CN111153990B - 针对Echo30的单克隆抗体、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了针对Echo30的单克隆抗体、制备方法及其应用。本发明进一步公开了抗Echo30抗体的抗原结合片段。本发明还涉及包含本发明抗体的组合物、检测产品、诊断产品。本发明进一步涉及包含编码所述抗体序列的分离的核酸、载体和宿主细胞和所述抗体在诊断或治疗方面的用途。

Description

针对Echo30的单克隆抗体、制备方法及其应用
技术领域
本申请属于生物医学领域，具体涉及针对Echo30的单克隆抗体、制备方法及其应用。
背景技术
人肠道致细胞病变孤儿病毒(Enteric Cytopathogenichuman Orphan Virus，ECHO)，简称埃可病毒，是一类单股正链RNA的肠道病毒，有34个血清型。最初对其致病性并不清楚，后来证明埃可病毒与无菌脑膜炎、婴儿腹泻、手足口病等多种疾病有关。大量研究和数据分析最终显示，本病遍布世界各地，在人群中引起广泛传播或流行，其感染可引起无菌性脑膜炎、发疹、胃肠道疾病、肝炎和肺炎等多种人类疾病，其中无菌性脑膜炎最为常见，可通过呼吸道和消化道传播。孕妇感染后可通过胎盘传播给胎儿，可引起胎儿畸形甚至死胎。
埃可病毒30型(Echo30)是肠道埃可病毒的一个型别，该病毒传播途径广、传染性强，感染者多为15岁以下的儿童。感染后可引发多种疾病，其中无菌性脑膜炎为较严重的并发症，Echo30已成为近年来引起国内外儿童无菌性脑膜炎的主要病原体。
目前对Echo30病毒相关研究比较少，更无特异性抗体的报道。本申请目的是制备针对Echo30病毒的特异性抗体以便检测Echo30病毒及其导致的相关疾病。
发明内容
本发明涉及一种单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体包括重链可变区中的一个或多个CDR，和/或，轻链可变区中的一个或多个CDR；
优选地，
重链可变区的CDR的氨基酸序列选自：
SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列；
或在SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列基础上经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列；
或与SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
更优选地，
重链可变区CDR1具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或具有在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列基础上经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列；或具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
重链可变区CDR2具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或具有在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列基础上经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列；或具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
重链可变区CDR3具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，或具有在SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列基础上经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列；或具有与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
优选地，
轻链可变区的CDR的氨基酸序列选自：
SEQ ID NO：5-7所示的氨基酸序列；
或在SEQ ID NO：5-7所示的氨基酸序列基础上经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列；
或与SEQ ID NO：5-7所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
更优选地，
轻链可变区CDR1具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，或具有在SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列基础上经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列；或具有与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
轻链可变区CDR2具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，或具有在SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列基础上经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列；或具有与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
