WO2021006599A1 - Ige fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인을 포함하는 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체 및 이를 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

Ige fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인을 포함하는 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체 및 이를 포함하는 약학적 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide dimer comprising the IgE Fc receptor and a high sialic acid content, and a pharmaceutical composition comprising the same.
  • IgE immunoglobulin E
  • IgE immunoglobulin E
  • Fc ⁇ RI high-affinity IgE receptor
  • mast cells or basophilic granulocytes release chemical mediators such as histamine, leukotriene, prostaglandin, bradykinin, and platelet-activating factors.
  • Allergic symptoms are caused by the released chemical mediators.
  • allergic diseases may worsen symptoms due to the combination of IgE and Fc ⁇ RI.
  • Fc ⁇ RI high-affinity IgE receptor
  • Omalizumab (trade name: Xolair), which targets the Fc portion of IgE, has been developed and is used as a treatment for refractory severe asthma and refractory urticaria.
  • omalizumab must be administered at a high dose to maintain the effect, so the cost is high, and side effects such as angioedema and anaphylaxis reactions are reported (The Journal of Clinical Investigation Volume 99, Number 5, March 1997, 915. -925).
  • serious adverse reactions such as allergic granulomatous vasculitis and idiopathic severe thrombocytopenia have been reported after the marketing.
  • the present inventors studied to develop a safe and effective treatment for allergic diseases.
  • the sialic acid content of the polypeptide dimer containing two monomers (Fc ⁇ RI ⁇ -ECD) containing the extracellular domain of the alpha subunit of the IgE Fc receptor is high, the polypeptide dimer has only excellent binding ability with IgE. Rather, it was found that the blood concentration was maintained high.
  • the present invention was completed by confirming that effective delivery into the body is possible even when the polypeptide dimer having a high sialic acid content is administered subcutaneously.
  • One aspect of the present invention provides a polypeptide dimer comprising two monomers comprising the extracellular domain (Fc ⁇ RI ⁇ -ECD) of the alpha subunit of the IgE Fc receptor, wherein the molar ratio of the sialic acid/polypeptide dimer is at least 8 to provide.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating allergic diseases comprising a polypeptide dimer having a high sialic acid content.
  • Another aspect of the present invention provides a transdermal patch comprising the pharmaceutical composition.
  • Another aspect of the present invention provides a topical patch comprising the pharmaceutical composition.
  • Another aspect of the present invention provides a food composition for improving or alleviating allergic symptoms comprising a polypeptide dimer having a high sialic acid content.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the polypeptide dimer having a high sialic acid content for the prevention or treatment of allergic diseases.
  • the polypeptide dimer having a high sialic acid content according to the present invention not only has superior persistence and safety in the body compared to the conventional anti-IgE antibody, but also strongly binds to IgE, so it has the advantage of extending the administration cycle.
  • the polypeptide dimer having a high sialic acid content according to the present invention is an IgE single target material, and does not bind to the Fc gamma receptor, unlike the conventional anti-IgE antibody to which Fc of IgG1 is applied.
  • a polypeptide dimer having a high sialic acid content can maintain a high blood concentration even when administered subcutaneously. Therefore, the polypeptide dimer having a high sialic acid content according to the present invention can be usefully used in the prevention or treatment of allergic diseases.
  • 1 is a diagram showing the results of confirming the polypeptide dimers produced in each cell line by SDS-PAGE.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of SDS-PAGE of the non-reduced and reduced forms of a polypeptide dimer according to an embodiment.
  • Figure 3 is a diagram showing the binding ability of omalizumab to IgE.
  • FIG. 4 is a diagram showing the binding ability of a polypeptide dimer (IgE TRAP ) to IgE according to an embodiment.
  • Figure 5a is a diagram showing the binding ability of a specific example of a polypeptide dimer (IgE TRAP ) or omalizumab and IgG Fc gamma receptor I (Fc ⁇ RI).
  • IgE TRAP polypeptide dimer
  • Fc ⁇ RI IgG Fc gamma receptor I
  • Figure 5b is a diagram showing the binding ability of a specific example of the polypeptide dimer (IgE TRAP ) or omalizumab and IgG Fc gamma receptor IIA (Fc ⁇ RIIA).
  • IgE TRAP polypeptide dimer
  • Fc ⁇ RIIA IgG Fc gamma receptor IIA
  • Figure 5c is a diagram showing the binding ability of a specific example of the polypeptide dimer (IgE TRAP ) or omalizumab and IgG Fc gamma receptor IIB (Fc ⁇ RIIB).
  • IgE TRAP polypeptide dimer
  • Fc ⁇ RIIB IgG Fc gamma receptor IIB
  • Figure 5d is a diagram showing the binding ability of a specific example of the polypeptide dimer (IgE TRAP ) or omalizumab and IgG Fc gamma receptor IIIA (Fc ⁇ RIIIA).
  • IgE TRAP polypeptide dimer
  • Fc ⁇ RIIIA IgG Fc gamma receptor IIIA
  • Figure 5e is a diagram showing the binding ability of the Fc gamma receptor IIIB (Fc ⁇ RIIIB) of a specific example polypeptide dimer (IgE TRAP ) or omalizumab and IgG.
  • FIG. 6 is a graph showing the quantification of the binding power of an exemplary polypeptide dimer (IgE TRAP ) or omalizumab to the Fc gamma receptors of IgG.
  • FIG. 7 is a diagram showing the degree of binding to IgE according to the concentration of the polypeptide dimer according to an embodiment.
  • FIG. 8 is a view comparing the activity inhibitory ability of mast cells derived from human Fc ⁇ RI-expressing mice according to the concentration of the polypeptide dimer protein (IgE TRAP ) and Xolere (omalizumab) according to an embodiment.
  • IgE TRAP polypeptide dimer protein
  • Xolere omalizumab
  • 9 is a view confirming the anti-allergic effect of the polypeptide dimer according to an embodiment through the measurement of the incidence of diarrhea in a food allergy model.
  • FIG. 10 is a view showing the results of SDS-PAGE of the non-reduced and reduced forms of the polypeptide dimers (SA low , SA medi and SA high ) according to an embodiment.
  • FIG. 11 is a diagram illustrating the isoelectric point of a polypeptide dimer (SA low , SA medi and SA high ) according to an embodiment.
  • FIG. 12 is a view confirming the anti-allergic effect according to subcutaneous injection of the polypeptide dimer (SA low and SA high ) of one embodiment through the measurement of the incidence of diarrhea in a food allergy model.
  • FIG. 13 is a view confirming the anti-allergic effect of the polypeptide dimers (SA low and SA high ) according to an embodiment through the measurement of blood IgE concentration in a food allergy model.
  • FIG. 14 is a view confirming the anti-allergic effect of the polypeptide dimers (SA low and SA high ) according to an embodiment through the measurement of blood MCPT-1 concentration in a food allergy model.
  • 15 is a diagram showing the pharmacokinetic profile analysis result of a specific example polypeptide dimer according to the sialic acid content in a mouse model.
  • 16 is a view confirming the anti-allergic effect according to the sialic acid content of an exemplary polypeptide dimer through body temperature measurement in a passive systemic anaphylaxis mouse model.
  • One aspect of the present invention is a polypeptide dimer comprising two monomers containing the extracellular domain (Fc ⁇ RIa-ECD) of the alpha subunit of the IgE Fc receptor, the monomer comprising an Fc region, the Fc region and Fc ⁇ RIa-ECD is bound through a hinge, and the polypeptide dimer provides a polypeptide dimer having a high sialic acid content, characterized in that the molar ratio of sialic acid/polypeptide dimer is at least 8.
  • IgE used in the present invention refers to an antibody known as immunoglobulin E. IgE has affinity for mast cells and basophils. In addition, when IgE and its corresponding antigen (allergen) react, it causes an inflammatory reaction. In addition, IgE is known to be the main cause of anaphylaxis.
  • IgE Fc receptor used in the present invention is also called an Fc ⁇ receptor, and refers to a receptor that binds to the Fc portion of IgE.
  • Fc ⁇ RI Fc ⁇ receptor I
  • Fc ⁇ RII Fc ⁇ receptor II
  • Fc ⁇ RI Fc ⁇ receptor I
  • Fc ⁇ RII Fc ⁇ receptor II
  • the Fc ⁇ RI is a membrane protein composed of one ⁇ -chain, one ⁇ -chain, and two ⁇ -chains bonded by disulfide bonds.
  • the part to which IgE binds is an ⁇ chain (Fc ⁇ RI ⁇ )
  • Fc ⁇ RI ⁇ has a size of about 60 kDa, and is composed of a hydrophobic domain present in the cell membrane and a hydrophilic domain present outside the cell membrane.
  • IgE binds to the extracellular domain of the ⁇ chain.
  • the Fc ⁇ RI ⁇ may be used interchangeably as an alpha subunit of the IgE Fc receptor.
  • the alpha subunit of the IgE Fc receptor may consist of the amino acid sequence described in NP_001992.1.
  • the extracellular domain (Fc ⁇ RIa-ECD) of the alpha subunit of the IgE Fc receptor may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the Fc ⁇ RIa-ECD may be a fragment of Fc ⁇ RIa-ECD or a variant thereof, as long as it can bind to IgE.
  • Fc ⁇ RIa-ECD of SEQ ID NO: 1 may be encoded by a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 5.
  • the variant may be performed through a method of substituting, deleting or adding one or more amino acids in wild-type Fc ⁇ RIa-ECD, as long as the function of Fc ⁇ RIa-ECD is not modified.
  • the variant may have 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the Fc region may be a wild-type Fc region or a modified Fc region.
  • the term "modified Fc region" used in the present invention refers to a region in which part of the Fc portion of an antibody has been modified.
  • the Fc region includes a heavy chain constant region 2 (CH2) and a heavy chain constant region 3 (CH3) of an immunoglobulin, and does not include the variable regions of the heavy and light chain and the light chain constant region 1 (CH1) of the immunoglobulin.
  • the modified Fc region may be prepared by substituting some amino acids in the Fc region or combining different types of Fc regions.
  • the modified Fc region may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the modified Fc region of SEQ ID NO: 2 may be encoded by a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 6.
  • the modified Fc region may be a natural sugar chain or an increased sugar chain compared to the natural type.
  • the immunoglobulin Fc sugar chain can be modified by conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms.
  • the modified Fc region does not have a binding site for the Fc gamma receptor (Fc ⁇ R) or C1q (complement component 1q), and thus may be lacking the functions of ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity) and CDC (Complement dependent Cytotoxicity). .
  • the modified Fc region may be coupled through the hinge of Fc ⁇ RI ⁇ -ECD and IgD.
  • the hinge may be a hinge region derived from immunoglobulin IgD or a variant thereof.
  • the hinge region of native IgD consists of 64 amino acids.
  • the hinge region derived from the immunoglobulin IgD or a variant thereof may be composed of 20 to 60 consecutive amino acids, 25 to 50 consecutive amino acids, or 30 to 40 amino acids.
  • the hinge variant may be a partial modification of the amino acid sequence of the hinge region of IgD in order to minimize the occurrence of a truncated form during protein production.
  • the hinge region derived from the immunoglobulin IgD or a variant thereof may be composed of 30 or 49 amino acids.
  • the hinge region derived from the immunoglobulin IgD or a variant thereof may include at least one cysteine.
  • the hinge region or a variant thereof derived from the immunoglobulin IgD may include the following sequence:
  • Xaa1 may be Lys or Gly
  • Xaa2 is Glu , Gly or Ser.
  • the hinge region derived from the immunoglobulin IgD or a variant thereof may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 19, thereby minimizing the occurrence of a truncated form during protein production.
  • the hinge region or a variant thereof derived from the immunoglobulin IgD may include the following sequence:
  • Xaa3 is Lys or Gly
  • Xaa4 may be Glu, Gly or Ser.
  • the hinge region derived from the immunoglobulin IgD or a variant thereof may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, thereby minimizing the occurrence of a truncated form during protein production.
  • threonine in the hinge region derived from the immunoglobulin IgD consisting of the amino acid represented by SEQ ID NO: 4 or a variant thereof, at least one of threonine (Thr) may be glycosylation.
  • threonine of the 13th, 14th, 18th and 19th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 may be glycosylated.
  • all four threonines can be glycosylated.
  • the saccharification may be O-glycosylation.
  • sugar chain attached to glycoprotein drugs is one of the main factors that determine quality as it plays an important role in therapeutic efficacy, persistence in the body, targeting and immune response. It was confirmed that the polypeptide dimer whose end of the sugar chain did not end with sialic acid was rapidly removed from the body.
  • sialic acid used in the present invention may include N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) of Formula 1 and N-glycorylneuraminic acid (Neu5Gc) of Formula 2:
  • the polypeptide dimer having a high sialic acid content may have a high content of N-acetylneuraminic acid.
  • the sialic acid content of the polypeptide dimer can be increased through a purification method.
  • the sialic acid content of the polypeptide dimer can be increased.
  • the polypeptide dimer having a high sialic acid content may be characterized in that the molar ratio of sialic acid/polypeptide dimer is 8 or more.
  • the sialic acid-rich polypeptide dimer has a sialic acid/polypeptide dimer molar ratio (mol/mol) of 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30.
  • the polypeptide dimer having a high sialic acid content has a molar ratio of sialic acid/polypeptide dimer of 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, It may be 23, 24 or 25.
  • the polypeptide dimer having a high sialic acid content has a molar ratio of sialic acid/polypeptide dimer of at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, or at least 21.
  • the molar ratio of the sialic acid/polypeptide dimer of the polypeptide dimer having a high sialic acid content may be 8 to 30, or 12 to 25.
