CN111100210B - 一种Fc融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Fc融合蛋白及其应用。所述的Fc融合蛋白包含第一抗原结合功能区、第二抗原结合功能区以及连接的第一Fc链和第二Fc链；其中，所述的第一抗原结合功能区包含FcεRIα，所述的第二抗原结合功能区包含hIL5Rα。本发明将能有效结合IgE及IL‑5的两个全人源自然受体融合成一个分子，保留了原来单独受体的功能及结合能力，其体外生物学功能与单一受体或者单抗效价几乎一致。因此，可以在临床上不增加毒副作用的基础上，联合抗IgE及抗IL‑5的作用，达到提高疗效的效果。

Description

一种Fc融合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种Fc融合蛋白及其应用。
背景技术
目前针对中重度哮喘类疾病，仅有的生物药治疗手段是使用单克隆抗体抗IgE或者抗IL-5。其主要作用是阻断过敏性因子诱发的一系列反应，达到改善症状的作用。但中重度哮喘类疾病的发病机理复杂，单一阻断IgE或者IL-5的作用，只是部分减轻病人的症状，而若是两种药物同时使用则会大幅增加治疗费用，并有可能产生超过人体耐受限度的毒副作用。而目前药物领域尚无既能够阻断IgE、又能够阻断IL-5的治疗方式出现。
尽管根据有关实验报道，水溶性IgE受体及IL-5受体在体外可以分别高效阻断IgE及IL-5的活性，并且动物实验模型也证实每个单一受体可有效改善哮喘症状。然而出于融合蛋白各功能团保留困难等原因，现有技术中并没有同时阻断IgE及IL-5活性的融合蛋白的出现。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中缺乏能够同时阻断IgE及IL-5活性的融合蛋白的缺陷，提供一种Fc融合蛋白及其应用。本发明中的Fc融合蛋白可在不增加毒副作用的同时，有效治疗中重度哮喘类疾病及其它过敏性疾病。
本发明主要通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供一种异源二聚体形式的Fc融合蛋白，其包含第一抗原结合功能区、第二抗原结合功能区以及连接的第一Fc链和第二Fc链；其中，所述的第一抗原结合功能区包含FcεRIα(Fc epsilon RIα)，所述的第二抗原结合功能区包含hIL5Rα(人IL-5受体alpha)。
所述第一Fc链和所述第二Fc链之间的所述连接可为本领域常规的连接，例如通过二硫键所形成的连接。所述的连接可为人工的或者天然形成的，本发明中的所述第一Fc链和所述第二Fc链之间的所述连接为自连接。另外，本发明中所述的第一Fc链和所述的第二Fc链可根据本领域的常规理解，即两者对应IgG1的CH2和CH3，所述的IgG1优选人源IgG1。
较佳地，所述的第一抗原结合功能区的C端连接于所述第一Fc链的N端，所述第二抗原结合功能区的C端连接于所述第二Fc链的N端；所述第一抗原结合功能区的氨基酸序列优选如序列表中SEQ ID NO.1所示，编码所述第一抗原结合功能区的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID NO.3所示；
所述第二抗原结合功能区的氨基酸序列优选如序列表中SEQ ID NO.2所示，编码所述第二抗原结合功能区的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID NO.4所示。
为了增加所述Fc融合蛋白的效用或者治疗效果，可增加所述Fc融合蛋白的元素数量。较佳地，所述第一抗原结合功能区还包含hIL5Rα，所述的第二抗原结合功能区还包含FcεRIα。较佳地，所述的第一抗原结合功能区从N端到C端依次为FcεRIα和hIL5Rα，所述第二抗原结合功能区从N端到C端依次为hIL5Rα和FcεRIα。其中，所述的第一抗原结合功能区中的所述FcεRIα和所述hIL5Rα之间优选通过连接子连接；所述的第二抗原结合功能区中的所述hIL5Rα和所述FcεRIα之间优选通过连接子连接。
本发明还提供一种编码如上所述的Fc融合蛋白的核苷酸。
本发明还提供一种包含如上所述的核苷酸的表达载体。
本发明还提供一种包含如上所述的核苷酸或如上所述的表达载体的宿主细胞，所述的宿主细胞较佳地为真核细胞，更佳地为CHO细胞。
本发明还提供一种药物组合物，其包含如上所述的Fc融合蛋白、所述的核苷酸、所述的表达载体或者所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
