CN101633698B

CN101633698B - 一种免疫融合蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101633698B
Application number: CN2009100918243A
Authority: CN
Inventors: 胡品良; 马金伟; 程红; 褚学者; 李先钟; 扈艳红; 赵天贵; 喻志爱; 林峰; 何丽华; 白先宏
Original assignee: BEIJING JINGYI TAIXIANG TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd; Biotech Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: BEIJING JINGYI TAIXIANG TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd; Biotech Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2009-08-26
Filing date: 2009-08-26
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2029-08-26
Also published as: CN101633698A

Abstract

本发明公开了一种蛋白。本发明提供的蛋白是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能与IgE分子结合的由1)衍生的蛋白质。该蛋白与IgE较高的亲和力；FcεRIα和IgG2均来自人源性蛋白，无抗原性，无需进行人源化改造；半衰期较长，分子量达170kDa，较sFcεRIα大。具有潜在的治疗哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎及食物过敏等过敏性疾病的价值。

Description

一种免疫融合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种免疫融合蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎及食物过敏等过敏性疾病，在过去的20年中该类疾病的发病率逐年上升。仅就哮喘而言全世界约有1.0-1.5亿人患有哮喘，该疾病严重影响患者的身心健康，每年可导致约18万人死亡。全球用于哮喘疾病的治疗费用超过了艾滋病和结核的总和。IgE分子是参与过敏性疾病的关键分子。过敏原与已结合于效应细胞膜表面的IgE结合，引起细胞表面IgE受体交联，使磷酸肌醇水解，胞浆Ca²⁺浓度增加，导致嗜碱性粒、肥大细胞等效应细胞脱颗粒，释放和合成组织胺、白细胞三烯和血小板活化因子等大量过敏介质，引起平滑肌收缩、腺体分泌增强，从而引发过敏症状。过敏性变态反应的治疗方案包括：避免接触过敏原、抗组胺治疗、脱敏疗法、免疫治疗、激素治疗等，但目前的治疗方法往往存在较严重的毒副反应和治疗效果不佳的问题。所以，研制高效药物用于此类疾病的治疗仍然是生物学家和医学家们面临的一个艰巨任务。

IgE分子是参与过敏性疾病的关键分子，其生理作用必须与相应受体结合而发生。E受体(FcεR)可分为FcεRI和FcεRII两种受体，其分布、结构及介导的生物学作用有所不同。

FcεRI：为IgE高亲和力受体，亲和常数Kd为10^-9-10^-10M。FcεRI型受体由两种形式存在，1、由四聚体(αβγ2)组成，主要表达于肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面。四个亚基为：一个单链跨膜、直接与IgE结合的α亚基，一个四次跨膜的β链以及两个以二硫键相连的γ亚基。α链直接与IgE结合，含222个氨基酸残基，分子量25kDa，β链含243个氨基酸残基，可能是把α链与γ链相连接和信号放大的作用，两条γ链由二硫键连接组成同源二聚体，γ与FcεRI的表达的稳定性和信号的传导有关，β和γ链通过受体酪氨酸激活基序的磷酸化参与了早期相反应胞内信号级联的传导。lyn，src家族的PTK被激活，lyn的激活又使β链、γ链及邻近的蛋白酪氨酸磷酸化，磷酸化的β、γ亚基反过来再分别激活lyn、Syk。激活的lyn又磷酸化激活Btk、Emt，两者均是Tec家族分别引起胞内Ca外流及激活PKC的作用。PKC的激活和细胞外钙的增加是脱颗粒反应所必需。2、三聚体(αγ2)形式的受体，主要表达于嗜酸性粒细胞、单核细胞、树突状细胞以及朗格汉氏细胞表面。IgE与FcεRI的结合是以1∶1比例结合，这样就避免了在没有过敏原存在时，1个IgE就可以结合2个相邻的FcεRI发生交联，从而引起细胞内信号传导、活化免疫效应细胞。

