CN111690058A

CN111690058A - 针对冠状病毒的具有中和活性的抗体及其用途

Info

Publication number: CN111690058A
Application number: CN202010236256.8A
Authority: CN
Inventors: 郎国竣; 邵俊斌; 谭永聪; 姚航平; 张文海; 闫鑫甜; 胡宇豪; 孔超; 周蕴华; 闫闰; 孙兴鲁; 吴琪; 姚福家; 田美; 韩晓刚
Original assignee: Shanghai ZJ Bio Tech Co Ltd; Sanyou Biopharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Shanghai ZJ Bio Tech Co Ltd; Sanyou Biopharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2020-09-22
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: WO2021196268A1; CN111690058B

Abstract

本发明涉及特异性结合冠状病毒S蛋白的抗体或抗原结合片段、多特异性抗体、以及抗体组合。本发明还涉及编码所述抗体或抗原结合片段、多特异性抗体的核酸及包含其的宿主细胞，以及制备所述抗体或抗原结合片段、多特异性抗体的方法。此外，本发明涉及所述抗体或抗原结合片段、多特异性抗体、抗体组合的预防、治疗和/或诊断用途。

Description

针对冠状病毒的具有中和活性的抗体及其用途

技术领域

本发明总体上涉及抗体及其用途。更具体地，本发明涉及特异性识别冠状病毒刺突蛋白的抗体和抗原结合片段、其制备方法及其用途。

背景技术

自2002年重症急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndromescoronavirus(SARS-CoV))爆发以来，冠状病毒(CoV)成为了一种引起主要公共卫生问题的RNA病毒。目前，全世界都在关注2019新型冠状病毒(2019novel CoV(2019-nCoV)), 该病毒可以在人与人之间传播，患者表现为严重的病毒性肺炎和呼吸系统疾病。从那时起，感染2019-nCoV的病例数量一直在增加。截止2020年3月30日，全世界有约72万例累计确诊的感染该新型冠状病毒的患者，而且确诊病例在急剧攀升，形势非常严峻。

至今为止，针对此类冠状病毒尚无有效的疫苗或治疗剂，临床以对症支持治疗为主。考虑到此类冠状病毒持续危及人类健康，且具有高传播性和致死率等特点，很有可能引起更多的公共卫生问题，因此需要针对此类冠状病毒的致病机制开发出具有抑制或阻断病毒感染的预防和治疗性抗病毒剂，为未来在人群中出现流行或甚至大范围地出现此类冠状病毒感染时提供针对它们的预防和早期治疗。

研究显示此类冠状病毒通过刺突蛋白(S蛋白)与宿主细胞上的受体血管紧张素转换酶Ⅱ(angiotensin converting enzymeⅡ，也称为ACE2)结合，介导病毒进入宿主细胞(Ashour HM等人，Insights into the Recent 2019Novel Coronavirus(SARS-CoV-2)inLight of Past Human Coronavirus Outbreaks，Pathogens，2020年3月4日；9(3).pii:E186.doi: 10.3390/pathogens9030186；Roujian Lu等人，Genomic characterisationand epidemiology of 2019novel coronavirus:implications for virus origins andreceptor binding，www.thelancet.com， 2020年1月29日网上公开，https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30251-8)，因此，本领域需要开发出针对冠状病毒S蛋白并且阻断其与宿主细胞上的ACE2受体结合的高亲和力中和抗体，来有效预防和治疗此类冠状病毒(例如，2019-n CoV、SARS-CoV)感染。

发明概述

本发明人通过锐意研究，开发了一组以高亲和力特异性结合冠状病毒S蛋白并抑制病毒感染性的人抗体，从而满足了上述需求。本发明的特异性识别冠状病毒S蛋白的抗体能够

(a)在25℃ELISA测定法中测量，以小于约10nM，例如小于约8nM的IC50阻断冠状病毒S蛋白与分离的ACE2蛋白的结合，优于对照抗体CR3022；

(b)在25℃ELISA测定法中测量，针对冠状病毒S蛋白的亲和力优于对照抗体CR3022；

(c)在25℃生物膜层干涉测定法中测量，以小于约1nM，例如约0.8nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM的结合解离平衡常数K_D结合冠状病毒S蛋白；

(d)在FACS测定法中测量，以小于约2nM，例如约1.8nM、1.5nM、1.2nM、0.9nM、0.6nM、0.3nM的IC50阻断冠状病毒S蛋白与Vero E6细胞上表达的天然ACE2蛋白的结合；

(e)在细胞病变法中测量，本发明的抗体具有抑制病毒侵染Vero E6细胞的中和活性，其保护50％细胞不受100TCID₅₀攻击病毒液感染的抗体最高稀释浓度(或抗体的滴度)为小于约0.5nM，例如约0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM。

因此，在第一方面，本发明提供了特异性结合冠状病毒S蛋白的分离的抗体或抗原结合片段，其包含

(a)SEQ ID NO:1所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；以及与上述6个CDR区具有单个或者多个CDR 不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体；或

(b)SEQ ID NO:3所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；以及与上述6个CDR区具有单个或者多个CDR 不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体。

在一些实施方案中，本发明提供了特异性结合冠状病毒S蛋白的分离的抗体或抗原结合片段，其包含

(a)SEQ ID NO:5所示的HCDR1或SEQ ID NO:5所示的HCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:6所示的HCDR2或SEQ ID NO:6所示的HCDR2的不超过2 个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:7所示的HCDR3或SEQ ID NO:7所示的HCDR3 的不超过2个氨基酸变化的变体；SEQ ID NO:8所示的LCDR1或SEQ ID NO:8所示的 LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:9所示的LCDR2或SEQ ID NO:9 所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:10所示的LCDR3或SEQ ID NO:10所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；或

(b)SEQ ID NO:11所示的HCDR1或SEQ ID NO:11所示的HCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:12所示的HCDR2或SEQ ID NO:12所示的HCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:13所示的HCDR3或SEQ ID NO:13所示的 HCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；SEQ ID NO:14所示的LCDR1或SEQ ID NO:14 所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:15所示的LCDR2或SEQ ID NO:15所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:16所示的LCDR3 或SEQ ID NO:16所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体。

在一些实施方案中，本发明的分离的抗体或抗原结合片段包含

(a)SEQ ID NO:5所示的HCDR1、SEQ ID NO:6所示的HCDR2和SEQ ID NO:7所示的HCDR3；SEQ ID NO:8所示的LCDR1、SEQ ID NO:9所示的LCDR2和SEQ ID NO:10 所示的LCDR3；或

(b)SEQ ID NO:11所示的HCDR1、SEQ ID NO:12所示的HCDR2和SEQ ID NO:13 所示的HCDR3；SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:15所示的LCDR2和SEQ ID NO:16所示的LCDR3。

(a)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:1的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:2的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％同一性的序列；或

(b)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:3的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:4的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％同一性的序列。

在一些实施方案中，本发明的分离的抗体包含

(a)SEQ ID NO:17或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链序列，以及SEQ ID NO:18或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链序列；或

(b)SEQ ID NO:19或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链序列，以及SEQ ID NO:20或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链序列。

在一些实施方案中，本发明的分离的抗体或抗原结合片段是完全人抗体。

在一些实施方案中，本发明的分离的抗体或抗原结合片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 抗体；优选地，是IgG1或IgG4抗体；更优选地，是人IgG1或人IgG4抗体。在一些实施方案中，本发明的抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、单链Fv、单链Fab、双体抗体(diabody)。

在第二方面，本发明提供了特异性结合冠状病毒S蛋白的多特异性抗体，其包含特异性结合冠状病毒S蛋白表位的上述第一方面所述的抗体或抗原结合片段。

在第三方面，本发明提供了抗体组合，其包含特异性结合冠状病毒S蛋白第一表位的上述第一方面所述的抗体或抗原结合片段，和/或其他特异性结合冠状病毒S蛋白第二表位的抗体或抗原结合片段，其中所述第一表位和第二表位可以是相同的表位或不同的表位。

在第四方面，本发明提供了编码上述第一方面所述的抗体或抗原结合片段或编码上述第二方面所述的多特异性抗体的核酸、包含所述核酸的载体(优选地，表达载体)、包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核的或真核的，例如，选自大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或抗原结合片段、多特异性抗体的其它细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是293细胞或CHO细胞。

在第五方面，本发明提供了制备本发明的抗体或抗原结合片段、或本发明的多特异性抗体的方法，所述方法包括在适于表达编码本发明的抗体或抗原结合片段或编码本发明的多特异性抗体的核酸的条件下培养本发明的宿主细胞，任选地从所述宿主细胞或从培养基回收本发明的抗体或抗原结合片段、或本发明的多特异性抗体。

在第六方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的抗体或抗原结合片段、本发明的多特异性抗体、或本发明的抗体组合，以及可药用载体。

在第七方面，本发明提供了本发明的抗体或抗原结合片段、或本发明的多特异性抗体的用途，用于制备预防和/或治疗冠状病毒感染的药物。在一些实施方案中，所述冠状病毒是2019-nCoV病毒。

在第八方面，本发明提供了在受试者中预防和/或治疗冠状病毒感染的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的抗体或抗原结合片段、本发明的多特异性抗体、本发明的抗体组合、或本发明的药物组合物。在一些实施方案中，所述冠状病毒是2019-nCoV病毒。

本发明的抗体以及本发明的抗体组合可有效阻断和/或抑制冠状病毒感染，能够用于冠状病毒的预防和/或治疗。

在第九方面，本发明提供了检测样品中冠状病毒S蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗体或抗原结合片段、本发明的多特异性抗体、或本发明的抗体组合，用于实施以下步骤：

(a)将样品与本发明的抗体或抗原结合片段、本发明的多特异性抗体、或本发明的抗体组合接触；和

(b)检测本发明的抗体或抗原结合片段、本发明的多特异性抗体、或本发明的抗体组合与冠状病毒S蛋白之间的复合物的形成，

由此，判断来自受试者或个体的样品中是否存在冠状病毒感染或者是否自冠状病毒感染后治愈。

发明的效果

本发明提供了针对冠状病毒S蛋白的抗体或抗体组合，至少具有以下的有益技术效果：

第一，S蛋白和受体ACE2结合是冠状病毒侵染宿主的第一步，且S蛋白的S1和S2 亚基承载着结合受体、促进病毒包膜和宿主细胞膜融合的功能，S蛋白是开发具有病毒中和活性的抗体的理想靶抗原。

第二，S蛋白属于作为冠状病毒(例如，2019-n CoV、SARS-CoV)的宿主(例如，人)的外源蛋白，相对于受体蛋白ACE2而言，针对S蛋白开发的抗体不容易与受试者有组织交叉反应，安全性更高。

