TW201932129A - 包含益生菌及IgE結合多肽的組成物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明有關一種包含益生菌及具IgE結合能力之多肽作為活性成份的組成物。特別是，在合併投與益生菌與根據本發明之含有IgE Fc受體之α次單元的胞外區域之重組蛋白時，確定了明顯地減少食物過敏之協同作用。相較於習用藥學組成物，本發明之組成物由於在IgE介導的過敏性疾病上能夠表現出卓越的治療作用，因此預期其非常適合產業上之應用。

Description

包含益生菌及IgE結合多肽的組成物及其用途
發明領域
本發明有關一種用於治療或預防過敏性疾病的組成物。
發明背景
食物過敏是一種由非病原食物抗原(過敏原)之免疫抗性降低所引起之疾病。此疾病因飲食上的限制而使得生活品質下降，且在發生急和慢性全身性過敏反應(anaphylaxis)之情況下，可能會有生命危險。過敏性疾病如過敏性關節炎及異位性皮膚炎以及此食物過敏，在工業化及西式現代化社會快速的蔓延。此外，全身性過敏反應，一種嚴重的過敏疾病，之發生亦漸增。此等免疫疾病嚴重地妨害生活品質及社會經濟成本相應的飆升。因此，迫切需要採取措施克服這些疾病。
雖然食物過敏性疾病可能經由IgE介導或非IgE介導的免疫反應形成，但IgE介導的食物過敏最常見。在IgE介導的食物過敏方面，過敏原結合IgE，而過敏原結合的IgE交聯作用細胞如肥大細胞及嗜鹼性球上的FcεRI，一種高親和性IgE Fc受體，從而誘導作用細胞的活化。在作用細胞活化之情況下，會釋出調節物質，從而引起立即的過敏反應。除了食物過敏性疾病之外，大部分的過敏性疾病是因免疫球蛋白E (IgE)過度的免疫反應引起。IgE是一種抗體，其在一般情況下以極低的濃度存在於血清中。IgE亦由無害的抗原產生。可在IgE的數量無任何特定刺激而增加之情況下引起過敏。數量異常增加的IgE會結合在肥大細胞、嗜鹼性球等表面上表達之高親和性IgE Fc受體(FcεRI)。
IgE與IgE Fc受體間之此結合導致肥大細胞或嗜鹼性球釋出化學介導物，如組織胺、白三烯、前列腺素、 緩激肽及血小板活性因子。肥大細胞或嗜鹼性球中此等化學介導物的釋出，導致過敏症狀。特別是，當IgE與FcεRI彼此結合時會表現出過敏症狀惡化。已知FcεRI表達細胞在過敏病患中會增加。
已經有很多方法被提出來用於治療過敏性疾病，例如避開過敏原、投與抗過敏藥物、調整體內IgE的合成及開發抗IgE抗體。然而，此等療法具有許多的缺點，如無法治療過敏的根本病因、 藥效不足及嚴重副作用的發生。
同時，為治療或緩解過敏性疾病之目的，已經有研究使用微生物如乳酸菌之方法。此保健的微生物稱作益生菌。然而，發現與評估益生菌之免疫控制，像是過敏抑制的技術還未建立。特別是，在益生菌之根本作用機制上的研究不足，且大部分的研究是在體外進行。換句話說，雖然益生菌是口服攝入，但目前為止大部分的研究著重在使用細胞株之體外實驗，且此等實驗方法具有一個很大的缺點，即其不可能替代在人攝入益生菌的情況下可能表現出來的功能研究。
此外，已研究出用於治療過敏性疾病之免疫球蛋白組成物。此組成物據報導可用於治療IgE介導的病症，包括過敏及氣喘(KR10-1783272B1)。特別是，奧馬珠單抗(omalizumab) (商品名：Xolair)，其會標靶IgE抗體之Fc部分，已開發用作為頑固性重症氣喘及頑固性蕁麻疹之治療劑。然而，為維持療效需投與高劑量的奥馬珠單抗。因此，據報導奥馬珠單抗有高成本負擔以及諸如血管性水腫及全身性過敏反應之副作用(The Journal of Clinical Investigation Volume 99, Number 5, March 1997, 915-925)。
雖然奥馬珠單抗引起副作用的根本機制還未確定，但可以預期奥馬珠單抗是一種IgG1抗體。標靶小鼠模型之研究顯示出，許多抗原專一性IgG1抗體在抗原豐富的環境下，可能透過FcγRIII，一種低親和性IgG受體，及血小板活化因子而引起被動全身性過敏反應(PSA)。此外，此IgG介導的全身性過敏反應之發生由於沒有FcεRI訊號而放大。因此，當於患有表現高位準的IgE之過敏性疾病的病患中注射大量的奥馬珠單抗之情況時，可能引起被動全身性過敏反應。近來，據報導，FcγRIIA，一種在人體內表達之低親和性IgG受體，亦與IgG介導的全身性過敏反應有關。此外，上市後之研究已有諸如過敏性肉芽腫血管炎及特發性血小板減少之異常反應的報告。
技術問題
雖然已經進行了許多有關過敏性疾病的研究，但目前為止仍未開發出可顯著地改善過敏性疾病之方法。本發明之一目的是提供一種用於治療或預防此過敏性疾病之組成物。
解決問題之方法
根據本發明之一態樣，提供一種包含益生菌及具IgE結合能力之多肽作為活性成份之組成物。
在另一態樣中，提供一種用於治療或預防過敏性疾病之藥學組成物，其包含該組成物作為活性成份。在又一態樣中，提供一種用於改善或緩解過敏症狀之保健功能食品組成物，其包含該組成物作為活性成份。
在又另一態樣中，提供一種用於治療或預防過敏性疾病之套組，其包含一第一組成物，其含有益生菌；及一第二組成物，其含有具IgE結合能力之多肽。
本發明之有利效果
根據本發明之包含益生菌及具IgE結合能力之多肽作為活性成份之組成物，在活體內表現出改善過敏的優異效果。因此，該組成物可用作為用於治療或預防重度過敏性疾病之藥學組成物。再者，從本發明之組成物可應用於口服免疫療法之觀點，該組成物不僅對食物過敏更有效，同時可減少副作用，且亦適合用於治療患有IgE介導的過敏之兒童。因此，該組成物可用作為用於改善或緩解過敏症狀之保健功能食品。
本發明之詳細說明
在本發明之一態樣中，提供一種包含益生菌及具IgE結合能力之多肽作為活性成份之組成物。
本文中所使用之術語"益生菌"統指在適量攝取的情況下對人體有益的微生物，意指對人體有益的細菌。益生菌可為乳酸菌或雙歧桿菌。乳酸菌統稱會將糖發酵成乳酸之細菌。大多數腸道有益細菌被歸類為乳酸菌，乳酸菌會分解糖，其50%或更多產生乳酸。
乳酸菌可為選自於由下列所構成之群組中之任一者：乳酸桿菌屬(Lactobacillus )、乳酸乳球菌屬(Lactococcus )、腸球菌屬(Enterococcus )及鏈球菌屬(Streptococcus )。具體地，乳酸桿菌屬可為選自於由下列所構成之群組中之任一者：嗜酸乳酸桿菌(L. acidophilus )、乾酪乳酸桿菌(L. casei )、加氏乳酸桿菌(L. gasseri )、德布律克氏乳酸菌保加利亞種(L. delbrueckii ssp. bulgaricus )、瑞士乳酸桿菌(L. helveticus )、發酵乳酸桿菌(L. fermentum )、副乾酪乳桿菌(L. paracasei )、胚芽乳酸桿菌(L. plantarum )、羅伊氏乳酸桿菌(L. reuteri )、鼠李糖乳酸桿菌(L. rhamnosus )、戊糖乳酸桿菌(L. pentosus )及涶液乳酸桿菌(L. salivarius )。此外，該乳酸乳球菌屬可為乳酸乳球菌(Lc. lactis )，及鏈球菌屬可為嗜熱鏈球菌(S. themophilus )。此外，雙歧桿菌可為選自於由下列所構成之群組中之任一者：兩歧雙歧桿菌(B.bifidum )、短雙歧桿菌(B.breve )、長雙歧桿菌(B. longum )及動物雙歧桿菌乳酸亞種(B.animalis ssp. lactis )。
較佳地，該益生菌可為乾酪乳酸桿菌或長雙歧桿菌。特別是，長雙歧桿菌可為登錄號：KACC 91563 (KR10-1778734B1)。特別地，KACC 91563菌株會標靶肥大細胞，其是過敏反應中很重要的細胞，因此可用作為治療過敏的乳酸菌。通常，益生菌可以活菌的形式使用，其中活菌可為凍乾的形式。此外，益生菌可以死菌的形式使用。
在本文中使用之術語"具IgE結合能力之多肽"意指能夠結合IgE之多肽。在此使用之術語"IgE"意指稱作免疫球蛋白E之抗體蛋白。IgE對肥大細胞、血液嗜鹼性球等等具有親和力。此外，IgE抗體與其對應的抗原(過敏原)之間的反應會引起發炎反應。此外，IgE已知為會引起全身性過敏反應之抗體。
具體地，該具IgE結合能力之多肽可為包括下列之重組蛋白中之任一種：抗IgE抗體、IgE Fc受體、IgE Fc受體之α次單元的胞外區域、IgE Fc受體之α次單元的胞外區域片段之片段及IgE Fc受體之α次單元的胞外區域或其片段。
在此，該抗IgE抗體意指能夠辨識作為抗原之IgE且結合IgE之抗體。在此，抗IgE抗體之片段可為選自於由下列所構成之群組中之任一者：Fab、scFv、F(ab)2 及Fv，只要該片段可結合至IgE即可。抗體片段意指排除可結晶區域(Fc區)之抗原結合區域，可結晶區域會進行將與抗原結合之刺激傳送至細胞或補體的功能(效應功能)。該抗IgE抗體之一實施例可為奧馬珠單抗。
本文中所使用之術語"IgE Fc受體"亦稱作Fcε受體，且會結合IgE之Fc部分。受體有二種類型。具高IgE Fc親和力之受體稱作Fcε受體I (FcεRI)。具低IgE Fc親和力之受體稱作Fcε受體II (FcεRII)。FcεRI在肥大細胞及嗜鹼性球中表達。在IgE抗體與FcεRI之結合是經由多價抗原交聯之情況下，肥大細胞或嗜鹼性球會發生去顆粒反應，從而釋出各種化學傳遞物質，包括組織胺。此釋出會引起立即的過敏反應。
FcεRI是一種由一個α鏈、一個β鏈及二個以雙硫鍵連接之γ鏈構成的膜蛋白。此等鏈中，IgE結合的部分是α鏈(FcεRIα)，且FcεRIα具有約60kDa之大小。FcεRIα由存在於細胞膜內側之疏水性區域及存在於細胞膜外側之親水性區域構成。特別是，IgE會結合至α鏈的胞外區域。
具體地，IgE Fc受體之α次單元可具有NP_001992.1中所述之胺基酸序列。此外，IgE Fc受體之α次單元的胞外區域(FcεRIa-ECD)可具有序列辨識編號：1之胺基酸序列。在本說明書中，該IgE Fc受體之α次單元的胞外區域可為IgE Fc受體之α次單元的胞外區域的片段或變體，只要該片段或變體能夠結合IgE即可。
該變體可透過於野生型FcεIaECD (胞外區域)中取代、刪除或加入一或多種蛋白之方法產生，只要該方法不會改變FcεRI之α鏈的功能即可。此各種蛋白或胜肽可與序列辨識編號：1之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的一致性。此外，序列辨識編號：1之FcεRIaECD可由具有序列辨識編號：5之多核苷酸編碼。
因此，該IgE Fc受體之α次單元的胞外區域本身或IgE Fc受體之α次單元的胞外區域的片段可用作為具IgE結合能力之多肽。該胞外區域之片段之實施例可為其中刪除該IgE Fc受體之α次單元的胞外區域之N端處的一些胺基酸之形式。在一實施例中，該胞外區域之片段可為其中刪除N端處的1至30個胺基酸之片段。此外，該胞外區域之片段可為其中刪除N端處的5至25個胺基酸之片段。此外，該胞外區域之片段可為其中刪除N端處的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸之片段。此外，該胞外區域之片段可為其中刪除該IgE Fc受體之α次單元的胞外區域之C端處的一些胺基酸之形式。在一實施例中，該胞外區域之片段可為其中刪除C端處的1至30個胺基酸之片段。此外，該胞外區域之片段可為其中刪除C端處的5至25個胺基酸之片段。此外，該胞外區域之片段可為其中刪除C端處的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸之片段。此外，該胞外區域之片段可為其中刪除該IgE Fc受體之α次單元的胞外區域之N端及C端處的一些胺基酸之形式。在一實施例中，該胞外區域之片段可為其中刪除N端及C端處的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸之形式。