FcεRI(CD23)：为IgE低亲和力受体，Kd为10^-7M。主要存在于B细胞、单核细胞以及嗜酸性粒细胞等炎症细胞表面，为II型整合素家族膜蛋白。其胞外区由3个含有C型凝集素样结构域的头部和1个含有多个蛋白酶切位点的柄部组成。FcεRII可能以两个含凝集素样结构域的头部与IgE分子的两个结合位点相结合形成IgE-FcεRII复合物，主要参与IgE的负反馈调节、增强IgE依赖的抗原呈递、引发炎症细胞介导的吞噬作用和细胞毒作用等。胞外C端被蛋白酶裂解的不同片段14kDa、25kDa和33-37kDa均称为IgE结合因子(IgE-BF)，亦称B细胞来源的B细胞生长因子(B-BCGF)，具有结合IgE和促进B细胞生长的作用。此外FcεRII可介导IgE依赖的ADCC和吞噬调理作用。

FcεRI受体中α亚基可直接与IgE结合，并具有很高的亲和力。FcεRIα胞外区包括两个Ig样区——Domain1(D1)和Domain2(D2)，D1和D2以反向平行的方式存在。其中D2对结合IgE的贡献最大，FcεRIα通过D2与IgE分子Cε3区的凸面平行结合，从而形IgE-Fc/FcεRI复合物。2000年，Garman SC等(参见，Nature，2000，406(6793)：259-266)利用X-射线晶体衍射技术解析了IgE-Fc/FcεRI复合物的晶体结构(分辨率3.5-

)，晶体结构证实IgE-Fc与FcεRI间存在2个结合位点——IgE双链中链1的Cε3区存在“Tyr131口袋”，链2的Cε3区存在“Pro426位点”，分别与FcεRIα上的“Tyr131位点”和“Pro426口袋”结合，从而形成IgE-Fc/FcεRI复合物。FcεRIαD2区包括Tyr131在内的八个残基与IgE-Fc直接作用，而D1不和IgE-Fc直接结合。D1-D2连接(85-87)、D2BC环(110-113)以及D2FG环(156-158)形成“Pro426口袋”，IgE-Fc链2的Cε3区Pro426残基插入这一口袋中的Trp87和Trp110残基之间，形成了疏水的“Trp-Pro-Trp”三明治结构；同时，IgE-Fc链1上的BC环(362-365)、FG环(424-427)以及Cε2-Cε3连接(334-336)形成了“Tyr131口袋”，FcεRIα的Tyr131位点伸入这一口袋中，与IgE-Fc链1Cε3区中的Pro333、Arg334和Arg427残基以氢键和极性作用直接结合，这一作用强于Pro426位点——“Pro426口袋”之间的疏水作用。IgE-Fc链2中的Pro333、Arg334和Arg427残基与FcεRIα之间也存在弱的相互作用。

尽管IgE在人体内含量极微(50～300ng/mL)，半衰期很短(约2.5d)，但由于IgE与FcεRI具有很高的亲和力，IgE的作用被明显放大。从理论上来说，阻止IgE分子与效应细胞表面的高亲和力受体FcεRI的结合便可以有效抑制过敏原诱导的过敏反应。目前，已相继出现了抗IgE抗体、抗IgE受体抗体以及依据抗IgE抗体效应部位设计的多肽等抑制性小分子，它们均显示了潜在的治疗过敏性疾病的能力。

Kim HM等(参见，Kim HM等人，Immunology，1998；93：589-94)，通过合成FcεRIα亚基的反义寡核苷酸(ODN)，使α亚基表达缺陷，从而抑制IgE介导的过敏反应，其良好的治疗效果已经在小鼠体内、体外得到证实。

近十年人们重点开始转向能够阻断受体、配体相互作用的抗体，于是人们制备了许多针对IgE及FcεRI受体的单克隆及多克隆抗体。2004年重组人源抗IgE抗体奥马佐单抗(omalizumab，又称为E25或rhuMAb2E25)获FDA批准上市，商品名为

