CN103562227B - Pcsk9拮抗剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9a型（“PCSK9”）的抗体拮抗剂，以及使用此类抗体的方法。

Description

PCSK9拮抗剂

相关专利申请的交互引用

本申请要求2011年2月11日提交的美国临时专利申请No.61/442,126的优先权，对于全部目的，将所述临时申请并入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及针对PCSK9的抗体拮抗剂。

背景技术

低密度脂蛋白受体（LDL-R）通过清除血流中的低密度脂蛋白（LDL）来预防动脉粥样硬化和高胆固醇血症。LDL-R在翻译后水平通过前蛋白转化酶（proprotein convertase）枯草杆菌蛋白酶/kexin9a型（“PCSK9”）调控。最近，报道了小鼠中PCSK9的敲除。这些小鼠显示血浆胆固醇水平降低了大约50%，并且在降低血浆胆固醇的过程中显示出对抑制素的敏感性的提高（Rashid S，等人（2005）Proc Natl Acad Sci102：5374-5379）。人类遗传学数据也支持PCSK9在LDL稳态中的作用。最近，在PCSK9中鉴定了两种突变，推测其是“功能缺失型”突变。具有这些突变的个体降低了大约40%LDL-C血浆水平，这相当于减少了大约50-90%的冠心病。总之，这些研究表明，PCSK9的抑制剂对于降低LDL-C的血浆浓度和减少由PCSK9介导的其他疾病是有益的，并且可以例如与用于降低胆固醇的第二试剂共同施用，用于增加功效。

发明概述

本发明提供了与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9a型（PCSK9）（例如，SEQ IDNO:43）结合并对抗其功能的抗体，以及使用此类抗体的方法，例如治疗由PCSK9介导的疾病。

在一个方面，本发明提供了与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型（PCSK9）结合的抗体和抗原结合分子。在一些实施方案中，抗体阻断PCSK9与低密度脂蛋白受体（LDLR）的相互作用，并抑制PCSK9-介导的LDLR的降解，其中所述抗体包含：

a)重链可变区，其包含人重链V-区段、重链互补决定区3（CDR3）和重链构架区4（FR4）；和

b)轻链可变区，其包含人轻链V-区段、轻链CDR3和轻链FR4，其中

i)重链CDR3可变区包含氨基酸序列ITTEGGFAY（SEQ ID NO:17）；和

ii)轻链CDR3可变区包含氨基酸序列QQSNYWPLT（SEQ ID NO:24）。

在一些实施方案中，与人PCSK9结合的抗体或抗原结合分子具有约500pM或更小的平衡解离常数（KD）。例如，在一些实施方案中，与人PCSK9结合的抗体或抗原结合分子具有约400pM、300pM、250pM、200pM、190pM、180pM、170pM、160pM、150pM、140pM或更小的平衡解离常数（KD）。

在一些实施方案中，重链V-区段与SEQ ID NO:27具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，并且轻链V区段与SEQ IDNO:28具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

在一些实施方案中，重链V-区段与选自SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，并且轻链V-区段与SEQ ID NO:28具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

在一些实施方案中，重链FR4是人种系FR4。在一些实施方案中，重链FR4为SEQ IDNO:35。

在一些实施方案中，轻链FR4是人种系FR4。在一些实施方案中，轻链FR4为SEQ IDNO:39。

在一些实施方案中，重链V-区段和轻链V-区段均包含互补决定区1（CDR1）和互补决定区2（CDR2），其中：

i)重链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；

ii)重链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；

iii)轻链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；且

iv)轻链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。

在一些实施方案中，

i)重链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO:14；

ii)重链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO:16；

iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:17；

iv)轻链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO:19；

v)轻链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO:22；且

vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:24。

在一些实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO:40的可变区具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性，并且轻链可变区与SEQ ID NO:41的可变区具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。

在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO:40的重链和含有SEQ ID NO:41的轻链。

在一些实施方案中，重链可变区与选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9的可变区具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性，并且轻链可变区与选自SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11的可变区具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。

在一些实施方案中，重链可变区包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且轻链可变区包含选自SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体是IgG。在一些实施方案中，抗体是IgG1。

在一些实施方案中，抗体是FAb'片段。在一些实施方案中，抗体是单链抗体（scFv）。在一些实施方案中，抗体包含人恒定区。在一些实施方案中，抗体包含人IgG1恒定区。在一些实施方案中，人IgG1恒定区是突变的，以对细胞上的效应子配体如Fc受体（FcR），例如FcγR1或者补体的C1组分具有降低的结合亲和力。参见，例如美国专利No.5,624,821。在一些实施方案中，将IgG1恒定区的氨基酸残基L234和L235取代成Ala234和Ala235。重链恒定区中残基的编号为EU索引的编号（参见，Kabat，等人，（1983）“Sequences of Proteinsof Immunological Interest，”U.S.Dept.Health and Human Services）。

在一些实施方案中，抗体与载体蛋白，例如白蛋白连接。

在一些实施方案中，抗体是聚乙二醇化的。

在其他方面，本发明提供了组合物，其包含如本文中所述的抗体或抗原结合分子，以及生理上相容的赋形剂。

在一些实施方案中，组合物还包含降低个体中的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平的第二试剂。

在一些实施方案中，第二试剂是抑制素。例如，抑制素可以选自托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。

在一些实施方案中，第二试剂选自贝特（fibrate）类、烟酸及其类似物、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸多价螯合剂、甲状腺激素模拟物、微粒体甘油三酯转移蛋白（MTP）抑制剂、二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）抑制剂、靶向PCSK9的抑制性核酸，以及靶向apoB100的抑制性核酸。

在其他方面，本发明提供了在需要其的个体中降低LDL-C、非-HDL-C和/或总胆固醇的方法，该方法包括给个体施用治疗有效量的如本文中所述的抗体或抗原结合分子。

在一些实施方案中，个体对抑制素治疗是低应答或者有抗性的。在一些实施方案中，个体是不耐受抑制素治疗的。在一些实施方案中，个体具有至少约100mg/dL，例如至少约110、120、130、140、150、160、170、180、190mg/dL或者更高的基线LDL-C水平。在一些实施方案中，个体具有家族性高胆固醇血症。在一些实施方案中，个体具有甘油三酯血症（triglyceridemia）。在一些实施方案中，个体具有功能获得型PCSK9基因突变。在一些实施方案中，个体具有药物诱导的血脂异常。

在一些实施方案中，总胆固醇与LDL-C一起降低。

在一些实施方案中，方法还包括给个体施用治疗有效量的有效降低LDL-C的第二试剂。

在一些实施方案中，第二药剂是抑制素。例如，抑制素可以选自托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。

在一些实施方案中，第二药剂选自贝特类、烟酸及其类似物、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸多价螯合剂、甲状腺激素模拟物、微粒体甘油三酯转移蛋白（MTP）抑制剂、二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）抑制剂、靶向PCSK9的抑制性核酸，以及靶向apoB100的抑制性核酸。

在一些实施方案中，将抗体或抗原结合分子和第二试剂以混合物的形式共同施用。

在一些实施方案中，将抗体或抗原结合分子和第二试剂分别共同施用。

在一些实施方案中，静脉内施用抗体。在一些实施方案中，皮下施用抗体。

定义

“抗体”指免疫球蛋白家族的多肽或包含能非共价地、可逆地，并且以特异的方式结合相应抗原的免疫球蛋白的片段的多肽。示例性抗体结构单元包含四聚体。每一四聚体由两个相同的多肽链对组成，每一对具有通过二硫键连接的一个“轻”链（约25kD）和一个“重”链（约50-70kD）。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每一链的N-端定义了主要负责抗原识别的约100-110或者更多的氨基酸的可变区。术语可变轻链（V_L）和可变重链（V_H）分别指轻链和重链的那些区域。如在本申请中所用，“抗体”包括例如对PCSK9拥有特定结合特异性的抗体及其片段的全部变型。因此，在该概念的范围内，抗体是具有相同结合特异性的全长抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体（ScFv）、Fab、Fab'和这些片段的多聚形式（例如F(ab')₂）。

“互补决定域”或“互补决定区（CDR）”可互换地指V_L和V_H的超变区。CDR是对该靶蛋白具有特异性的抗体链的靶蛋白质结合位点。在每个人V_L或V_H中存在三个CDR（CDR1-3，从N-端顺次编码），其构成了约15-20%的可变域。CDR在结构上与靶蛋白质的表位互补，因此直接负责结合特异性。V_L和V_H的剩余链（所称作的构架区）在氨基酸序列方面表现出较少的变化（Kuby，Immunology，第4版，第4章。W.H.Freeman&Co.，New York，2000）。

使用本领域的多种熟知定义，例如，Kabat，Chothia，internationalImMunoGeneTics数据库（IMGT）（在imgt.cines.fr/的全球网上)和AbM（参见，例如Johnson等人，Nucleic Acids Res.，29：205-206（2001）；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917（1987）；Chothia等人，Nature，342：877-883（1989）；Chothia等人，J.Mol.Biol.，227：799-817（1992）；Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.，273：927-748（1997））可以确定CDR和构架区的位置。抗原结合部位的定义还描述于下文：Ruiz等人，Nucleic Acids Res.，28：219–221（2000）；和Lefranc，M.P.，NucleicAcids Res.，29：207-209（2001）；MacCallum等人，J.Mol.Biol.，262：732-745（1996）；和Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9268–9272（1989）；Martin等人，Methods Enzymol.，203：121–153（1991）；和Rees等人，InSternberg M.J.E.(ed.)，Protein Structure Prediction，Oxford University Press，Oxford，141–172（1996）中。

术语“结合特异性决定簇”或“BSD”可互换地指对于决定抗体的结合特异性所必需的互补决定区内的最小连续或不连续氨基酸序列。最小结合特异性决定簇可以在一个或多个CDR序列内。在一些实施方案中，最小结合特异性决定簇位于抗体重链和轻链的CDR3序列的一部分或者全长内（即仅由抗体重链和轻链的CDR3序列的一部分或者全长决定）。

如本文中所用，“抗体轻链”或“抗体重链”指分别包含V_L或V_H的多肽。内源V_L由基因区段V（可变的）和J（接合的）编码，而内源V_H由V、D（多样性）和J编码。每一V_L或V_H包括CDR以及构架区。在本申请中，有时将抗体轻链和/或抗体重链统称为“抗体链”。正如本领域技术人员所理解，这些术语包括含有不会破坏V_L或V_H的基本结构的突变的抗体链。

抗体以完整的免疫球蛋白或者以通过多种肽酶消化产生的许多完全表征的片段存在。因此，例如胃蛋白酶在铰链区中的二硫键消化抗体，产生F(ab)'₂（Fab'的二聚体），其自身是通过二硫键与V_H-C_H1结合的轻链。在温和条件下可以还原F(ab)'₂，以破坏铰链区的二硫键，从而将F(ab)'₂二聚体转变成Fab'单体。Fab'单体在本质上是具有铰链区的一部分的Fab。Paul，Fundamental Immunology第三版（1993）。尽管按照完整抗体的消化，定义了多种抗体片段，但技术人员应当理解，可以通过化学方法或者通过使用重组DNA方法从头合成此类片段。因此，如本文中所用，术语“抗体”还包括通过全抗体的修饰产生的抗体片段、或者使用重组DNA方法从头合成的那些抗体片段（例如，单链Fv）或者使用噬菌体展示文库鉴定的那些抗体片段（参见，例如，McCafferty等人，Nature348：552-554（1990））。

对于单克隆或多克隆抗体的制备，可以使用本领域已知的任何技术（参见，例如Kohler&Milstein，Nature256：495-497（1975）；Kozbor等人，Immunology Today4：72（1983）；Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，第77-96页。AlanR.Liss,Inc.1985）。可以采用产生单链抗体的技术（美国专利No.4,946,778）来产生针对本发明多肽的抗体。此外，可以将转基因小鼠或者其他生物例如其他哺乳动物用于表达人源化抗体。备选地，可以将噬菌体展示技术用于鉴定抗体和与选定的抗原特异性结合的异聚Fab片段（参见，例如McCafferty等人，上述；Marks等人，Biotechnology，10：779-783，（1992））。

用于人源化或者灵源化（primatize）非人抗体的方法是本领域熟知的。通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为输入残基，其一般取自输入可变域（import variable domain）。基本上可以按照Winter和同事的方法（参见，例如Jones等人，Nature321:522-525（1986）；Riechmann等人，Nature332:323-327（1988）；Verhoeyen等人，Science239:1534-1536（1988）和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596（1992）），通过将啮齿类动物CDR或CDR序列取代成相应的人抗体的序列来进行人源化。因此，此类人源化抗体是嵌合抗体（美国专利No.4,816,567），其中已经用来自非人物种的相应序列取代了基本上少于一个完整的人可变域。实际上，人源化抗体一般是人抗体，其中用来自啮齿类动物抗体中类似位点的残基取代了一些互补决定区（“CDR”）残基，以及可能的一些构架（“FR”）残基。

本发明抗体或抗原结合分子还包括与其他蛋白质化学结合或者与其他蛋白质一起表达为融合蛋白的一个或多个免疫球蛋白链。本发明抗体或抗原结合分子还包括双特异性抗体。双特异性或双功能抗体是人工的杂合抗体，其具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点。本发明的其他抗原结合片段或抗体部分包括二价scFv（双特异性抗体）、双特异性scFv抗体（其中抗体分子识别两个不同的表位）、单结合结构域（dAb）和微抗体。

可以通过完整抗体的酶促修饰或者化学修饰产生或者使用重组DNA方法从头合成（例如，单链Fv）或者使用噬菌体展示文库鉴定（参见，例如McCafferty等人，Nature348：552-554，1990）本文中所述的多种抗体或抗原结合片段。例如，可以使用本领域所述的方法，例如Vaughan和Sollazzo，Comb Chem High Throughput Screen。4：417-302001产生微抗体。可以通过多种方法包括杂交瘤的融合或者Fab'片段的连接来产生双特异性抗体。参见，例如Songsivilai&Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321（1990）；Kostelny等人，J.Immunol.148，1547-1553（1992）。可以使用噬菌体展示文库或者核糖体展示文库、基因改组文库鉴定单链抗体。可以从合成的、半合成的或者天然的且具有免疫能力的来源中构建此类文库。

“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)改变、替换或者交换了恒定区或其部分，以使抗原结合位点（可变区）与不同或者改变种类、效应子功能和/或物种的恒定区或者完全不同的分子例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等连接，所述完全不同的分子给嵌合抗体赋予了新的性质；或(b)改变、替换或者交换了可变区或其部分，并且所述可变区具有不同的或者改变的抗原特异性。例如，如在下文实施例中所示，可以通过用来自人免疫球蛋白的恒定区替换小鼠抗PCSK9抗体的恒定区来修饰小鼠抗PCSK9抗体。由于用人恒定区进行了替换，所以嵌合抗体可以保留其识别人PCSK9的特异性，而与最初的小鼠抗体相比，在人类中还具有降低的抗原性。

术语“抗体结合分子”或“非抗体配体”指使用非免疫球蛋白的蛋白质骨架的抗体模拟物，包括adnectin、avimer、单链多肽结合分子，以及抗体样结合肽模拟物。

术语“可变区”或“V-区”可互换地指包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的重链或轻链。参见图1。内源可变区通过免疫球蛋白重链V-D-J基因或者轻链V-J基因编码。V-区可以是天然存在的、重组的或者合成的。

如本文中所用，术语“可变区段”或“V-区段”可互换地指包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的可变区的子序列。参见图1。内源V-区段由免疫球蛋白V-基因编码。V-区段可以是天然存在的、重组的或者合成的。

