEE RETKTPECPS HTQPLGVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWESngQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK

Claims (7)

1. 有効成分として、
   プロバイオティクス；および
   IgEへの結合能を有するポリペプチド；
   を含む、アレルギー性疾患を治療または予防するための医薬組成物であって、
   プロバイオティクスが、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトコッカス・ラクチス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ロイテリ、およびラクトバチルス・ファーメンタムからなる群から選択されるいずれか1つであり、
   IgEへの結合能を有するポリペプチドが、単量体のそれぞれが、配列番号：1のアミノ酸配列からなるIgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン(FcεRIαECD)を含む2つの単量体を含むポリペプチド二量体であり、
   単量体が、配列番号：2のアミノ酸配列からなる改変Fc領域を含み、
   改変Fc領域およびFcεRIαECDが、ヒンジを介して連結され、
   ヒンジが、Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (配列番号：17)またはAla Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (配列番号：18)であって、
   Xaa1およびXaa3がGlyであり、および
   Xaa2およびXaa4がGlyまたはSerである、免役グロブリンIgDに由来するヒンジ領域の変異体である、ポリペプチドである、医薬組成物。
2. プロバイオティクスが、乾燥粉末の形態である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. アレルギー性疾患が、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎、慢性特発性蕁麻疹、およびアレルギー性接触皮膚炎からなる群から選択されるいずれか1つである、請求項１に記載の医薬組成物。
4. 有効成分として、
   プロバイオティクス；および
   IgEへの結合能を有するポリペプチド；
   を含む、アレルギー症状を改善または緩和するための健康機能性食品組成物であって、
   プロバイオティクスが、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトコッカス・ラクチス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ロイテリ、およびラクトバチルス・ファーメンタムからなる群から選択されるいずれか1つであり、
   IgEへの結合能を有するポリペプチドが、単量体のそれぞれが、配列番号：1のアミノ酸配列からなるIgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン(FcεRIαECD)を含む2つの単量体を含むポリペプチド二量体であり、
   単量体が、配列番号：2のアミノ酸配列からなる改変Fc領域を含み、
   改変Fc領域およびFcεRIαECDが、ヒンジを介して連結され、
   ヒンジが、Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (配列番号：17)またはAla Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (配列番号：18)であって、
   Xaa1およびXaa3がGlyであり、および
   Xaa2およびXaa4がGlyまたはSerである、免役グロブリンIgDに由来するヒンジ領域の変異体である、ポリペプチドである、健康機能性食品組成物。
5. プロバイオティクスを含む第一の組成物；および
   IgEへの結合能を有するポリペプチドを含む第二の組成物；
   を含む、アレルギー性疾患を治療または予防するためのキットであって、
   プロバイオティクスが、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトコッカス・ラクチス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ロイテリ、およびラクトバチルス・ファーメンタムからなる群から選択されるいずれか1つであり、
   IgEへの結合能を有するポリペプチドが、単量体のそれぞれが、配列番号：1のアミノ酸配列からなるIgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン(FcεRIαECD)を含む2つの単量体を含むポリペプチド二量体であり、
   単量体が、配列番号：2のアミノ酸配列からなる改変Fc領域を含み、
   改変Fc領域およびFcεRIαECDが、ヒンジを介して連結され、
   ヒンジが、Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (配列番号：17)またはAla Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (配列番号：18)であって、
   Xaa1およびXaa3がGlyであり、および
   Xaa2およびXaa4がGlyまたはSerである、免役グロブリンIgDに由来するヒンジ領域の変異体である、ポリペプチドである、キット。
6. 第二の組成物が、皮下または静脈内投与用の組成物である、請求項５に記載のキット。
7. プロバイオティクスおよびポリペプチドが、組み合わせて投与される、請求項１に記載の医薬組成物。

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