然而，野生型IgE受體之α次單元的胞外區域或其片段在體內的持續性很差。為了改良這個，可透過各種方法修飾IgE受體之α次單元的胞外區域或其片段。修飾方法之一實施例可為結合聚乙二醇(PEG)。修飾方法之另一實施例可為結合免疫球蛋白之Fc區。在此，除了天然形式的免疫球蛋白Fc外，可使用修飾的Fc區。
此外，本文中所使用之術語"修飾的Fc區"意指其中抗體之Fc部分的一部分經過修飾之區。在此，術語"Fc區"意指含有免疫球蛋白之重鏈恆定區2 (CH2)及重鏈恆定區3 (CH3)，但不含免疫球蛋白之重鏈與輕鏈之可變區與輕鏈恆定區1 (CH1)之部分。特別是，該修飾的Fc區意指通過取代Fc區中之一些胺基酸或通過結合不同類型的Fc區而獲得之區。具體地，該修飾的Fc區可具有序列辨識編號：2之胺基酸序列。此外，具有序列辨識編號：2之修飾的Fc區，可由具有序列辨識編號：6之序列的多核苷酸編碼。
此外，本發明之修飾的Fc區可為具有天然形式的糖鏈、相對於天然形式糖鏈增加或相對於天然形式糖鏈減少之形式，或可為去除糖鏈之形式。免疫球蛋白Fc糖鏈可通過習用方法，如化學方法、酵素方法及使用微生物之基因工程方法修飾。
在此，本發明之修飾的Fc區由於沒有FcγR或C1q之結合位置，可為無抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)功能之區。
此外，該FcεRIα-ECD或其片段可透過一連接子連接至野生型Fc區或修飾的Fc區。該連接子可由20至60個連續胺基酸、25至50個連續胺基酸或30至40個胺基酸構成。在一實施例中，該連接子可由30或49個胺基酸構成，如下文所述。且，該連接子可含有至少1個半胱胺酸。具體地，該連接子可含有1個、2個或3個半胱胺酸。較佳地，該連接子含有1個半胱胺酸。在一實施例中，該連接子可為從IgD抗體衍生而來之鉸鏈區。此外，該連接子可為通過修飾IgD抗體之鉸鏈區獲得之鉸鏈變體。為了使蛋白生產過程期間截短型的產生最小化，該鉸鏈變體可通過修飾IgD抗體中之一些鉸鏈序列獲得。
在一實施例中，該鉸鏈可含有下列序列：
Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (序列辨識編號：17)，其中Xaa1可為Lys或Gly，而Xaa2可為Glu、Gly或Ser。具體地，該連接子可具有序列辨識編號：3及序列辨識編號：19之胺基酸序列，從而使蛋白生產過程期間截短型的產生最小化。
在另一實施例中，該鉸鏈可含有下列序列：
Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (序列辨識編號：18)，其中Xaa3可為Lys或Gly，而Xaa4可為Glu、Gly或Ser。具體地，該連接子可具有序列辨識編號：4之胺基酸序列，從而使蛋白生產過程期間截短型的產生最小化。
特別是，在具有序列辨識編號：4之連接子中，至少一個Thr可為糖基化的。具體地，在序列辨識編號：18之胺基酸中，第13個、第14個、第18個或第19個Thr可為糖基化的。較佳地，全部四個胺基酸均為糖基化的。在此，糖基化可為O糖基化的。
IgETRAP ，其是本發明之具IgE結合能力之多肽之一實施例，意指FcεRIα胞外區域與IgD/IgG4雜交Fc區域之Fc融合蛋白。IgE Fc受體FcεR由α鏈、β鏈及二個以雙硫鍵連接之一樣的γ鏈構成。FcεRIβ及FcεRIγ沒有胞外區域。然而，FcεRIα具有二個胞外免疫球蛋白相關區域，且涉及IgE結合。因此，為了產生更安全及有效的IgE抑制劑，將人FcεRIα胞外區域連接至人IgD/IgG4雜交Fc區域(圖1及2)以產生IgETRAP 。與奥馬珠單抗不同，IgETRAP 不會結合至IgG受體且可能降低IgG介導的全身性過敏反應之風險(圖9至13)。此外，IgETRAP 具有比奥馬珠單抗高69倍之IgE親和力。因此，作為食物過敏治療劑，IgETRAP 會比奥馬珠單抗更安全有效。
具IgE結合能力之多肽之作用為阻斷作用細胞上FcεRIα與IgE間的結合。人IgD/IgG4雜交Fc含有上面IgD之CH2區域及下面IgG4之CH2與CH3區域，其不具FcγR或C1q之結合位置(圖1)。然而，此雜交Fc可具有新生兒Fc受體之結合位置(圖1)。此外，同源二聚型之IgETRAP 的理論分子量為約97.6kDa。然而，由於糖基化，其實際分子量為約150kDa (圖6)。
相較於習用的抗IgE抗體，根據本發明之多肽二聚蛋白不僅在體內具有極佳的安全性及持續性，且由於具有IgE結合能力比習用抗IgE抗體，奧馬珠單抗，大70倍，所以會與IgE強力結合，此容許延長投藥周期。此外，根據本發明之多肽二聚蛋白是一種通過採用修飾的Fc獲得之物質，其僅以IgE作為單一標靶，不會結合至Fcγ受體，因此沒有抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)之功能。因此，不同於含有IgG1 Fc區之習用抗IgE抗體，該多肽二聚蛋白不會結合至Fcγ受體，因此可抑制因結合至肥大細胞表面上之Fcγ受體而引起之介導物的釋出。因此，本發明之具IgE結合能力之多肽可使諸如因IgG1與肥大細胞上之Fcγ受體III間之結合而導致全身性過敏反應之嚴重副作用的發生減低至最小程度。據此，根據本發明之多肽二聚蛋白可用作為取代含有習用抗IgE抗體之治療劑之新的藥學組成物。
此外，本發明提供之具IgE結合能力之多肽的實施例可為單體之形式。特別是，在使用的連接子中沒有半胱胺酸之情況下，該多肽可為單體形式。
此外，本發明所提供之具IgE結合能力之多肽之一實施例可為多肽二聚體。在此，如上所述，該多肽二聚體可為其中二個單體彼此結合且各單體是通過IgE Fc受體之α次單元的胞外區域與修飾的Fc區之間的結合而獲得之形式。該多肽二聚體可為其中相同的二個單體彼此通過位在連接位置處之半胱胺酸結合之形式。此外，該多肽二聚體可為其中二個不同的單體彼此結合之形式。例如，在該二個單體彼此不同之情況下，該多肽二聚體可為其中一個單體含有IgE Fc受體之α次單元的胞外區域，而另一個單體含有IgE Fc受體之α次單元的胞外區域之片段之形式。在此，該單體之實施例可具有序列辨識編號：20、序列辨識編號：21或序列辨識編號：22之胺基酸序列。
在本發明之另一態樣中，提供一種用於治療或預防過敏性疾病之藥學組成物，其包含含有益生菌及具IgE結合能力之多肽作為活性成份之組成物。
該益生菌及具IgE結合能力之多肽如以上所述。可適當地決定該組成物中該益生菌與該具IgE結合能力之多肽的混合數量。在一實施例中，該組成物中該益生菌之含量可為1x105 cfu至1x1012 cfu。選擇性地，該組成物中該益生菌之含量可為1x106 cfu至1x1011 cfu、1x107 cfu至1x1010 cfu或1x109 cfu至5x109 cfu。此外，該具IgE結合能力之多肽之含量可為，但不限於，0.1ug至5mg、0.5ug至1mg、1ug至500ug、10ug至400ug或200ug至300ug。此外，可適當地改變該組成物中該益生菌與該具IgE結合能力之多肽的混合比例。
在本說明書中，"過敏性疾病"意指由肥大細胞活化作用，如肥大細胞去顆粒反應介導之過敏反應引起的病理症狀。此過敏性疾病包括食物過敏、異位性皮膚炎、氣喘、過敏性關節炎、過敏性結膜炎、過敏性皮膚炎、過敏性接觸性皮膚炎、全身性過敏反應、蕁麻疹、昆蟲過敏、慢性自發性蕁麻疹、藥物過敏等等。特別是，該過敏性疾病可為IgE介導的。
在本發明之一實施例中，含有FcεRIα胞外區域之具IgE結合能力之多肽，透過其與IgE的結合阻斷IgE結合至作用細胞上的FcεRI，因此可稱作IgETRAP 。此外，確定了長雙歧桿菌可改善IgETRAP 之治療效果及顯著地降低治療所需的IgETRAP 劑量。
在本發明之用於治療或預防過敏性疾病之組成物中，可視用途、配方、摻合目的等等而包含任何數量的活性成份(有效量)，只要該活性成份可表現出抗過敏活性即可。以該組成物之重量計，該活性成份一般的有效量測定在0.001重量%至20.0重量%之範圍內。在此，"有效量"意指活性成份能夠誘導抗過敏作用之數量。此一有效量可由熟悉此技術領域之人士實驗決定。
在此，該藥學組成物可進一步含有一藥學上可接受之載劑。對於該藥學上可接受之載劑，可使用任何的載劑，只要該載劑為適合遞送給病患之無毒物質即可。可包含蒸餾水、酒精、脂肪、蠟及惰性固體作為載劑。在該藥學組成物中亦可包含藥學上可接受之佐劑(緩衝液及分散劑)。特別是，可使用任何的藥學上可接受之配方，只要該益生菌及該具IgE結合能力之多肽在該配方中可維持其等之安定性即可。
具體地，除了活性成份外，本發明之藥學組成物亦含有一藥學上可接受之載劑，且可視投藥途徑，以此技術領域中已知之慣用方法製成口服或非口服配方。在此，術語"藥學上可接受"意指具有不超過施用(處方)的受試者可接受之毒性且不會抑制活性成份之活性。
在本發明之藥學組成物是製成口服配方之情況，可依照此技術領域中已知之方法，將該藥學組成物與適合的載劑配在一起製成如粉劑、顆粒、錠劑、丸劑、糖衣錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、懸浮液及薄片之配方。在此，適合的藥學上可接受之載劑的例子可包括糖類，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、右旋糖、山梨糖醇、甘露糖及木糖醇；澱粉類，如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉及小麥澱粉；纖維素類，如纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉及羥丙基甲基纖維素；聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、硬脂酸鎂、礦物油、麥芽、明膠、滑石、多元醇、植物油等等。在製成製劑之情況，必要時，該製劑可透過包括稀釋劑和/或賦形劑，如填料、增量劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑及界面活性劑進行。
在本發明之藥學組成物是製成非口服配方之情況，可依照此技術領域已知之方法，將該藥學組成物與適合的載劑一起製成注射劑、穿皮藥物、鼻吸入劑及栓劑形式之製劑。在製成注射劑之情況，可使用無菌水、乙醇、多元醇，如甘油及丙二醇，或其混合物作為適合的載劑。至於該載劑，較佳地可使用等張溶液，如林格氏溶液、含三乙醇胺之磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)、注射用無菌水及5%右旋糖等等。
該藥學組成物之製備是此技術領域已知的，具體地可參考Remington's Pharmaceutical Sciences (第19版，1995)等等。該文獻視為本發明之一部分。
本發明之藥學組成物的較佳每日劑量範圍從0.01ug/kg至10g/kg，較佳地從0.01mg/kg至1g/kg，取決於患者的狀況、體重、性別、年齡、疾病嚴重性或投藥途徑。一天可投藥一次或數次。此一劑量決不應被解釋為本發明之範圍的限制。
本發明之組成物可施用(處方)之受試者為哺乳動物及人，人是最適合的。除了該活性成份外，本發明之用於抗過敏的組成物可進一步包含安全性已經過認證且已知具有抗過敏活性之任何的化合物或天然萃取物，目的用於提升及強化抗過敏活性。在此該藥學組成物可進一步包含從長雙歧桿菌KACC 91563中單離出來的胞外內質網。
在本發明之又另一態樣中，提供一種用於改善或緩解過敏症狀之保健功能性食品組成物，其包含含有益生菌及具IgE結合能力之多肽作為活性成份之組成物。在此，該食品組成物可進一步包含從長雙歧桿菌KACC 91563單離出來的胞外內質網作為活性成份。