如本文中所用，术语“J-区段”指编码的包含CDR3和FR4的C-端部分的可变区的子序列。内源J-区段由免疫球蛋白J-基因编码。参见图1。J-区段可以是天然存在的、重组的或者合成的。

“人源化抗体”指这样的抗体，其保留了非人抗体的反应性，但在人类中具有更低的免疫原性。这例如可以通过保留非人CDR区，而抗体的剩余部分用其人类的对应物替换来实现。参见，例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855（1984）；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92（1988）；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536（1988）；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498（1991）；Padlan，Molec.Immun.，31（3）：169-217（1994）。

术语“相应的人种系序列”指编码人可变区氨基酸序列或子序列的核酸序列，与由人种系免疫球蛋白可变区序列编码的全部其他已知的可变区氨基酸序列相比，所述核酸序列与参照可变区氨基酸序列或子序列共有所确定的最高的氨基酸同一性。相应的人种系序列还可以指与全部其他被评价的可变区氨基酸序列相比，与参照可变区氨基酸序列或子序列具有最高的氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或子序列。相应的人种系序列可以是单独的构架区、单独的互补决定区、构架区和互补决定区、可变区段（如上所定义）或者包含可变区的序列或子序列的其他组合。可以使用本文中所述的方法，例如，使用本领域已知的BLAST、ALIGN或其他比对算法比对两个序列，来确定序列同一性。相应的人种系核酸或氨基酸序列可以与参照可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。可以例如通过公共可获得的国际ImMunoGeneTics数据库（IMGT）（在imgt.cines.fr/的全球网上）和V-base（在vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk的全球网上）确定相应的人种系序列。

当用于描述抗原，例如蛋白质与抗体或抗体衍生的结合剂之间的相互作用时，短语“特异地（或者选择地）结合”，指结合反应，其确定抗原在蛋白质的异源群体以及其他生物制品中，例如生物样品，如血液、血清、血浆或组织样品中的存在。因此，在设定的免疫测定条件下，抗体或结合剂与特定抗原结合的特定的结合特异性至少是背景的两倍，并且基本上不以显著量与样品中存在的其他抗原结合。在此种条件下与抗体或结合剂的特异性结合可能需要已经选择了抗体或试剂对特定蛋白质的特异性。根据需要或者根据情况，这种选择可以通过去除与，例如来自其他物种（例如小鼠）的PCSK9分子或者其他PCSK亚型交叉反应的抗体实现。可以将多种免疫测定形式用于选择与特定蛋白质特异地进行免疫反应的抗体。例如，常规地将固相ELISA免疫测定用于选择与蛋白质特异地进行免疫反应的抗体（对于可用于测定特异性免疫反应的免疫测定形式和条件的描述，参见例如Harlow&Lane，Using Antibodies，A Laboratory Manual（1998））。通常，特异性或选择性结合反应会产生至少两倍于背景信号，并且更一般地至少10-100倍于背景的信号。

术语“平衡解离常数（K_D，M）”指解离速率常数（k_d，时间^-1）除以结合速率常数（k_a，时间^-1，M^-1）。可以使用本领域任何已知的方法测量平衡解离常数。本发明抗体通常具有低于约10^-7或10^-8M的平衡解离常数。

如本文中所用，术语“抗原结合区”指本发明PCSK9-结合分子的结构域，其负责分子和PCSK9之间特异性结合。抗原结合区包括至少一个抗体重链可变区和至少一个抗体轻链可变区。在本发明的每一个PCSK9-结合分子中至少存在一个这样的抗原结合区，并且每一抗原结合区可以与其他抗原结合区相同或者不同。在一些实施方案中，本发明PCSK9-结合分子的至少一个抗原结合区起着PCSK9的拮抗剂的作用。

如本文中所用，术语“拮抗剂”指能特异地结合并抑制靶分子的活性的试剂。例如，PCSK9的拮抗剂与PCSK9特异地结合，并完全或者部分抑制PCSK9介导的LDLR的降解。如本文中所用，抑制PCSK9介导的LDLR的降解干扰了PCSK9与LDLR的结合。在一些情况下，可以通过PCSK9拮抗剂与PCSK9结合并且抑制PCSK9与LDLR结合的能力来鉴定PCSK9拮抗剂。与对照存在的情况下或者拮抗剂不存在的情况下PCSK9介导的降解相比，当暴露于本发明拮抗剂且抑制了PCSK9介导LDLR降解时，发生的抑制为至少约10%、例如至少约25%、50%、75%或者完全抑制。可以将对照暴露于没有抗体或抗原结合分子、特异地结合另一个抗原的抗体或抗原结合分子、抗PCSK9抗体或者已知不作为拮抗剂发挥作用的抗原结合分子。“抗体拮抗剂”指拮抗剂是抑制抗体的情况。

术语“PCSK9”或“前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9a型”可互换地指属于分泌性枯草杆菌蛋白酶家族的蛋白酶K亚家族的天然存在的人前蛋白转化酶。PCSK9合成为可溶性酶原，其在内质网中经历自身催化的分子内加工，并认为PCSK9的功能为前蛋白转化酶。PCSK9在胆固醇稳态中发挥作用，并在皮层神经元的分化中起作用。PCSK9基因的突变与常染色体显性家族性高胆固醇血症的形成相关。参见，例如Burnett andHooper，ClinBiochem Rev（2008）29（1）：11-26。PCSK9的核酸和氨基酸序列是已知的，并且已经分别在GenBank登录号NM_174936.2和NP_777596.2中公开。如本文中所用，PCSK9多肽在功能上与LDLR结合，并促进LDLR的降解。在结构上，PCSK9氨基酸序列与GenBank登录号NP_777596.2的氨基酸序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在结构上，PCSK9氨基酸序列与GenBank登录号NM_174936.2的氨基酸序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。

短语“PCSK9功能获得型突变”指在PCSK9基因中发生的天然突变，其与家族性高胆固醇血症表型、加速的动脉粥样硬化和早发冠心病相关和/或与上述病症的成因相关，所述成因例如是由于增加的LDLR降解和LDLR水平的降低。PCSK9功能获得型突变的等位基因频率是罕见的。参见，Burnett和Hooper，Clin Biochem Rev.（2008）29（1）：1-26。示例性PCSK9功能获得型突变包括D129N、D374H、N425S和R496W。参见，Fasano，等人，Atherosclerosis（2009）203（1）：166-71。例如，在Burnett和Hooper，上述；Fasano，等人，上述；Abifadel，等人，J Med Genet（2008）45（12）：780-6；Abifadel，等人，Hum Mutat（2009）30（4）：520-9；和Li，等人，Recent Pat DNA Gene Seq（2009）11月1日（PMID19601924）中综述了PCSK9功能获得型突变。

本发明多肽的“活性”指多肽在其天然细胞或组织中的结构功能、调节功能或生物化学功能。多肽活性的实例包括直接活性和间接活性。PCSK9的示例性直接活性是与多肽直接相互作用的结果，包括与LDLR结合和PCSK9-介导的LDLR的降解。就PCSK9而言，示例性间接活性观察为细胞、组织、器官或受试者的表型的改变或者对多肽的直接活性的应答的改变，例如降低增加的肝LDLR、降低血浆HDL-C、减少血浆胆固醇、增加了对抑制素的敏感性。

当应用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”指核酸或蛋白质基本上没有其他细胞组分，所述细胞组分在天然状态下是与所述核酸或蛋白质相伴随的。所述核酸或蛋白质优选地是均一状态。它可以是干的或者是水溶液。通常使用分析化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或者高效液相层析测定纯度和均一性。在制备物中以主要种类存在的蛋白质是基本上纯化的。特别地，分离的基因与基因侧翼的可读框分离，并且编码不同于目的基因的蛋白质。术语“纯化的”指核酸或蛋白质在电泳凝胶上基本上只产生一条带。特别地，它指的是核酸和蛋白质是至少85%的纯度、更优选地至少95%的纯度，最优选地至少99%的纯度。

术语“核酸”或“多肽”指单链或双链形式的脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）及其聚合物。除非特定限制，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参照核酸相似的结合性质，并以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另外指明，特定的核酸序列还隐含地包括经保守修饰的变体（例如，简并密码子取代）、等位基因、直向同源物、SNP、互补序列，以及明确指出的序列。特别地，可以通过用混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代一个或多个选定的（或者全部）密码子的第三个位置而产生的序列，来实现简并密码子取代（Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081（1991）；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608（1985）；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes8：91-98（1994））。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指氨基酸残基的聚合物。可将该术语用于氨基酸聚合物（其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物），天然存在的氨基酸聚合物以及非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即与氢结合的α-碳、羧基、氨基和R基，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍（methionine methyl sulfonium）。此类类似物具有经修饰的R基（例如正亮氨酸）或者经修饰的肽主链，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指化学化合物，其具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥作用。

“经保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，经保守修饰的变体指编码相同的或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者其中该核酸并不编码氨基酸序列或者指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量在功能上相同的核酸编码任一给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在通过密码子指定的丙氨酸的每一位置处，都可以在不改变所编码的多肽的情况下，将密码子改变成任一相应的所述密码子。此类核酸变异是“沉默变异”，其是经保守修饰的变异的一种。本文中编码多肽的每一核酸序列还描述了该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域技术人员应当理解，可以修饰核酸中的每一密码子（除通常作为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常作为色氨酸的唯一密码子的TGG外），以产生在功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每一沉默变异隐含在每一所述的序列中。

对于氨基酸序列，本领域技术人员应当理解，通过改变、添加或者缺失编码序列中的单个氨基酸或者小部分的氨基酸而导致核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个取代、缺失或添加都是“经保守修饰的变体”，其中改变导致氨基酸被取代为化学上相似的氨基酸。本领域熟知提供功能上相似的氨基酸的保守取代表。此类经保守修饰的变体另外地并不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。

以下八组都含有相互保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸（A），甘氨酸（G）；

2)天冬氨酸（D），谷氨酸（E）；

3)天冬酰胺（N），谷氨酰胺（Q）；

4)精氨酸（R），赖氨酸（K）；

5)异亮氨酸（I），亮氨酸（L），甲硫氨酸（M），缬氨酸（V）；

6)苯丙氨酸（F），酪氨酸（Y），色氨酸（W）；

7)丝氨酸（S），苏氨酸（T）；和

8)半胱氨酸（C），甲硫氨酸（M)（参见，例如Creighton，Proteins（1984））。

“序列的同一性百分比”通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列确定，其中与用于两个序列最佳比对的不包含添加或缺失的参照序列（例如，本发明多肽）相比，比较窗口中多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失（即，空位）。通过以下计算百分比：通过确定两个序列中存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目来产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数，将结果乘以100从而产生序列的同一性百分比。

就两个或两个以上核酸或多肽序列而言，术语“同一性”或“同一性百分比”指相同的两个或两个以上多个序列或子序列。当使用以下序列比较算法之一或者通过人工比对和目视检查在比较窗口上或者所测量的指定区域上比较并比对最大一致性时，如果两个序列具有相同的氨基酸残基或核苷酸的特定百分比（即，在特定区域上，或者当没有指定时，在参照序列的整个序列上具有70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性），那么两序列是“基本上同一的”。本发明提供了分别与本文中所示例的多肽或多核苷酸（例如，在SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11和40-41的任意之一中示例的可变区；在SEQ ID NO:25-29的任意之一中示例的可变区段；在SEQ ID NO:13-24的任意之一中示例的CDR；在SEQ ID NO:30-39的任意之一中示例的FR；和在SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和46-49的任意之一中示例的核酸序列）基本上同一的多肽或多核苷酸。任选地，在至少约15、25或50个核苷酸长度的区域上或者更优选地，在100-500或1000或者以上核苷酸长度的区域上或者在参照序列的全长上存在同一性。就氨基酸序列而言，可以在至少5、10、15或20个氨基酸长度，任选地至少约25、30、35、40、50、75或100个氨基酸长度，任选地至少约150、200或250个氨基酸长度的区域上或者在参照序列的全长上存在同一性或基本同一性。就更短的氨基酸序列，例如20个或者更少氨基酸的氨基酸序列而言，当根据本文中所定义的保守取代，保守取代了一个或两个氨基酸残基时，存在基本同一性。

对于序列比较，通常将一个序列作为参照序列与测试序列比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入到计算机中，指定子序列坐标（subsequence coordinate），根据需要，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者指定备选的参数。然后，基于程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参照序列的序列百分比同一性。

如本文中所用，“比较窗口”包括提及选自20至600，通常约50至约200，更通常地约100至约150个连续位置数的任意之一的区段，其中在最佳地比对该序列与相同数目连续位置的参照序列后，可以比较这两个序列。比对用于比较的序列的方法是本领域熟知的。例如通过Smith和Waterman（1970）Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch（1970）J.Mol.Biol.48：443的同源性算法、通过Pearson和Lipman，（1988）Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85：2444的检索相似性的方法、通过这些算法的计算机化实现（GAP、BESTFIT、FASTA和Wisconsin遗传软件包中的TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI0）或者通过人工比对和目视检查（参见，例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology）(1995增刊)）,可以进行用于比较的序列的最佳比对。

适合于测定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人，（1977）Nuc.Acids Res.25：3389-3402；和Altschul等人，（1990）J.Mol.Biol.215：403-410中。用于进行BLAST分析的软件是可从国家生物技术信息中心(National Centre for Biotechnology Information)公开得到的。该算法涉及通过在查询序列中鉴定W长度的短字来首先鉴定高得分的序列对（HSP），当与数据库序列中相同长度的字比对时，所述序列对匹配或者满足了一些正值阈值得分（positive-valued threshold score）T。T称为邻近字得分阈值（Altschul等人，上述）。将这些最初的邻近字命中作为启动检索的种子以寻找含有它们的更长HSP。字命中沿着每一序列的两个方向延伸，只要积累的比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M（匹配残基对的奖励得分；总是大于0）和N（错配残基的罚分；总是小于0）计算积累得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算积累得分。在以下情况下，中止在每一方向中字命中的延伸：积累比对得分从其最大达到值减少了X值；由于一个或多个负得分残基比对的积累，积累得分变成了0或者更低；或者到达了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序（对于核苷酸序列）使用字长（W）11、期望（E）10、M=5、N=-4作为默认值，并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用3的字长、10的期望（10），以及BLOSUM62得分矩阵（参见Henikoff和Henikoff，（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915）、50的比对（B）、10的期望（E）、M=5、N=-4作为默认值，并比较两条链。

BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计学分析（参见，例如，Karlin和Altschul（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5787）。BLAST算法提供的相似性的一种测量方法是最小和概率（smallest sumprobability）（P(N)），其提供了两个核苷酸序列或者氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参照核酸的比较中，最小和概率低于约0.2，更优选地低于约0.01，以及最优选地低于约0.001，那么认为核酸与参照序列相似。

两个核酸序列或多肽是基本上相同的另一个指标是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体在免疫学上交叉反应。因此，该多肽通常基本上与第二多肽相同，例如，其中两种肽仅是保守性取代的不同。如下所述，两个核酸序列是基本上相同的另一种指标是，在严格条件下两个分子或其互补核酸序列相互杂交。两种核酸序列是基本上相同的又一个指标是，可以将相同的引物用于扩增序列。

当就描述本发明PCSK9结合分子内抗原结合区如何连接而言使用时，术语“连接”包括物理连接该区域的全部可能方法。常常通过直接键合（即在两个抗原结合区之间没有接头）或者间接键合（即在两个或两个以上抗原结合区之间借助于至少一个接头分子）的化学键如共价键（例如，肽键或二硫键）或非共价键连接多个抗原结合区。