轻链可变区CDR3具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，或具有在SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列基础上经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列；或具有与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。
最优选地，重链可变区CDR1具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；重链可变区CDR2具有SEQ ID NO：2；重链可变区CDR3具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；轻链可变区CDR1具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；轻链可变区CDR2具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；轻链可变区CDR3具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
进一步，所述单克隆抗体包括重链可变区和/或轻链可变区，其中：
所述重链可变区具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或具有在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列基础上经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列；或具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
所述轻链可变区具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，或具有在SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列基础上经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列；或具有与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。
优选地，所述重链可变区具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；所述轻链可变区具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
本发明中使用的“至少有80％同源性”是指有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同源性。
所述单克隆抗体的抗原结合部分包括所述单克隆抗体的Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv片段。
本发明所披露的单克隆抗体进一步还包含构架区。所述框架区包括鼠受体框架区、或人受体框架区。
本发明的单克隆抗体也可以为CDR嫁接抗体。优选地，CDR嫁接抗体包含一个或多个上述披露的CDRs。
优选地，CDR嫁接抗体包含受体构架区。
本发明的单克隆抗体可以为人源化抗体。优选地，人源化抗体包含一个或多个上述披露的CDRs。更优选地，人源化抗体包含三个或更多个上述披露的CDRs。最优选地，人源化抗体包含6个上述披露的CDRs。在一个特定的实施方案中，将CDRs插入人抗体可变区的人受体构架区中。优选地，人抗体可变区为共有的人可变区。更优选地，人受体构架区在关键残基处包含至少一个构架区氨基酸取代，其中关键残基选自邻近于CDR的残基；糖基化位点残基；稀有残基；能对Aβ(20-42)球聚体有影响的残基；能对CDR有影响的残基；规范残基；重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；游标(Vernier)区残基；和Chothia定义的可变重链CDR1与Kabat定义的第一重链构架区之间重叠区中的残基。优选地，人受体构架区包含至少一个构架区氨基酸取代，其中构架区的氨基酸序列至少65％相同于所述人受体构架区的序列并且包含至少70个与所述人受体构架区相同的氨基酸残基。
本发明所披露的单克隆抗体进一步还包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE恒定区的重链恒定区。
本发明所披露的单克隆抗体可以为糖基化的抗体。优选糖基化型为人糖基化型或在此披露的任何一种真核细胞特别是CHO细胞所产生的糖基化型。
本发明还涉及本发明的单克隆抗体的抗原结合部分。上述抗原结合部分包括但不限于抗体的Fab片段、F(ab’)2片段和单链Fv片段。更多的抗原结合部分为Fab’片段、Fv片段和二硫键连接的Fv片段。
本发明还提供了一种编码任何一种在此披露的抗体的分离的核酸。进一步的实施方案提供了一种包含在此披露的分离的核酸的载体。所述载体可特别选自pcDNA；pTT(Durocher等，Nucleic Acids Research 2002，Vol 30，No.2)；pTT3(具有额外的多克隆位点的pTT)；pEFBOS(Mizushima，S.和Nagata，S.，(1990)Nucleic Acids Research Vol 18，No.17)；pBV；pJV和pBJ。
用本文所披露的载体转化宿主细胞。优选地，宿主细胞为原核细胞。更优选地，宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)。在一个相关实施方案中，宿主细胞为真核细胞。优选地，真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞(如哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞)、植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞为哺乳动物细胞，包括但不限于CHO和COS；或为真菌细胞，如酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；或为昆虫细胞如Sf9。
