CN108473551A - 高亲和力IgE受体的α链(FceRIa) - Google Patents

Abstract

公开了人高亲和力IgE受体的α链(FceRIa)，其中43位氨基酸赖氨酸(K43)交换为选自下组的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸和缬氨酸，优选丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或酪氨酸，特别是丙氨酸。

Description

高亲和力IgE受体的α链(FceRIa)

本发明涉及高亲和力IgE受体(FceRI)的α链的改良形式和使用这些改良形式的方法。

IgE介导的疾病

在工业化社会中，变态反应的患病率目前达到人口的30％。变态反应通常可以从温和的形式如变应性鼻结膜炎发展到严重病况，如对生活质量有严格限制的变应性支气管哮喘。因此，广泛的努力一直致力于开发靶向作为变应性免疫应答的关键介质的血浆IgE的新治疗策略。随着临床抗IgE试验出现在多种(变应性)疾病和合并症中，具有IgE依赖性特征的病况的数目正在增加(Holgate 2014)。最近，证据已经证明了IgE在炎症和变态反应相关疾病的扩展领域中也发挥作用，包括慢性荨麻疹、特应性皮炎、变应性胃肠病和各种其他(自身)免疫介导的病况。IgE的致病作用的进一步实例和轶事证据来自诸如例如肠易激综合征(Pearson等，2015)或特发性血管性水肿(Shroba等，2015)的病况。因此，IgE及其下游信号转导的核心作用已经公认是比最初设想更宽的疾病范围的最重要的靶向机会。

作为严重变应性病况的原型实例，变应性支气管哮喘(allergic asthmabronchiale)受先天免疫系统、T细胞、上皮细胞功能和导致产生IgE的B细胞免疫之间的复杂相互作用控制。自从20世纪60年代认为它是变态反应的关键介质(Bennich和Ishizaka，1968)以来，IgE在其临床和分子方面得到了广泛的研究。该分子的结构和生物化学特征已得到充分了解，并且其通过细胞受体，最值得注意地高亲和力IgE受体(FceRI)的生理作用模式已得到良好表征(Miller等1989；Wurzburg等2002；Sutton等2015)。IgE产生受IgE自身强烈调控(Dullaers等，2012)，提示IgE/FceRI途径是变态反应和IgE依赖性疾病中有吸引力的靶向机会。IgE的一个特殊特征是它对称为FceRI的高亲和性IgE受体，更具体地对α链(除非另有规定命名为FceRIa)具有非常高的亲和力。受体主要在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上表达，但也在抗原呈递细胞上表达。四聚体高亲和性IgE受体由一个α、一个β和两个γ链组成，并在由变应原或免疫复合物结合的IgE交联时介导胞内信号传导(Galli&Tsai2012)。因此，通过变应原的交联导致变态反应机制的激活，特别是由肥大细胞脱粒引起的组胺和细胞因子释放。

抗IgE疗法和限制

自从治疗性抗IgE单克隆抗体奥马珠单抗(Licari等，2015；Incorvaia等，2014)获得临床和市场成功以来，对负担得起的且广泛适用的抗IgE治疗剂的需求日益增加。改进的第二代治疗性抗体(例如单克隆抗体或活性抗IgE疫苗)目前处于临床前和临床开发和评估阶段。

的被动抗-IgE抗体治疗的主要缺点是成本高且剂量要求相对较高，前提是需要将多达数百毫克的重组抗体重复注射入患者中。出于多种原因，与高剂量的被动施用的重组生物制剂如存在一般风险：首先，重组分子含有潜在被患者免疫系统识别的外源序列。其次，聚集倾向必须始终与蛋白质的结构和质量相平衡，最后，特别地疗法目前仅限于不超过600IU/ml血浆IgE的严重肾上腺皮质激素抗性哮喘患者。除非响应者外，的最大允许剂量为每两周375mg，这可以造成严重的局限性。其他限制包括过敏风险和需要连续的、良好控制的治疗方案(参见Drugs.com http://www.drugs.com/dosage/xolair.html)。商品成本对更广泛使用造成严重限制，例如对于不太严重但最烦琐的变态反应表现。用于例如具有400-500IU/ml血浆IgE的70-80kg患者的典型治疗方案由每两周375mgs.c.的抗IgE剂量组成。由于给药和价格计算限制，该药不能被批准用于IgE水平非常高的患者，也不批准用于重和超重患者。限制使用的其他原因包括在某些病况如食物过敏中不利的风险收益比、缺乏疗效或患者依从性或者仅仅在哮喘患者亚组中的疗效缺乏。根据定义，被动施用的抗IgE抗体如需要固有高的给药以满足功效和药效学要求。重组抗体如的半衰期和药动学处于受限制的窗内，并且在不进行大量的开发工作的情况下不能容易地调整。预期给药方案的修改不会显著促进当前抗IgE疗法的剂量限制或降低财务负担(Lowe等2015)。

为了规避或缓解抗IgE mAB的局限性，已经提出了备选的组合IgE降低策略：体外预消减高IgE水平，然后进行被动IgE降低抗IgE治疗。

测试多克隆抗IgE抗体作为选择性单采血液成分术吸附剂的可能用途(Sato等1989)，在超过25年前提出了通过单采血液成分术降低IgE的原理。这些早期研究中的主要问题不仅包括从血浆中的IgE耗尽的低效力，而且还包括从吸附剂分子的性质预期的安全性问题，所述吸附剂分子是具有倾向于泄漏到患者的血液循环中的多克隆山羊抗IgE抗体。因此，这种非人吸附剂带有在可能的免疫复合物形成的情况下诱导针对外来表位的免疫应答的风险。类似地，Lebedin及同事使用单特异性兔多克隆抗IgE抗血清和单克隆抗体或其Fab片段作为吸附剂(Lebedin等，1991)。在大多数情况下，由于吸附剂不能充分固定到支持基质或由于蛋白水解切割，主要担心的是较低的血浆消减效力和吸附剂材料(即非人抗体物质)泄漏或脱落到血浆中。

最近，Kerzel及同事(Kerzel等，2011)提出，抗IgE疗法前特异性IgE清除允许疗法，即使在通常不会选择治疗的非常高的IgE患者中。作者应用临床设置，其中抗IgE疗法前的血浆去除术(plasmapheresis)可以补充常规抗IgE疗法，特别是当单独的不可行时(Kerzel等，2011；Kasperkiewicz等，2011)。该试点试验指示抗IgE治疗前IgE特异性消减可能对高IgE患者有益。Zink及同事显示了可能使用单采血液成分术和的组合在重度特应性皮炎患者中靶向IgE(Zink等2012[论文]和Zink等2015)。

在此种情况下，Lupinek及同事(Lupinek等，2009)提出缺乏FceRI交联活性的单链抗体吸附剂(称为scFv12)作为常规抗体的备选(Lupineket等，US2014/124448 A1)。Fresenius Medical care Deutschland GmbH(临床试验编号NCT02096237；ESPIRA研究；Derfler等，2015)最近的概念验证研究，题为“First in Man Trial of Study of Safetyand Efficacy of the New IgE Adsorber”，已经证明了scFv12可以成功地用作IgE单采血液成分术的吸附剂。产生称为(https://www.fresenius.com/5689_5968.htm)的商业吸附剂柱，并且基于单价高亲和力scFv12吸附剂。作者声称IgE降低86.2％、皮肤试验反应性降低和变应性患者中的变应性症状减少。这项特殊的研究未设计为IgE单采血液成分术和随后抗IgE治疗的联合治疗。重要的是，它可以验证在外来吸附剂蛋白可能泄漏到血液循环(诸如例如常见的抗IgE抗体)的情况下用不带有FceRI交联风险的第一种单价IgE吸附剂的IgE单采血液成分术的原理。与scFv12研究平行，类似于使用来自非人物种的多克隆抗体材料进行IgE吸附的早期试验性试验，使用基于绵羊抗人IgG抗体的吸附剂(由Miltenyi命名为Therasorb-IgE，产品编号330-000-571或330-000-572；Morren,ClinicalTrial NCT02365246)在15名特应性皮炎患者中发起临床IgE消减研究。同样，在这些情况下，使用外来的非人吸附剂抗体(来自绵羊)，提供诱导抗棉羊IgG反应性抗体的风险以及在吸附剂材料从柱中脱落进入患者的血液循环中时发生FceRI交联的一些风险。

完全建立的是非人蛋白如多克隆抗体由于血清病的诱导而不适合作为被动疫苗治疗剂应用。在此种情况下，必须强调的是，在用选择性吸附剂的治疗性单采血液成分术中，非人蛋白质诸如例如来自动物的多克隆抗体带有一些风险和缺点：首先，它们需要仔细的纯化和质量评估程序。其次，它们的亲和力一般低于筛选和合理优化的重组吸附剂蛋白的亲和力。第三，在单采血液成分术治疗期间，吸附剂必须不脱落入患者的血液循环中。最后，商品成本是单采血液成分术的实用性的决定性标准。迄今为止，现代的选择性吸附剂分子以负担得起的成本以足够的质量生产和纯化是先决条件。由于采用选择性吸附剂的免疫单采血液成分术或单采血液成分术通常在几个随后的单采血液成分术期间中进行，可回收或可重复使用的吸附剂柱相对于昂贵的一次性吸附剂装置是优选的。

不幸的是，这些特征中的一些不能从最近提出的基于单链抗体的吸附剂获得(Lupinek等2009；WO2012/140214 A1和Fresenius Medical Care https://www.fresenius.com/5689_5968.htm)：重要的是，不能重复使用和循环使用，因为它在低pH处理后不能有效再折叠(如本专利实施例部分的实施例8中证明(见下文))。此外，细菌产生的scFv构建体对人是先验免疫原性的，因为由于它们的序列材料的非人结构和起源而认为它们是“外来的”，所述序列材料在吸附剂脱落到血流中的情况下带有抗体诱导的风险。因此，已被开发为用于单采血液成分术的一次性产品，其在脱落到血流中时带有免疫原性的风险。scFv12并非意图作为被动治疗用途的单链IgE阻断剂，诸如例如

用于体外或体内应用的基于抗体的IgE结合剂的备选：

作为基于mAB或单链抗体的生物制剂的备选，先前已提出在疗法和诊断学中使用人高亲和力IgE受体的重组可溶性α链(命名为FceRIa)作为原型高度亲和力且特异性的IgE结合分子。作为关键特征，FceRIa不含任何潜在免疫原性(即非自身)序列材料。在自然界中，FceRI通常作为IgE的异四聚体受体存在于嗜碱性粒细胞和肥大细胞上。它是IgE的单价高亲和力受体，具有复杂的结构动力学，如文献中广泛描述(综述见Sutton等，2015)。自然地，FceRIα链作为延伸到胞外空间中的高亲和力IgE膜受体的一部分存在，具有对于正确折叠和与IgE的高亲和力结合必需的两个免疫球蛋白样域(Mallamaci等，1993)。强调的是，FceRI的这两个域对于FceRIa的正确折叠是需要的，并且蛋白质的折叠和糖基化是强力的“天然”候选IgE吸附剂或阻断分子的先决条件，尽管提出了人工措施，例如以产生和再折叠细菌产生的重组FceRI或产生具有经修饰的特征的截短的或突变的变体。最近，在人血浆中以游离形式或与IgE复合的形式找到天然形式的脱落sFceRI(称为sFceRI)。提出了sFceRI可能对IgE途径起调节作用，因为它阻止IgE与表面表达的受体结合，或者它可能与例如类似促成特异性配体阻断。。然而，从膜锚定的FceRI中脱落的天然sFceRI的确切生理学作用仍要限定(Platzer等2011)。

因此，不令人惊讶的是FceRIa不仅公认为候选IgE阻断剂或IgE吸附剂用于治疗用途。Digan等(WO1998/004718A1)先前提出了单体或二聚体FceRIa/HSA融合构建体，其可以在基于抗体的疗法(例如)的途径之前用作被动抗IgE疗法的可溶性IgE抑制剂。Digan等进一步提出了基于FceRI的体外诊断测定法(如ELISA)。基本上不追求基于FceRI的生物制剂的开发的一个主要原因是达不到(人源化)治疗性抗体的血浆半衰期的其药动学行为，尽管存在人工措施如将其与血清清蛋白融合(WO1998/004718A1)。由于其分子大小，当作为IgE阻断剂被动应用时，FceRIa的血浆半衰期比IgG短。因此，可能需要开发具有增加的大小或备选修饰的经修饰的基于FceRIa的构建体和配制剂以改善血浆半衰期。McKenzie等(美国专利US5,985,599A)也提出使用FceRIa或其片段作为吸附剂来除去“血浆去除术”(即体外IgE消减)中的免疫复合物或以游离形式作为用于预防IgE信号传导的单价IgE阻断剂。

Huber R等先前提出使用细菌产生的FceRIa用于诊断或治疗用途或用于吸附IgE(WO 2000/032767 A1)。提示FceRI及其变体用于治疗或诊断用途的其它现有技术出版物包括例如Gould等(WO 99/05271 A1)和Hogarth等(WO 96/08512A1，US8,729,247B2)。此外，其他国际专利申请诸如例如Siraganian等(WO 89/05352 A1)公开了编码IgE受体α亚基“或其IgE结合片段”的cDNA，并提出使用FceRIa亚基治疗变态反应或产生用于体外诊断的实体。后来，Robertson等(1993)提示了尽管与IgE有较弱的结合，但比含有这两个域的受体的可溶性片段以低得多的亲和力结合IgE的仅含有第二近膜域的截短受体片段可能在治疗上应用。此外，Yanagihara及同事在1994年提出假定下调IgE的合成的人FceRIa受体的重组可溶性片段。最近，Lingyun Jia等(CN102660569A)提示使用FceRIα链的单域变体。如在McKenzie申请中一样，这些作者(参见CN102660569A)再次提及使用FceRIa链的一个单域用于单采血液成分术的可能性。然而，基于详细的现有技术结构和功能研究，先前已经充分建立FceRIa需要两个免疫球蛋白域用于正确折叠和高亲和力结合IgE(Mallamaci等，1993；Garman等，1998；Sutton等，2015)。不清楚且未证明这些作者如何可以产生用于单采血液成分术的功能性、正确折叠的高亲和力FceRIa链。因此，认为此文件就这些单域FceRIa分子而言公开不充分。