本发明还提供一种如上所述的Fc融合蛋白或者如上所述的药物组合物在制备治疗与IgE受体和/或IL-5受体表达或者功能异常相关的疾病的药物中的应用；较佳地，所述与IgE受体和/或IL-5受体表达或者功能异常相关的疾病为中重度哮喘。
本发明中所提及的“第一抗原结合功能区”以及“第一Fc链”中的数字仅为区分相同的术语，并无实际意义；该情况说明也同样适用于“第二抗原结合功能区”以及“第二Fc链”中的数字。
如本发明所述，除非另外说明，Fc是指人免疫球蛋白的Fc片段。术语“免疫球蛋白Fc区”指免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，例如免疫球蛋白Fc区可包括重链CH1、CH2、CH3的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合，在优选例中，所用的免疫球蛋白的Fc区包括至少一个免疫球蛋白绞链区，一个CH2结构域和一个CH3结构域，优选缺少CH1结构域。
已知人免疫球蛋白有多种类别，如IgA、IgD、IgE、IgM及IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4四个亚类)，从特定的免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白Fc区是在本领域技术人员所掌握的范围之内的，在一个优选的实例中，免疫球蛋白Fc区可选择包含有人免疫球蛋白IgG4亚类Fc区的编码序列，其中缺失一个免疫球蛋白重链1结构域(CH1)，但包括了铰链区以及CH2、CH3、二个结构域的编码序列。
如本发明所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
如本发明所用，除非另外说明，所述的融合蛋白是一种分离的蛋白，与其它蛋白、多肽或分子无联系，是重组宿主细胞培养的纯化产物或作为一种纯化的提取物。
根据本发明提供的氨基酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的融合蛋白。这些方法例如但不限于：重组DNA法、人工合成等，参见Murray KM,DahlSLAnn；Pharmacother 1997Nov；31(11):1335-8。
在得知了本发明的融合蛋白的氨基酸序列后，本领域人员可以方便地根据所述的氨基酸序列获得编码本发明的融合蛋白的基因序列。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明将能有效结合IgE及IL-5的两个全人源自然受体融合成一个分子，保留了原来单独受体的功能及结合能力，其体外生物学功能与单一受体或者单抗效价几乎一致。因此，可以在临床上不增加毒副作用的基础上，联合抗IgE及抗IL-5的作用，达到提高疗效的效果。
附图说明
图1为融合蛋白结构示意图。
图2及表1为ELISA检测的稳定细胞株的融合蛋白产量。
图3及表2为检测融合蛋白中FcεRIα的生物学功能检测。
图4及表3为检测融合蛋白中hIL-5Rα的生物学功能检测。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1合成DNA
将脱氧核糖核酸片段FcεRIα(详见序列表中SEQ ID NO.3，亦可见于GenBank:E07699.1；对应的蛋白质序列详见序列表中SEQ ID NO.1所示，亦可见于NCBI ReferenceSequence:NP_001992.1)与hIL5Rα(详见SEQ ID NO.4，亦可见于NCBI ReferenceSequence:NM_000564.4；对应的蛋白质序列详见SEQ ID NO.2，亦可见于ACCESSION NP_000555)分别和人的IgG1的Hinge(铰链)连接，作为Fc(人的IgG1的CH2和CH3)的双臂。连接后重组表达的蛋白名称为FcepsilonRIalph-hIL5Rα-Fc。
合成的DNA经过PCR扩增(引物带有酶切位点)、纯化、酶切，再度纯化，将该酶切的片段与表达载体PGKpuro-EF(购自生物风，http://www.biofeng.com/)进行连接。该表达载体含有人的IgG1片段。插入的片段已经设计为连接片段与IgG1位于同一阅读框架。连接反应的产物经纯化后，转入DH5α细菌，选择抗生素Puromycin抵抗菌落，扩增，提取DNA质粒，酶切证实插入片段的长度及方向正确。进一步测序证实每个核酸及阅读框架均正确。扩增含该表达载体的细菌，制备maxiPrep高纯度质粒备用。
