KR20170120579A - Fc-융합 고친화성 IgE 수용체 알파 사슬 - Google Patents

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Abstract

낮은 pH에서 우수한 안정성을 갖는 Fc 융합 고친화성 IgE 수용체 α 사슬의 제공.
(i) 고친화성 IgE 수용체 α 사슬; 및
(ii) IgG1의 Fc 영역;
을 함유하고, 상기 (i) 및 (ii) 링커 단편 영역이 서열번호 2의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 Fc 융합 단백질(Fc fusion protein).

Description

Fc-융합 고친화성 IgE 수용체 알파 사슬{Fc-FUSED HIGH AFFINITY IgE RECEPTOR α-CHAIN}
본 발명은 의약품으로서 유용한 Fc 융합 고친화성 IgE 수용체 α 사슬(Fc-fused high affinity IgE receptor α-chain)에 관한 것이다.
자세히 설명하면, 본 발명은 낮은 pH에서 우수한 안정성을 갖는 Fc 융합 고친화성 IgE 수용체 α 사슬 및 그 의약 용도에 관한 것이다.
면역 글로불린 E (IgE)는 알레르기 반응을 담당하는 면역 글로불린 군 중의 하나이다. B 세포에 의해 분비되거나 B 세포 표면에 발현되는 IgE는 비만 세포(Mast cell)와 호염기성 과립구(basophils) 등의 표면에 발견되는 고친화성 IgE 수용체(FcεRI)에 결합한다. 비만 세포 표면 수용체에 IgE 항원 단백질이 결합하면 IgE가 항원을 가교하는 형태가 된다. 그 후, 세포 내 과립 안에 저장되는 히스타민(Histamine)과 세로토닌(serotonin) 등의 화학 중재자 등이 방출된다. 이 결과 염증 반응이 유도되어 모세 혈관 확장(telangiectasis), 혈관 투과성 항진(vascular hyperpermeability) 등의 I 형 알레르기 증상이 발생한다(비특허문헌 1).
따라서, IgE와 FcεRI의 결합을 저해하는 화합물 또는 단백질은 IgE가 비만 세포와 호염기성 과립구 등의 표면에서 발견되는 FcεRI에 결합하는 것을 저해하기 때문에, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염 등의 I 형 알레르기 질환의 치료제로 기대된다(비특허문헌 2).
최근, 기존의 저분자 화합물을 유효 성분으로 하는 의약품과 더불어, 생체 내의 특정 수용체 등에 강하게 결합하여 우수한 치료 효과를 나타내는 단백질 의약품의 개발이 이루어지고 있다. 예를 들어, 류마티스 관절염 치료제로 에타너셉트(Etanercept) 알려져있다. 에타너셉트는 종양 괴사 인자(TNF)의 가용성 수용체가 생체 내에서 TNF의 작용을 억제하는 역할을 하는 것에 착안하여 개발된 완전 인간형 가용성 TNFα/LTα 수용체 제제이다.
단백질 의약품은 높은 치료 효과를 기대할 수 있지만, 반면 그 제조 공정에서 단백질 의약품 관련 문제가 발생할 수도 있다.
일반적으로 항체 및 Fc 융합 단백질을 의약품으로 제조할 때 단백질 A를 이용한 정제 방법이 이용된다. 이 방법은 단백질 A에 결합된 목적 단백질을 용출시키기 위해 낮은 pH의 완충액이 이용된다. 또한 바이러스 불활성화(inactivation)를 위한 목적 단백질을 일정 시간동안 낮은 pH에서 처리하는 것이 바람직하다.
낮은 pH에서의 안정성이 부족한 단백질은, 응집체(aggregates)를 만들기 쉽다. 응집체의 비율이 높은 경우, 단백질 의약품의 생산에서 정제 효율과 생산량의 저하가 일어난다. 또한 의약품에 응집체가 혼입함으로써 면역 반응이 야기되고, 알레르기 등 심각한 부작용이 발생될 수 있다.
따라서 단백질 의약품의 제조에 있어서, 낮은 pH에서 목적 단백질의 불안정성이 문제가 될 수 있다.