基于此现有技术知识，明显的是基于FceRIa的生物制剂相对于抗体衍生的IgE结合剂的主要区别特征是下述实情：(1)它是不会被免疫系统识别为外来抗原性实体诸如scFv、纳米体或具有非人蛋白质序列材料的其它天然的AB样形式的天然“自身”分子，(2)其IgE结合行为将严格依赖于结构变化，诸如例如增加或减少IgE结合亲和力或影响正确折叠的突变和(3)FceRIa是缺乏交联活性的优异的高亲和力单价IgE结合剂。在本发明中证明，除了这些优点外，FceRIa在再折叠行为(实施例8(下文))中显示高度的稳健性，与单链吸附剂scFv12形成对比。因此，它在应用于单采血液成分术时是可重复使用的，因此将成本有效性与吸附蛋白质材料(即IgE)可以容易通过低pH处理解吸以用于分析和质量控制目的的优点相结合。这不能通过变性解吸后破坏的吸附剂来实现，如实施例7和8中所证明(参见下文，实施例部分)。除了其主要配体，即可溶性IgE之外，FceRIa蛋白的另一方面是慢性自身免疫性荨麻疹患者的血浆中的FceRIa自身抗体也结合FceRIa蛋白(Zubebier等，2000)，允许抗FceRIa自身抗体和IgE的联合体外消减。总之，FceRIa组合使其成为用于体外IgE和/或自身抗体消减目的或用于提供可以与生物制剂诸如类似施用的可溶性抗IgE治疗剂的优异单价IgE结合剂的特征。

如上文讨论，用于选择性IgE单采血液成分术的抗体相关吸附剂形式(如先前由Sato等1989，Lebedin等1991或Lupinek等2009提出)不会提供基于FceRIa的吸附剂的特征和优点。另一方面，用于被动IgE靶向的基于FceRIa的生物制剂的胃肠外施用治疗学开发在数年前中断，这不仅因为 获得成功，而且因为重组FceRIa的血清稳定性差(即使作为血清清蛋白融合蛋白)，如之前由Digan等(WO1998/004718A1)证明的。

WO 02/06298 A1公开了可溶性IgE受体α样分子。WO 96/08512 A1公开了具有改变的氨基酸序列的多肽。Ra等(J.Biol.Chem.264(1989):15323-15327)公开了针对IgE的小鼠肥大细胞受体(FceRI)的完整结构。WO 99/38974 A1涉及马FceRIa。WO 01/21816 A1公开了通过FceRIbeta链变体调节IgE受体细胞表面调节。Liu et al.(PNAS 85(15)(1988):5639-5643)报告cDNA异质性提示与高亲和性IgE受体有关的结构变体。

本发明的目的是提供用于预防和治疗IgE相关疾病的改进手段。

因此，本发明提供了高亲和力IgE受体的经修饰的α链(FceRIa)，特别是人FceRIa，其中43位氨基酸赖氨酸(K43)交换为选自下组的氨基酸：丙氨酸，丝氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，谷氨酸，苏氨酸，谷氨酰胺，色氨酸，甘氨酸和缬氨酸，优选丙氨酸，甘氨酸，丝氨酸或酪氨酸，特别是丙氨酸。

与现有技术相比，本发明提供的新FceRIa分子具有显著的优点：与现有形式的FceRIa相比，其具有显著更高的蛋白酶抗性。另一方面，它不引入新的免疫原性位点，但保留wt FceRI的吸附和再折叠以及IgE结合特征。这使得根据本发明的分子优于wt FceRIa、现有技术mAB或以基于scFv的抗体为基础的吸附剂，特别是当用于结合IgE时，例如在IgE单采血液成分术中。

本分子具有蛋白酶抗性，并且显示出令人惊讶的性能和作为吸附材料和装置可重复使用的能力，它们在与柱结合时可以容易且有效地再生，它们可以用作解吸物质的分析以用于临床监测，它们允许FceRIa与血浆(体外和体内使用FceRIa)的更长的接触，等等。

因此，本发明首次提供了FceRIa的蛋白酶抗性形式。本发明通过引入微妙且特异的突变实现这点，所述突变同时提供蛋白酶抗性和低免疫原性以及无功能丧失(＝IgE结合，pH抗性)，因为FceRIa的点突变可以在功能上修饰其结合特性(参见例如Mackay等2002和类似论文)。

这是特别令人惊讶的，因为在现有技术中未认识到FceRIa的K43位蛋白酶切割位点的问题。事实上，本发明提供的数据显示当与其他预测或经验确定的切割位点相比，新发现的蛋白酶切割位置K43是最相关的血浆蛋白酶切割位点(参见下面的实施例2)。

特别是对于IgE单采血液成分术，使用蛋白酶不稳定IgE捕捉分子(如天然FceRIa)是有问题的。因此，FceRIa是一种IgE捕捉分子，其由于分子被蛋白酶活性降解的风险，在单采血液成分术中使用是有问题的。此类降解不仅导致单采血液成分术装置对IgE的结合能力下降，而且也代表一个重要的安全问题，因为这些降解产物潜在污染单采血液成分术患者的血流。利用本发明，检测到FceRIa的新的蛋白酶切割位点(在43位处)。将此蛋白酶切割位点工程化改造以排除蛋白酶切割产生根据本发明的FceRIa的更稳定形式。作为提供用于IgE单采血液成分术的合适手段的问题的办法，本发明提供了改进的FceRIa变体，其组合两个基本特征：首先，必须最小化在FceRIa的N端部分内新识别的蛋白水解切割位点处的切割，同时不应改变FceRIa的结构以保留IgE结合、pH稳定性和再折叠特性，如以下实施例5、6和8中证明。为了赋予FceRIa以蛋白酶抗性，特别重要的是避免形成通常不存在于野生型FceRIa序列内的新表位。除了血液、血浆或血清中的蛋白酶抗性外，本发明的修饰必须保证最小的结构变化，以使从头免疫原性位点的风险最小化。因此，微妙的氨基酸变化相对于多种变化或含有非FceRIa序列的较大片段的嵌合FceRIa变体是优选的。同时，它应当保留与wt FceRI可以提供的相同的有利解吸和再折叠特征。这在下面的实施例5、6和8中得到证明。

本发明的基础是出乎意料的发现，即FceRIa优先在位于分子的N端部分的K43位(根据UniProt)处由血浆蛋白酶，特别是由纤溶酶切割。因此，本发明涉及新的FceRIa蛋白(或其IgE结合片段)，其具有偏离天然存在的序列并且与天然对应物相比具有增加的蛋白酶抗性的序列。

天然人FceRIa的氨基酸序列是

根据本发明的人FceRIa变体的氨基酸序列是

其中43位处的“X”可以是选自A,I,L,N,D,M,F,E,T,Q,W,G和V的任何氨基酸。优选的“X”是A，G，S和T；在“X”为A的情况下已经获得最有希望的结果。因此，就人FceRIa而言的此优选实施方案具有以下氨基酸序列：

值得注意的是，如实施例3中所证明，在K43处切割后IgE结合受损。该先前未知的特征严重限制了通常将重组FceRIa用于治疗目的的有用性，因为在使重组蛋白与血浆接触后IgE结合将减少，如实施例3中证明。在本发明的过程中，认识到由于本发明过程中找到的K43处的新的切割机制，FceRIa对于体外消减或体内IgE特异性抑制或消减(诸如例如)的实际应用是有限的。负责本发明提供的切割位点的相关蛋白酶明显不同于产生脱落的sFceRI的假定的(金属)蛋白酶，因为此种先前公开的“天然”片段必须在近膜区处切割以便保持其IgE结合能力(Platzer等2011)。重要的是，在本发明中发现重组FceRI在与人血浆接触后与血浆蛋白酶诸如纤溶酶和凝血酶缔合(如实施例1中所证实)并且K43处的FceRIa切割由血浆蛋白酶引起，特别是纤溶酶，如实施例2-5中证明。因此，如实施例3中证明，重组FceRIa无论何时与血液、血浆或血清接触都会丧失其IgE结合能力。

为了防止FceRIa在K43位处被血浆蛋白酶切割，本发明因此提供了新发明的FceRIa的蛋白酶抗性变体，其保持天然FceRIa的所有功能和实际特征。此种新的蛋白酶抗性FceRIa变体特别有利于体外消减IgE或抗FceRI自身抗体(例如通过治疗性单采血液成分术)或用于体内用途，诸如例如作为与 相似的可溶性IgE的IgE抑制剂。

因此，根据本发明的FceRIa优选具有根据SEQ ID No.1的氨基酸序列(人FceRIa)，其中43位氨基酸赖氨酸(K43)交换为选自下组的氨基酸(以变成SEQID No.2)：丙氨酸(即SEQ ID No.3)，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸和缬氨酸。

FceRIa链应当优选含有一个最微妙的序列修饰，其使蛋白质变得完全蛋白酶不敏感的，以允许反复或长期使用吸附剂(如实施例4中所证明)。在实施例部分中通过K43→A43变体(SEQ ID No.3)例示了这种最优选的FceRIa变体。然而，在K43位点的3个氨基酸的N端或2个氨基酸的C端内使用另外的或备选的修饰也是可能的，但不太优选。在围绕带正电荷的K43切割位点的共有纤溶酶底物位点内，也可以单独取代F42或与用除苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸外的任何其他氨基酸的其他取代组合以降低K43处纤溶酶敏感性。与其它取代组合或在其他取代外，也可以用带电荷的氨基酸或脯氨酸或半胱氨酸取代I41，这也会降低K43处的纤溶酶敏感性。基于先前的纤溶酶底物共有位点研究诸如例如Backes等2000和Hervio等2000的研究，与其它取代组合或在其它取代外，也可以将R40改变为除了精氨酸，苏氨酸，缬氨酸，甘氨酸，赖氨酸，苯丙氨酸和异亮氨酸之外的任何其它氨基酸，以降低K43处的纤溶酶敏感性。与其它取代组合或在其它取代外，也可以但不太优选将G44改变为除甘氨酸，精氨酸，赖氨酸或丝氨酸以外的任何其他氨基酸以降低纤溶酶底物识别。根据该区域的进化保守性(参见上面的zoo比对)和共有纤溶酶底物位点，如由Backes等2000,Yuan等2009或Hervio等2000提示，例如可以通过改变K43的N端或C端侧翼的一个或几个相邻的氨基酸来减少蛋白水解切割，如上所述。

尽管存在有关纤溶酶底物共有序列的知识，如Backes等2000,Hervio2000等或Yuan等2009提出，但重要的是注意到纤溶酶消化不仅取决于一级序列，而且很大程度上取决于底物的结构可及性，如本发明的实施例2中所证明的，显示虽然存在几个蛋白酶共有位点，但是特别地，K43位点比其他鉴定的位点更强地被切割(参见实施例2)。这显示并非所有潜在的切割位点同等可及。此外，底物识别还取决于翻译后修饰。

然而，与K43的邻近氨基酸的变化或组合变化相反，最优选的取代K43→A43是微妙的，同时提供了完全消化抑制的基本优点，如实施例4证明，同时保持FceRIa分子的所有期望的物理化学性质，如实施例5-7中证明。同时，此种取代将使对蛋白酶抗性FceRIa的免疫原性最小化。总之，优选尽可能“天然”地保留野生型FceRIa结构以不失去亲和力(即结合速率和解离速率)、pH稳定性和折叠性质。

总之，最优选的取代是微妙的K43→A43取代，其不引入FceRIa的抗原性或结构变化。

虽然本发明的数据显示K43切割位点是最重要的蛋白酶切割位点并且由于存在有公开或假定的其他蛋白酶切割位点，可以引入进一步的氨基酸交换，例如，以使FceRIa分子甚至对这些位点处的切割具有抗性或改善此种分子的其他性质。优选地，另外的氨基酸在选自以下的氨基酸处交换：31位赖氨酸(K31)，40位精氨酸(R40)，41位异亮氨酸(I41)，42位苯丙氨酸(F42)，44位甘氨酸(G44)，45位谷氨酸(E45)，142位赖氨酸(K142)，196位赖氨酸(K196)，199位精氨酸(R199)和201位赖氨酸(K201)，尤其选自下组：31位赖氨酸(K31)，40位精氨酸(R40)，142位赖氨酸(K142)，196位赖氨酸(K196)，199位精氨酸(R199)和201位赖氨酸(K201)(所有编号均指以上的SEQ ID No.1至3；它们对应于实施例部分中提到的UniProtSequence P12319)。当然，也可以引入其他修饰，已知其可以改善FceRIa的性质，但是保持根据本发明的蛋白酶抗性以及FceRIa的功能特性，特别是用于有效结合IgE并避免引入新的表位并且用于当通过变性回收单采血液成分术吸附剂时正确再折叠。

由于根据本发明的蛋白酶抗性FceRI变体优选用作单采血液成分术吸附手段，本发明的FceRIa变体的IgE结合片段也是有利的并且对本发明提供。还有，对于片段方面，本发明主要涉及人方面。因此，关于FceRIa作为全蛋白质的陈述，片段方面也特别涉及人FceRIa。

由于本片段的单采血液成分术使用是重要的，因此根据本发明的特别合适的片段必须含有免疫球蛋白结合域1(氨基酸30-110)和2(氨基酸111-193)。这两个免疫球蛋白结合域对于正确折叠是必需的，并且对于正确结合必须存在。当然，根据本发明的任何片段还必须在对应于SEQ ID NO:2或3中的43位的氨基酸位置处含有蛋白酶抗性变异。氨基酸51-93和132-176含有必需的二硫桥，并且对于正确折叠是相关的。最后，氨基酸位置46、67、75、99、160、165、191含有糖基化位点(GlcNAc)，因此对于正确折叠和稳定性也是相关的。

