CN111153989B

CN111153989B - Echo30单克隆抗体的制备及其用途

Info

Publication number: CN111153989B
Application number: CN202010043727.3A
Authority: CN
Inventors: 张黎; 王康; 郑滨洋; 朱玲; 苏璇; 张倩; 陶焱炀; 崔仑标; 潘红星; 葛以跃; 吴涛; 王祥喜; 朱凤才
Original assignee: Jiangsu Center For Disease Control And Prevention (jiangsu Institute Of Public Health)
Current assignee: Jiangsu Center For Disease Control And Prevention (jiangsu Institute Of Public Health)
Priority date: 2020-01-15
Filing date: 2020-01-15
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2040-01-15
Also published as: CN111153989A

Abstract

本发明涉及Echo30单克隆抗体的制备及其用途。本发明的抗体的CDR序列如SEQ ID NO：1‑3和SEQ ID NO：5‑7所示，抗体重链可变区的序列如SEQ ID NO：4所示，抗体轻链可变区的序列如SEQ ID NO：8所示。本发明的抗体可使用本领域常规方法制备，利用体外实验证明纯化的抗体具有Echo30结合特异性和中和Echo30的中和活性，故本发明的抗体可用于临床诊断或治疗。

Description

Echo30单克隆抗体的制备及其用途

技术领域

本申请属于生物医学领域，具体涉及Echo30单克隆抗体的制备及其用途。

背景技术

埃可病毒(Echovirus)属于肠道病毒(Enteroviruses，EVs)。肠道病毒由微小核糖核酸病毒科中的67种独特的血清型的病毒组成。小核糖核酸病毒是正链RNA 病毒，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A组和B组、埃可病毒、肠病毒68-71 型。埃可病毒颗粒体积极小，呈球形，病毒颗粒由简单的衣壳和单正股RNA组成，裸露无膜，直径小于30nm。病毒的衣壳含4种蛋白质，分别为VP1、VP2、 VP3、VP4。病毒的RNA为单一分子，长约7.44kb，是病毒翻译和复制的模板。有64种不同的血清型的肠道病毒可引起人类感染，其中已知埃可病毒有34个血清型。在临床上病毒的分型主要基于它们的基因特征，埃可病毒属于人肠道病毒 HEV B种。与其它肠道病毒一样，埃可病毒的最适生长温度为35-37℃，能在猴肾、人羊膜细胞、人喉癌细胞、横纹肌肉瘤、人胚肺等细胞进行培养。

人类埃可病毒30(Echo30)是埃可病毒最常见的类型之一，是引起儿童和成人无菌性脑膜炎的主要病原体。在儿童病毒性脑炎病例中，由Echo30引起的病例占80％～93％。该病毒是一种无胞膜病毒，在高盐、高pH值等恶劣环境下均可稳定存活。肠道病毒排毒时间长，患者感染后的数周内仍能从呼吸道或肠道中排出病毒，从而引起病毒传播、感染甚至暴发或流行。近年来在我国台湾、浙江、福建和河南等地多次报道由Echo30引起病毒性脑炎的暴发或流行。

目前对Echo30相关研究比较少，更无特异性抗体的报道。本申请目的是制备针对Echo30的特异性抗体以便检测Echo30及其导致的相关疾病。

发明内容

本发明提供与Echo30特异性结合的抗Echo30的抗体或其抗原结合片段。例示性CDR的氨基酸序列以及例示性抗Echo30抗体的重链及轻链的VH区及VL 区的氨基酸序列提供于下文具体实施方式中。

抗Echo30的抗体可包括更改抗体的特性的修饰和/或突变，这些特性诸如，延长半衰期、增加或减少ADCC等如本领域已知。

本文提供包含编码本发明的抗Echo30的抗体的核苷酸序列的核酸，以及包含核酸的载体。另外，本文提供用包含编码所披露的抗Echo30的抗体的核苷酸序列的载体转化的原核及真核宿主细胞，以及经工程化以表达核苷酸序列的真核 (诸如，哺乳动物)宿主细胞。还提供通过培养宿主细胞及回收抗体来制造抗体的方法，且进一步在下文具体实施方式中论述。

本发明提供检测Echo30的产品，所述产品包括本发明的Echo30抗体或其抗原结合片段。本发明提供诊断Echo30感染或其导致的疾病的产品，所述产品包括本发明的Echo30抗体或其抗原结合片段。

在另一方面中，本发明提供包括本文所描述的抗Echo30的抗体的组合物。组合物通常包含一种或多种如本文所描述的抗Echo30的抗体和/或其盐、及一种或多种赋形剂、运载体或稀释剂。

本发明提供用抗Echo30的抗体治疗经诊断患有埃可病毒感染导致的疾病的方法。该方法通常涉及向受试者施用一定量的本文所描述的可有效地提供治疗益处的抗Echo30的抗体。