면역 글로불린 및 세포 외 도메인을 포함하는 폴리펩티드(면역 유착; Immune adhesion)이 특허문헌 1에 기재되어있다. 특허문헌 1에서 면역 유착의 예시 중 하나로 고친화성 IgE 수용체가 기재되어 있다. 그러나, 상기 문헌에 고친화성 IgE 수용체와 면역 글로불린과의 융합 단백질은 구체적으로 기재되어 있지 않다.
고친화성 IgE 수용체 α 사슬 (FcεRI α-chain, 이하 "FCER1A"이라 칭함)과 면역 글로불린 G1 (IgG1)과의 융합 단백질 (이하 "Fusion protein A"라 칭함)가 비특허문헌 3에 기재되어 있다. 그러나, 상기 문헌에 기재된 Fusion protein A와, 본원 발명의 단백질은 FCER1A와 IgG1(Fc)의 접합 양식이 크게 다르다. 즉, 본 발명의 단백질은 그 FcεRI와 IgG1 링커 단편 영역에 특징적인 아미노산 서열을 갖는다.
고친화성 IgE 수용체(FcεRI)의 수용성 단편과 인간 Fc 영역이 펩티드 링커로 연결된 융합 단백질(NPB301)이 특허문헌 2에 기재되어 있다. 그러나, 본 발명의 단백질은 특허문헌 2에 기재된 펩타이드 링커를 포함한다. 또한, 특허문헌 2에는 본 발명의 링커 단편 영역의 특징적인 아미노산 서열에 대해 기재도 시사도 없다.
FCER1A 및 면역 글로불린 G2(IgG2)와의 융합 단백질이 특허문헌 3에 기재되어 있다. 그러나 상기 IgG2와의 융합 단백질과 본원 발명의 단백질은 링커 단편 영역 및 Fc 영역에서 아미노산 배열이 다르다.
비 인간 영장류 FCER1A와 IgG1과의 융합 단백질이 특허문헌 4에 기재되어 있다. 또한 FCER1A와 IgG1과의 융합 단백질이 특허문헌 5~7에 기재되어 있다. 그러나, 상기 문헌은 본원 발명의 링커 단편 영역의 특징적인 아미노산 서열에 대해 기재도 시사도 없다.
상기 비특허문헌 3 및 특허문헌 1 ~ 7은 본 발명의 단백질의 기재도 시사도 없다.
[특허문헌 1] 미국 특허 5,565,335 호 명세서 [특허문헌 2] 국제 공개 제 2012/169735 호 [특허문헌 3] 중국 특허 출원 공개 제 101633698 호 명세서 [특허문헌 4] 국제 공개 제 2008/028068 호 [특허문헌 5] 국제 공개 제 2011/056606 호 [특허문헌 6] 국제 공개 제 2008/099178 호 [특허문헌 7] 국제 공개 제 2008/099188 호
[비특허문헌 1] Rashiroyoshi, "알레르기의 분자 세포 메커니즘", BIO INDUSTRY, 2008년 제25권 제9호, P.23-39 [비특허문헌 2] Chisei Ra 등, "International Immunology", 1993년 제5권 제1호, P.47-54 [비특허문헌 3] M. Haak-Frendscho 등, "Journal of Immunology", 1993년 제151권, 제1호, P.351-358
본 발명은, 낮은 pH에서 우수한 안정성을 갖는 Fc 융합 고친화성 IgE 수용체 α 사슬을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자는 낮은 pH와 온도에 대한 안정성이 높은 Fc 융합 고친화성 IgE 수용체 α 사슬을 얻고자 예의 검토를 실시했다. 그 결과 고친화성 IgE 수용체 α 사슬과 IgG1의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질에서 링커 단편으로 3개의 Cys을 포함하는 것을 이용함으로써 안정적인 Fc 융합 고친화성 IgE 수용체 α 사슬을 얻을 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 다음과 같다.
본 발명은 하기의 [1] ~ [5] 등에 관한다.
[1] (i) 고친화성 IgE 수용체 α 사슬; 및
(ii) IgG1의 Fc 영역;
을 함유하고, 상기 (i) 및 (ii) 링커 단편 영역이 서열번호 2의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 Fc 융합 단백질.
[2] [1]의 Fc 융합 단백질로서, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열의 C 말단의 리신(K)이 결손된 아미노산 서열을 포함 Fc 융합 단백질.
[3] 이량체인 것인, [1] 또는 [2]의 Fc 융합 단백질.