术语“受试者”、“患者”和“个体”可互换地指哺乳动物，例如人类或非人灵长类哺乳动物。哺乳动物还可以是实验室哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠。在一些实施方案中，哺乳动物可以是农业哺乳动物（例如，马、绵羊、牛、猪、骆驼（camelid））或者驯养哺乳动物（例如，犬、猫科动物）。

术语“可治疗用的量”或“治疗有效量”可互换地指足以实现期望结果（即，降低血浆中的非HDL-C、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、冠心病）的量。在一些实施方案中，可治疗用的量并不诱导或者导致不期望的副作用。可以通过首先施用低剂量，然后逐渐地增加剂量，直到实现期望的作用来确定可治疗用的量。本发明“预防有效量”和“治疗有效量”的PCSK9拮抗抗体可以分别预防与PCSK9的存在相关的疾病症状（例如，高胆固醇血症）的发病或者导致所述疾病症状的严重程度的降低。所述术语还可以分别促进或增加无疾病症状的频率和持续时间。“预防有效量”和“治疗有效量”还可以分别预防或减轻由于PCSK9活性导致的病症和疾病产生的损伤和残疾。

术语“共同施用”指在个体的血液中同时存在两种活性剂。可以同时或者顺次地递送共同施用的活性剂。

术语“抑制素”指一类药剂，其是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶的竞争性抑制剂。

附图简述

图1显示了亲本小鼠单克隆抗体MAB1的重链氨基酸序列（SEQ ID NO:1）和轻链氨基酸序列（SEQ ID NO:3）。CDR1、CDR2和CDR3的序列以下划线和加粗表示。

图2显示了Humaneered^TM抗体MAB2的重链氨基酸序列（SEQ ID NO:5）和轻链氨基酸序列（SEQ ID NO:7）。CDR1、CDR2和CDR3的序列以下划线和加粗表示。

图3显示了Humaneered^TM抗体MAB3的重链氨基酸序列（SEQ ID NO:9）和轻链氨基酸序列（SEQ ID NO:11）。CDR1、CDR2和CDR3的序列以下划线和加粗表示。

图4A-B显示了与MAB1相比，测试(A)MAB2和(B)MAB3与几种不同的人和小鼠抗原结合的ELISA测定。

图5A-C显示了MAB2和MAB3与(A)人Pcsk9和(B)食蟹猴Pcsk9的结合。(C)将数据拟合到Piehler，等人，（1997）J Immunol Methods201：189-206中所述的模型，并且从该拟合中计算Kd值。该图代表至少2次独立实验。

图6基于氘交换质谱，显示了有可能与氨基酸残基159-182（ERITPPRYRADEYQPPDGGSLVE；SEQ ID NO:42）内的表位结合的亲本小鼠单克隆抗体，MAB1。使用与Chalmers等人，Anal Chem2006，78，1005-1014中所述的相似设定和相似方式进行自动氢/氘交换质谱。简言之，将LEAP Technologies Pal HTS液体-处理器（LEAPTechnologies，Carrboro，NC）用于全部液体的处理操作。通过LEAP Shell中记录的自动化脚本控制液体-处理器，并放置于维持在2℃的冷藏罩中。将6孔进样阀和水洗工位安装在液体-处理器轨道上，并协助将样品注射到层析系统中以及洗涤注射器。对于在线消化，将酶柱（ABI固定化胃蛋白酶）放置在进样阀和捕获柱之间的线上。将由两个另外的阀门（15kPSIValco，Houston，TX）、4μL EXP Halo C18反相捕获筒（Optimize Technologies Inc.，Oregon City，OR）和分析柱（300μm ID，Halo2.7μm C18，MichromBioresources Inc.）组成的层析系统放置在单独的冷却罩中，所述冷却罩安装在LTQ-Orbitrap质谱仪（ThermoElectron Corp.）的前面。通过安装在罩顶部的peltier冷却器将放置层析系统的罩的温度维持在0℃。对于PCSK9的分析，在开始每一次实验之前，将含有样品、稀释剂、还原剂和淬灭剂的4个96孔板装载到液体-处理器中。每一次注射之前，将25μL的蛋白质溶液（～2mg/mL）与25μL的50mM TEA缓冲液（pH7.4）或者含～21μg13C10-FAB的25μL50mM TEA缓冲液（pH7.4）混合，并允许混合30分钟。为了起始交换反应，加入150μL的D₂O缓冲液（D₂0，150mMNaCl）或H₂0缓冲液（150mM NaCl），并允许交换1分钟。然后加入200uL的redux缓冲液（1M TCEP，8M尿素，pH4.0），并允许混合物反应～1分钟。然后用300uL的淬灭缓冲液（5%TFA）淬灭混合物，以将混合物的pH值降低至pH2.5。然后注射500uL的样品并且在线消化，通过如下所述的LC-MS捕获并分析得到的肽。层析系统使用两个单独的HPLC泵，以进行线内消化，将经消化的肽捕获到C18捕获柱上，并通过分析柱洗脱捕获的肽。以125μL/分钟的流速（0.05%TFA）运行的“装载”泵将样品从PAL进样阀试样环管（500μL）经胃蛋白酶柱转移到反相捕获筒中。在6分钟的上样步骤后，开启第一15kPSI阀，以允许液体从“梯度”泵流经捕获器（3分钟脱盐期（25μL/分钟））。脱盐步骤后，开启第二15kPSI阀，以协助肽从捕获器中洗脱并进入分析柱和质谱仪的离子源中。梯度泵（Waters Nano Acquity）以5μL/分钟递送0-40%梯度的移动相B，然后递送40-75%第二梯度的移动相B。梯度的总时间为75分钟。梯度泵缓冲液组合物为A：99.75:0.25%v/v（H₂0:甲酸）和B：99.75:0.25%v/v（乙腈:甲酸）。对于质谱，在LTQ-Orbitrap（ThermoElectron，San Jose，CA）上进行LC-ESI-MS。进行数据-依赖性MS/MS实验，以收集串联质谱，其用于鉴定通过蛋白酶解产生的肽的序列。对于这些获取，MS/MS在LTQ中获取，并且MS扫描在Orbitrap中获取。出于测定氘化水平的目的进行了获取，在Orbitrap（m/z400-2000以上）中，以60,000的分辨率获取。用于全部实验的仪器参数包括3.5kV的喷雾电压、1000ms的最大注射时间、靶向50,000离子的MS的LTQ AGC和靶向1,000,000离子的MS的FTMS AGC。使用内部程序（RawXtract），将Orbitrap.RAW文件转变成.mzXML文件。随后，将.mzXML文件转变成.mzBIN文件，使用SEQUEST（ThermoElectron）检索串联MS获取。使用肽序列鉴定，将内部编写的程序（Deutoronomy）用于对每一鉴定序列自动地提取层析谱，并产生平均谱。然后平滑化并矩心化平均谱，以测定氘吸收的水平。最初的自动处理后，人工验证或者使用Deutoronomy中构建的交互数据指示器校准每一平均谱的质量和矩心化（quality and centroiding）。使用基于bio-layer干涉法的表位竞争测定，发现Humaneered^TM抗体MAB2和MAB3与MAB1竞争相同的表位。

图7显示了如在时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）生物化学测定法中所测定，MAB2和MAB3能阻断PCSK9与LDL-R之间的相互作用。Pcsk9拮抗剂抗体与Pcsk9的结合可以破坏Pcsk9与LDLr形成复合体的能力，从而保护LDLr免于下调/降解，并增强LDL摄取。为了对Pcsk9拮抗剂抗体进行测试，将用荧光团标记的人PCSK9（hPCSK9-AF）和测定缓冲液（20mMHEPES，pH7.2、150mM NaCl，1mM CaCl₂、0.1%v/vTween20和0.1%w/v BSA）中的MAB2或MAB3一起室温温育30分钟。然后加入铕标记的LDL-R（hLDL-R-Eu），又在室温温育90分钟，以使终浓度为hPcsk9-AF8nM和hLDL-R-Eu1nM。使用酶标仪测量（EnVision2100，Perkin Elmer）TR-FRET信号（330nm激发光和665nm发射光），并计算Pcsk9抗体存在下的%抑制。通过在Prism（GraphPad）中对抑制百分比值作图来计算IC₅₀值。每一数据点表示为平均值±SD（n=每个点4次重复）。数据代表了至少两次独立的实验。Humaneered^TM抗体MAB2和MAB3能分别以20nM和28nM的IC₅₀值破坏复合体，这与发现的亲本抗体MAB177nM的IC₅₀是相当的（数据未显示）。

图8显示，对于导致增加的LDL-R水平和HepG2细胞对LDL-的摄取，Humaneered^TM抗体MAB2和MAB3与小鼠抗体MAB1是等同的。对于LDL-R测量，将细胞和结合PCSK9的抗体一起温育，并用抗LDL-R抗体标记所述细胞。对于LDL摄取，将细胞和结合PCSK9的抗体、PCSK9和DiI-LDL一起温育。通过流式细胞术测量LDL-R抗体和DiI-LDL荧光。MAB2和MAB3的图显示了重复测量的平均值±SEM。结果代表了2次独立的实验。

对于LDL-摄取测定，在含10%脂蛋白缺失的胎牛血清（Intracel）和200nM人PCSK9的DMEM中室温温育结合PCSK9的抗体30分钟（Hampton等人PNAS（2007）104：14604-14609），将抗体/PCSK9/培养基溶液加入到96-孔板中的细胞中，并培养过夜。第二天，加入1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青-高氯酸盐（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate）标记的LDL（DiI-LDL，BiomedicalTechnologies），另外温育2小时。然后吸去培养基，用PBS洗涤细胞三次，并用0.25%胰酶-EDTA分散细胞。然后将细胞转移到FACS缓冲液（含5%胎牛血清、2mM EDTA和0.2%叠氮化钠）中，1000×g离心10分钟，吸干，并固定于1%的多聚甲醛中。使用流式细胞仪（BectonDickinson LSR II），通过细胞DiI荧光（488nm的激发光和575nm的发射光）测量LDL摄取。对于表面LDL-R测定，用含抗体的无血清培养基培养细胞，用PBS洗涤，并收获于Versine（Biowhittaker，17-771E）和FACS缓冲液中。将细胞转移到新的平板中，在1200×rpm离心5分钟，并用正常的兔IgG（MP biomedicals）封闭。在FACS缓冲液中，用兔抗hLDL-R-Alexa647IgG（5μg/ml）标记的抗体标记细胞，离心、洗涤，并固定于1%的多聚甲醛中。通过流式细胞仪（488nm的激发光和633nm的发射光）测量表面LDL-R。使用Prism（GraphPad）计算EC50。

图9提供了用于测定本发明抗体的降低胆固醇效应的人PCSK9灌输小鼠模型的研究设计示意图。MAB2和MAB3是以高亲和力结合hPCSK9的Humaneered^TM抗PCSK9抗体（检测不到与鼠PCSK9的结合）。为了测试抗体是否能抑制hPCSK9介导的非HDL胆固醇的升高和防止PCSK9介导的肝LDL-R的降解，在含hPCSK9的渗透微型泵植入（用于连续输注）前3小时，将每一个抗体都注射到小鼠中。hPCSK9注射后的第24小时进行血浆和肝组织获取。

图10显示在灌输小鼠模型中，用抗体MAB2和MAB3进行的治疗导致了人PCSK9（“hPCSK9”）的积累。通过Meso Scale Discovery（MSD）测定法定量了血浆IgG和hPCSK9水平。对于IgG MSD测定法，使用MSD标准96板（L11XA-3）。简言之，在4℃，用25-28μl在PBS中的1μg/ml捕获抗原PCSK9-His过夜包被平板（25-28ng/孔）。弃去包被溶液，并用150μl/孔的MSD Blocker A（R93AA-2）在室温振荡封闭平板1小时。用PBS+0.05%Tween-20300μl洗涤平板3次后，加入25μl的IgG校准稀释液（用MSD blocker A从10,000-0.0003ng/ml进行的10个连续稀释）、未知血浆样品稀释液（用MSD blocker A稀释10,000倍）或质量控制样品，室温振荡温育1小时。洗涤后，加入25μl/孔的1μg/ml检测抗体（用1%BSA/PBS/0.05%Tween20稀释的MSD山羊抗小鼠SULFO-TAG标记的检测抗体，R32AC-5）（MSD山羊抗人SULFO-TAG标记的检测抗体，R32AJ-5）并室温振荡温育1小时。洗涤后，加入150μl/孔的1×读取缓冲液T，立即在MSD SECTOR Imager6000上读取平板。使用MSD数据分析软件计算标准曲线和未知样品的图。

通过Meso Scale Discovery（MSD）测定法定量血浆IgG水平。使用hPCSK9捕获，测量游离的抗体。该测定法测量“游离的”抗体，并且有可能测量1:1的Ab:PCSK9复合体。对于IgG MSD测定法，使用MSD标准96板（L11XA-3）。简言之，在4℃，用25-28μl在PBS中的1μg/ml捕获抗原PCSK9-His过夜包被平板（25-28ng/孔）。去除包被溶液，并用150μl/孔的MSDBlocker A（R93AA-2）在室温振荡封闭平板1小时。用PBS+0.05%Tween-20300μl洗涤平板3次后，加入25μl的IgG校准稀释液（用MSD blocker A从10,000-0.0003ng/ml进行的10个连续稀释）、未知血浆样品稀释液（用MSD blocker A稀释10,000倍）或质量控制样品，室温振荡温育1小时。洗涤后，加入25μl/孔的1μg/ml检测抗体（用1%BSA/PBS/0.05%Tween20稀释的MSD山羊抗小鼠SULFO-TAG标记的检测抗体，R32AC-5）并室温振荡温育1小时。洗涤后，加入150μl/孔的1×读取缓冲液T，立即在MSD SECTOR Imager6000上读取平板。使用MSD数据分析软件计算标准曲线和未知样品的图。

MSD hPCSK9测定法与IgG测定法相似，但具有以下不同。用1μg/ml的25-28μl捕获抗体（7D16.C3:2.95mg/ml）包被平板。封闭平板后，室温振荡温育25μl的hPCSK9校准稀释液（来自10,000-0.0003ng/ml的10个点）和血浆样品稀释液（用MSD blocker A2,000倍稀释）1小时，之后用一级检测抗体（兔抗PCSK9多克隆抗体，Ab4，内部Rabbit ID#RB11835）温育。加入第二检测抗体（MSD山羊抗小鼠SULFO-TAG标记的检测抗体，R32AC-5）以进行额外的温育步骤，之后用MSD SECTORImager6000读数。

图11显示在hPCSK9灌输小鼠模型中，抗体MAB2和MAB3导致血浆非HDL胆固醇的降低。预注射MAB2抗体导致52%的非HDL胆固醇免于hPCSK9介导的非HDL胆固醇升高。预注射MAB3导致了等量的非HDL胆固醇免于hPCSK9介导的非HDL胆固醇升高的保护。用仅载体、仅PCSK9、PCSK9+20mg/kg MAB2或PCSK9+20mg/kg MAB3处理C57BL/6小鼠。用标界为水平条的平均值显示各个值。为了定量血浆总胆固醇水平，使用Olympus临床用分析仪（OlympusAmerica Inc.：OlympusAU400）。在ddH2O中以1:3稀释血浆样品，并根据厂商说明定量40μl经稀释的血浆样品的总胆固醇水平。为了定量血浆HDL和非HDL，使用来自HelenaLaboratories的Spife3000获得脂蛋白胆固醇级分。按照操作手册提供的说明进行全部步骤，其包括样品制备、凝胶制备、点样、凝胶电泳、染色、洗涤和干燥。然后使用Slit5在QuickScan2000中扫描凝胶，并使用Helena光密度计计算脂蛋白胆固醇级分的相对百分比。最后，通过每一级分的百分比乘以总胆固醇水平，来计算HDL和非HDL的绝对值。