同時，本發明之食品組成物可進一步包含營養學上可接受的載劑。此外，該食品組成物可與另一食品或食品成份一起使用，且可適當地根據習用之方法使用。活性成份之混合量可適當地依照其預定用途(預防、保健或治療處理)決定。
食品之類型沒有特別限制。該食品之例子包括肉類、香腸、麵包、巧克力、糖果、零食、糖果甜點、乳製品，包括冰淇淋、各種湯品、軟飲料、茶、飲料、酒精飲料和維生素複合物。包括傳統意義上之所有的功能性保健食品。可添加上述物質的食品，含有一般在製造期間添加的成份，且該成份之例子包括蛋白、碳水化合物、脂肪、營養素、調味劑及調味料。以上提及的碳水化合物是典型的糖類，例如，單糖類，如葡萄糖及果糖；雙糖類，如麥芽糖及蔗糖；及多糖類，如糊精及環糊精；及糖醇類，如木糖醇、山梨糖醇及赤藻糖醇。可使用諸如索馬甜及甜菊萃取物之天然調味劑，諸如糖精及阿斯巴甜之合成調味劑或相似物作為調味劑。
例如，在本發明之食品組成物製成飲料之情況，除了本發明之組成物外，可進一步包含檸檬酸、液態果糖、糖、葡萄糖、醋酸、蘋果酸、果汁、萃取物等等。
除了以上之外，本發明之組成物可含有各種營養素、維生素、電解質、香料、著色劑、果膠酸及其鹽類、海藻酸及其鹽類、有機酸、保護膠體增稠劑、pH調整劑、安定劑、防腐劑、甘油、酒精、碳酸飲料中使用之碳酸化劑等等。此外，本發明之組成物可含有用於生產果汁及蔬菜飲料之果肉。此等成份可單獨或混合使用。
此外，本發明之食品組成物可歸在任何合法的產品類別或功能分類，只要該食品組成物在製造及分銷時符合執法規定即可。例如，該食品組成物可為根據保健功能食品法之保健功能性食品，或屬於根據食品衛生法之食品法典(食品藥品管理局通報的食品標準和規範)中的每種食品類型之糖果甜點、豆類、茶、飲料、特殊用途食品等。至於其它可包含在本發明之食品組成物中之食品添加物，可參考根據食品衛生法之食品法典或食品添加物法典落在任何產品類。
在本發明之又另一態樣中，提供一種用於治療或預防過敏性疾病之套組，其包含一第一組成物，其含有益生菌；及一第二組成物，其含有具IgE結合能力之多肽。在此，該第二組成物可為供皮下或靜脈投與之組成物。
在本發明之又另一態樣中，提供一種用於治療或預防過敏性疾病之方法，其包含投與益生菌之步驟；及投與具IgE結合能力之多肽之步驟。
該益生菌如上所述，且可口服投與。在此，該具IgE結合能力之多肽可口服投與，且可非口服投與。在此，非口服投與可通過諸如皮下投與、靜脈投與、黏膜投與等等之方法進行。
在小鼠食物過敏模型中，已顯示出IgETRAP 不僅會降低游離IgE位準，亦會減少肥大細胞的數量，從而緩解食物過敏症狀(圖21至26)。由IgETRAP 引起的肥大細胞之數量的減少，預期是由於IgE通過增加肥大細胞的存活率來增加肥大細胞的數量。此外，小腸中杯狀細胞的過度增生顯著地受到單獨投與IgETRAP 及長雙歧桿菌的抑制，且甚至進一步受到同時合併投與之抑制(圖23至26)。因為Th2細胞激素如IL-13已知會引起杯狀細胞的過度增生，所以預期IgETRAP 、長雙歧桿菌及其組合會緩和小腸中Th2細胞激素之環境。以下支持了此預期：IgETRAP 及長雙歧桿菌顯示出減少mRNA表達IL-33之傾向，其中IL-33涉及通過活化第II型固有淋巴细胞(ILC2s)而促進小腸中IL-13的分泌；及其組合以更有效的方式顯著地減少IL-33之表達(圖28)。此外，IL-33不僅在IgE活化的肥大細胞中分泌，且亦會促進肥大細胞之去顆粒反應。因此，IL-33與食物過敏的嚴重程度密切相關。此表明IgETRAP 和長雙歧桿菌可以通過各種機制改善食物過敏症狀。
據先前之報導，長雙歧桿菌會引起肥大細胞之細胞凋亡以及改善食物過敏症狀，其與本發明人之結果相符。然而，每天投與長雙歧桿菌來治療食物過敏的效果低於單獨投與IgETRAP 。然而，長雙歧桿菌顯著地改善IgETRAP 之治療效果(圖18)，而IgETRAP 與長雙歧桿菌之結合使用表現出相當於單獨投與IgETRAP 所獲得之治療效果的10倍(圖19B)。此外，據報導，一些腸道細菌可藉由增加Treg細胞或減少IgE與Th2細胞激素位準來改善過敏疾病。因此，除了長雙歧桿菌以外，預期其它益生菌亦能夠改善IgETRAP 之治療效果。的確，合併投與各種類型之益生菌與IgETRAP 時，確實表現出提高的治療效果(圖29至34)。
在本發明之又另一態樣中，提供一種用於治療或預防過敏性疾病之方法，其包含對一個體投與該具IgE結合能力之多肽與該益生菌之組合。該個體可為哺乳動物，較佳地人。在此，投藥可以口服或非口服方式達成。在此，可將該具IgE結合能力之多肽與該益生菌製成適合口服投與的配方。此外，非口服投與可通過如皮下投與、靜脈投與、黏膜投與及肌肉投與之方法進行。
本發明之詳細說明
於下文中，將參考下列範例詳細說明本發明。然而，下列範例僅旨在說明本發明，本發明之範疇不僅限於此。
材料與方法
IgETRAP 細胞株之建構及其純化
將FcεRIα胞外區域之C端(第26個至第205個)連接至IgD/IgG4雜交Fc區域之N端(IgD，第133個至第170個；IgG4，第121個至327個)，建構IgETRAP 之核苷酸序列。於二氫葉酸還原酶缺失之中國倉鼠卵巢DG44細胞中表達該蛋白。使用HiTrap rProtein A FF管柱(GE Healthcare)純化IgETRAP ，然後使用SDS-PAGE，在還原及非還原條件下鑑定其純度。
3D 結構模擬
以蛋白資料庫中之FcεRIα (PDB登錄號1F6A)及IgD/IgG4 Fc (PDB登錄號1ADQ)的資訊為基礎，使用WinCoot設計以及PyMOL軟體建立IgETRAP 之結構模型。
表面電漿子共振(SPR) 分析
使用ProteOn XPR36 (Bio-Rad)裝置進行SPR分析。使用動力學分析鑑定奥馬珠單抗及IgETRAP 對人IgE (Calbiochem)之結合程度。將850反應單位(RUs)之配製於醋酸鹽緩衝液(pH 5.5)中之奥馬珠單抗及500反應單位之配製於醋酸鹽緩衝液(pH 4.0)中之IgETRAP 固定在ProteOn™ GLC感測晶片(Bio-Rad)上。使用含有Tween-20之PBS作為電泳緩衝液，將流速設定在30ul/min。使用ProteOn Manager軟體(Bio-Rad)分析各數據之圖表。
生物膜干涉技術 (BLI) 分析
使用Octet RED384系統(Pall ForteBio, CA, USA)鑑定IgETRAP 及奥馬珠單抗對IgG受體之結合程度。將已稀釋於300mM醋酸鹽緩衝液(pH 5)中之FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA及FcγRIIIB 重組蛋白(R & D Systems Inc., 5 μg/ml)固定在經400mM EDC與10mM 硫-NHS之組合激活的胺反應性第2代(AR2G)生物感測器上。之後，分別測量與各濃度下的IgETRAP 及奥馬珠單抗之結合及解離，歷時300秒。在此，使用的動力學緩衝液是含有0.1% Tween-20及1%牛血清之PBS，且全部的實驗均在30°C下，以1,000rpm速率之樣本盤振盪器進行。
β- 己糖胺酶釋出分析
將骨髓來源肥大細胞(BMMCs)培養於37°C 下，含有10%熱去活性的FBS、10ng/mL小鼠IL-3 (PeproTech, Inc.)及50ng/mL小鼠SCF (PeproTech, Inc.)之RPMI中。分析前，在室溫下培育1ug/mL之抗二硝苯IgE (Sigma-Aldrich)及各濃度的IgETRAP 30分鐘。將該骨髓來源肥大細胞培育於抗二硝苯IgE (Sigma-Aldrich)及IgETRAP 之混合物中，37°C下30分鐘，然後於其中加入0.1μg/ml的抗二硝苯IgE。產物再次於37°C下培育30分鐘。收集培養上清液，並在37°C下，以3mM對硝苯基-N-乙醯基-β-D-葡萄胺糖苷培育20分鐘。添加0.1M碳酸鈉緩衝液(pH 10)以終止反應，然後測量在405nm下之吸收度。通過與用0.1% Triton X-100中溶解之BMMCs的總胞內含量比較，計算釋出的β-己糖胺酶之比率。
食物過敏誘發及投與長雙歧桿菌
在第0天及第14天，經腹膜於小鼠中投與50 ug之OVA (第V級；Sigma-Aldrich)及1mg之硫酸鋁鉀佐劑(Sigma-Aldrich)。14天後，以2天之間隔，對該小鼠口服投與50mg之OVA (第III級；Sigma-Aldrich) 5次。在口服投與OVA前，令該小鼠禁食約4至5個小時。OVA接種後，評估腹瀉之發生達1個小時。將長雙歧桿菌凍乾，並以3×109 cfu/g之濃度與粉末狀小鼠飼料混合。容許小鼠隨意取得飼料。為了維持新鮮度，每2至3天更換混合長雙歧桿菌之小鼠飼料。
組織學
用4%三聚甲醛固定小腸之空腸，然後埋到石蠟中製成蠟塊。之後，製作石蠟切片。將切片脫蠟，用萘酚AS-D氯醋酸酯酶套組(Sigma-Aldrich)染肥大細胞。對於杯狀細胞，切片用過碘酸-Schiff染色套組(ScyTek Laboratories, Inc.)染色。使用Pannoramic MIDI (3D HISTECH Ltd.)拍攝染色切片之影像。
ELISA
使用小鼠總IgE ELISA套組(BioLegend)及MCPT-1 ELISA套組(Invitrogen)，依照製造商的操作手冊測量小鼠血清中之IgE及MCPT-1的總濃度。為了測量游離IgE，用1mg/mL之IgETRAP 塗佈該盤，令其在4°C下反應一整夜。剩下的分析依照小鼠總IgE ELISA套組之製造商的操作手冊進行。
統計分析
全部的數據均使用GraphPad Prism 5軟體(GraphPad Software Inc.)進行統計分析。使用Kaplan-Meier存活曲線分析與對數等級檢定(Mantel-Cox)分析計算腹瀉的發生。使用單因子變異數分析(One-way ANOVA)與Newman-Keuls多重比較，鑑定檢定中有意義的差異。
I. IgETRAP 之製備及表徵
範例1 ，含FcεRIα-ECD 及修飾的Fc 區之多肽的製備
IgE Fc受體之α次單元的胞外區域(FcεRIα-ECD)之C端修飾的多肽，依照美國專利案第7,867,491號中所揭示之方法製備。
首先，製備含有序列辨識編號：1之胺基酸序列之FcεRI之α鏈的胞外區域及序列辨識編號：2之修飾的免疫球蛋白Fc之融合蛋白。具體地，為了表達分別透過序列辨識編號：19之鉸鏈、序列辨識編號：3之鉸鏈及序列辨識編號：4之絞鏈連接之蛋白(FcεRIαECD-Fc1)、蛋白(FcεRIαECD-Fc2)及蛋白(FcεR1αECD-Fc3)，將連接編碼各蛋白之基因所獲得的盒選殖進入pAD15載體(Genexin, Inc.)中，建構FcεRIαECD-Fc蛋白表達載體。之後，將各表達載體轉染進入CHO DG44細胞(來自Dr. Chasin, Columbia University, USA)中。
在此，在轉染進入細胞株之時，同時將通過選殖α-2,6-涶液酸轉移酶基因進入pCI Hygro載體(Invitrogen)所獲得之表達載體，轉染進入分開製備之能夠表達FcεRIαECD-Fc2ST及FcεRIαECD-Fc3ST蛋白(其中加入涶液酸)的細胞株中。
使用無5-羥色胺(HT)10%dFBS培養基(Gibco, USA, 30067-334)、MEMα培養基(Gibco, 12561, USA, Cat No. 12561-049)及HT+培養基(Gibco, USA, 11067-030)進行HT選擇，作為主要篩選程序。之後，使用HT選擇的選殖株進行胺甲喋呤(MTX)擴增，以便放大使用二氫葉酸還原酶(DHFR)系統之產率。
在MTX擴增完成後，進行繼代培養約1至5次 以穩定細胞，供產率之評估。之後，進行MTX擴增的細胞之單位產率的評估。結果顯示於下表1中。