[4] 링커 단편 영역의 시스테인 잔기들이 3개의 이황화 결합을 형성하는 [3]의 Fc 융합 단백질.
[5] [1] ~ [4] 중 어느 하나의 Fc 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본 특허 출원 번호 2015-032231 호, 2015-252231 호의 공개 내용을 포함하고 있다.
본 발명의 단백질은 낮은 pH에서 우수한 안정성을 가진다. 또한, 본 발명의 단백질은 IgE에 대한 뛰어난 중화 활성을 가진다. 따라서, 본 발명의 단백질은 IgE가 관여하는 I 형 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 단백질 의약품으로 유용하다.
[도 1] 인간 IgE에 결합 저해 활성을 나타낸다. 도에서 가로축은 각 약물의 농도(mol/L)를 나타내고, 세로축은 플레이트에 고정된 Protein 1에 결합한 IgE의 양을 일정량의 IgE를 첨가했을 때의 결합량을 기준으로 백분율로 나타낸 값(free- IgE(컨트롤에 대한 %))을 나타낸다. 도에서 동그라미는 Protein 1 사각형은 omalizumab의 값을 각각 나타낸다.
[도 2] 낮은 pH의 응집체 함유율(content rate) 변화(%) 추이를 나타낸다. 도에서 가로축은 기간(일)을 나타내고, 세로축은 응집체 함유율의 변화(%)를 나타낸다. 도에서 동그라미는 Protein 1 사각형은 Fusion protein A의 값을 각각 나타낸다.
[도 3] 열처리의 응집체 함유율 변화(%) 추이를 나타낸다. 도에서 가로축은 기간(일)을 나타내고, 세로축은 응집체 함유율의 변화(%)를 나타낸다. 도에서 동그라미는 Protein 1 사각형은 Fusion protein A의 값을 각각 나타낸다.
본 발명의 실시예는 아래에 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 달리 명시되지 않는 한, 다음의 의미를 가진다.
본 발명에서 "고친화성 IgE 수용체 α 사슬 (FCER1A)"은 고친화성 IgE 수용체의 세포 외 도메인인 α 사슬 부분을 포함한 단백질을 말한다. 고친화성 IgE 수용체 α 사슬은, 예를 들면 하기 서열번호 1로 표시되는 단백질을 말한다.
서열번호 1 :
VPQKPKVSLNPPWNRIFKGENVTLTCNGNNFFEVSSTKWFHNGSLSEETNSSLNIVNAKFEDSGEYKCQHQQVNESEPVYLEVFSDWLLLQASAEVVMEGQPLFLRCHGWRNWDVYKVIYYKDGEALKYWYENHNISITNATVEDSGTYYCTGKVWQLDYESEPLNITVIKAPREKYWL
상기 고친화성 IgE 수용체 α 사슬은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 대해, 예를 들어, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information (미국 국립 생물 정보 센터의 기본 로컬 정렬 검색 도구)) 등 (예를 들어, 디폴트 값 즉 초기 설정 파라미터를 사용하여)을 이용하여 계산했을 때, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, IgE에 대한 결합능을 갖는 단백질이 포함된다. 또한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 복수 혹은 몇 개 (1 ~ 10개, 바람직하게는 1 ~ 5개, 더욱 바람직하게는 1개 또는 2개)의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, IgE에 대한 결합능을 갖는 단백질이 포함된다.
본 발명에서 "IgG1의 Fc 영역"은 면역 글로불린 G1의 Fc 단편, 즉 천연 면역 글로불린 G1의 CH2와 CH3 정상 도메인을 말한다. 상기 IgG1의 Fc 영역은 천연의 돌연변이체, 인공 돌연변이체, 및 절단된 형태 모두 포함된다.
본 발명에서 "고친화성 IgE 수용체 α 사슬 및 IgG1의 Fc 영역의 링커 단편 영역"은 상기 고친화성 IgE 수용체 α 사슬과 상기 IgG1의 Fc 영역의 접합 지점에서 Fc 영역 방향으로 14 아미노산 잔기의 영역을 말한다.
본 발명에서 "Fc 융합 단백질"은 고친화성 IgE 수용체 α 사슬 및 면역 글로불린의 Fc 단편을 포함하는 재조합 단백질을 말한다.