因此，也显示显著稳定性和天然折叠的本发明的优选片段包含SEQ ID NO:1的氨基酸26至205，优选氨基酸30至193。

分别在N端和C端上K43位置侧翼的多达8个氨基酸的区域内的序列相似性的保守显示此区域的结构和功能保守(参见下文用于来自选定物种的FceRIa N端序列的部分比对)。因此，优选使蛋白酶共有序列内的氨基酸取代，特别是围绕K43的N端和C端的多达4个氨基酸位置的氨基酸取代最小化，以便在该阶段时使蛋白酶易感性失活。然而，同时有必要通过结构变化或通过减少IgE结合行为来最小化形成新表位的风险。为了使此种风险最小化，优选用如在其他哺乳动物物种中发现的亲水/极性/碱性或酸性同源残基取代K43，诸如例如存在于豚鼠(E；谷氨酸)或小鼠和大鼠(T；苏氨酸)中。然而，用R(精氨酸)(诸如在一些非人灵长类动物或猪中发现)的最保守取代不会提供有效的蛋白酶抗性，因为已知精氨酸是纤溶酶共有物的一部分，如下面进一步评论的(参见例如Bakes等，2000)。

覆盖人FceRIa的K43位点(下划线)的N端FceRIa序列(当然，术语“K43”总是涉及其他非人物种中的相应位置)的物种比对：

图注(氨基酸特性的颜色编码)：

红色：小(小+疏水性(包括芳香族-Y))

蓝色：酸性

红紫色：碱性-H

绿色：羟基+硫氢基+胺+G

因此，本发明通常适用于除人之外的所有同源FceRIa物种，然而，如上文已经公开的，本发明的最优选实施方案是人FceRIa物种的K43变体。这通过下述事实进一步加强：为了避免对外来(即，非自身)治疗性蛋白质的免疫应答，现在现有技术在可能的情况下严格避免在治疗性蛋白质中使用来自其他物种的同源序列。因此，不期望在人中使用任何非人FceRIa链用于治疗目(即作为注射剂或作为血浆分离术吸附剂)，因为这将带有诱导ADA(＝抗药物抗体)的风险，诸如在例如早期代小鼠/人嵌合体治疗性抗体中看到。此外，由于不能预期对含有几个氨基酸取代的外来蛋白质诸如例如非人FceRIa序列的任何T细胞耐受性，来自非人起源的治疗性蛋白质在人中的治疗性使用带有经由T细胞表位诱导T细胞的风险。

通过交换FceRI序列中的K43来提供蛋白酶抗性FceRIa变体是设计FceRIa序列的全新方法。首先，同源物种无一含有在该区域中具有此类蛋白酶抗性交换的人序列；其次，先前对FceRIa序列的设计建议无一提供可防止蛋白酶切割的交换。这就是为何本FceRIa分子代表突破性创新并与现有技术中公开的所有FceRIa序列(如例如WO 02/06298 A1,WO96/08512 A1,Ra et al.(J.Biol.Chem.264(1989):15323-15327),WO 99/38974 A1,WO01/21816 A1,Liu et al.(PNAS 85(15)(1988):5639-5643中描述的FceRIa分子)显著不同。

根据本发明的FceRIa优选固定在固体表面上，以使得能够例如表面捕捉IgE。固体表面可以是能够固定多肽分子(例如微珠、微粒、滤器、玻璃、硅、金属、金属合金、Anopore，聚合物，尼龙或塑料)的任何表面。此类固体表面材料和用于将FceRIa结合到此类材料的方法对于本领域技术人员而言是完全可用的；可以根据本发明使用现有技术中用于天然FceRIa的所有材料和方法。

根据另一方面，本发明涉及用于预防和/或治疗IgE介导的疾病的根据本发明的FceRIa，其中所述FceRIa用于在单采血液成分术中从人体液，尤其是人血浆或血清中消减过多的IgE(抗IgE疗法)。

根据本发明的FceRIa可以用于对天然FceRIa建议和进行的任何医学/治疗/诊断用途，并且提供根据本发明的优点，即蛋白酶抗性和结构天然性，同时保留天然折叠和全部功能性。

因此，根据本发明的FceRIa可以用于制备药物，所述药物用于预防或治疗变应性疾病，优选季节性、食物、花粉、霉菌孢子、毒植物、药物/药品、昆虫毒液、蝎毒液、或蜘蛛毒液、胶乳或房尘螨变态反应、宠物变态反应、变应性鼻炎和结膜炎、变应性结膜炎、变应性支气管哮喘、非变应性哮喘、丘斯综合征、特应性皮炎、鼻息肉病、基穆拉病(Kimura’sdisease)、针对粘合剂、抗微生物剂、香料(fragrance)、染发剂、金属、橡胶组分、外用药物、松香、蜡、抛光剂(polishes)、粘固剂(cement)和皮革的接触性皮炎、慢性鼻窦炎、特应性湿疹、IgE相关自身免疫性疾病，优选慢性(特发性)和自身免疫性荨麻疹、胆碱能性荨麻疹、肥大细胞增多症，特别是皮肤肥大细胞增多症，变应性支气管肺曲霉病、慢性或复发性特发性血管性水肿、间质性膀胱炎、过敏反应，特别是特发性和运动诱发的过敏反应，免疫疗法、嗜曙红细胞相关疾病(eosinophil-associated disease)，优选嗜酸细胞性哮喘(eosinophilic asthma)，嗜酸细胞性胃肠炎(eosinophilic gastroenteritis)，嗜酸粒细胞性中耳炎(eosinophilic otitis media)和嗜酸粒细胞性食管炎(eosinophilicoesophagitis)；淋巴瘤、抗酸治疗的敏化副作用，优选所述抗酸治疗用于胃或十二指肠溃疡或返流。

根据本发明，将有效量的根据本发明的FceRIa施用于有此需要的患者(例如作为可注射、口服或其它胃肠外递送的治疗剂施用)，特别是人患者(无论如何，其位于本治疗用途的中心)。

根据本发明的FceRIa的优点使其特别适用于单采血液成分术技术以降低IgE相关疾病患者的血液中的IgE含量。因此，FceRIa优选偶联于适合于与人个体的血流接触的固体载体。

因此，本发明的另一方面涉及包含能够与血液或血浆流接触的固体载体的单采血液成分术装置，其特征在于固体载体包含本发明的FceRIa。

由于单采血液成分术装置的适当使用也可能需要可通过pH激发(shock)进行的再循环(解吸)，优选的吸附剂应当是pH抗性的，即FceRIa分子应当正确重折叠以使其亲和力和特异性不受阻碍。

根据本发明的FceRIa可以有效地固定在单采血液成分术基质支持物(即固体载体)上，优选通过共价、导向/定向固定(特别是通过分子上一种限定的反应基团，诸如例如半胱氨酸的硫醇基、赖氨酸的伯胺、人工引入的醛等。对于蛋白质上侧基的官能化，参见例如van Vught等2014的综述，其中列出了对任何重组蛋白质的一般应用。在固定过程中，还清楚的是必须注意在可能的程度上防止固定的蛋白质的负面功能性结果。例如，清楚的是在此类固定的过程中充分保护功能相关的半胱氨酸或赖氨酸。

在此固体表面上进行含有要从具有IgE相关疾病的患者的血液中除去的IgE的(体外)血液或血浆流，以通过将IgE与根据本发明的单采血液成分术装置的固体表面上的根据本发明的FceRIa变体分子结合来特异性除去IgE。

根据本发明的装置优选含有无菌且无热原的柱作为载体。

根据本发明，单采血液成分术或血浆单采血液成分术定义为医学技术，其中使患者的血液通过装置，所述装置将一种特定成分分开并将剩余部分返回至循环。根据本发明，采用单采血液成分术来通过使用本发明中提供的FceRIa分子从血浆中分离出IgE分子。根据本发明，单采血液成分术装置包含可以与血液接触或与血浆通量接触并且具有根据本发明的FceRIa变体作为结合IgE的受体的固体柱。无菌且无热原的柱优选用作单采血液成分术载体。本文中，“柱”定义为具有可以与蛋白质化学偶联的基质材料的任何形状的模块。

优选地，固体载体的基质材料是基于碳水化合物的材料，例如Sepharose^TM、葡聚糖、琼脂糖或纤维素。其他合适的基质材料包括可高压灭菌的基质，诸如珠、纤维和膜或由玻璃或合成聚合物如聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯和聚酰胺组成的膜。在使用珠的情况下，只要单采血液成分术的液相可以循环，珠的直径不受限制。然而，为了降低流动阻力，优选使用直径为50-3000μm，尤其是200-3000μm的那些珠。根据US 5,817,528 A或熟练技术人员已知的任何其他技术，通过用无菌溶液进行预漂洗并在低温下进行额外的蒸汽处理来灭菌基质材料。然后如US 5,817,528A或本领域技术人员已知的任何其他技术中所述，通过与溴化氰溶液一起温育来活化无菌且无热原的基质材料。连续地通过温育将期望的抗原结合分子偶联到柱。或者，也可以通过根据US 5,817,528 A或本领域技术人员已知的任何其他技术将抗原结合分子与1,1’-羰二咪唑一起温育同时实现活化和偶联。一旦完成偶联程序，将偶联有抗体的基质材料彻底清洗并测试氰酸酯、无菌性和致热原性。待固定在柱中的吸附剂分子的量和柱的大小不受限制。还测试偶联的基质材料的总结合蛋白和偶联蛋白的结合活性。然后在无菌条件下将偶联的基质材料填充到无菌的去热源的硅烷化玻璃壳体中以形成无菌且无热原的蛋白质偶联柱。可以通过适当选择回路的管的内径或通过使用辅助泵(US4,770,774A)来控制通过单采血液成分术装置的流速。本发明的柱可以重复使用，并且在使用后通过洗脱吸附的IgE再循环。

如果合适的话，根据本发明的单采血液成分术装置可以包含其他IgE结合分子(如抗体、天然FceRIa或其他已知的IgE结合分子)；然而，由于本FceRIa分子的蛋白酶抗性特征，最优选使用这些分子作为唯一种类的分子(或者与其他蛋白酶抗性IgE结合分子(如果可用的话)一起)。

本发明还涉及根据本发明的单采血液成分术装置用于提供预防和/或治疗装置的用途，所述预防和/或治疗装置用于预防和/或治疗IgE相关疾病，特别是用于进行抗IgE治疗。

根据另一方面，本发明涉及用于预防和/或治疗IgE相关疾病的试剂盒，其包含含有根据本发明的FceRIa的固体单采血浆成分术载体，其中所述载体是无菌且无热原的柱。

试剂盒可以进一步包括对患者的连接和输送手段，用于接收来自患者的血液并将血液带回患者(具有降低量的IgE)，泵送手段，用于在具有根据本发明的FceRI变体的固体表面上泵送血液或血浆，以及合适的控制装置，用于在患者治疗之前、期间和之后(例如此后也在再生单采血液成分术柱的过程中)控制血液或血浆流以及单采血液成分术性能(吸附等)。

本发明还涉及根据本发明的FceRIa，用于治疗方法，尤其用于预防或治疗IgE相关疾病，和/或用于制备用于预防或治疗IgE相关疾病的药物。

本主题特别适合于与其他IgE降低疗法组合，例如上文“抗IgE疗法和限制”下列出的抗IgE疗法，尤其是例如由Kerzel等，2011公开的联合疗法，其将抗IgE抗体(诸如)与血浆去除术一起应用。

虽然本FceRIa变体用于IgE单采血液成分术的用途是一个特别优选的实施方案，但根据本发明的FceRIa分子可以用于现有技术中对天然FceRIa或包含天然FceRIa的组合物建议和进行的任何(治疗或诊断)目的。例如，根据本发明的FceRIa可以用作施用的生物治疗剂(例如通过注射、口服递送或用于递送生物治疗剂的任何其它胃肠外路径，如i.v.、i.m.、s.c.、泵、透皮、吸入，等等)。因此，本发明还涉及包含根据本发明的FceRIa和药学可接受载体的药物组合物。

优选地，根据本发明的药物组合物还包含增加根据本发明的FceRIa变体在施用组合物的患者中的半衰期的试剂。此类半衰期增加剂的实例是本领域技术人员已知的；实例是人血清清蛋白(HSA)或引入PEG基团(“PEG化”)。

根据另一方面，本发明涉及根据本发明的FceRIa作为用于含有蛋白酶的样品，特别是血浆样品或含有IgE和膜IgE的组织和细胞中IgE检测的可循环探针的用途。当必须连续测量而非平行测量样品时，例如在典型的Biacore设置中，可以例如通过变性/复性再循环根据本发明的蛋白酶抗性FceRIa变体。对于单采血液成分术，变性后的重要性或重复使用性在此类探针用途中也是相关的。根据本发明的探针不受样品中的蛋白酶或不受遵循包括变性/复性的再循环步骤损害。一旦捕获并测量IgE，IgE可以通过变性释放而不损害根据本发明的FceRIa。在复性后(与例如scFv12形成对比没有丧失功能性)，可以进行下一次测量，如以下实施例证明(参见例如图7A)。

本蛋白酶抗性FceRIa作为用于检测IgE(优选来自血浆和所有其他含蛋白酶的样品)的探针的应用可以应用于任何基于捕捉/检测的方法。因此，特别优选在ELISA(酶联免疫吸附测定法)或SPR(表面等离子体共振；Biacore)测定法中使用本探针。

本蛋白酶抗性FceRIa作为分子成像示踪剂与荧光团组合的应用代表本发明的优选用途，所述荧光团允许体内检测含有IgE或膜IgE的组织或体液和隔室用于诊断或生物标志物分析的目的。经标记的FceRIa代表适用于光学体内成像的相对小的示踪剂孔。一般而言，较小的示踪剂为分子成像提供优势，例如Oliveira 2015详细综述。

此外，本蛋白酶抗性FceRIa可以作为现代治疗剂的更复杂的(多)功能构建体的一部分提供，例如作为双功能mAB或一些其他现有技术生物制剂的一部分，所述生物制剂由于它们的模块系统而组合几种功能性：因此，根据本发明的蛋白酶抗性FceRIa也可以用作用于体内或体外治疗和诊断或成像目的的缀合物或多功能构建体的一部分。作为重组融合蛋白，它可以是双功能或多功能蛋白的一部分，其中根据常规技术，功能域可以通过惰性柔性或刚性肽接头彼此遗传融合，如Chen等2013综述的。此类接头和附着的域将对稳定性、溶解性、表达产率、生物活性、抗原性和药动学具有影响。此类接头也可以设计成使得它们在体内可切割以实现受控激活或递送至靶细胞或组织，例如，用于局部激活治疗功能或用于提供原位特定的标记物激活，诸如体内成像需要。