第三，相对于小分子药物，抗体药物特异性更高，脱靶带来的毒性效应更低，而且半衰期相对较长，用药频率较低。

第四，本发明的抗体为全人抗体，不需要人源化就可以进行临床治疗，免疫原性更低，成药性更好。

在本发明的一个实施方案中，针对冠状病毒(例如，2019-nCoV冠状病毒)S蛋白的抗体是通过筛选人类天然抗体库获得的，其中两个抗体P16-A3、P17-A11在体外经ELISA 测定法测定，针对S蛋白的亲和力均优于对照抗体CR3022，且可以更加显著地阻断S蛋白和ACE2的结合；在细胞水平上，所述抗体也可显著阻断S蛋白与Vero E6细胞上ACE2 的结合，进一步的实验还发现所述抗体抑制病毒侵染Vero E6细胞的中和活性显著优于对照抗体，50％细胞不受100TCID₅₀病毒液感染的最低抗体浓度约为0.100nM。

本发明的抗体以及抗体组合可有效抑制冠状病毒的感染，极具潜力成为针对此类冠状病毒预防和治疗的有效药物。

附图简述

结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。

图1显示本发明的靶向2019-nCoV冠状病毒S蛋白的全人抗体的产生方法和活性检测方法。

图2A显示人ACE2-huFc与S蛋白RBD-mFc的结合活性。

图2B显示人ACE2-His与S蛋白S1-huFc(也称为Spike S1-huFc)或S蛋白RBD-mFc(也称为Spike RBD-mFc)的结合活性。

图3A显示抗体在第一轮和第二轮淘选中输出(Output)的噬菌体于ELISA测定法中与S蛋白RBD-mFc的结合能力。从该图中可见，每一轮都有更好的富集。使用VSCM13 辅助噬菌体作为阴性对照。

图3B显示了抗体在第二轮和第三轮淘选中输出的噬菌体于ELISA测定法中与S蛋白 RBD-mFc的结合能力。从该图中可见，每一轮都有更好的富集，且富集最好的是3rd-1(即，第三轮淘选中的1号样品)。

图4显示在ELISA测定法中候选抗体Fab上清与S蛋白RBD-mFc的结合能力。从该图中可见，候选抗体P17-A11 Fab上清与S蛋白RBD-mFc有较好的结合能力；候选抗体 P16-A3Fab上清与S蛋白RBD-mFc也有一定的结合能力。

图5显示细胞水平上候选抗体阻断S蛋白与细胞上表达的ACE2结合的能力。结果显示抗体P16-A3 Fab和P17-A11 Fab均表现出了显著的阻断S蛋白与细胞结合的活性。图中的MFI表示平均荧光强度。

图6显示候选抗体的分子量和纯度鉴定结果。两个候选抗体P16-A3、P17-A11以及对照抗体CR3022的纯度均大于98％。

图7A显示候选抗体P16-A3的单体纯度鉴定结果，其单体纯度大于98％。

图7B显示候选抗体P17-A11的单体纯度鉴定结果，其单体纯度大于98％。

图7C显示对照抗体CR3022的单体纯度鉴定结果，其单体纯度大于98％。

图8显示基于ELISA测定法的候选抗体特异性结合S蛋白的亲和活性。候选抗体P16-A3和P17-A11表现出优异的且明显优于对照抗体CR3022的特异性结合S蛋白的活性。图中的阴性抗体是同种型人IgG1抗体。

图9显示基于ELISA检测候选抗体的阻断活性。候选抗体P16-A3和P17-A11都表现出优异的阻断病毒S蛋白与分离的ACE2蛋白结合的能力，而对照抗体CR3022无阻断活性。图中的阴性抗体是同种型人IgG1抗体。

图10显示利用ELISA的双抗夹心法对候选抗体的表位进行分组。结果显示，在2019-nCoV冠状病毒S蛋白RBD结构域上，抗体P17-A11和抗体CR3022结合不同的表位，而抗体P17-A11和抗体P16-A3结合相同的表位。

图11显示利用ELISA的竞争法对候选抗体的表位进行分组。结果显示，在2019-nCoV 冠状病毒S蛋白RBD结构域上，抗体P17-A11和抗体CR3022结合不同的表位，而抗体P17-A11和抗体P16-A3结合相同的表位。

图12A显示基于Fortebio的候选抗体P16-A3和P17-A11的表位分组结果，抗体P16-A3 和P17-A11的表位一致。

图12B显示基于Fortebio的候选抗体P16-A3和对照抗体CR3022的表位分组结果，抗体P16-A3和对照抗体CR3022的表位不同。

图12C显示基于Fortebio的候选抗体P17-A11和对照抗体CR3022的表位分组结果，抗体P17-A11和对照抗体CR3022的表位不同。

图13显示细胞水平检测候选抗体阻断S蛋白在ACE2天然表达细胞上结合的活性。候选抗体P16-A3和P17-A11均显示出剂量依赖的阻断活性，在细胞水平上有优异的阻断效果且显著优于对照抗体CR0322。图中的MFI表示平均荧光强度。

发明详述

在详细描述本发明之前，应了解，本发明不受限于本说明书中的特定方法及实验条件，因为所述方法以及条件是可以改变的。另外，本文所用术语仅是供说明特定实施方案之用，而不意欲为限制性的。

I.定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小10％的下限和比指定数字数值大10％的上限的范围内的数字数值。

术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项。

如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。

术语“冠状病毒(Coronaviruses，CoV)”在本文中是指属于冠状病毒科(Coronaviridae) β冠状病毒属的病毒，病毒颗粒呈球形或椭圆形，直径约60～220nm。病毒为单股正链RNA (+ssRNA)病毒。在几种对人类有致病性的冠状病毒中，大多数与轻度的临床症状有关(Su S,Wong G,Shi W等人，Epidemiology,genetic recombination,andpathogenesis of coronaviruses.Trends Microbiol 2016；24:490–502)，但有两种冠状病毒是值得注意的例外：一种是SARS-CoV，其于2002年到2003年间在37个国家和地区造成8000多例人类感染和774例死亡(Chan-Yeung M,Xu RH.SARS:epidemiology.Respirology2003；8(suppl):S9– 14)；另一种是引起人类新型冠状病毒疾病(Corona Virus Disease2019，COVID-19)的2019 新型冠状病毒(2019-nCoV)，具有强烈的在人群中传播的能力，大多数感染患者发高烧，有些患有呼吸困难，胸部X光片显示双肺都有浸润性病变(Huang C,Wang Y,Li X等人, Lancet，2020年1月24日网上公开)。世界卫生组织(WHO)最近将所述2019-nCoV命名为SARS-CoV-2。在本文中，“2019-nCoV”和“SARS-CoV-2”可互换地使用。

术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。抗体可以是任何型和亚型(例如，IgM、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA1和IgA2)的完整抗体(例如，具有两个全长的轻链和两个全长的重链)。完整抗体的单体是由二硫键连接两个全长的轻链和两个全长的重链形成的一个四肽链分子，也称为Ig分子的单体。抗体单体是构成抗体的基本结构。

本文所用的“分离的抗体”旨在指基本不含其他具有不同抗原特异性的抗体(Ab)的抗体(例如，分离的特异性结合冠状病毒S蛋白的抗体或其抗原结合片段基本不含特异性结合冠状病毒S蛋白以外的抗原的Ab)。在某些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)来确定。

本文所用的“阻断抗体”、“中和性抗体”、“具有中和活性的抗体”或“中和抗体” 在本文中可互换地使用，指这样的抗体，其与靶抗原结合或与之相互作用并阻止靶抗原与结合配偶体如受体结合或缔合，因而抑制或阻断本将因靶抗原与结合配偶体如受体的相互作用而产生的生物学反应。在本发明的情况下，指所述抗体与冠状病毒S蛋白的结合导致冠状病毒的至少一种生物活性被抑制。例如，本发明的中和抗体可以阻止或阻断冠状病毒S蛋白与ACE2结合。

“表位”或“抗原决定子”指与抗体分子的可变区中称为互补位的特异性抗原结合部位相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有一个以上表位。因此，不同抗体可以结合抗原上的不同区域，并可以具有不同的生物学效应。表位可以由连续氨基酸或经蛋白质的三级折叠并接的不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常消失。表位通常在独特空间构象中包括至少3个，并且更通常至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。

术语“抗原结合片段”是比完整或完全抗体的氨基酸残基数要少的完整或完全抗体的一部分或一段，其能结合抗原或与完整抗体(即与抗原结合片段所来源的完整抗体)竞争结合抗原。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、单链Fv(scFv)、单链Fab、双体抗体(diabody)、单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)、骆驼Ig、Ig NAR、F(ab)'₃片段、双-scFv、(scFv)₂、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。所述术语还包括经遗传工程改造的形式，例如嵌合抗体(例如人类化鼠抗体)、杂结合抗体(例如双特异性抗体)和其抗原结合片段。更详细的描述也请参见：皮尔斯目录与手册(Pierce Catalog and Handbook),1994-1995(皮尔斯化学公司(PierceChemical Co.),罗克福德(Rockford), 伊利诺伊州(IL))；Kuby,免疫学杂志,第3版,W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.),纽约,1997。

术语“全抗体”、“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指包含由二硫键相互连接的至少两条重链(HC)和两条轻链(LC)的糖蛋白。每条重链由重链可变区 (本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域 CL组成。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ。哺乳动物轻链分类为λ或κ。包含α、δ、 ε、γ和μ重链的免疫球蛋白分类为免疫球蛋白(Ig)A、IgD、IgE、IgG和IgM。完全抗体形成“Y”形状。Y的茎由两条重链的第二和第三恒定区(并且对于IgE和IgM，第四恒定区)结合在一起组成，并且二硫键(链间)在铰链中形成。重链γ、α和δ具有由三个串联(成一行)Ig 结构域构成的恒定区，和用于增加柔性的铰链区；重链μ和ε具有由四个免疫球蛋白结构域构成的恒定区。第二和第三恒定区分别称为“CH2结构域”和“CH3结构域”。Y的每个臂包括结合到单个轻链的可变和恒定区的单个重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。

轻链可变区和重链可变区分别包含间插有三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”) 的“构架”区。“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”(在本文中与超变区“HVR”可以互换使用)，是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for thecanonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology, 273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(万维网imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagationclustering)的North CDR定义。

然而，应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。例如，对使用Kabat和Chothia编号的CDR区域在不同指派系统定义下的残基范围如下表A所示。

表A.不同指派系统定义下的CDR残基范围

因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR 边界不同。

本发明抗体的CDR可以根据本领域的任何方案或其组合人工地评估确定边界。除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的 CDR序列。

不同轻链或重链的构架区的序列在物种(例如人类)内具有相对保存性。抗体的构架区 (其是成分轻链和重链的组合构架区)用以在三维空间中定位和比对CDR。CDR主要负责结合到抗原的表位。具有不同特异性(即针对不同抗原有不同组合位点)的抗体具有不同CDR。尽管抗体与抗体之间的CDR不同，但CDR内仅有限数目的氨基酸位置直接参与抗原结合。 CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。