  • the sialic acid/polypeptide dimer molar ratio of the polypeptide dimer having a high sialic acid content may be 10 to 25, 11 to 24, 12 to 23.
  • the molar ratio of the sialic acid/polypeptide dimer of the polypeptide dimer having a high sialic acid content is 13 to 22, 14 to 22, 15 to 22, 16 to 22, 17 to 22, 18 to 22 or 19 to 22 days.
  • the sialic acid may be N-acetylneuraminic acid.
  • the sialic acid may bind to 8 positions in the monomer including the extracellular domain (Fc ⁇ RIa-ECD) and the Fc region of the alpha subunit of the IgE Fc receptor. At this time, sialic acid may be bonded to at least four or more of the positions. Specifically, the sialic acid may be bonded to the monomer at 4, 5, 6, 7 or 8 positions.
  • the polypeptide dimer having a high sialic acid content provided by the present invention may be in a form in which two monomers to which an extracellular domain of the alpha subunit of the IgE Fc receptor and a modified Fc region are bound are combined.
  • the polypeptide dimer having a high sialic acid content may be a form in which two identical monomers are bonded by a cysteine located at a hinge site.
  • the polypeptide dimer having a high sialic acid content may be in a form in which two different monomers are combined.
  • each of the polypeptide monomers may include sialic acid at the same position, but may include sialic acid at different positions.
  • the molar ratio of the sialic acid/polypeptide dimer is 8 or more, each of the monomers constituting the dimer may have a different molar ratio of sialic acid/polypeptide.
  • the polypeptide dimer may contain two different monomers.
  • one monomer may include the extracellular domain of the alpha subunit of the IgE Fc receptor, and the other monomer may be a form including a fragment of the extracellular domain of the alpha subunit of the IgE Fc receptor.
  • one specific example of the monomer may be composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, or SEQ ID NO: 22.
  • polypeptide dimer having a high sialic acid content provided by the present invention is 10 to 100 times, 20 to 90 times, 20 to 70 times, 30 to 70 times or 40 to 70 times higher IgE than omalizumab, an anti-IgE antibody.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating allergic diseases comprising a polypeptide dimer having a high sialic acid content.
  • the polypeptide dimer is the same as described above.
  • the pharmaceutical composition may be characterized in that it is for subcutaneous injection.
  • a polypeptide dimer having a high sialic acid content it was confirmed that it is effective in the treatment and/or prevention of allergic diseases compared to a polypeptide dimer having a low sialic acid content upon subcutaneous injection.
  • allergic disease used in the present invention refers to a pathological condition caused by an allergic reaction mediated by the activation of mast cells, such as degranulation of mast cells.
  • the allergic disease is food allergy, atopic dermatitis, asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, allergic dermatitis, chronic idiopathic urticaria. (chronic idiopathic urticarial) and allergic contact dermatitis (allergic contact dermatitis) may be one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the allergic disease may be a disease mediated by IgE.
  • the polypeptide dimer in the pharmaceutical composition, as long as the polypeptide dimer can exhibit anti-allergic activity, it may be included in an arbitrary amount (effective amount) depending on the use, formulation, purpose of combination, etc., and a typical effective amount is based on the total weight of the composition. It may be determined in the range of 0.001% to 20.0% by weight.
  • the effective amount means an amount capable of inducing an anti-allergic effect. Such an effective amount can be determined by one of skill in the art.
  • the pharmaceutical composition may additionally include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in an oral dosage form or a parenteral dosage form according to the route of administration by a conventional method known in the art, including a pharmaceutically acceptable carrier.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers include sugars such as lactose, glucose, sucrose, dextrose, sorbitol, mannitol, and xylitol, corn starch, potato starch, wheat starch, and other starches, cellulose, methylcellulose, and ethylcellulose.
  • Celluloses such as sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, magnesium stearate, mineral oil, malt, gelatin, talc, polyol, Vegetable oils and the like.
  • it may include diluents and/or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • the pharmaceutical composition When the pharmaceutical composition is prepared in a parenteral formulation, it may be formulated in the form of an injection, transdermal administration, topical administration, nasal inhalation and suppository according to a method known in the art together with a suitable carrier.
  • a suitable carrier When formulated as an injection, sterile water, ethanol, polyols such as glycerol or propylene glycol, or mixtures thereof may be used as suitable carriers, preferably Ringer's solution, PBS (phosphate buffered saline) containing triethanol amine, or sterilization for injection Water, isotonic solutions such as 5% dextrose can be used.
  • the formulation of the pharmaceutical composition is known in the art, and specifically, Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995) may be referred to.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition is in the range of 0.01 ⁇ g/kg to 10 g/kg per day, preferably 0.01 mg/kg to 1 g, depending on the patient's condition, weight, sex, age, patient severity, and route of administration. May be in the range of /kg.
  • the pharmaceutical composition may be administered once a day or several times a day if the dosage is large.
  • Subjects to which the pharmaceutical composition can be applied are mammals, for example, humans, dogs, and cats, particularly preferably humans, but are not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may further include any known compounds or natural extracts, which have already been verified for safety and have anti-allergic activity, in order to increase or enhance anti-allergic activity.
  • a polypeptide dimer having a high sialic acid content has better binding ability with IgE than a polypeptide dimer having a low sialic acid content (Table 3).
  • a polypeptide dimer having a high sialic acid content is administered subcutaneously to an individual suffering from an allergic disease, it effectively reduces the concentration of IgE and MCPT-1 in the blood than a polypeptide dimer having a low sialic acid content, and a predetermined time has passed. It was confirmed that the effect persisted even after (FIGS. 13 and 14 ).
  • another aspect of the present invention provides a transdermal patch comprising the pharmaceutical composition.
  • another aspect of the present invention provides a topical patch comprising a pharmaceutical composition.
  • Another aspect of the present invention provides a food composition for improving or alleviating allergic symptoms comprising a polypeptide dimer having a high sialic acid content.
  • polypeptide dimer having a high sialic acid content is the same as described above.
  • sialic acid-rich polypeptide dimer can be combined with an appropriate delivery means for efficient delivery into the intestine.
  • the food composition may be prepared in any form, such as beverages such as tea, juice, carbonated beverages, ion beverages, processed oils such as milk, yogurt, tablets, capsules, pills, granules, liquids, powders, It can be prepared as a health functional food preparation such as flannel, paste, syrup, gel, jelly, bar, etc.
  • the food composition may be classified as an arbitrary product as long as it conforms to the enforcement regulations at the time of manufacture and distribution in terms of legal and functional classification.
  • it may be a health functional food according to the Health Functional Food Act, or confectionery, beans, tea, beverages, special purpose foods, etc., according to each food type according to the food code of the Food Sanitation Act (notified by the Ministry of Food and Drug Safety, food standards and standards).
  • food code notified by the Ministry of Food and Drug Safety, food standards and standards.
  • reference may be made to the food code or food additive code according to the Food Sanitation Act.
  • Another aspect of the present invention provides a method for treating or preventing an allergic disease comprising administering to an individual a polypeptide dimer having a high sialic acid content.
  • the polypeptide dimer having a high sialic acid content is the same as described above.
  • the individual may be a mammal, preferably a human, a dog or a cat.
  • administration may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration may be performed by subcutaneous administration, intravenous administration, mucosal administration, and intramuscular administration.
  • the allergic diseases include food allergy, atopic dermatitis, asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, allergic dermatitis, and chronic idiopathic urticaria.
  • allergic contact dermatitis may be one selected from the group consisting of.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the sialic acid-rich polypeptide dimer for preventing or treating allergic diseases.
  • a polypeptide having a modified C-terminus of the extracellular domain of the alpha subunit of the IgE Fc receptor was prepared according to the method disclosed in US Pat. No. 7,867,491.
  • the extracellular domain of the ⁇ chain of Fc ⁇ RI having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the modified immunoglobulin Fc of SEQ ID NO: 2 are respectively linked by a linker of SEQ ID NO: 19 (Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc1), a linker of SEQ ID NO: 3
  • a cassette connecting the gene encoding each protein was cloned into the pAD15 vector (Genexine), and Fc ⁇ RI ⁇ ECD -Fc protein expression vector was constructed. Then, the expression vector was transfected into CHO DG44 (from Dr. Chasin, Columbia University, USA) cells, respectively.
  • the expression vector in which the ⁇ -2,6-sialic acid transferase gene was cloned was simultaneously transfected into the pCI Hygro vector (Invitrogen) to express the sialic acid-added Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2ST and Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc3ST proteins.
  • a capable cell line was prepared separately.
  • the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc3 cell line exhibited 16.9 ⁇ g/10 6 cell productivity after 2 ⁇ M methotrexat amplification.
  • the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc3 cell line (Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc3ST) co-transfected with 2,6-sialic acid transferase showed 10.2 ⁇ g/10 6 cells productivity after 1 ⁇ M methotrexat amplification.
  • the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2 cell line showed a productivity of 20.9 ⁇ g/10 6 cells under 0.5 ⁇ M methotrexat amplification conditions.
  • the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2 cell line (Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2ST) co-transfected with 2,6-sialic acid transferase showed a productivity of 25.1 ⁇ g/10 6 cells after 0.1 ⁇ M methotrexat amplification. That is, it was confirmed that the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2ST cell line co-transfected with 2,6-sialic acid transferase selected under 0.1 ⁇ M methotrexat amplification conditions had the best productivity.
  • the polypeptide produced from the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2 cell line was named "Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2"
  • the polypeptide produced from the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2+a2,6-ST cell line was named "Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2ST”.
  • the polypeptide produced from the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc3 cell line was named "Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc3
  • the polypeptide produced from the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc3+a2,6-ST cell line was named "Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc3ST".
  • the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc3 cell line i) the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc3+a2,6-ST cell line
  • the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2+a2,6-ST cell line was batch-cultured in a 60 ml medium volume (batch culture). After purifying Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc using a Protein-A affinity column of the culture medium, the purified Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc was subjected to size-exclusion high performance liquid chromatography (SE-HPLC) and SDS-PAGE to obtain the purity of the polypeptide. was confirmed.
  • SE-HPLC size-exclusion high performance liquid chromatography
  • SDS-PAGE was performed under non-reducing conditions.
  • the non-reducing conditions are, after mixing each purified polypeptide with a non-reducing sample buffer, in Mini-Protean TGX TM gels (Bio-Rad) TGS (Tris Glycine SDS) buffer, under 200V conditions Electrophoresis was performed for 30 minutes. After electrophoresis, the protein was stained with Coomassie Brilliant Blue solution. The results are shown in Table 2 and FIG. 1.
  • the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc3 cell line i) the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc3+a2,6-ST cell line, iii) the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2+a2,6-ST cell line was batch-cultured in a 60 ml medium volume I did. Thereafter, the purified product obtained by purifying the polypeptide using the culture supernatant and the Protein-A affinity column was subjected to SE-HPLC and SDS-PAGE. At this time, the culture supernatant and the purified product were performed under non-reducing conditions and reducing conditions, respectively.
  • each purified polypeptide was mixed with a reducing sample buffer containing 2-mercaptoethanol, and then denatured for 5 minutes at 100°C. . Thereafter, electrophoresis was performed on Mini-Protean TGX TM gels (Bio-Rad) for 30 minutes at 200V using a TGS buffer. After electrophoresis, the protein was stained with Coomassie Brilliant Blue solution.
  • polypeptides of i) Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2, ii) Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2ST, iii) Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc3 and iv) Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc3ST produced in Example 1 were purified by the same method as in Example 2 and are commercially available. IgE binding strength was compared and measured with respect to the anti-IgE antibody, Omalizumab (trade name: Xolair).
  • IgE binding ability is determined by coating IgE on the channel of the Protein GLC sensor chip (Bio-Rad, Cat #. 176-5011), and omalizumab or each FceR1 ⁇ ECD-Fc protein at various concentrations at a rate of 30 ⁇ l/min. I spilled it. At this time, after confirming the zero-base using a sodium hydroxide solution having a concentration of 25 mM as a regeneration buffer, the above steps were repeated to measure. Thereafter, a binding curve was confirmed using a protein binding analyzer (Proteon XPR36, BIO-RAD, USA), and the results are shown in Table 3.
  • the association rate (ka) value of the polypeptide dimer and IgE according to an embodiment of the present invention was measured to be 1.5 to 2.0 times smaller than that of omalizumab. That is, it was found that the binding force with substances other than IgE was 1.5 to 2.0 times lower than that of omalizumab.
  • the dissociation rate (kd) value of the polypeptide dimer according to an embodiment of the present invention was measured to be 40 to 106 times greater than that of omalizumab.
  • the value of the equilibrium dissociation constant (KD ⁇ kd/ka>) of the polypeptide dimer according to an embodiment of the present invention is 22 to 69 times higher than that of omalizumab.
  • the polypeptide dimer according to an embodiment of the present invention has a remarkably increased binding capacity to IgE compared to omalizumab.
  • the polypeptide dimer to which sialic acid was added had the best IgE binding ability, 69 times as compared to omalizumab.
  • omalizumab is degraded after a certain time after binding to IgE, whereas the polypeptide dimer (Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2ST, IgE TRAP ) according to an embodiment of the present invention is once IgE After combining with, it was confirmed that it did not separate from IgE. That is, it was confirmed that the polypeptide dimer according to an embodiment of the present invention was not easily separated from IgE, and the ability to remain in a bound state was superior to omalizumab.
  • the ability of the polypeptide dimer (Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2ST, IgE TRAP ) or omalizumab (Xolair) to bind to the Fc gamma receptor of the polypeptide according to an embodiment of the present invention was measured using the Octet RED384 system (Pall ForteBio, CA, USA) And confirmed.