可以与FceRIa组合的功能域的原型实例是人血清清蛋白。这是最初由Digan等(专利WO 1998/004718 A1)提出的。作为优选的备选方案，转铁蛋白或Fc域也可用于调节生物制剂的药效学行为。根据常规技术，FceRIa可以与其他功能性蛋白质或肽实体，诸如例如细胞因子(通常称为“免疫细胞因子”，如Bootz&Neri2015中所述)或由Spiess等2015广泛综述的工程化抗体、抗体片段或抗体样结构以遗传或化学方式连接或异源二聚化。用于设计双特异性或多特异性治疗剂的新型形式包括(作为抗体/抗体片段或抗体样结构的实例)纳米体、(串联)scFv、(四价双特异性串联)IgG、双重靶向域、BiTE、Triomab、DART、DVD-Ig、IgG-fynomers等。目前在临床评估中常用形式的广泛综述由Spiess等2015提供。基于它们的技术灵活性，此类形式可以用作与FceRIa的融合蛋白，以便提供新的治疗功能并将其与FceRIa组合。因此，根据本发明的FceRIa可以偶联于(下组功能性分子中每种的一种或多种)：

-接头分子，优选肽接头，尤其是由1至10个，优选2至5个氨基酸残基组成的肽接头；和/或

-治疗或诊断分子，优选单克隆抗体或抗体片段、细胞因子、抗体样结构、细胞毒剂，优选毒素或细胞毒性药物、光学示踪剂；和/或

-载体，优选载体蛋白，特别是人血清清蛋白、转铁蛋白或Fc域。

根据此方面的优选实施方案，根据本发明的蛋白酶抗性FceRIa可以以与用于靶向IgE B细胞受体表达细胞如IgE转换B细胞的抗体药物缀合物(ADC)治疗剂类似的方式使用。这将杀死或阻止这些细胞或提供最终导致IgE降低的抑制性信号传导。如Peters&Brown2015综述，ADC通常用作抗癌药物用于将功能活性剂，特别是细胞毒剂递送至特定的靶细胞。因此，根据本发明的FceRI与至少一种细胞毒剂化学偶联或遗传连接。该偶联的分子然后适合于例如靶向IgE B细胞受体表达细胞，从而基于杀死或抑制表达IgE B细胞受体的细胞将最终减少患者中产生IgE的浆细胞的数目和由此可溶性IgE水平的事实，实现IgE降低，诸如治疗如上文提及的变态反应或其他IgE相关疾病需要的。或者，类似于抗体药物缀合物方法，FceRIa药物缀合物也可以靶向任何其他表达IgE B细胞受体的细胞例如罕见的癌症形式。根据本发明的FceRIa和此类其他(功能性)分子的组合可以优选视为包含用于将细胞毒剂特异性靶向到IgE B细胞受体表达性细胞的根据本发明的FceRIa的ADC样实体(如由Peters&Brown，2015定义)。

以上问题和方面也适用于根据本发明的FceRI片段。因此，本发明还涉及根据本发明的FceRIa片段，其中FceRIa片段偶联于适于与人个体的血流接触的固体载体。

本发明的片段优选在单采血液成分术装置中应用。本发明因此还涉及包含能够与血液或血浆流接触的固体载体的单采血液成分术装置，其特征在于固体载体包含根据本发明的FceRIa片段。因此，本发明还涉及根据本发明的含有此类FceRIa片段的装置用于提供预防和/或治疗装置的用途，所述预防和/或治疗装置用于预防和/或治疗IgE相关疾病，特别是用于进行抗IgE疗法。本发明还涉及用于预防和/或治疗IgE相关疾病的试剂盒，其包含含有根据本发明的FceRIa片段的固体单采血液成分术载体，其中所述载体是无菌且无热原的柱。

图1显示了通过FceRIa对纤溶酶的共沉淀。

图2显示了重组FceRIa与合并的人血清(A)和纤溶酶(B)的温育/消化。

图3显示当将野生型或蛋白酶抗性A43-FceRIa吸附剂与纤溶酶一起温育时以不同程度减少IgE消减。

图4描绘了基本峰色谱图，显示重组A43-FceRIa的突变体，蛋白酶抗性变体中的切割产物的完全缺乏(黑线)，而野生型受体消化峰出现在30分钟时(灰线)。

图5显示计算的EC50值(对于FceRIa、A43-FceRIa和ScFv12分别为24.5ng/ml、34,4ng/ml和428ng/ml)，并且IgE与A43-FceRIa结合的曲线形状与wt-FceRIa或scFv12相似，证明了在FceRIa序列的43位K→A变化的无负面影响。

图6显示通过pH 3.4处理(在将FceRIa和scFv12对珠上的相等固定，然后体外IgE吸附后)，IgE几乎可以完全从FceRIa解吸附，而IgE不从ScFv12释放。

图7显示在有或无血清的情况下的再生性能；与没有血清再生的条件(图7B)相比，通过血清再生的情况下IgE结合能力的中度降低(图7A)反映血清环境对蛋白酶抗性FceRI吸附剂的稳定/复性效应。

实施例

本发明提供了改进的FceRIa变体，其组合两个基本特征：首先，排除在FceRIa的N端部分内新识别的蛋白水解切割位点处的切割，同时不改变FceRIa的结构以保留IgE结合、pH稳定性和再折叠特性(如实施例5、6和8中证明)。为了赋予FceRIa以蛋白酶抗性，特别重要的是避免形成通常不存在于野生型FceRIa序列内的新表位。除了血液、血浆或血清中的蛋白酶抗性外，本发明的修饰必须保证无结构变化或仅最小的结构变化，以使从头免疫原性位点的风险最小化。同时，它应当保留与wt FceRI可以提供的相同的有利解吸和再折叠特征(如实施例5、6和8中证明)。

在实施例1中发现了FceRI和血浆蛋白酶之间的物理缔和。在实施例2中证明和解释了FceRIa的N端部分中血浆蛋白酶敏感性位点的鉴定。实施例3显示重组FceRIa的蛋白水解切割导致减少对IgE抑制(例如当用作治疗性IgE阻断剂时)或体外IgE除去(例如当用作选择性IgE吸附剂时)有害的IgE结合。在该实施例中，显示切割的FceRI吸附剂遭受吸附功效的损失，这由先前的功能/结构研究证实，显示了FceRIa的N端域含有有效IgE结合所需要的部分(Mallamaci等，1993)。基于新的蛋白酶敏感性位点(命名为K43)的本发现及其对IgE结合的功能相关性的评估，本发明提供了技术方案，其使得FceRIa吸附剂蛋白酶变得对K43处的蛋白酶消化有抗性，允许与血液、血浆或血清的持续接触，如实施例4和5中证明。实施例5和6证明了当与现有技术scFv12(Lupinek等2009和US2014/124448A1)相比时，蛋白酶抗性FceRIa具有相当的IgE结合和吸附质量。然而，与scFv12相反，蛋白酶抗性FceRIa吸附剂显示比scFv12显著更高的pH稳定性，从而当例如在单采血液成分术中使用时允许解吸/复性和再循环。实施例7和8显示现有技术的单链抗体吸附剂scFv12由于其在低pH下的破坏而不能在IgE解吸后再循环。然而，为了允许多次使用一个柱以节省成本，重要的是提供允许解吸(例如通过低pH)和再生而不会不可逆地破坏或变性吸附剂分子的单采血液成分术柱，如实施例8中证明。最终，本发明的蛋白酶抗性FceRIa吸附剂还能够通过治疗性单采血液成分术消减抗FceRI自身抗体。此类自身抗体可以在诸如例如慢性自身免疫性荨麻疹的病况中找到(Zuberbier等，2000)。此特征不是由基于抗IgE抗体或抗体衍生物，诸如例如ScFv或Fab的IgE吸附剂提供的。最重要的是，本发明提供了不改变分子的IgE结合和再折叠的FceRIa序列的微妙修饰。通过一个单一的小且不带电荷的氨基酸可以用于完全消除蛋白酶切割的事实使对免疫系统呈现“非自身”、新的抗原性结构的风险最小化。因此，本蛋白酶抗性FceRIa不仅可以用于体外治疗性处理，诸如例如选择性IgE单采血液成分术或自身抗体消减，而且还作为产生施用(例如通过胃肠外、口服或其它常用施用途径)的治疗剂以被动施用到血流中的基础。

总之，本发明涉及FceRIa链的人工修饰，所述人工修饰使其对血浆蛋白酶的消化有抗性，同时保持其功能性和pH稳定性并且同时使“外来”氨基酸取代诱导的免疫原性风险最小化，所述氨基酸取代携带修饰天然FceRIa结构的风险。因此，新的蛋白酶抗性FceRIa变体提供了在需要IgE结合的治疗性应用中使用FceRIa链的优点。

实施例1：FceRIa与血浆蛋白酶的结合。

重组FceRIa与几种血浆蛋白质共沉淀，所述血浆蛋白质包括血清蛋白酶如纤溶酶原或凝血酶原。此种关联使得FceRIa在与血液、血浆或血清接触期间被这些蛋白酶切割成为可能。表1.1列出了在用人血清温育的重组FceRIa的共沉淀物中鉴定的蛋白质，如下文在材料和方法下解释的。

表1

因此，至少两种相关的蛋白酶，即纤溶酶原/纤溶酶和凝血酶原/凝血酶在与人血清温育时与重组FceRIa缔和。这提供了当施用到血液中或作为单采血液成分术中的吸附剂应用时FceRIa蛋白的不期望的蛋白水解切割和降解的可能性。实施例2和3的结果证明FceRIa被蛋白水解切割，这确实对IgE结合有害。

图1显示在10μg/ml温育时通过FceRIa对纤溶酶(Sigma P1867)的共沉淀提供了吸附剂与血浆蛋白酶的直接物理相互作用的证据，如用血清温育鉴定(参见表1)。通过Western印迹分析解析共沉淀的纤溶酶；泳道如下加载：M，蛋白质标志物；泳道P，纤溶酶；泳道1，FceRIa(珠上50μg)+1μg纤溶酶；泳道2，FceRIa+100ng纤溶酶；泳道3，HSA+1μg纤溶酶；泳道4，HSA+100ng纤溶酶。与来自血清共沉淀实验的结果一致，与用HSA包被的对照珠(泳道3和4)相反，当使用重组FceRIa包被的珠时(泳道1)，共沉淀的纤溶酶可以以25kD条带揭示。FceRIa和纤溶酶之间的体外缔和证实了来自血清共沉淀的结果，如表1所示(上文)。

材料和方法：

重组FceRIa的表达和纯化：

将HEK293freestyle细胞(Invitrogen R790-07)在适当的培养基(Invitrogen12338-026)中在125ml和250ml烧瓶中在37℃旋转(180rpm)下培养。通过每第二天以1:3至1:5分开维持细胞，允许最大细胞密度2x10E6个细胞/ml。为了转染，在用30μg质粒DNA、30μl MAXreagent(Invitrogen 16447-100)和1ml Optimem(Invitrogen 31983-062)在30ml培养基的体积中处理前24小时以5x10E5个细胞/ml分开细胞。将重组真核FceRIa克隆到真核表达载体pTT5(NRC National Research Council Canada)的EcoRI和BamHI之间。该构建体由以下构成：源自Genbank Seq BAA75054.1的信号肽，随后是涵盖FceRIa的胞外区的从氨基酸20开始(根据UniProt序列P12319在本文献中的所有编号)直到氨基酸205，接着是间隔物和6His，用于标准Ni-NTA纯化。预清洗后，将1ml Ni2+NTA琼脂糖珠(Qiagen30210)和2-5ml预浓缩细胞培养上清液施加到2ml Talon重力柱(Takara635696)上并用6xHIS清洗缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，5mM咪唑，pH8)清洗几次。在非变性条件下(根据制造商方案Qiagen 30210)，用6xHIS洗脱缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，150mM咪唑，pH 8)进行洗脱。使用AMICON-ULTRA-15-离心滤器(10K)(Millipore；目录号：UFC801024)将洗脱液浓缩至100-200μl，用6ml PBS清洗3次并再次浓缩至100-150μl并用于免疫沉淀。

在将重组FceRIa与人血清一起温育后检测共沉淀的血浆蛋白酶。

在以900rpm振荡的情况下将经吸附剂包被的珠(Bioclone FG-102)与50μl 17种人血清的混合物或50μl经IgE消减的血清混合物或50μl PBS在27℃温育21小时。温育后，将珠用PBS/0.1％BSA/0.5％Tween清洗3次，并用PBS清洗3次。