图12显示了与“典型的”IgG1（PK）谱相比，抗体MAB2和MAB3（沉默人IgG1）的大鼠药物代谢动力学（PK）谱。没有靶向介导配置（target mediated disposition）（TMD）的证据，表明抗体不与啮齿动物PCSK9交叉反应。对于每一测试抗体，以10mgs/kg注射3只雄性Lewis大鼠。在时间=0小时、1小时、6小时、24小时、2天、4天、8天和16天，取样250μl的血液，稀释澄清的血浆，并且在捕获ELISA（山羊抗人IgG）中评价所述血浆，以测量回收的总的人抗体。也产生每一测试抗体的标准曲线。相对于在大鼠中预期回收的典型人IgG，对回收的IgG的量作图。

发明详述

I.简介

本发明抗体和抗原结合分子特异地结合前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9a型（“PCSK9”）。本发明抗PCSK9抗体和抗原结合分子与PCSK9的催化结构域结合，并破坏PCSK9/低密度脂蛋白受体（LDL-R）复合体，从而防止PCSK9介导的细胞LDL-R的下调和LDL更新。特别地，抗PCSK9抗体和抗原结合分子与位于PCSK9的催化结构域中的PCSK9的残基159-182内的表位，例如氨基酸序列ERITPPRYRADEYQPPDGGSLVE（SEQ ID NO:42）内的表位结合。本发明抗PCSK9抗体和抗原结合分子是PCSK9的拮抗剂，这是因为它们防止、减弱和/或抑制PCSK9与低密度脂蛋白受体（LDLR）之间的相互作用，并防止、减少和/或抑制PCSK9介导的LDL-R的降解，从而协助增加低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的摄取。发现可将抗PCSK9抗体和抗原结合分子用于治疗患例如血脂异常、高胆固醇血症、甘油三酯血症和其他PCSK9介导的疾病的受试者。

Ⅱ.一般改进的抗PCSK9抗体

抗PCSK9抗体片段可以通过本领域已知的方法产生，所述方法包括但不限于重组表达、化学合成和抗体四聚体的酶消化产生，而全长单克隆抗体可以通过例如，杂交瘤或重组产生获得。可以在本领域已知的任意合适的宿主细胞中重组表达，所述宿主细胞是例如，哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。当存在时，抗PCSK9抗体的恒定区可以是任意类型或者亚型，根据需要，并且可以选自待用本发明方法治疗的受试者的物种（例如，人类、非人灵长类或其他哺乳动物，如农业用哺乳动物（例如，马、绵羊、牛、猪、骆驼）、驯养哺乳动物（例如，犬、猫科动物）或者啮齿动物（例如，大鼠、小鼠、仓鼠、兔））的恒定区。

在一些实施方案中，抗PCSK9抗体是人源化的或者Humaneered^TM。在一些实施方案中，恒定区同种型是IgG，例如IgG1。在一些实施方案中，人IgG1恒定区是突变的，以具有对效应子配体如Fc受体（FcR），例如细胞上的FcγR1或者补体的C1组分降低的结合亲和力。参见，例如美国专利No.5,624,821。含有此类突变的抗体介导的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）或者补体依赖性细胞毒性（CDC）降低或者无上述效应。在一些实施方案中，IgG1恒定区的氨基酸残基L234和L235被取代成Ala234和Ala235。重链恒定区中残基的编码为EU索引的编码（参见，Kabat，等人，（1983）“Sequences of Proteins of Immunological Interest，”U.S.Dept.Health and Human Services）。还参见，例如Woodle，等人，Transplantation（1999）68（5）：608-616；Xu，等人，Cell Immunol（2000）200（1）：16-26；和Hezareh，等人，JVirol75（24）：12161-8。

本发明抗PCSK9抗体或抗原结合分子还包括具有骆驼支架的单结构域抗原结合单位。骆驼家族的动物包括骆驼、骆马和羊驼。骆驼产生无轻链的功能性抗体。重链可变（VH）域自动折叠并独立地作为抗原结合单位发挥作用。与经典的抗原结合分子（Fab）或单链可变片段（scFv）中的六个CDR相比，骆驼抗体的结合表面仅包括三个CDR。骆驼抗体能保留与常规抗体的那些结合亲和力相当的结合亲和力。可以使用本领域熟知的方法，例如Dumoulin等人，Nature Struct.Biol.11：500–515，2002；Ghahroudi等人，FEBSLetters414：521–526，1997；和Bond等人，J MolBiol.332：643-55，2003，产生具有本文中所示例的抗PCSK9抗体的结合特异性的基于骆驼支架的抗PCSK9分子。

本发明改进的抗PCSK9抗体是经改造的具有V-区序列的人抗体，同时保留了参照抗体的特异性和亲和力，所述V-区序列与人种系V-区序列具有基本的氨基酸序列同一性。参见，美国专利公开No.2005/0255552和美国专利公开No.006/0134098，在此处将所述专利并入本文作为参考。改进方法包括，从参照抗体的可变区鉴定确定抗原结合特异性所需的最小序列信息，将该信息转移到人部分V-区基因序列的文库中，以产生人抗体V-区的表位-集中文库。可以将基于微生物的分泌系统用于表达文库的成员，因为例如使用菌落转移结合测定法（colony lift binding assay）可以针对抗原结合Fab，筛选抗体Fab片段和文库。参见，例如美国专利公开No.2007/0020685。可以进一步表征阳性克隆，以鉴定具有最高亲和力的那些克隆。得到的经改造的人Fab保留了亲本（参照抗PCSK9抗体）的结合特异性，通常与亲本抗体相比，所述经改造的人Fab具有相当的或者更高的抗原亲和力，并且与人种系抗体V-区相比，所述经改造的人Fab具有高度序列同一性的V-区。

通常通过重链CDR3（“CDRH3”）内的序列和轻链的CDR3（“CDRL3”）内的序列表示产生表位-集中文库所需要的最小结合特异性决定簇（BSD）。BSD可以包含CDR3的一部分或者全长。BSD可以包含连续的或者非连续的氨基酸残基。在一些情况下，从与来自参照抗体的独特CDR3-FR4区连接的人V-区段序列构建表位-集中文库，所述参照抗体含有BSD和人种系J-区段序列（参见，美国专利公开No.2005/0255552）。备选地，可以通过连续的盒替换产生人V-区段文库，其中最初用人序列的文库替换参照抗体V-区段的一部分。然后，在第二次文库筛选中重组在剩余的参照抗体氨基酸序列中支持结合的经鉴定的人类“盒”。（参见，美国专利公开No.2006/0134098）。

在每一种情况下，将含有来自参照抗体的特异性决定簇的经配对的重链和轻链CDR3区段、CDR3-FR4区段或J-区段用于限制结合特异性，以使从文库中获得的抗原结合子（binder）保留参照抗体的表位特异性。在文库构建期间，可以将其他成熟的改变引入到每一链的CDR3区中，以鉴定具有最佳结合动力学的抗体。得到的经改造的人抗体具有来源于人种系文库的V-区段序列，保留了来自CDR3区的短BSD序列，并具有人种系构架4（FR4）区。

因此，在一些实施方案中，抗PCSK9抗体含有来源于最初的或者参照单克隆抗体的重链和轻链的CDR3内的最小结合序列决定簇（BSD）。重链和轻链可变区（CDR和FR）的剩余序列，例如V-区段和J-区段来自相应的人种系和亲和力成熟的氨基酸序列。V-区段可以选自人V-区段文库。通过亲和力成熟可以实现其他序列的精制。

在另一个实施方案中，抗PCSK9抗体的重链和轻链含有来自相应的人种系序列（FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3），例如选自人V-区段文库的人V-区段，以及来自最初的单克隆抗体的CDR3-FR4序列区段。可以通过用相应的人种系序列替换序列区段和/或通过亲和力成熟来进一步精制CDR3-FR4序列区段。例如，可以用相应的人种系序列替换BSD周围的FR4和/或CDR4序列，而保留来自最初的单克隆抗体的CDR3的BSD。

在一些实施方案中，重链V-区段的相应人种系序列是VH22-05。在一些实施方案中，重链J-区段的相应人种系序列是JH1、JH4或JH5。根据免疫球蛋白可变区基因的标准命名法参考可变区基因。通过全球网，例如在ImMunoGeneTics（IMGT）、V-base和PubMed数据库上可得到当前的免疫球蛋白基因信息。还参见，Lefranc，Exp Clin Immunogenet.2001；18（2）：100-16；Lefranc，Exp Clin Immunogenet.2001；18（3）：161-74；Exp ClinImmunogenet.2001；18（4）：242-54；和Giudicelli,等人，NucleicAcids Res.2005年1月1日；33（数据库期号）：D256-61.。

在一些实施方案中，轻链V-区段的相应人种系序列是VK1O2或VK1O12。在一些实施方案中，轻链J-区段的相应人种系序列是JK2。

在一些实施方案中，重链V-区段与氨基酸序列Q(I/V)TLKESGPVLVKPT(E/Q)TLTLTCTVSGFSLSTSG(M/V)GVGWIRQPPGKALEWLADIWWDDNKYYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR（SEQ ID NO:27）具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在一些实施方案中，重链V-区段与氨基酸序列

QITLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLADIWWDDNKYYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR（SEQ ID NO:25）具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在一些实施方案中，重链V-区段与氨基酸序列QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTVSGFSLSTSGVGVGWIRQSPGKALEWLADIWWDDNKYYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR序列（SEQ ID NO:26）具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。

在一些实施方案中，轻链V-区段与氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRA(G/S)Q(R/S)I(N/S)(H/N)NLHWYQQKPDESPRLLINFASRLISGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC（SEQ ID NO:29）具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在一些实施方案中，重链V-区段与氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAGQRISHNLHWYQQKPDESPRLLINFASRLISGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC（SEQ ID NO:28）具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。

在一些实施方案中：

i)重链CDR3包含氨基酸序列ITTEGGFAY（SEQ ID NO:17）；并且

ii)轻链CDR3可变区包含氨基酸序列QQSNYWPLT（SEQ ID NO:24）。

在一些实施方案中，本发明抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含含有氨基酸序列TSG(M/V)GVG（SEQ ID NO:15）的CDR1；含有氨基酸序列DIWWDDNKYYNPSLKS（SEQ IDNO:16）的CDR2；和含有氨基酸序列ITTEGGFAY（SEQ ID NO:17）的CDR3。

在一些实施方案中，本发明抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含含有氨基酸序列RA(G/S)Q(R/S)I(N/S)(H/N)NLH（SEQ ID NO:20）的CDR1；含有氨基酸序列FASR(L/S)IS（SEQ ID NO:23）的CDR2；和含有氨基酸序列QQSNYWPLT（SEQ ID NO:24）的CDR3。

在一些实施方案中，重链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:32的FR1；含有氨基酸序列SEQ ID NO:33的FR2；含有氨基酸序列SEQ IDNO:34的FR3；和含有氨基酸序列SEQID NO:35的FR4。经鉴定的氨基酸序列可以具有一个或多个取代的氨基酸（例如，来自亲和力成熟）或者一个或两个经保守取代的氨基酸。

在一些实施方案中，轻链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:36的FR1；含有氨基酸序列SEQ ID NO:37的FR2；含有氨基酸序列SEQ ID NO:38的FR3；和含有氨基酸序列SEQID NO:39的FR4。经鉴定的氨基酸序列可以具有一个或多个经取代的氨基酸（例如，来自亲和力成熟）或者一个或两个保守取代的氨基酸。

在其全长上，本发明抗PCSK9抗体的可变区通常与相应的人种系可变区氨基酸序列具有至少约85%，例如至少约89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的整体可变区（例如，FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4）氨基酸序列同一性。例如，抗PCSK9抗体的重链与人种系可变区Vh22-05可以具有至少约85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性。抗PCSK9抗体的轻链与人种系可变区Vk1O2可以具有至少约85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，仅添加、缺失或者取代构架区内的氨基酸。在一些实施方案中，序列同一性不包括CD3。

在一些实施方案中，本发明抗PCSK9抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO:40的重链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性，且所述轻链可变区与SEQ ID NO:41的轻链可变区（即，共有序列）具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性。

在一些实施方案中，本发明抗PCSK9抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO:1的重链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性，且所述轻链可变区与SEQ ID NO:3（即小鼠MAB1）的轻链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性。

在一些实施方案中，本发明抗PCSK9抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO:5的重链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性，且所述轻链可变区与SEQ ID NO:7（即，MAB2）的轻链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性。

在一些实施方案中，本发明抗PCSK9抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO:9的重链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性，且所述轻链可变区与SEQ ID NO:11（即，MAB3）的轻链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性。

对于经鉴定的少于20个氨基酸长度的氨基酸序列，可以容许一个或两个保守氨基酸残基的取代，同时仍保留期望的特异性结合和/或拮抗剂活性。

本发明抗PCSK9抗体通常以低于约10^-8M或10^-9M，例如低于约10^-10M或10^-11M，在一些实施方案中低于约10^-12M或10^-13M的平衡解离常数（K_D）结合PCSK9。

可以任选地多聚化抗PCSK9抗体，并根据本发明方法使用抗PCSK9抗体。抗PCSK9抗体可以是全长四聚体抗体（即，具有两个轻链和两个重链）、单链抗体（例如，scFv）或者包含抗体片段，例如重链和轻链可变区（如，Fab'或其他类似片段）的分子，所述抗体片段形成一个或多个抗原结合位点并赋予PCSK9结合特异性。

本发明还提供了编码本文中所述抗体的多核苷酸，例如编码重链和轻链可变区或者包含如本文中所述的互补决定区的区段的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸序列是表达优化的，例如哺乳动物表达优化的或者在特定细胞类型中表达优化的。在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:46和SEQ ID NO:48的多核苷酸具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49的多核苷酸具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。

在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:2的多核苷酸具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:4（即，MAB1）的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。

在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与选自SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:46的多核苷酸具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与选自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:47（即，MAB2）的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。

在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与选自SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:48的多核苷酸具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与选自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:49（即，MAB3）的多核苷酸具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。

Ⅲ.鉴定抗PCSK9抗体的测定法

可以通过产生抗PCSK9抗体，然后测试每一抗体减弱或抑制PCSK9介导的事件，例如与LDLR结合、促进LDLR降解的能力，来鉴定拮抗剂抗体。可以在体外或者体内实施测定。示例性抗体与PCSK9结合，破坏PCSK9与LDLR形成的复合体，并减少或抑制PCSK9介导的LDLR的降解。

可以使用本领域已知的任何方法来测定抗体或抗原结合分子与PCSK9的结合，所述方法包括但不限于ELISA、Biacore和蛋白质印迹。

还可以使用本领域已知的任何方法测量PCSK9介导的LDLR降解。在一个实施方案中，使用灌输小鼠模型测定抗PCSK9抗体或抗原结合分子抑制LDLR降解的能力。将抗PCSK9抗体或抗原结合分子由静脉内输注（例如，3μg/小时）到小鼠中，测定肝脏膜制备物中LDLR的水平，并将其与接受了对照抗体（例如，与无关抗原结合的抗体）静脉内输注的小鼠的肝脏膜制备物中LDLR的水平比较。与接受了对照抗体的小鼠相比，接受了拮抗剂抗PCSK9抗体的小鼠具有可检测到的更高的LDLR水平，例如至少增加了10%、20%、50%、80%、100%。