  • Fc gamma receptors Fc ⁇ RI, Fc ⁇ RIIA, Fc ⁇ RIIB, Fc ⁇ RIIIA or Fc ⁇ RIIIB recombinant protein were immobilized in 300 mM acetate buffer (pH 5) on the activated AR2G biosensor.
  • PBS containing 0.1% Tween-20 and 1% bovine serum (BS) was used as a running buffer. All measurements were performed at a temperature of 30° C. at a speed of 1,000 rpm on a sample plate shaker. The measurement results are shown in FIGS. 5A to 5E, and the binding ability of omalizumab and the polypeptide dimer to the IgG Fc gamma receptor is quantified and shown in FIG. 6.
  • omalizumab showed a high binding ability with the Fc gamma receptor of IgG, while the polypeptide dimer had a remarkably low binding ability with the Fc gamma receptor of IgG.
  • the polypeptide dimer did not bind to the Fc gamma receptor of IgG.
  • beta-hexosaminidase analysis was performed.
  • a polypeptide dimer (Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2) was mixed with IgE (1 ⁇ g/ml) by concentration, and incubated at a temperature of 20° C. for 30 minutes to prepare a sample.
  • the cultured mouse bone marrow-derived mast cells for mast cell activation were washed with HBSS (Hank's balanced salt solution) buffer to remove the medium. After measuring the number of cells, 5x10 5 cells were removed in 40 ⁇ l Resuspended in HBSS buffer.
  • Each of the polypeptide dimers and Xolere were prepared by concentration, mixed with human IgE (1 ⁇ g/ml), and incubated at room temperature for 30 minutes to prepare a sample.
  • human IgE 1 ⁇ g/ml
  • mast cells derived and differentiated from the bone marrow of a mouse into which the human Fc ⁇ RI gene was introduced and the mouse Fc ⁇ RI gene was removed were prepared. After the prepared mast cells were washed with HBSS buffer, 5 ⁇ 10 5 cells were resuspended in 60 ⁇ l of HBSS buffer.
  • the IC 50 of the polypeptide dimer was measured to be approximately 11.16 ng/ml, and the IC 50 of Xolair was measured to be approximately 649.8 ng/ml. Therefore, it was confirmed that the polypeptide dimer has a mast cell activity inhibitory ability that is 58 times higher than that of Xolair.
  • mice After oral administration of the OVA twice, the mice were classified into three groups of 7 mice each on the 31st day.
  • the first group the group administered with a high concentration (200 ⁇ g) of the polypeptide dimer (Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2ST), the second group, the group administered with a low concentration (20 ⁇ g), and the third group, the group not administered were classified.
  • mice were sacrificed on day 37 to analyze the number of mast cells in the small intestine, the concentration of IgE in the blood, and the concentration of degranulation enzymes (MCPT-1, Mast cell protease-1) of the mast cells in the blood for mice belonging to each group.
  • MCPT-1 degranulation enzymes
  • mice of the third group As a result, as shown in FIG. 9, diarrhea occurred in the mice of the third group after oral administration of the second OVA.
  • the mice of the first and second groups developed diarrhea after oral administration of the third OVA.
  • the mice of the first group had a lower incidence of diarrhea than the mice of the second group, and through this, it was confirmed that the food allergic effect increased in proportion to the concentration of the polypeptide dimer.
  • Example 1 The production rate of the polypeptide produced from the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2+a2,6-ST cell line is the highest, and in Experimental Examples 4 to 6, the anti-allergic effect of the polypeptide dimer (Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2ST) is excellent.
  • the sialic acid content of the polypeptide dimer (Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2ST) was analyzed to determine the anti-allergic efficacy of the polypeptide dimer.
  • Example 1 prepared in Example 1 In order to measure the sialic acid content contained in the glycan structure of the polypeptide dimer (Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2ST) produced from the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2+a2,6-ST cell line, first, sialidase, a sialic acid-degrading enzyme. ) To separate sialic acid. Then, the separated sialic acid was separated, detected, and quantified using HPLC (waters, alliance e2659).
  • HPLC waters, alliance e2659
  • the polypeptide dimer was separated and purified by dividing into three samples according to the pH gradient. Three samples were placed in an AmiconUltra 10K (Millipore, UFC501096) filter, centrifuged for 10 minutes under conditions of 13,000 rpm and 4°C, and repeated 5 times to exchange the concentrate with deionized water and concentrated. The concentration of the sample was 10 mg/ml or more when measured at a wavelength of 280 nm.
  • the sample was reacted in an incubator at 37° C. for 18 hours, then placed in an AmiconUltra 10K filter, centrifuged at 13,000 rpm and 4° C. for 15 minutes, and the filtrate exiting the filter was used for analysis.
  • HPLC analysis conditions are shown in Table 4 below.
  • the standard material for calculating the sialic acid content is a mixture of N-acetylneuraminic acid (N-acetylneuraminic acid, hereinafter referred to as NANA) and N-glycolylneuraminic acid (N-glycolylneuraminic acid, hereinafter referred to as NGNA).
  • NANA N-acetylneuraminic acid
  • NGNA N-glycolylneuraminic acid
  • the NANA sialic acid content of the sample was calculated using the NANA content.
  • the sialic acid content of the sample was expressed as a sialic acid/sample mole ratio (mol/mol).
  • Sialic acid content of the sample (NANA molar concentration of the sample)/(Molar concentration of the sample)
  • the NGNA content of the sample was calculated using the NGNA content.
  • the content of NGNA in the sample was expressed as the NGNA/analytical sample molar ratio (mol/mol).
  • the sialic acid content of the samples separated and purified by dividing into three samples according to the pH gradient was measured differently.
  • SA low In order to compare the anti-allergic efficacy according to the sialic acid content, it was named "SA low ", “SA medi” and "SA high " in the order of sialic acid content.
  • sensitization was induced by intraperitoneal administration of 50 ⁇ g of OVA and 1 mg of Alum to Balb/c mice (Orientbio) at 14 days intervals. Thereafter, on days 28, 30, 32, 34, 36, 38, and 40, OVA 50 mg was orally administered over a total of 7 times to induce food allergy. At this time, oral administration of OVA was performed after fasting for 4 hours.
  • mice After oral administration of the OVA twice, the mice were classified into 3 groups of 7 mice each on the 40th day.
  • the first group a group in which a polypeptide dimer having a high sialic acid content (SA high ) is administered subcutaneously at a high concentration (200 ⁇ g)
  • a second group a polypeptide dimer having a low sialic acid content (SA low )
  • SA high a polypeptide dimer having a high sialic acid content
  • SA low a polypeptide dimer having a low sialic acid content
  • mice of the third group had diarrhea after oral administration of the fourth OVA.
  • the second group of mice developed diarrhea after oral administration of the fifth OVA.
  • the incidence of diarrhea rapidly increased in mice in the second group after oral administration of the 6th OVA.
  • diarrhea occurred after oral administration of the 6th OVA, but the incidence of diarrhea did not increase even after oral administration of the 7th OVA (FIG. 12 ).
  • SA high polypeptide dimer having a high sialic acid content
  • SA low a polypeptide dimer having a low sialic acid content
  • a 96-well plate was coated with a polypeptide dimer diluted in PBS (SA low and SA high ), and reacted at 4°C overnight. The next day, after washing with PBS containing 0.05% tween 20 (hereinafter, washing buffer), a blocking buffer (assay diluent) was added and reacted for 1 hour. Thereafter, after washing with a washing buffer, mouse IgE to be used as a standard solution and a serum sample of a mouse were diluted in 1X assay diluent, placed in a plate, and reacted for 2 hours.
  • washing buffer PBS containing 0.05% tween 20
  • assay diluent assay diluent
  • the blood IgE concentration was calculated to be about 8,000 ng/ml.
  • the concentration of IgE in the blood was calculated to be about 7,000 ng/ml.
  • SA high polypeptide dimer having a high sialic acid content
  • a 96-well-immune plate was coated with a mouse anti-MCPT-1 antibody and reacted at 4°C overnight.
  • the next day after washing with PBS containing 0.05% tween 20 (hereinafter, washing buffer), PBS containing 1% BSA (Bovine serum albumin) (hereinafter referred to as blocking buffer, assay diluent) was added and reacted for 1 hour.
  • PBS containing 1% BSA Bovine serum albumin
  • blocking buffer assay diluent
  • the concentration of MCPT-1 in the blood was calculated to be about 4,000 ng/ml.
  • the concentration of MCPT-1 in blood was calculated to be about 4,200 ng/ml.
  • SA high polypeptide dimer having a high sialic acid content
  • Example 3 Preparation of a polypeptide dimer containing a high content of sialic acid through purification
  • polypeptide dimer containing various ranges of sialic acid was obtained. Specifically, the polypeptide dimer obtained from the Fc ⁇ RI ⁇ ECD-Fc2+a2,6-ST cell line was purified using affinity chromatography and anion exchange chromatography.
  • the cell culture solution was subjected to affinity chromatography to remove primary impurities from the culture solution.
  • Affinity chromatography is Amshpere TM A3 resin is packed (packing) the Amsphere TM A3 pre-packed column (Amsphere TM A3 pre-packed column ; bed height (bed hight) 5 cm, bulk (volume) 5 ml) and liquid chromatography It was carried out using the AKTA Avant 25 equipment, which is a graphic system. At this time, the elution buffer was performed using 100 mM Glycine, pH 3.3.
  • the sialic acid content of 7.0 mol/mol, 10.3 mol/mol, 12.9 mol/mol, 14.9 mol/mol and 21.4 mol/ prepared in Example 3 Moles of the polypeptide dimers were injected subcutaneously into mice at a concentration of 10 mg/kg each.
  • blood was collected at 0 hours, 3 hours, 10 hours, 24 hours, 72 hours, 168 hours, and 240 hours after administration of the substance and analyzed by the following method.
  • Anti-Fc ⁇ RI antibody (Invitrogen) was diluted in 1X PBS (Welgene) to a concentration of 0.5 ⁇ g/ml, added to an immunoplate (Thermo), and reacted overnight at 4°C. The immunoplate after the reaction was washed with 1X PBST, and I-Block solution (invitrogen), a blocking solution, was added per well and reacted at room temperature for 1 hour. During blocking, a standard and a sample for analysis were prepared.
  • the polypeptide dimer was diluted in 1% BSA/PBS containing mouse blank serum at a concentration of 0.19 ng/ml to 200 ng/ml and prepared as a standard material, and the sample for analysis was also 1% BSA/PBS containing blank serum. It was prepared by diluting it to 1/20-1/300 using.
  • the plate after blocking was washed with 1X PBST, and the prepared standard and sample for analysis were added per well, and then reacted at room temperature for 1 hour.
  • anti-human IgG4-HRP Southern biotech
  • TMB solution TMB solution
  • the plate on which the reaction was terminated was measured for absorbance and numerical analysis at 450 nm wavelength within 5 minutes.
  • the resulting pharmacokinetic graph and pharmacokinetic parameter results of the polypeptide dimer according to the resulting sialic acid content are shown in FIGS. 15 and 7.
  • Transponder-inserted Balb/c mice measured body temperature and administered intraperitoneally with 20 ⁇ g of anti-DNP IgE (Sigma) containing 0.9% NaCl, and polypeptides with different sialic acid contents 10 mg/kg of the dimer was injected subcutaneously. After 24 hours, the mouse body temperature was measured before administration of DNP-HAS (Sigma) containing 0.9% NaCl of foreign antigen. Thereafter, 1 mg of antigen was administered intravenously. After administration, the mouse body temperature was measured for 1 hour at 10-minute intervals using a remote thermometer (Bio medic data systems). The experimental results are shown in FIG. 16.
  • the mouse body temperature decreased in the group administered with the vehicle and the sialic acid content of 10.3 mol/mol polypeptide dimer, but the mouse body temperature did not decrease in the group having a sialic acid content of 14.9 mol/mol or more.
  • the polypeptide dimer having a high sialic acid content is superior to the dimer having a low sialic acid content in reducing the induction of passive systemic anaphylaxis.

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Abstract

본 발명은 시알산 함량이 높은 변형된 IgE Fc 수용체 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 기존에 사용되는 항-IgE 항체에 비하여 체내 지속성 및 안전성이 우수할 뿐만 아니라, IgE와 강하게 결합하므로, 투여 주기를 늘릴 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명에 따른 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 IgE 단일표적 물질로서, IgG1의 Fc가 적용된 기존의 항-IgE 항체와는 다르게 Fc gamma 수용체와는 결합하지 않는다. 이로 인해 비만세포 표면의 Fc gamma 수용체와의 결합에 의한 매개자 방출을 억제할 수 있어, IgG1과 비만세포의 Fc gamma 수용체 III와의 결합에 의해 유발될 수 있는 아나필락시스 등의 부작용을 최소화할 수 있다. 뿐만 아니라, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 피하 투여의 경우에도 높은 혈중 농도를 유지할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 알러지 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

IGE FC 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인을 포함하는 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
본 발명은 IgE Fc 수용체를 포함하고 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
현대사회가 산업화되고 식습관이 서구화되면서 천식을 비롯한 알러지성 비염, 아토피 피부염, 식품 알러지 등 알러지 질환의 발병률이 증가하고 있다. 중증 알러지 질환인 아나필락시스(anaphylaxis)의 발병률도 증가하고 있다. 이러한 알러지 질환은 개인 삶의 질을 떨어트리며, 경제적 비용도 증가시키고 있어, 이를 극복하기 위한 대책이 절실한 실정이다.