［表1］
如表1所示，FcεRIαECD-Fc3細胞株在2μM胺甲喋呤擴增後，表現出16.9ug/106 個細胞之產率。另一方面，與2,6-涶液酸轉移酶共轉染之FcεRIαECD-Fc3細胞株(FcεRIαECD-Fc3ST)，在1μM胺甲喋呤擴增後，表現出17.5ug/106 個細胞之產率。此外，FcεRIαECD-Fc2細胞株在0.5μM胺甲喋呤擴增下表現出20.9ug/106 個細胞之產率。此外，與2,6-涶液酸轉移酶共轉染之FcεRIαECD-Fc2細胞株(FcεRIαECD-Fc2ST)，在0.1μM胺甲喋呤擴增後，表現出25.1μg/106 個細胞之產率。即，確定了與2,6-涶液酸轉移酶共轉染之FcεRIαECD-Fc2細胞株，其已經過在0.1μM胺甲喋呤擴增條件下之選擇，表現出最好的產率。
範例2 ，FcεRIαECD 融合蛋白之純化及其純度之鑑定
利用批次培養方法，以60ml的規模培養以上範例1中所選擇的細胞株i)FcεRIαECD-Fc3、ii) FcεRIαECD-Fc3ST及iii) FcεRIαECD-Fc2ST。使用蛋白A親和性管柱純化所產生的培養物，然後對純化的蛋白進行SDS-PAGE及粒徑篩析HPLC (SE-HPLC)之處理，以鑑定蛋白之純度。
如圖3A及3B所示，所有各別通過SE-HPLC方法純化之蛋白經鑑定均具有93%或更高之純度。此外，根據SDS-PAGE分析之結果，確定分別在非還原及還原條件下檢測到具有約150kDa及約75kDa大小之蛋白(圖3A，第1至6道)。從這裡發現，Fc結合FcεRIαECD形成二聚體。此外，在SDS-PAGE結果中沒有觀察到諸如截短型的雜質。特別是，即使在解凍/冷凍之製程後(圖3A，第7至9道)，全部的蛋白經鑑定均具有93%或更高的純度且沒有雜質。在此，在下列測試條件下進行Gel-IEF，以鑑定在引入涶液酸轉移酶後的蛋白中涶液酸含量之程度。從這裡確定了酸性蛋白之含量由於涶液酸含量之增加而增加。
[表2]
為了鑑定純化產率之再現性，將FcεRIαECD-Fc2ST細胞株以250ml之規模批次培養於1L燒瓶中，然後使用蛋白A親和性管柱純化。之後，使培養上清液及純化的產物在4%至15% TGXTM 凝膠(Bio-Rad Laboratories, Inc.)上，於Tris-甘胺酸SDS (TGS)緩衝液及200V條件下電泳30分鐘，然後進行SDS PAGE分析之處理。結果確定了不僅純化出具有非常高純度(98％或更高)的蛋白(即使僅通過第一步驟之純化)，亦表達出非常高純度的蛋白(即使在培養上清液中)。此指出，在開發已經於所討論的細胞系中表達之FcεRIαECD-Fc蛋白成為醫療產品時，可簡化製程開發步驟，因此，極有可能顯著降低醫療產品的開發成本。
實驗例 1 ，FcεRIαECD 融合蛋白之IgE 結合能力的鑑定
比較測量下列四種蛋白及市售抗IgE抗體，奧馬珠單抗(商品名：Xolair)之IgE結合能力：i) FcεRIαECD-Fc2、ii) FcεRIαECD-Fc2ST、iii) FcεRIαECD-Fc3及iv) FcεRIαECD-Fc3ST，其等已經過以上範例2中之方法純化。具體地，將IgE塗佈在蛋白GLC感測晶片(Bio-Rad Laboratories, Inc.)之管道上，然後使奧馬珠單抗或不同濃度之各個FcεR1αECD-Fc蛋白以30μl/分之速率流過，以測量IgE之結合能力。
實驗之進行是使用25mM NaOH作為再生緩衝液，確定零基線，然後重複以上步驟。之後，使用蛋白結合分析器(ProteOn XPR36, Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)確定結合曲線。結果示於表3及圖7與8中。圖8中之IgETRAP 意指FceR1αECD-Fc2ST，其是本發明之具IgE結合能力之多肽之一實施例。