본 발명의 단백질은 고친화성 IgE 수용체 α 사슬 및 IgG1의 Fc 영역의 링커 단편 영역이 하기의 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 한다.
서열번호 2 :
EPKSCDKTHTCPPC
본 발명의 단백질은 바람직하게는 하기의 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 Fc 융합 단백질(이하, "Protein 1"이라 함)이다.
서열번호 3 :
VPQKPKVSLNPPWNRIFKGENVTLTCNGNNFFEVSSTKWFHNGSLSEETNSSLNIVNAKFEDSGEYKCQHQQVNESEPVYLEVFSDWLLLQASAEVVMEGQPLFLRCHGWRNWDVYKVIYYKDGEALKYWYENHNISITNATVEDSGTYYCTGKVWQLDYESEPLNITVIKAPREKYWLEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열(서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 첫 번째 Val에서 179번째 Leu까지)과 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열(서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 180번째의 Glu에서 193번째 Cys까지)와 면역 글로불린의 Fc 단편의 아미노산 서열(서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 194번째 Pro에서 411번째 Lys까지)을 이 순서로 융합한 배열을 가진다. 상기 Fc 융합 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열 중 서열번호 2의 아미노산 서열에 해당하는 180번째 Glu에서 193번째 Cys까지의 아미노산 서열 이외의 아미노산 서열에 대해, 예를 들어, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information (미국 국립 생물 정보 센터의 기본 로컬 정렬 검색 도구)) 등 (예를 들어, 디폴트 값, 즉 기본 파라미터 값을 이용하여) 을 이용하여 계산했을 때, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, IgE에 대한 결합능을 갖는 단백질이 포함된다. 또한 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열 중 서열번호 2의 아미노산 서열에 해당하는 180번째 Glu에서 193번째 Cys까지의 아미노산 서열 이외의 아미노산 서열에 1 또는 복수 혹은 몇 개 (1 ~ 10개, 바람직하게는 1 ~ 5개, 더욱 바람직하게는 1개 또는 2개)의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, IgE에 대한 결합능을 갖는 단백질이 포함된다.
재조합 항체를 제조할 때, C 말단의 리신이 번역 후 수식에 의해 결실될 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질은 상기 Protein 1의 C 말단의 리신 (K)가 결손된 아미노산 서열을 포함하는 Fc 융합 단백질이어도 좋다. 예를 들어, 서열번호 3으로 표시되는 단백질 Protein 1의 C 말단의 리신 (K)가 결손된 아미노산 서열을 포함하는 Fc 융합 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 1번째부터 410번째 아미노산 배열로 구성된다.
본 발명의 단백질 고친화성 IgE 수용체 α 사슬 및 IgG1의 Fc 영역이 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 링커 단편을 통해 Fc 융합 단백질의 단량체도 이량체도 포함한다. 상기 링커 단편 영역에는 3개의 Cys 잔기가 존재하여(서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 184 번째, 190 번째와 193 번째 Cys), 이황화 결합에 의해 이량체를 형성할 수 있다. 일반적으로 2개의 Fc 융합 단백질 단량체는 상기의 3개의 Cys의 같은 위치의 Cys 사이의 3개의 이황화 결합의 형성에 의해 이량체를 형성한다. 상기 3개의 이황화 결합에 의해 이량체는 안정화되고 낮은 pH, 열에 대해 높은 안정성을 갖는다. 낮은 pH, 열에 대한 안정성이 높다는 것은 예를 들어, 낮은 pH 조건에서 가열 하에서 응집체의 형성이 적은 것을 말하며, 예를 들면, 낮은 pH 처리 또는 가열 처리한 후, 겔 여과 크로마토그래피로 응집체의 함유율(content rate)을 측정함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Fc 융합 단백질을 2 ~ 8℃, 바람직하게는 4℃의 저온 하, pH 1 ~ 5, 바람직하게는 pH 2 ~ 4에서, 1일 ~ 1개월, 바람직하게는 1일 ~ 14일, 더욱 바람직하게는 5 ~ 12일 동안 보관해도, 혹은 25 ~ 45℃, 바람직하게는 30 ~ 40℃에서 1일 ~ 1개월, 바람직하게는 1일 ~ 14일, 더욱 바람직하게는 1일 ~ 7일간 저장해도 응집체 함유율 변화는 적다. 예를 들어, 본 발명의 단백질 응집체 함유율 변화는 겔 여과 크로마토그래피의 피크 면적에 따라 계산한 경우에 10% 이하, 바람직하게는 8% 이하이다. 또한 링커 단편으로써 2개 이하의 Cys를 갖는 것을 가지는 Fc 융합 단백질에 비해, 본 발명의 단백질 응집체 함유율 변화는 작다.