대부분의 알러지 질환은 면역글로불린 E(IgE)의 과잉 면역반응에 의해 유발된다. IgE는 정상적인 상태에서는 혈액 내 아주 낮은 농도로 존재하는 항체이다. IgE는 일반적으로 무해한 항원에 의해서 생성되기도 하며, 특별한 자극 없이도 IgE가 증가되는 경우가 있다. 이러한 경우 알러지 질환이 야기될 수 있다. 비정상적으로 증가된 IgE는 비만세포(mast cell)와 호염기성 과립구(basophils) 등의 표면에 발현되는 고친화성 IgE 수용체(high-affinity IgE receptor, 이하, FcεRI)에 결합할 수 있다. 이러한 결합에 의해 비만세포나 호염기성 과립구는 히스타민, 류코트리엔, 프로스타글란딘, 브라디키닌 및 혈소판-활성화 인자 등 화학 매개자를 방출한다. 방출된 화학 매개자에 의해 알러지 증상이 나타나게 된다. 즉, 알러지 질환은 IgE와 FcεRI의 결합으로 인해 증상이 악화될 수 있다. 또한, 알러지 환자에서 FcεRI을 발현하는 세포가 증가된다고 알려져 있다.
현재, 알러지 질환을 치료하기 위해 알레르겐 회피, 항알러지 약물 투여, 체내 IgE 합성 조절, 항-IgE 항체 등의 방법이 제안되었다. 그러나, 약제의 효능이 불충분하거나 심각한 부작용이 발생하는 등의 문제점이 남아있다. 최근, IgE 및 FcγRIIb에 고친화성으로 결합하며, 막에 고정된 IgE를 발현하는 세포를 억제할 수 있는 조성물이 연구된 바 있다. 이러한 조성물은 알러지 및 천식을 포함하여 IgE가 매개된 질환을 치료하는데 유용하다고 보고된 바 있다(KR10-1783272B).
특히, IgE의 Fc부분을 표적으로 하는 오말리주맙(Omalizumab, 상품명: 졸레어(Xolair))이 개발되어 난치성 중증 천식과 난치성 두드러기 치료제로 사용되고 있다. 하지만, 효과를 유지하기 위해서는 오말리주맙을 고용량으로 투여하여야 하기 때문에 비용부담이 크고, 혈관부종, 아나필락시스 반응 등의 부작용이 있다는 것이 보고되었다(The Journal of Clinical Investigation Volume 99, Number 5, March 1997, 915-925). 그뿐 아니라, 시판 후 알러지성 육아종 혈관염, 특발성 중증 혈소판감소증 등의 심각한 이상반응이 보고되었다.
이에 본 발명자들은 안전하고 효과적인 알러지 질환 치료제를 개발하기 위해 연구하였다. 그 결과, IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인을 포함하는 단량체(FcεRIα-ECD) 두 개를 포함하는 폴리펩티드 이량체의 시알산 함량이 높을 경우, 상기 폴리펩티드 이량체가 IgE와의 결합능이 우수할 뿐 아니라, 혈중 농도가 높게 유지되는 것을 발견하였다. 특히, 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체를 피하로 투여할 경우에도 체내로 효과적인 전달이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면은, 시알산/폴리펩티드 이량체의 몰 비율이 적어도 8인, IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인(FcεRIα-ECD)을 포함하는 단량체 두 개를 포함하는 폴리펩티드 이량체를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체를 포함하는 알러지 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 약학적 조성물을 포함하는 경피 패치를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 약학적 조성물을 포함하는 국소 패치를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체를 포함하는 알러지 증상 개선 또는 완화용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 알러지 질환 예방 또는 치료를 위한 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 기존에 사용되는 항-IgE 항체에 비하여 체내 지속성 및 안전성이 우수할 뿐만 아니라, IgE와 강하게 결합하므로, 투여 주기를 늘릴 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명에 따른 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 IgE 단일표적 물질로서, IgG1의 Fc가 적용된 기존의 항-IgE 항체와는 다르게 Fc gamma 수용체와는 결합하지 않는다. 이로 인해 비만세포 표면의 Fc gamma 수용체와의 결합에 의한 매개자 방출을 억제할 수 있어, IgG1과 비만세포의 Fc gamma 수용체 III와의 결합에 의해 유발될 수 있는 아나필락시스 등의 부작용을 최소화할 수 있다. 뿐만 아니라, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 피하 투여의 경우에도 높은 혈중 농도를 유지할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 알러지 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 각 세포주에서 생산된 폴리펩티드 이량체를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 폴리펩티드 이량체의 비환원된 형태 및 환원된 형태의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 오말리주맙의 IgE에 대한 결합능을 나타내는 도면이다.
도 4는 일 구체예에 따른 폴리펩티드 이량체(IgETRAP)의 IgE에 대한 결합능을 나타낸 도면이다.
도 5a는 일 구체예인 폴리펩티드 이량체(IgETRAP) 또는 오말리주맙과 IgG Fc gamma 수용체I(FcγRI)의 결합능을 나타낸 도면이다.
도 5b는 일 구체예인 폴리펩티드 이량체(IgETRAP) 또는 오말리주맙과 IgG Fc gamma 수용체IIA(FcγRIIA)의 결합능을 나타낸 도면이다.
도 5c는 일 구체예인 폴리펩티드 이량체(IgETRAP) 또는 오말리주맙과 IgG Fc gamma 수용체IIB(FcγRIIB)의 결합능을 나타낸 도면이다.
도 5d는 일 구체예인 폴리펩티드 이량체(IgETRAP) 또는 오말리주맙과 IgG Fc gamma 수용체IIIA(FcγRIIIA)의 결합능을 나타낸 도면이다.
도 5e는 일 구체예인 폴리펩티드 이량체(IgETRAP) 또는 오말리주맙과 IgG의 Fc gamma 수용체IIIB(FcγRIIIB)의 결합능을 나타낸 도면이다.
도 6은 일 구체예인 폴리펩티드 이량체(IgETRAP) 또는 오말리주맙과 IgG의 Fc gamma 수용체들의 결합력을 수치화한 그래프이다.
도 7은 일 구체예에 따른 폴리펩티드 이량체의 농도에 따른 IgE와 결합 정도를 나타낸 도면이다.
도 8은 일 구체예에 따른 폴리펩티드 이량체 단백질(IgETRAP) 및 졸레어(오말리주맙)의 농도에 따른 인간 FcεRI 발현 마우스 유래 비만세포의 활성 억제력을 비교한 도면이다.
도 9는 식품 알러지 모델에서 설사 발생 빈도 측정을 통해 일 구체예에 따른 폴리펩티드 이량체의 항알러지 효과를 확인한 도면이다.
도 10은 일 구체예에 따른 폴리펩티드 이량체(SAlow, SAmedi 및 SAhigh)의 비환원된 형태 및 환원된 형태의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 일 구체예에 따른 폴리펩티드 이량체(SAlow, SAmedi 및 SAhigh)의 등전점을 확인한 도면이다.
도 12는 식품 알러지 모델에서 설사 발생 빈도 측정을 통해 일 구체예의 폴리펩티드 이량체(SAlow 및 SAhigh)의 피하 주사에 따른 항알러지 효과를 확인한 도면이다.
도 13은 식품 알러지 모델에서 혈중 IgE 농도 측정을 통해 일 구체예에 따른 폴리펩티드 이량체(SAlow 및 SAhigh)의 항알러지 효과를 확인한 도면이다.
도 14는 식품 알러지 모델에서 혈중 MCPT-1 농도 측정을 통해 일 구체예에 따른 폴리펩티드 이량체(SAlow 및 SAhigh)의 항알러지 효과를 확인한 도면이다.
도 15는 마우스 모델에서 시알산 함량에 따른 일 구체예인 폴리펩티드 이량체의 약동학 프로파일 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 수동성 전신적 아나필락시스 마우스 모델에서 체온 측정을 통해 일 구체예인 폴리펩티드 이량체의 시알산 함량에 따른 항알러지 효과를 확인한 도면이다.
본 발명의 일 측면은, IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인(FcεRIa-ECD)을 포함하는 단량체 두 개를 포함하는 폴리펩티드 이량체로서, 상기 단량체는 Fc 영역을 포함하며, 상기 Fc 영역과 FcεRIa-ECD는 힌지를 통해 결합되고, 상기 폴리펩티드 이량체는 시알산/폴리펩티드 이량체의 몰 비율이 적어도 8인 것을 특징으로 하는 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체를 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "IgE"란, 면역글로불린 E로 알려진 항체를 의미한다. IgE는 비만세포나 호염기구 등에 친화성을 가진다. 또한, IgE와 그것에 대응하는 항원(알레르겐)이 반응하면 염증반응을 일으킨다. 또한, IgE는 아나필락시스(anaphylaxis)를 일으키는 주된 원인으로 알려져 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "IgE Fc 수용체"란, Fcε수용체라고도 불리며, IgE의 Fc 부분과 결합하는 수용체를 의미한다. 상기 수용체는 2개의 종류가 존재한다. IgE의 Fc에 대해 고친화성인 수용체는 Fcε수용체I(FcεRI)라고 한다. IgE의 Fc에 대해 저친화성인 수용체는 Fcε수용체II(FcεRⅡ)라고 한다. FcεRI은 비만세포와 호염기구에서 발현된다. FcεRI에 결합한 IgE 항체가 다가 항원에 의해 가교되면, 비만세포 또는 호염기구에서 탈과립이 생겨 히스타민 등의 여러 화학물질을 방출한다. 이러한 방출에 의해 즉시형 알러지 반응이 일어난다.
상기 FcεRI는 하나의 α사슬과 한 개의 β사슬 및 2황화 결합한 2개의 γ사슬로 구성된 막단백질이다. 이 중에서 IgE가 결합하는 부분은 α사슬(FcεRIα)로서, FcεRIα는 60 kDa 정도의 크기를 가지며, 세포막 안에 존재하는 소수성 도메인과 세포막 외부에 존재하는 친수성 도메인으로 구성된다. 특히, α사슬의 세포외 도메인에 IgE가 결합하게 된다. 상기 FcεRIα는 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛으로 혼용되어 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛은 NP_001992.1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인(FcεRIa-ECD)은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 FcεRIa-ECD는 IgE와 결합할 수 있는 한, FcεRIa-ECD의 단편 또는 이의 변이체일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 FcεRIa-ECD는 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
상기 변이체는 FcεRIa-ECD의 기능을 변형시키지 않는 한, 야생형 FcεRIa-ECD에서 하나 이상의 아미노산을 치환, 결실 또는 추가하는 방법을 통하여 수행될 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 것일 수 있다.
이때, 상기 Fc 영역은 야생형 Fc 영역 또는 변형된 Fc 영역일 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용하는 용어 "변형된 Fc 영역"이란, 항체의 Fc 부분 중 일부가 변형된 영역을 의미한다. 이때, 상기 Fc 영역은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CH1)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 특히, 변형된 Fc 영역은 Fc 영역 중 일부 아미노산이 치환되거나, 서로 다른 종류의 Fc 영역을 조합하여 제조된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 변형된 Fc 영역은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 서열번호 2의 변형된 Fc 영역은 서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
또한, 상기 변형된 Fc 영역은 천연형 당쇄 또는 천연형에 비해 증가된 당쇄 일 수 있다. 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린 Fc 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 변형된 Fc 영역은 Fc gamma 수용체(FcγR) 또는 C1q(complement component 1q)에 대한 결합 부위를 갖지 않음으로 ADCC(antibody dependent Cellular Cytotoxicity) 및 CDC(Complement dependent Cytotoxicity) 기능이 결여된 것일 수 있다.
일 구체예로, 상기 변형된 Fc 영역은 FcεRIα-ECD와 IgD의 힌지를 통해 결합될 수 있다. 상기 힌지는 면역글로불린 IgD에서 유래한 힌지 영역 또는 이의 변이체일 수 있다. 천연형 IgD의 힌지 영역은 64개 아미노산으로 이루어져 있다. 상기 면역글로불린 IgD에서 유래한 힌지 영역 또는 이의 변이체는 20 내지 60개의 연속된 아미노산, 25 내지 50개의 연속된 아미노산 또는 30 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다. 이때, 상기 힌지 변이체는 단백질 생산 과정에서 절단형 발생을 최소화하기 위해 IgD의 힌지 영역의 아미노산 서열의 일부를 변형한 것일 수 있다.
일 구체예로, 상기 면역글로불린 IgD에서 유래한 힌지 영역 또는 이의 변이체는 30개 또는 49개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다. 상기 면역글로불린 IgD에서 유래한 힌지 영역 또는 이의 변이체는 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다.
일 실시예로, 상기 면역글로불린 IgD에서 유래한 힌지 영역 또는 이의 변이체는 다음과 같은 서열을 포함할 수 있다:
Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (서열번호 17), 이때, Xaa1은 Lys 또는 Gly일 수 있으며, Xaa2는 Glu, Gly 또는 Ser일 수 있다. 구체적으로, 상기 면역글로불린 IgD에서 유래한 힌지 영역 또는 이의 변이체는 서열번호 3 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 이를 통해 단백질 생산 과정에서 절단형 발생을 최소화할 수 있다.
또한, 다른 실시예로, 상기 면역글로불린 IgD에서 유래한 힌지 영역 또는 이의 변이체는 다음과 같은 서열을 포함할 수 있다:
Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (서열번호 18)이며, 이때, Xaa3은 Lys 또는 Gly이며, Xaa4는 Glu, Gly 또는 Ser일 수 있다. 구체적으로, 상기 면역글로불린 IgD에서 유래한 힌지 영역 또는 이의 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 이를 통해 단백질 생산 과정에서 절단형 발생을 최소화할 수 있다.