将含有固定的蛋白质的珠与含有15mM DTT(Roth，#6908.3)的碳酸氢铵缓冲液(ABC缓冲液；Acros organics目录号1066-33-7)混合，并在56℃温育45分钟以还原二硫键。加入100mM ABC中的碘乙酰胺(Sigma#I1149-5G)并将混合物在黑暗中温育30分钟以进行半胱氨酸的氨基甲酰甲基化(carbamidomethylation)。用100mM ABC缓冲液清洗珠两次，并用5μg胰蛋白酶(Promega#90058)温育过夜。使用0.1％甲酸作为水性溶剂将经消化的样品加载到BioBasic C18柱(BioBasic-18,150x0.32mm,5μm,Thermo Scientific)上。在35分钟中应用从5％B(溶剂A：水中的0.1％FA，ACCN中的0.1％FA)到35％B的梯度，接着是促进大肽洗脱的从32％B到75％B的15分钟梯度，流速为6μL/min。用配备有正离子的标准ESI源，DDA模式(＝切换至MSMS模式以洗脱峰)的QTOF MS(Bruker maXis 4G ETD)进行检测。记录MS扫描(范围：150-2200Da)，并且选择6个最高峰用于碎裂。使用ESI校准混合物(Agilent)进行仪器校准。将数据文件转换(使用Data Analysis，Bruker)为mgf文件，其适合于用GPM进行MS/MS离子搜索。GPM是一种基于网络的开源用户界面，用于分析和显示蛋白质鉴定数据(http://human.thegpm.org)。该界面创建了一系列已分配给蛋白质序列的串联质谱术数据的Web浏览器页面视图。在鉴定的蛋白质中，鉴定出与胰蛋白酶具有相同的理论切割位点的两种蛋白酶(即凝血酶原和纤溶酶原)(参见Perkins等，1999)。由于胰蛋白酶消化可以已经干扰鉴定蛋白酶切割位点的方法，进行备选消化(GluC，Roche，#1104781700)以释放肽。表1分别显示鉴定的蛋白质与它们的MASCOT得分http://www.matrixscience.com/help/scoring_help.html)。MASCOT得分越高，检测到的蛋白质与理论蛋白质谱的一致性越好。针对PBS样品对得分排序(MASCOT得分3)。(有关MS方法的更多详细参考文献，参见Botelho等2010)。

纤溶酶的共沉淀：

将经FceRI包被的珠(Bioclone FG-102)与50μl人血清混合物(与实施例1中一样)一起或在50μl PBS中在37℃在以900rpm振荡的情况下温育21小时，然后用PBS清洗4次。与实施例1中一样进行还原、S-烷基化、GluC消化和质谱分析的方案。将重组FceRIa蛋白以1mg蛋白质/ml珠与1μm BcMag碘乙酰基活化的磁珠(Bioclone FG-102)根据制造商的方案偶联。用8mg/ml半胱氨酸封闭后，用PBS+0.5％Tween将珠清洗3次。将1x纤溶酶消化缓冲液(0.1M Tris-HCl，2mM EDTA，pH8)加到珠，然后在指定的纤溶酶浓度下于37℃温育1小时。对于蛋白质印迹分析，将珠用PBS清洗3次并用PBS+0.1％Tween清洗3次，之后加入LDS缓冲液(Invitrogen目录号NP0007)和样品还原剂(Invitrogen目录号NP0009)。在95℃变性10分钟后，将样品加载到NuPAGE Novex 4-12％BisTris凝胶(Invitrogen NP0322BOX)上并运行2h/70V。使用QUICK-TRANSFER SYSTEM(Biorad，设置：标准，混合MW，1,3A，25V，7min)将凝胶印迹到膜上并用在PBS-T(1xPBS，0.1％Tween20)中1％脱脂乳封闭2h，RT。通过在4℃温育膜过夜(ON)用PBS-T中1:5000小鼠抗纤溶酶原(R&D System，MAB1939)进行纤溶酶的检测。用PBS-T清洗30分钟后，在TBS-T中加入1:10000稀释的抗小鼠HRPO(Jackson，目录号115-035-068)2小时，然后在TBS-T中最后清洗并通过Clarity Western ECL Substrate(BioRad170-5060)检测。将膜暴露于检测屏(UVP BioImaging Systems，AutoChemi System)1-10分钟。

实施例2：通过血浆蛋白酶切割FceRIa。

FceRIa(基于UniProt序列P12319编号)在与血清和纤溶酶温育后受到切割。当将重组FceRIa与来自具有各种炎性病况的患者的合并的人血清温育时，而非当与PBS温育时观察到蛋白酶敏感性。鉴定出K43处的强烈消化峰(图2A)。纤溶酶温育(表2.1和表2.2)提供了纤溶酶为优先的候选血浆蛋白酶以及当与鉴定的其他切割位点相比时鉴定的K43为FceRIa序列的最敏感的蛋白酶切割位点的证据。

重组wt wtFceRIa的位点K43(在图2B中标示为肽K)优先受到切割，而当在37℃与纤溶酶一起温育1小时时，纤溶酶切割位点K31、R40、K201、R199、K196和K142(在图2B中标示为肽1-8)以较小的程度受到切割，如图2B所示。因此，K43定义为FceRIa的最重要的血浆蛋白酶超敏感性位点，如表2.1和表2.2所总结。重要的是，先前显示了N端的区域(含有蛋白酶敏感性K43位点)对于FceRIa的正确IgE结合是相关的，如例如由Mallamaci等1993描述，他们在其研究中使用各种缺失和嵌合受体变体来提供FceRIa的结构/功能见解。图2A显示重组FceRIa的血清温育与未处理的FceRIa(黑线)相比产生消化产物(灰色线)，如基本峰色谱图中显示(x-轴＝时间；y-轴＝峰强度)。因此，仅在存在人血清而非PBS的情况下发生FceRIa的消化。图2B证明了此种血清蛋白酶活性至少部分是由纤溶酶促成的，因为用12.5μg/ml纤溶酶处理重组FceRIa后，可以显示出乎意料地，K43切割相关的“肽K”(如图2B中所示)比其他残基(诸如例如肽1-8)对蛋白酶切割更敏感，这是因为它在基本峰色谱图中提供了更高的峰信号。尽管根据现有技术知识(参见例如Backes等2000，Yuan等2009或Hervio等2000)，其他8个鉴定的纤溶酶切割位点一致地携带纤溶酶底物识别共有序列，但是在纤溶酶消化后当与“肽K”比较时它们以显著更小的程度释放。因此，不能预测应当修饰9个鉴定的纤溶酶切割位点中的哪个以使FceRIa变得血清蛋白酶和/或纤溶酶抗性。同时修饰几个纤溶酶切割位点将是可能的，但不是期望的，因为具有多个突变的FceRIa变体将影响受体的结构和功能。

为了改善FceRIa血浆或血清蛋白酶的稳定性，因此有必要引入氨基酸变化，所述变化显著减少蛋白酶如纤溶酶的底物位点识别，与先前鉴定的纤溶酶底物特异性一致，如Yuan等2009或由Backes等2000描述。然而，如实施例2所述，在本发明中鉴定的最敏感和相关的切割位点，即K43处降低蛋白酶的底物位点特异性是最重要的。也可以但不太优选单独或组合取代鉴定的不太敏感的纤溶酶切割位点，包括K31、R40、K142和K196、R199和K201。通常将43位赖氨酸(即K43)改变为任何其他氨基酸(除了属于纤溶酶底物位点识别基序的精氨酸和组氨酸外)可以阻断K43处的纤溶酶切割易感性，因为已知纤溶酶切割需要带正电荷的氨基酸。然而，由于在纤溶酶切割位点处带正电的氨基酸的任何取代增加扰乱FceRI折叠或IgE亲和力的风险，最优选引入不会影响FceRIa功能和可循环性的修饰。可以同时突变一个底物识别序列的几个残基；然而，优选使可能带来不期望的新表位的风险的先验结构变化或可以无意引入的结构变化最小化。也不期望引入会允许不期望的O-连接或N-连接的寡糖添加的外来氨基酸。

因此，选择最优选的丙氨酸(A43)取代以使不期望的免疫原性的风险最小化。为了将A43突变的蛋白酶抗性FceRIa(命名为A43-FceRIa)就其蛋白质结构和物理化学性质而言维持得尽可能“天然”，选择A43作为最优选的取代，赋予FceRIa血浆/血清蛋白酶抗性，如实施例2中证明。这是因为丙氨酸取代不会引入可能提供不期望的免疫原性、固定困难或IgE结合变化的出乎意料的结构变化。作为负面的实例，半胱氨酸可能引起出乎意料的分子间或分子内二硫桥，而脯氨酸可能由于此区域中柔性的扭结形成而引起结构伪像。例如，精氨酸取代将提供至少部分消化，因为它对应于纤溶酶或其他蛋白酶的底物识别位点(参见例如Backes等2000)。实施例8证明了通过低pH解吸后正确再折叠的必要性和重要性。

纤溶酶切割位点不仅取决于切割位置处赖氨酸或精氨酸(与上文描述的物种比较一致)或偶尔地组氨酸的存在，而且还取决于先前由Backes等2000和Yuan等2009探索的底物识别序列。举例而言，在-3位处的Lys、在-1位处的酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸富集(其一致地根据上面的同源性比对发现)与纤溶酶切割位点位置处必需的带正电荷的氨基酸组合可以构成用于底物识别的共有物，只要该位点在结构上是蛋白酶可接近的。Yuan等2009年进一步提出，在纤溶酶切割位点的-3位氨基酸的69％是非极性的(Backes等提出在这些位置处赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸)，在-2位处的氨基酸的85％是极性的，而-1位处的氨基酸的81％是非极性的。另外，Hervio等2000提示缬氨酸可能在-2位处富集，而丝氨酸在+1位处富集，这提示了在FceRIa的K43切割共有物内此类替代不会是有利的。蛋白质结构、切割位点可及性和附近的翻译后修饰如糖基化对于蛋白酶切割的易感性起着重要作用。这可以解释为何根据本发明，K43是最敏感的纤溶酶切割位点，如表2.2中证明。

根据实施例3的结果，与上面列出的几个其他不太相关的纤溶酶切割位点相反，已证明K43是实际上最相关的纤溶酶切割位点。因此，本发明的主要要求是使K43切割位点变得蛋白酶不敏感。同时，必须在不降低FceRIa的结构和功能质量的情况下维持FceRIa的结构和功能。当使用蛋白酶抗性FceRIa以通过治疗性单采血液成分术进行体外IgE消减或被动施用到血流中时，重要的是避免(新)抗原性位点或减少IgE结合的功能改变。

表2.1：在与来自其他肽的峰面积相比时用12.5μg/ml纤溶酶的重组FceRIa的体外消化产生更高的肽K峰面积，如第4行指示。证明赖氨酸K43切割比如描绘的其它残基对蛋白酶切割更敏感，所述赖氨酸K43切割在与人血浆温育后鉴定，如图2A中显示。

表2.2：分别将8种不同肽的峰面积比较并表示为肽K和肽1、2、3等之间的比率。尽管过量的蛋白酶浓度(第1行)在所有组合之间表现出相似的比率，但较低的蛋白酶浓度(第4行)在不同切割位点之间提供了显著的比率差异，从而证实K43位点在较低浓度下优先切割。与血清蛋白酶切割一致，K43比其他鉴定的切割位点对纤溶酶切割更敏感，证实了图2A的出乎意料的发现。因此，期望提供FceRIa的蛋白酶抗性变体以实现用于FceRIa的治疗性使用的更高的蛋白酶稳定性。

材料与方法：

将经FceRI包被的珠(Bioclone FG-102)与50μl人血清混合物(与实施例1中一样)一起或在50μl PBS中在37℃在以900rpm振荡的情况下温育21小时，然后用PBS清洗4次。如实施例1中一样进行还原、S-烷基化、GluC消化和质谱分析方案。

体外纤溶酶消化。

通过在37℃与50mM NH4Ac缓冲液约pH8中0.125单位PNG酶F(Roche#06538355103)温育过夜将重组FceRIa蛋白去糖基化。通过用纤溶酶反应缓冲液(0.1M Tris-HCl，2mMEDTA，pH8)稀释使蛋白质溶液达到1μg/μL的终浓度。将反应混合物在37℃在四种不同纤溶酶浓度(1.25-9μg)下温育1小时。通过在99℃热灭活5分钟终止消化。如实施例1中一样进行BioBasic C18柱上的样品加载和质谱分析。

实施例3：降低的IgE与经蛋白酶消化的FceRIa的结合。

在珠固定的吸附剂蛋白的纤溶酶消化后FceRIa和蛋白酶抗性A43-FceRIa的IgE结合能力(以％表示；参见图3)。当与蛋白酶抗性A43-FceRIa相比时，纤溶酶暴露后FceRIa的IgE结合能力显著降低，从而显示wt构建体的增加的敏感性。

图3显示当将野生型或蛋白酶抗性A43-FceRIa吸附剂与纤溶酶温育时，IgE消减以不同程度减少(分别为黑线和亮线)。在与最高浓度的纤溶酶温育后，wt吸附剂的IgE消减能力降低至23％(对应于最初的50ng IgE的12ng)，而可以将蛋白酶抗性变体A43-FceRIa的消减能力维持于约60％。x轴指示用于消化固定的吸附剂的纤溶酶的量(以μg计)，而y轴表示相对的IgE消减能力。总之，野生型FceRIa吸附剂的纤溶酶消化以剂量依赖性方式降低其IgE消减能力，从而强调保护吸附剂分子免受蛋白水解降解和IgE结合能力的重要性。

材料与方法：

将重组野生型FceRIa和A43-FceRIa蛋白质以1-2mg蛋白质/ml珠与1mgBcMag碘乙酰基活化的磁珠(Bioclone FG-102)根据制造商的方案偶联。用8mg/ml半胱氨酸封闭后，用PBS+0.5％Tween(PBS-T)将珠清洗3次。将相同量(18μg)的FceRIa偶联珠在1x纤溶酶消化缓冲液(0.1M Tris-HCl，2mM EDTA，pH8)中与9μg/3μg/1μg和无纤溶酶(Sigma P1867)在室温/900rpm下温育1小时。用PBS-T清洗3次后，将用5μg/ml IgE掺杂的PBS-T中的20％人血清溶液与包被的珠一起温育1h/RT/900rpm。分别在珠温育之前和之后通过ELISA测量IgE主混合物的IgE含量，以测定吸附剂的IgE消减效率。相对消减能力从ELISA EC50和用经纤溶酶处理的吸附剂消减后保留在上清液中的推断的IgE量计算。

IgE结合测定法：

通过ELISA测量IgE结合，期间将50μl的2μg/ml BSW17小鼠抗人IgE抗体(NBS-C0910-1-100)包被到Maxisorp ELISA板上，随后封闭(用1xPBS/1％BSA封闭缓冲液)和在“珠温育IgE样品之前和之后”在RT温育1小时。对于IgE检测，随后在室温下温育1μg/ml抗IgE-HRPO mAB(Novus Biologicals NBP1-74934)1小时，随后是标准ABTS(Merck 8.22287.100)反应(在OD 405处测量)。基于非线性回归曲线拟合模型计算EC50。