可施用抗Echo30的抗体作为单一治疗剂(单药疗法)或辅助通常(但非必需) 用于治疗埃可病毒感染导致的疾病的那些的其他治疗剂，或与这些其他治疗剂一起施用。治疗剂通常应以其经批准的剂量、施用途径及施用频率来使用，但可以更低的剂量来使用。

抗Echo30的抗体可经由各种施用途径或模式来施用，这些施用途径或模式包括但不限于静脉内输注和/或注射、皮下注射。施用的量将取决于施用途径、给药时间表、所治疗的疾病类型、所治疗的疾病所处的阶段、以及如本领域熟知的其他参数，例如患者的年龄和体重。

本发明提供用抗Echo30的抗体检测Echo30的方法。该方包括如下步骤：a) 将样品与本发明的抗Echo30的抗体进行接触；b)检测抗体与Echo30的反应。

本发明提供抗Echo30抗体的检测用途。所述用途包括：在制备检测Echo30 的产品中的应用。

本发明中所公开的埃可病毒30型感染导致的疾病包括但不限于脑膜炎，上呼吸道感染，心肌炎，皮疹，呕吐，发烧，头痛。

所述上呼吸道感染包括咳嗽、咽痛等流感样症状。

所述脑膜炎包括无菌性脑膜炎，无菌性脑膜炎又包括儿童无菌性脑膜炎。

附图说明

图1显示本发明抗体的SDS-PAGE图；

图2显示本发明抗体的亲和活性曲线，其中，A：4B10-IgG，B：4B10-Fab，C： 6C5-IgG，D：6C5-Fab；

图3显示本发明病毒与受体结合的亲和力曲线，其中，A：FcRn，B：CD55；

图4显示本发明的抗体对病毒与其受体结合的抑制曲线，其中，A：先加入6C5 抗体后加入受体，B：先加入受体后加入6C5抗体；C：先加入4B10抗体后加入受体，D：先加入受体后加入4B10抗体；

图5显示本发明抗体的亲和活性专一性测定图；

图6显示本发明的抗体的中和活性统计图，其中，A：6C5，B：4B10；

图7显示本发明的抗体的中和活性专一性测定图；

图8显示病毒与细胞接触前或接触后抗体对病毒活性的影响结果图，其中，A：接触前，B：接触后；

图9显示灭活E30颗粒免疫小鼠后血清的效价统计图；

图10显示本发明的抗体与病毒结合对抗原表位的影响图；

图11显示本发明的抗体与病毒结合对病毒稳定性影响的结果图，其中：A：pH＝5.5的缓冲液，B：pH＝7.4的缓冲液，C：A导数值，D：B导数值。

具体实施方式

除非本文中另外定义，否则结合本发明使用的科学与技术术语应具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。

抗Echo30的抗体及结合片段

在一个方面中，本发明是关于特异性结合人类Echo30的抗体和/或其抗原结合片段。

本发明的抗体可为多克隆、单克隆、基因工程化和/或在本质上另外修饰的，包括但不限于鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、单链抗体等。在各种实施例中，抗体包含抗体的恒定区的全部或一部分。在一些实施例中，恒定区为选自以下各项的同种型：IgA(例如，IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如，IgG1、 IgG2、IgG3或IgG4)及IgM。

如本文所使用，抗体的“恒定区”包括天然恒定区、同种异型或天然变体。

抗Echo30的抗体的轻链恒定区可为κ(kappa)轻链区或λ(lambda)区。λ轻链区可为已知亚型中的任一者，例如，λ1、λ2、λ3或λ4。在一些实施例中，抗Echo30 的抗体包含κ(kappa)轻链区。

如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于经由杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体通过本领域中可用的或已知的任何方式自单一克隆获得，包括任何真核、原核或噬菌体克隆。用于本发明的单克隆抗体可使用本领域中已知的广泛多种技术来制备，包括杂交瘤技术、重组技术及噬菌体展示技术或其组合的使用。

本发明的还披露能够特异性地结合Echo30的抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的实例包括(借助于实例且非限制的)Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、单链Fv片段及单一域片段。

本发明的抗Echo30的抗体包括衍生抗体。例如，但并非限制性的，衍生抗体通常通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、利用已知保护/阻断基团衍化、蛋白质分解性裂解、连接至细胞配体或其他蛋白质来修饰。可利用已知技术来进行诸多化学修饰中的任一者，这些技术包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素(tunicamycin)的代谢合成等。另外，衍生物例如使用Ambryx技术(参见例如，Wolfson，2006，Chem.Biol[化学生物学].13(10)：1011-2) 可含有一个或多个非天然氨基酸。