특히, 서열번호 4로 표시되는 아미노산으로 이루어진 면역글로불린 IgD에서 유래한 힌지 영역 또는 이의 변이체에 있어서, 트레오닌(Thr) 중 적어도 하나는 당화(glycosylation)될 수 있다. 구체적으로, 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열 중, 13번째, 14번째, 18번째 및 19번째의 트레오닌이 당화될 수 있다. 바람직하게, 상기 4개의 트레오닌이 모두 당화될 수 있다. 이때, 상기 당화는 O-당화(O-glycosylation)일 수 있다.
당단백질 의약품에 부착되어 있는 당사슬은 치료 효능, 체내 지속성, 타겟팅 및 면역반응 등에 있어서 중요한 역할을 수행하기에 품질을 결정하는 주요 인자 중 하나이다. 당사슬의 말단이 시알산으로 끝나지 않은 폴리펩티드 이량체는 체내에서 빠르게 제거됨을 확인하였다.
본 발명에서 사용하는 용어 "시알산"은 하기 화학식 1의 N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac) 및 화학식 2의 N-글리코릴뉴라민산(Neu5Gc)을 포함할 수 있다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2020008855-appb-I000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2020008855-appb-I000002
.
이때, 일 구체예로, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 N-아세틸뉴라민산의 함량이 높은 것일 수 있다.
또한, 폴리펩티드 이량체의 시알산 함량은 정제 방법을 통하여 높일 수 있다. 또한, 시알산 전이효소 유전자가 도입된 세포에서 폴리펩티드 이량체를 생산함으로써, 상기 폴리펩티드 이량체의 시알산 함량을 높일 수 있다.
상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 시알산/폴리펩티드 이량체의 몰 비율이 8 이상인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 시알산/폴리펩티드 이량체의 몰 비율(mol/mol)이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30인 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 시알산/폴리펩티드 이량체의 몰 비율이 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25인 것일 수 있다.
일 구체예로, 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 시알산/폴리펩티드 이량체의 몰 비율이 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 또는 적어도 21일 수 있다. 또한, 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체의 시알산/폴리펩티드 이량체의 몰 비율은 8 내지 30, 또는 12 내지 25일 수 있다. 또한, 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 시알산/폴리펩티드 이량체의 몰 비율은 10 내지 25, 11 내지 24, 12 내지 23 일 수 있다. 또한, 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체의 시알산/폴리펩티드 이량체의 몰 비율은 13 내지 22, 14 내지 22, 15 내지 22, 16 내지 22, 17 내지 22, 18 내지 22 또는 19 내지 22일 수 있다. 이때, 상기 시알산은 N-아세틸뉴라민산일 수 있다.
또한, 상기 시알산은 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인(FcεRIa-ECD) 및 Fc 영역을 포함하는 단량체에서 8개의 위치에 결합할 수 있다. 이때, 시알산은 상기 위치 중 적어도 4개 이상의 위치에 결합할 수 있다. 구체적으로, 상기 시알산은 단량체에 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 위치에 결합할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 상술한 바와 같이, IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인과 변형된 Fc 영역이 결합된 단량체 두 개가 결합된 형태일 수 있다. 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 동일한 두 개의 단량체가 힌지 부위에 위치한 시스테인에 의해 결합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 서로 상이한 단량체 두 개가 결합된 형태일 수 있다.
이때, 각각의 폴리펩티드 단량체는 동일한 위치에 시알산을 포함할 수 있으나, 서로 다른 위치에 시알산을 포함할 수 있다. 또한, 시알산/폴리펩티드 이량체의 몰 비율이 8 이상일 경우라면, 이량체를 구성하는 각각의 단량체는 서로 상이한 시알산/폴리펩티드의 몰 비율을 가질 수 있다.
또한, 상기 폴리펩티드 이량체는 서로 상이한 두 개의 단량체를 포함할 수 있다. 구체적으로, 하나의 단량체는 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인을 포함하고, 다른 단량체는 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인의 단편을 포함한 형태일 수 있다. 이때, 상기 단량체의 일 구체예는 서열번호 20, 서열번호 21 또는 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 제공하는 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 항-IgE 항체인 오말리주맙 대비 10 내지 100배, 20 내지 90배, 20 내지 70배, 30 내지 70배 또는 40 내지 70배 높은 IgE 결합력을 나타내며, 바람직하게는 오말리주맙 대비 약 70배 높은 IgE 결합력을 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체를 포함하는 알러지 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 폴리펩티드 이량체는 상술한 바와 동일하다. 특히, 상기 약학적 조성물은 피하 주사제용인 것을 특징으로 할 수 있다. 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체의 경우에는 피하 주사시에 시알산 함량이 낮은 폴리펩티드 이량체에 비해 알러지 질환의 치료 및/또는 예방에 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명에서 사용하는 용어 "알러지 질환"이란, 비만세포의 탈과립 등 비만세포의 활성화가 매개된 알러지 반응으로 인하여 초래되는 병리적 증상을 의미한다. 예를 들어, 상기 알러지 질환은 식품 알러지, 아토피 피부염(atopic dermatitis), 천식(asthma), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 알러지성 결막염(allergic conjunctivitis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 만성 특발성 두드러기(chronic idiopathic urticarial) 및 알러지성 접촉성 피부염(allergic contact dermatitis)으로 구성된 군에서 선택된 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 상기 알러지 질환은 IgE에 의해 매개되는 질환일 수 있다.
상기 약학적 조성물 내에서 폴리펩티드 이량체는 항알러지 활성을 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 20.0 중량% 범위에서 결정될 수 있다. 상기 유효량은 항알러지 효과를 유도할 수 있는 양을 의미한다. 이러한 유효량은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화할 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 국소 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ㎍/㎏ 내지 10 g/㎏ 범위, 바람직하게는 0.01 ㎎/㎏ 내지 1 g/㎏ 범위일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 1일 1회 또는 투여량이 많은 경우에는 하루에 수회에 걸쳐 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물이며, 예를 들어, 사람, 개 및 고양이일 수 있고, 특히 사람인 경우가 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 항알러지 활성의 상승 또는 보강을 위해, 이미 안전성이 검증되고 항알러지 활성을 갖는 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명자들은 안전하고 효과적인 알러지 질환 치료제를 개발하기 위해 연구한 결과, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체가 시알산 함량이 낮은 폴리펩티드 이량체보다 IgE와의 결합능이 우수한 것을 확인하였다(표 3). 또한, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체를 알러지 질환을 앓고 있는 개체에게 피하 투여하는 경우, 시알산 함량이 낮은 폴리펩티드 이량체보다 혈액 내 IgE 및 MCPT-1 농도를 효과적으로 감소시키며, 소정의 시간이 지난 후에도 그 효과가 지속되는 것을 확인하였다(도 13 및 도 14).
이에 본 발명의 또 다른 측면은, 상기 약학적 조성물을 포함하는 경피 패치(transdermal patch)를 제공한다. 또한, 본 발명의 또 다른 측면은, 약학적 조성물을 포함하는 국소 패치(topical patch)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체를 포함하는 알러지 증상 개선 또는 완화용 식품 조성물을 제공한다.
상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 상술한 바와 동일하다. 또한, 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 장내로 효율적인 전달을 위해 적절한 전달 수단과 결합될 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다.
상기 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품으로 구분될 수 있다. 예컨대 건강기능식품에 관한 법률에 따른 건강기능식품이거나, 식품위생법의 식품공전(식약처 고시, 식품의 기준 및 규격)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다. 상기 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품 첨가물과 관련해서는 식품위생법에 따른 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 알러지 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체는 상술한 바와 동일하다.
상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간, 개 또는 고양이일 수 있다. 이때, 투여는 경구 또는 비경구를 통하여 투여할 수 있다. 이때, 비경구는 피하 투여, 정맥 투여, 점막 투여, 근육 투여 등의 방법으로 수행될 수 있다.
상기 알러지 질환은 식품 알러지, 아토피 피부염(atopic dermatitis), 천식(asthma), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 알러지성 결막염(allergic conjunctivitis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 만성 특발성 두드러기(chronic idiopathic urticarial) 및 알러지성 접촉성 피부염(allergic contact dermatitis)으로 구성된 군에서 선택된 하나일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 알러지 질환을 예방하거나 치료하기 위한 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. FcεRIα-ECD과 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 제조
IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인(FcεRIα ECD)의 C-말단이 변형된 폴리펩티드는 미국 특허 7,867,491에 개시된 방법에 따라 제조하였다.
먼저, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 FcεRI의 α사슬의 세포외 도메인과 서열번호 2의 변형된 면역글로불린 Fc가 각각, 서열번호 19의 링커로 연결된 단백질(FcεRIαECD-Fc1), 서열번호 3의 링커로 연결된 단백질(FcεRIαECD-Fc2) 및 서열번호 4의 링커로 연결된 단백질(FcεR1αECD-Fc3)을 발현시키기 위하여, 각각의 단백질을 코딩하는 유전자를 연결한 카세트를 pAD15 벡터(제넥신)에 클로닝하여, FcεRIαECD-Fc 단백질 발현 벡터를 제작하였다. 그 후, 상기 발현 벡터를 각각 CHO DG44(from Dr. Chasin, Columbia University, USA) 세포에 형질주입하였다.
이때, 세포주에 형질 주입시 pCI Hygro 벡터(Invitrogen)에 α-2,6-시알산 전이효소 유전자가 클로닝된 발현 벡터를 동시에 형질주입하여, 시알산이 부가된 FcεRIαECD-Fc2ST 및 FcεRIαECD-Fc3ST 단백질을 발현할 수 있는 세포주를 별도로 제조하였다.
1차 스크리닝 과정으로 HT(5-hydroxytrypamine)가 없는 10% dFBS(Gibco, USA, 30067-334), MEMα(Gibco, 12561, USA, Cat No. 12561-049), HT+(Gibco, USA, 11067-030)) 배지를 사용하여 HT 선별을 수행하였다. 이후, DHFR(dihydrofolate reductase)-시스템을 이용하여 생산성을 증폭시키기 위해, HT 선별된 클론들을 이용하여 메토트렉사트(MTX) 증폭을 수행하였다.
MTX 증폭이 완료된 후 생산성 평가를 위한 세포 안정화를 위해 1회 내지 5회 정도 계대 배양을 진행하였다. 그 후, MTX 증폭이 된 세포의 단위 생산성 평가를 수행하였고, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
Version Media MTX conc. Productivity
3-day culture Batch culture(㎎/㎖)
㎍/㎖ ㎍/106 cells
FcεRIαECD-Fc2 Ex-cellDHFR 500nM 37.23 20.9 225
FcεRIαECD-Fc2+a2,6-ST 100nM 45.4 25.1 338.2
FcεRIαECD-Fc3 2uM 27.0 16.9 180.4
FcεRIαECD-Fc3+a2,6-ST 1uM 17.5 10.2 101.7
상기 표 1에 기재된 바와 같이, FcεRIαECD-Fc3 세포주는 2 μM 메토트렉사트 증폭한 후 16.9 ㎍/106 cells 생산성을 나타내었다. 반면, 2,6-시알산 전이효소가 공동 형질주입된 FcεRIαECD-Fc3 세포주(FcεRIαECD-Fc3ST)는 1 μM 메토트렉사트 증폭 후 10.2 ㎍/106 cells 생산성을 나타내었다. 또한, FcεRIαECD-Fc2 세포주는 0.5 μM 메토트렉사트 증폭 조건에서 20.9 ㎍/106 cells 생산성을 나타내었다. 또한, 2,6-시알산 전이효소가 공동 형질주입된 FcεRIαECD-Fc2 세포주(FcεRIαECD-Fc2ST)는 0.1 μM 메토트렉사트 증폭후 25.1 ㎍/106 cells 생산성을 나타내었다. 즉, 0.1 μM 메토트렉사트 증폭 조건에서 선별된 2,6-시알산 전이효소가 공동 형질주입된 FcεRIαECD-Fc2ST 세포주가 생산성이 가장 우수한 것을 확인하였다.
상기 FcεRIαECD-Fc2 세포주로부터 생산된 폴리펩티드(FcεRIαECD-Fc)를 "FcεRIαECD-Fc2"로 명명하였으며, FcεRIαECD-Fc2+a2,6-ST 세포주로부터 생산된 폴리펩티드를 "FcεRIαECD-Fc2ST"로 명명하였다. 또한, 상기 FcεRIαECD-Fc3 세포주로부터 생산된 폴리펩티드를 "FcεRIαECD-Fc3"으로 명명하였으며, FcεRIαECD-Fc3+a2,6-ST 세포주로부터 생산된 폴리펩티드를 "FcεRIαECD-Fc3ST"로 명명하였다.
실시예 2. 폴리펩티드(FcεRIα ECD-Fc)의 정제 및 순도 확인
상기 실시예 1에서 선별된 세포주 중 i) FcεRIαECD-Fc3 세포주, ii) FcεRIαECD-Fc3+a2,6-ST 세포주, iii) FcεRIαECD-Fc2+a2,6-ST 세포주를 60 ㎖ 용량의 배지에서 배치배양(batch culture)하였다. 상기 배양액을 Protein-A affinity column을 이용하여 FcεRIα ECD-Fc를 정제한 후, 상기 정제된 FcεRIα ECD-Fc를 SE-HPLC(Size-Exclusion High performance liquid chromatography) 및 SDS-PAGE를 수행하여 폴리펩티드의 순도를 확인하였다.