还可以测试抗PCSK9拮抗剂抗体在降低LCL-C、非HDL-C和/或总胆固醇的血浆水平中的治疗功效。将抗PCSK9抗体或抗原结合分子由静脉内输注（3μg/小时）到哺乳动物（例如，小鼠、大鼠、非人灵长类动物、人类）中，测定LCL-C、非HDL-C和/或总胆固醇的血浆水平，并将其与来自治疗前的相同哺乳动物或者接受了对照抗体（例如，结合无关抗原的抗体）的静脉内输注的哺乳动物的LCL-C、非HDL-C和/或总胆固醇的血浆水平比较。与治疗前的哺乳动物或者接受了对照抗体的哺乳动物相比，接受了拮抗剂抗PCSK9抗体的哺乳动物具有可检测到的更低的LCL-C、非HDL-C和/或总胆固醇血浆水平，例如减少了10%、20%、50%、80%、100%。

Ⅳ.包含抗PCSK9抗体的组合物

本发明提供了包含与可药用载体配制在一起的本发明PCSK9抗体或抗原结合分子的药物组合物。组合物可以另外地含有适合于治疗或预防给定疾病的其他治疗剂。可药用载体增强或者稳定组合物，或者有助于组合物的制备。可药用载体包括在生理上相容的溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。

可以通过本领域已知的多种方法施用本发明药物组合物。取决于期望的结果来改变施用的途径和/或模式。优选的施用是静脉内、肌内、腹膜内或皮下或者邻近靶位点的施用。可药用载体应当适合于由静脉内、肌内、皮下、肠胃外、鼻内、吸入、脊柱或者经表皮施用（例如，通过注射或灌输）。取决于施用的途径，可以用材料涂布活性化合物，即抗体、双特异性和多特异性分子，以保护化合物免于酸和可能使化合物失活的其他天然条件的作用。

可以将抗体单独地或者与其他合适的组分组合制备成待通过吸入施用的气溶胶制剂（即它们是可“喷雾的“）。可以将气溶胶制剂放置于可加压推进剂，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。

在一些实施方案中，组合物是无菌的并且是液体。可以例如通过使用涂层如卵磷脂、在分散的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。在许多情况下，组合物中优选地包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇，以及氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝或明胶，可以导致可注射组合物的长期吸收。

可以根据本领域熟知的和常规实践的方法制备本发明的药物组合物。可药用载体部分地由施用的特定组合物，以及施用组合物所使用的特定方法决定。因此，存在本发明药物组合物的多种合适制剂。配制抗体和确定合适剂量和方案的适用方法可见于例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，University of theSciences in Philadelphia，Lippincott Williams&Wilkins(ed.)（2005）中；和Martindale：The Complete Drug Reference，Sweetman，2005，London:PharmaceuticalPress.中，以及Martindale，Martindal：The Extra Pharmacopoeia，第31版，1996，AmerPharmaceutical Assn，和Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson(ed.)，Marcel Dekker，Inc.，New York,1978中，由此将所述每一文献并入本文作为参考。药物组合物优选地在GMP条件下生产。通常，在本发明药物组合物中使用抗PCSK9抗体的治疗有效剂量。通过本领域技术人员已知的常规方法，将抗PCSK9抗体配制成可药用剂量形式。调整剂量方案，以提供期望的应答（例如，治疗应答）。在确定治疗有效剂量或预防有效剂量中，可以施用低剂量，然后逐渐地增加，直到在最小或无不期望的副作用的情况下实现期望的应答。例如，可以施用快速灌注剂、可以在一段时间施用几次分开的剂量或者可以如治疗情况的需求所指示，按比例降低或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外的组合物的特别益处是容易施用和剂量的一致性。如本文中所用，剂量单位形式指在物理上分离的单位，其适合作为用于待治疗受试者的单位剂量；每一单位含有计算的与所需药物载体相关的活性化合物的预定量，以产生期望的治疗作用。

可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得有效实现对特定患者、组合物和施用方式所希望的治疗反应的活性成分的实际剂量水平，而不会对患者有毒性。选择的剂量水平将取决于多种药物动力学因素，包括本发明使用的特定组合物或者其酯、盐或酰胺的活性、施用的途径、施用的时间、所使用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所使用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质、所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和既往病史，以及类似因素。

在一些实施方案中，药物组合物包含抗PCSK9抗体或抗原结合分子和第二试剂的混合物。例如，组合物可以包含本发明抗PCSK9抗体或抗原结合分子和已知对于降低胆固醇，包括LDL-C、非HDL-C和总胆固醇和/或升高HDL-C有益的试剂。

在具有本发明抗PCSK9拮抗剂抗体或抗原结合分子的混合物中包含的示例性第二试剂包括但不限于，HMG-CoA还原酶抑制剂（即，抑制素）、贝特类（例如，氯贝丁酯、吉非贝齐、非诺贝特、环丙贝特、苯扎贝特）、烟酸及其类似物、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸多价螯合剂（例如，考来烯胺、考来替泊、colesvelam）、回肠胆汁酸运输（IBAT）抑制剂、甲状腺激素模拟物（例如，化合物KB2115）、微粒体甘油三酯转移蛋白（MTP）抑制剂、双过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）α和γ激动剂、乙酰辅酶A:二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）抑制剂、乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶（ACAT）抑制剂、Niemann Pick C1-样1（NPC1-L1）抑制剂（例如，依泽替米贝）、ATP结合盒（ABC）蛋白G5或G8的激动剂、胆固醇酯转移蛋白（CETP）抑制剂、靶向PCSK9的抑制性核酸，以及靶向apoB100的抑制性核酸。降脂剂是本领域已知的，并且描述于例如Goodman和Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第11版，Brunton，Lazo和Parker(ed.)，McGraw-Hill（2006）；2009Physicians'Desk Reference(PDR)，例如，in the63rd（2008）Eds.，Thomson PDR中。

在本发明组合物中使用的其他降脂剂描述和/或综述于例如Chang,等人，CurrOpin Drug Disco Devel（2002）5（4）：562-70；Sudhop,等人，Drugs（2002）62（16）：2333-47；Bays和Stein，Expert Opin Pharmacother（2003）4（11）：1901-38；Kastelein，Int J ClinPract Suppl（2003）Mar（134）：45-50；Tomoda和Omura，Pharmacol Ther（2007）115（3）：375-89；Tenenbaum,等人，Adv Cardiol（2008）45：127-53；Tomkin，Diabetes Care（2008）31（2）：S241-S248；Lee，等人，J Microbiol Biotechnol（2008）18（11）：1785-8；Oh，等人，ArchPharm Res（2009）32（1）：43-7；Birch，等人，J Med Chem（2009）52（6）：1558-68；和Baxter和Webb，Nature Reviews Drug Discovery（2009）8：308-320中。

在一些实施方案中，将本发明抗PCSK9抗体或抗原结合分子与抑制素一起提供为混合物。示例性抑制素包括但不限于，托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。

在一些实施方案中，将本发明抗PCSK9抗体或抗原结合分子与诱导高胆固醇血症或甘油三酯血症的试剂一起提供为混合物。例如，第二药剂可以是蛋白酶抑制剂，如沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安普那韦、洛匹那韦、阿扎那韦、福沙那韦（Fosamprenavir）、替拉那韦、达芦那韦、阿巴卡韦-齐多夫定-拉米夫定（三协唯）。在一些实施方案中，第二药剂是他克莫司。

V.使用抗PCSK9抗体的方法

A.用抗PCSK9抗体进行治疗的病症

发现可将本发明抗PCSK9拮抗剂抗体和抗原结合分子用于治疗由PCSK9的活性或者过量活性介导的任何疾病。

例如，出于任何原因或病因学，具有或者处于发展成血脂异常或高胆固醇血症的个体可以受益于本发明抗PCSK9拮抗剂抗体和抗原结合分子。例如，个体可能具有家族性或者遗传性传递的纯合子型或杂合子型高胆固醇血症，其中存在有功能的LDL-R。例如，在Burnett和Hooper，Clin Biochem Rev（2008）29（1）：11-26中总结了与家族性或者遗传性遗传的高胆固醇血症相关的和/或引起家族性或者遗传性遗传的高胆固醇血症的基因突变。个体可能还具有其他疾病或者涉及有助于或增加发展成为血脂异常或高胆固醇血症风险的行为。例如，个体可能肥胖或者患糖尿病或者代谢综合征。个体可能是吸烟者，具有久坐的生活方式或者具有高胆固醇饮食。

对于降低、逆转、抑制或预防血脂异常、高胆固醇血症和餐后甘油三酯血症，靶向PCSK9是有用的。参见，例如Le May，等人，Arterioscler Thromb Vasc Biol（2009）29（5）：684-90；Seidah，Expert Opin Ther Targets（2009）13（1）：19-28；和Poirier，等人，J BiolChem（2009）PMID19635789。因此，发现可将本发明抗PCSK9拮抗剂抗体和抗原结合分子的施用用于需要其的个体中以降低、逆转、抑制或预防血脂异常、高胆固醇血症和餐后甘油三酯血症。

发现可将本发明抗PCSK9拮抗剂抗体和抗原结合分子用于需要其的个体中以减少或降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。个体可以具有持续升高的LDL-C水平。在一些实施方案中，个体具有持续高于80mg/dL，例如高于约90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190mg/dL或者以上的LDL-C血浆水平。发现还可以将本发明抗PCSK9拮抗剂抗体和抗原结合分子用于需要其的个体中以减少或降低非-高密度脂蛋白胆固醇（非-HDL-C）或总胆固醇。

个体可能已经服用了另一种降低胆固醇的药剂，并对该药剂具有抗性或者不耐受性。例如，个体可能已经接受了抑制素的治疗方案，已经证实所述方案不能有效地将该个体中的LDL-C、非-HDL-C或总胆固醇降低到可接受水平。个体可能还不耐受抑制素的施用。将本发明抗PCSK9拮抗剂抗体和抗原结合分子与用于降低LDL-C或非-HDL-C和/或提高HDL-C的第二试剂组合施用，例如通过允许降低待施用的第二试剂的剂量，来改进第二试剂的有效性和耐受性。

在一些实施方案中，个体具有PCSK9基因中的功能获得型突变，例如这导致了LDLR降解的异常增加。

在一些实施方案中，个体接受了诱导血脂异常或高胆固醇血症的药剂，即个体具有药物诱导的血脂异常或高胆固醇血症。例如，个体可能接受了蛋白酶抑制剂的治疗方案，例如用于治疗HIV感染。已知引起血浆甘油三酯升高的另一药剂是他克莫司，其是给移植患者施用的免疫抑制药物。已经显示，环孢菌素可以显著增加LDL。参见，例如Ballantyne，等人（1996）78（5）：532-5。第二代抗精神病药物（例如，阿立哌唑、氯氮平、奥氮平、喹硫平、利培酮和齐拉西酮）也与血脂异常相关。参见，例如Henderson，J Clin Psychiatry（2008）69（2）：e04和Brooks，等人，Curr Psychiatry Rep（2009）11（1）：33-40。

B.抗PCSK9抗体的施用

医师或兽医可以以低于实现期望的治疗效果所需的水平，并逐渐增加剂量直到实现期望效果而开始在药物组合物中应用本发明抗体的剂量。总之，取决于许多不同的因素来改变本发明组合物的有效剂量，所述因素包括待治疗的特定疾病或病症、施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人类还是动物、施用的其他药物，以及治疗是预防性的还是治疗性的。需要滴定治疗剂量，以优化安全性和有效性。对于抗体的施用，剂量为宿主体重的约0.0001-100mg/kg和更通常地0.01-5mg/kg。例如，剂量可以是每kg体重1mg或者每kg体重10mg，或者1-10mg/kg的范围内。根据需要或期望，可以每日、每周、每两周、每月或者更频繁或更不频繁地施用剂量。示例性治疗方案需要每周施用一次、每两周施用一次或者每月施用一次或者每3-6月施用一次。

在一些实施方案中，施用编码本发明抗PCSK9抗体和抗原结合分子的多核苷酸。在试剂是核酸的实施方案中，一般的剂量可以为每kg体重约0.1mg至（并包括）每kg体重约100mg，例如每kg体重约1mg至每kg体重约50mg。在一些实施方案中，所述剂量为每kg体重约1、2、3、4、5、10、15、20、30、40或50mg。

抗体可以以单个的或者分开的剂量施用。通常在多个时间施用抗体。根据需要或根据期望，单个剂量之间的间隔可以是每周、每两周、每月或每年。如根据测量的患者中的抗PCSK9抗体的血液水平所指示，间隔还可以是无规律的。在一些方法中，可以调整剂量，以实现1–1000μg/ml，以及在一些方法中25-300μg/ml的血浆抗体浓度。备选地，可以将抗体施用为缓释制剂，在这种情况下需要较低频率的施用。取决于患者中抗体的半寿期，来改变剂量和频率。总之，人源化抗体显示的半寿期比嵌合抗体和非人抗体显示的半寿期长。取决于治疗是预防性的还是治疗性的，可以改变施用的剂量和频率。在预防性应用中，以相对低频率的间隔，长期施用相对低的剂量。一些患者终身继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量，直到疾病的进程减缓或终止，并且优选地直到患者表现出疾病症状的部分或完全改善。之后，可以给患者施用预防性方案。在一些实施方案中，当患者中血浆LDL-C水平超出预定的阈值水平，例如至少约80mg/dL，如至少约90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190mg/dL或者更高时，施用抗PCSK9抗体或抗原结合剂。

C.与第二试剂共同施用

可以将PCSK9抗体拮抗剂与已知有益于降低胆固醇，包括LDL-C、非-HDL-C和总胆固醇和/或升高HDL-C的试剂组合使用。

可以将活性剂与抗PCSK9拮抗剂抗体混合一起施用，或者可以单独地施用每一种试剂。可以但无需同时施用抗体剂和其他活性剂。

用于与本发明抗PCSK9拮抗剂抗体或抗原结合分子共同施用的示例性第二试剂包括但不限于，HMG-CoA还原酶抑制剂（即，抑制素）、贝特类（例如，氯贝丁酯、吉非贝齐、非诺贝特、环丙贝特、苯扎贝特）、烟酸及其类似物、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸多价螯合剂（例如，考来烯胺、考来替泊、colesvelam）、回肠胆汁酸运输（IBAT）抑制剂、甲状腺激素模拟物（例如，化合物KB2115）、微粒体甘油三酯转移蛋白（MTP）抑制剂、双过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）α和γ激动剂、乙酰辅酶A:二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）抑制剂、乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶（ACAT）抑制剂、Niemann Pick C1-样1（NPC1-L1）抑制剂（例如，依泽替米贝）、ATP结合盒（ABC）蛋白G5或G8的激动剂、胆固醇酯转移蛋白（CETP）抑制剂、靶向PCSK9的抑制性核酸，以及靶向apoB100的抑制性核酸。

使用的其他降脂剂描述和/或综述于例如Chang,等人，Curr Opin DrugDiscoDevel（2002）5（4）：562-70；Sudhop,等人，Drugs（2002）62（16）：2333-47；Bays和Stein，Expert Opin Pharmacother（2003）4（11）：1901-38；Kastelein，Int J Clin Pract Suppl（2003）Mar（134）：45-50；Tomoda和Omura，Pharmacol Ther（2007）115（3）：375-89；Tenenbaum,等人，Adv Cardiol（2008）45：127-53；Tomkin，Diabetes Care（2008）31（2）：S241-S248；Lee，等人，J Microbiol Biotechnol（2008）18（11）：1785-8；Oh，等人，ArchPharm Res（2009）32（1）：43-7；Birch，等人，J MedChem（2009）52（6）：1558-68；和Baxter和Webb，Nature Reviews DrugDiscovery（2009）8：308-320中。

在一些实施方案中，将本发明抗PCSK9抗体或抗原结合分子与抑制素共同施用。示例性抑制素包括但不限于，托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。