在本发明的具体实施方案中，编码重链可变区CDR1的核酸具有SEQ ID NO：9所示的序列；编码重链可变区CDR2的核酸具有SEQ ID NO：10所示的序列；编码重链可变区CDR3的核酸具有SEQ ID NO：11所示的序列；编码轻链可变区CDR1的核酸具有SEQ ID NO：13所示的序列；编码轻链可变区CDR2的核酸具有SEQ ID NO：14所示的序列；编码轻链可变区CDR3的核酸具有SEQ ID NO：15所示的序列。
在本发明的具体实施方案中，编码重链可变区的核酸具有SEQ ID NO：12所示的序列；编码轻链可变区的核酸具有SEQ ID NO：16所示的序列。
本发明还提供了一种产生本发明的抗体的方法，本发明的抗体可用本领域已知的方法获得。
标准的杂交瘤技术可使针对目的抗原具有单一特异性的抗体得以产生。简言之，将无限增殖细胞系(通常为骨髓瘤)与用埃可病毒30型免疫接种的哺乳动物的淋巴细胞(通常为脾细胞或淋巴结细胞或外周血淋巴细胞)融合，并筛选所得到的杂交瘤细胞的培养物上清液，以便鉴定产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤。诸多众所周知的用于融合淋巴细胞和无限增殖细胞系的方法中的任何一种都可用于该目的(也参见G.Galfre等(1977)Nature266：550-52；Gefter等Somatic Cell Genet.，在前引证的；Lerner，Yale J.Biol.Med.，在前引证的；Kenneth，Hybridoma，在前引证的)。此外，本领域技术人员应当理解存在着上述方法的不同变化，其同样是有用的。典型地，无限增殖细胞系(如骨髓瘤细胞系)来源于与淋巴细胞相同的哺乳动物物种。例如，可通过将来自用本发明的免疫原性制品免疫接种的小鼠的淋巴细胞与无限增殖的小鼠细胞系融合建立鼠杂交瘤。优选的无限增殖细胞系为对含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基(HAT培养基)敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。多种骨髓瘤细胞系中的任何一种均可默认用作为融合伴侣，例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤细胞系。这些骨髓瘤细胞系可获得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD。典型地，使用聚乙二醇(PEG)将HAT-敏感的小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合。然后利用HAT培养基选择由融合产生的杂交瘤细胞，由此杀死未融合的以及没有出产物的融合的骨髓瘤细胞(几天后由于未融合的脾细胞没有转化因此死亡了)。通过对上述抗体筛选杂交瘤培养物上清液鉴定产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
可通过在宿主细胞中重组表达编码免疫球蛋白轻链和重链的基因产生本发明的抗体或抗体部分。为了重组表达抗体，用一种或多种携带编码所述抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，由此在宿主细胞中表达轻链和重链并优选将它们分泌入培养所述宿主细胞的培养基中。可从该培养基分离抗体。使用标准的重组DNA方法以便获得编码抗体重链和轻链的基因，将所述基因插入重组表达载体中以及将所述载体导入宿主细胞中。
优选用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞(包括描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220中的dhfr-CHO细胞，其与如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所描述的DHFR-选择标记一起使用)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞直至抗体在所述宿主细胞中表达，从而产生抗体，或优选地，抗体分泌入宿主细胞生长的培养基中。然后可通过使用标准的蛋白纯化方法从培养基中分离抗体。
为了产生完整抗体的一部分如Fab片段或scFv分子，同样有可能使用宿主细胞。上述方法的变形当然包括在本发明中。例如，用编码本发明的抗体的轻链或重链(但非两者)的DNA转染宿主细胞可能是合乎需要的。如果轻链或重链的存在对于目的抗原结合不是必需的，则通过利用重组DNA技术可部分或完全除去编码上述轻链或上述重链或两者的DNA。上述截短的DNA分子所表达的分子同样地包括于本发明的抗体中。此外，通过利用标准的化学方法将本发明的抗体与另一种抗体交联，有可能产生其中一条重链和一条轻链为本发明的抗体的以及另一条重链和另一条轻链具有针对不同于目的抗原的抗原的特异性的双功能抗体。
在本发明的具体实施方案中，本发明公开了一种生产抗体的方法：包括在适合于产生抗体的条件下，在培养基中培养本文所披露的任何一种宿主细胞。本发明还提供了一种通过本文所披露的上述方法可获得的抗体。
用于产生抗体的本发明的方法可用于产生多种类型的抗体。这些包括单克隆的、特别是重组抗体，基本上尤其是人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和CDR嫁接抗体，以及它们的抗原结合部分。
本发明进一步涉及能产生(分泌)本发明的单克隆抗体的杂交瘤。