，是基因泰克和诺华共同开发的单克隆抗体药物，为人源化抗IgE抗体。Xolair于2003年在美国上市，用于治疗成人和12岁以上青少年的严重哮喘，其2006年的销售额将近5亿美元。Xolair与循环IgE的Cε3区结合，并阻断IgE与效应细胞膜表面FcεRI和FcεRII受体的结合，从而抑制I型变态反应性疾病的发生。

因为其过敏反应发生率较高达2/1000，患者出现呼吸急促、气短和低血压等症状，甚至导致死亡。2007年，美国FDA决定给Xolair贴上最严重的安全警告标志“黑框”，“黑框”警告是美国处方药最严厉的安全警示标志。Xolair的销售市场使我们看到了治疗哮喘和过敏性鼻炎的市场前景。所以，患者急需治疗效果好毒副作用低的新产品提供给他们。

sFcεRIα为细胞膜外区，仍然保留与IgE特异性结合的能力，与IgE亲和力与完整的受体基本一致，但丧失信号转导功能。sFcεRIα可与膜表面完整受体竞争IgE，从而发挥阻断效应，抑制过敏反应的发生。未糖基化的sFcεRIα其分子量预测大约28Kd，有7个潜在的N糖基化位点，在CHO表达的分子量58kD。实验结果表明(参见Gavin AL等，Immunology.1995，86(3)：392-8.Ra c等，Int Immunol.1993，5(1)：47-54.)，sFcεRIα可与IgE竞争结合FcεRI，阻止RBL-2H3细胞组胺的释放；被动皮肤过敏实验证实，sFcεRIα可抑制过敏反应的发生。说明sFcεRIα在治疗I型变态反应性疾病有很大的潜力。但是其半衰期较短t_1/2＝15分钟，限制其在临床上的应用。Haak FM等(参见，Haak FM等，J Immunol，1993，151：351-58)构建了FcεRIα-IgG免疫融合蛋白。它是由FcεRIα亚基的细胞外区和IgG1重链的CH2、CH3、铰链区相结合而组成的融合蛋白。该融合蛋白对游离的IgE具有高亲和力，但不能识别已结合到受体上的IgE，因此不会引起受体交联，无诱发变态反应的能力。融合蛋白通过FcεRI的α亚基细胞外区识别游离的IgE，而IgG1的CH2、CH3可延长重构体在体内的循环时间，还有易提纯、易检测的优点，由于其组成部分均来源于人类，不会引起免疫排斥反应。但是，Haak FM在融合蛋白中采用的是IgG1的Fc结构，这样的融合蛋白结构在未来的使用中会带来毒副作用大的问题。众所周知，免疫球蛋白在发挥抗肿瘤和抗感染的功效中其重链恒定区Fc发挥重要的作用：1、通过Fc与细胞表面的Fc受体(FcγRs，即FcγRI、FcγRII和FcγRIII)的结合，介导抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)杀伤靶细胞。此外，抗体与NK细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等免疫效应细胞结合后诱发丝裂原活性，导致TNFα、IL-2、IFN-γ、IL-6等大量炎性细胞因子的释放；2、通过Fc的CH2区的补体结合位点与补体C1结合，激活补体，引发补体依赖的细胞毒作用(CDC)。在应用FcεRIα/Ig类融合蛋白进行治疗时，必须力求避免在应用于人体后所诱发的ADCC、CDC和丝裂原活性，降低由此产生的毒副作用。在IgG的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四个亚类中，IgG1和IgG3能有效结合FcγRs，IgG4比IgG1、IgG低一个数量级，IgG2与FcγRs的结合能力低得难以测定。IgG1和IgG3能有效结合补体C1q，诱导补体经典激活途径，IgG2对补体的固定能力很弱。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白。