본 발명의 단백질, 예를 들어 하기의 방법 또는 그에 준하는 방법, 또는 문헌에 기재된 방법 또는 그에 준하는 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 단백질은 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA를 준비하고, 이 DNA를 포함하는 발현 벡터를 구축한다. 이어서, 상기 벡터를 이용하여 원핵 또는 진핵 세포를 형질 전환(transformed) 또는 형질 감염(transfected)하여 얻은 세포의 배양 상청으로부터 목적 단백질을 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명의 단백질은 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 단백질 발현 세포를 이용하여 제조할 수도 있다. 예를 들어, 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA를 포유동물 발현 플라스미드 벡터에 조립하여 단백질 발현 플라스미드를 제조한 후, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO) 등의 동물 세포에 도입하여 안정적 발현 세포주를 수립한다. 이 세포를 배양하여 배양 상청으로부터 본 발명의 단백질을 얻을 수 있다.
본 발명의 단백질은 필요에 따라 해당 기술 분야의 당업자에게 공지된 분리 및 정제 수단에 의해 분리 및 정제할 수 있다. 예를 들면, 분리 및 정제 방법으로는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피, 투석 침전 분획법, 전기영동 등을 들 수 있다. 이러한 방법을 적절히 조합하여 본 발명의 단백질을 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명의 단백질은 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 화학 수식이 되어있어도 좋다. 예를 들어, 화학 수식에는 글리코실화(glycosylation), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycolation; PEG) 화, 아세틸화(acetylation), 아미드화(amidation) 등을 들 수 있다.
본 발명의 단백질은 IgE에 대한 뛰어난 중화 활성을 가지므로, IgE가 관여하는 각종 질환의 예방 또는 치료제로 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단백질은 기관지 천식(bronchial asthma), 호산구성 중이염(eosinophilic otitis media), 호산구성 부비강염(eosinophilic sinusitis), 알레르기성 결막염(allergic conjunctivitis), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 꽃가루 알레르기(pollinosis), 식품 알레르기(food allergy), 진드기 알레르기 질환(mite allergic disease), 두드러기(hives), 아나필락시스(anaphylactic shock) 등의 I 형 알레르기가 관여하는 질환 등의 예방 또는 치료에 유용하다.
본 발명의 단백질은 IgE에 대한 뛰어난 친화력을 가진다. 따라서 항체 약물 복합(ADC) 같이, 본 발명의 단백질은 그 친화성을 활용 한 "단백질-약물 복합체"로 사용할 수도 있다. 예를 들어, "Protein 1-약물", "Protein 1-링커-약물" 등의 사용 양태를 들 수 있다. 약물로는 항알레르기제 등을 사용할 수 있으며, 복합체는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 용도에 따라 다양한 제형의 것이 사용된다. 예를 들어, 경구제로는 정제, 산제, 과립제, 세립제, 캡슐제 등을 들 수 있다. 비경구제로는 주사제, 흡입 분말제(inhalation powders), 흡입액제(inhalation liquid), 점안제, 액제, 로션제, 스프레이제, 점비제(nasal drops), 점적제(drip), 연고제, 좌제(suppository), 첨부제(patch) 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 용도에 따라 다양한 투여 방법이 이용된다. 예를 들어, 경구 투여로는, 정맥 주사, 복강 내 투여, 피하 투여, 국소 투여, 근육 내 투여 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 단백질 및 적어도 하나의 부형제를 사용하여 조제된다. 본 발명의 의약 조성물은 그 제형에 따라 제제학적으로 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 의약품 첨가물로는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 희석제, 완충제, 등장화제, 보존제, 안정제, 용해 보조제 등의 부형제를 들 수 있다. 상기 의약품 첨가물은 생리식염수, 주사용수 등도 포함된다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 의약품 첨가물과 혼합, 희석 또는 용해하여 조제할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 예방 또는 치료에 이용하는 경우, 그 유효성분인 본 발명의 단백질의 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중, 질병의 정도, 제형, 투여 경로 등에 따라 적절히 결정된다. 성인에 대한 투여량은 경구 투여의 경우, 예를 들어, 0.1 μg/kg ~ 1000mg/kg/day의 범위에서 정할 수 있다. 경구 투여의 1일 투여량은 제형에 따라, 바람직하게는 0.1 mg/kg ~ 10 mg/kg/day의 범위이다. 1일 투여량을 1회, 2회 또는 3회로 나누어 투여하여도 좋다. 또한 성인에 대한 투여량은 비경구 투여의 경우 0.01 μg/kg ~ 1000 mg/kg/day 범위에서 정할 수 있다. 비경구 투여의 1 일 투여량은 제형에 따라, 바람직하게는 0.1μg/kg ~ 10μg/kg/일, 1 μg/kg ~ 100 μg/kg/일, 또는 10 μg/kg ~ 1000 μg/kg/day의 범위이다.