[表3]
如表3所示，根據本發明之一實施例之多肽二聚體測得之結合率(ka)值比奧馬珠單抗低1.5至2.0倍。即，發現其對IgE以外的物質之結合能力比奧馬珠單抗低1.5至2.0倍。此外，根據本發明之一實施例之多肽二聚體測得之解離率(kd)值比奧馬珠單抗高40至106倍。此外，如圖7及8所示，能夠確定奧馬珠單抗在結合後經過一段時間之情況下會喪失其對IgE之結合，然而本發明之FcεRIαECD融合蛋白之多肽二聚體一旦結合至IgE，該多肽二聚體不會與IgE分開。即，可看出本發明之多肽二聚體不容易和IgE分開，且維持其結合狀態的能力比奥馬珠單抗好很多。結果可看出根據本發明之一實施例之多肽二聚體具有比奥馬珠單抗高22至69倍之平衡解離常數(KD ＜kd/ka＞)值。
從這裡可確定，相較於奥馬珠單抗，本發明之FcεRIαECD融合蛋白對IgE之結合能力顯著的增加。特別是可確定其中添加涶液酸之FcεRIαECD-Fc2 (FcεRIαECD-Fc2ST)表現出最高的IgE結合能力，其比奥馬珠單抗高69倍。特別是，在FceR1αECD-Fc2ST方面，IgETRAP 之結合率(Ka)及解離率(Kd)比分別比奥馬珠單抗低約1.5倍及94.5倍(圖7及8，及表4)。據先前之報導，IgE會與FcεRIα很緩慢的解離。確定IgETRAP 亦很緩慢的解離(圖8)。結果，IgETRAP 之人IgE結合能力比奥馬珠單抗高69倍(圖8及表4)。
[表4]
實驗例2 ，IgETRAP 對IgG 介 導的IgG 受體之結合能力的鑑定。
IgETRAP 不會結合至與IgG介導的全身性過敏反應相關的低親和性IgG受體。因為預期全身性過敏反應，奥馬珠單抗之主要副作用，可能是因結合至低親和性IgG受體而引起，所以使用BLI分析法檢測IgETRAP 對IgG受體之結合能力，同時使用奥馬珠單抗作為對照組。具體地，使用Octet RED384系統(Pall ForteBio, CA, USA)鑑定IgETRAP 及奥馬珠單抗對IgG受體之結合程度。
將已經稀釋於300mM醋酸鹽緩衝液(pH 5)中之FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA及FcγRIIIB重組蛋白(R & D Systems Inc.，5μg/ml)固定在由400mM EDC與10mM硫-NHS之組合活化的胺反應第2代(AR2G)生物感測器上。之後，分別測量與各濃度下的IgETRAP 及奥馬珠單抗之結合及解離，歷時300秒。在此，所使用之動力學緩衝液是含有0.1% Tween-20及1%牛血清之PBS，及所有的實驗均在30°C下，以1,000rpm速率之樣本盤振盪器進行。
正如預期地，奥馬珠單抗對FcγRI、高親和性IgG受體以及低親和性IgG受體，如FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA及FcγRIIIB (圖9至14)顯示出顯著的結合能力。此意指與奥馬珠單抗不同，IgETRAP 不會結合IgG受體如FcγRIIA及FcγRIII，因此引起IgG介導的全身性過敏反應之風險非常低(圖9至14)。定量奥馬珠單抗及IgETRAP 之IgG受體結合能力，並顯示於圖14中。
實驗例3 ，透過β- 己糖胺酶分析法，鑑定FcεRIα ECD 融合蛋白在小鼠骨髓來源肥大細胞中之活性
進行β-己糖胺酶分析來分析本發明之FcεRIαECD融合蛋白的體外活性。具體地，將根據本發明之一實施例之FcεRIαECD-Fc2融合蛋白以各種濃度的與小鼠IgE (1ug/mL)混合，於室溫下(20℃)培育30分鐘以製得樣本。用Hank平衡鹽溶液(HBSS)緩衝液清洗培養用來進行肥大細胞活化之小鼠骨髓來源肥大細胞，以去除培養基，然後測量細胞數量。之後，調整細胞數量，以便以5×105 個細胞之數量注入40μL之HBSS緩衝液中。
之後，將50uL通過預培育製得的樣本溶液加至活化的肥大細胞中。然後，令產物在5% CO2 、37℃培育箱中培育30分鐘。之後，在各添加10μL外來抗原DNP (2,4-二硝苯，100ng/mL)後，再次於5% CO2 、37℃下培育30分鐘，然後分開30μL的上清液。使30μL分開的上清液與30μL基質(4-硝基苯N-乙醯基-β-D-葡萄糖苷，5.84mM)充分混合， 然後於5% CO2 、37℃下培育20分鐘。之後，添加140μL作為終止溶液之0.1M碳酸鈉緩衝液(pH10)，終止該反應。之後，測量在405nm下之吸收度，以鑑定活化的肥大細胞中因外來抗原而分泌的β-己糖胺酶之分泌量。結果示於圖15A 中。
在1μg/ml小鼠IgE之存在下，IgETRAP 以劑量依賴性之方式抑制肥大細胞的去顆粒反應，IC50 為0.45μg/ml (表現50%抑制作用所須之藥物的濃度)(圖15A)。IgE：IgETRAP 之分子比為0.79時，IgETRAP 完全抑制骨髓來源肥大細胞之去顆粒反應(表5)。
[表5]
具體地，如圖15A，本發明之一實施例之多肽二聚體在一半的小鼠IgE濃度下(0.5ug/mL)，表現出約49.4%的肥大細胞抑制率，而在相同的小鼠IgE濃度下(1ug/mL)，表現出約99.4%的肥大細胞抑制率。即，可看出IgE誘發骨髓來源肥大細胞之活性大幅地受到本發明之FceRIa-ECD多肽二聚體的抑制。
實驗例4 ，使用β- 己糖胺酶分析法，比較FcεRIαECD 融合蛋白與抗人IgE 抗體在人表達FcεRI 骨髓來源肥大細胞中之活性
進行β-己糖胺酶分析法，透過體外活性分析鑑定FcεRIαECD融合蛋白相對於Xolair之優勢。製備各別藥物FcεRIαECD-Fc2ST (IgETRAP )及Xolair之各個濃度，然後與人IgE (1μg/mL)混合。之後，在室溫下培育30分鐘。在藥物之預培育期間，引入人FcεRI基因及製備從小鼠骨髓衍生及分化而來之肥大細胞(其中已移除小鼠FcεRI基因)。用HBSS緩衝液清洗製得的肥大細胞，然後將5×105 個細胞注入60μL之HBSS緩衝液中。於製得的肥大細胞中添加20μL之預培育的樣本，然後在5% CO2 、37℃培育箱中培育30分鐘。
隨後，在添加20μL之抗人IgE抗體(BioLegend, Cat No. 325502, 0.5 μg/mL)以誘發出與外來抗原相同的反應後，令產物再次於5% CO2 、37℃培育箱中培育30分鐘。之後，在1,500rpm、4℃下離心後，分開30μL之上清液。使30μL分開的上清液與30μL基質(4-硝基苯N-乙醯基-β-葡萄糖苷，5.84mM)充分混合，然後於5% CO2 、37℃培育箱中培育25分鐘。之後，添加140μL之0.1M碳酸鈉緩衝液(pH 10)結束反應。
之後，測量在405nm下之吸收度，比較分泌的β-己糖胺酶之相對量，並鑑定依各藥物濃度之肥大細胞的抑制作用。結果示於圖15B中。如圖15B所示，FcεRIαECD融合蛋白之IC50 經測量大約為11.16ng/mL，而Xolair蛋白之IC50 經測量大約為649.8ng/mL。因此，確定了FcεRIαECD融合蛋白在肥大細胞活性上之抑制能力比Xolair大58倍。
實驗例5 ，FcεRIαECD 融合蛋白之活體內分析：食物過敏模型
以14天的間隔，經腹膜對Balb/c小鼠(Orientbio Inc.)投與50μg之卵白蛋白(OVA)及1mg之明礬二次，用以誘發敏感。之後，在第28、30、32、34及36天口服投與50mg的OVA五次，用以誘發腸道食物過敏。
在口服投與OVA二次後，即在第31天，將小鼠分成三群，各有7隻小鼠。被分開的三群如下：第一群接受高濃度(200μg)之FcεRIαECD-Fc2ST融合蛋白，第二群接受低濃度(20μg)之FcεRIαECD-Fc2ST融合蛋白，而第三群沒有接受任何東西。在口服投與OVA的同時，鑑定是否因食物過敏誘發腹瀉發生。在第37天犧牲小鼠，分析屬於各群之小鼠的小腸中肥大細胞的數量、血液中IgE濃度及血液中肥大細胞去顆粒反應產生的酵素(肥大細胞蛋白酶-1 (MCPT-1))之濃度。
如圖16所示，鑑定出相較於屬於沒有接受任何東西之小鼠群，接受高濃度FcεRIαECD-Fc2ST (其是多肽二聚體)之小鼠群，表現出呈濃度依賴性方式緩解食物過敏。
II. 具IgE 結合能力之多肽與益生菌之組合的製備，及其作用的鑑定
範例3 ：益生菌的培養及投與
於MRS培養液或腦心浸液(BHI)培養基中接種乾酪乳酸桿菌(L. casei ；KACC 12413)、乳酸乳球菌(Lc. lactis ；KACC 13877)、發酵乳酸桿菌(L. fermentum ；KACC 11441)及鼠李糖乳酸桿菌(L. rhamnosus ；KACC 11953)，然後在37°C培養箱(N-Biotek Cat # NB201L)中培育24個小時。羅伊氏乳酸桿菌(L.reuteri ；KACC 11452)及嗜熱鏈球菌(S. thermophiles ；KACC 11857)鑑於其等之好氧特性，培養在振盪培養箱(N-biotek)中，於37°C及50rpm下培養24個小時。
將培養的益生菌溶於含有10%脫脂牛奶及10%蔗糖之凍乾培養基中，然後使用冷凍乾燥機(Labcono)冷凍。之後，產物是粉末狀的。針對完成的益生菌，利用連續稀釋測量存在的菌落形成單位(cfu)/克。
實驗期間，使用口服用針(oral zonde)，以2至3天的間隔連續餵食每隻小鼠1×109 至2.5×109 cfu凍乾的益生菌。陰性對照組餵食等量的凍乾培養基。
範例4 ：包含益生菌及具IgE 結合能力之多肽之組成物的製備
將於範例1中獲得之具IgE結合能力之多肽與於範例3中獲得之益生菌混合，製得用於治療過敏之組成物。
實驗例6 ，FcεRIα-Fc 融合蛋白在過敏的改善上之作用的鑑定
以14天的間隔，經腹膜對Balb/c小鼠(Orientbio Inc.)投與50μg之奥馬珠單抗(OVA)及1mg之明礬二次，用以誘發敏感。之後，在第28、30、32、34及36天口服投與50mg的OVA五次，用以誘發腸道食物過敏。將已誘發食物過敏之小鼠分成五群，各有7隻小鼠。被分開的五群如下：第一群接受高濃度(200μg)之FcεRIαECD重組蛋白，第二群接受低濃度(20μg)之FcεRIαECD重組蛋白，第三群接受高濃度(200μg)之FcεRIαECD重組蛋白加上長雙歧桿菌，第四群接受低濃度(20μg)之FcεRIαECD重組蛋白加上長雙歧桿菌，而第五群沒有接受任何東西。
在口服投與OVA的同時，鑑定是否因食物過敏誘發腹瀉發生。在第37天犧牲小鼠，分析屬於各群之小鼠的小腸中肥大細胞的數量、血液中IgE濃度及血液中肥大細胞去顆粒反應產生的酵素(肥大細胞蛋白酶-1 (MCPT-1))之濃度。如圖19B所示，鑑定出相較於屬於沒有接受任何東西之小鼠群，接受FcεRIαECD多肽二聚體與長雙歧桿菌之組合之小鼠群，表現出緩解食物過敏之作用。
實驗例7 ，合併投與IgETRAP 與益生菌在改善過敏上的作用之鑑定
為了評估IgETRAP 在食物過敏上之作用，於BALB/c小鼠中誘發劑量依賴性急性腹瀉，產生過敏原誘發食物過敏的小鼠模型。具體地，用與實驗例6相同之方法進行實驗，但投與100μg/頭之IgETRAP (一種FcεRIαECD重組蛋白)。此外，將益生菌長雙歧桿菌凍乾，並以3×109 cfu/g之濃度與粉末狀小鼠飼料混合。容許該小鼠隨意取得飼料。為了維持新鮮度，每2至3天更換混合長雙歧桿菌之小鼠飼料。結果，如下表6及圖18所示，發現在同時接受益生菌長雙歧桿菌與IgETRAP (一種FcεRIαECD多肽二聚體)之實驗群中，表現出極佳的過敏緩解作用。
[表6]
使用此模型，本發明人發現單獨投與IgETRAP 能有效地減少腹瀉之發生，且確定了相較於單獨投與IgETRAP ，合併投與IgETRAP 與長雙歧桿菌顯著地減少腹瀉之發生(圖18)。據報導，長雙歧桿菌會透過細胞凋亡減少肥大細胞的數量及緩解食物過敏症狀。然而，接受腹膜注射IgETRAP 之群組，表現出比每天接受長雙歧桿菌之群組好的治療效果(圖18)。有趣的是，即使是使用濃度減少10倍的IgETRAP 之情況，IgETRAP 與長雙歧桿菌之組合療法仍表現出與單獨IgETRAP 之療法相似的效果(圖19B)。
實驗例8 ，合併投與IgETRAP 與長雙歧桿菌時之作用的鑑定：MCPT-1 及IgE 位準
此外，測量血清MCPT-1之位準，以鑑定肥大細胞之去顆粒反應。單獨投與IgETRAP 與長雙歧桿菌不會降低MCPT-1之位準，但合併投與IgETRAP 與長雙歧桿菌顯著地降低MCPT-1之位準(圖20)。因此，可看出長雙歧桿菌與IgETRAP 合作抑制肥大細胞去顆粒反應。在食物過敏小鼠模型中，為了研究治療劑減少IgE之效果，使用ELISA分析血清中總IgE及游離IgE之位準。IgETRAP ，及IgETRAP 與長雙歧桿菌之組合稍微增加總IgE之位準(圖21)。然而，IgETRAP ，及IgETRAP 與長雙歧桿菌之組合大幅地降低游離IgE之位準(圖22)。相反的，單獨投與長雙歧桿菌不會影響總IgE及游離IgE之位準(圖21及22)。因此，IgETRAP 與長雙歧桿菌從幾個方面緩解食物過敏症狀，顯示此組合可對食物過敏發揮有效的治療作用。
實驗例9 ，IgETRAP 與長雙歧桿菌之組合在肥大細胞數量及杯狀細胞過度增生上的抑制作用之鑑定
為了研究IgETRAP 及長雙歧桿菌及其組合是否會減少肥大細胞之數量，使用氯乙酸酯酶活性染肥大細胞。結果顯示單獨投與IgETRAP 及長雙歧桿菌顯著地減少肥大細胞之數量，而二個之組成更有效(圖23及24)。可看出長雙歧桿菌之結果與先前報導的一致。進行IgETRAP 、長雙歧桿菌及其組合是否會抑制由Th2細胞激素環境引起的杯狀細胞過度增生之研究。如預期的，確定食物過敏小鼠之小腸中杯狀細胞的大小增加，並且隨著細胞數量的增加發生過度增生(圖25及26)。
確定投與IgETRAP 及長雙歧桿菌顯著地減少杯狀細胞的大小及數量，且此作用在合併投與IgETRAP 與長雙歧桿菌之情況時變得更好(圖25及26)。此外，可看出IL-33之mRNA表達因IgETRAP 及長雙歧桿菌而有減少之傾向，且此作用在合併投與時更顯地變得更好(圖28)。此等結果顯示，IgETRAP 及長雙歧桿菌顯著地抑制腸肥大細胞之數量及杯狀細胞的過度增生，且在合併投與時表現出進一步的改善作用。
實驗例10 ，鑑定口服投與IgETRAP 至小鼠後血清中存在的IgETRAP
口服投與IgETRAP (300μg)至小鼠2個小時後，利用眼眶後採血器採集血清。允許在室溫下反應30分鐘後，在4°C下1,300rpm下離心15分鐘，獲得上清液(血清)。以抗FcεRI抗體(Abcam, ab54411)塗佈96孔免疫盤，容許在4°C下反應一整夜。用清洗緩衝液(含0.05% Tween-20之PBS)清洗盤，之後於其中加入阻斷緩衝液(含1%牛血清白蛋白之PBS)。讓該盤反應1個小時。再次用清洗緩衝液清洗盤，及於該盤中加入標準樣本及稀釋的小鼠血清樣本。讓盤反應2個小時，再次用清洗緩衝液清洗。於其中加入抗人IgG4 Fc抗體(Abcam，ab99823)，讓該盤反應1個小時。再次用清洗緩衝液清洗盤，於其中加入TMB基質(Supmodics)。在容許反應20分鐘後，同時阻斷光線，添加終止反應物(1M H2 SO4 )以終止反應。用微盤讀取器(Epoch微孔盤分光光度計)，將波長設定在450nm，測量濃度值。結果，在正常小鼠血清中測到IgETRAP (圖35)。從此等結果可看出，在口服投與IgETRAP 蛋白之情況下，IgETRAP 蛋白透過與黏膜上與FcRn之結合被遞送進入血清中，因此可表現出治療作用。
實驗例11 ，鑑定合併投與IgETRAP 與各種益生菌在食物過敏模型中所獲得之作用
為了評估IgETRAP 與益生菌在食物過敏上之作用，於BALB/c小鼠中誘發劑量依賴性急性腹瀉，以產生過敏原誘發食物過敏的小鼠模型。具體地，用與實驗例7相同之方法進行實驗，但依圖17中之實驗計劃，經腹膜對小鼠投與100ug/頭之IgETRAP (一種FcεRIαECD重組蛋白)。此外，在實驗期間，以2至3天之間隔，使用口服用針對每隻小鼠連續餵食1×109 至2.5×109 cfu之凍乾的益生菌，陰性對照組餵食等量之凍乾的培養基。
投與IgETRAP 與乾酪乳酸桿菌後，鑑定腹瀉頻率所獲得之結果示於圖29中。投與IgETRAP 與乳酸乳球菌後，鑑定腹瀉頻率所獲得之結果示於圖30中。投與IgETRAP 與嗜熱鏈球菌後，鑑定腹瀉頻率所獲得之結果示於圖31中。投與IgETRAP 與鼠李糖乳酸桿菌後鑑定腹瀉頻率所獲得之結果示於圖32中。投與IgETRAP 與羅伊氏乳酸桿菌後鑑定腹瀉頻率所獲得之結果示於圖33中。投與IgETRAP 與發酵乳酸桿菌後鑑定腹瀉頻率所獲得之結果示於圖34中。
參考符號列表
B. longum ：長雙歧桿菌
OIT：口服免疫療法
PSA：被動全身性過敏反應
SPR：表面電漿子共振
BLI：生物膜干涉技術
BMMC：骨髓來源肥大細胞
Cfu：菌落形成單位
MCPT-1：肥大細胞蛋白酶-1
OVA: 卵清蛋白
Treg cell：調節性T細胞
Th2 cell：第2型輔助T細胞
ILC2：第2型先天免疫細胞
[序列表文本]
序列辨識編號：1
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序列辨識編號：2
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序列辨識編號：3
RNTGRGGEEK KGSKEKEEQE ERETKTPECP