本发明提供的一种蛋白，命名为FcεRIα/IgG2，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能与IgE分子结合的由1)衍生的蛋白质。

FcεRIα/IgG2是将sFcεRIα与IgG2的铰链区、CH2和CH3进行融合表达。为进一步降低IgG2的CH2区可能具有的较弱的丝裂原活性，将IgG2中的Val234和Gly237突变为Ala，以降低其与FcγRII的结合活性。

序列2的第1-20位是抗体轻链κ信号肽，序列2的第21-199位是sFcεRIα，其余氨基酸序列为IgG2的铰链区、CH2和CH3区，IgG2中的Val234和Gly237突变为Ala。

上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围之内。

上述编码基因可以为如下1)或2)或3)的基因：

1)编码序列是序列表中序列1的自5′端第8位至1303位所示的基因；

2)在严格条件下与1)限定的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

3)与1)限定的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

上述编码基因可以是序列1所示的基因。

上述的严格条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。

含有上述基因的重组载体或重组菌也属于本发明的保护范围之内。

上述重组载体是在PCI/neo的多克隆位点插入上述基因得到的重组载体。

含有上述基因的转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。

上述转基因细胞系是含有上述基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。

本发明的另一目的在于提供一种制备上述蛋白的方法，是培养上述转基因细胞系，得到所述蛋白。

上述细胞培养的条件是35-39℃，3-8％(体积百分比)CO₂，8-12％(体积百分比)胎牛血清的DMEM培养基；优选是37℃，5％CO₂，10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。

本发明的又一目的在于提供上述的蛋白或上述的基因在制备治疗过敏性疾病的药物中的应用；所述过敏性疾病是哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎或食物过敏。

本发明提供的免疫融合蛋白FcεRIα/IgG2保持了与IgE较高的亲和力；FcεRIα和IgG2均来自人源性蛋白，无抗原性，无需进行人源化改造；半衰期较长，分子量达170kDa，较sFcεRIα大；低毒性，在融合蛋白中采用突变的人源IgG2的稳定区，IgG2不易与FcγRI、FcγRII和FcγRII结合，无ADCC、CDC和丝裂原活性；易纯化和检测，IgG2的稳定区CH2和CH3仍保留与Protein A的结合特性，为将来产品的纯化提供了便利。

为将来产品的纯化提供了便利。

本发明所研制的免疫融合蛋白FcεRIα/IgG2对该类疾病的治疗具有广阔的临床应用前景，将来对其进一步开发可产生巨大的经济效益和社会效益。

附图说明

图1是凝胶电泳图谱，其中A是PCR扩增FcεRIα/mIg基因；B是XhoI-EcoRI双酶切鉴定。

图2是IgE蛋白标准曲线。

图3是FcεRIα/IgG2融合蛋白Western-blot检测结果。

图4是FcεRIα/IgG2纯化产物非还原电泳。

图5是ELISA检测FcεRIα/IgG2与鼠IgE结合活性。

图6是竞争ELISA方法检测FcεRIα/IgG2与人IgE结合活性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、免疫融合蛋白FcεRIα/IgG2的获得及其功能分析

一、免疫融合蛋白FcεRIα/IgG2的获得

1、免疫融合蛋白FcεRIα/IgG2表达基因的优化及合成

人工合成序列1所示的DNA片段，以该DNA片段为模板，用如下的引物进行PCR扩增：

上游引物：5-CCGCTCGAGCCGCCACCATGGAGAC-3；

下游引物5-CCGGAATTCTTACTTTCCA GGAGACAGGGACAGG-3，

其中下划线部分分别为XhoI和EcoRI的酶切位点，北京奥科生物技术有限责任公司合成。

PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5分钟；以94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min，扩增30个循环；再以72℃延伸10分钟。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，如图1A(1，FcεRIα/mIg基因；2，分子量标准DL2000)所示，得到大约1300bp的条带，命名为FcεRIα/IgG2。然后将目的条带切下，用DNA试剂盒(北京天根生化科技有限公司产品)回收扩增产物。将回收的产物连接T载体，送奥科生物技术有限责任公司测序，测序结果表明该条带具有序列表中序列1所示的自5’端第1-1303位所示的核苷酸序列，该序列的编码基因如序列1的自5′端第8位至1303位所示。