[실시예]
본 발명의 내용에 대해서, 이하의 실시예 및 시험예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 그 내용에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
Protein 1의 발현 및 제조
(1) Protein 1 발현 벡터의 제조
서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA를 포유동물 발현 플라스미드 벡터에 통합하여 Protein 1 발현 플라스미드를 제조하였다.
(2) Protein 1 발현 세포의 제조
Protein 1 발현 플라스미드를 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)에 도입하여 Protein 1의 안정적 발현 세포주를 수립했다. 배양 상청(culture supernatant)에서 Protein 1의 분비를 SDS-PAGE로 확인했다.
시험예 1
IgE 결합 저해 활성 ( IgE 중화 활성)
(1) 분석 플레이트의 제조
Protein 1을 코팅 완충액에 용해하여 마이크로 플레이트에 일정량을 첨가하였다. 4℃에서 18시간 이상 방치 후 세척용 완충액(PBS-Tween20)로 세척하고 차단액(Assay Diluent)(BD Biosciences)을 첨가하였다. 실온에서 1시간 방치 후 차단액을 제거하고 세척 완충액으로 세척하고 결합 저해 활성 측정에 사용하였다.
(2) 결합 저해 활성의 측정 방법
양성 대조로 omalizumab(항 사람 IgE 항체)를 이용하여 Protein 1의 IgE 결합 저해 활성을 다음과 같이 측정했다.
일정량의 인간 IgE(ANTIBODYSHOP)와 임의의 농도 Protein 1 또는 omalizumab (Novartis)를 혼합하여 상기 (1)에서 제조한 플레이트에 첨가하여 실온에서 2시간 방치했다. 혼합액을 폐기 후 세척용 완충액으로 세척하고 HRP가 표지된 항 사람 IgE 항체(BD Biosciences)를 첨가하여 실온에서 1시간 방치하였다. 항체액을 폐기 후 세척용 완충액을 이용하여 세척하였다. TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 용액을 첨가하여 일정 시간 후에 인산을 첨가하여 발색 반응을 정지했다. 그 후, 플레이트 리더를 이용하여 흡광도(OD450)을 측정했다. 플레이트에 고정된 Protein 1에 결합한 IgE 양보다 Protein 1 및 omalizumab의 IgE 결합 저해 활성 (IgE 중화 활성)을 평가했다 (도 1).
(3) 결과
본 발명의 Protein 1은 IgE의 FCER1A에 결합을 농도 의존적으로 억제했다.
시험예 2
낮은 pH에서의 안정성 시험
(1) 샘플의 준비
정화 작업은 AKTA Explorer 10 S(GE 헬스케어)을 이용하여 실시하였다. 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법에 의해 Protein 1을 발현하고 그 배양 상청을 D-PBS(-)(Dulbecco 's Phosphate Buffered Saline)로 2배 희석하고, HiTrap rProtein A FF (GE 헬스케어, 17 -5079-01)에 부하했다. 상기 컬럼을 D-PBS(-)로 세정한 후, 100 mM 글리신 염산 완충액 (pH 2.2)로 용출하여 단백질 A 흡착 분획을 1.0mL/tube에서 분취했다. 피크 분획을 혼합하여 낮은 pH 처리 샘플(pH 2.9)로 했다. 상기 낮은 pH 처리 샘플을 4℃에서 저장한 것을 평가용 샘플로 했다. 평가용 샘플에서 소정 시간(4℃ 저장에서 5일 ~ 12일 후)에 0.25 mL의 샘플링을 실시해, 0.05 mL의 1M 트리스 염산 완충액 (pH 9.0)을 가하여 중화하고 중화 처리 샘플을 얻었다.