구체적으로, SDS-PAGE는 비환원(non-reducing) 조건으로 진행하였다. 상기 비환원 조건은 각각의 정제된 폴리펩티드를 비환원 샘플 버퍼(Non-Reducing sample buffer)와 혼합한 후, Mini-Protean TGXTM gels(Bio-Rad)에서 TGS(Tris Glycine SDS) 버퍼, 200V 조건에서 30분 동안 전기영동하였다. 전기영동 후, 단백질은 쿠마시 브릴리언트블루(Coomassie Brilliant Blue) 용액으로 염색하였다. 그 결과를 표 2 및 도 1에 나타내었다.
Lane # Sample Purification Purity(SE-HPLC) Sample condition
M Protein standard One-step(Protein-A affinity column)Purification - - -
1 FcεRIαECD-Fc3 94.5% - Non-reducing
2 FcεRIαECD-Fc3ST 93.7%
3 FcεRIαECD-Fc2ST 93.2%
4 FcεRIαECD-Fc3 94.5% Freezing/Thawingtest
5 FcεRIαECD-Fc3ST 93.7%
6 FcεRIαECD-Fc2ST 93.2%
상기 표 2에서 나타난 바와 같이, SE-HPLC 방법으로 정제된 각각의 폴리펩티드의 순도는 모두 93% 이상인 것을 확인하였다. 비환원 조건(Non-reducing condition)에서 절단된 형태 등의 불순물이 나타나지 않았으며, 특히, 해동(thawing)/냉동(freezing)의 과정을 거친 후에도 모두 순도가 93% 이상이었고 불순물이 없는 것을 확인하였다.
실험예 1. 폴리펩티드(FcεRIα ECD-Fc)의 이량체 형성 확인
상기 실시예 1에서 선별된 세포주 중 i) FcεRIαECD-Fc3 세포주, ii) FcεRIαECD-Fc3+a2,6-ST 세포주, iii) FcεRIαECD-Fc2+a2,6-ST 세포주를 60 ㎖ 용량의 배지에서 배치배양하였다. 그 후, 배양 상등액과 Protein-A affinity column을 이용하여 폴리펩티드를 정제한 정제물을 SE-HPLC 및 SDS-PAGE를 수행하였다. 이때, 배양 상등액 및 정제물을 비환원 조건 및 환원 조건에서 각각 수행하였다.
상기 비환원 조건은 실시예 2와 동일하게 진행하였다. 한편, 환원(reducing) 조건은 각각의 정제된 폴리펩티드를 2-메르캅토에탄올(Mercaptoethanol)을 포함하는 환원 샘플 버퍼(reducing sample buffer)와 혼합한 후, 100℃ 온도에서 5분 동안 변성(denature)시켰다. 그 후 Mini-Protean TGXTM gels(Bio-Rad)에서 TGS 버퍼를 사용하여 200V 조건에서 30분 동안 전기영동하였다. 전기영동 후, 단백질은 쿠마시 브릴리언트블루(Coomassie Brilliant Blue) 용액으로 염색하였다.
그 결과, 비환원 조건에서 약 150 kDa 크기의 폴리펩티드가 검출되었고, 환원 조건에서 약 75 kDa 크기의 폴리펩티드가 검출되었다. 이를 통해 폴리펩티드가 이량체를 형성하고 있음을 확인하였다(도 2). 특히, 인풋(Input)에 해당하는 배양 상등액에서도 폴리펩티드 이량체의 순도가 높은 것을 알 수 있고, 이 배양 상등액을 친화성 컬럼(affinity column)을 통과시켜 얻은 샘플(FT; Flow Through)에는 폴리펩티드가 전혀 검출되지 않지만 용출된 샘플에서는 검출되었다. 또한, 용출된 샘플이 pH가 낮아 1 M Tris buffer(pH 9.0)로 금방 중화를 시킨 샘플(Elute_N)과 그렇지 않은 샘플(Elute)을 비교했을 경우에도 큰 차이는 관찰되지 않았다(도 2).
또한, 정제물에서 매우 높은 순도(98% 이상)의 폴리펩티드가 정제되었을 뿐 아니라, 배양 상등액에서도 매우 높은 순도로 폴리펩티드가 발현되어 있는 것을 확인하였다. 이는 상기 세포주들에서 발현된 폴리펩티드를 의약품으로 개발하는데 있어, 공정 개발 단계가 간소화될 수 있고 결과적으로 의약품으로의 개발 비용이 현저한 절감될 수 있는 가능성이 매우 높음을 의미한다.
실험예 2. 폴리펩티드 이량체의 IgE 결합능 확인
실시예 1에서 생산된 i) FcεRIαECD-Fc2, ii) FcεRIαECD-Fc2ST, iii) FcεRIαECD-Fc3 및 iv) FcεRIαECD-Fc3ST의 폴리펩티드들을 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 정제한 정제물과 시중에 판매되고 있는 항-IgE 항체인 오말리주맙(Omalizumab, 상품명: 졸레어(Xolair))에 대하여 IgE 결합력을 비교 측정하였다.
구체적으로, IgE 결합력은 Protein GLC sensor chip(Bio-Rad, Cat #. 176-5011)의 채널에 IgE를 코팅하고, 오말리주맙 또는 각각의 FceR1αECD-Fc 단백질을 여러 농도로 30 ㎕/min의 속도로 흘려주었다. 이때, 재생버퍼인 25 mM 농도의 수산화나트륨 용액을 이용하여 제로-베이스(zero-base)를 확인한 후, 상기 단계를 반복하여 측정하였다. 그 후, 단백질 결합 분석기기(Proteon XPR36, BIO-RAD, USA)를 이용하여 결합곡선을 확인하였으며, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
SamplesItems FcεRIa ECD-Fc 오말리주맙 비고
Drug type Fc 융합 단백질 Anti-IgE Ab
Bindingaffinity ka (Association rate) Fc2 2.14 x 105 4.05 x 105 오말리주맙 대비 1.9배 약함
Fc2ST 2.64 x 105 오말리주맙 대비 1.5배 약함
Fc3 1.98 x 105 오말리주맙 대비 2.0배 약함
Fc3ST 2.40 x 105 오말리주맙 대비 1.7배 약함
kd (Dissociation rate) Fc2 8.29 x 10-5 6.02 x 10-3 오말리주맙 대비 73배 좋음
Fc2ST 5.69 x 10-5 오말리주맙 대비 106배 좋음
Fc3 1.33 x 10-4 오말리주맙 대비 45배 좋음
Fc3ST 1.49 x 10-4 오말리주맙 대비 40배 좋음
KD (kd/ka) Fc2 3.88 x 10-10 1.49 x 10-8 오말리주맙 대비 38배 좋음
Fc2ST 2.16 x 10-10 오말리주맙 대비 69배 좋음
Fc3 6.72 x 10-10 오말리주맙 대비 22배 좋음
Fc3ST 6.21 x 10-10 오말리주맙 대비 24배 좋음
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 구체예에 따른 폴리펩티드 이량체와 IgE의 결합상수(Association rate, ka) 값은 오말리주맙과 비교하여 1.5 내지 2.0배 작은 것으로 측정되었다. 즉, IgE 외의 물질과의 결합력이 오말리주맙에 비해 1.5 내지 2.0배 정도 낮은 것을 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 폴리펩티드 이량체의 해리상수(Dissociation rate, kd) 값은 오말리주맙과 비교하여 40 내지 106배 큰 것으로 측정되었다. 결과적으로, 본 발명의 일 구체예에 따른 폴리펩티드 이량체의 평형상수(Equilibrium dissociation constant, KD <kd/ka>) 값은 오말리주맙과 비교하여 22 내지 69배 높은 것을 알 수 있다. 이를 통해, 본 발명의 일 구체예에 따른 폴리펩티드 이량체는 오말리주맙과 비교하여 IgE에 대한 결합능이 현저히 증가한 것을 알 수 있다. 특히, 시알산이 부가된 폴리펩티드 이량체(FcεRIαECD-Fc2ST)가 오말리주맙 대비 69배로 IgE 결합력이 가장 우수한 것을 확인하였다.
또한, 도 3 및 도 4에서 나타난 바와 같이, 오말리주맙은 IgE와 결합한 후 일정 시간이 지나면 결합이 떨어지는 반면, 본 발명의 일 구체예에 따른 폴리펩티드 이량체(FcεRIαECD-Fc2ST, IgETRAP)는 일단 IgE와 결합한 후에는 IgE와 떨어지지 않는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 일 구체예에 따른 폴리펩티드 이량체는 IgE와 쉽게 분리되지 않고, 결합된 상태로 유지되는 능력이 오말리주맙에 비해 월등히 좋은 것을 확인하였다.
실험예 3. 폴리펩티드 이량체와 IgG 수용체의 결합능 확인
본 발명의 일 실시예에 따른 폴리펩티드 이량체(FcεRIαECD-Fc2ST, IgETRAP) 또는 오말리주맙(omalizumab, Xolair)의 IgG의 Fc gamma 수용체와의 결합능을 Octet RED384 시스템(Pall ForteBio, CA, USA)을 이용하여 확인하였다.
구체적으로, 활성화된 AR2G 바이오 센서에 Fc gamma 수용체인 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA 또는 FcγRIIIB 재조합 단백질(R & D 시스템, 5 ㎍/㎖)을 300 mM 아세테이트 완충액(pH 5)에 고정화 하였다. 이때, 0.1% Tween-20 및 1% BS(bovine serum)가 포함된 PBS를 러닝버퍼(Running buffer)로 사용하였다. 모든 측정은 샘플 플레이트 쉐이커 1,000 rpm 속도로 30℃ 온도에서 진행하였다. 상기 측정 결과를 도 5a 내지 도 5e에 나타내었고, 오말리주맙과 폴리펩티드 이량체의 IgG Fc gamma 수용체와의 결합능을 수치화하여 도 6에 나타내었다.
그 결과, 오말리주맙은 IgG의 Fc gamma 수용체와 높은 결합능을 나타낸 반면, 폴리펩티드 이량체는 IgG의 Fc gamma 수용체와의 결합능이 현저히 낮은 것을 확인하였다. 이를 통해, 폴리펩티드 이량체가 IgG의 Fc gamma 수용체와 결합하지 않는 것을 확인하였다.
실험예 4. 마우스 골수 유래 비만세포에서 베타-헥소사미니다제 어세이를 통한 폴리펩티드 이량체의 활성 확인
본 발명의 일 실시예에 따른 폴리펩티드 이량체들의 in vitro 활성을 분석하기 위하여 베타-헥소사미니다제 분석을 수행하였다.
구체적으로, 본 발명의 일 구체예에 폴리펩티드 이량체(FcεRIαECD-Fc2)를 농도별로 IgE(1 ㎍/㎖)와 혼합하여, 20℃ 온도에서 30분간 인큐베이션(incubation)시켜 시료를 준비하였다. 또한, 비만세포 활성화를 위해 배양중인 마우스 골수 유래 비만세포(mast cell)를 HBSS(Hank's balanced salt solution) 버퍼로 세척하여 배지를 제거하였으며, 세포수를 측정한 후, 5x105 개의 세포들을 40 ㎕의 HBSS 버퍼에 재부유시켰다.
상기 준비한 시료 50 ㎕를 활성화된 비만세포에 첨가하였다. 그 후, 37℃ 온도에서 30분간 5% CO2 배양기에서 30분 동안 배양하였다. 이후, 외래 항원(DNP(2,4-dinitrophenol), 100 ng/㎖)을 10 ㎕씩 첨가한 후, 다시 37℃ 온도에서 30분간 5% CO2 배양시킨 다음 상층액을 30 ㎕ 분리하였다.
분리된 상층액 30 ㎕와 기질(4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide, 5.84 mM) 30 ㎕를 잘 혼합한 후, 37℃ 온도에서 20분간, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 그 후, 정지용액(Stop solution)인 0.1 M 소디움 카보네이트 버퍼(sodium carbonate buffer, pH 10) 140 ㎕를 넣고 반응을 종결시켰다. 이후, 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 활성화된 비만세포에서 외래 항원에 의해 분비되는 베타-헥소사미니다제(β-hexosaminidase)의 분비량을 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, IgE와 본 발명의 폴리펩티드 이량체의 농도가 1:1인 경우부터 IgE의 활성이 크게 억제되는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 일 구체예의 폴리펩티드 이량체가 IgE와 동일한 농도가 있을 때에도 반응하는 것을 확인하였다.
실험예 5. 인간 FcεRI 발현 마우스 골수 유래 비만세포에서 베타-헥소사미니다제 어세이를 이용한 폴리펩티드 이량체 및 인간 항-IgE 항체의 활성 비교
본 발명의 일 실시예에 따른 폴리펩티드 이량체(FcεRIαECD-Fc2ST, IgETRAP)와 인간 항-IgE 항체인 졸레어(Xolair, omalizumab)의 활성을 비교하기 위해, 베타-헥소사미니다제 분석을 진행하였다.
각각의 폴리펩티드 이량체와 졸레어를 농도별로 준비한 후, 인간 IgE(1 ㎍/㎖)와 혼합한 후 상온에서 30분간 인큐베이션시켜 시료를 준비하였다. 또한, 인간 FcεRI 유전자가 도입되고, 마우스 FcεRI 유전자가 제거된 마우스의 골수로부터 유래 및 분화된 비만세포를 준비하였다. 준비한 비만세포들을 HBSS 버퍼로 세척해준 후, 5x105 개의 세포들을 60 ㎕의 HBSS 버퍼에 재부유시켰다.