抗Echo30的抗体或结合片段可为其序列已经修饰以更改至少一个恒定区介导的生物效应功能的抗体或片段。例如，在一些实施例中，抗Echo30抗体可经修饰以相对于未经修饰的抗体减少至少一个恒定区介导的生物效应功能，例如，减少与Fc受体(FcγR)(诸如，FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和/或 FcγRIIIB)中的一个或多个的结合。FcγR结合可通过使抗体在对于FcγR相互作用必需的特定区处的免疫球蛋白恒定区区段突变来减少(参见例如，Canfield 及Morrison，1991，J.Exp.Med.[实验医学杂志]173：1483-1491；及Lund等人， 1991，J.Immunol[免疫学杂志].147：2657-2662)。抗体的FcγR结合能力的减少还可减少依赖于FcγR相互作用的其他效应功能，诸如，调理作用(opsonization)、吞噬及抗原依赖性细胞毒性(“ADCC”)。

本文所描述的抗Echo30的抗体或结合片段包括已经修饰以相对于未经修饰的抗体获得或改良至少一个恒定区介导的生物效应功能例如以增强FcγR相互作用的抗体(参见例如，美国专利申请号2006/0134709)。例如，本发明的抗Echo30 的抗体可具有以比对应野生型恒定区更大亲和力结合FcγRI、FcγRIIA、Fcγ RIIB、FcγRIIIA和/或FcγRIIIB的恒定区。

在一些实施例中，本发明的抗Echo30的抗体，其包含至少一个CDR的VH，和/或，至少一个CDR的VL；

VH的CDR序列选自：SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列；

或

VH的CDR序列选自：在SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列基础上经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列；

或

VH的CDR序列选自：与SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；

VL的CDR序列选自：SEQ ID NO：5-7所示的氨基酸序列；

或

VL的CDR序列选自：在SEQ ID NO：5-7所示的氨基酸序列基础上经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列；

或

VL的CDR序列选自：与SEQ ID NO：5-7所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。

至少有80％同源性是指有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同源性。

在本发明的具体实施方案中，VH的CDR序列选自：SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列；VL的CDR序列选自：SEQ ID NO：5-7所示的氨基酸序列。

更具体第，VH的CDR1序列具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；VH 的CDR2序列具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；VH的CDR3序列具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；VL的CDR1序列具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；VL的CDR2序列具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；VL的CDR3 序列具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。

进一步，本发明的所述抗体包括VH和/或VL，其中：

所述VH具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或所述VH具有在SEQ ID NO： 4所示的氨基酸序列基础上经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列；或所述VH具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；

所述VL具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，或所述VL具有在SEQ ID NO： 8所示的氨基酸序列基础上经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列；或所述VL具有与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。

在本发明的具体实施方案中，所述VH具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；所述VL具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

编码抗Echo30的抗体的聚核苷酸、制备抗体的表达系统及方法

本发明涵盖编码抗Echo30的免疫球蛋白轻链基因及重链基因的核酸分子、包含此类核酸的载体及能够制造本发明的抗Echo30的抗体的宿主细胞。

在本发明的具体实施方案中，编码重链可变区CDR1的核酸具有SEQ ID NO： 9所示的序列；编码重链可变区CDR2的核酸具有SEQ ID NO：10所示的序列；编码重链可变区CDR3的核酸具有SEQ ID NO：11所示的序列；编码轻链可变区 CDR1的核酸具有SEQ ID NO：13所示的序列；编码轻链可变区CDR2的核酸具有 SEQ ID NO：14所示的序列；编码轻链可变区CDR3的核酸具有SEQ ID NO：15 所示的序列。

在本发明的具体实施方案中，编码重链可变区的核酸具有SEQ ID NO：12 所示的序列；编码轻链可变区的核酸具有SEQ ID NO：16所示的序列。

本发明的抗Echo30的抗体可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链基因及重链基因来制备。为以重组方式表达抗体，用携带编码抗体的免疫球蛋白轻链及重链的DNA片段的一个或多个重组表达载体来转染宿主细胞，使得在宿主细胞中表达轻链及重链且任选地分泌至培养宿主细胞的培养基中，可从该培养基回收抗体。标准重组DNA方法用于获得抗体重链及轻链基因，将这些基因并入至重组表达载体中且将载体引入至宿主细胞中。

为产生编码此类抗Echo30的抗体的核酸，首先获得编码轻链可变区及重链可变区的DNA片段。这些DNA可通过扩增及修饰编码轻链可变序列及重链可变序列的种系DNA或cDNA来获得，例如使用聚合酶链反应(PCR)。

一旦获得编码抗Echo30抗体相关的VH区段及VL区段的DNA片段，则可进一步利用标准重组DNA技术操纵这些DNA片段例如以将可变区基因转化成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操纵中，编码VL或VH的 DNA片段可操作地连接至编码另一蛋白质(诸如抗体恒定区或挠性连接体)的另一DNA片段。如用于此情况下，术语“可操作地连接”意指两个DNA片段接合使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保留于框内。