实施例4：产生蛋白酶抗性FceRIa变体。

为了防止纤溶酶对突出的蛋白酶敏感性K43位点的切割，基于关于如上文实施例2中讨论的纤溶酶的蛋白质底物特异性的知识，有必要在氨基酸位置43处将带正电荷的切割位点交换成的小的不带电荷的位点，诸如例如丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或酪氨酸。相反，不期望由带电荷的、芳香族、脂肪族氨基酸或由半胱氨酸交换K43位置，因为这些氨基酸可能提供不期望的蛋白质折叠伪像(例如通过不可预测的二硫键)或者因为它们由于它们一般倾向于参与表位而可能提供不期望的新表位。例如，已知脯氨酸或甘氨酸可能由于在表位区域中形成弯曲或柔性而经常参与如先前由Singh等2013确定的核心表位结构。此类新表位可能在单采血液成分术治疗期间脱落吸附剂蛋白后变得与生物体有关，导致诱导针对吸附剂蛋白存在的人工新表位的不期望的抗体。为了保证蛋白质折叠和抗原性的最小结构变化，同时使不正确折叠的可能性和不期望的新表位出现最小化，因此有必要最优先通过丙氨酸或备选通过另一种小氨基酸如丝氨酸或酪氨酸或可能但不太优选通过甘氨酸诱变K43位点。作为最优选的范例，在实施例2中呈现了K43→A43突变，证明此取代同时提供了蛋白酶抗性，同时由于FceRIa的最小结构变化而保留IgE吸附的全部功能性。与不同位点处的许多其他突变(参见例如Mackay等2002)相反，本发明的最优选的K43→A43修饰将不改变FceRIa的功能特性，只是它使蛋白质变得有血浆蛋白酶抗性。此外，如实施例2和4所示，此类取代不会影响由哺乳动物表达系统得到的重组FceRIa的沉淀倾向。K43→A43突变提供针对K43处蛋白酶切割的保护，同时在变性/再循环后维持IgE结合和正确再折叠，如实施例5-7中证明。可能但不期望且不必要取代或缺失周围的氨基酸(即K43的N端或C端的多达4个氨基酸位置)，以使此位点处的结构变化和抗原性的风险最小化。

为了证明实用性，构建了A43-FceRIa吸附剂变体，其不能被纤溶酶在K43位处切割。蛋白酶抗性吸附剂提供增加的稳定性、更长的持续性组合在单采血液成分术期间吸附剂片段对血浆的不期望脱落的降低风险或当作为施用的生物治疗剂应用时降低的降解倾向。同时，如实施例6所示，改进的吸附剂A43-FceRIa保留其对IgE的高亲和力。

图4描绘了基本峰色谱图，显示在变体，重组A43-FceRIa的突变体中的切割产物的完全缺乏(黑线)，而野生型受体消化峰出现在30分钟时(灰线)。

材料与方法：

如实施例2中所述，在蛋白酶抗性A43-FceRIa与纤溶酶温育后通过质谱法进行分析。

实施例5：A43-FceRIa不改变FceRIa的性质并维持其相对于scFv12的优点(ELISA)。

当通过捕捉ELISA比较IgE结合时，在与野生型FceRIa或现有技术的单链抗体scFv12(WO2012/140214A1)相比时蛋白酶抗性A43-FceRIa吸附剂对IgE具有类似的亲和力、亲合力和特异性。用捕捉抗体包被板，在封闭源自经ScFv12和FceRIa转染的细胞的HEK细胞纯化的重组蛋白后，将经包被的蛋白质在室温温育1小时。1μg/ml IgE(NBS-C0911-0-100)，捕捉1h/RT，并使用1μg/ml抗IgE-HRPO mAB(Novus Biologicals NBP1-74934)在RT下检测IgE结合1小时。图5显示计算的EC50值(对于FceRIa、A43-FceRIa和ScFv12分别为24.5ng/ml、34,4ng/ml和428ng/ml)，并且IgE与A43-FceRIa结合的曲线形状与wt-FceRIa或scFv12相似，证明在FceRIa序列的43位处K→A变化无负面影响。

实施例6：A43-FceRIa、FceRIa和scFv12对可溶性IgE的相似亲和力。

IgE/FceRIa和IgE/ScFv12相互作用的亲和力和动力学。这两种重组FceRIa变体(即wt和A43突变体)的KD和结合/解离动力学是高度相当的(KD约4x10e-10)，参见实施例6，表3，指示在43位AA交换不影响IgE结合能力或质量。在表3中，对于3种构建体中的每种构建体列出了结合速率和解离速率以及计算的KD。ScFv12结合动力学不同于FceRIa结合动力学。

表3

对于FceRIa变体，在与scFv12(ka约4x10e5)相比时结合速率更快(ka值约1x10e6)。同时，在与scFv12(kd约1.6x10e-4)相比时FceRIa变体的解离速率更快(kd值约5x10e-4)。另一方面，在与scFv12相比时FceRI的IgE结合的解离速率增加。原则上，这可以对期望更快的IgE对柱的吸附的治疗性单采血液成分术背景具有影响。值得注意的是，较快的解吸速率对于吸附剂再循环(如实施例7中证明)、临床单采血液成分术中的流速以及吸附剂分子在单采血液成分术柱的固体支持物基质上所需要的包被密度具有重要的实际意义。或者，例如在施用A43-FceRI作为IgE阻断的生物治疗剂时，它可以具有重大影响。

材料与方法：

在HBS-EP(0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％(v/v)表面活性剂P20(pH7.4)(GE Healthcare Cat.Nr.BR-1001-88)中稀释至2μg/ml的生物素化的抗Tag-mAB(Abcam ab10241)的200μl注射后，通过三次注射20μl的50mM NaOH制备链霉抗生物素蛋白(SA)传感器芯片(GE Healthcare Biacore,Cat.Nr.BR-1000-32)的表面，产生约2500RU的固定水平以在流动池4上捕捉。通过1mM D-生物素(Sigma#47868)的两次连续100μl注射使游离的SA结合位点饱和。流动池3用游离的D-生物素饱和，并且充当参考池。获得100RU IgE结合的最大响应所需要的FceRIa变体和ScFv12的捕捉水平分别计算为75RU和80RU。因此，将FceRIa、A43-FceRIa和scFv12在HBS-EP中稀释并且注射到流动池3和4(30μl/min)直至达到90RU的固定水平。在在注射运行缓冲液的情况下的10分钟稳定时间后，分别获得75和80RU的最终捕捉水平。最后，分别以30μl/min的流速以3分钟的IgE结合相评估FceRIa、A43-FceRIa和scFv12与以2倍递增浓度(起始浓度，0.5nM；最大浓度，64nM)于HBS-EP运行缓冲液中稀释的IgE(NBS-C0911-0-100)的单独相互作用。通过以30μl/min的流速注射HBS-EP达30分钟来研究解离阶段。通过同时注射15μl 10mM甘氨酸-HCl pH1.8再生传感器芯片表面。用BIAevaluation 4.1(GE Healthcare Biacore)使用1:1相互作用模型计算解离常数(KD-Value)、结合速率(ka)和解离速率(kd)。所有测量均在Biacore 2000装置上于25℃进行。

实施例7：FceRIa对低pH处理有抗性，从而允许在临床IgE单采血液成分术中吸附/解吸的再循环和质量监测。

在将FceRIa和scFv12相等固定到珠上，然后进行体外IgE吸附后，通过pH3.4处理，IgE几乎可以从FceRIa完全解吸，而IgE不从ScFv12释放，如图6所示。图6的y轴显示在洗脱之前和之后在珠上测量的IgE信号(分别为黑和亮柱形)。x轴分别指示所用的固定的吸附剂。在与scFv12相比时，此结果与更短的FceRIa解离速率一致，如实施例6中显示。由于低pH可破坏scFv12(如实施例8中显示)，因此推断scFv12不适于在低pH条件下的IgE解吸，这与制造商的下述记录一致：基于scFv12的单采血液成分术柱仅设计用于一次性使用(https://www.fresenius.com/5689_5968.htm)。基于FceRI的吸附剂相对于基于单链的吸附剂的此种出乎意料的优点代表了回收和再利用昂贵的单采血液成分术柱的重要实践方面。此外，每次单采血液成分术循环后精确定量解吸的IgE或自身抗体物质而不破坏吸附剂可以为监测治疗效力提供极其重要的临床读出。根据本发明，基于FceRI的吸附剂，但不是pH敏感的基于scFv的吸附剂有利于该方面。

材料和方法：

将重组FceRIa和ScFv12蛋白以1mg蛋白质/ml珠与1μm BcMag碘乙酰基活化的磁(Bioclone FG-102)根据制造商的方案偶联。通过使用1μg/ml小鼠抗FceRI抗体(AcrisSM2251PS)和50μl 0.4μg/ml山羊小鼠IgG HRPO进行检测的珠ELISA来评估蛋白质对珠上的相等加载。用8mg/ml半胱氨酸封闭后，用PBS+0.5％Tween将珠清洗3次。将用5μg/ml IgE掺杂的PBS-T中的20％人血清溶液与包被的珠温育1小时/室温/900rpm。用300μl PBS-T清洗珠3次，并且用100mM甘氨酸缓冲液，pH3.4洗脱IgE并用0.5M Tris，pH8中和。进行珠ELISA以检测洗脱之前和之后珠上的IgE量。对于珠ELISA，用PBS-T清洗珠3次并用封闭缓冲液(PBS-1％BSA)封闭1h/RT/900rpm。将50μl的1μg/ml IgE(NBS-C0911-0-100)加入珠并温育1h/RT/900rpm。用PBS-0.5％Tween将珠清洗3次，并与1μg/ml抗IgE-HRPO mAB(Novus BiologicalsNBP1-74934)一起温育，随后在405nm下进行标准ABTS(Merck 8.22287.100)反应检测。

实施例8：IgE吸附剂的低pH处理和用或不用血清的再生。

为了监测单采血液成分术中的吸附效力，不仅有必要测量血浆参数，而且还有必要提供有关吸附物质的定量信息。优选提供用于临床实践的吸附剂，其不需要为分析目的而破坏。FceRIa满足这些标准并且允许IgE或可能的自身抗体(例如在慢性自身免疫性荨麻疹中发现)的解吸，以监测临床实践中的吸附效力。因此，有必要提供也不应太强而不能在单采血液成分术循环之间应用实用的变性条件的吸附剂。这仅可以在吸附剂具有下述能力时才能实现：在严格条件诸如例如低pH值处理下解吸后复性而不丧失其结合能力。同时，此类吸附剂柱的使用者必须确保在再循环后捕获材料已经以何种程度释放，以便允许定量例如用于临床目的和效力评估的捕获IgE或自身抗体材料。为了测试野生型和蛋白酶抗性FceRIa吸附剂相对于现有技术scFv12吸附剂的复性能力，在几个变性/复性循环后直接比较这些吸附剂的IgE结合能力。如图7A中所示，重复注射100mM甘氨酸pH 1.8中等降低这两种FceRIa吸附剂的IgE结合能力，而ScFv12的IgE结合能力显著降低至<15％。此外，该实验证实提供蛋白酶抗性的修饰不对基于FceRIa的吸附剂赋予pH敏感性或IgE结合能力的任何缺点。图7B显示在Biacore芯片上(无血清注射)，在较温和的酸性条件(pH3)下IgE结合的相对丧失，证实了在生理条件下变性/复性条件对于维持吸附剂在几个循环内的能力的重要性。如图7B所示，与没有血清再生的条件相比，通过在图7A中IgE结合能力的中度降低(在血清再生的情况下)反映血清环境对蛋白酶抗性FceRI吸附剂的稳定/复性效应。与实施例7的结果一致，在IgE的pH3或pH1.8解吸后，这些条件都不能再生现有技术的scFv12吸附剂。由于其稳定性改善，提出A43-FceRIa作为野生型FceRIa或scFv12的可循环备选。本发明提供了改进的商品成本并促进了每次单采血液成分术循环之后吸附效力的监测。更一般地，当意图作为用于注射使用的生物治疗剂(组合)时，A43-FceRIa还提供改善的血液、血浆或血清蛋白酶稳定性。

材料与方法：

使用Biacore在使用或不使用血清注射的情况下用pH3重复再生后IgE结合能力的 相对丧失。

根据制造商的说明书(购自GE-Healthcare BR-1005-57的硫醇偶联试剂盒)进行硫醇配体偶联。简言之，通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的1:1混合物的35μl注射，随后溶于50mM硼酸钠缓冲液pH8.5的80mM 2-(2-吡啶基二硫代)乙烷胺盐酸盐(PDEA)的35μl注射活化CM5传感器芯片(GE HealthcareBiacore，BR1000-12)的单独流动池的表面。以10μg/ml的浓度将溶于50mM乙酸钠pH 4.5中的配体注射至约1200RU的水平。通过50mM L-半胱氨酸的35μl注射使芯片表面饱和，导致约1000RU的最终固定水平。固定的配体的顺序：Fc1：K43del-FceRIa(即阴性对照，具有从氨基酸1-37的缺失)；Fc2：(野生型)FceRIa；Fc3：(蛋白酶抗性)A43-FceRIa；Fc4：scFv12(即现有技术的单价IgE吸附剂)。使用HBS-EP作为运行缓冲液以5μl/分钟的流速进行完整的固定程序。固定后，在IgE结合后使用100mM甘氨酸pH3的重复注射来评估IgE与配体的结合能力的稳定性。因此，如图7所示，在100mM甘氨酸pH3的20μl注射(＝循环1)后，注射IgE(10μg/ml)直至达到Fc2、3和4上的饱和水平。然后再次注射600μl IgE(10μg/ml)和2x5μl的100mM甘氨酸pH3(＝循环2)。第三次IgE/再生循环包括200μl IgE(10μg/ml)和5μl 100mM甘氨酸pH3(＝循环3)，而第四次IgE/再生循环包含100μl IgE(10μg/ml)和5μl 100mM甘氨酸pH3。评估每个循环的最大IgE结合能力。将每个配体/流动池的最大IgE结合能力的参考扣除的RU(Fc2-1、3-1、4-1)在每个流动池上用100mM甘氨酸pH3的第一次再生之前相对于饱和水平标准化，并以百分比在图7A/7B中指示。如实施例6中一样使用流速和缓冲液。