비교 대조로서, 비특허문헌 3의 기재의 Fusion protein A를 사용하였다. 실시예 1과 동일한 방법에 의해 Fusion protein A를 발현하고, 상기 방법과 동일한 방법에 의해 중화 처리 샘플을 얻었다. 또한, 본 시험에 사용된 Fusion protein A는 다음의 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 단백질이다. 서열번호 4의 아미노산 서열은 제 180번째 Asp에서 188번째 Cys로 구성된 링커 단편을 포함하며, 상기 링커 조각에 포함된 Cys의 수는 2개이다.
서열번호 4 :
VPQKPKVSLNPPWNRIFKGENVTLTCNGNNFFEVSSTKWFHNGSLSEETNSSLNIVNAKFEDSGEYKCQHQQVNESEPVYLEVFSDWLLLQASAEVVMEGQPLFLRCHGWRNWDVYKVIYYKDGEALKYWYENHNISITNATVEDSGTYYCTGKVWQLDYESEPLNITVIKAPREKYWLDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(2) 응집체 함량의 분석 방법
응집체의 분석 작업은 AKTA Explorer 10 S(GE 헬스케어)을 이용하여 이동상을 D-PBS(-)로 Superdex200 10/300GL(GE 헬스케어, 17-5175-01)에 의한 겔 여과 크로마토그래피를 실시하여 확인하였다. 용출 위치가 단량체인 피크와, 고분자 영역에 용출되는 응집체 피크에 대한 면적을 산출하고, Protein 1 및 Fusion protein A의 낮은 pH 처리에 대한 응집체 함유율 변화(%) 추이를 평가하였다(도 2).
(3) 결과
본 발명의 단백질은 Fusion protein A에 비해 낮은 pH 처리 시간에 따른 응집체 형성의 증가량이 크게 적고, 낮은 pH 노출에 대한 높은 안정성을 보여 주었다. 따라서, 본 발명의 단백질은 낮은 pH에서의 안정성이 우수하고 제조 공정에 있어서 정제 효율과 생산성 향상이 기대된다.
시험예 3
열에 대한 안정성 시험
(1) 샘플의 제조
정화 작업은 AKTA Explorer 10 S(GE 헬스케어)을 이용하여 실시하였다. 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법에 의해 Protein 1을 발현하고 그 배양 상청을 HiTrap MabSelect SuRe(GE 헬스케어, 17-0034-94)에 부하했다. 상기 컬럼을 D-PBS (-) 및 100 mM 구연산 완충액(pH 4.0)로 세정한 후, 단백질 A 흡착물을 100 mM 글리신 염산 완충액(pH 3.3)으로 용출했다. 회수한 분획에 1/10 용량의 1M 트리스 염산 완충액(pH 9.0)을 가하여 중화하고 단백질 A 정제 단백질을 얻었다. 이 단백질 A 정제 단백질을 1 N HCl로 pH 4.0로 조정하고, 소수성 상호 작용과 양이온 교환 믹스-모드 수지를 충전한 컬럼에 부하했다. 50 mM 초산 완충액 (pH 4.0)에서 비 흡착 단백질을 세척 후 50 mM 트리스 염산 완충액(pH 9.0)에 100% 선형 그레디언트 용출을 실시하고, 피크 분획을 회수하고 정제 단백질을 얻었다. 얻어진 단백질을, 이동상을 D-PBS(-)로 HiLoad 16/60 Superdex200 prep grade(GE 헬스케어, 17-1069-01)을 이용하여 겔 여과 분획을 실시했다. 단량체에 상당하는 피크 분획을 회수하여 겔 여과 정제 샘플을 얻었다. 이 겔 여과 정제 샘플 D-PBS(-)로 다시 제조하고 마이크로 튜브에 분주하고 37℃에서 배양한 것을 평가용 샘플로 했다. 평가용 샘플에서 소정의 시간(37℃ 저장에서 1일 ~ 7일 후)에 샘플링을 실시하여, 열처리 샘플을 얻었다.