为表达本发明的抗Echo30的抗体，将如上文所描述获得的编码部分或全长轻链及重链的DNA插入至表达载体中，使得基因可操作地连接于转录及翻译控制序列。在此上下文中，术语“可操作地连接”意指，将抗体基因接合至载体中使得在载体内的转录及翻译控制序列提供调整抗体基因的转录及翻译的其预定功能。选择表达载体及表达控制序列以与所用表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因及抗体重链基因插入至独立载体中，或更通常将两个基因插入至同一表达载体中。

有可能在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达本发明的抗体。在某些实施例中，抗体的表达是在最佳分泌正确地折叠及免疫主动抗体的真核细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中进行。用于表达本发明的重组抗体的例示性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括DHFR-CHO细胞，其描述于Urlaub及 Chasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77：4216-4220中，与DHFR可选标记一起使用，例如，如Kaufman及Sharp，1982，Mol.Biol.[分子生物学]159：601-621中所描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞及SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入至哺乳动物宿主细胞中时，抗体是通过培养宿主细胞持续足以允许抗体在宿主细胞中表达或将抗体分泌至生长宿主细胞的培养基中的时间段来制造。可使用标准蛋白质纯化方法自培养基回收抗体。宿主细胞还可用于制造完整抗体的部分，诸如，Fab片段或scFv分子。应了解，以上程序上的变化形式是在本发明的范畴内。例如，可能需要用编码本发明的抗 Echo30抗体的轻链或重链(但并非两者)的DNA转染宿主细胞。

一旦核酸编码抗Echo30的抗体的一个或多个部分，则可将其他更改或突变引入至编码序列中，例如以产生编码具有不同CDR序列的抗体、具有针对Fc 受体亲和力减少的抗体或不同亚类的抗体的核酸。

在本发明的具体实施方案中，本发明涉及的抗Echo30抗体的核酸序列如SEQ NOID：9-16所示。

药物组合物

本文所描述的抗Echo30的抗体可呈组合物形式，这些组合物包含抗体及一种或多种运载体、赋形剂和/或稀释剂。可以将组合物配制用于特定用途，例如用于兽医用途或人类的药物用途。组合物的形式(例如干粉、液体配制品等)和使用的赋形剂、稀释剂和/或运载体将取决于ADC的预期用途，以及针对治疗用途的给药方式。

辅助疗法

抗Echo30的抗体可用于辅助或并与具有其他药物一起使用。当辅助使用时，抗Echo30的抗体及一种或多种其他药物可共同配制成单一的组合药物配制品，或可在单一协同给药方案上或在不同给药方案上分开配制及施用。辅助或与抗 Echo30的抗体一起施用的药物通常具有针对抗Echo30的抗体的互补活性，使得抗体与其他药物彼此没有不利影响。使得整体治疗方案提供治疗益处。

剂量及施用方案

所施用抗Echo30的抗体的量将视各种因素而定，这些因素包括但不限于：所治疗实体瘤的特定类型、所治疗实体瘤的阶段、施用模式、施用频率、所需治疗益处及其他参数(诸如，患者的年龄、体重及其他特征等)。针对特定模式及施用频率的有效提供治疗益处的剂量的测定是在本领域普通技术人员的能力内。

当辅助其他药物施用或与这些一种或多种其他药物一起施用时，抗Echo30 的抗体可能以与其他药物相同的时间表或以不同时间表施用。当以相同时间表施用时，抗Echo30的抗体可在其他药物之前、之后施用，或与这些其他药物一起同时施用。

检测方法/诊断方法

一方面，本发明提供了检测样品中Echo30的方法，包括以下几个步骤：(1) 将本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与上述样品中的病毒结合而成抗体病毒或抗体片段病毒复合物；(2)检测该样品复合物以确定样品中是否有病毒。

另一方面，本发明提供了一种检测样品中Echo30的方法，包括以下几个步骤：(1)将第一抗体吸附到固相支持物上；(2)在上述支持物中加入可能含有Echo30 的可疑待测样品；(3)在上述支持物中加入带有标记物的第二抗体；(4)检测该标记物的存在从而判定Echo30是否存在。

检测方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。利用竞争法或夹心法方式，上述检测方法可以用于检测目标抗原或抗体。

本发明中，用于检测Echo30的样品包括但不限于动物或病人的血液、血浆血清等。

产品或试剂盒

本发明还涉及一种检测Echo30的产品，尤其涉及检测Echo30的试剂盒。本发明还涉及一种诊断Echo30感染或其导致的疾病的产品，尤其涉及诊断Echo30 感染或其导致的疾病的试剂盒。

本发明所述试剂盒包含本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。本发明的试剂盒还包含适合检测抗原-抗体反应的检测试剂。