在血清的情况下用pH3重复再生后IgE结合能力的相对丧失。

如上文对非血清条件所述进行芯片固定。固定后，注射600μl IgE(10μg/ml)，然后注射50μl来自健康供体的纯人血清，并使用10μl 100mM甘氨酸pH 1.8进行再生。再进行分别用600μl IgE(10μl/mg)和10μl 100mM甘氨酸pH1.8的两次连续的IgE/再生注射循环，并评估最大IgE结合能力。将每种配体/流动池的最大IgE结合能力在每个流动池上用100mM甘氨酸pH1.8首次再生之前相对于饱和水平标准化，并以百分数表示。使用HBS-EP作为运行和稀释缓冲液，以30μl/分钟的流速进行固定后的所有注射。

实施例9：使用重组FceRIa体内应用IgE单采血液成分术。

为了证明重组FceRIa作为选择性IgE吸附剂对体外IgE消减的有用性，通过长期植入的导管将80μg人IgE(NBS-C0911-0-100)注射到6只Wistar大鼠的血流中。在此种用于治疗性单采血液成分术的临床前模型中，将4只动物与具有偶联有FceRI的CIM Monolith柱(BIA Separations#34003)的单采血液成分术装置连接，并且将2只对照大鼠与具有模拟(空)柱的单采血液成分术装置连接。表4指示了单采血液成分术持续时间、流速和过滤的血浆体积。

表4

使用此体内设置(如先前例如由Wallukat等2012所述)，可以洗脱6至21μg的IgE(在从单采血液成分术柱扣除“模拟大鼠”洗脱液的背景信号之后)，如最后一列中指示。总之，这首次证明FceRIa可以用于在体内单采血液成分术模型中从外周血液中的体外IgE消减。除了用作可注射治疗剂的先前实例之外，这支持了FceRIa在治疗用途中的有用性。

材料与方法：

将体重约250g的Wistar大鼠适应一周。在单采血液成分术时期开始前一周长期植入动脉和静脉导管。使用的柱是CIM Monolith柱(BIA Separations 313.7175)，其根据制造商的方案与FceRIa偶联。为了封闭，使用在0.5M磷酸钠缓冲液pH8.0中的100mM半胱氨酸。最后，将3.5mg蛋白偶联至1ml柱(根据BIA Separations方案)。如所示，2只动物构成用模拟柱处理的对照组，而4只动物用于“处理组”(FceRIa柱)中。从植入导管开始和单采血液成分术后每周2-3x常规测量体重。如实施例3中所述，通过ELISA测量血浆中的IgE浓度。在观察后，将动物麻醉(Sevorane)并通过心脏穿刺取血浆并且冷冻以进行进一步分析。单采血液成分术设置：在IgE应用前5分钟，从大鼠中取血清。在零时间点，对每只动物应用80μg人IgE(NBS-C0911-0-100)。IgE应用后15分钟/20分钟/25分钟，取血液样品进行血浆IgE测定。IgE注射后30分钟，将动物与单采血液成分术柱连接并根据流速进行单采血液成分术达60-75分钟。在程序期间在单采血液成分术开始后30分钟以及单采血液成分术后的几个时间点时采集血液样品。

本发明的优选实施方案是：

1.高亲和力IgE受体的α链(FceRIa)，特别是人FceRIa，其中43位氨基酸赖氨酸(K43)交换为选自下组的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸和缬氨酸，优选丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或酪氨酸，特别是丙氨酸。

2.根据实施方案1的FceRIa，其具有根据SEQ ID No.1的氨基酸序列，其中43位氨基酸赖氨酸(K43)交换为选自下组的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸和缬氨酸，优选丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或酪氨酸，特别是丙氨酸。

3.根据实施方案1或2的FceRIa，其中进一步的氨基酸是交换的，优选选自以下的氨基酸：31位赖氨酸(K31)、40位精氨酸(R40)、41位异亮氨酸(I41)、42位苯丙氨酸(F42)、44位甘氨酸(G44)、45位谷氨酸(E45)、142位赖氨酸(K142)、196位赖氨酸(K196)、199位精氨酸(R199)和201位赖氨酸(K201)，尤其选自下组：31位赖氨酸(K31)、40位精氨酸(R40)、142位赖氨酸(K142)、196位赖氨酸(K196)、199位精氨酸(R199)和第201位赖氨酸(K201)。

4.根据实施方案1至3中任一项的FceRIa，其中所述FceRIa固定在固体表面上。

5.包含通过两个二硫桥连接的α链、β链和两条γ链的FceRI，其中所述α链是根据实施方案1至4中任一项的经修饰的α链。

6.根据实施方案1至4中任一项的FceRIa，用于预防和/或治疗IgE介导的疾病，其中所述FceRIa用于在单采血液成分术中从人体液，特别是人血浆或血清中消减过量的IgE(抗IgE疗法)。

7.根据实施方案6使用的FceRIa，其中所述IgE介导的疾病选自下组：变应性疾病，优选季节性、食物、花粉、霉菌孢子、毒植物、药物/药品、昆虫毒液、蝎毒液、或蜘蛛毒液、胶乳或房尘螨变态反应、宠物变态反应、变应性鼻炎和结膜炎、变应性结膜炎、变应性支气管哮喘、非变应性哮喘、丘斯综合征、特应性皮炎、鼻息肉病、基穆拉病(Kimura’s disease)、针对粘合剂、抗微生物剂、香料(fragrance)、染发剂、金属、橡胶组分、外用药物、松香、蜡、抛光剂(polishes)、粘固剂(cement)和皮革的接触性皮炎、慢性鼻窦炎、特应性湿疹、IgE相关自身免疫性疾病，优选慢性(特发性)和自身免疫性荨麻疹、胆碱能性荨麻疹、肥大细胞增多症，特别是皮肤肥大细胞增多症，变应性支气管肺曲霉病、慢性或复发性特发性血管性水肿、间质性膀胱炎、过敏反应，特别是特发性和运动诱发的过敏反应，免疫疗法、嗜曙红细胞相关疾病，优选嗜酸细胞性哮喘，嗜酸细胞性胃肠炎，嗜酸粒细胞性中耳炎和嗜酸粒细胞性食管炎；淋巴瘤、抗酸治疗的敏化副作用，优选所述抗酸治疗用于胃或十二指肠溃疡或返流。

8.根据实施方案6或7使用的FceRIa，其中所述FceRIa偶联于适于与人个体的血流接触的固体载体。

9.单采血液成分术装置，其包含能够与血液或血浆流接触的固体载体，所述单采血液成分术装置的特征在于所述固体载体包含根据实施方案1至4中任一项的FceRIa。

10.根据实施方案9的装置，其特征在于所述载体为无菌且无热原的柱。

11.根据实施方案9或10的装置，其特征在于其进一步包含IgE结合分子。

12.根据实施方案9-11中任一项的装置用于提供预防和/或治疗装置的用途，所述预防和/或治疗装置用于预防和/或治疗IgE相关疾病，特别是用于进行抗IgE疗法。

13.用于预防和/或治疗IgE相关疾病的试剂盒，其包含含有根据实施方案1至4中任一项的FceRIa的固体单采血液成分术载体，其中所述载体为无菌且无热原的柱。

14.根据实施方案1至4中任一项的FceRIa，其用于治疗方法中，特别用于预防或治疗IgE相关疾病。

15.根据实施方案14使用的FceRIa，用作可注射生物治疗剂。

16.根据实施方案14或15使用的FceRIa，其与进一步的IgE降低疗法组合使用。

17.药物组合物，其包含根据实施方案1至4中任一项的FceRIa和药学可接受载体。

18.根据实施方案17的药物组合物，其进一步包含延长接受组合物施用的患者中的半衰期的药剂。

19.根据实施方案18的药物组合物，其中所述延长半衰期的试剂是人血清清蛋白(HSA)或化学修饰，诸如PEG化。

20.根据实施方案1至4中任一项的FceRIa作为可循环探针用于含有蛋白酶的样品，尤其是血浆样品中的IgE检测的用途。

21.根据实施方案20的用途，其中在ELISA或SPR测定法中使用所述探针。

22.根据实施方案1至4中任一项的FceRIa，其偶联于：

-接头分子，优选肽接头，尤其是由1至10个，优选2至5个氨基酸残基组成的肽接头；和/或

-治疗或诊断分子，优选单克隆抗体或抗体片段、细胞因子、抗体样结构、细胞毒剂或抑制剂、光学示踪剂；和/或

-载体，优选载体蛋白，特别是人血清清蛋白、转铁蛋白或Fc域。

23.根据实施方案22的FceRIa，其中所述FceRIa偶联于细胞毒剂。

24.根据实施方案22或23的FceRIa，用于治疗变态反应或其它IgE介导的疾病，其中使用FceRIa将细胞毒剂或抑制剂递送到IgE B细胞受体表达细胞以防止这些细胞分化为IgE生成性浆细胞。

25.根据实施方案22至24中任一项的FceRIa，用于治疗选自下组的疾病：变应性疾病，优选季节性、食物、花粉、霉菌孢子、毒植物、药物/药品、昆虫毒液、蝎毒液、或蜘蛛毒液、胶乳或房尘螨变态反应、宠物变态反应、变应性鼻炎和结膜炎、变应性结膜炎、变应性支气管哮喘、非变应性哮喘、丘斯综合征、特应性皮炎、鼻息肉病、基穆拉病、针对粘合剂、抗微生物剂、香料、染发剂、金属、橡胶组分、外用药物、松香、蜡、抛光剂、粘固剂和皮革的接触性皮炎、慢性鼻窦炎、特应性湿疹、IgE相关自身免疫性疾病，优选慢性(特发性)和自身免疫性荨麻疹、胆碱能性荨麻疹、肥大细胞增多症，特别是皮肤肥大细胞增多症，变应性支气管肺曲霉病、慢性或复发性特发性血管性水肿、间质性膀胱炎、过敏反应，特别是特发性和运动诱发的过敏反应，免疫疗法、嗜曙红细胞相关疾病，优选嗜酸细胞性哮喘、嗜酸细胞性胃肠炎、嗜酸粒细胞性中耳炎和嗜酸粒细胞性食管炎；淋巴瘤、抗酸治疗的敏化副作用，优选所述抗酸治疗用于胃或十二指肠溃疡或返流。

26.根据实施方案1至25中任一项的FceRI的片段，其至少包含SEQ ID NO:2或3的IgE结合区和蛋白酶抗性区。

27.根据实施方案26的片段，其包含SEQ ID NO:2或3的氨基酸26至205，优选氨基酸30至193。

28.根据实施方案26或27的FceRIa片段，其中所述FceRIa片段偶联于适于与人个体的血流接触的固体载体。

29.单采血液成分术装置，其包含能够与血液或血浆流接触的固体载体,所述单采血液成分术装置的特征在于所述固体载体包含实施方案26或27的FceRIa片段。

30.根据实施方案29的装置用于提供预防和/或治疗装置的用途，所述预防和/或治疗装置用于预防和/或治疗IgE相关疾病，特别是用于进行抗IgE疗法。

31.用于预防和/或治疗IgE相关疾病的试剂盒，其包含含有根据实施方案26或27的FceRIa片段的固体单采血液成分术载体，其中所述载体为无菌且无热原的柱。

参考文献:

Backes et al.；Synthesis of positional-scanning libraries offluorogenic peptide substrates to define the extended substrate specificityof plasmin and thrombin.Nat Biotechnol.2000Feb；18(2):187-93.Erratum in:NatBiotechnol 2000May；18(5):559.PubMed PMID:10657126

Bennich&Ishizaka et al.；Immunoglobulin E.A new class of humanimmunoglobulin.Immunochemistry.1968Jul；5(4):327-8.PubMed PMID:4103909

Bootz F,Neri D.Immunocytokines:a novel class of products for thetreatment of chronic inflammation and autoimmune conditions.Drug DiscovToday.2015Oct 23.Review.PMID:26526566

Botelho et al.；Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containingsolutions following mass-based separation.J Proteome Res.2010Jun 4；9(6):2863-70.doi:10.1021/pr900949p.PubMed PMID:20377267.

Chen et al.Fusion protein linkers:property,design andfunctionality.Adv Drug Deliv Rev.2013Oct；65(10):1357-69.Review.PMID:23026637

Derfler et al.；Effective and safe in vivo IgE-depletion by a novelIgE-adsorber (IgEnio),EAACI Online Library,Jun 6,2015；103776

Digan et al.；专利WO1998/004718 A1

Dullaers et al.；The who,where,and when of IgE in allergic airwaydisease.J Allergy Clin Immunol.2012,129(3):635-45.PubMed PMID:22168998.

Galli&Tsai；IgE and mast cells in allergic disease.Nat Med.2012；18(5):693-704.doi:10.1038/nm.2755.Review.PubMed PMID:22561833

Garman et al.；Crystal structure of the human high-affinity IgEreceptor.Cell.1998Dec 23；95(7):951-61.PubMed PMID:9875849.

Gould et al.；PatentWO 99/05271 A1

Hervio LS,et al.；Negative selectivity and the evolution of proteasecascades:the specificity of plasminfor peptide and protein substrates.ChemBiol.20007(6):443-53.PubMed PMID:10873836.

Hogarth et al.；专利WO 96/08512 A1,US8,729,247 B2(Austin ResearchInstitute)

Holgate；World Allergy Organ J.2014Jul 29；7(1):17.doi:10.1186/1939-4551-7-17.eCollection 2014.Review.PMID:25097719

Huber et al.；专利WO 2000/032767 A1

Incorvaia et al.；Omalizumab,an anti immunoglobulin E antibody:stateof the art.Drug Des Devel Ther.2014Feb 7；8:197-207.doi:10.2147/DDDT.S49409.eCollection 2014.PubMed PMID:24532966；PubMed Central PMCID:PMC3923619.