비교 대조로서, 비특허문헌 3 기재의 Fusion protein A를 사용하였다. 실시예 1과 동일한 방법에 의해 Fusion protein A를 발현하고, 상기 방법과 동일한 방법으로 열처리 샘플을 얻었다. 또한, 시험에 사용된 Fusion protein A는 시험예 2에서 이용한 단백질과 동일한 아미노산 서열의 단백질이다.
(2) 응집체 함유량의 분석 방법
응집체의 분석 작업은 AKTA Explorer 10 S(GE 헬스케어)을 이용하여 이동상을 D-PBS(-)로 Superdex200 10/300GL(GE 헬스케어, 17-5175-01)에 의한 겔 여과 크로마토그래피를 실시하여 확인하였다. 용출 위치가 단량체인 피크와, 고분자 영역에 용출되는 응집체 피크에 대한 면적을 산출하고, Protein 1 및 Fusion protein A 열처리의 응집체 함유율 변화(%) 추이를 평가했다(도 3).
(3) 결과
본 발명의 단백질은 Fusion protein A에 비해 37℃ 저장에서의 응집체 함량의 증가가 적고, 37℃ 노출에 대해 보다 안정적임을 보여 주었다. 따라서, 본 발명의 단백질은 낮은 pH에서 안정성뿐만 아니라 열에 대한 안정성도 우수하여, 제조 공정에 있어서 정제 효율과 생산성 향상이 기대된다.
본 발명의 단백질은 IgE에 대한 뛰어난 중화 활성을 가지므로, IgE가 관여하는 각종 질환의 예방 또는 치료용 단백질 의약품으로 사용할 수 있다.
서열번호 2 합성
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
<110> Kissei Pharmaceutical Co., Ltd. <120> An Fc-fused high affinity IgE receptor alpha-chain <130> 2017FPI-06-002_JP <150> JP 2015-032231 <151> 2015-02-20 <150> JP 2015-252231 <151> 2015-12-24 <150> PCT/JP 2016/054854 <151> 2016-02-19 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile 1 5 10 15 Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe 20 25 30 Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu 35 40 45 Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val 85 90 95 Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn 100 105 110 Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys 115 120 125 Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu 130 135 140 Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr 145 150 155 160 Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys 165 170 175 Tyr Trp Leu <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 411 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile 1 5 10 15 Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe 20 25 30 Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu 35 40 45 Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val 85 90 95 Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn 100 105 110 Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys 115 120 125 Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu 130 135 140 Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr 145 150 155 160 Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys 165 170 175 Tyr Trp Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 180 185 190 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 195 200 205 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 210 215 220 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 225 230 235 240 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 245 250 255 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 260 265 270 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 275 280 285 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 290 295 300 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 305 310 315 320 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 325 330 335 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 340 345 350 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 355 360 365 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 370 375 380 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 385 390 395 400 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 405 410 <210> 4 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile 1 5 10 15 Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe 20 25 30 Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu 35 40 45 Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val 85 90 95 Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn 100 105 110 Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys 115 120 125 Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu 130 135 140 Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr 145 150 155 160 Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys 165 170 175 Tyr Trp Leu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 180 185 190 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 195 200 205 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 210 215 220 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 225 230 235 240 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 245 250 255 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 260 265 270 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 275 280 285 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 290 295 300 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 305 310 315 320 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 325 330 335 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 340 345 350 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 355 360 365 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 370 375 380 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 385 390 395 400 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 405

Claims (5)

  1. (i) 고친화성 IgE 수용체 α 사슬(high affinity IgE receptor α-chain); 및
    (ii) IgG1의 Fc 영역;
    을 함유하고, 상기 (i) 및 (ii)의 링커 단편 영역이 서열번호 2의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는, Fc 융합 단백질(Fc fusion protein).
  2. 제 1항에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열의 C 말단의 리신(lysine; K)이 결손된 아미노산 서열을 포함하는 Fc 융합 단백질.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 이량체(dimer)인, Fc 융합 단백질.
  4. 제 3항에 있어서, 링커 단편 영역의 시스테인(cysteine) 잔기들이 3개의 이황화 결합(disulfide bonds)을 형성하는, Fc 융합 단백질.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 Fc 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물.
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