序列辨識編號：4
AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK GSKEKEEQEE RETKTPECP

序列辨識編號：5
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序列辨識編號：6
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序列辨識編號：7
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序列辨識編號：8
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序列辨識編號：9
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序列辨識編號：10
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序列辨識編號：11
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序列辨識編號：12
atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag aagtactggc tgcagaggaa caccggcaga ggaggcgagg aaaagaaagg aagcaaggag aaggaggagc aggaggaaag agaaaccaag acccccgagt gccccagcca cacccagccc ctgggcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc gaggtgacct gcgtggtcgt ggatgtgagc caggaagatc ccgaagtgca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagaaga gcagttcaac tccacctaca gagtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaaggc ctgcccagct ccatcgagaa gaccatcagc aaagccaaag gccagcccag agaaccccag gtgtacaccc tgcctcccag ccaggaagag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggaaagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagacaac ccctcccgtg ctggatagcg atggcagctt ctttctgtac agcagactga ccgtggacaa gagcagatgg caggaaggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgaag ccctgcacaa ccactacacc cagaagagcc tgtccctgag cctgggcaag

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序列辨識編號：14
atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag aagtactggc tgcaggccca gccccaggcc gagggcagcc tggctaaggc caccacagct cccgccacca ccaggaacac cggcagagga ggcgaggaaa agaaaggaag caaggagaag gaggagcagg aggaaagaga aaccaagacc cccgagtgcc ccagccacac ccagcccctg ggcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag gtgacctgcg tggtcgtgga tgtgagccag gaagatcccg aagtgcagtt caactggtac gtggatggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaagagca gttcaactcc acctacagag tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtgtccaa caaaggcctg cccagctcca tcgagaagac catcagcaaa gccaaaggcc agcccagaga accccaggtg tacaccctgc ctcccagcca ggaagagatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg aaagcaacgg ccagcccgag aacaattaca agacaacccc tcccgtgctg gatagcgatg gcagcttctt tctgtacagc agactgaccg tggacaagag cagatggcag gaaggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaagccc tgcacaacca ctacacccag aagagcctgt ccctgagcct gggcaag