그 후, 상기 준비한 시료 20 ㎕를 비만세포에 첨가한 후 37℃ 온도에서 30분간 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 이후 인간 항-IgE 항체(Biolegend, Cat No. 325502, 0.5 ㎍/㎖)를 20 ㎕ 첨가한 후, 다시 37℃ 온도에서 30분간 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 이후 1,500 rpm 및 4℃ 온도 조건에서 원심분리를 한 후, 상층액 30 ㎕를 분리하였다. 분리한 상층액 30 ㎕와 기질(4-Nitrophenyl N-acetyl-β-glucosaminide, 5.84 mM) 30 ㎕를 잘 혼합한 후, 37℃ 온도에서 25분간 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 그 후, 0.1 M 소디움 카보네이트 버퍼(sodium carbonate buffer, pH10) 140 ㎕를 넣고 반응을 종결시켰다. 이후, 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하여, 분비된 베타-헥소사미니다제(β-hexosaminidase)의 상대량을 비교하여 각 시료의 농도에 따른 비만세포 억제효과를 확인하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 폴리펩티드 이량체의 IC50은 대략 11.16 ng/㎖로 측정되었고, 졸레어의 IC50은 대략 649.8 ng/㎖로 측정되었다. 따라서, 폴리펩티드 이량체가 졸레어에 비해 58배 정도 높은 비만세포 활성 억제력이 있음을 확인하였다.
실험예 6. 식품 알러지 모델에서 in vivo 에세이를 통한 폴리펩티드 이량체의 활성 확인
Balb/c 마우스(오리엔트바이오)들에 대하여 OVA(ovalbumin) 50 ㎍ 및 알럼(Alum) 1 ㎎을 14일 간격으로 2회 복강 투여하여 감작(sensitization)을 유발하였다. 이후, 28, 30, 32, 34, 36일째, 총 5회에 걸쳐 OVA 50 ㎎을 경구 투여하여 장에 음식물 알러지를 유발하였다.
상기 OVA를 2회 경구 투여한 후, 31일째에 상기 마우스를 7마리씩 3개의 그룹으로 분류하였다. 제1그룹인 폴리펩티드 이량체(FcεRIαECD-Fc2ST)를 고농도(200 ㎍)로 투여하는 군, 제2그룹인 저농도(20 ㎍)로 투여하는 군 및 제3그룹인 투여하지 않는 군으로 분류하였다.
상기 OVA를 경구 투여하면서 음식물 알러지 유발에 따라 설사 발생 여부를 확인하였다. 또한, 37일째 상기 마우스를 희생시켜 각 그룹에 속한 마우스에 대하여 소장 내 비만세포의 수, 혈중 IgE 농도 및 혈중 비만세포의 탈과립 효소 농도(MCPT-1, Mast cell protease-1)를 분석하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 제3그룹의 마우스는 2번째 OVA를 경구 투여한 후부터 설사가 발생하였다. 반면, 제1그룹 및 제2그룹의 마우스는 3번째 OVA를 경구 투여한 후부터 설사가 발생하였다. 특히, 제1그룹의 마우스는 제2그룹의 마우스보다 설사 발생 빈도가 낮았으며, 이를 통해, 폴리펩티드 이량체의 농도에 비례하여 식품 알러지 효과가 증가하는 것을 확인하였다.
실험예 7. 폴리펩티드 이량체의 시알산 함량 분석
상기 실시예 1에서 제조한 FcεRIαECD-Fc2+a2,6-ST 세포주로부터 생산된 폴리펩티드의 생산율이 가장 높고, 실험예 4 내지 6에서 폴리펩티드 이량체(FcεRIαECD-Fc2ST)의 항알러지 효과가 우수하다는 점에서 착안하여, 시알산 함량에 따른 폴리펩티드 이량체의 항알러지 효능에 대해 알아보고자 폴리펩티드 이량체(FcεRIαECD-Fc2ST)의 시알산 함량을 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 FcεRIαECD-Fc2+a2,6-ST 세포주로부터 생산된 폴리펩티드 이량체(FcεRIαECD-Fc2ST)의 글리칸(glycan) 구조에 포함된 시알산 함량을 측정하기 위해, 먼저 시알산 분해 효소인 시알리데이즈(sialidase)를 처리하여 시알산을 분리시켰다. 그 후, 분리된 시알산을 HPLC(waters, alliance e2659)를 이용하여 시알산을 분리, 검출 및 정량하였다.
상기 폴리펩티드 이량체를 pH 그래디언트(gradient)에 따라 3개의 샘플로 구분하여 분리 및 정제하였다. 3개의 시료를 AmiconUltra 10K(Millipore, UFC501096) 필터에 넣고, 13,000 rpm, 4℃ 온도의 조건으로 10분 동안 원심분리하였으며, 5회 반복하여 농축액을 탈이온수로 교환하고 농축하였다. 시료의 농도는 280 nm 파장에서 측정하였을 때, 10 ㎎/㎖ 이상이 되도록 하였다.
그 후, 각각의 시료들을 0.5 ㎎씩 취하여 EP 튜브에 넣고 시알리데이즈 (Roche, 10 269 611 001) 1 ㎕와 10 mM 농도의 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충액(pH 7.0) 40 ㎕을 넣은 후, 최종 부피가 100 ㎕가 되도록 탈이온수를 넣었다. 각각의 시료를 2 ㎕씩 취하여 280 nm 파장에서 농도를 측정하여 확인된 농도 값을 최종 분석 농도로 사용하였다.
상기 시료를 37℃ 인큐베이터에서 18시간 동안 반응시킨 후, AmiconUltra 10K 필터에 넣고, 13,000 rpm, 4℃ 조건으로 15분간 원심분리하여 필터를 빠져나온 여과액을 분석에 사용하였다. HPLC 분석 조건은 하기 표 4에 나타내었다.
분석컬럼 RHM-monosaccharide H+ (8%) 300 Х 7.8 mm (Rezex); 분석칼럼RHM-monosaccharide H+ (8%) 50 Х 7.8 mm (Rezex); 가드칼럼
표준물질 NGNA: 2 ~ 40 μMNANA: 100 ~ 2000 μM
유량 0.55 ㎖/min
컬럼 온도 50℃
검출(Detection) 206 nm
주입량 5 ㎕
이동상 5 mN sulfuric acid in water
그래디언트/시간(Gradient / time) 등용매용리 / 45 분
시알산 함량 계산을 위한 표준물질은 N-아세틸뉴라민산(N-acetylneuraminic acid, 이하 NANA라 함)과 N-글리코릴뉴라민산(N-glycolylneuraminic acid, 이하 NGNA라 함) 혼합물로 표준 곡선에 대한 선형 회귀식을 구하여 분석시료의 NGNA와 NANA의 몰농도를 계산하였다. 사용된 혼합물은 하기 표 5에 나타내었다.
혼합물 1 2 3 4 5
NANA (μM) 2,000 1,000 500 300 200
NGNA (μM) 40 20 10 6 4
NANA 함량을 이용하여 시료의 NANA 시알산 함량을 계산하였다. 시료의 시알산 함량은 시알산/시료 몰 비율(mol/mol)로 나타내었다.
[수학식 1]
시료의 시알산 함량=(시료의 NANA 몰농도)/(시료의 몰농도)
또한, NGNA 함량을 이용하여 시료의 NGNA의 함량을 계산하였다. 시료의 NGNA의 함량은 NGNA/분석시료 몰 비율(mol/mol)로 나타내었다.
[수학식 2]
시료의 NGNA의 함량=(분석시료의 NGNA 몰농도)/(분석시료의 몰농도)
그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
시료 NGNA/Protein(mol/mol) NANA/Protein(mol/mol)
FcεRIαECD-Fc2ST 시료 1 (SAlow) 0.13 7.7
시료 2 (SAmedi) 0.17 12.0
시료 3 (SAhigh) 0.27 19.1
표 6에 나타난 바와 같이, pH 그래디언트에 따라 3개의 샘플로 구분하여 분리 및 정제한 시료들의 시알산 함량이 모두 다르게 측정되었다. 시알산 함량에 따른 항알러지 효능을 비교하기 위해, 시알산 함량 순으로 "SAlow", "SAmedi" 및 "SAhigh"로 명명하였다.
실험예 8. 시알산 함량에 따른 폴리펩티드의 이량체 형성 변화 확인
시알산 함량에 따라 폴리펩티드의 이량체 형성 변화가 있는지 확인하기 위해, 실시예 9에서 분리한 SAlow, SAmedi 및 SAhigh를 실험예 1과 동일한 방법으로 비환원 조건 및 환원 조건에서 SDS-PAGE 분석을 수행하였다.
그 결과, SAlow, SAmedi 및 SAhigh 모두 비환원 조건에서 약 150 kDa 크기의 폴리펩티드가 검출되었고, 환원 조건에서 약 75 kDa 크기의 폴리펩티드가 검출되었다. 이를 통해 폴리펩티드가 이량체를 형성하고 있음을 확인하였다(도 10).
실험예 9. 시알산 함량에 따른 폴리펩티드의 이량체 등전점 확인
시알산 함량에 따라 폴리펩티드의 이량체 등전점이 변하는지 확인하기 위해, 실험예 7에서 분리한 SAlow, SAmedi 및 SAhigh를 IEF 샘플 용액과 혼합시킨 후, pH 3-7 IEF gel(Invitrogen)에 로딩(loading)하여, 100V 조건에서 1시간, 200V 조건에서 1시간, 500V 조건에서 30분 동안 순차적으로 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 후, 겔(gel)은 12% 트리클로로아세트산(Trichloroacetic acid)와 3.5% 설포살리실산 (Sulfosalicylic acid)를 포함하는 고정 용액에 30분간 반응시킨 후, 증류수로 세척하였다. 단백질은 쿠마시 브릴리언트블루(Coomassie Brilliant Blue) 용액으로 염색하였다.
그 결과, 시알산 함량에 따라 SAlow, SAmedi 및 SAhigh의 등전점이 조금씩 상이하게 나타났으며, 각각 약 5.3, 4.9 및 4.7로 나타났다(도 11).
실험예 10. 식품 알러지 동물모델에서 시알산 함량에 따른 폴리펩티드 이량체의 항알러지 활성 확인: 설사 빈도 측정
시알산 함량에 따라 폴리펩티드 이량체의 활성이 변하는지 확인하기 위해, Balb/c 마우스(오리엔트바이오)들에 대하여 OVA 50 ㎍ 및 알럼 1 ㎎을 14일 간격으로 2회 복강 투여하여 감작을 유발하였다. 이후, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40일째, 총 7회에 걸쳐 OVA 50 ㎎을 경구 투여하여 음식물 알러지를 유발하였다. 이때, OVA 경구 투여는 4시간 금식 후에 시행하였다.
상기 OVA를 2회 경구 투여한 후, 40일째에 상기 마우스를 7마리씩 3개의 그룹으로 분류하였다. 제1그룹인 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체(SAhigh)를 고농도(200 ㎍)로 피하 투여하는 군, 제2그룹인 시알산 함량이 낮은 폴리펩티드 이량체(SAlow)를 고농도(200 ㎍)로 피하 투여하는 군 및 제3그룹인 PBS를 피하 투여한 군으로 분류하였다. 상기 OVA를 경구 투여하면서 음식물 알러지 유발에 따라 설사 발생 여부를 확인하였다.
그 결과, 제3그룹의 마우스는 4번째 OVA를 경구 투여한 후부터 설사가 발생하였다. 제2그룹의 마우스는 5번째 OVA를 경구 투여한 후부터 설사가 발생하였다. 특히, 제2그룹의 마우스는 6번째 OVA를 경구 투여한 후부터 설사 발생 빈도가 급격히 증가하였다. 반면, 제1그룹의 마우스는 6번째 OVA를 경구 투여한 후부터 설사가 발생하였으나, 7번째 OVA 경구 투여에도 설사 발생 빈도가 증가하지 않고 유지되었다(도 12). 이를 통해, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체(SAhigh)가 시알산 함량이 낮은 폴리펩티드 이량체(SAlow)보다 항알러지 효과가 우수한 것을 확인하였다.
실험예 11. 식품 알러지 동물 모델에서 시알산 함량에 따른 폴리펩티드 이량체의 항알러지 활성 확인: 혈중 IgE 농도 측정
실험예 10의 7번의 OVA를 경구 투여한 각 그룹의 마우스에서 안와채혈법으로 혈액을 채취하였다. 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 4℃ 온도에서 13,000 rpm 조건으로 15분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈중에서의 유리된 IgE(free IgE) 농도를 측정하기 위해 mouse total IgE ELISA kit(BioLegend)를 사용하였으며, 이때, 96-웰-플레이트에 코팅된 물질이 항-IgE 항체 대신 본 발명의 일 실시예인 폴리펩티드 이량체(SAlow 및 SAhigh) 사용한 점을 제외하고는 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA를 수행하였다.
구체적으로, 96-웰-플레이트에 PBS로 희석시킨 폴리펩티드 이량체(SAlow 및 SAhigh)로 코팅하고, 4℃ 온도에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, 0.05% tween 20이 포함된 PBS(이하, 워싱버퍼)로 세척한 후, 블로킹 버퍼(blocking buffer, Assay diluent)를 넣어 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 워싱버퍼로 세척한 후, 표준용액으로 사용할 마우스 IgE와 마우스의 혈청 샘플을 1X Assay diluent에 희석하여 플레이트에 넣고 2시간 동안 반응시켰다.
다시 워싱버퍼로 세척한 후, 비오틴(biotin)이 표지된 마우스 항-IgE 항체를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 워싱버퍼로 세척한 후, HRP(horse radish peroxidase)가 표지된 아비딘(Avidin-HRP)을 넣고 30분 동안 반응시켰다. 워싱버퍼로 세척한 후, 기질용액(Substrate Solution)을 넣고 빛을 차단한 상태로 20분간 반응시킨 후, 정지용액(Stop solution, 1 M H2SO4)을 넣어 반응을 중단시켰다. 그 후, 마이크로 플레이트 리더(Epoch Microplate Spectrophotometer)로 450 nm 파장에서 흡광도 값을 측정하여 농도를 계산하였다.