在一些实施方案中，将本发明抗PCSK9抗体或抗原结合分子与诱导高胆固醇血症或甘油三酯血症的药剂共同施用。例如，第二药剂可以是蛋白酶抑制剂，如沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安普那韦、洛匹那韦、阿扎那韦、福沙那韦、替拉那韦、达芦那韦、阿巴卡韦-齐多夫定-拉米夫定（三协唯）。在一些实施方案中，第二药剂是他克莫司。

在一些实施方案中，将本发明抗PCSK9抗体或抗原结合分子与特异地靶向PCSK9或apoB100的抑制性核酸（例如，siRNA、miRNA、反义序列、核酶）共同施用。

Ⅵ.试剂盒

可以在试剂盒中提供本发明药物组合物。在某些实施方案中，本发明试剂盒包含如本文中所述的本发明抗PCSK9拮抗剂抗体或抗原结合分子。可以以一致的或不同的剂量提供抗PCSK9抗体或抗原结合分子。

在一些实施方案中，试剂盒包含如本文中所述的一个或多种第二药剂。可以在与抗PCSK9拮抗剂抗体或抗原结合分子相同的制剂或者分离的试剂中提供第二药剂。第一和第二试剂的剂量可以是独立统一的或者不同的。

在一些实施方案中，试剂盒包含PCSK9抗体拮抗剂和已知有益于降低胆固醇，包括LDL-C、非-HDL-C和总胆固醇和/或升高HDL-C的一种或多种试剂。

与本发明抗PCSK9拮抗剂抗体或抗原结合分子一起包含于试剂盒中的示例性第二试剂包括但不限于，HMG-CoA还原酶抑制剂（即，抑制素）、贝特类（例如，氯贝丁酯、吉非贝齐、非诺贝特、环丙贝特、苯扎贝特）、烟酸及其类似物、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸多价螯合剂（例如，考来烯胺、考来替泊、colesvelam）、回肠胆汁酸运输（IBAT）抑制剂、甲状腺激素模拟物（例如，化合物KB2115）、微粒体甘油三酯转移蛋白（MTP）抑制剂、双过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）α和γ激动剂、乙酰辅酶A:二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）抑制剂、乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶（ACAT）抑制剂、Niemann Pick C1-样1（NPC1-L1）抑制剂（例如，依泽替米贝）、ATP结合盒（ABC）蛋白G5或G8的激动剂、胆固醇酯转移蛋白（CETP）抑制剂、靶向PCSK9的抑制性核酸，以及靶向apoB100的抑制性核酸。

在试剂盒中使用的其他降脂剂描述和/或综述于例如Chang,等人，CurrOpin DrugDisco Devel（2002）5（4）：562-70；Sudhop,等人，Drugs（2002）62（16）：2333-47；Bays和Stein，Expert Opin Pharmacother（2003）4（11）：1901-38；Kastelein，Int J Clin PractSuppl（2003）Mar（134）：45-50；Tomoda和Omura，Pharmacol Ther（2007）115（3）：375-89；Tenenbaum,等人，Adv Cardiol（2008）45：127-53；Tomkin，Diabetes Care（2008）31（2）：S241-S248；Lee，等人，J Microbiol Biotechnol（2008）18（11）：1785-8；Oh，等人，ArchPharm Res（2009）32（1）：43-7；Birch，等人，J Med Chem（2009）52（6）：1558-68；和Baxter和Webb，Nature Reviews Drug Discovery（2009）8：308-320中。

在一些实施方案中，在试剂盒中提供本发明抗PCSK9抗体或抗原结合分子与抑制素。示例性抑制素包括但不限于，托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。

在一些实施方案中，在试剂盒中提供本发明抗PCSK9抗体或抗原结合分子与诱导高胆固醇血症或甘油三酯血症的药剂。例如，第二药剂可以是蛋白酶抑制剂，如沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安普那韦、洛匹那韦、阿扎那韦、福沙那韦、替拉那韦、达芦那韦、阿巴卡韦-齐多夫定-拉米夫定（三协唯）。在一些实施方案中，第二药剂是他克莫司。

实施例

提供以下实施例以说明但并非限制要求专利保护的发明。

实施例1：PCSK9拮抗剂MAB1的产生和鉴定

概述

进行研究，以产生针对Pcsk9的功能性抗体拮抗剂。鉴定了多个杂交瘤，其分泌能与His-标签化形式的蛋白质结合的抗体。如通过测量抗体抑制Pcsk9介导的HepG2细胞上的LDL受体降解的能力（导致这些细胞摄取LDL胆固醇的能力增加），评价了来自杂交瘤的抗体的功能性拮抗剂活性。鉴定了有效的功能性鼠抗人Pcsk9IgG1-κ单克隆抗体，并称作MAB1。

方法

抗原和其他蛋白质

通过转染HEK293Freestyle^TM细胞（Invitrogen，Carlsbad，Ca）产生分泌人Pcsk9蛋白的稳定表达细胞系。简言之，使用Lipofectamine2000^TM转染试剂将以mellittin信号序列、成熟Pcsk9cDNA（aa31-692）和序列C端处的his6标签为特征的重组质粒（由E.Hampton，GNF，NPL010051克隆）转染到培养于添加了10%胎牛血清的培养基（Invitrogen）的细胞中，所述细胞以粘附模式存在于BioCoat烧瓶（Becton Dickinson）上。转染后48小时，将100μg/mL Zeocin加入到培养基中，从而开始阳性转染子的选择。4周后，出现了产生Pcsk9的细胞的4个稳定细胞库。使库4（最高的生产者）适应Freestyle^TM培养基中的无血清悬浮条件，随后使用Wave^TM生物反应器，以10-20L生产体积的规模扩大，用于大规模生产。

在一段时间进行了几轮试验，得到了以12至30mg/L之间的比率产生的重组蛋白质。收获细胞上清液，并通过交叉流过滤浓缩。将得到的浓缩物以0.5mL/分钟应用于25mLNiNTA His-Bind Superflow柱（用50mM Tris/300mM NaCl/1mM CaCl₂/2mMβ-巯基乙醇，pH7.4平衡）。用50mM Tris/300mM NaCl/20mM咪唑，pH7.4进行基线洗涤后，用50mM Tris/300mM NaCl/250mM咪唑，pH7.4洗脱结合的物质。将得到的洗脱物对PBS，pH7.3透析，无菌过滤并且等分。通过测定寡聚化的分析型大小排阻层析分析样品。由HPLC层析获得的纯化蛋白质显示出两个峰，主峰占85%。全长蛋白质的HPLC-ESI MS分析显示了58176.0Da的质量，其是来自具有全部半胱氨酸残基均氧化的mellitinmellitin-hsPcsk9aa31-692-His的预期质量。部分样品是另外N-糖基化的。大约13kD质量的污染蛋白质类似于（最可能是）该蛋白质的游离的前域结构域（pro-domain）。再次使用在Freestyle培养基中以无血清悬浮培养的HEK293Freestyle细胞，以大规模瞬时表达方法产生来自小鼠、大鼠和食蟹猴的Pcsk9的相应同源物。使用聚乙稀亚胺（作为质粒DNA的载体），以1:3的比例（μg/mL:μg/mL DNA:PEI），将重组质粒小鼠/大鼠Pcsk9cDNA和食蟹猴Pcsk9转染到Freestyle细胞中，所述小鼠/大鼠Pcsk9cDNA以天然前导序列和C端的his6-标签为特征，所述食蟹猴Pcsk9以CD33前导序列和C端的his6-标签为特征。在Wave^TM生物反应器中，以10升规模实施生产试验；类似于上述用于人Pcsk9蛋白的方案进行蛋白质纯化和表征。

筛选分泌PCSK9的功能抗体的杂交瘤

产生杂交瘤，并在融合后第10天，针对Pcsk9特异性抗体的存在筛选杂交瘤平板。对于ELISA筛选，用50μL的Pcsk9（在PBS中稀释成15ng/孔）包被Maxisorp384-孔板（Nunc#464718），并在4℃温育过夜。吸出剩余的蛋白质，并用PBS中的1%BSA封闭孔。室温温育30分钟后，用PBS+0.05%Tween（PBST）洗涤孔四次。将15μL的杂交瘤上清液转移到ELISA板中。在PBS中将在去除PLN时取得的15μL小鼠血清1:1000稀释，并作为阳性对照加入。将50μL的第二抗体（在PBS中1:5000稀释的山羊抗鼠IgG–HRP（Jackson Immuno Research#115-035-071））加入到ELISA平板的全部孔中。室温温育1小时后，用PBST洗涤平板8次。加入25μL的TMB（KPL#50-76-05），在室温温育30分钟后，在605nm的吸光度读取平板。在HT培养基（DMEM+20%FBS，Pen/Strep/Glu，1×NEAA，1×HT，0.5×HFCS）中，将来自阳性孔的细胞扩大至24孔板。

抗体纯化

使用G蛋白（Upstate#16-266（Billerica，MA））纯化含MAB1的上清液。装载上清液之前，用10个柱体积的PBS平衡树脂。结合样品后，用10个柱体积的PBS洗涤柱子，然后用5个柱体积的0.1M甘氨酸，pH2.0洗脱抗体。立即用1/10体积的Tris HCl，pH9.0中和柱级分。测量级分的OD280，汇集阳性级分并对PBS，pH7.2透析过夜。

通过溶液平衡滴定进行的亲和力测定

制备连续稀释的Pcsk9，并将抗体加入到每一抗原浓度中，以达到100pM的恒定抗体浓度。将100μL/孔的每一稀释混合物一式两份分配到96-孔聚丙烯微量滴定板（Greiner）中。密封平板，并室温温育过夜。用25μLPBS中稀释的1μg/mL Pcsk9包被96-孔标准结合（Standard Bind）微量滴定板（Meso Scale Discovery）。密封该平板，并在4℃温育过夜。温育后，用每孔200μL的PBS/0.05%（w/v）Tween20洗涤经抗原包被的标准结合微量滴定板3次。然后，用每孔150μL的PBS/5%（w/v）BSA封闭平板，室温振荡温育1小时。重复洗涤步骤，并将25μL/孔抗体-抗原制备物从聚丙烯微量滴定板转移到经抗原包被的标准结合平板中。室温振荡温育标准结合平板60分钟。3次额外的洗涤步骤后，将25μL在PBS/1%（w/v）BSA/0.05%（w/v）Tween20缓冲液中稀释的1μg/mL的经Sulfo-Tag-标记的山羊抗鼠检测抗体（R32AC-5，Meso Scale Discovery）加入到每孔中，室温振荡温育1小时。洗涤平板3次后，将150μL的2×Read Buffer（R92TC-1，Meso Scale Discovery）转移到每孔中。产生电化学发光信号，并通过Sector Imager6000（Meso Scale Discovery）检测该信号。输出电化学发光数据，使用prism软件和以下等式处理所述数据：

$y=\frac{\left[B_0\right]}{2}-\frac{{[\frac{\left[B_0\right]+\left[A_0\right]+\frac{1}{K_d}}{2}-\sqrt{\frac{{\left(\right[B_0]+[A_0]+\frac{1}{K_d})}^2}{4}-\left[B_0\right]\left[A_0\right]}]}^2}{2\left[B_0\right]}$

TR-FRET测定

在384-孔白色、浅层平板（Perkin Elmer，6008280）中进行TR-FRET测定。在15μL的测定缓冲液（20mM HEPES,pH7.2、150mM NaCl、1mM CaCl₂、0.1%v/v Tween20和0.1%w/vBSA）中，将hPcsk9-AF（10.7nM）与连续稀释的未标记的hPcsk9蛋白以及MAB1、MAB2或MAB3抗体一起室温温育30分钟。然后将在测定缓冲液中的5μL hLDL-R-Eu（4nM）加入到hPcsk9和抗体的预温育复合体中，并室温温育90分钟。这些经标记的蛋白质的终浓度为hPcsk9-AF8nM、hLDL-R-Eu1nM。在330nm激发光和665nm发射光处，用EnVision2100多标记读取读数器（Perkin Elmer）测量TR-FRET信号。使用以下公式：[(665nm值×10,000)/(615nm值)]，将数据转变成归一化的值。使用以下公式：100-[(处理样品的归一化值/未处理样品的平均归一化值)×100]计算抑制百分比。使用Prism版本5（GraphPad Prism Software）用公式Y=底部+(上部-底部)/(1+10^((LogIC50-X)×HillSlope))进行抑制剂量应答百分比曲线的作图。

LDL-R周转测定（LDL-R turnover assay）

胰酶消化HepG2细胞，并以每孔6x10⁴个细胞接种于用1%v/v胶原预包被的平底96-孔板（Corning，3595）中的100μL培养基中，然后在37℃在5%CO₂中培养24小时。通常，用100μL含hPcsk9蛋白和MAB1、MAB2或MAB3抗体的无血清培养基处理细胞。处理后，弃去培养基，并用100μL的PBS洗涤细胞。为了收获细胞，加入100μL的Versine（Biowhittaker，17-771E），在37℃在5%CO₂中温育1小时，然后加入100μL的FACS缓冲液。将细胞转移到V-底96-孔板（Corning，3894）中，在1200转/分钟离心5分钟，以沉淀细胞。为了封闭细胞上的非特异的结合位点，将50μLFACS缓冲液中的100μg/mL正常兔IgG（MP biomedicals，55944）和小鼠IgG（Sigma，I5381）加入到每孔中，并在冰上温育30分钟。在1200转/分钟离心细胞5分钟，并通过轻拍平板去除缓冲液。为了标记细胞，将在FACS缓冲液中的经10μL兔抗hLDL-R-Alexa647IgG（5μg/mL）标记和经10μL小鼠抗转铁蛋白-R-藻红蛋白（PE）IgG（2μg/mL）（CD71，Becton Dickinson Biosciences，624048）标记的抗体加入到每孔中，并在冰上温育60分钟。在1200转/分钟离心细胞5分钟，并通过轻拍平板去除缓冲液。通过用每孔200μL的FACS缓冲液洗涤细胞两次，来去除未结合的抗体。将细胞固定在PBS中的1%多聚甲醛中，使用BDLSR II流式细胞仪和FACSDIVA软件（Becton Dickinson）门控存活细胞（5000）并分析。在488nm的激发光和575nm发射光处测量PE荧光的中值。在488nm的激发光和633nm发射光处测量Alexa647荧光的中值。通过Covance（Denver，PA，美国）定制了兔抗Hldl-R多克隆IgG583，以用于HepG2细胞上的表面hLDL-R的FACS检测。与正常兔IgG相比，对于检测HepG2细胞表面上的hLDL-R，兔抗hLDL-R IgG583表现出大约7倍的窗口（window）。为了测定抗hLDL-RIgG583对HepG2细胞表面上的LDL-R的特异性，将hLDL-R蛋白用作该IgG结合的竞争者，进行了实验。随着hLDL-R蛋白浓度的增加，观察到了抗hLDL-R IgG583针对HepG2细胞的平均中间荧光的剂量依赖性降低。这表明，如通过FACS所测量，抗hLDL-R IgG583特异地识别HepG2细胞表面上的LDL-R。进一步的工作使用直接标记的抗hLDL-R-583-Alexa647IgG，用于HepG2细胞表面上的LDL-R的FACS定量。