2、重组载体的构建

纯化的PCR产物和载体PCI/neo(Promega Corporation)用EcoR I和XhoI双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T₄DNA连接酶作用下16℃连接过夜，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细菌中，在LB(氨苄酶素抗性)培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用EcoR I和XhoI双酶切鉴定，结果如图1B(1，切出预期大小的片段；2，空载体；3，分子量标准DL2000)所示。鉴定正确后送奥科生物技术有限责任公司测序，将测序结果正确的重组载体命名为pCI/neo-FcεRIα/IgG2。

3、免疫融合蛋白FcεRIα/IgG2的表达及纯化

1)免疫融合蛋白FcεRIα/IgG2的表达

A、将中国仓鼠卵巢细胞(CHO)培养于含10％(体积百分比)胎牛血清(FCS)的DMEM(购自Hyclone公司，Cat.No：B11000179)完全培养液中，转染前一天均匀铺于6孔板，每孔3×10⁵。细胞传代24h后，吸弃培养板中的培养液，用双无DMEM培养液(无血清无抗生素的DMEM培养液)轻轻洗两次，加入800μl双无DMEM培养液，得到含待转染CHO细胞的培养板。

B、然后按照脂质体Lipofectamine-^TM试剂说明书(Invitrogen公司产品，Cat.No：11668-027)，将脂质体加入到100μl上述的无血清无抗生素的DMEM培养液中混匀，静置10min，同样将步骤2中pCI/neo-IgG2加入到100μl无抗生素、无血清的DMEM培养液中混匀，静置10min。然后将两份静置10min中后的培养液混合，室温放置30min，得到脂质体/DNA混悬液。

C、将步骤B的200μl脂质体/DNA混悬液逐滴加入步骤A得到的含有待转染CHO细胞的培养板，轻轻混匀，置于5％(体积百分比)CO₂、37℃孵育6h后，得到转染的细胞，然后将培养液换成含10％(体积百分比)FCS的DMEM完全培养液继续培养，即可得到免疫融合蛋白FcεRIα/IgG2。

2)ELISA检测表达量

转染细胞培养48h后，采用夹心ELISA法检测融合蛋白的瞬时表达。96孔板包被3μg/ml抗人IgG(Sigma，，Cat.No：I3382)，50μl/孔，4℃过夜；0.25g/100ml BSA的PBST(0.05％(体积百分比)Tween-20)洗涤96孔板4次；1g/100ml的BSA-PBS封闭(50μl/孔)，37℃，封闭1小时；PBST(Ph7.4)洗涤4次后，加入0.25％BSA的PBST稀释转染细胞上清液，50μl/孔，37℃孵育1h，同时蛋白标准品(人IgG)也进行相同的操作，37℃孵育1h。

0.25％BSA的PBST(0.05％Tween-20)洗板4次后，加入1∶2000稀释碱性磷酸酶标记抗人IgG(Sigma，Cat.No：A3188)，50μl/孔；0.25％BSA的PBST(0.05％Tween-20)洗板4次后，加1mg/ml用二乙醇胺新鲜配制的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)50μl/孔，避光反应30min；加终止液3M NaOH(50μl/孔)，405nm和490nm双波长读数。根据标准品的结果绘制标准曲线如图2所示，进行x(浓度)，y(吸光度)的直线拟合；求出细胞上清液中融合蛋白的浓度。实验重复三次。