“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆或由其中已经转染单个抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域的技术人员已知的方法产生，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合体制备杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人类化单克隆抗体。

“Fv”是含有完全抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施例中，双链Fv种类由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域呈紧密非共价缔合的二聚体组成。在单链Fv(scFv) 种类中，一个重链可变结构域与一个轻链可变结构域可以通过柔性肽连接子共价连接，使得轻链和重链可以按类似于双链Fv种类的“二聚”结构缔合。在这一配置中，每个可变结构域的三个高变区(HVR)相互作用以定义VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。六个HVR 共同地赋予对抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或包含仅三个对抗原具有特异性的HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，但亲和力低于完整结合位点。

Fab片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段不同之处在于，重链CH1结构域的羧基末端增添了几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab′-SH是本文关于Fab′ 的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携有游离硫醇基。F(ab′)2抗体片段最初是作为其间具有铰链半胱氨酸的Fab′片段对产生。还已知抗体片段的其它化学偶合。

当谈及抗原和抗体时使用的术语“特异性结合”或“结合”意指抗体与生理条件下相对稳定的抗原形成复合物。用于确定抗体是否与抗原特异性结合的方法是本领域熟知的并且例如包括表面等离振子共振测定法、MSD测定法(Estep,P.等人,High throughputsolution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning,MAbs,2013.5(2): p.270-278)、ForteBio亲和力测定法(Estep,P等人，High throughputsolution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitopebinning.MAbs,2013.5(2):p.270-8)等。在一个实施方案中，本发明的“特异性结合”冠状病毒S蛋白抗体如ForteBio亲和力测定法中测量，以至少约10^-8M，优选10^-9M；更优选10^- ¹⁰M，进一步优选10^-11M，更优选10^-12 M的K_D与S蛋白结合，由此阻断或抑制冠状病毒S蛋白与其受体ACE2结合以及随后的膜融合。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用结合解离平衡常数(K_D)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括现有技术已知以及本文中所描述的那些。

当术语“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体) 的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如S蛋白或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如 Stahli等，1983，Methods in Enzymology 9：242-253)。通常所述测定法涉及使用结合带有未标记的检测抗原结合蛋白及标记的参考抗原结合蛋白任一种的固态表面或细胞的纯化的抗原。通过测量在所测抗原结合蛋白存在下结合固态表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常所测抗原结合蛋白过量存在。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：结合与参考抗原结合蛋白同一表位的抗原结合蛋白；和结合充分接近参考抗原结合蛋白的结合表位的邻近表位的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍发生结合。在本文实施例中提供关于用于测定竞争性结合的方法的其它详细资料。

如本文所用，术语“变体”是指已经修饰至少一个，例如1、2或3个氨基酸取代、缺失或添加的重链可变区或轻链可变区，其中包含重链或轻链变体的经修饰的抗原结合蛋白基本上保留修饰前抗原结合蛋白的生物学特征。在一个实施方案中，含有变体重链可变区或轻链可变区序列的抗原结合蛋白保留修饰前抗原结合蛋白的60％、70％、80％、90％、100％生物学特征。应当理解，可以单独或在与另一个重链可变区或轻链可变区组合修饰每个重链可变区或轻链可变区。本公开的抗原结合蛋白包含与本文描述的重链可变区氨基酸序列90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同源的重链可变区氨基酸序列。本公开的抗原结合蛋白包括与本文描述的轻链可变区氨基酸序列90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同源的轻链可变区氨基酸序列。同源性百分比可以在整个重链可变区和/或整个轻链可变区上，或者百分比同源性可以限于构架区，而对应于CDR的序列与重链可变区和/或轻链可变区内本文中公开的CDR具有100％同一性。如本文所用，术语“CDR变体”是指已经修饰至少一个，例如1、2或3个氨基酸取代、缺失或添加的CDR，其中包含CDR变体的经修饰的抗原结合蛋白基本上保留修饰前抗原结合蛋白的生物学特征。在一个实施方案中，含有变体CDR的抗原结合蛋白保留修饰前抗原结合蛋白的60％、70％、80％、90％、100％生物学特征。应当理解，可以修饰的每个CDR 可以单独或与另一个CDR组合修饰。在一个实施方案中，修饰是取代，特别是保守取代。

“人源化抗体”是指一类工程化抗体，其具有源自非人供体免疫球蛋白的CDR，该人源化抗体的剩余免疫球蛋白部分是来源自一种(或多种)人免疫球蛋白。此外，构架支持残基可以改变以保留结合亲和力(参见例如Queen等,Proc.Natl Acad Sci USA,86:10029-10032(1989),Hodgson等,Bio/Technology,9:421(1991))。合适的人接受抗体可以是通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性从常规数据库，例如Los Alamos数据库和Swiss蛋白质数据库选择的抗体。以与供体抗体的构架区的同源性(基于氨基酸)表征的人抗体可以适合于提供用于插入供体CDR的重链恒定区和/或重链可变构架区。可以以类似的方式选择能够提供轻链恒定或可变构架区的合适受体抗体。应当注意的是，受体抗体重链和轻链不需要来源于相同的受体抗体。

如本领域已知，在本文中可交换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或者能够通过DNA或RNA聚合酶掺入链的任何底物。

如下进行序列之间序列同一性的计算。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。

可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol. Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、 70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。

还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN 程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。

额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列” 以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。

如本文所用，“载体(vector)”表示构建体，其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的DNA 或RNA表达载体、包囊化于脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。

在本发明中术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已经引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化子”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞以及由此来源的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上与亲代细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本文包括与在初始转化的细胞中筛选或选择的细胞具有相同功能或生物学活性的突变子代。

本发明还涉及一种生产单克隆抗体的方法，所述方法包括培养本发明所述的宿主细胞从而生产上述本发明所述的单克隆抗体。

在本文中，“受试者”、“个体”或“对象”指需要缓解、预防和/或治疗疾病或病症如病毒感染的动物，优选哺乳动物，更优选是人。哺乳动物还包括但不限于农场动物、竞赛动物、宠物、灵长类、马、犬、猫、小鼠和大鼠。该术语包括具有冠状病毒感染或处于具有冠状病毒感染风险的人受试者。在本发明中，向有此需要的受试者施用本发明所述的抗体或本发明所述的药物组合物或制品是指给予有效量的所述抗体或药物组合物或制品等。

如本发明所用，术语“有效量”表示引发例如研究者或临床医师所追求的组织、系统、动物或人的生物学或药学响应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”表示，与没有接受该量的相应受试者相比，引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量，或者使疾病或病况的进展速率降低的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。

II.本发明抗体所针对的冠状病毒、其结构和进入宿主细胞的方式

冠状病毒(包括SARS-CoV和新近发现的2019-nCoV)是球形单股正链RNA病毒，其特征是，具有从病毒体表面突出的刺突蛋白(Barcena,M.等人，Cryo-electron tomographyof mouse hepatitis virus:Insights into the structure of the coronavirion.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2009,106,582–587)。病毒颗粒的球形形态以及刺突突起使得冠状病毒在电子显微镜下看起来像冠冕而被命名为冠状病毒。

冠状病毒是被包膜的病毒(所被包膜衍生自宿主细胞膜的脂质双层)，具有主要由病毒结构蛋白(例如刺突蛋白(Spike，S)，膜蛋白(Membrane，M)，包膜蛋白(Envelope， E)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N))形成的病毒结构，其中S蛋白、M蛋白和E蛋白均嵌入在病毒包膜中，N蛋白与病毒RNA相互作用，位于病毒颗粒的核心，形成核衣壳(Fehr, A.R.等人，Coronaviruses:An overview of their replication and pathogenesis.MethodsMol.Biol. 2015,1282,1–23)。S蛋白是一种高度糖基化的蛋白，可在病毒颗粒表面形成同源三聚体的刺突，并介导病毒进入宿主细胞。

2019-nCoV是具有膜结构的、大小为80-120nm的单股正链RNA病毒，基因组长度约为29.9kb，该病毒与同属于冠状病毒科β冠状病毒属的SARS-CoV的基因组序列之间的同源性为80％。病毒基因组的可读框(Open reading frame，ORF)ORF1a和ORF1b占基因组的2/3，表达水解酶以及与复制、转录相关的酶，例如，半胱氨酸蛋白酶(PLpro)和丝氨酸蛋白酶(3CLpro)，RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)和解旋酶(Hel)；后面的基因组 1/3区域主要负责编码结构蛋白，包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)等主要结构蛋白，其中N蛋白包裹病毒基因组形成核蛋白复合体，E蛋白和M蛋白主要参与病毒的装配过程，S蛋白则主要通过与宿主细胞受体结合介导病毒的入侵并决定病毒的宿主特异性。经序列比对，发现2019-nCoV病毒和SARS-CoV病毒的S 蛋白具有75％的相似度，据报道称多株SARS-CoV冠状病毒分离株中位于S蛋白与ACE2 受体(在人体中主要分布于呼吸道上皮细胞、肺脏、心脏、肾脏和消化道等位置)复合物界面的442、472、479、487和491位点的氨基酸残基是高度保守的。与SARS-CoV的S蛋白相比较，在所述5个位点处，2019-nCoV S蛋白仅第491位氨基酸相同，其它4处氨基酸都发生了突变(Xu X等人，Sci China Life Sci.,2020年3月；63(3):457-460)。尽管如此，通过蛋白质3D结构模拟预测发现虽然2019-nCOV S蛋白与ACE2受体结合的所述4个关键氨基酸都发生了替换，但是相对于SARS-CoV S蛋白，2019-nCoV S蛋白中的受体结合结构域(receptor binding domain，RBD)的三维结构几乎不变，由此2019-nCoV S蛋白与人体ACE2仍然具有较高的亲和力，最近的文章(Wrapp D等人，Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation，Science,.2020年2月19日，网上公开，pii: eabb2507.doi:10.1126/science.abb2507)以及(Xiaolong Tian等人，Potent binding of 2019 novel coronavirus spike proteinby a SARS coronavirus-specific human monoclonal antibody, Emerging Microbes&Infections，2020,9:1,p382-385,DOI:10.1080/22221751.2020.1729069) 通过Fortebio检测，2019-nCoV的S蛋白结合人类ACE2的亲和力(K_D)约为15nM，与 SARS-CoV的S蛋白结合人类ACE2的亲和力相当，由此可见，ACE2也是2019-nCoV感染人体进入细胞内部的受体蛋白。预期针对冠状病毒S蛋白并且阻断其与ACE2受体结合的高亲和力中和抗体，能够有效预防和治疗冠状病毒(例如，2019-n CoV、SARS-CoV) 感染。