实施例2融合蛋白表达
使用Fugene将实施例1制备的表达质粒5μg，转入5×105CHO细胞(购自ATCC)。24小时后开始用5μg/ml puromycin(嘌呤霉素)选择(操作为本领域常规，具体为每隔2～3天置换含5μg/ml puromycin细胞培养液)，直至明显克隆形成。挑取大约8～10个克隆，进一步扩增。在细胞数量大约达到1×106个时，使用5×105细胞，培养在10ml不含抗生素的培养液中，24小时后，收集培养液，检查相关蛋白质的产量。选取2～3个高表达克隆株，在含有puromycin培养液中继续选择1个月，无puromycin选择1个月，最后选择最高表达株作为稳定细胞株。
表达Fc融合蛋白的细胞培养液，其蛋白以protein A柱纯化，检查含量后备用。
实施例3Fc融合蛋白的性能测定
1、以ELISA检测Fc融合蛋白中FcεRIα或者hIL-5Rα的含量及活性。对FcεRIα的检测，采用Lifespan BioSciences，Inc.公司的Human FcERI/Fc ΕRI ELISA Kit(SandwichELISA)。操作步骤按其试剂盒要求执行。对hIL5Rα的检测，采用Mybiosource.com公司的Interleukin 5ReceptorΑ,ELISA Kit(#MBS073569)。操作步骤按其试剂盒的要求执行。
检测结果如图2及表1所示，可知：稳定细胞株培养液经Protein A柱纯化后，含有的融合蛋白成分经ELISA检测，含有FcεRIα及hIL5Rα的活性。说明该细胞株产生的融合蛋白的各蛋白组成部分，保留了原来各自蛋白的结构及功能。
表1稳定细胞株融合蛋白的产量(mg/ml)
FcepsilonR1 IL-5Rα
第一次检测 0.35 0.68
第二次检测 0.53 0.73
第三次检测 0.39 0.61
2、以bioassay检测其生物学功能
FcεRIα的生物学功能以组胺释放试验(histamine release assay)检测。24孔细胞培养盘的每个孔中加入3×106KU812F细胞(购自ATCC)，细胞混悬在200μl BSA的0.1％PBS溶液。阴性对照组加入100μl PBS，阳性对照组分别加入1、2、4和8nM omalizumab in100μl PBS，实验组加入1、2、4和8nM的FcεRIα融合蛋白。然后其中每个孔中加入2.5μg/mlNative Human IgE protein(无Azide)(abcam公司ab65866)和1μM hydrocortisone(abcam公司ab141250)。30分钟后，离心细胞，取150μl液体，分析组胺浓度。试剂盒采用HistamineAssay Kit(Colorimetric)(abcam公司ab235630)，按其手册操作。
图3及表2显示，在加入2.5μg/ml IgE后，如果加入不同浓度的FcεRIα融合蛋白，可以阻止KU812F细胞释放组胺。测定的含量以OD值表示。细胞释放组胺的量与加入的FcεRIα融合蛋白浓度反向相关。这个结果与阳性对照结果没有显著差异(P<0.05)，说明FcεRIα融合蛋白的功能与标准蛋白功能几乎一致。
表2 KU812F细胞在不同刺激浓度下组胺释放的检测
PBS+IgE蛋白 omalizumab+IgE蛋白 Fc epsilonRIα+IgE蛋白
1nM 0.45 0.36 0.37
2nM 0.46 0.29 0.26
4nM 0.47 0.22 0.24
8nM 0.44 0.15 0.13
hIL-5Rα的生物学功能以CTLL-2-hIL5R生长抑制实验检测。CTLL-2(购自ATCC)转入含hIL-5R的质粒后得到的筛选稳定细胞株，可以依赖IL-2或者IL-5存活，而在没有这两个生长因子时细胞死亡。96孔细胞培养盘的每个孔中加入5×105CTLL-2-hIL5R细胞，细胞混悬在100μl的10％FBS的RPMI溶液。阴性对照组加入100μl PBS，阳性对照组加入100μl10％FBS的RPMI溶液，其中含重组hIL-5 5ng/100μl/孔(Recombinant human IL-5protein，abcam公司，ab9625)及不同浓度的重组hIL-5Rα蛋白(Recombinant Human IL-5RAprotein(Fc Chimera protein，abcam公司，ab83828)，实验组加入100μl 10％FBS的RPMI溶液，其中含重组hIL-5 5ng/100μl/孔(Recombinant human IL-5protein，abcam公司，ab9625)及不同浓度的FcεRIα融合蛋白。48小时后，MTT检测CTLL-2-hIL5R细胞的存活率。