Kasperkiewicz et al.；Improvement of treatment-refractory atopicdermatitis by immunoadsorption:a pilot study.J Allergy Clin Immunol.2011Jan；127(1):267-70,270.e1-6.doi:10.1016/j.jaci.2010.07.042.Epub 2010Oct 20.PubMedPMID:20970174.

Kerzel et al.；Plasmapheresis prior to omalizumab administration in a15-year-old boy withsevere asthma and very high IgE levels:sustained effectover 2 years.Klein Padiatr.2011Nov；223(6):356-9.doi:10.1055/s-0031-1287824.Epub 2011Oct 19.,PubMed PMID:22012605.

Lebedin et al.；Ex vivo removal of IgE in atopic asthma byextracorporeal plasmoimmunoadsorption(EPIA):development of a clinicaladsorbent.Int J Artif Organs.1991Aug；14(8):508-14.PubMed PMID:1937940.

Licari et al.；The discoveryand development of omalizumab for thetreatment of asthma.Expert Opin Drug Discov.2015；10(9):1033-42.doi:10.1517/17460441.2015.1048220.Epub 2015May 15.PubMed PMID:25979110.

Lingyun Jia et al.；专利CN102660569 A

Lowe et al.；Revision of omalizumab dosing table for dosing every4instead of 2weeks for specific ranges of bodyweight and baseline IgE.RegulToxicol Pharmacol.2015Feb；71(1):68-77.doi:10.1016/j.yrtph.2014.12.002.Epub2014Dec 8.PubMed PMID:25497995.

Lupinek et al.；Trimolecular complex formation of IgE,Fc epsilon RI,and arecombinant nonanaphylactic single-chain antibody fragment with highaffinity forIgE.J Immunol.2009Apr 15；182(8):4817-29.doi:10.4049/jimmunol.0800726.PubMedPMID:19342660.

Lupinek et al.；WO2012/140214 A1；专利US2014/0124448 A1

Mackay et al.；Mutagenesis within human FcepsilonRIalphadifferentially affects human and murine IgE binding.J Immunol.2002Feb 15；168(4):1787-95.PubMed PMID:11823511.

Mallamaci et al.；Identification of sites on the human Fc epsilon RIalpha subunit which are involved in binding human and rat IgE.J BiolChem.1993Oct 15；268(29):22076-83.PubMed PMID:8408065.

McKenzie et al.；专利US5,985,599 A

Miller et al.；Expression of high-affinity binding of humanimmunoglobulin E by transfected cells.Science.1989Apr 21；244(4902):334-7.PubMed PMID:2523561.

Oliveira S；Considerations on the Advantages of Small Tracers forOptical Molecular Imaging.J Mol Biol&Mol Imaging.2015；2(2):1016.

Pearson et al.；J.Immunoglobulin E in irritable bowel syndrome:anothertarget for treatment？A case report and literature review.Therap AdvGastroenterol.2015Sep；8(5):270-7.doi:10.1177/1756283X15588875.Review.PubMedPMID:26327917；PubMed Central PMCID:PMC4530434.

Perkins et al.；Probability-based protein identification by searchingsequence databases using mass spectrometry data.Electrophoresis.1999Dec；20(18):3551-67.PubMed PMID:10612281.

Peters C and Brown S.Antibody-drug conjugates as novel anti-cancerchemotherapeutics.Biosci Rep.2015Jun 12；35(4).Review.PMID:26182432

Platzer et al.,Soluble IgE receptors-elements of the IgEnetwork.Immunology Letters[2011,141(1):36-44]2012/01,PubMed PMID:21920387

Robertson；Phage and Escherichia coli expression of the human highaffinity immunoglobulin E receptor alpha-subunit ectodomain.Domainlocalization of the IgE-binding site.J Biol Chem.1993Jun 15；268(17):12736-43.PubMed PMID:8509408.

Sato et al.；Specific removal of IgE by therapeutic immunoadsorptionsystem.J Immunol Methods.1989Mar 31；118(2):161-8.PubMed PMID:2647856.

Shroba et al.；J.Current treatment options for idiopathicangioedema.Ann Allergy Asthma Immunol.2015Sep 1.pii:S1081-1206(15)00522-0.doi:10.1016/j.anai.2015.07.023.[Epub ahead of print]PubMed PMID:26341649.

Singh et al.；Improved method for linear B-cell epitope predictionusing antigen'sprimary sequence.PLoS One.2013May 7；8(5):e62216.doi:10.1371/journal.pone.0062216.Print 2013.PubMed PMID:23667458；PubMed,Central PMCID:PMC3646881.

Siraganian et al.；专利WO 89/05352 A1

Spiess C et al.Alternative molecular formats and therapeuticapplications for bispecific antibodies.Mol Immunol.2015Oct；67(2Pt A):95-106.Review.PMID:25637431

Sutton et al.；Structure and dynamics of IgE-receptor interactions:FcεRI and CD23/FcεRII.Immunol Rev.2015Nov；268(1):222-35.doi:10.1111/imr.12340.Review.PubMed PMID:26497523.

Van Vught R et al.；Site-specific functionalization of proteins andtheir applications to therapeutic antibodies.Comput StructBiotechnolJ.2014Feb 14；9:e201402001.doi:10.5936/csbj.201402001.eCollection2014.Review.PubMed PMID:24757499；PubMed Central PMCID:PMC3995230.

Wallukat et al.；The first aptamer-apheresis column specifically forclearing blood ofβ1-receptor autoantibodies.Circ J.2012；76(10):2449-55.Epub2012Jul 27.PubMed PMID:22850243.

Wurzburg et al.；Structural insights into the interactions betweenhuman IgE and its high affinity receptor FcepsilonRI.Mol Immunol.2002May；38(14):1063-72.Review.PubMed PMID:11955598.

Yanagihara et al.；Recombinant soluble form of the human high-affinityimmunoglobulin E(IgE)receptor inhibits IgE production through its specificbinding to IgE-bearing B cells.J Clin Invest.1994 Nov；94(5):2162-5.PubMedPMID:7525655；PubMed Central PMCID:PMC294671.

Yuan et al.；The serine protease plasmin cleaves the amino-terminaldomain of the NR2A subunit to relieve zinc inhibition of the N-methyl-D-aspartate receptors.J Biol Chem.2009 May 8；284(19):12862-73.doi:10.1074/jbc.M805123200.Epub 2009 Feb 24.PubMed PMID:19240037

Zink et al.；Targeting IgE in Severe Atopic Dermatitis with aCombination of Immunoadsorption and Omalizumab.Acta Derm Venereol.2015 Jun10.doi:10.2340/00015555-2165.[Epub ahead of print]PubMed PMID:26059424

Zink Alexander；Pilotstudie zur experimentellen Kombinationstherapievon Ig-Apherese und Omalizumab bei schwerem Atopischem Ekzem mitIgE-Spiegeln,2012,PhD Thesis https://mediatum.ub.tum.de/doc/1085022/1085022.pdf

Zuberbier T,Henz BM,Fiebiger E,Maurer D,Stingl G.Anti-FcepsilonRIalpha serum autoantibodies in different subtypes ofurticaria.Allergy.2000 Oct；55(10):951-4.PubMed PMID:11030376.

Claims (21)

1.人高亲和力IgE受体的α链(FceRIa)，其中43位氨基酸赖氨酸(K43)交换为选自下组的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸和缬氨酸，优选丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或酪氨酸，特别是丙氨酸。

2.根据权利要求1的FceRIa，其具有根据SEQ ID No.1的氨基酸序列，其中43位氨基酸赖氨酸(K43)被交换为选自下组的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸和缬氨酸，优选丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或酪氨酸，特别是丙氨酸。

3.根据权利要求1或2的FceRIa，其中进一步的氨基酸是被交换的，优选选自以下的氨基酸：31位赖氨酸(K31)、40位精氨酸(R40)、41位异亮氨酸(I41)、42位苯丙氨酸(F42)、44位甘氨酸(G44)、45位谷氨酸(E45)、142位赖氨酸(K142)、196位赖氨酸(K196)、199位精氨酸(R199)和201位赖氨酸(K201)，尤其选自下组：31位赖氨酸(K31)、40位精氨酸(R40)、142位赖氨酸(K142)、196位赖氨酸(K196)、199位精氨酸(R199)和第201位赖氨酸(K201)。

4.根据权利要求1至3中任一项的FceRIa，其中所述FceRIa固定在固体表面上。

5.包含通过两个二硫桥连接的α链、β链和两条γ链的FceRI，其中所述α链是根据权利要求1至4中任一项的经修饰的α链。

6.根据权利要求1至4中任一项的FceRIa，用于预防和/或治疗IgE介导的疾病，其中所述FceRIa用于在单采血液成分术中从人体液，特别是人血浆或血清中消减过量的IgE(抗IgE疗法)。

7.根据权利要求6使用的FceRIa，其中所述IgE介导的疾病选自下组：变应性疾病，优选季节性、食物、花粉、霉菌孢子、毒植物、药物/药品、昆虫毒液、蝎毒液、或蜘蛛毒液、胶乳或房尘螨变态反应、宠物变态反应、变应性鼻炎和结膜炎、变应性结膜炎、变应性支气管哮喘、非变应性哮喘、丘斯综合征(Churg-Strauss Syndrome)、特应性皮炎、鼻息肉病、基穆拉病(Kimura’s disease)、针对粘合剂、抗微生物剂、香料(fragrance)、染发剂、金属、橡胶组分、外用药物、松香、蜡、抛光剂(polishes)、粘固剂(cement)和皮革的接触性皮炎、慢性鼻窦炎、特应性湿疹、IgE相关自身免疫性疾病，优选慢性(特发性)和自身免疫性荨麻疹、胆碱能性荨麻疹、肥大细胞增多症，特别是皮肤肥大细胞增多症，变应性支气管肺曲霉病、慢性或复发性特发性血管性水肿、间质性膀胱炎、过敏反应，特别是特发性和运动诱发的过敏反应，免疫疗法、嗜曙红细胞相关疾病(eosinophil-associated disease)，优选嗜酸细胞性哮喘(eosinophilic asthma)，嗜酸细胞性胃肠炎(eosinophilic gastroenteritis)，嗜酸粒细胞性中耳炎(eosinophilic otitis media)和嗜酸粒细胞性食管炎(eosinophilicoesophagitis)；淋巴瘤、抗酸治疗的敏化副作用，优选所述抗酸治疗用于胃或十二指肠溃疡或返流。

8.根据权利要求6或7使用的FceRIa，其中所述FceRIa偶联于适于与人个体的血流接触的固体载体。

9.单采血液成分术装置，其包含能够与血液或血浆流接触的固体载体，所述单采血液成分术装置的特征在于所述固体载体包含根据权利要求1至4中任一项的FceRIa。

10.根据权利要求9的装置用于提供预防和/或治疗装置的用途，所述预防和/或治疗装置用于预防和/或治疗IgE相关疾病，特别是用于进行抗IgE疗法。

11.用于预防和/或治疗IgE相关疾病的试剂盒，其包含含有根据权利要求1至4中任一项的FceRIa的固体单采血液成分术载体，其中所述载体为无菌且无热原的柱。

12.根据权利要求1至4中任一项的FceRIa，其用于治疗方法中，特别用于预防或治疗IgE相关疾病。

13.药物组合物，其包含根据权利要求1至4中任一项的FceRIa和药学可接受载体。

14.根据权利要求1至4中任一项的FceRIa，其偶联于：

-接头分子，优选肽接头，尤其是由1至10个，优选2至5个氨基酸残基组成的肽接头；和/或

-治疗或诊断分子，优选单克隆抗体或抗体片段、细胞因子、抗体样结构、细胞毒剂或抑制剂、光学示踪剂；和/或

-载体，优选载体蛋白，特别是人血清清蛋白、转铁蛋白或Fc域。

15.根据权利要求14的FceRIa，用于治疗选自下组的疾病：变应性疾病，优选季节性、食物、花粉、霉菌孢子、毒植物、药物/药品、昆虫毒液、蝎毒液、或蜘蛛毒液、胶乳或房尘螨变态反应、宠物变态反应、变应性鼻炎和结膜炎、变应性结膜炎、变应性支气管哮喘、非变应性哮喘、丘斯综合征(Churg-Strauss Syndrome)、特应性皮炎、鼻息肉病、基穆拉病、针对粘合剂、抗微生物剂、香料、染发剂、金属、橡胶组分、外用药物、松香、蜡、抛光剂、粘固剂和皮革的接触性皮炎、慢性鼻窦炎、特应性湿疹、IgE相关自身免疫性疾病，优选慢性(特发性)和自身免疫性荨麻疹、胆碱能性荨麻疹、肥大细胞增多症，特别是皮肤肥大细胞增多症，变应性支气管肺曲霉病、慢性或复发性特发性血管性水肿、间质性膀胱炎、过敏反应，特别是特发性和运动诱发的过敏反应，免疫疗法、嗜曙红细胞相关疾病，优选嗜酸细胞性哮喘、嗜酸细胞性胃肠炎、嗜酸粒细胞性中耳炎和嗜酸粒细胞性食管炎；淋巴瘤、抗酸治疗的敏化副作用，优选所述抗酸治疗用于胃或十二指肠溃疡或返流。

16.根据权利要求1至4、14和15中任一项的FceRI的片段，其至少包含SEQ ID NO:2或3的IgE结合区和蛋白酶抗性区。

17.根据权利要求16的片段，其包含SEQ ID NO:2或3的氨基酸26至205，优选氨基酸30至193。

18.根据权利要求16或17的FceRIa片段，其中所述FceRIa片段偶联于适于与人个体的血流接触的固体载体。

19.单采血液成分术装置，其包含能够与血液或血浆流接触的固体载体,所述单采血液成分术装置的特征在于所述固体载体包含根据权利要求16或17的FceRIa片段。

20.根据权利要求19的装置用于提供预防和/或治疗装置的用途，所述预防和/或治疗装置用于预防和/或治疗IgE相关疾病，特别是用于进行抗IgE疗法。

21.用于预防和/或治疗IgE相关疾病的试剂盒，其包含含有根据权利要求16或17的FceRIa片段的固体单采血液成分术载体，其中所述载体为无菌且无热原的柱。