III.本发明的针对冠状病毒S蛋白的抗体

术语“针对冠状病毒S蛋白的抗体”、“抗冠状病毒S蛋白的抗体”、“抗S蛋白抗体”、“冠状病毒S蛋白抗体”、“S蛋白抗体”或“结合S蛋白的抗体”在本文中可互换地使用，是指这样的本发明的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合冠状病毒S蛋白 (例如，2019-nCoV S蛋白、SARS-CoV S蛋白)，由此所述抗体可以用作靶向冠状病毒 S蛋白的诊断剂、预防剂和/或治疗剂。

本发明的抗体和抗原结合片段以高亲和力特异性结合冠状病毒S蛋白。在一些实施方案中，本发明的抗体是阻断抗体或中和抗体，其中抗体可以结合冠状病毒S蛋白，并阻断冠状病毒S蛋白与ACE2的结合。在一些实施方案中，该阻断抗体或中和抗体可以用于预防冠状病毒感染和/或治疗冠状病毒感染的个体。

在一些实施方案中，本发明的冠状病毒S蛋白抗体特异性结合冠状病毒S蛋白，其包含

其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代，例如，所述氨基酸变化是保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，本发明的冠状病毒S蛋白抗体结合哺乳动物冠状病毒S蛋白，例如人冠状病毒S蛋白、猴冠状病毒S蛋白。例如，本发明的冠状病毒S蛋白抗体与冠状病毒S蛋白上的表位(例如，线性或构象表位)特异性结合。

在一些实施方案中，本发明的冠状病毒S蛋白抗体具有以下一个或多个特性：

(e)在细胞病变法中测量，本发明的抗体抑制病毒侵染Vero E6细胞的中和活性显著优于对照抗体，其保护50％细胞不受100TCID50攻击病毒液感染的抗体最高稀释浓度(或抗体的滴度)小于约0.5nM，例如约0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM。

在一些实施方案中，本发明的冠状病毒S蛋白抗体包含SEQ ID NO:5所示的HCDR1或SEQ ID NO:5所示的HCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:6所示的 HCDR2或SEQ ID NO:6所示的HCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO: 7所示的HCDR3或SEQ ID NO:7所示的HCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；SEQ ID NO:8所示的LCDR1或SEQID NO:8所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、 SEQ ID NO:9所示的LCDR2或SEQ IDNO:9所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:10所示的LCDR3或SEQ IDNO:10所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体，其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代，例如，所述氨基酸变化是保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，本发明的冠状病毒S蛋白抗体包含SEQ ID NO:11所示的HCDR1或SEQ ID NO:11所示的HCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:12所示的 HCDR2或SEQ ID NO:12所示的HCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO: 13所示的HCDR3或SEQ ID NO:13所示的HCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；SEQ ID NO:14所示的LCDR1或SEQ ID NO:14所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:15所示的LCDR2或SEQ ID NO:15所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:16所示的LCDR3或SEQ ID NO:16所示的LCDR3的不超过 2个氨基酸变化的变体，其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代，例如，所述氨基酸变化是保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，本发明的冠状病毒S蛋白抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:1的序列或与其具有至少90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ IDNO: 2的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。优选地，所述氨基酸变化不发生在CDR区中。

在一些实施方案中，本发明的冠状病毒S蛋白抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:3的序列或与其具有至少90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ IDNO: 4的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。优选地，所述氨基酸变化不发生在CDR区中。

在一些实施方案中，本发明的冠状病毒S蛋白抗体包含Fc区，所述Fc区来自IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，所述Fc区来自IgG1或IgG4。在一些实施方案中，所述Fc区来自人IgG1或人IgG4。

在本发明的一些实施方案中，本文所述的氨基酸变化包括氨基酸的取代、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸变化为氨基酸取代，优选地保守取代。保守取代是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸取代，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸取代，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸取代。示例性的取代如下表B所示：

表B.示例的氨基酸取代

在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸变化发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸变化发生在Fc区。在一些实施方案中，提供了包含含有一个或多个突变的Fc结构域的抗冠状病毒S蛋白抗体，该突变增强或减弱抗体例如与中性 pH相比在酸性pH下与FcRn受体的结合。例如，本发明包括在Fc结构域的C_H2或C_H3 区中含有突变的抗冠状病毒S蛋白抗体，其中该一个或多个突变提高Fc结构域在酸性环境(例如在pH在约5.5至约6.0范围内的内体中)中与FcRn的亲和力。这种突变可以导致对动物施用时抗体血清半衰期的提高。这类Fc修饰的非限制性实例包括，例如：250位(例如E或Q)、250位和428位(例如L或F)、252位(例如L/Y/F/W或T)、254位(例如S或 T)和256位(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或428位和/或433位(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/ 或434位(例如A、W、H、F或Y[N434A、N434W、N434H、N434F或N434Y])的修饰；或250位和/或428位的修饰；或307位或308位(例如308F、V308F)和434位的修饰。在一个实施方案中，该修饰包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254 和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；及307 和/或308修饰(例如308F或308P)。还在另一实施方案中，该修饰包括265A(例如D265A) 和/或297A(例如N297A)修饰。

例如，本发明包括含有Fc结构域的抗冠状病毒S蛋白抗体，该Fc结构域包含选自以下的一对(组)或多对(组)突变：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E (例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；257I和311I(例如P257I和Q311I)；257I和434H(例如P257I和N434H)；376V和434H(例如D376V和 N434H)；307A、380A和434A(例如T307A、E380A和N434A)；和433K和434F(例如 H433K和N434F)。在一个实施方案中，本发明包括含有Fc结构域的抗冠状病毒S蛋白抗体，该Fc结构域包含IgG4铰链区中的S108P突变以促进二聚体稳定化。前述Fc结构域突变和本文公开的抗体可变结构域内的其他突变的任意可能的组合都包含在本发明的范围之内。

在某些实施方案中，本文中所提供的冠状病毒S蛋白抗体经改变以增加或降低其糖基化的程度。对冠状病毒S蛋白抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一个或多个糖基化位点而方便地实现。当冠状病毒S蛋白抗体包含Fc区时，可以改变与Fc区连接的糖类。在一些应用中，除去不想要的糖基化位点的修饰可以是有用的，例如除去岩藻糖模块以提高抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等 (2002)JBC277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以调节补体依赖性细胞毒性(CDC)。在某些实施方案中，可在本文中所提供冠状病毒S蛋白抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以便增强例如本发明的冠状病毒S蛋白抗体预防和/或治疗冠状病毒感染的有效性。

在一些实施方案中，本发明的冠状病毒S蛋白抗体是双特异性或多特异性抗体分子形式。在一个实施方案中，双特异性抗体分子具有针对冠状病毒S蛋白第一表位的第一结合特异性和对冠状病毒S蛋白第二表位的第二结合特异性，其中所述第一表位和第二表位可以是相同的，也可以是不同且非重叠的。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含本发明的抗体P17-A11 Fab和P16-A3 Fab。又在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含本发明的抗体P17-A11 scFv和P16-A3 scFv。

在一些实施方案中，本发明涉及抗体组合，其包含特异性结合冠状病毒S蛋白表位的本发明的抗体或抗原结合片段，和/或其他特异性结合冠状病毒S蛋白表位的抗体或抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体组合是抗体P17-A11或其抗原结合片段和抗体P16-A3 或其抗原结合片段的组合。

IV.本发明的核酸以及包含其的宿主细胞

在一方面，本发明提供了编码以上任何冠状病毒S蛋白抗体或其抗原结合片段或其任一条链的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。

例如，本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO:1、2、3、4中任一项所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO:1、2、3、4中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸。

又在一个实施方案中，本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO:17、18、19、20中任一项所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO:17、18、19、20中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸。

本发明还涵盖与下述核酸在严格性条件下杂交的核酸或与下述核酸相比编码具有一个或多个氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的多肽序列的核酸：包含编码选自SEQ ID NO:1、2、3、4中任一项所示氨基酸序列的核酸序列的核酸；或包含编码与选自SEQID NO: 1、2、3、4中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列的核酸。

在一个实施方案中，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。

一旦已经制备了用于表达的表达载体或DNA序列，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下，将细胞在培养基中培育并且筛选适宜的活性。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法，根据使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞变动或优化。

另外，可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物，选出已经稳定将DNA掺入至其染色体中的细胞。标记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性(例如，抗生素)或重金属(如铜)抗性等。可选择标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。也可能需要额外元件以便最佳合成mRNA。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。

在一个实施方案中，提供了包含本发明多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含本发明表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体的其它细胞。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌。宿主细胞还可以是真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，例如昆虫细胞等。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK 293或293F细胞)、293细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(Hep G2)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、CHOS细胞、 NSO细胞、骨髓瘤细胞系如Y0、NS0、P3X63和Sp2/0等。适于产生蛋白质的哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo 编著，HumanaPress，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞或293细胞。

V.本发明的冠状病毒S蛋白抗体的生产和纯化

在一个实施方案中，本发明提供了制备冠状病毒S蛋白抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达编码所述冠状病毒S蛋白抗体的核酸的条件下培养包含编码所述冠状病毒S 蛋白抗体的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，以及任选地分离所述冠状病毒S 蛋白抗体。在某个实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收冠状病毒S蛋白抗体。

为了重组产生本发明的冠状病毒S蛋白抗体，首先分离编码本发明冠状病毒S蛋白抗体的核酸，并将所述核酸插入载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序，例如通过使用能够与编码本发明冠状病毒S蛋白抗体的核酸特异性结合的寡核苷酸探针进行。

如本文所述制备的本发明的冠状病毒S蛋白抗体可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的冠状病毒S蛋白抗体的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。

VI.本发明的冠状病毒S蛋白抗体的活性测定法

可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的冠状病毒S蛋白抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本发明的冠状病毒S蛋白抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹等来进行。可使用本领域已知方法来测定对冠状病毒S蛋白的结合，本文中公开了例示性方法。在一些实施方案中，使用SPR或生物膜层干涉测定本发明的冠状病毒S蛋白抗体对冠状病毒S蛋白的结合。

本发明还提供了用于鉴定具有生物学活性的冠状病毒S蛋白抗体的测定法。生物学活性可以包括例如阻断对细胞表面ACE2的结合。

VII.药物组合和药物制剂

在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何冠状病毒S蛋白抗体的组合物，优选地组合物为药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料。在一个实施方案中，组合物(例如，药物组合物)包含本发明的冠状病毒S蛋白抗体，以及一种或多种其它治疗剂(例如抗感染活性剂、小分子药物)的组合。所述抗感染活性剂、小分子药物是用来治疗、预防或缓解受试者中冠状病毒感染的任何抗感染活性剂、小分子药物，包括但不限于瑞德西韦、利巴韦林、奥司他韦、扎那米韦、羟氯喹、干扰素-α2b、镇痛药、阿奇霉素和皮质类固醇。在本发明的上下中，冠状病毒感染包括由冠状病毒(包括但不限于2019-n CoV、SARS-CoV)引起的感染。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物或药物制剂包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。