本发明的试剂盒还包括供单克隆抗体或其抗原结合片段附着的固相底物，所述固相底物包括但不限于微孔板、磁微粒、免疫色谱用滤纸、聚合体例如聚苯乙烯、玻璃珠、玻璃滤器和其它不溶的载体。

本发明的试剂盒还包含一些其它成分，包括但不限于标记用的酶、相应底物、放射性同位素、反光物质、荧光物质、有色物质、缓冲液等。

本发明的试剂盒中，所使用的单克隆抗体或抗原必须事先用上述提到的标记物标记。

以下实施例旨在举例说明本发明，而不限制其范围。

实施例1单克隆抗体制备

1、免疫原(抗原)：Echo30。

每只小鼠免疫5次，每次100μl抗原，病毒共需3-3.5ml。

2、动物免疫

使用两种佐剂进行免疫，分别为改良的弗氏佐剂及水性佐剂，病毒免疫两组，每3只小鼠为一组，使用一种佐剂，病毒共免疫6只小鼠。所有免疫均在SPF动物房中进行。

选取5-8周龄Balb/c小鼠6只(雌鼠)，免疫原与佐剂混匀后分别乳化进行免疫，第一次注射使用弗氏完全佐剂，以后4次加强注射使用弗氏不完全佐剂，均与等体积抗原充分混匀后注射。

免疫方法为背部多点注射，免疫量主注射100μl抗原/只实验鼠，加强注射 100μl抗原/只实验鼠，免疫周期6-8周。

3、单克隆抗体制备流程

抗血清检测：将病毒包板酶标板，间接ELISA方法检测抗血清效价。血清效价大于1:50K，方可进行下一步融合。如有多个小鼠效价超过1：50K，选择效价最高的小鼠进行融合。

骨髓瘤细胞制备：融合前一周，复苏SP2/0细胞，正常培养至对数期。

脾细胞制备：选定要融合的小鼠，融合当天用颈椎脱臼法处死，取脾，标准流程收集脾细胞并计数。

细胞融合：按1:3-1：10的比例混合骨髓瘤细胞和脾细胞，标准流程进行细胞融合操作，随后用HAT DMEM完全培养基培养，融合后3天即可以看到杂交瘤细胞，第7天换1/2HAT完全培养基，第8天换1/2HT培养基。融合后10天左右开始进行筛选检测。

细胞融合结果：融合后用HAT选择性培养基培养，显微镜下观察，看到多个生长的杂交瘤细胞，证明融合操作成功。

融合筛选：吸取细胞上清100μl/孔进行间接ELISA检测。根据ELISA结果，判断阳性孔。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次复检，进一步确认阳性孔。

亚克隆：对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆。(因为第一次亚克隆得到的阳性孔细胞株尚不稳定，有可能包含多个杂交瘤细胞，普遍认为第二次亚克隆后杂交瘤细胞为单个细胞株，并确定为阳性)。

4、病毒中和实验：将含有抗体的培养液上清(第一次亚克隆后制备的培养上清，均为对抗原ELISA阳性)与一定浓度的抗体一起接种细胞，噬斑减少或者没有发生的孔，即为中和抗体阳性孔。

5、腹水制备及抗体纯化

5.1腹水制备

将上述阳性细胞扩大培养并注射至Balb/C小鼠(经弗氏不完全佐剂至敏)的腹腔，一般7-10日可见小鼠腹部隆起即代表有腹水产生。当小鼠有明显腹水产生时及时抽取腹水。

5.2腹水纯化

将上述细胞的腹水，用Protein A/G进行纯化，纯化后抗体纯度大于90％。检测浓度纯度后，调整浓度至2mg/ml。

6、抗体鉴定

利用SDS-PAGE检验抗体的表达及纯化情况，结果见图1，证实得到较纯蛋白，可清晰观察到解链后的抗体轻、重链，注：图中M所在泳道代表的是蛋白 Marker。

7、抗体序列测定

经测序，鉴定出的命名为6C5的单克隆抗体的氨基酸序列和核苷酸序列如下及表1所示。

重链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：12 所示。

QVQLQQSGSELVRPGASVKLSCRASGYTFTTYWMHWVKQRPGQGLEWI GNIYPHSGNTNYDERFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRDLR GFAYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：4)

CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGTCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAGC TTCAGTGAAGCTGTCCTGCAGGGCTTCTGGCTACACATTCACCACCTACTG GATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAA ATATTTATCCTCATAGTGGTAATACTAACTACGATGAGAGGTTCAAGAGCAA GGCCACACTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAG CAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAGATTTACG GGGCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：12)

轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：16 所示。

DIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSLRYMHWYQQKSGTSPKRWIYDT YNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGAGTKL ELK(SEQ ID NO：8)；

GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGG AGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTTTACGTTACATGCACT GGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACAT ACAACCTGGCCTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGA CCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTA TTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCACCCACGTTCGGTGCTGGGACCA AGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO：16)