LDL-C摄取

胰酶消化HepG2细胞，并以每孔6x10⁴个细胞接种于平底96-孔板（Corning，3595，所述板用1%v/v胶原预包被）中的100μL培养基中，然后在37℃在5%CO₂中培养24小时。除非另外指出，用100μL含hPcsk9蛋白和MAB1、MAB2或MAB3抗体的无血清培养基处理细胞。处理后，每孔接受20μL无血清培养基中的30μg/mL3,3'-双十八烷基吲哚羰花青标记的低密度脂蛋白（DiI-LDL）（Intracell，RP-077-175），并在37℃在5%CO₂中培养2小时。通过轻拍平板去除培养基，并用100μL的磷酸缓冲盐水（无钙或镁的PBS，Invitrogen，14190-144）洗涤细胞。通过轻拍平板去除PBS，将100μL的0.25%胰酶-EDTA加入到每孔中，并在37℃在5%CO₂中温育5分钟。将100μL的FACS缓冲液（含5%FBS、2mM EDTA和0.2%叠氮化钠的PBS）加入到每孔中，通过在1200转/分钟离心5分钟沉淀细胞。通过轻拍平板弃去培养基，每孔加入50μL PBS中的1%多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，15710）以固定细胞。使用BD LSR II流式细胞仪和FACSDIVA软件（Becton Dickinson）门控存活细胞（5000）并分析。在488nm的激发光和575nm发射光处测量DiI-LDL荧光的中值，并分析5000个细胞。使用Microsoft Excel2002（Microsoft Corporation）产生条形图。活性百分比计算如下：%活性=[1-(X÷A)]×100，其中X=从样品孔读取的中间荧光，并且A=从仅用hPcsk9处理的孔读取的中间荧光。

相对于处理对活性百分比作图，以确定通过使用等式Y=底部+(上部-底部)/(1+10^((LogIC50-X)×HillSlope))和GraphPad Prism5（GraphPad软件）产生的剂量应答曲线的EC50。

结果

抗人Pcsk9单克隆抗体的产生

从用Pcsk9蛋白免疫的动物的原发淋巴结中获取B细胞。使用标准的PEG介导的融合产生杂交瘤。通过ELISA测定得到的融合，鉴定人Pcsk9的阳性结合子并扩大以产生上清液。鉴定了潜在的功能性鼠抗人Pcsk9IgG1-κ单克隆抗体，并称作MAB1。

筛选MAB1对Pcsk9的结合特异性

通过评价与一系列其他蛋白质在ELISA中的结合，来检查MAB1特异性。将MAB1与其他六种蛋白质的结合同与Pcsk9-HIS的结合比较。这显示与Pcsk9的结合是特异性的，并且抗体不结合HIS标签。

评价MAB1与食蟹猴Pcsk9的结合

测定了MAB1与食蟹猴的Pcsk9同源物的结合。对于该测定，使用表达食蟹猴HIS标记的Pcsk9的细胞的上清液和Ni捕获平板，以避免需要纯化物质。稀释人Pcsk9，且也通过HIS标签捕获。MAB1能与人Pcsk9和食蟹猴Pcsk9结合。

MAB1的结合动力学

通过使用溶液平衡滴定（SET）分析了识别人Pcsk9蛋白的小鼠抗体MAB1的结合亲和力。发现，MAB1以高亲和力与重组人Pcsk9结合，具有亚纳摩尔（sub-nanomolar）的亲和力（K_d=270pM）。

针对封闭Pcsk9LDL-R相互作用，筛选MAB1

将TR-FRET测定法用于测定抗hPcsk9抗体MAB1是否会破坏经标记的hPcsk9-AF蛋白和hLDL-R-Eu蛋白之间的相互作用。评估了未经标记的hPcsk9蛋白或EGF-A肽，以显示该测定法能检测由于经标记的hPcsk9-AF蛋白和hLDL-R-Eu蛋白之间的相互作用而导致产生的TR-FRET信号的破坏。增加浓度的未经标记hPcsk9与hPcsk9-AF竞争对hLDL-R-Eu的结合，这导致了TR-FRET信号的减弱。EGF-A肽以2.5μM的IC50破坏hLDL-R-Eu与hPcsk9-AF之间的相互作用。MAB1破坏hPcsk9-Eu与hLDL-R-AF之间的TR-FRET信号，IC50=77nM。

针对抑制Pcsk9介导的LDL-R降解，筛选MAB1

已经显示，csk9与LDL-R的结合导致了LDL-R降解，并且这通过使用HepG2细胞和重组人Pcsk9进行了证实。测定了MAB1结合Pcsk9并阻断该作用的能力。在经外源性hPcsk9处理的HepG2细胞中，MAB1已知抑制该作用，并导致细胞表面LDL-R的增加。

针对抑制Pcsk9和恢复LDL摄取，筛选MAB1

抑制Pcsk9介导的LDL-R的降解应当恢复HepG2细胞内化LDL-C的能力。在用外源性hPcsk9处理的HepG2细胞上，MAB1防止了Pcsk9介导的LDL-R降解，并导致DiI-LDL的摄取以194nM的EC50增加。

实施例2：PCSK9拮抗剂抗体MAB2和MAB3的产生

概述

该实施例通过改造鼠单克隆PCSK9拮抗剂抗体MAB1产生了人抗体MAB2和MAB3，以与人种系抗体具有更高的序列同源性。MAB2和MAB3保留了亲本鼠抗体的表位特异性、亲和力，以及食蟹猴（cynomolgusmacaque）PCSK9交叉反应。与原始的鼠抗体相比，MAB2和MAB3与人种系序列具有更高的同源性，因此应当更好地耐受人免疫系统。

将鼠单克隆抗体MAB1进行Humaneered^TM，以使其蛋白质序列与人种系序列更接近，并降低其免疫原性。通过South San Francisco的KaloBios（在kalobios.com的全球网上）可得到Humaneering^TM技术。抗体的Humaneering^TM产生了改造的具有V-区序列的人抗体，其与人种系序列具有高同源性，同时仍保留了亲本或参照抗体的特异性和亲和力（美国Patent Publ.2005/0255552和2006/0134098）。该方法首先鉴定了参照Fab的重链和轻链可变区中最小的抗原结合特异性决定簇（BSD）（通常为重链CDR3和轻链CDR3内的序列）。因为在Humaneering^TM方法中构建的全部文库中都维持着这些重链和轻链BSD，所以每一文库都是表位集中的，并且最终，完全Humaneered^TM抗体保留了原始鼠抗体的表位特异性。

接下来，产生全部的链文库（其中用人序列的文库替换了整个轻链或重链可变区）和/或盒文库（其中用人序列的文库替换了小鼠Fab的重链或轻链可变区的一部分）。将细菌分泌系统用于将文库成员表达为抗体Fab片段，并且使用菌落转移结合测定法（CLBA），针对结合抗原的Fab筛选文库。进一步表征阳性克隆，以鉴定具有最高亲和力的那些克隆。然后在剩余鼠序列的背景下，在最终的文库筛选中组合经鉴定的支持结合的人类盒，以完全产生人V-区。

得到的Humaneered^TMFab具有从人类文库衍生的V-区段序列，保留了在CDR3区内鉴定的短BSD序列，并且具有人种系构架4区。通过将重链和轻链的可变区克隆到IgG表达载体中，来将这些Fab转变成完全IgG。在该方法中产生的完全Humaneered^TM抗体保留了亲本抗体、鼠抗体的结合特异性，通常具有与亲本抗体等同的或者比亲本抗体更高的抗原亲和力，并且在蛋白质水平与人种系抗体基因相比，所述Humaneered^TM抗体具有高度序列同一性的V-区。

方法

鼠V-区的克隆

使用标准方法，通过RT-PCR分离自杂交瘤细胞系的RNA，来扩增鼠单克隆MAB1的V-区DNA。成功用于从杂交瘤cDNA PCR扩增重链可变区的引物为V_H8（5'-GTCCCTGCATATGTCYT-3'；SEQ ID NO:50）（Chardes T，等人1999）和HCconstant

（5'-GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC-3'；SEQ ID NO:51）。成功用于从杂交瘤cDNA PCR扩增轻（κ）链可变区的引物为Vκ23（5'-CTGGAYTYCAGCCTCCAGA-3'；SEQID NO:52）（Chardes T，等人1999）和LCconstant

（5'-GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG-3'；SEQ ID NO:53）。测序扩增的重链和轻链可变区。然后，将PCR用于扩增V-基因和掺入用于克隆到KaloBios载体中的限制性酶位点：在NcoI（5'）和NheI（3'）将Vh克隆入KB1292-His（KB1292的修饰形式，其在CH1上编码C端柔性接头和氨基酸序列为AAGASHHHHHH（SEQ ID NO:54）的6-His（SEQ ID NO:45）标签）中；在NcoI（5'）和BsiWI（3'）将Vk克隆入KB1296中。然后通过用BssHII和ClaI限制酶切消化和连接，将这些单独的重链和轻链载体组合成单一的bicistronic KaloBios Fab表达载体。在大肠杆菌中表达该载体的Fab片段。测试该Fab的PCSK9抗原结合，并称为参照Fab SR101-B1。

Fab纯化

使用KaloBios表达载体，通过从大肠杆菌中分泌表达Fab片段。细胞在2×YT培养基中生长至～0.6的OD600。通过加入IPTG至100μM诱导表达，并在33℃振荡4小时。通过渗透裂解，从周质部分获得组装的Fab，根据标准方法，使用Ni-NTA柱（HisTrap HP柱；GEHealthcarecatalog#17-5247-01）通过亲和层析纯化。在含500mM咪唑的缓冲液中洗脱Fab，并对没有钙和镁的PBS pH7.4完全透析。

文库构建

通过连接KaloBios人类文库序列、亲本鼠序列和含BSD的独特CDR3-FR4区构建文库。BSD含有人种系J-区段序列和来自优化的参照Fab EJS005的CDR3，使用重叠PCR将BSD与人V-区段文库连接。KaloBios人类盒文库是基于与CDR区中原始的鼠Vh和Vk接近的人种系序列。原始的鼠MAB1Vh与人种系序列Vh2-70接近，因此将含有Vh2亚组成员（KB1412）的KaloBios文库用于制备Vh盒文库。同样地，因为MAB1Vk与Vk1O2人种系序列接近，所以将含有Vk1亚组成员（KB1419和KB1420）的两个KaloBios人V-区段文库的混合物用于制备Vk盒文库。通过重叠PCR，将这些盒文库与来自亲本鼠可变区的序列连接，以完成V-区段。通过搭桥PCR(bride PCR)构建两种类型的盒：从上述作为模板的Vh2文库（KB1412）的混合物或Vk1文库（KB1419和KB1420）的混合物中扩增前端盒，其含有FR1、CDR1以及FR2的第一部分中的人类序列。使用上述完全人Vh-或Vk-区文库作为模板，扩增中间盒，其含有FR2的最后一部分、CDR2以及FR3中的人类序列。Vh盒在氨基酸位置45-49（Kabat编码）处具有FR2中重叠的共有序列。Vk盒在氨基酸残基42-47（Kabat编码）处具有FR2中重叠的共有序列。因此，通过PCR构建了人V-重链2和V-κ1同种型的前端和中部人类盒文库。在NcoI（5'）和KpnI（3'）处将每一Vh盒文库克隆到载体KB1292-His中；在NcoI（5'）和HindIII（3'）处，将每一Vk盒文库克隆到载体KB1296-B（KaloBios载体KB1296的修饰形式，其具有添加在FR4中的沉默HindIII位点）中。然后通过用BssHII和ClaI消化和随后连接，将得到的Vh或Vk质粒文库与来自参照FabJG024的互补链组合（例如，将Vh前端文库与优化的参照Vk载体组合），以产生表达完全Fab的双顺反子载体文库。

一般ELISA

将重组人或食蟹猴PCSK9-His6抗原用于全部ELISA测定。通常，在4℃，通过过夜温育，将在PBS pH7.4中稀释的PCSK9-His6抗原以300ng/孔与96-孔微量滴定板结合。在37℃，用PBS中的3%BSA溶液封闭平板1小时，然后用PBST洗涤一次。然后将含Fab的诱导细胞培养基或者经稀释、纯化的Fab（50μL）加入到每孔中。在37℃温育1小时后，用PBST洗涤平板3次。将在PBS中1:5000稀释的抗人κ链HRP缀合物（Sigma#A7164）加入到每孔中，室温温育平板45分钟。用PBST洗涤平板3次，然后将100μL的SureBlue TMB底物（KPL#52-00-03）加入到每孔中，并室温温育平板～10分钟。在分光光度计中在650nm处读取平板。

对于在纯化的人和鼠IgG上的特异性ELISA，用一组纯化的人或小鼠抗原，以每孔88ng包被384-孔板，并在4℃温育过夜。如上所述封闭并洗涤平板，然后将22μL在PBS中稀释成2μg/mL的纯化的小鼠或人抗PCSK9抗体加入到每孔中。37℃温育平板1小时，然后用PBST洗涤。在PBS中以1:5000稀释与HRP缀合的抗鼠Fc抗体（Jackson ImmunoResearch Labs#115-035-071）或抗人κ抗体（Sigma#A7164）（25μL）并将其加入到每孔中。室温温育平板1小时，然后如上所述洗涤并显色。

菌落转移结合测定法（CLBA）

使用以1μg/mL PCSK9-His₆包被的硝酸纤维素膜，基本上如（美国PatentPubl.2005/0255552和2006/0134098）中所述实施Fab片段的humaneered文库的筛选。使用在PBST中1:5000稀释的缀合了碱性磷酸酶的抗人κ轻链抗体（Sigma#A3813）检测与经抗原包被的膜结合的Fab，并用碱性磷酸酶的DuoLux化学发光底物（Vector Laboratories#SK-6605）显色印迹。

生物素化重组PCSK9的产生和亲和力测量

通过在pRS5a/PCSK9质粒中的编码PCSK9的基因和His6标签之间插入EcoRI限制位点产生具有C端Avi-（用于定点生物素化）和His6-标签（PCSK9-Avi-His6）的PCSK9；表达具有C-端His6的PCSK9Uniprot Accession Q8NBP7的氨基酸31-692（（SEQ ID NO:45）标签）。使用T4多核苷酸激酶（Invitrogen）磷酸化编码Avi标签（氨基酸序列：GGGLNDIFEAQKIEWHE；SEQ ID NO:55）和侧翼具有EcoRI突出端的寡核苷酸，退火，随后使用新插入的EcoRI位点将所述寡核苷酸连接到pRS5a/PCSK9中。通过序列分析验证含Avi标签的克隆。在293Freestyle表达系统（Invitrogen）中进行PCSK9-Avi-His6的表达，并使用Ni-NTA树脂（QIAGEN）纯化分泌的重组蛋白质。纯化后，对10mM Tris pH8.0，50mM NaCl透析PCSK9-Avi-His6蛋白。根据厂商方案，使用生物素-蛋白质连接酶（Avidity）体外生物素化蛋白质。完成后，对PBS pH7.2透析该反应物，并通过蛋白质印迹、用HRP缀合的链酶亲和素探测来验证生物素化。