本发明还涉及一种包含如上所定义的本发明的抗体或其抗原结合部分的组合物。
根据一个特定的实施方案，所述组合物是一种包含本发明的抗体或抗原结合部分以及药学上可接受的载体的药物组合物。
药学上可接受的载体包括任何溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等，只要它们是生理学相容的。药学上可接受的载体包括例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等，以及它们的组合。在多数情况下，优选使用等渗剂例如糖类、诸如甘露糖醇或山梨糖醇的多元醇类或氯化钠。药学上适合的载体可额外包含相对少量的增加抗体半衰期或有效性的辅助物质如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。
本发明的组合物可具有多种剂型。这些剂型包括液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(如可注射和可输注的溶液)、分散液或混悬剂、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的剂型取决于期望的给药类型以及治疗应用。典型地，组合物优选以可注射的或能输注的溶液形式给予，例如类似于用于人被动免疫接种的其他抗体的组合物。优选的给药途径为肠胃外(如静脉内、皮下、腹膜内或肌内)给药。根据一个优选的实施方案，通过静脉输注或注射给予抗体。根据另一个优选的实施方案，通过肌内或皮下注射给予抗体。
本发明还提供了一种检测埃可病毒30型存在的产品，所述产品包括本发明所披露的单克隆抗体或其抗原结合部分。
本发明还提供了一种诊断埃可病毒30型感染导致的疾病的产品，所述产品包括本发明所披露的单克隆抗体或其抗原结合部分。
本发明的上述产品根据免疫学的方法进行检测或诊断。原则上，其可通过使用任何其中使用了抗体的分析或诊断测定方法执行，包括凝集和沉淀技术、免疫测定法、免疫组织化学法和免疫印迹技术，例如蛋白质印迹，或优选地斑点印迹法。体内方法例如成像法也包括在此。
优选地，所述产品包括试剂盒，所述试剂盒包含：a)本发明的单克隆抗体或抗原结合部分，和b)包含连接有信号产生化合物的抗体的缀合物，其中缀合物的抗体不同于本发明分离的单克隆抗体。
如上所述，缀合物(或指示剂)应包含连接有信号产生化合物或标记的抗体(或许是抗-抗体，取决于测定法)。该信号发生化合物或“标记”是自身可检测的或可与一种或多种其他化合物起反应以产生可检测的产物。信号产生化合物的例子包括发色团，放射性同位素(如125I、131I、32P、3H、35S和14C)、化学发光化合物(如吖啶鎓)、颗粒(可见的或荧光的)、核酸、络合剂或催化剂如酶(如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和核糖核酸酶)。在使用酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)的情况下，添加显色、发出荧光或发光的底物能引起可检测信号的产生。其他检测系统如时间分辨荧光测定、内反射荧光测定、扩增(如聚合酶链反应)和拉曼光谱学也是有用的。
可通过上述免疫测定进行检验的生物样品的例子包括血浆、全血、干的全血、血清、脑脊液或组织和细胞的水或有机-水提取物。
本发明还提供了治疗或预防埃可病毒30型感染的方法，述方法包括给予个体前面所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。
进一步，所述给予个体的所述单克隆抗体或其抗原结合部分用于被动免疫接种。
本发明还提供了治疗或预防埃可病毒30型感染导致的疾病的方法，所述方法包括给予个体前面所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。
进一步，所述给予个体的所述单克隆抗体或其抗原结合部分用于被动免疫接种。
本发明还提供了检测埃可病毒30型的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提供怀疑存在埃可病毒30型的样品；
(2)将样品与前面所述的单克隆抗体或抗原结合部分接触；
(3)检测包含所述单克隆抗体或抗原结合部分与抗原的复合物的形成，存在复合物则指示样品中含有埃可病毒30型。
本发明还提供了前面所述的单克隆抗体或其抗原结合部分在制备检测埃可病毒30型的产品中的应用。
本发明还提供了前面所述的单克隆抗体或其抗原结合部分在制备诊断埃可病毒30型感染导致的疾病的产品中的应用。
本发明还提供了前面所述的单克隆抗体或其抗原结合部分在制备治疗或预防埃可病毒30型感染的药物中的应用。
本发明还提供了前面所述的单克隆抗体或其抗原结合部分在制备治疗或预防埃可病毒30型感染导致的疾病的药物中的应用。
本发明中所公开的埃可病毒30型感染导致的疾病包括但不限于脑膜炎，上呼吸道感染，心肌炎，皮疹，呕吐，发烧，头痛。
所述上呼吸道感染包括咳嗽、咽痛等流感样症状。
所述脑膜炎包括无菌性脑膜炎。无菌性脑膜炎又包括儿童无菌性脑膜炎。
如本文中所使用的，术语“CDR”指抗体可变序列内的互补决定区。在每一重链和轻链可变区内存在三个CDR，对于每一可变区其称为CDR1、CDR2和CDR3。
附图说明
图1显示本发明抗体的SDS-PAGE图；
图2显示本发明抗体的亲和活性曲线，其中，A：4B10-IgG，B：4B10-Fab，C：6C5-IgG，D：6C5-Fab；
图3显示本发明病毒与受体结合的亲和力曲线，其中，A：FcRn，B：CD55；
图4显示本发明的抗体对病毒与其受体结合的抑制曲线，其中，A：先加入6C5抗体后加入受体，B：先加入受体后加入6C5抗体；C：先加入4B10抗体后加入受体，D：先加入受体后加入4B10抗体；
图5显示本发明抗体的亲和活性专一性测定图；
图6显示本发明的抗体的中和活性统计图，其中，A：6C5，B：4B10；
图7显示本发明的抗体的中和活性专一性测定图；