如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”,第五版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准药用载体和/或赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。

可以通过将具有所需纯度的本发明的冠状病毒S蛋白抗体与一种或多种任选的药用辅料(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备包含本文所述的冠状病毒S蛋白抗体的药物制剂，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。

本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它抗感染活性成分，例如其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明的冠状病毒S蛋白抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

VIII.组合产品或试剂盒

在一些实施方案中，本发明还提供了组合产品，其包含至少一种本发明的冠状病毒S 蛋白抗体或其抗原结合片段，或者还包含一种或多种其它治疗剂(例如，抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等)。

在一些实施方案中，所述组合产品中的两种或多种成分可以依次、分开或同时联合施用给受试者。

在一些实施方案中，本发明还提供了包含本发明的冠状病毒S蛋白抗体、药物组合物或组合产品的试剂盒，以及任选的指导施用的包装插页。

在一些实施方案中，本发明还提供了包含本发明的冠状病毒S蛋白抗体、药物组合物、组合产品的药物制品，任选地，所述药物制品还包括指导施用的包装插页。

IX.本发明的冠状病毒S蛋白抗体的预防和/或治疗用途

本发明提供了用于预防受试者中冠状病毒相关疾病或病患的方法，其包括向受试者施用本发明的抗体、抗体组合或多特异性抗体。

具有冠状病毒相关疾病风险的受试者包括与感染者接触的受试者或以一些其他方式暴露于冠状病毒的受试者。预防剂的施用可以在表现出冠状病毒相关疾病的症状特征之前施用，以便阻止疾病，或可选择地延迟疾病的进展。

本发明还提供了治疗患者中冠状病毒相关疾病的方法。在一个实施方案中，该方法涉及将中和冠状病毒的本发明的抗体、抗体组合或多特异性抗体施用至患所述疾病的患者。

在一些实施方案中，提供了治疗患者中冠状病毒感染的方法，所述方法包括施用选自由以下组成的组的至少一种抗体或其抗原结合片段：抗体P16-A3、P17-A11。在一个优选的实施方案中，将抗体P16-A3、P17-A11或其片段的两种一起施用给所述患者，

在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以交叉中和人和动物传染性冠状病毒分离株。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段在冠状病毒感染后的最初24小时内施用。

X.用于诊断和检测冠状病毒的方法和组合物

在一些实施方案中，本文中提供的任何冠状病毒S蛋白抗体可以用于检测冠状病毒在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、 ELISA测定法。

在一个实施方案中，提供了用于诊断或检测方法中的冠状病毒S蛋白抗体。在另一个方面中，提供检测冠状病毒在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括检测冠状病毒S蛋白在生物样品中的存在。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的冠状病毒S蛋白抗体在允许冠状病毒S蛋白抗体与冠状病毒S蛋白结合的条件下接触，并检测在冠状病毒S蛋白抗体和冠状病毒S蛋白之间是否形成复合物。复合物的形成表示存在冠状病毒。该方法可以是体外或体内方法。

用于冠状病毒的示例性诊断测定包括例如使用本发明的抗冠状病毒S蛋白接触从患者获得的样品，其中使用可检测的标记或报告分子标记抗冠状病毒S蛋白或用作捕获配体以选择性地从患者样品分离冠状病毒。备选地，未标记的抗冠状病毒S蛋白可与本身被可检测地标记的第二抗体组合在诊断应用中使用。可检测的标记或报告分子可以是放射性同位素、如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I；荧光或化学发光的部分如荧光素异硫氰酸酯或罗丹明，或酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。可用于检测或测量样品中冠状病毒的具体的示例性测定包括酶连接的免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。

可在根据本发明的冠状病毒诊断测定中使用的样品包括从患者可获得的任何生物样品，其包含在正常或生理条件下可检测量的冠状病毒刺突蛋白或其片段。在一些实施方案中，生物样品是血液、血清、咽拭子、下呼吸道样本(如气管分泌物、气管吸取物、肺泡灌洗液)或生物来源的其他样品。一般而言，将测量从健康患者获得的特定样品中的冠状病毒刺突蛋白水平(例如未受与冠状病毒相关的疾病所扰的患者)以初始性地建立基线或标准冠状病毒水平。该冠状病毒基线水平可随后与从疑似具有冠状病毒相关病况或与该病况相关的症状的个体获得的样品中测量的冠状病毒水平进行比较。

特异性针对冠状病毒刺突蛋白的抗体可不包含其他标记物，或其可包含N-末端或C 末端的标记物。在一个实施方案中，标记物是生物素。在结合测定中，标记物(如果存在的话)的位置可确定肽相对于所结合的表面的方向。例如，如果表面以抗生物素蛋白包被，包含N末端生物素的肽将被定向，使得肽的C末端部分远离表面。

描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成对本发明的保护范围的限制。

实施例

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明的范围。这些实施例并不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。

实施例1冠状病毒S蛋白抗原的制备和检测用ACE2的制备

实施例中共用到如下抗原和ACE2蛋白：S蛋白RBD-His(319Arg-532Asn),S蛋白S1-huFc(14Gln-685Arg)，人ACE2-huFc(18Gln-740Ser)，人ACE2-His(18Gln-740Ser)， S蛋白RBD-mFc(购自Sinobio，40592-V05H)，其中前四种蛋白的具体制备方法如下。

1.1质粒构建

从NCBI获取各蛋白序列，其中人ACE2序列获自NCBI Gene ID:59272，S蛋白序列获自NCBI Gene ID:43740568，分别按照上述氨基酸片段位置获得各蛋白序列，转化成基因序列后由金斯瑞生物科技股份有限公司进行目的片段基因合成。PCR扩增各目的片段，然后通过同源重组的方法构建至真核表达载体pcDNA3.3-TOPO(Invitrogen)，用于后续重组蛋白的表达。

1.2质粒制备

将构建好的各重组蛋白表达载体分别转化到大肠杆菌SS320中，37℃过夜培养，利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒提取，得到无内毒素的各质粒以供真核表达使用。

1.3各蛋白的表达纯化

S蛋白RBD-His(319Arg-532Asn)，S蛋白S1-huFc(14Gln-685Arg)，人ACE2-huFc(18Gln-740Ser)和人ACE2-His(18Gln-740Ser)均通过Expi293瞬转表达系统(ThermoFisher， A14635)表达，具体方法如下：

转染当天，确认细胞密度为每毫升4.5×10⁶至5.5×10⁶个活细胞左右，细胞存活率>95％，此时用37℃预温的新鲜Expi293表达培养基将细胞调整到终浓度为每毫升3×10⁶个细胞。用4℃预冷的Opti-MEM^TM稀释目的质粒(1mL Opti-MEM^TM中加入1μg质粒)，同时用Opti-MEM^TM稀释ExpiFectamine^TM293试剂，再将两者等体积混合并轻轻吹打混匀制备成ExpiFectamine^TM293试剂/质粒DNA混合液，室温孵育10-20min，缓慢加入到准备好的细胞悬液中，并同时轻轻摇晃，最后置于细胞培养摇床中，在37℃，8％CO₂条件下培养。

在转染后18-22h内添加ExpiFectamine^TM293 Transfection Enhancer 1和ExpiFectamine^TM293 Transfection Enhancer 2，摇瓶放置于32℃摇床和5％CO₂条件下继续培养，在转染5-7天后，将细胞表达上清于15000g高速离心10min，所得Fc标签蛋白表达上清用MabSelect SuRe LX(GE，17547403)进行亲和纯化，然后用100mM乙酸钠(pH3.0) 洗脱目的蛋白，接着用1M Tris-HCl中和；所得His标签蛋白表达上清用Ni Smart Beads 6FF(常州天地人和生物科技有限公司，SA036050)进行亲和纯化，然后用梯度浓度的咪唑洗脱目的蛋白。洗脱下来的各蛋白分别通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)置换至PBS 缓冲液中。经SDS-PAGE鉴定和活性鉴定合格后于－80℃冻存待用。

1.4各蛋白的质量检测

将上述1.3制备的S蛋白S1-huFc(也称为Spike-S1-huFc；或S1-huFc)和S蛋白RBD-mFc(也称为Spike-RBD-mFc；或RBD-mFc)与人ACE2-huFc、人ACE2-His通过 ELISA测定法进行相互结合测定。结果显示在图2A和图2B中，人ACE2-huFc和RBD-mFc 有良好的结合活性；S蛋白S1-huFc和商品化的S蛋白RBD-mFc分别与人ACE2-his有良好的结合活性，且活性相当。

实施例2天然的人抗体噬菌体展示文库的构建和筛选

在本实施例中，构建了抗体基因噬菌体展示文库，并用重组的2019-nCoV冠状病毒RBD蛋白(即，Spike-RBD-mFc，Sinobio，40592-V05H)为筛选抗原对该文库进行筛选，获得了多个具有特异性结合2019-nCoV冠状病毒RBD蛋白的抗体分子。

2.1构建人抗体的基因文库

取Ficoll-Paque密度梯度分离液(购自GE公司，目录号：17144003S)15mL缓缓加入50mL离心管中。将离心管倾斜并分批次沿管壁缓慢加入15mL采集的正常人血液，使得Ficoll-Paque密度梯度分离液与正常人血液保持清晰的分离界面。将装有所述血液和分离液的50mL离心管于15℃左右离心20min，其中将离心机设置为400g，加速度为3，减速为0的参数。离心之后，整个液面分为四层，上层为血浆混合物，下层为红细胞和粒细胞，中层为Ficoll-Paque液体，在上、中层交界处有以PBMC为主的白色云雾层狭窄带，即PBMC细胞层。用无菌巴氏吸管小心地吸去上层的血浆混合物，然后再用新的无菌巴氏吸管吸取PBMC，获得分离的PBMC。将分离的PBMC先用PBS润洗两遍，再在4℃下以 1500rpm的转速离心10min，最后用1.5mL的PBS重悬，并通过细胞计数仪(CountStar， CountStar Altair)计数。

通过常规方法自分离的PBMC细胞提取总RNA。使用反转录试剂盒(购自TaKaRa 公司,目录号：6210A)将提取的总RNA反转录成cDNA。基于重链和轻链种系基因的序列相似度，分别在重链和轻链的V区前端和第一个恒定区后端设计简并引物(李晓琳，大容量非免疫人源性Fab噬菌体抗体库的构建及初步筛选，《中国协和医科大学》硕士学位论文，2007年6月)，PCR后得到抗体的重链可变区基因片段和轻链可变区基因片段。回收抗体的重链可变区基因片段和轻链可变区基因片段后，通过融合PCR方法扩增得到含有抗体的轻重链可变区的片段，接着，对该PCR产物和噬菌体展示用载体进行酶切、回收和连接，连接产物通过回收试剂盒(Omega，目录号：D6492-02)回收，具体材料和方法参见上文李晓琳的论文。最后，通过电转仪(Bio-Rad，MicroPulser)转化至感受态大肠杆菌 SS320(Lucigen，MC1061 F)中，并将经转化的大肠杆菌SS320菌液涂布于具有氨苄青霉素抗性的2-YT固体平板(固体平板由1.5％的胰蛋白胨，1％的酵母提取物，0.5％的NaCl， 1.5％的琼脂，按质量体积g/mL配制而成)。