根据厂商说明，使用ForteBio Octet QK系统分析Humaneering^TM方法中产生的IgG和Fab片段的结合动力学。将生物素化的PCSK9-Avi-His₆抗原与链霉亲和素高结合生物传感器（ForteBio#18-0006）偶联。使用bio-layer干涉法分析和由厂商提供的软件实时监测与抗原结合的Fab。从测定的结合常数和解离常数计算亲和力。使用溶液平衡滴定（“SET”）测定法分析最终选定的候选物的结合动力学。简言之，制备人、食蟹猴、小鼠或大鼠Pcsk9的连续稀释物，并将抗Pcsk9Ab加入到每一抗原浓度中，以达到100pM的恒定抗体浓度。将100μL/孔的每一稀释混合物一式两份分配到96-孔聚丙烯微量滴定板（Greiner）中。密封平板，并室温温育过夜。用25μLPBS中稀释的1μg/mL Pcsk9包被96-孔标准结合微量滴定板（MesoScale Discovery）。密封该平板，并在4℃温育过夜。温育后，用每孔200μL的PBS/0.05%（w/v）Tween20洗涤经抗原包被的标准结合微量滴定板3次。然后，用每孔150μL的PBS/5%（w/v）BSA封闭平板，室温振荡温育1小时。重复洗涤步骤，并将25μL/孔抗体-抗原制备物从聚丙烯微量滴定板转移到经抗原包被的标准结合平板中。室温振荡温育标准结合平板60分钟。3次额外的洗涤步骤后，将25μL在PBS/1%（w/v）BSA/0.05%（w/v）Tween20缓冲液中稀释的1μg/mL的经Sulfo-Tag-标记的山羊抗人检测抗体（R32AJ-5，Meso Scale Discovery）加入到每孔中，室温振荡温育1小时。洗涤平板3次后，将150μL的2×Read Buffer（R92TC-1，Meso ScaleDiscovery）转移到每孔中。产生电化学发光信号，并通过Sector Imager6000（Meso ScaleDiscovery）检测该信号。使用在Piehler,等人，(1997)J Immunol Methods201:189-206中所述的应用于抗体的拟合模型，用excel add-in XLfit4.3.2（ID Business Solutions）处理数据。在溶液中，在人和食蟹猴PCSK9与抗体MAB2和MAB3之间观察到了高亲和力的结合。

抗体产生和纯化

根据厂商方案，使用293fectin转染试剂（Invitrogen#51-0031），通过将载体pJG04（重链）和pJG10（轻链）共转染到293Freestyle细胞中产生完全Humaneered^TMMAB2和MAB3抗体（沉默的IgG1κ）。使用5-mL HiTrap A蛋白HP柱（GE Healthcare#17-0403-03），从293Freestyle细胞上清液中纯化抗体。使用IgG洗脱缓冲液（Pierce#21004）洗脱抗体，并通过透析，将缓冲液交换成PBS。在AKTAFPLC液体层析系统（GEHealthcare）上进行A蛋白亲和层析。

表位竞争测定

使用ForteBio Octet QK系统和用生物素化PCSK9-Avi-His6包被的链霉亲和素高结合生物传感器测定原始小鼠抗体MAB1和其Humaneered^TM衍生物MAB2和MAB3之间对PCSK9上表位结合的竞争。然后，将四种不同的抗体：小鼠MAB1、完全人MAB2、完全人MAB3或humaneered抗PCSK-9抗体NVP-LGT209（已知具有来自MAB1的表位的单独表位）与用单独的PCSK9包被的传感器结合至饱和。然后，将全部传感器浸入含MAB1小鼠抗体的孔中，以测定第一抗体是否阻断MAB1结合。

结果

鼠和参照V-区氨基酸序列

测序了来自表达MAB1的杂交瘤细胞的RT-PCR产物，并使用ThermoElectron LTQ-Orbitrap质谱仪在蛋白质水平大体上（95%或更高）验证了该序列。然后将MAB1的重链和轻链可变区克隆到KaloBios载体中，以产生参照Fab SR101-B1。除参照Fab（SR101-B1）外，构建了优化的参照Fab，JG024。将SR101-B1中的几个构架氨基酸残基改变成JG024中的人种系。

参照和优化的参照Fab亲和力分析

掺入到优化的参照Fab J EJS005中的FR1和FR3中的人种系残基是通过用于扩增人V-区所有组成成分的PCR引物所指定的那些人种系残基，因此所述残基存在于humaneered的V-区文库的全部成员中。构建优化的参照Fab，以评估人种系的任何改变是否会改变Fab结合的性质。通过使用纯化Fab进行的稀释ELISA，SR101B-1和EJS005对重组PCSK9抗原的亲和力出现在实验噪音内，表明EJS005中的氨基酸改变是容许的。

文库构建和完全Humaneered^TMFab的选择

通过CLBA产生并筛选局限于Vh2或Vk1的重链和轻链前端和中部盒文库亚组。对于Vh，通过菌落转移结合测定法鉴定支持与PCSK9结合的前端盒，但Vh中部盒未通过菌落转移结合测定法鉴定。在Vk中也同样如此，通过菌落转移结合仅鉴定前端盒。在ELISA测定中，在含Fab的细胞上清液上再次确认来自每一前端文库的许多结合子，并通过浓度归一化的亲和力ELISA进一步排序。

因为没有鉴定支持PCSK9结合的V-重链盒，所以使用在前端筛选中鉴定的与CDR-2结合的盒构建Fr-3文库，所述CDR-2从优化的参照Fab扩增，而Fr-3文库从KaloBios Vh2文库扩增。因此，在抗原结合前端盒的背景下，构建Fr-3人类盒文库、筛选，并鉴定结合抗原的克隆。

通过不同的途径构建Vk的中部。在Vk中部，构建从Fr-2延伸至CDR-2的诱变文库，并且其编码亲本鼠残基或者接近的人种系残基。将诱变文库与Vk1Fr-3文库连接。得到的文库具有与Fr-2连接的抗原结合Fe盒以及与Fr-3文库连接的Cdr-2诱变文库。

根据上述文库，通过CLBA成功鉴定了针对重链和轻链的支持与PCSK9抗原结合的前端和中部人类盒。在本文中筛选了这些文库，以使CLBA阳性克隆可以含有完全的Humaneered^TMFab。通过归一化亲和力ELISA，确认并排序了全部的CLBA阳性克隆。纯化了具有最高亲和力并且其序列显示出最高种系同一性的六个克隆，并使用ForteBio Octet系统进行了更准确的亲和力测量。

使用ForteBio Octet分析测试完全Humaneered^TMFab对PCSK9抗原的亲和力

然后，使用ForteBio Octet系统将六个人Fab的结合动力学与参照FabJG024的动力学进行了（数据总结于表1中）。

表1.完全Humaneered^TMFabs对PCSK9的亲和力

Fab	ka	kd	KD
				克隆#44	8.48E3	1.89E-4	2.23E-8
克隆#45	2.67E4	1.00E-4	3.75E-9
				克隆#46	2.03E4	1.21E-3	5.93E-8

Fab	ka	kd	KD
				克隆#56	1.38E4	1.08E-4	7.79E-9
克隆#57	1.43E4	6.37E-5	4.46E-9
				克隆#58	3.63E4	9.92E-4	2.73E-8
RefFab（JG024）	7.70E3	2.08E-4	2.70E-8

这些Fab的蛋白质浓度测定是困难的；同样地，解离速率（off-rate）（k_d）数据比结合速率（on-rate）（k_a）和K_D数据更可靠（只有解离速率不是浓度依赖的）。经测试的全部Humaneered^TMFab中只有一个表现出比参照Fab的解离速率好的（即，更慢的）解离速率。尽管可靠性较低，但全部六个Fab的K_a测量结果都与参照Fab相似或比参照Fab更好（更快）。

从结合抗原的Humaneered^TMFab的这种选择中，选定了大多数具有最高亲和力的人抗体链以制备成完全IgG抗体。因此，MAB2的可变区含有来自克隆44的重链和来自克隆45的轻链。MAB3的可变区含有来自Vh2Fr3文库筛选的克隆37的重链和来自完全轻链文库的克隆45的轻链。因为并没有以相同的筛选鉴定重链和轻链的这种组合，所以将它们克隆到表达载体中、表达，并通过ForteBio Octet测量亲和力。在确认候选Fab的亲和力达到或者超过了参照Fab的亲和力之后，将所述候选Fab克隆到完全IgG载体中。

使用溶液平衡滴定（SET）系统分析MAB2和MAB3的结合动力学

如在表2中所示，使用SET测定法，所测定的MAB2和MAB3抗体与人PCSK2的结合亲和力分别为260和300pM。这提示了溶液中抗体和PCSK9之间以高的亲和力相互作用。

表2.MAB2和MAB3的结合动力学

抗体	kD[pM]
		MAB2	260±50
MAB3	300±20

通过ELISA分析MAB2和MAB3的抗原特异性

为了测试在最终的Humaneered^TMIgG，MAB2和MAB3中是否保留了亲本小鼠抗体MAB1的抗原特异性，在ELISA测定中测试了抗体与一组人和小鼠抗原（以及人PCSK9）的结合。该测定的结果（图4A-B）显示，与鼠抗体MAB1相似，MAB2和MAB3对PCSK9保留了高特异性。

ELISA中与人和食蟹猴Pcsk9结合的抗体

评价了MAB2和MAB3与人和食蟹猴（cyno）Pcsk9的特异性结合。该ELISA测定显示，与亲本小鼠抗体MAB1一样，Humaneered^TM抗体MAB2和MAB3能以相似的方式结合人和食蟹猴Pcsk9（图5A-C）。

基于Bio-layer干涉法的表位竞争测定

为了测试最终的Humaneered^TM抗体MAB2和MAB3中是否保留了亲本鼠抗体MAB1的表位特异性，研发了使用ForteBio Octet系统进行的竞争测定法。Humaneered^TM抗体MAB2和MAB3阻断了亲本小鼠抗体MAB1的结合，表明Humaneered^TM抗体保留了原始鼠抗体的表位特异性。当改变抗体的装载顺序时，即首先结合MAB1，然后是Humaneered^TM抗体，获得了相似的结果。

Humaneered^TM抗体MAB2和MAB3的氨基酸序列，以及其与人种系序列的同一性百分比

分别在图2和3中显示了最终的Humaneered^TMIgG MAB2和MAB3的可变区氨基酸序列；CDR以下划线和加粗显示。在序列表中包含了核苷酸序列。

通过将Vh和Vk氨基酸序列与单个人种系序列（分别为Vh22-05和Vk1O2；表3）比对，测定了MAB2和MAB3与人种系序列的同一性百分比。对于每一条链，在计算中省去了CDRH3和CDRL3中的残基。

表3.MAB2和MAB3与人种系序列的同一性百分比

Vh对比Vh22-05	Vk对比Vk1O2
		90.0%	86.7%

在图7-12的图注中讨论了有关人源化抗体的功能性特征的其他信息。应当理解，本文中所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，建议本领域技术人员根据所述的实施例和实施方案进行多种修饰或改变，并且所述修饰或改变包含于本申请的精神和权限以及所附权利要求的范围内。对于全部目的，将本文中引用的全部出版物、专利、专利申请和序列登录项（sequence accession entry）以其整体并入本文作为参考。

Claims (42)

1.抗体，其与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)结合，其中所述抗体阻断PCSK9与低密度脂蛋白受体(LDLR)的相互作用并抑制PCSK9介导的LDLR降解，其中所述抗体包含：

a)重链可变区，其包含人重链V-区段、重链互补决定区3(CDR3)和重链构架区4(FR4)；和

b)轻链可变区，其包含人轻链V-区段、轻链CDR3和轻链FR4，其中

i)所述重链CDR3可变区包含氨基酸序列ITTEGGFAY(SEQ ID NO:17)；且

ii)所述轻链CDR3可变区包含氨基酸序列QQSNYWPLT(SEQ ID NO:24)，

其中所述重链V-区段和所述轻链V-区段均包含互补决定区1(CDR1)和互补决定区2(CDR2)；其中：

i)所述重链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO:14；

ii)所述重链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO:16；

iii)所述轻链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO:19；且

iv)所述轻链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO:22。

2.权利要求1的抗体，其中所述抗体以约500pM或更小的平衡解离常数(KD)与人PCSK9结合。

3.权利要求1的抗体，其中所述重链V-区段与SEQ ID NO:27具有至少85％的序列同一性，并且其中所述轻链V-区段与SEQ ID NO:28具有至少85％的序列同一性。

4.权利要求1的抗体，其中所述重链V-区段与选自SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性，并且其中所述轻链V-区段与SEQ ID NO:28具有至少85％的序列同一性。

5.权利要求1的抗体，其中所述重链FR4是人种系FR4。

6.权利要求5的抗体，其中所述重链FR4是SEQ ID NO:35。

7.权利要求1的抗体，其中所述轻链FR4是人种系FR4。

8.权利要求7的抗体，其中所述轻链FR4是SEQ ID NO:39。

9.权利要求1的抗体，其中所述重链可变区与SEQ ID NO:40的可变区具有至少90％的氨基酸序列同一性，并且所述轻链可变区与SEQ ID NO:41的可变区具有至少90％的氨基酸序列同一性。

10.权利要求1的抗体，其中所述重链可变区与SEQ ID NO:40的可变区具有至少95％的氨基酸序列同一性，并且所述轻链可变区与SEQ ID NO:41的可变区具有至少95％的氨基酸序列同一性。

11.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:40，所述轻链包含SEQ ID NO:41。

12.权利要求1的抗体，其中所述重链可变区与选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9的可变区具有至少90％的氨基酸序列同一性，并且所述轻链可变区与选自SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:11的可变区具有至少90％的氨基酸序列同一性。

13.权利要求1的抗体，其中所述重链可变区与选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9的可变区具有至少95％的氨基酸序列同一性，并且所述轻链可变区与选自SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:11的可变区具有至少95％的氨基酸序列同一性。

14.权利要求1的抗体，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

15.权利要求1的抗体，其中所述抗体是FAb'片段。

16.权利要求1的抗体，其中所述抗体是IgG。

17.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单链抗体(scFv)。

18.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含人恒定区。

19.权利要求1的抗体，其中所述抗体与载体蛋白连接。

20.权利要求1的抗体，其中所述抗体是聚乙二醇化的。

21.组合物，其包含权利要求1-20中任一项的抗体和生理上相容的赋形剂。

22.权利要求21的组合物，其中所述组合物还包含第二试剂，其降低个体中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。

23.权利要求22的组合物，其中所述第二试剂是抑制素。

24.权利要求23的组合物，其中所述抑制素选自托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。

25.权利要求22的组合物，其中所述第二试剂选自贝特类、烟酸及其类似物、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸多价螯合剂、甲状腺激素模拟物、微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)抑制剂、二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)抑制剂、靶向PCSK9的抑制性核酸，以及靶向apoB100的抑制性核酸。

26.治疗有效量的权利要求1的抗体在制备用于降低个体中的LDL-C的药物中的用途。

27.权利要求26的用途，其中所述个体是对抑制素治疗低应答或者有抗性的。

28.权利要求26的用途，其中所述个体是对抑制素治疗不耐受的。

29.权利要求26的用途，其中所述个体具有至少约100mg/dL的基线LDL-C水平。

30.权利要求26的用途，其中所述个体具有家族性高胆固醇血症。

31.权利要求26的用途，其中总胆固醇随所述LDL-C一起降低。

32.权利要求26的用途，其中所述个体具有甘油三酯血症。

33.权利要求26的用途，其中所述个体具有功能获得型PCSK9基因突变。

34.权利要求26的用途，其中所述个体具有药物诱导的血脂异常。

35.权利要求26的用途，其中所述药物进一步包含治疗有效量的第二试剂，所述第二试剂有效降低LDL-C。

36.权利要求35的用途，其中所述第二试剂是抑制素。

37.权利要求36的用途，其中所述抑制素选自托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。

38.权利要求35的用途，其中所述第二试剂选自贝特类、烟酸及其类似物、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸多价螯合剂、甲状腺激素模拟物、微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)抑制剂、二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)抑制剂、靶向PCSK9的抑制性核酸，以及靶向apoB100的抑制性核酸。

39.权利要求35的用途，其中所述抗体和所述第二试剂以混合物的形式制备。

40.权利要求35的用途，其中所述抗体和所述第二试剂分别制备。

41.权利要求26的用途，其中所述药物静脉内施用。

42.权利要求26的用途，其中所述药物皮下施用。