图8显示病毒与细胞接触前或接触后抗体对病毒活性的影响结果图，其中，A：接触前，B：接触后；
图9显示灭活E30颗粒免疫小鼠后血清的效价统计图；
图10显示本发明的抗体与病毒结合对抗原表位的影响图；
图11显示本发明的抗体与病毒结合对病毒稳定性影响的结果图，其中：A：pH＝5.5的缓冲液，B：pH＝7.4的缓冲液，C：A导数值，D：B导数值。
具体实施方式
以下实施例旨在举例说明本发明，而不限制其范围。
实施例1单克隆抗体制备
1、免疫原(抗原)：Echo30。
每只小鼠免疫5次，每次100μl抗原，病毒共需3-3.5ml。
2、动物免疫
使用两种佐剂进行免疫，分别为改良的弗氏佐剂及水性佐剂，病毒免疫两组，每3只小鼠为一组，使用一种佐剂，病毒共免疫6只小鼠。所有免疫均在SPF动物房中进行。
选取5-8周龄Balb/c小鼠6只(雌鼠)，免疫原与佐剂混匀后分别乳化进行免疫，第一次注射使用弗氏完全佐剂，以后4次加强注射使用弗氏不完全佐剂，均与等体积抗原充分混匀后注射。
免疫方法为背部多点注射，免疫量主注射100μl抗原/只实验鼠，加强注射100μl抗原/只实验鼠，免疫周期6-8周。
3、单克隆抗体制备流程
抗血清检测：将病毒包板酶标板，间接ELISA方法检测抗血清效价。血清效价大于1:50K，方可进行下一步融合。如有多个小鼠效价超过1：50K，选择效价最高的小鼠进行融合。
骨髓瘤细胞制备：融合前一周，复苏SP2/0细胞，正常培养至对数期。
脾细胞制备：选定要融合的小鼠，融合当天用颈椎脱臼法处死，取脾，标准流程收集脾细胞并计数。
细胞融合：按1:3-1：10的比例混合骨髓瘤细胞和脾细胞，标准流程进行细胞融合操作，随后用HAT DMEM完全培养基培养，融合后3天即可以看到杂交瘤细胞，第7天换1/2HAT完全培养基，第8天换1/2HT培养基。融合后10天左右开始进行筛选检测。
细胞融合结果：融合后用HAT选择性培养基培养，显微镜下观察，看到多个生长的杂交瘤细胞，证明融合操作成功。
融合筛选：吸取细胞上清100μl/孔进行间接ELISA检测。根据ELISA结果，判断阳性孔。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次复检，进一步确认阳性孔。
亚克隆：对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆。(因为第一次亚克隆得到的阳性孔细胞株尚不稳定，有可能包含多个杂交瘤细胞，普遍认为第二次亚克隆后杂交瘤细胞为单个细胞株，并确定为阳性)。
4、病毒中和实验：将含有抗体的培养液上清(第一次亚克隆后制备的培养上清，均为对抗原ELISA阳性)与一定浓度的抗体一起接种细胞，噬斑减少或者没有发生的孔，即为中和抗体阳性孔。
5、腹水制备及抗体纯化
5.1腹水制备
将上述阳性细胞扩大培养并注射至Balb/C小鼠(经弗氏不完全佐剂至敏)的腹腔，一般7-10日可见小鼠腹部隆起即代表有腹水产生。当小鼠有明显腹水产生时及时抽取腹水。
5.2腹水纯化
将上述细胞的腹水，用Protein A/G进行纯化，纯化后抗体纯度大于90％。检测浓度纯度后，调整浓度至2mg/ml。
6、抗体鉴定
利用SDS-PAGE检验抗体的表达及纯化情况，结果见图1，证实得到较纯蛋白，可清晰观察到解链后的抗体轻、重链，注：图中M所在泳道代表的是蛋白Marker。
7、抗体序列测定
经测序，鉴定出的命名为4B10的单克隆抗体的氨基酸序列和核苷酸序列如下及表1所示。
重链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：12所示。
EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGYYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTGAYGSTYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：4)
GAGGTGCAGCTGGAGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTTATTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTACAGGAGCCTACGGTAGTACCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO：12)
轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：16所示。
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNSLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPHTFGAGTKLELK(SEQ ID NO：8)；
GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGTATCAACAGAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAGTAACAGCTGGCCTCACACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO：16)
表1抗体序列
Figure BDA0002368852810000131
实施例2抗体功能
1、抗原抗体亲和力测定
1.1表面等离子共振法(SPR)
1.1.1步骤：
利用Pierce Fab Preparation Kit(Thermo)对4B10-IgG(全长抗体)、6C5-IgG(全长抗体)进行切割以及纯化得到4B10-Fab(抗体的Fab片段)、6C5-Fab(抗体的Fab片段)。