2.2抗体基因库容的计算

取经转化的大肠杆菌SS320菌液用无抗生素的2YT培养液以1:50的体积进行接菌，37℃，220rpm培养1.5-2h至OD600达到0.5-0.6后取出至室温。将菌液按照90μL/孔添加到96孔圆底稀释板中，每个菌液样品进行10倍梯度稀释，共12个稀释梯度。将稀释好的样品使用8道10μL量程移液器，吸取2μL的液体按照稀释梯度从低到高的顺序加到羧苄青霉素和四环素浓度分别为50μg/mL和50μg/mL的2YT(下文中也简称为C⁺/T⁺2YT) 平板上，正置5min后倒置放在37℃培养过夜。第二天观察克隆生长的情况，并计算库容。库容的计算方法如下，从A行开始，依次标记为1,2,3,4,5,6,7,8到X行。首先选择计数孔，先将克隆数目在3-20个克隆的计数孔选出，得出行数X,并数出对应孔中的克隆数n，计算公式为5×100×10^X×n，经计算，获得了每毫升菌液库容大小为3×10¹¹cfu，即3×10¹¹个抗体基因的抗体基因库。

2.3抗体基因噬菌体展示文库的制备

基于抗体基因库容容量，吸取50个OD(1个OD为5×10⁸cfu)的全人抗体基因库的菌液加入到新鲜的2-YT液体培养基中，使得初始OD值为0.1。将所得物置于37℃，220rpm 的摇床中培养至对数生长期(OD600＝0.6左右)，再以50倍于细菌数的数量(即，感染复数(MOI)为大约50)加入VSCM13辅助噬菌体(购自Stratagene)，充分混匀，静置30min 后在220rpm的摇床中继续培养1小时。随后，将培养物以10000rpm的转速离心5min 后，弃上清，将培养液替换为羧苄青霉素50μg/mL/卡那霉素40μg/mL双抗性的2-YT培养基(下文也称为C⁺/K⁺2-YT培养基)，并于30℃，220rpm继续培养过夜。次日，菌液于13000g离心10min，收集上清后加入20％PEG/NaCl(由体积浓度为20％的PEG6000 和2.5M NaCl配制而成)使得PEG/NaCl最终浓度为4％，混匀，并置于冰上1小时，再以13000g的转速离心10min，将沉淀的噬菌体用PBS润洗后保存并用于后续噬菌体筛选。

2.4抗体基因噬菌体展示文库的筛选

2.4.1磁珠法筛选抗体基因噬菌体展示文库

磁珠法筛选是基于将抗原蛋白(Spike-RBD-mFc，Sinobio，40592-V05H)进行生物素标记后，再与偶联有链霉亲和素的磁珠结合，通过将结合抗原的磁珠和抗体基因噬菌体展示文库进行孵育、洗涤和洗脱的淘选过程，通常经历3-4轮的淘选，由此针对抗原的特异性单克隆抗体可以大量富集。本实施例中，将生物素标记的2019-nCoV冠状病毒RBD蛋白用于噬菌体展示文库筛选，经过3轮淘选后进行针对RBD蛋白的单克隆抗体初筛。

抗体筛选的具体实施方法如下：

首先用生物素标记的2019-nCoV冠状病毒RBD蛋白(Spike-RBD-mFc，Sinobio，40592-V05H)与链霉亲和素偶联的磁珠孵育，使得生物素标记的RBD蛋白结合到磁珠上。将结合RBD蛋白的磁珠和构建的噬菌体库室温下孵育2h。经PBST洗涤6-8次后，去除非特异性吸附的噬菌体，加入Trypsin(Gibco，25200072)轻轻混匀并反应20min，以洗脱特异性结合的抗体展示噬菌体。随后，用洗脱下来的噬菌体侵染对数期的SS320菌体 (Lucigen,MC1061F)并静置30min，然后在220rpm条件下培养1h，再加入VSCM13 辅助噬菌体并静置30min，继续在220rpm条件下培养1h，离心并置换至C⁺/K⁺2-YT培养基中，最终得到的噬菌体继续用于下一轮的淘选。

2.4.2免疫管法筛选抗体基因噬菌体展示文库

免疫管法和磁珠法的目的均为富集针对抗原的特异性抗体，为两个相互补充和验证的实验方法。

免疫管法筛选的原理是将2019-nCoV冠状病毒RBD蛋白(Spike-RBD-mFc，Sinobio，40592-V05H)包被在具有高吸附力的免疫管表面，通过将噬菌体展示抗体文库加入免疫管中并和吸附于免疫管表面的抗原蛋白进行孵育、洗涤和洗脱的淘选过程，经历2-4轮淘选，最终将针对抗原的特异性单克隆抗体富集下来。

具体实施方法如下：

第一轮筛选时，在免疫管中加入1mL 100μg/mL的RBD-mFc，4℃包被过夜，第二天弃去包被液，加入5％牛奶的PBS封闭2h，PBS润洗两次后加入构建的总量为10¹⁴个全人抗体基因的噬菌体库，孵育2h，用PBS润洗8遍，然后用PBST润洗2遍，以去除非特异性结合的噬菌体，然后向免疫管中加入0.8mL 0.05％EDTA胰酶消化液，用于洗脱特异性结合目标抗原的噬菌体，接着将其侵染对数期的SS320菌体(Lucigen，60512-1)，37℃ 静置30min，然后220rpm条件下培养1h，再加入VSCM13辅助噬菌体，静置30min，继续在220rpm条件下培养1h，离心并置换至C⁺/K⁺2-YT培养基中，并于30℃，220rpm 环境下继续培养过夜。第二天沉淀噬菌体，用于后续2-4轮的筛选。通常用于第二轮、第三轮和第四轮噬菌体筛选的抗原包被浓度依次递减，分别为30μg/mL，10μg/mL和3μg/mL；除此之外，PBS润洗强度也逐渐加大，PBS洗脱次数依次为12次，16次和20次。

对每轮洗脱下来的噬菌体池进行ELISA检测来评价富集的效果，并从每轮筛选的噬菌体池中随机挑选10个克隆进行序列分析，结果显示在图3A和图3B中。

结果表明，第三轮筛选后抗体序列富集明显，因此，选择第三轮所得的克隆进行ELISA 的阳性克隆筛选。

2.5单克隆的挑选

在共四轮筛选后，选择第三轮所得的克隆进行ELISA的阳性克隆ELISA筛选。最终，在2304个克隆中共筛选到88个能够与RBD蛋白结合的阳性克隆，经测序分析、ELISA 结合和Fab水平的FACS阻断检测后，最终选取了2个克隆的序列构建全长抗体以进行进一步的实验。具体实施方法如下。

2.5.1阳性克隆测序与分析

在完成初筛工作后，对88个能够与RBD蛋白结合的阳性克隆进行编号，吸取2μL 菌液到2mL的2YT培养基中，37℃，220rpm培养过夜，提取质粒进行二代测序。测序结果通过SeqMan将原始的AB1文件整合、比对、去掉非抗体基因序列，生成抗体基因整合版的fasta文件。随后将DNA序列通过MEGA6翻译为氨基酸序列，并通过氨基酸序列找出含有终止子、非常规序列等，导出氨基酸序列的fasta文件。

2.5.2ELISA测定法检测Fab形式抗体的亲和效果

首先挑取第三轮筛选的克隆于含有300μL 2-YT培养基的96孔深孔板中，37℃培养过夜，上清即含有表达的Fab，取上清，梯度稀释后加入到包被2μg/mL RBD-mFc的ELISA 板中，然后用HRP标记的山羊抗人Fab作为第二抗体(Goat anti-Human Fab-HRP,ThermoFisher,31482,1:6000稀释)进行检测，信号值越高，表明亲和力越强，结果显示在图4中，结果表明，在ELISA测定法中，2个抗体(分别命名为P16-A3抗体、P17-A11 抗体)的Fab均表现出了较好的亲和活性。

2.5.3裂解液的制备

将所有的阳性克隆进行测序分析，将序列唯一的克隆接种至50mL 2-YT培养基中，37℃过夜培养，离心得到的菌体沉淀中加入500μL含有浓度为25U/mL Benzonase核酸酶(Merck，70746-3)的裂解液，置于冰上1h，13000rpm离心5min后获得裂解液并进行定量，裂解液将用于细胞水平的阻断效果检测。

2.5.4细胞水平检测Fab形式抗体的阻断效果

流式细胞水平上用于筛选具有S蛋白阻断活性的候选抗体，方法如下：将梯度稀释(首孔10μg/mL，3倍梯度稀释)的候选抗体Fab裂解液和0.5μg/mL RBD-mFc等体积混合，在4℃孵育1h，然后将100μl混合物转移至含有2.0×10⁵个Vero E6细胞/100μl(Vero E6 细胞获自ATCC,CRL-1586)的96孔板中，接着孵育1h，FACS缓冲液润洗后，加入100μl PE标记的抗小鼠IgG-Fc流式抗体(Jackson,115-115-164，1:200稀释)作为第二抗体，用于检测VeroE6细胞上结合的RBD-mFc。结果显示在图5中，结果表明，2个抗体(P16-A3 抗体、P17-A11抗体)的Fab均表现出较好的细胞水平的阻断活性。

本实施例中，发现序列独特的2个Fab形式的抗体(P16-A3抗体、P17-A11抗体)表现出较好的细胞水平的阻断结合活性，因此将所述2个Fab形式的抗体分别构建至人IgG1Fc中获得全长抗体并进行进一步的验证。

实施例3全长抗体的构建、表达和纯化

在本实施例中，将实施例2中获得的2个对结合ACE2阻断活性较好的Fab抗体构建为人IgG1型，其中轻链均为κ型，抗体类型为全人抗体。

3.1质粒构建

从筛选获得的含有Fab抗体菌株中，PCR扩增获取抗体轻、重链可变区片段，通过同源重组方法，分别构建至经过改造的含有轻、重链恒定区片段的真核表达载体质粒pcDNA3.3-TOPO(Invitrogen)上，组成完整的抗体轻、重链全长基因，编码SEQ ID NO： 17、18、19、20所示的抗体重链和轻链氨基酸序列)。

3.2质粒准备

将构建好的含抗体轻重链全长基因的载体分别转化到大肠杆菌SS320中，37℃过夜培养，利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒提取，得到无内毒素的抗体轻重链质粒以供真核表达使用。