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MIHTNLKKKF SCCVLVFLLF AVICVWKEKK KGSYYDSFKL QTKEFQVLKS LGKLAMGSDS QSVSSSSTQD PHRGRQTLGS LRGLAKAKPE ASFQVWNKDS SSKNLIPRLQ KIWKNYLSMN KYKVSYKGPG PGIKFSAEAL RCHLRDHVNV SMVEVTDFPF NTSEWEGYLP KESIRTKAGP WGRCAVVSSA GSLKSSQLGR EIDDHDAVLR FNGAPTANFQ QDVGTKTTIR LMNSQLVTTE KRFLKDSLYN EGILIVWDPS VYHSDIPKWY QNPDYNFFNN YKTYRKLHPN QPFYILKPQM PWELWDILQE ISPEEIQPNP PSSGMLGIII MMTLCDQVDI YEFLPSKRKT DVCYYYQKFF DSACTMGAYH PLLYEKNLVK HLNQGTDEDI YLLGKATLPG FRTIHC

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atgatccaca ccaacctgaa gaagaagttc agctgctgcg tgctggtgtt cctgctgttc gccgtgatct gcgtgtggaa ggagaagaag aaaggcagct actacgacag cttcaagctg cagaccaagg agttccaggt gctgaagagc ctgggcaagc tggccatggg cagcgacagc cagagcgtgt ccagctcctc cacccaggat ccccacagag gcagacagac cctgggcagc ctgagaggcc tggccaaggc caagcccgag gccagcttcc aggtgtggaa caaggacagc agcagcaaga acctgatccc cagactgcag aagatctgga agaactacct gagcatgaac aagtacaagg tgagctacaa aggacccgga cccggcatca agttcagcgc cgaggccctg aggtgccacc tgagagacca cgtgaacgtg agcatggtgg aagtgaccga cttccccttc aacaccagcg agtgggaagg ctacctgccc aaggagagca tcaggaccaa ggctggcccc tggggcagat gcgccgtggt gagcagcgct ggcagcctga agagctccca gctgggcaga gagatcgacg accacgatgc cgtgctgagg ttcaatggcg ctcccaccgc caacttccag caggacgtgg gcaccaagac cacaatccgg ctgatgaaca gccagctggt gacaaccgag aagcggttcc tgaaggacag cctgtacaac gagggcatcc tgatcgtgtg ggatcccagc gtgtaccaca gcgacatccc caagtggtac cagaatcccg actacaactt cttcaacaac tacaagacct atagaaagct gcaccccaac cagcccttct acatcctgaa gccccagatg ccctgggagc tgtgggacat cctgcaggag atcagccctg aagagatcca gcccaaccct ccctccagcg gcatgctggg cattatcatc atgatgaccc tgtgcgacca ggtggacatc tacgagttcc tgcccagcaa gagaaagacc gacgtgtgct actactatca gaagttcttc gacagcgcct gcaccatggg cgcctaccac cccctgctgt acgagaagaa cctggtgaag cacctgaacc agggcaccga cgaggacatc tacctgctgg gcaaagccac cctgcccggc ttcagaacca tccactgc

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圖1描述形成本發明之多肽二聚體之一實施例之單體(IgETRAP )之構造的示意圖。IgETRAP 之一實施例包含從人FcεRIα (從FcεRIα胞外區域中第26個胺基酸至第205個胺基酸之區，180個胺基酸)至人IgD/IgG4雜交Fc (245個胺基酸)的425個胺基酸。IgD/IgG4雜交Fc具有FcRn結合位置(右邊陰影線)，但無FcγR及C1q (左邊陰影線)之結合位置。在此，IgD可為從第133個胺基酸至第170個胺基酸之區(38個胺基酸)，而IgG4可為從第121個胺基酸至第327個胺基酸之區(207個胺基酸)。
圖2描述IgETRAP 同源二聚體之三維結構模型。該結構顯示FcεRIα胞外區域(藍色)、IgD鉸鏈(黃色)及IgG4 Fc (綠色)。
圖3描述各細胞株中所產生之具IgE結合能力之多肽的SDS-PAGE結果(圖3A)。在此可看出在還原及非還原二者條件下沒有產生截短型(圖3A及3B)。
圖4描述進行凝膠等電聚焦(GEL-IEF)實驗，用以鑑定各細胞株中所產生之具IgE結合能力之多肽的涶液酸含量增加之結果。由於帶負電之涶液酸含量因引入涶液酸轉移酶基因而增加，因此具較低的主要等電點(pI)之蛋白的含量增加。從此可看出酸性蛋白的含量透過添加涶液酸轉移酶而增加。
圖5描述根據本發明之實施例之多肽二聚蛋白(IgETRAP )於非還原及還原形式的SDS-PAGE結果。特別是可看出即使在對應於輸入(Input)的培養上清液中，該多肽二聚體亦具有高純度。
圖6描述於非還原及還原條件下進行IgETRAP 之SDS-PAGE分析所獲得之結果。
圖7描述奧馬珠單抗與IgE的結合能力之圖。該圖顯示固定奥馬珠單抗及分析其依處理的IgE濃度之結合能力所獲得的結果。使用表面電漿子共振(SPR)分析人IgE與奥馬珠單抗間之交互反應，然後計算各分子之結合親和力。
圖8描述顯示根據本發明之實施例之多肽二聚蛋白(IgETRAP )之IgE結合能力之圖。該圖顯示固定IgETRAP 及分析其依處理的IgE濃度之結合能力所獲得的結果。使用表面電漿子共振(SPR)分析人IgE與IgETRAP 間之交互反應，然後計算各分子之結合親和力。
圖9至13描述通過生物膜干涉技術(BLI)分析鑑定本發明之實施例之二聚蛋白(IgETRAP )及奥馬珠單抗與IgG受體FcγRI (圖9)、FcγRIIA (圖10)、FcγRIIB (圖11)、FcγRIIIA (圖12)及FcγRIIIB (圖13)之交互反應所獲得的結果。
圖14描述量化IgETRAP 與IgG受體之間以及奥馬珠單抗與IgG受體之間之結合能力所獲得的圖。
圖15A描述顯示根據本發明之實施例之多肽二聚蛋白(IgETRAP )，依其濃度在小鼠來源肥大細胞活性上的抑制能力之圖。
圖15B描述顯示根據本發明之實施例之多肽二聚蛋白(IgETRAP )及Xolair (奥馬珠單抗)，依其等之濃度，在人FcεRI表達小鼠來源肥大細胞活性上的抑制能力間之比較圖。
圖16描述顯示根據本發明之實施例之多肽二聚蛋白在食物過敏引起的疾病模型中之強度。
圖17描述食物過敏誘發及IgETRAP 、長雙歧桿菌(B. longum )及組合療法之實驗計劃。i.p.，腹膜內；i.g，胃內。
圖18描述IgETRAP 、長雙歧桿菌及組合療法抑制過敏引起的腹瀉症狀之強度。n=16至18隻小鼠/群，OVA對OVA+IgETRAP ：*P ＜ .05，OVA對OVA+長雙歧桿菌+IgETRAP ，及OVA對PBS：***P ＜ .0001。
圖19A描述用以鑑定長雙歧桿菌改善IgETRAP 之治療效果的實驗計劃。具體地，顯示用於食物過敏誘發及單一或合併投與IgETRAP 與長雙歧桿菌之實驗計劃。i.p.，腹膜內；i.g.，胃內。
圖19B描述通過鑑定合併投與益生菌與具IgE結合能力之多肽二聚蛋白(IgETRAP )，依劑量增加，在食物過敏引起的疾病模型中之作用所獲的圖。顯示IgETRAP 、長雙歧桿菌及其組合抑制食物過敏腹瀉之作用。n=14隻小鼠/群，OVA對OVA+長雙歧桿菌+IgETRAP (20μg)、OVA對OVA+長雙歧桿菌+IgETRAP (200μg)，及OVA對PBS：**P ＜ .001。
圖20描述用ELISA分析在食物過敏引起的疾病模型中，投與IgETRAP 、長雙歧桿菌及其組合時，從各別的實驗群獲得之血清中肥大細胞蛋白酶-1 (MCPT-1)位準所獲得的結果。
圖21描述用ELISA測量在食物過敏引起的疾病模型中，投與IgETRAP 、長雙歧桿菌及其組合時，從各別的實驗群獲得之血清中總IgE (游離IgE及IgE-IgETRAP 複合物)位準所獲得的結果。n=16至18隻小鼠/群，OVA對OVA+IgETRAP 、OVA對OVA+長雙歧桿菌+IgETRAP ，及OVA對PBS：***P ＜ .0001。
圖22描述用ELISA測量在食物過敏引起的疾病模型中，投與IgETRAP 、長雙歧桿菌及其組合時，從各別的實驗群獲得之血清中游離IgE位準所獲得的結果。n=16至18隻小鼠/群，OVA對OVA+IgETRAP 、OVA對OVA+長雙歧桿菌+IgETRAP ，及OVA對PBS：***P ＜ .0001。
圖23描述通過鑑定在食物過敏引起的疾病模型中，投與IgETRAP 、長雙歧桿菌及其組合時，在各別的實驗群中之肥大細胞增生及杯狀細胞增生上之抑制作用所獲得的結果。顯示對各別實驗群中空腸的代表性石蠟切片中的肥大細胞(紅色)染色所獲得之結果(放大倍數400x)。放大的空腸清楚地顯示出肥大細胞(紅色)。
圖24描述將圖23中之肥大細胞放大400倍及鑑定該肥大細胞所獲得的結果。n=10至12隻小鼠/群，OVA對長雙歧桿菌，及OVA對IgETRAP ：**P ＜ .001，OVA對OVA+長雙歧桿菌+IgETRAP ，及OVA對PBS：***P ＜ .0001。
圖25描述通過鑑定在食物過敏引起的疾病模型中，投與IgETRAP 、長雙歧桿菌及其組合時，在各別的實驗群中之肥大細胞增生及杯狀細胞增生上之抑制作用所獲得的結果。顯示對各別實驗群中空腸的代表性石蠟切片中的杯狀細胞染色所獲得之結果(紫色，放大倍數400x)。
圖26描述從圖25中之絨毛-隱窩單元(VCUs)隨機選擇杯狀細胞並計數10個VCUs所獲得的結果。n=5至6隻小鼠/群，OVA對長雙歧桿菌，及OVA對IgETRAP ：*P ＜ .05，OVA對OVA+長雙歧桿菌+IgETRAP ，及OVA對PBS：***P ＜ .0001。
圖27描述通過長雙歧桿菌與IgETRAP 組合療法引起食物過敏抑制的機制之示意圖。攝入的食物過敏原會通過使IgE結合至作用細胞上之高親和性IgE Fc受體(FcεRI)而引起作用細胞(肥大細胞及嗜鹼性球)的活化。活化的作用細胞釋出調節物，從而引起立即的過敏反應。長雙歧桿菌透過胞外囊泡(EV)之分泌引起肥大細胞的細胞凋亡，此會減少肥大細胞的數量。同時，IgETRAP 會阻擋IgE結合至作用細胞上的FcεRI，因此抑制該作用細胞的活化及增生。合併投與長雙歧桿菌與IgETRAP 使其能有效地緩解食物過敏症狀及杯狀細胞增生。
圖28描述通過鑑定投與長雙歧桿菌及IgETRAP 後腸組織內IL-33表達的變化所獲得的圖。投與長雙歧桿菌與IgETRAP 降低了食物過敏模型小鼠中空腸之IL-33 mRNA的表達。n=16至18隻小鼠/群，OVA對OVA+長雙歧桿菌+IgETRAP ：*P ＜ .05。
圖29描述通過鑑定腹膜內注射IgETRAP 及乾酪乳酸桿菌(L. casei )後之腹瀉頻率所獲得的圖。n=7至10隻/群
圖30描述通過鑑定腹膜內注射IgETRAP 及乳酸乳球菌(Lc. lactis )後之腹瀉頻率所獲得的圖。n=5隻/群。
圖31描述通過鑑定腹膜內注射IgETRAP 及嗜熱鏈球菌(S. thermophilus )後之腹瀉頻率所獲得的圖。n=6至10隻/群。
圖32描述通過鑑定腹膜內注射IgETRAP 及鼠李糖乳酸桿菌(L. rhamnosus )後之腹瀉頻率所獲得的圖。n=5至10隻/群。
圖33描述通過鑑定腹膜內注射IgETRAP 及羅伊氏乳酸桿菌(L. reuteri )後之腹瀉頻率所獲得的圖。n=5至10隻/群。
圖34描述通過鑑定腹膜內注射IgETRAP 及發酵乳酸桿菌(L. fermentum )後之腹瀉頻率所獲得的圖。n=7至10隻小鼠/群。
圖35描述口服投與IgETRAP 至正常小鼠，然後鑑定該小鼠血清中吸附的IgETRAP 所獲得的圖。






















