그 결과, PBS를 피하 투여한 제3그룹의 마우스의 경우, 혈중 IgE 농도가 약 8,000 ng/㎖로 계산되었다. 또한, 시알산 함량이 낮은 폴리펩티드 이량체(SAlow)를 피하 투여한 제2그룹의 마우스의 경우, 혈중 IgE 농도가 약 7,000 ng/㎖로 계산되었다. 반면, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체(SAhigh)를 피하 투여한 제1그룹의 마우스의 경우, 약 4,900 ng/㎖ 계산되었으며, 제2그룹 및 제3그룹의 마우스의 혈중 IgE 농도값과 유의미한 차이를 나타내었다(도 13).
이러한 결과에서 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체를 피하 투여시에, 혈중 IgE 함량이 감소함을 알 수 있었다. 또한, 이러한 혈중 IgE의 감소로, 상기 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체가 알러지 치료에 효과가 있음을 예측할 수 있었다.
실험예 12. 식품 알러지 동물 모델에서 시알산 함량에 따른 폴리펩티드 이량체의 항알러지 활성 확인: 혈중 MCPT-1 농도 측정
식품 알러지 실험이 끝나고, 2일 후에 각 그룹의 마우스에서 혈액을 채취하여 혈청을 준비하였다. 혈중 MCPT-1(Mast Cell Protease-1) 농도를 측정하기 위해, MCPT-1 ELISA kit(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 진행하였다.
구체적으로, 96-웰-면역 플레이트에 마우스 항-MCPT-1 항체를 코팅하고 4℃ 온도에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, 0.05% tween 20이 포함된 PBS(이하, 워싱버퍼)로 세척한 후, 1% BSA(Bovine serum albumin)가 포함된 PBS(이하, 블로킹 버퍼, Assay diluent)를 넣어 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 워싱버퍼로 세척한 후, 표준용액으로 사용할 MCPT-1와 마우스의 혈청 샘플을 1X Assay diluent에 희석하여 플레이트에 넣고 2시간 동안 반응시켰다.
2시간 후, 비오틴이 표지된 마우스 항-MCPT-1 항체를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 워싱버퍼로 세척한 후, HRP(horse radish peroxidase)가 표지된 아비딘(Avidin-HRP)을 넣고 30분 동안 반응시켰다. 워싱버퍼로 세척한 후, 기질용액(Substrate Solution)을 넣고 빛을 차단한 상태로 20분간 반응시킨 후, 정지용액(Stop solution, 1 M H2SO4)을 넣어 반응을 중단시켰다. 그 후, 마이크로 플레이트 리더(Epoch Microplate Spectrophotometer)로 450 nm 파장에서 570 nm 파장을 제외한 흡광도 값을 측정하여 농도를 계산하였다.
그 결과, PBS를 피하 투여한 제3그룹의 마우스의 경우, 혈중 MCPT-1 농도가 약 4,000 ng/㎖로 계산되었다. 또한, 시알산 함량이 낮은 폴리펩티드 이량체(SAlow)를 피하 투여한 제2그룹의 마우스의 경우, 혈중 MCPT-1 농도가 약 4,200 ng/㎖로 계산되었다. 반면, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체(SAhigh)를 피하 투여한 제1그룹의 마우스의 경우, 약 2,800 ng/㎖ 계산되었으며, 제2그룹 및 제3그룹의 마우스의 혈중 IgE 농도값과 유의미한 차이를 나타내었다(도 14).
실시예 3. 정제를 통한 시알산이 고함량 포함된 폴리펩티드 이량체 제조
시알산 함량에 따른 폴리펩티드 이량체의 물성을 확인하기 위해, 다양한 범위의 시알산이 포함된 폴리펩티드 이량체를 수득하였다. 구체적으로, FcεRIαECD-Fc2+a2,6-ST 세포주에서 수득한 폴리펩티드 이량체를 친화성 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.
먼저, 세포 배양액을 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 통해 배양액에서 나오는 1차 불순물 제거를 진행하였다. 친화성 크로마토그래피는 AmshpereTM A3 수지가 팩킹(packing)된 AmsphereTM A3 프리-팩킹 컬럼(AmsphereTM A3 pre-packed column; 베드 높이(bed hight) 5 ㎝, 부피(volume) 5 ㎖)과 액체크로마토그래피 시스템인 AKTA Avant 25 장비를 이용하여 진행하였다. 이때, 용출 버퍼는 100 mM Glycine, pH 3.3를 이용하여 수행하였다.
이 후, 음이온 교환 크로마토그래피(Anion Exchange Chromatography)는 Q 세파로스 패스트 플로우 수지(Q Sepharose Fast Flow resin)가 팩킹된 Hiscreen QFF(베드 높이(bed hight) 10 ㎝, 부피(volume) 5 ㎖)와 액체크로마토그래피 시스템인 AKTA Avant 25 장비를 이용하여 진행하였다. 용출 버퍼는 20 mM Phospho-citrate, pH 3.5를 이용하였다. 이때, 세척 버퍼인 20 mM Phospho-citrate, pH 4.0의 농도를 조절하여 다양한 시알산 함량을 가지는 이량체를 수득하였다. 시알산 함량 분석은 실험예 7에서 분석한 방법으로 수행하였다. 이를 통해, 시알산 함량이 7.0 mol/mol, 10.3 mol/mol, 12.9 mol/mol, 14.9 mol/mol 및 21.4 mol/mol인 폴리펩티드 이량체를 수득하였다.
실험예 13. 마우스 모델에서 시알산 함량에 따른 폴리펩티드 이량체의 약동학 분석
폴리펩티드 이량체 시알산 함량에 따른 약동학(pharmacokinetics) 분석을 수행하기 위해, 실시예 3에서 제조한 시알산 함량 7.0 mol/mol, 10.3 mol/mol, 12.9 mol/mol, 14.9 mol/mol 및 21.4 mol/mol의 폴리펩티드 이량체를 각각 10 mg/kg의 농도로 마우스에 피하 주사하였다. 폴리펩티드 이량체의 약동학 분석을 위해 물질 투여 후 0시간, 3시간, 10시간, 24시간, 72시간, 168시간, 240시간 째에 채혈하여 아래와 같은 방법으로 분석하였다.
1X PBS(Welgene)에 항-FcεRI 항체(Invitrogen)를 0.5 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 immunoplate(Thermo)에 첨가하고 4℃ 조건에서 밤새 반응시켰다. 반응이 끝난 immunoplate는 1X PBST를 이용하여 세척하고 Blocking solution인 I-Block solution(invitrogen)을 well당 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. Blocking 도중 standard와 분석용 샘플을 준비하였다. 폴리펩티드 이량체를 0.19 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖의 농도로 마우스 blank serum이 포함된 1% BSA/PBS에 희석하여 Standard 물질로 준비하였고, 분석용 샘플 또한 blank serum이 포함된 1% BSA/PBS를 이용하여 1/20-1/300으로 희석하여 준비하였다.
Blocking이 끝난 plate는 1X PBST를 이용하여 세척하고 준비된 standard와 분석용 샘플을 well당 첨가 후 상온에서 1시간 반응시켰다. 이후 1X PBST를 이용하여 세척하고 1:10,000으로 희석된 항-인간 IgG4-HRP(Southern biotech)를 첨가한 다음 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 plate는 1X PBST를 이용하여 세척하고 TMB solution(Thermo)을 well에 넣고 반응시켰다. Microplate reader (Molecular devices)를 이용하여 650 nm 파장에서 흡광도 값이 0.8-1.0 범위에서 측정되면 stop solution(Sigma)을 well 당 첨가하여 반응을 종결시켰다. 반응이 종결된 plate는 5분 이내에 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 수치를 분석하였다. 그 결과로 얻은 시알산 함량에 따른 폴리펩티드 이량체의 약동학 그래프와 약동학적 파라미터 결과는 도 15 및 표 7에 나타내었다.
그 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, 마우스에 투여한 폴리펩티드 이량체의 시알산 함량이 높을수록 혈중 농도가 증가하는 것을 확인하였다.
시알산 함량 (mol/mol) T1/2 (hr) Tmax (hr) Cmax (㎍/㎖) AUClast (hr*㎍/㎖)
7.0 51.3 ± 5.9 5.3 ± 3.3 1.3 ± 0.5 47.8 ± 3.2
10.3 44.5 ± 6.7 5.3 ± 3.3 1.6 ± 0.6 57.1 ± 9.6
12.9 40.0 ± 9.5 17 ± 9.9 2.0 ± 0.4 119.7 ± 5.2
14.9 35.4 ± 3.5 7.7 ± 3.3 2.6 ± 0.3 182.7 ± 7.0
21.4 38.5 ± 5.0 10.0 ± 0.0 12.1 ± 0.9 890.0 ± 64.4
실험예 14. 수동성 전신적 아나필락시스 마우스 모델에서 폴리펩티드 이량체의 시알산 함량에 따른 효능 확인
폴리펩티드 이량체의 시알산 함량에 따른 생체 내(in vivo)에서의 항알러지 효과 차이를 확인하기 위해, 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같은 방법으로 마우스에서 수동성 전신적 아나필락시스(passive systemic anaphylaxis, PSA)를 유도하였다(Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1032, DOI 10.1007/978-1-62703-496-8_10). 아나필락시스 유도에 의해 비만세포가 활성화되고 비만세포 증가에 의해 체온이 감소되는 것으로 알려져 있다. 이를 이용하여 마우스에서 PSA를 유도하면서 시알산 함량별 폴리펩티드 이량체를 투여한 다음 체온을 측정하여 항알러지 효과를 비교하고자 하였다.
트랜스폰더(transponder)가 삽입된 Balb/c 마우스(오리엔트바이오)에서 체온을 측정한 후 0.9% NaCl이 포함된 항-DNP IgE(Sigma) 20 ㎍을 복강 투여 후, 각기 다른 시알산 함량을 가진 폴리펩티드 이량체 10 mg/kg을 피하 주사하였다. 24시간 후 외래 항원 0.9% NaCl이 포함된 DNP-HAS(Sigma) 투여 전 마우스 체온을 측정하였다. 이후, 항원 1 mg을 정맥으로 투여하였다. 투여 후 10분 간격으로 1시간 동안 마우스 체온을 원격 체온측정기(Bio medic data systems)로 측정하였다. 실험 결과는 도 16에 나타내었다.
그 결과, 비히클(vehicle)과 시알산 함량 10.3 mol/mol 폴리펩티드 이량체 투여 군에서는 마우스 체온이 감소하였으나 시알산 함량 14.9 mol/mol 이상 그룹에서는 마우스 체온이 감소하지 않음을 확인하였다. 이를 통해, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체가 시알산 함량이 낮은 이량체 보다 수동성 전신적 아나필락시스 유발을 감소시키는 효과가 우수한 것을 확인하였다.

Claims (17)

  1. IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인(FcεRIa-ECD)을 포함하는 단량체 두 개를 포함하는 폴리펩티드 이량체로서,
    상기 단량체는 Fc 영역을 포함하며,
    상기 Fc 영역과 FcεRIa-ECD는 힌지를 통해 결합되고,
    상기 폴리펩티드 이량체는 시알산/폴리펩티드 이량체의 몰 비율이 적어도 8인 것인, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 힌지는 면역글로불린 IgD에서 유래한 힌지 영역 또는 이의 변이체인 것인, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 시알산은 N-아세틸뉴라민산인 것인, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 이량체는 시알산/폴리펩티드 이량체의 몰 비율이 적어도 10인 것인, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 이량체는 시알산/폴리펩티드 이량체의 몰 비율이 12 내지 25인 것인, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 면역글로불린 IgD에서 유래한 힌지 영역 또는 이의 변이체는 적어도 하나의 시스테인을 포함하는 것인, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체.
  9. 제4항에 있어서,
    상기 면역글로불린 IgD에서 유래한 힌지 영역 또는 이의 변이체는
    Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro(서열번호 17),
    이때, Xaa1은 Lys 또는 Gly이며, Xaa2는 Glu, Gly 또는 Ser인; 또는
    Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (서열번호 18),
    이때, Xaa3은 Lys 또는 Gly이며, Xaa4는 Glu, Gly 또는 Ser인,
    시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체.
  10. 제4항에 있어서,
    상기 면역글로불린 IgD에서 유래한 힌지 영역 또는 이의 변이체가 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 19로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체를 포함하는 알러지 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 피하 주사제용인 것인, 알러지 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 알러지 질환은 식품 알러지, 아토피 피부염(atopic dermatitis), 천식(asthma), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 알러지성 결막염(allergic conjunctivitis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 만성 특발성 두드러기(Chronic idiopathic urticarial) 및 알러지성 접촉성 피부염(allergic contact dermatitis)으로 구성된 군에서 선택된 하나인 것인, 알러지 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제11항의 약학적 조성물을 포함하는 경피 패치(transdermal patch).
  15. 제11항의 약학적 조성물을 포함하는 국소 패치(topical patch).
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체를 포함하는 알러지 증상 개선 또는 완화용 식품 조성물.
  17. 알러지 질환 예방 또는 치료를 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체의 용도.
PCT/KR2020/008855 2019-07-08 2020-07-07 Ige fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인을 포함하는 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체 및 이를 포함하는 약학적 조성물 WO2021006599A1 (ko)

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