使用BIAcore T100(Biacore，GE Healthcare)进行SPR实验，缓冲液为含有0.05％Tween-20的PBS。使用NHS/EDC方法将纯化的E30全病毒颗粒固定在CM5传感器芯片表面上，直到RU值达到740。然后，梯度浓度的IgG或Fab以20μl/min的速度流经芯片，并在每个注射周期后使用10mM甘氨酸-盐酸(pH 1.7)再生芯片。通过使用软件BIAevaluation(版本4.1)全局拟合曲线来获得结合亲和力。
1.1.2结果
结果如图2所示，4B10-IgG(全长抗体)，4B10-Fab(抗体的Fab片段)，6C5-IgG(全长抗体)，6C5-Fab(抗体的Fab片段)与E30的亲和力分别达到：2.88nM、67.70nM、1.51nM、3.68nM。
1.2竞争性SPR
1.2.1步骤
竞争性SPR步骤与上述SPR类似，将E30病毒颗粒固定在CM5芯片上直至RU值达到740。第一针加入受体或抗体直至拟合曲线饱和，然后第二针再进待测竞争性抗体或受体。通过拟合曲线的变化趋势反应前后两种物质针对芯片上E30病毒颗粒的结合竞争关系。
1.2.2结果
结果显示：病毒与受体(FcRn和CD55)的亲和力分别达到：2.38μM(图3A)和2.11μM(图3B)，远小于病毒与抗体的亲和力，并且相比于对照组(第一针加入1A1，一个针对E6病毒的特异性抗体)，加入E30抗体，能够强力抑制FcRn与CD55和E30的结合(对照成立，ICAM5是EVD68特异性的细胞受体)(图4A和图4C)。而相反地，先加入细胞受体并不能有效抑制抗体与病毒的结合(图4B和图4D)。
2、抗原抗体结合特异性测定
使用ELISA实验进行测定。
2.1步骤
将纯化的病毒颗粒(E30，E6，E3，E11或CVB3)以30ng/孔包被到ELISA板(Costar，Corning，USA)上，然后在4℃下孵育过夜。在37℃下用含有1％BSA的PBST溶液(PBS加0.1％Tween20)封闭包被板2小时。此后，将板用PBST洗涤五次，并在37℃下以1：1000的稀释度将4B10-IgG或6C5-IgG作为第一抗体添加到每个孔中作用1小时。再次用PBST洗涤板五次，并添加HRP缀合的山羊抗小鼠IgG H&L(1:3000稀释)(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)作为二抗。在37℃下放置0.5小时。将板用PBST洗涤五次，并且在室温下将3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物(碧云天，中国上海)添加到每个孔中作用5分钟。最后，将2M H2SO4加入板中以终止反应，并读取每个孔在450nm的吸光度值。
2.2结果
结果如图5所示，4B10和6C5均能特异性地识别E30，而与E3，E6，E11和CVB3不发生反应。说明二者是E30特异性的。
3、抗体中和活性检测
3.1减少斑块的中和试验(PRNT)
3.1.1步骤
将4B10/6C5-IgG，4B10/6C5-Fab或小鼠血清在DMEM培养基中稀释以达到2倍系列稀释，最高浓度分别为128nM，128nM，384nM或64nM。此外建立了一个没有任何抗体，Fab或血清的对照组。将相同数量的E30病毒(PFU范围从50到100)与每种稀释液混合，在37℃下孵育1小时，然后添加到接种在6孔板中的RD细胞的汇合单层中。将板放回细胞培养箱培养1小时，每20分钟轻轻震荡一下，之后用DMEM(pH 7.4)冲洗3次。用添加2％FBS的琼脂糖覆盖物(1％(质量体积比)AGAROSEⅡ(Amresco)，溶剂为双蒸水)(2mL/孔)覆盖，并在5％CO2细胞培养箱中于37℃孵育3天。然后用2.5％的结晶紫染色使噬菌斑可视化，抑制百分比计算为(Ncontrol-Ntest)/Ncontrol x 100％，其中Ncontrol和Ntest分别代表对照组和测试组中观察到的噬菌斑计数的平均值。所有实验均重复三次。
3.1.2结果
结果如图6所示，4B10-IgG，4B10-Fab，6C5-IgG，6C5-Fab对E30的Neut50分别达到：0.3nM，25nM，1.2nM和6.8nM。
3.2交叉中和实验
3.2.1步骤
将50nM或500nM的4B10或6C5与一定量的E30(PFU＝～50)在37℃下混合1小时，然后添加到RD细胞铺满的单层中。在温育和漂洗后，将细胞用琼脂糖覆盖物覆盖并在37℃下再温育三天，然后用结晶紫染色，抑制率计算公式为：(Ncontrol-Ntest)/Ncontrol x100％，其中Ncontrol和Ntest分别代表对照组和测试组中观察到的噬菌斑计数的平均值。所有实验均重复三次。
3.2.2结果
结果如图7所示，50nM和500nM的4B10-IgG和6C5-IgG均能够100％中和E30的感染活性，而等量的这两种抗体却对E3、E6、E11和CVB3起不到任何的中和作用，说明二者对E30的中和活性具有极高的专一性。
3.3Pre/post attachment实验
3.3.1步骤
Pre attachment
将抗体溶液(终浓度为0nM、3nM、30nM、300nM)和病毒(MOI＝1)于冰上作用30min，将接种12孔板中过夜培养的细胞消化至EP管中，离心1000rpm，5min，移除上清，加入1mlDMEM，将细胞悬起，再次离心，重复3次，移除上清，加入抗体和病毒作用后的液体将细胞悬起，于冰上作用30min，之后如上清洗5次，移除上清，最后加入200μl裂解液裂解。
Post attachment：
将接种12孔板中过夜培养的细胞消化至EP管中，清洗3次，移除上清，加入病毒液(MOI＝1)将细胞重悬，冰上孵育30min，按照上述步骤洗5次，移除上清，加入抗体溶液(终浓度为0nM、3nM、30nM、300nM)将细胞重悬，冰上孵育30min，按照上述步骤清洗5次，移除上清，最后加入200μl裂解液进行裂解。
将Pre/post attachment得到的裂解液提取核酸，并进行QPCR定量分析。