图4及表3中，“hIL-5Rα+hIL-5-ST”为hIL-5Rα蛋白及重组hIL-5(如方法中描述，皆为购自abcam公司的标准蛋白，商品号分别为ab83828和ab9625)，而“hIL-5Rα+hIL-5”为本发明实施例2制得的含有hIL-5Rα的融合蛋白及重组hIL-5(hIL-5是购自abcam公司的标准蛋白，商品号为ab9625)。结果显示，加入5ng/100μl/孔重组标准蛋白hIL-5及不同浓度的重组hIL-5Rα蛋白后，hIL-5Rα可以阻止hIL-5对CTLL-2-hIL5R细胞的生长作用。CTLL-2-hIL5R细胞的存活率与加入的hIL-5Rα融合蛋白浓度反向相关。这个结果与阳性对照结果没有显著差异(P<0.05)，说明hIL-5Rα融合蛋白的功能与标准蛋白功能几乎一致。
表3 CTLL2-hIL5R细胞在hIL-5Rα+融合蛋白中的成活率
浓度ng/ml 1000 250 62.5 15.63 3.91 0.98 0.24 0.06
PBS 4.56 6.31 5.67 4.26 4.89 3.98 4.32 5.24
hIL-5Rα+hIL-5-ST 100 100 99.48 97.33 47.25 14.62 6.94 4.39
hIL-5Rα+hIL-5 100 100 100 91.68 38.74 11.77 6.91 5.99
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉九州钰民医药科技有限公司
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Claims (9)

1.一种异源二聚体形式的Fc融合蛋白，其特征在于，其由第一抗原结合功能区、第二抗原结合功能区以及连接的第一Fc链和第二Fc链组成；其中，所述的第一抗原结合功能区为FcεRIα，所述的第二抗原结合功能区为hIL5Rα；
所述的第一抗原结合功能区的C端连接于所述第一Fc链的N端，所述第二抗原结合功能区的C端连接于所述第二Fc链的N端；所述第一抗原结合功能区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述第二抗原结合功能区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述的Fc融合蛋白，其特征在于，编码所述第一抗原结合功能区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；
和/或，编码所述第二抗原结合功能区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。
3.一种编码如权利要求1或2所述的Fc融合蛋白的核苷酸。
4.一种包含如权利要求3所述的核苷酸的表达载体。
5.一种包含如权利要求3所述的核苷酸或如权利要求4所述的表达载体的宿主细胞。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为真核细胞。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为CHO细胞。
8.一种药物组合物，其包含如权利要求1或2所述的Fc融合蛋白、如权利要求3所述的核苷酸、如权利要求4所述的表达载体或者如权利要求5或6所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
9.一种如权利要求1或2所述的Fc融合蛋白或者如权利要求8所述的药物组合物在制备治疗与IgE受体和/或IL-5受体表达或者功能异常相关的疾病的药物中的应用；
所述与IgE受体和/或IL-5受体表达或者功能异常相关的疾病为中重度哮喘。
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Pledgor: Wuhan Jiuzhou Yumin Medical Technology Co.,Ltd.

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