表1抗体序列

实施例2抗体功能

1、抗原抗体亲和力测定

1.1表面等离子共振法(SPR)

1.1.1步骤：

利用Pierce Fab Preparation Kit(Thermo)对4B10-IgG(全长抗体)、6C5-IgG(全长抗体)进行切割以及纯化得到4B10-Fab(抗体的Fab片段)、6C5-Fab(抗体的Fab片段)。

使用BIAcore T100(Biacore，GE Healthcare)进行SPR实验，缓冲液为含有0.05％Tween-20的PBS。使用NHS/EDC方法将纯化的E30全病毒颗粒固定在CM5 传感器芯片表面上，直到RU值达到740。然后，梯度浓度的IgG或Fab以20μl/min 的速度流经芯片，并在每个注射周期后使用10mM甘氨酸-盐酸(pH 1.7)再生芯片。通过使用软件BIAevaluation(版本4.1)全局拟合曲线来获得结合亲和力。

1.1.2结果

结果如图2所示，4B10-IgG(全长抗体)，4B10-Fab(抗体的Fab片段)， 6C5-IgG(全长抗体)，6C5-Fab(抗体的Fab片段)与E30的亲和力分别达到： 2.88nM、67.70nM、1.51nM、3.68nM。

1.2竞争性SPR

1.2.1步骤

竞争性SPR步骤与上述SPR类似，将E30病毒颗粒固定在CM5芯片上直至RU 值达到740。第一针加入受体或抗体直至拟合曲线饱和，然后第二针再进待测竞争性抗体或受体。通过拟合曲线的变化趋势反应前后两种物质针对芯片上E30病毒颗粒的结合竞争关系。

1.2.2结果

结果显示：病毒与受体(FcRn和CD55)的亲和力分别达到：2.38μM(图3A) 和2.11μM(图3B)，远小于病毒与抗体的亲和力，并且相比于对照组(第一针加入1A1，一个针对E6病毒的特异性抗体)，加入E30抗体，能够强力抑制FcRn 与CD55和E30的结合(对照成立，ICAM5是EVD68特异性的细胞受体)(图4A和图4C)。而相反地，先加入细胞受体并不能有效抑制抗体与病毒的结合(图4B和图4D)。

2、抗原抗体结合特异性测定

使用ELISA实验进行测定。

2.1步骤

将纯化的病毒颗粒(E30，E6，E3，E11或CVB3)以30ng/孔包被到ELISA 板(Costar，Corning，USA)上，然后在4℃下孵育过夜。在37℃下用含有1％BSA 的PBST溶液(PBS加0.1％Tween20)封闭包被板2小时。此后，将板用PBST洗涤五次，并在37℃下以1：1000的稀释度将4B10-IgG或6C5-IgG作为第一抗体添加到每个孔中作用1小时。再次用PBST洗涤板五次，并添加HRP缀合的山羊抗小鼠IgG H&L(1:3000稀释)(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)作为二抗。在37℃下放置 0.5小时。将板用PBST洗涤五次，并且在室温下将3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB) 底物(碧云天，中国上海)添加到每个孔中作用5分钟。最后，将2M H₂SO₄加入板中以终止反应，并读取每个孔在450nm的吸光度值。

2.2结果

结果如图5所示，4B10和6C5均能特异性地识别E30，而与E3，E6，E11和CVB3 不发生反应。说明二者是E30特异性的。

3、抗体中和活性检测

3.1减少斑块的中和试验(PRNT)

3.1.1步骤

将4B10/6C5-IgG，4B10/6C5-Fab或小鼠血清在DMEM培养基中稀释以达到2倍系列稀释，最高浓度分别为128nM，128nM，384nM或64nM。此外建立了一个没有任何抗体，Fab或血清的对照组。将相同数量的E30病毒(PFU范围从50到100)与每种稀释液混合，在37℃下孵育1小时，然后添加到接种在6 孔板中的RD细胞的汇合单层中。将板放回细胞培养箱培养1小时，每20分钟轻轻震荡一下，之后用DMEM(pH 7.4)冲洗3次。用添加2％FBS的琼脂糖覆盖物(1％(质量体积比)AGAROSEⅡ(Amresco)，溶剂为双蒸水)(2mL/孔) 覆盖，并在5％CO₂细胞培养箱中于37℃孵育3天。然后用2.5％的结晶紫染色使噬菌斑可视化，抑制百分比计算为(Ncontrol-Ntest)/Ncontrol x 100％，其中 Ncontrol和Ntest分别代表对照组和测试组中观察到的噬菌斑计数的平均值。所有实验均重复三次。

3.1.2结果

结果如图6所示，4B10-IgG，4B10-Fab，6C5-IgG，6C5-Fab对E30的Neut50 分别达到：0.3nM，25nM，1.2nM和6.8nM。