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































Claims (21)

  1. 一種組成物，其包含活性成份： 益生菌；及 具IgE結合能力之多肽。
  2. 如請求項1之組成物，其中該益生菌是乳酸菌或雙歧桿菌(Bifidobacterium)。
  3. 如請求項2之組成物，其中該乳酸菌是選自於由下列所構成之群組中之任一者：乳酸桿菌屬(Lactobacillus )、乳酸乳球菌屬(Lactococcus )、腸球菌屬(Enterococcus )及鏈球菌屬(Streptococcus )。
  4. 如請求項3之組成物，其中該乳酸桿菌屬是選自於由下列所構成之群組中之任一者：嗜酸乳酸桿菌(L. acidophilus )、乾酪乳酸桿菌(L. casei )、加氏乳酸桿菌(L. gasseri )、德布律克氏乳酸菌保加利亞種(L. delbrueckii ssp. bulgaricus )、瑞士乳酸桿菌(L. helveticus )、發酵乳酸桿菌(L. fermentum )、副乾酪乳桿菌(L. paracasei )、胚芽乳酸桿菌(L. plantarum )、羅伊氏乳酸桿菌(L. reuteri )、鼠李糖乳酸桿菌(L. rhamnosus )、戊糖乳酸桿菌(L. pentosus )及涶液乳酸桿菌(L. salivarius )， 該乳酸乳球菌屬是乳酸乳球菌(Lc. lactis )，及 該鏈球菌屬是嗜熱鏈球菌(S. themophilus )。
  5. 如請求項2之組成物，其中該雙歧桿菌是選自於由下列所構成之群組中之任一者：兩歧雙歧桿菌(B. bifidum )、短雙歧桿菌(B. breve )、長雙歧桿菌(B. longum )及動物雙歧桿菌乳酸亞種(B. animalis ssp. lactis )。
  6. 如請求項2之組成物，其中該益生菌是乾酪乳酸桿菌(L. casei )或長雙歧桿菌(B. longum )。
  7. 如請求項1之組成物，其中該具IgE結合能力之多肽是抗IgE抗體。
  8. 如請求項7之組成物，其中該抗IgE抗體是奥馬珠單抗(omalizumab)。
  9. 如請求項1之組成物，其中該具IgE結合能力之多肽是含有IgE Fc受體之α次單元的胞外區域或其片段之重組蛋白。
  10. 如請求項9之組成物，其中該IgE Fc受體之α次單元的胞外區域具有序列辨識編號：1之胺基酸序列。
  11. 如請求項9之組成物，其中該重組蛋白含有免疫球蛋白Fc區。
  12. 如請求項11之組成物，其中該免疫球蛋白Fc區是天然或修飾型。
  13. 如請求項1之組成物，其中該益生菌為乾粉形式。
  14. 如請求項9之組成物，其中該重組蛋白是含有二個單體之多肽二聚體，該二個單體各含有IgE Fc受體之α次單元的胞外區域(FcεRIαECD)， 該單體含有一修飾的Fc區，及 該修飾的Fc區及該FcεRIαECD透過一鉸鏈連接。
  15. 一種用於治療或預防過敏性疾病之藥學組成物，其包含： 如請求項1之組成物。
  16. 如請求項15之藥學組成物，其中該過敏性疾病是選自於由下列所構成之群組中之任一者：食物過敏、異位性皮膚炎、氣喘、過敏性關節炎、過敏性結膜炎、過敏性皮膚炎、慢性自發性蕁麻疹及過敏性接觸性皮膚炎。
  17. 一種用於改善或緩解過敏症狀之保健功能性食品組成物，其包含： 如請求項1之組成物。
  18. 一種用於治療或預防過敏性疾病之套組，其包含： 一第一組成物，其含有益生菌；及 一第二組成物，其含有具IgE結合能力之多肽。
  19. 如請求項18之套組，其中該第二組成物是用於皮下或靜脈投與之組成物。
  20. 一種用於治療或預防過敏性疾病之方法，其包含： 對一個體投與一組成物之步驟，該組成物包含益生菌及具IgE結合能力之多肽作為活性成份。
  21. 一種用於治療或預防過敏性疾病之方法，其包含： 投與益生菌之步驟；及 投與具IgE結合能力之多肽之步驟。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021006599A1 (ko) * 2019-07-08 2021-01-14 (주)지아이이노베이션 Ige fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인을 포함하는 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
EP4183803A4 (en) * 2020-07-17 2024-04-17 GI Innovation, Inc. FUSION PROTEIN WITH EXTRACELLULAR DOMAIN OF IGE-FC RECEPTOR ALPHA SUBUNIT AND ANTI-IL-4R ANTIBODIES AND USE THEREOF
KR20220011931A (ko) * 2020-07-22 2022-02-03 (주)지아이이노베이션 IgE Fc 수용체를 포함하는 융합단백질 및 이를 포함하는 개 알레르기성 질환 치료 용도

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH092959A (ja) * 1995-06-16 1997-01-07 Yakult Honsha Co Ltd ＩｇＥ抗体産生抑制剤および抗アレルギー剤
JPH10309178A (ja) * 1997-05-09 1998-11-24 Wakamoto Pharmaceut Co Ltd ビフィズス菌を有効成分とする抗アレルギー剤および醗酵食品
JP2000095697A (ja) 1998-09-18 2000-04-04 Advance Co Ltd 抗アレルギー剤
AUPQ415899A0 (en) * 1999-11-19 1999-12-16 Vasse Research Institute Pty Ltd Compositions for and methods of treatment of allergic diseases
EP1239032A1 (en) * 2001-03-02 2002-09-11 Société des Produits Nestlé S.A. Lactic acid bacteria as agents for treating and preventing allergy
JP2009067679A (ja) 2005-12-27 2009-04-02 Univ Of Tokushima 抗ヒスタミン作用を有する医薬
WO2008028068A2 (en) * 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. NON-HUMAN PRIMATE FCεR1α POLYPEPTIDES
EP2097452A1 (en) 2006-12-14 2009-09-09 Actogenix N.V. Delivery of binding molecules to induce immunomodulation
AR065368A1 (es) 2007-02-15 2009-06-03 Astrazeneca Ab Anticuerpos para moleculas de ige
EP2162472B1 (en) 2007-05-30 2013-02-27 Postech Academy-Industry- Foundation Immunoglobulin fusion proteins
EP2065048A1 (en) * 2007-11-30 2009-06-03 Institut Pasteur Use of a L. casei strain, for the preparation of a composition for inhibiting mast cell activation
AU2009212295A1 (en) 2008-02-06 2009-08-13 The Procter & Gamble Company Compositions methods and kits for enhancing immune response to a respiratory condition
WO2010013143A2 (en) * 2008-08-01 2010-02-04 Institut Pasteur Methods for inhibiting mast cell activation and treating mast cell-dependent inflammatory diseases and disorders using lactobacillus
ES2742419T3 (es) 2008-09-17 2020-02-14 Xencor Inc Nuevas composiciones y métodos para tratar trastornos mediados por IgE
AU2010315470B2 (en) * 2009-10-26 2016-05-05 Genentech, Inc. Assays for detecting antibodies specific to therapeutic anti-IgE antibodies and their use in anaphylaxis
WO2012169735A2 (ko) * 2011-06-07 2012-12-13 (주)네오팜 FCεRI의 수용성 단편을 포함하는 복합체 및 이를 포함하는 IGE 매개 알레르기성 질환 치료용 조성물
KR20120135865A (ko) * 2011-06-07 2012-12-17 (주)네오팜 ＦｃεＲＩ의 수용성 단편을 포함하는 복합체 및 이를 포함하는 ＩｇＥ 매개 알레르기성 질환 치료용 조성물
CN103169733B (zh) * 2011-12-26 2014-11-12 浙江贝因美科工贸股份有限公司 复合益生菌、其在治疗过敏性疾病中的应用及孕产妇防过敏益生菌冲剂
TWI691512B (zh) * 2015-02-20 2020-04-21 日商橘生藥品工業股份有限公司 Ｆｃ融合高親和性ＩｇＥ受體α鏈
JP2018515426A (ja) * 2015-03-12 2018-06-14 ザ ユニヴァーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア 細菌組成物およびその使用方法
KR101778734B1 (ko) 2016-03-11 2017-09-18 대한민국(농촌진흥청장) 비피도박테리움 롱검 kacc 91563으로부터 분리된 esbp 및 이를 이용한 항알레르기 조성물
US20210070833A1 (en) * 2018-01-08 2021-03-11 Gl INNOVATION, INC. Extracellular domain of alpha subunit of ige fc receptor, pharmaceutical composition comprising same and method for producing same

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