结果表明转染CHO细胞48h后，培养上清液中融合蛋白的瞬时表达量为72.3±5.779ng/ml。

3)western-blot检测免疫融合蛋白FcεRIα/IgG2的表达

细胞转染48h后，吸弃培养液，用预冷的PBS(pH7.4)洗二次，每孔加入80μl1×SDS上样缓冲液(50mmol/L Tris，pH 6.8，2g/100ml的SDS，10％(体积百分比)甘油，0.1％(体积百分比)溴酚蓝，临用前加入100mmol/L DTT)，刮下细胞，将细胞裂解液吸入EP管。100℃水浴3min。离心取上清进行10g/100mlSDS-PAGE电泳。电泳结束后将蛋白电转印至硝酸纤维素膜，转印结束后，将分子量标准位置的硝酸纤维素膜剪下。用含5g/100ml脱脂奶粉的TBS(150mmol/LNaCl，50mmol/L Tris，pH 7.5)室温封闭转印膜2h，然后加入1μg/ml抗FcεRIα单克隆抗体[UPSTATE，Cat.No：06-725用，5g/100ml脱脂奶TBS-T(50mmol/L NaCl，50mmol/L Tris，pH 7.5，0.2％(体积百分比)Tween 20)稀释]，室温下孵育3h。用TBS-T洗膜3次，每次10min。再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(中杉金桥，Cat.No：2B-2305。用5g/100ml脱脂奶TBS-T 1∶5000稀释)，室温下孵育1h。TBS-T洗膜3次，每次10min。用增敏化学发光底物试剂(ECL，AmershamBiosciences公司)检测。

结果如图3所示，细胞转染48h后，其培养上清表达免疫融合蛋白FcεR Iα/IgG2，并且在还原条件下单体FcεRIα/IgG2分子约为85kDa。

4)亲和层析法纯化FcεRIα/IgG2融合蛋白以及非还原SDS-PAGE分析

转染细胞24h后，换成无血清培养基CD CHO medium(Invitrogen产品，Cat.No：10743-029)，5天后收集上清做纯化。用pH7.4的PBS溶液平衡HiTrapMabSelect SuRe 1ml柱(GE Healthcare Life Sciences产品，Cat.No11-0034-93)10个床体积，流速为0.5ml/min；将经转染得到的60ml上清液用0.45μm滤膜过滤上样。流速为0.5ml/min；用pH7.4的PBS溶液再洗5-10个床体积，流速为0.5ml/min；用100mM柠檬酸缓冲液(pH4.0)洗脱，流速为0.5ml/min，收集洗脱峰。

纯化收集的样品于EP管中，加入1/9体积的100％三氯乙酸(TCA)采用颠倒10次混匀。样品置于冰浴中0.5小时。13000rpm，离心10分钟，可见有棕黑色沉淀，弃上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。加入预冷的400μl丙酮，冲洗EP管壁，洗去管底和管壁残余的TCA。重悬沉淀，13000rpm，离心10分钟。弃上清，将EP管倒置于吸水纸，如果沉淀仍然有棕色可再用丙酮重新清洗一遍。加入20-50ul电泳上样缓冲液重悬沉淀，100℃煮沸5分钟。

TCA(三氯乙酸)沉淀法对收集的纯化样品进行浓缩后，采用非还原SDS-PAGE法分析纯化产物，其中非还原SDS-PAGE法与步骤3)western-blot检测中SDS-PAGE法的区别在于未加DTT，其余步骤完全相同。

结果如图4(1，FcεRIα/IgG2.2，对照.3，蛋白分子量标准(Fermentas产品))所示，纯化蛋白的纯度达到95％以上，FcεRIα/IgG2的分子量达到170kDa，较免疫球蛋白IgG 150kDa的分子量还大。

二、免疫融合蛋白FcεRIα/IgG2的功能分析

1、ELISA方法检测FcεRIα/IgG2融合蛋白与鼠IgE的结合能力

1)ELISA方法检测融合蛋白与鼠IgE的结合

本步骤的ELISA方法与步骤一的步骤3的步骤2)的区别在于一抗是10μg/ml的鼠IgE(BD Pharmingen，Cat No：55381)，以及待测试样品是将步骤3的步骤2)中的转染CHO细胞48h后的上清液用0.25％BSA-PBST倍比稀释过的，稀释后的融合蛋白的浓度梯度是0、0.452、9.04、18.08、36.15和72.31ng/ml。其余步骤完全相同。