QPCR步骤：通过QPCR对4B10/6C5处理后残留在RD细胞表面的E30进行定量。简而言之，在病毒附着于细胞的MOI为1的前后，E30在4℃下与各种浓度的6C5混合。然后将细胞洗涤3次，并通过RNeasy mini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)提取总RNA，并在QuantStudioDx Real-Time PCR Instrument(Applied Biosystems,Foster City,USA)上使用SuperScrip III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit(Invitrogen,Carlsbad,USA)进行QPCR。20μL反应体系包含0.2μL SuperScript III RT/Platinum Taq Mix，5μL2XSYBR Green Reaction Mix，10Μm正向引物(5'-AACAGCAGCGTTGCCCGCGTCTA-3')和反向引物(5'-ACCCTG TAGTTCCCTACATA-3')各0.2μL，2μL总RNA，2.4μL无RNase的H2O。QPCR扩增程序为：42℃、5分钟用于逆转录，95℃、5分钟用于逆转录灭活。随后95℃变性15s，共40个循环，60℃退火并延伸30s。内源性管家基因β-肌动蛋白(正向引物：5'-GCCCTGAGGCACTCTTCCA-3'，反向引物：5'-CGGATGTCCACGTCACACTT-3')被用作内部对照以标准化样品。通过2-ΔΔCt法进行不同样品中E30 RNA的相对水平的分析。
3.3.2结果
结果如图8所示：病毒与细胞接触前(图8A)或接触后(图8B)抗体(4B10和6C5)均能够有效抑制病毒的活性，表明抗体可以竞争性抑制病毒与病毒受体的识别与结合，并且已经结合受体的病毒也可以被抗体(4B10和6C5)竞争下来。
4、抗体效价和抗体结合表位的免疫优势测定
将培养的E30病毒用甲醛进行灭活、浓缩、蔗糖密度梯度离心，在不同蔗糖梯度层得到纯度较高的空心和实心病毒颗粒；将空心和实心颗粒按照实施例1的步骤分别注射免疫小鼠，然后取血得到抗血清。
利用表位竞争测定
步骤：
为了测试与抗体4B10或6C5结合的表位是否具有免疫优势，首先将纯化的E30全颗粒包被在Elisa平板上，然后按照上述Elisa方法将平板封闭。然后加入针对氢氧化铝佐剂化的E30实心颗粒的血清(anti-F-par sera)，氢氧化铝佐剂化的病毒空心颗粒的血清(anti-E-par sera)或氢氧化铝佐剂的血清(anti-adj sera)。在37℃下孵育0.5小时后，将所有孔洗涤五次，并添加HRP缀合的4B10/6C5-IgG，以在37℃下进一步孵育0.5小时。然后洗涤孔，添加TMB底物，2M H2SO4，并如上所述在A450读取。抑制百分比计算公式为(OD阴性对照-OD血清)/OD阴性对照×100％。
结果：
灭活的E30实心颗粒和空心颗粒的抗血清能够有效中和病毒E30对细胞的感染，效价分别达到1：12和1：11(图9)，并且它们二者与病毒的结合能够block掉约60-80％的4B10和6C5的抗原表位。表明4B10和6C5所识别的抗原表位是免疫优势表位(图10)。
6、抗体对病毒稳定性的影响
Thermofluor实验步骤：
使用MX3005 qPCR仪(Agilent，Santa Clara，USA)，用SYTO9和SYPROred(Invitrogen，Carlsbad，USA)作为荧光探针检测RNA和蛋白质的疏水性残基。建立50μl反应体系，该体系包含2μg目标蛋白，5μM SYTO9和3X SYPROred，并将温度从25℃升至99℃。以1℃的间隔一式三份记录荧光。
结果：4B10-IgG与6C5-IgG与E30的结合均能够微弱破坏E30的稳定性，提示二者的结结合区间可能与病毒的与受体的结合区域相关(图11)，图中E30F-particle。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 江苏省疾病预防控制中心（江苏省公共卫生研究院）
<120> 针对Echo30的单克隆抗体、制备方法及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr
1 5
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Gly Ala Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Gly Ala Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Ser Ile Ser Asn Ser
1 5
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Tyr Ala Ser
1
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His Thr
1 5
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggattcactt tcagtagcta tacc 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
attagtagtg gtggttatta cacc 24
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acaggagcct acggtagtac ctactacttt gactac 36
<210> 12
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaggtgcagc tggaggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatacca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggttatta cacctactat 180
ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aggagcctac 300
ggtagtacct actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caaagtatta gcaacagc 18
<210> 14
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tatgcttcc 9
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caacagagta acagctggcc tcacacg 27
<210> 16
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gatattgtgc taactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagcgtcagt 60
ctttcctgca gggccagcca aagtattagc aacagcctac actggtatca acagaaatca 120
catgagtctc caaggcttct catcaagtat gcttcccagt ccatctctgg gatcccctcc 180
aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctca gtatcaacag tgtggagact 240
gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag agtaacagct ggcctcacac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321

Claims (18)

1.一种抗埃可病毒30型的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合部分包括重链可变区CDR1-CDR3以及轻链可变区CDR1-CDR3；
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述单克隆抗体的抗原结合部分包括所述单克隆抗体的Fab片段、 F(ab’) 2片段、单链Fv片段。
4.编码权利要求1-3中任一项所述的氨基酸序列的分离的核酸。
5.根据权利要求4所述的核酸，其特征在于，所述核酸序列如：SEQ ID NO：9-16所示。
6.包含权利要求4或5所述的核酸的载体；所述载体包括：pcDNA、pTT、pTT3、 pEFBOS、pBV、pJV或pBJ。
7.包含权利要求6所述的载体的宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞， 其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞、真核细胞。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞包括大肠杆菌，所述真核细胞包括原生生物细胞、动物细胞、植物细胞或真菌细胞。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述动物细胞包括哺乳动物细胞、鸟类细胞和昆虫细胞。
11.一种产品，所述产品包括以下任一项所述的产品：
（1）检测埃可病毒30型的产品，所述产品包括权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分；
（2）诊断埃可病毒30型感染导致的疾病的产品，所述产品包括权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分；所述疾病为脑膜炎，上呼吸道感染，心肌炎，皮疹，呕吐，发烧或头痛。
12.根据权利要求11所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒。
13.根据权利要求12所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括连接有信号产生化合物的抗体的缀合物。
14.包含权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的组合物。
15.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括药学上可接受的载体。
16.产生抗体的方法，其特征在于，所述方法包括在适合于产生抗体的条件下，在培养基中培养权利要求7-10中任一项所述的宿主细胞。
17.非诊断目的的检测埃可病毒30型的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）提供怀疑存在埃可病毒30型的样品；
（2）将样品与权利要求1或2所述的单克隆抗体或抗原结合部分接触；
（3）检测包含所述单克隆抗体或抗原结合部分与抗原的复合物的形成，存在复合物则指示样品中含有埃可病毒30型。
18.权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的应用，所述应用包括以下任一项所述的应用：
（1）在制备检测埃可病毒30型的产品中的应用；
（2）在制备诊断埃可病毒30型感染导致的疾病的产品中的应用；所述疾病为脑膜炎，上呼吸道感染，心肌炎，皮疹，呕吐，发烧或头痛；
（3）在制备治疗或预防埃可病毒30型感染的药物中的应用；
（4）在制备治疗或预防埃可病毒30型感染导致的疾病的药物中的应用；所述疾病为脑膜炎，上呼吸道感染，心肌炎，皮疹，呕吐，发烧或头痛。
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