3.2交叉中和实验

3.2.1步骤

将50nM或500nM的4B10或6C5与一定量的E30(PFU＝～50)在37℃下混合 1小时，然后添加到RD细胞铺满的单层中。在温育和漂洗后，将细胞用琼脂糖覆盖物覆盖并在37℃下再温育三天，然后用结晶紫染色，抑制率计算公式为： (Ncontrol-Ntest)/Ncontrol x100％，其中Ncontrol和Ntest分别代表对照组和测试组中观察到的噬菌斑计数的平均值。所有实验均重复三次。

3.2.2结果

结果如图7所示，50nM和500nM的4B10-IgG和6C5-IgG均能够100％中和E30 的感染活性，而等量的这两种抗体却对E3、E6、E11和CVB3起不到任何的中和作用，说明二者对E30的中和活性具有极高的专一性。

3.3Pre/post attachment实验

3.3.1步骤

Pre attachment

将抗体溶液(终浓度为0nM、3nM、30nM、300nM)和病毒(MOI＝1)于冰上作用30min，将接种12孔板中过夜培养的细胞消化至EP管中，离心1000rpm， 5min，移除上清，加入1mlDMEM，将细胞悬起，再次离心，重复3次，移除上清，加入抗体和病毒作用后的液体将细胞悬起，于冰上作用30min，之后如上清洗5次，移除上清，最后加入200μl裂解液裂解。

Post attachment：

将接种12孔板中过夜培养的细胞消化至EP管中，清洗3次，移除上清，加入病毒液(MOI＝1)将细胞重悬，冰上孵育30min，按照上述步骤洗5次，移除上清，加入抗体溶液(终浓度为0nM、3nM、30nM、300nM)将细胞重悬，冰上孵育30min，按照上述步骤清洗5次，移除上清，最后加入200μl裂解液进行裂解。

将Pre/post attachment得到的裂解液提取核酸，并进行QPCR定量分析。

QPCR步骤：通过QPCR对4B10/6C5处理后残留在RD细胞表面的E30进行定量。简而言之，在病毒附着于细胞的MOI为1的前后，E30在4℃下与各种浓度的 6C5混合。然后将细胞洗涤3次，并通过RNeasy mini试剂盒(Qiagen，Hilden， Germany)提取总RNA，并在QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument(Applied Biosystems,Foster City,USA)上使用SuperScrip III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit(Invitrogen,Carlsbad,USA)进行QPCR。20μL反应体系包含0.2μL SuperScript III RT/Platinum TaqMix，5μL 2X SYBR Green Reaction Mix，10Μm正向引物(5'-AACAGCAGCGTTGCCCGCGTCTA-3')和反向引物(5'-ACCCTG TAGTTCCCTACATA-3')各0.2μL，2μL总RNA，2.4μL无RNase的H₂O。QPCR扩增程序为：42℃、5分钟用于逆转录，95℃、5分钟用于逆转录灭活。随后95℃变性15s，共40个循环，60℃退火并延伸30s。内源性管家基因β-肌动蛋白(正向引物：5'-GCCCTGAGGCACTCTTCCA-3'，反向引物： 5'-CGGATGTCCACGTCACACTT-3')被用作内部对照以标准化样品。通过2^-ΔΔCt法进行不同样品中E30 RNA的相对水平的分析。

3.3.2结果

结果如图8所示：病毒与细胞接触前(图8A)或接触后(图8B)抗体(4B10和6C5) 均能够有效抑制病毒的活性，表明抗体可以竞争性抑制病毒与病毒受体的识别与结合，并且已经结合受体的病毒也可以被抗体(4B10和6C5)竞争下来。

4、抗体效价和抗体结合表位的免疫优势测定

将培养的E30病毒用甲醛进行灭活、浓缩、蔗糖密度梯度离心，在不同蔗糖梯度层得到纯度较高的空心和实心病毒颗粒；将空心和实心颗粒按照实施例1的步骤分别注射免疫小鼠，然后取血得到抗血清。

利用表位竞争测定

步骤：

为了测试与抗体4B10或6C5结合的表位是否具有免疫优势，首先将纯化的 E30全颗粒包被在Elisa平板上，然后按照上述Elisa方法将平板封闭。然后加入针对氢氧化铝佐剂化的E30实心颗粒的血清(anti-F-par sera)，氢氧化铝佐剂化的病毒空心颗粒的血清(anti-E-par sera)或氢氧化铝佐剂的血清(anti-adj sera)。在 37℃下孵育0.5小时后，将所有孔洗涤五次，并添加HRP缀合的4B10/6C5-IgG，以在37℃下进一步孵育0.5小时。然后洗涤孔，添加TMB底物，2M H₂SO₄，并如上所述在A450读取。抑制百分比计算公式为(OD阴性对照-OD血清)/OD阴性对照×100％。