3.3抗体的表达纯化

候选抗体P16-A3、P17-A11以及对照抗体CR3022(参见US10066238)是通过ExpiCHO瞬转表达系统(Thermo Fisher，A29133)表达的，具体方法如下：

转染当天，确认细胞密度为7×10⁶至1×10⁷个活细胞/mL左右，细胞存活率>98％，此时，用37℃预温的新鲜ExpiCHO表达培养基将细胞调整到终浓度为6×10⁶个细胞/mL。用4℃预冷的OptiPRO^TM SFM稀释目的质粒(向1mL所述培养基中加入1μg质粒)，同时，用OptiPRO^TMSFM稀释ExpiFectamine^TMCHO，再将两者等体积混合并轻轻吹打混匀制备成ExpiFectamine^TMCHO/质粒DNA混合液，室温孵育1-5min，缓慢加入到准备好的细胞悬液中，并同时轻轻摇晃，最后置于细胞培养摇床中，在37℃，8％CO₂条件下培养。

在转染后18-22h，向培养液中添加ExpiCHO^TMEnhancer和ExpiCHO^TMFeed，摇瓶放置于32℃摇床和5％CO₂条件下继续培养，在转染后的第5天，添加相同体积的ExpiCHO^TMFeed，缓慢加入的同时轻轻混匀细胞混悬液，在转染7-15天后，将表达有目的蛋白的细胞培养上清于15000g高速离心10min，所得上清用MabSelect SuRe LX(GE，17547403)进行亲和纯化，然后用100mM乙酸钠(pH3.0)洗脱目的蛋白，接着用1M Tris-HCl中和，最后通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)将所得蛋白置换至PBS缓冲液中。

3.4抗体的浓度测定

将经纯化的抗体蛋白用经验证过的超微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司，Nano-300)进行浓度测定，将经测定的A280数值除以抗体理论消光系数后的数值作为后续研究的抗体浓度值，质检合格后，分装并保存于－80℃。

实施例4候选抗体的分子量和纯度鉴定

在本实施例中，用SDS-PAGE检测两个候选抗体P16-A3、P17-A11以及对照抗体CR3022的相对分子量和纯度。

4.1样品溶液制备

非还原溶液制备：候选抗体，对照抗体以及质控品IPI(所述IPI是伊匹木单抗(Ipilimumab)的缩写，用作每次SDS-PAGE、SEC-HPLC等理化性质的质控品)1μg加入 5×SDS上样缓冲液，和40mM碘代乙酰胺，75℃干浴加热10min，冷却到室温后，12000 rpm离心5min，取上清。

还原溶液制备：候选抗体，对照抗体以及质控品IPI 2μg加入5×SDS上样缓冲液和5 mM DTT，100℃干浴加热10min，冷却到室温后，12000rpm离心5min，取上清。

4.2实验流程

Bis-tris 4-15％梯度胶(购于金斯瑞)，恒压110V电泳，当考马斯亮蓝迁移到凝胶底部，停止运行，取出凝胶片置考马斯亮蓝染色液中1-2h，弃去染色液，加入脱色液，根据需要更换2-3次脱色液，脱色至凝胶背景透明后保存在去离子水中。

4.3实验结果

结果显示在图6中，结果表明，候选抗体和质控品IPI非还原胶的条带在为150kD左右，还原胶的条带分别是55kD左右和25kD左右，符合预期大小，且纯度均大于98％。

实施例5候选抗体单体纯度鉴定

在本实施例中，用SEC-HPLC检测两个候选抗体P16-A3、P17-A11以及对照抗体CR3022的单体纯度。

5.1材料准备

流动相：150mmol/L磷酸缓冲液，pH 7.4。

样品制备：候选抗体、对照抗体以及质控品IPI均用流动相溶液稀释到0.5mg/mL。

5.2实验流程

Agilent HPLC 1100色谱柱(XBridge BEH SEC 3.5μm,7.8mm I.D.×30cm,Waters)流速设为0.8mL/min，进样体积20μL，VWD检测器波长为280nm和214nm。依次进样空白溶液、IPI质控品溶液和样品溶液。

5.3实验结果

按照面积归一法计算样品中高分子聚合物，抗体单体和低分子物质百分比，结果显示在图7A-图7C，结果表明，两个候选抗体P16-A3、P17-A11以及对照抗体CR3022的单体纯度均大于98％。

实施例6候选抗体热稳定性检测

差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry；DSF)能够根据蛋白质图谱中的荧光变化过程提供有关蛋白质结构稳定性的信息，检测蛋白的构型变化，获得蛋白质的熔解温度(T_m)。

在本实施例中，采用DSF法检测了两个候选抗体P16-A3、P17-A11以及对照抗体CR3022的T_m值。

6.1实验流程

制备抗体溶液，0.2mg/mL，19μL/孔，每个供试品在96孔板(Nunc)中设置三个平行孔，并以PBS和IPI(Ipilimlumab)作为参比，然后在每个孔中加入1μL浓度为100× 的SYPROorange染料，用移液枪吹打混匀，准备上机。样品热稳定测试采用ABI 7500FAST RT-PCR仪器，试验类型选择熔解曲线，采用连续模式，扫描温度范围为25～95℃，升温速率为1％，25℃平衡5min，在升温过程中采集数据，报告基团选择“ROX”，淬灭基团选择“None”，反应体积20μL，以熔解曲线一阶导数的第一个峰谷对应的温度确定为候选抗体的熔解温度Tm。

6.2实验结果

实验结果显示在表1中，结果表明，抗体P16-A3、抗体P17-A11与对照抗体CR3022的热稳定性相当，都在70℃左右，具有较好的热稳定性。

表1 候选抗体和对照抗体的熔解温度

抗体名称	Tm(℃)
		CR3022	70.1
P16-A3	69.3
		P17-A11	70.5

实施例7基于ELISA检测候选抗体的亲和活性和阻断活性

在本实施例中，检测了两个候选抗体P16-A3、P17-A11对2019-nCoV冠状病毒S蛋白的亲和活性和阻断S蛋白与分离的ACE2蛋白结合的能力。

7.1基于ELISA检测候选抗体的亲和活性

在96孔ELISA板上，包被重组的2019-nCoV冠状病毒Spike-RBD-mFc，2μg/mL， 30μL/孔，4℃过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h，用PBST洗板3次后，加入梯度稀释(梯度浓度见图8)的两个候选抗体P16-A3、P17-A11或对照抗体CR3022，并孵育1h。之后，用PBST清洗3次后加入100μL/孔1:5000稀释的HRP标记的抗人Fc第二抗体(Abcam，ab98624(山羊抗人IgG Fc(HRP)预吸附抗体))并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板六次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M的HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450下读板，结果显示在图8中，结果表明，两个候选抗体P16-A3、P17-A11表现出显著优于对照抗体CR3022的S蛋白亲和活性。

7.2基于ELISA检测候选抗体的阻断活性

用人ACE2-huFc蛋白，8μg/mL，30μL/孔，4℃过夜包被96孔板。次日，将96孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h。然后分别将两个候选抗体P16-A3、P17-A11或对照抗体CR3022梯度稀释(梯度浓度见图9)，并与生物素标记的上述Spike-RBD-His提前预混1.0h，在封闭完成并洗板结束后转移至96孔ELISA板中，孵育1h。用PBST清洗 3次后加入100μL/孔1:5000稀释的第二抗体NeutrAvidin-HRP(Thermofisher，31001)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板六次，加入TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色，根据显色结果，加入2MHCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450 下读板，结果显示在图9中。用Prism^TM软件(GraphPad)内的S形剂量-反应模型进行数据分析。用计算的IC₅₀值(定义为使病毒S蛋白与ACE2的结合减少50％所需的抗体浓度)作为阻断效力的指示。经计算，两个候选抗体P16-A3、P17-A11分别具有7.7nM和4.2nM 的IC₅₀值，表明了这两个候选抗体P16-A3、P17-A11具有优异的阻断病毒S蛋白与分离的 ACE2蛋白结合的能力。

实施例8基于ELISA测定法的候选抗体表位分组

在本实施例中，对两个候选抗体P16-A3、P17-A11和对照抗体CR3022结合2019-nCoV 冠状病毒S蛋白的表位进行了分组。

8.1双抗夹心法对候选抗体的表位进行分组

将96孔板的孔分别用候选抗体P16-A3、P17-A11和对照抗体CR3022包被，2μg/mL，30μL/孔，4℃过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h。然后，加入 S蛋白RBD-His，2μg/mL，30μL/孔，孵育1h。之后，用PBST清洗3次后，如图10加入梯度稀释的生物素化的候选抗体P17-A11，30μL/孔，孵育1h。之后，用PBST清洗3 次后加入100μL/孔1:5000稀释的第二抗体NeutrAvidin-HRP(Thermofisher，31001)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板六次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色，根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450 下读板，结果表明，P17-A11和CR3022结合在2019-nCoV冠状病毒S蛋白RBD结构域不同的表位，而P17-A11和P16-A3结合在2019-nCoV冠状病毒S蛋白RBD结构域相同的表位。

8.2竞争法对候选抗体的表位进行分组

将96孔板分别用S蛋白RBD-His进行包板，4μg/mL，30μL/孔，4℃过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h。然后，加入梯度稀释(如图11)的候选抗体P16-A3、P17-A11和对照抗体CR3022，30μL/孔，孵育1h。之后加入生物素化的候选抗体P17-A11，30μL/孔，孵育1h。之后，用PBST清洗3次后加入100μL/孔1:5000稀释的第二抗体NeutrAvidin-HRP(Therofisher，31001)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板六次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色，根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450下读板，结果显示在图11中，结果表明，P17-A11和CR3022结合在2019-nCoV冠状病毒S蛋白RBD结构域不同的表位，而P17-A11和P16-A3结合在2019-nCoV冠状病毒S蛋白RBD结构域相同的表位，竞争法的结果与上述8.1所述双抗夹心法的结果相符合。

实施例9基于Fortebio的候选抗体和抗原结合亲和力的测定

在本实施例中，采用Fortebio BLItz仪器，检测了两个候选抗体P16-A3、P17-A11和对照抗体CR3022与2019-nCoV冠状病毒S蛋白RBD-his的亲和力。

9.1材料准备

称取10g的BSA，量取5mL的Tween 20，加入到1000mL的10×PBS，混匀，制成 10×KB缓冲液。过滤后分装保存。吸取0.1mL 0.1M且pH＝2.0的甘氨酸溶液加入至0.9mL 的超纯水中，混匀，制成传感器再生缓冲液。作为抗原的S蛋白RBD-His以10×KB稀释成10μg/mL，抗体以10×KB稀释成系列浓度梯度，依次为200、66.6、22.2、7.41、0nM。