结果如图5所示，IgG2能与鼠IgE结合，在包被10μg/ml的IgE的情况下，随着IgG2浓度的增加，结合量也逐渐增加，在浓度为36ng/ml左右时进入平台期。

2)融合蛋白与鼠IgE亲和常数测定

根据融合蛋白与鼠IgE结合曲线的结果，选择接近饱和(近平台期)的融合蛋白浓度进行亲和力的检测，即36ng/ml。将36ng/ml的融合蛋白与梯度浓度的鼠IgE(6.25ng/ml和12.5ng/ml)混匀，4℃过夜孵育，然后进行ELISA检测。ELISA检测方法同步骤1)。

使用如下公式计算亲和常数：

K^-1＝a₀[A₀/(A₀-A)-1]

其中，A指加入抗原后的吸光度值，a₀指吸光度值为A时对应的抗原浓度，A₀指预孵育时不加入鼠IgE的样品的吸光度值。计算不同鼠IgE浓度下的亲和常数(K)，求平均值从而确定二者的亲和常数。

表1FcεRIα/IgG2融合蛋白与鼠IgE亲和力测定

在鼠IgE浓度分别为6.25ng/ml和12.5ng/ml时，所测得的FcεRIα/mIg(IgG2)融合蛋白与鼠IgE的亲和力分别为2.25×10⁹M^-1和2.66×10⁹M^-1，均值为2.42×10⁹M^-1，属于高亲和力结合。Hakimi J等研究表明(参见，J Biol Chem.，199025；265(36)：22079-81)，鼠IgE与FcεRIα的结合力低于人IgE与FcεRIα的结合力，所以，FcεRIα/IgG2融合蛋白与人IgE的亲和力高于2.42×10⁹M^-1。

2、FcεRIα/IgG2融合蛋白与人IgE的结合能力分析

1)10μg/ml鼠IgE包被96孔板，50μl/孔，4℃过夜；

2)0.25％BSA的PBST稀释纯化人血清IgE(BIODESIGN，Cat No：A75320H)分别进行1∶500；3∶600；1∶700；1∶800；1∶900；1∶1000稀释，与4.5ng/ml FcεRIα/mIg混匀，4℃孵育过夜；

3)用0.25％BSA的PBST(0.05％Tween-20)洗涤96孔板4次，用1％BSA-PBS封闭(每孔50μl)，37℃，1小时，用0.25％BSA的PBST(0.05％Tween-20)洗涤96孔板4次；

4)将步骤2)得到的融合蛋白与人IgE的共同孵育物加入96孔板，50μl/孔，37℃孵育1h，用0.25％BSA的PBST(0.05％Tween-20)洗涤96孔板4次；

5)加入1∶2000稀释碱性磷酸酶标记抗人IgG，50μl/孔，避光反应30min，用0.25％BSA的PBST(0.05％Tween-20)洗涤96孔板4次；

6)加底物NPP(用二乙醇胺新鲜配制，1mg/ml；每孔50μl)，避光反应30min；

7)加终止液3M NaOH(每孔50μl)

8)405nm和490nm双波长读数

FcεRIα/IgG2融合蛋白含有IgE高亲和力受体FcεRI的α亚单位完整的细胞外功能域，仍保留与IgE结合能力，并且与IgE亲和力与完整的受体基本一致。结果如图6所示，当人IgE与融合蛋白结合后，融合蛋白暴露出的与IgE的结合位点减少，从而抑制了融合蛋白与96孔板上包被的鼠IgE的结合。结果表明，随着人IgE浓度的增加，与鼠IgE结合的FcεRIα/IgG2融合蛋白量逐渐减少。FcεRIα/IgG2融合蛋白高亲和力结合游离IgE(人IgE)，说明可用于治疗哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎及食物过敏等过敏性疾病的价值。