结果：

灭活的E30实心颗粒和空心颗粒的抗血清能够有效中和病毒E30对细胞的感染，效价分别达到1：12和1：11(图9)，并且它们二者与病毒的结合能够block掉约60-80％的4B10和6C5的抗原表位。表明4B10和6C5所识别的抗原表位是免疫优势表位(图10)。

6、抗体对病毒稳定性的影响

Thermofluor实验步骤：

使用MX3005 qPCR仪(Agilent，Santa Clara，USA)，用SYTO9和SYPROred(Invitrogen，Carlsbad，USA)作为荧光探针检测RNA和蛋白质的疏水性残基。建立50μl反应体系，该体系包含2μg目标蛋白，5μM SYTO9和3X SYPROred，并将温度从25℃升至99℃。以1℃的间隔一式三份记录荧光。

结果：4B10-IgG与6C5-IgG与E30的结合均能够微弱破坏E30的稳定性，提示二者的结结合区间可能与病毒的与受体的结合区域相关(图11)，图中E30 F-particle。

序列表

<110> 江苏省疾病预防控制中心（江苏省公共卫生研究院）

<120> Echo30单克隆抗体的制备及其用途

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Tyr Pro His Ser Gly Asn Thr

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Thr Arg Asp Leu Arg Gly Phe Ala Tyr

1 5

<210> 4

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro His Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Arg Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Asp Leu Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ser Ser Leu Arg Tyr

1 5

<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Thr Tyr

1

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 8

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Leu Arg Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Tyr Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggctacacat tcaccaccta ctgg 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atttatcctc atagtggtaa tact 24

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acaagagatt tacggggctt tgcttac 27

<210> 12

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caggtgcagc tgcagcagtc tgggtctgag ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60

tcctgcaggg cttctggcta cacattcacc acctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggaaat atttatcctc atagtggtaa tactaactac 180

gatgagaggt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagagattta 300

cggggctttg cttactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctca 348

<210> 13

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcaagtttac gttac 15

<210> 14

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gacacatac 9

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cagcagtgga gtagtaaccc acccacg 27

<210> 16

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gacattgagc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtttacgt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120

acctccccca aaagatggat ttatgacaca tacaacctgg cctctggagt ccctgttcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cacccacgtt cggtgctggg 300

accaagctgg agctgaaa 318

Claims

1.一种抗Echo30的抗体或其抗原结合片段，其包含VH和 VL；

VH的CDR1序列如SEQ ID NO：1所示；VH的CDR2序列如SEQ ID NO：2所示；VH的CDR3序列如SEQ ID NO： 3所示；VL的CDR1序列如SEQ ID NO：5所示；VL的CDR2序列如SEQ ID NO：6所示；VL的CDR3序列如SEQ ID NO： 7所示。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段包括所述抗体的Fab片段、F(ab’) 2片段、单链Fv片段。

4.一种组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。

6.一种核酸，其包含编码如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的核酸，所述核苷酸序列如SEQ NO ID：9-16所示。

8.一种载体，其包含如权利要求6或7所述的核酸。

9.一种宿主细胞，其用如权利要求8所述的载体转化。

10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核宿主细胞、真核宿主细胞。

11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核宿主细胞经工程化以表达如权利要求6或7所述的核酸。

12.根据权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。

13.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括：(a)培养如权利要求9-12中任一项所述的宿主细胞及(b)回收该抗体或其抗原结合片段。

14.一种产品，所述产品包括以下任一项所述的产品：

（1）检测样品中Echo30的产品；

（2）诊断Echo30感染或其导致的疾病的产品；

所述产品包括权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

15.根据权利要求14所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒，所述试剂盒包括附着于固相底物上的所述抗体或其抗原结合片段以及可检测的、被标记的第二抗体。

16.根据权利要求15所述的产品，其特征在于，所述第二抗体能特异性地结合Echo30。

17.根据权利要求16所述的产品，其特征在于，所述试剂盒还包括控制标准。

18.根据权利要求14所述的产品，其特征在于，所述疾病包括脑膜炎。

19.一种非诊断目的的检测样品中Echo30的方法，其包括如下步骤：

a)将样品与权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段进行接触；

b)检测所述抗体或其抗原结合片段与Echo30的反应。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段附着在固相底物上。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述固相底物选自如下一组：微滴定板、磁颗粒、胶乳颗粒和硝化纤维素膜。

22.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述反应的测定方法包括酶显色、荧光、化学发光。

23.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的应用，其包括以下任一项应用：

（1）在制备检测Echo30的产品中的应用；

（2）在制备诊断Echo30感染或其导致的疾病的产品中的应用；

（3）在制备治疗或预防Echo30感染的药物中的应用；

（4）在制备治疗或预防Echo30感染导致的疾病的药物中的应用。

24.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述疾病包括脑膜炎，上呼吸道感染，心肌炎，皮疹，呕吐，发烧，头痛。