序列表

<110>北京精益泰翔技术发展有限公司百泰生物药业有限公司

<120>一种免疫融合蛋白及其编码基因与应用

<130>CGGNARL92504

<160>2

<210>1

<211>1303

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>1

cgccaccatg gagacagaca cactcctgct atgggtactg ctgctctggg ttccaggttc 60

cactggtgtg cctcagaaac ctaaggtgtc cctgaaccct ccatggaatc gcatctttaa 120

aggagagaat gtgactctga cctgtaatgg gaacaatttc tttgaagtga gctccaccaa 180

atggttccac aatggcagcc tgtccgaaga gacaaattcc agcctgaata ttgtgaatgc 240

caaatttgaa gacagcggag agtacaaatg tcagcaccag caggtgaatg agagcgaacc 300

tgtgtacctg gaagtgttca gcgactggct gctgctgcag gcctctgctg aggtggtgat 360

ggagggccag cccctgttcc tgaggtgcca tggttggcgc aactgggatg tgtacaaggt 420

gatctattat aaggatggcg aagctctcaa gtactggtat gagaaccaca acatctccat 480

taccaatgcc accgtggaag acagcggaac ctactactgt accggcaaag tgtggcagct 540

ggactatgag tctgagcccc tgaacattac cgtgatcaag gctcctcggg agaagtactg 600

gctggacaag accgtggagc gcaagtgctg tgtggagtgc cctccctgcc ctgctcctcc 660

tgctgccgct ccttctgtgt tcctgttccc ccctaagccc aaggacaccc tgatgatctc 720

ccggacccct gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgca 780

gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaatgcc aagacaaagc cacgggagga 840

gcagttcaac agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct 900

gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaagggc ctgcctgccc ccatcgagaa 960

gaccatctcc aagaccaagg gacagccccg cgagcctcag gtgtacaccc tgcccccttc 1020

ccgggaggag atgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc 1080

cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tggccagcct gagaacaact acaagaccac 1140

ccctcccatg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa 1200

gagccgctgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ctctgcacaa 1260

ccactacacc cagaagagcc tgtccctgtc tcctggaaag taa 1303

<210>2

<211>431

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro

20 25 30

Trp Asn Arg Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly

35 40 45

Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser

50 55 60

Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe

65 70 75 80

Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser

85 90 95

Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala

100 105 110

Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His

115 120 125

Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly

130 135 140

Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn

145 150 155 160

Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp

165 170 175

Gln Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala

180 185 190

Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys

195 200 205

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val

210 215 220

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

225 230 235 240

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

245 250 255

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

260 265 270

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser

275 280 285

Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

290 295 300

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

305 310 315 320

Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

325 330 335

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

340 345 350

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

355 360 365

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser

370 375 380

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

385 390 395 400

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

405 410 415

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

420 425 430

Claims

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因，编码序列是序列表中序列1的自5′端第8位至1303位所示的基因。

3.含有权利要求2所述基因的重组载体或重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是在PCI/neo的多克隆位点插入权利要求2所述基因得到的重组载体。

5.含有权利要求2所述基因的转基因细胞系。

6.根据权利要求5所述的转基因细胞系，其特征在于：所述转基因细胞系是含有权利要求2所述基因的中国仓鼠卵巢细胞。

7.一种制备权利要求1所述蛋白的方法，是培养权利要求5或6所述转基因细胞系，得到所述蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述细胞培养的条件是35-39℃，3-8％(体积百分比)CO₂，含体积百分比8-12％胎牛血清的DMEM培养基中培养。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述细胞培养的条件是37℃，5％CO₂，含体积百分比10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。

10.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在制备治疗过敏性疾病的药物中的应用；所述过敏性疾病是哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎或食物过敏。