9.2实验流程

避光条件下，采用10×KB缓冲液预湿传感器(Anti-Penta-HIS，HIS1K,Fortebio,CA)，至少10min后开始测试样品板(GreinierBio，PN655209)，测试无误后按预设程序进行。首先采用抗原S蛋白RBD-His进行结合，300s,在10×KB缓冲液中平衡30s后，将结合有抗原的传感器转移至不同浓度抗体稀释液中结合300s，待信号稳定后，再转移到10×KB 缓冲液中，解离时间为900s，最后通过不同浓度抗体的结合解离数据拟合得到K_D、Kon 和Koff。

9.3结果分析

结果显示在表2中，候选抗体P16-A3、P17-A11的亲和力分别为0.415nM、0.311nM，对照抗体CR3022亲和力为2.42nM。该实验结果与ELISA测定法中的亲和阻断数据一致 (详见实施例7)，候选抗体结合2019-nCoV冠状病毒S蛋白的能力显著优于对照抗体 CR3022。

表2 BLI测定抗体对2019-nCoV S蛋白RBD-his的亲和力

抗体名称	K<sub>D</sub>(M)	k<sub>on</sub>(1/Ms)	k<sub>off</sub>(1/s)
				CR3022	2.42E-9	1.15E5	2.78E-4
P16-A3	4.15E-10	1.73E5	7.17E-5
				P17-A11	3.11E-10	2.16E5	6.71E-5

实施例10基于Fortebio的候选抗体表位分组

在本实施例中，为了考察候选抗体以及对照抗体的结合表位是否一致，采用Fortebio BLItz仪器对候选抗体和对照抗体进行了抗体表位的判定。

10.1材料准备

同实施例9

10.2实验流程

避光条件下，采用10×KB缓冲液预湿传感器(Anti-Penta-HIS，HIS1K,Fortebio,CA), 至少10min后开始测试样品板(GreinierBio，PN655209)，测试无误后按预设程序进行。固化抗原S蛋白RBD-His，300s，在10×KB缓冲液中平衡30s后和200nM浓度的第一抗体结合300s，待信号稳定后，记录其信号强度，再转移到200nM的第二抗体溶液中，并观察其结合强度，此时如果结合信号值在第一抗体基础上明显增强，说明了两个抗体的结合表位不一样，如果结合信号值相较于第一抗体没有增强，说明了两个抗体的结合表位相同。

10.3结果分析

实验结果显示在图12A-12C中，结果表明，候选抗体P16-A3和P17-A11的表位一致，且两者与对照抗体CR3022的表位不同。结果和实施例8中基于ELISA的表位分组结果一致。

实施例11细胞水平检测候选抗体阻断S蛋白结合ACE2

本实施例中，基于FACS方法评价候选抗体阻断病毒S蛋白RBD结构域和受体ACE2的结合活性。本实施例中使用的Vero E6细胞属于绿猴肾细胞系，天然表达ACE2。绿猴 ACE2与人ACE2非常保守，序列同源性达到95％，因此本实施例选择用Vero E6代替表达人ACE2的细胞系进行实验。

11.1实验流程

配制FACS缓冲液(1X PBS+2％FBS)，使用FACS缓冲液将候选抗体和对照抗体进行梯度稀释(稀释比例见图13)，将抗体稀释液按100μL每孔加入96孔圆底板中。同样使用FACS缓冲液将RBD-mFc蛋白稀释至1μg/mL，向对应96孔板中加入100μL，用排枪轻轻吹打混匀并将96孔板放置于4℃孵育1h。

将传代2-4次且生长状态良好的Vero E6细胞用于实验，胰酶消化后重悬细胞，4℃、 300g离心去除上清，随后将细胞用FACS缓冲液重悬，计数后将细胞密度调整为2×10⁶个细胞/mL，以每孔100μL加至新的96孔圆底板中，4℃、300g离心并去除上清。向对应 96孔板对应位置的细胞中加入预先孵育的抗体/RBD-mFc混合液，每孔180μL，用排枪轻轻吹打混匀，并于4℃孵育30min。

将孵育后的细胞混合液于4℃、300g离心并去除上清，随后向对应孔中各加入200μL 的FACS缓冲液并重悬细胞，4℃、300g离心去上清；重复此步骤2次。使用FACS缓冲液将PE标记的抗小鼠IgG-Fc流式抗体(Jackson,115-115-164)以1:200配制成第二抗体稀释液，使用排枪向对应细胞中加入200μL/孔的该第二抗体稀释液并轻轻吹打重悬细胞，随后将细胞放置于4℃避光孵育30min，孵育结束后将细胞于4℃、300g离心去除上清，加入 FACS缓冲液重悬细胞，重复该步骤两次。最后通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)检测。

11.2实验结果

实验结果显示在表3和图13中，结果表明，两个候选抗体显示出了剂量依赖的受体结合阻断活性，在细胞水平有优异的阻断效果且显著优于对照抗体CR0322。

表3 两个候选抗体和对照抗体的IC50

抗体名称	IC50(nM)
		P16-A3	0.89
P17-A11	0.89
		CR3022	无明显阻断活性

实施例12 2019-nCoV冠状病毒中和实验

本实施例中，以抗CD20抗体利妥昔单抗(Rituxmab)作为阴性同种型对照(IsotypeIgG)，测试评价了候选抗体P16-A3、P17-A11对2019-nCoV冠状病毒的中和效果。2019-nCoV冠状病毒S蛋白结合细胞表面上的受体ACE2是病毒感染宿主细胞的第一步。本实施例中使用的Vero E6细胞属于绿猴肾细胞系，天然表达ACE2。因为绿猴ACE2与人ACE2的序列同源性达到95％，Vero E6细胞常用于抗冠状病毒候选药物的体外药效评价，因此使用Vero E6细胞用于候选抗体的病毒中和活性测定。

12.1材料准备

12.1.1配制细胞培养基

在MEM培养基(Invitrogen,41500-034)中，添加谷氨酰胺(终浓度2mM)、青霉素(终浓度100U/mL)、链霉素(终浓度100μg/mL)、灭活FBS(终浓度10％)。

12.1.2配制病毒培养基

在MEM培养基(Invitrogen,41500-034)中，添加谷氨酰胺(终浓度2mM)、青霉素(终浓度100U/ml)、链霉素(终浓度100μg/mL)、灭活FBS(终浓度5％)。

12.1.3配制抗体稀释液

使用无血清培养基稀释测试抗体和阴性同种型对照(Isotype IgG)，初始浓度为60 μg/mL，2倍梯度稀释，共稀释12个稀释度(配制的抗体浓度为60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234、0.117、0.059、0.029μg/mL)。每个抗体浓度各取50μL至96 孔细胞培养板中，并设置3个复孔。

12.2实验流程

12.2.1病毒和抗体混合孵育

获得2019-nCoV病毒(hCoV-19/Hangzhou/ZJU-05/2020，全球共享流感数据倡议组织 (GISAID)登录号EPI_ISL_415711)，稀释于无血清MEM中，感染Vero E6细胞。感染6 天后，用Karber法计算50％组织培养物(在本实施例中为细胞)感染剂量(TCID₅₀)。

向各抗体稀释液中加入等体积50μL含有100TCID₅₀的所述2019-nCoV病毒 (hCoV-19/Hangzhou/ZJU-05/2020，稀释在无血清MEM中)，混匀，并置于室温中孵育60 min。此时，抗体终浓度为：30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234、0.117、0.059、 0.029、0.015μg/mL。

12.2.2病毒和抗体混合物感染细胞

收集新鲜培养的Vero E6细胞，用实施例12.1.2配制的病毒培养基(5％FBS-MEM)配制细胞浓度为2×10⁵个细胞/mL，取100μl加入至上述含病毒抗体混合物的培养板中并混匀，放置于35℃、5％CO₂细胞培养箱中。

12.2.3观察细胞病变和计算抗体的中和效应

接种后的第2天起显微镜下观察细胞生长情况，第4天观察细胞病变效应(cytopathic effect(CPE))情况，并记录。第6天最终判定结果。

CPE分级标准：“+”为少于25％的细胞出现CPE；“++”为大于25％、少于50％细胞出现CPE；“+++”为50％－70％的细胞出现CPE；“++++”为大于75％的细胞出现CPE。

判定标准：抗体组本身无明显细胞毒性，仅培养基的正常细胞对照组显示为细胞生长，仅加入病毒的病毒对照组显示为CPE达++++。

用Karber法计算抗体对病毒的中和终点(将抗体稀释度转化为对数)，即能够保护50％细胞不受100TCID50攻击病毒液感染的抗体最高稀释浓度就是该抗体的滴度。

12.3实验结果

实验结果显示在表4中，结果表明，候选抗体P17-A11和P16-A3能够显著抑制2019-nCoV病毒对Vero E6细胞的感染，其保护50％细胞不受100TCID₅₀病毒液感染的抗体滴度分别为0.015μg/mL和0.029μg/mL，即0.100nM和0.193nM。

表4.抗体对2019-nCoV冠状病毒的中和作用

抗体名称	抗病毒滴度(μg/mL)
		P17-A11	0.015
P16-A3	0.029
		CR3022	无中和活性
同种型IgG	无中和活性

实施例13

基于上述实施例选定了抗体P16-A3、P17-A11，对它们进行了分析和测序。基于IMGT 数据库(http://www.imgt.org/)对人抗体序列可变区进行定义，确定本发明抗体轻链和重链可变区的序列(SEQ ID NO:1-4)，针对可变区序列进行分析，采用AbM定义CDR的方式，确定了抗体重链和轻链的互补决定区序列(SEQ ID NO:5-16)。具体序列信息如下：

表5 抗体的VH和VL序列

表6.抗体的重链可变区CDR序列

表7.抗体的轻链可变区CDR序列

表8.全长抗体的氨基酸序列

表9.全长抗体的核苷酸序列

序列表

<110> 三优生物医药（上海）有限公司

上海之江生物科技股份有限公司

<120> 针对冠状病毒的具有中和活性的抗体及其用途

<130>

<160> 24

<170> PatentIn版本3.3

<210> 1

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P16-A3 VH序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Ser Ser Ser Trp Leu Leu Gln Ser Phe Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P16-A3 VL序列

<400> 2

Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Tyr Ser

20 25 30

Leu Val Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ile His Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P17-A11 VH序列

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Ala Thr Leu Met Asn Asn Lys Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P17-A11 VL序列

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P16-A3 HCDR1

<400> 5

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His

1 5 10

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P16-A3 HCDR2

<400> 6

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P16-A3 HCDR3

<400> 7

Ala Tyr Ser Ser Ser Trp Leu Leu Gln Ser Phe Tyr Tyr Tyr Gly Met

1 5 10 15

Asp Val

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P16-A3 LCDR1

<400> 8

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Tyr Ser Leu Val

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P16-A3 LCDR2

<400> 9

Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P16-A3 LCDR3

<400> 10

Gln Gln Val Ile His Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P17-A11 HCDR1

<400> 11

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His

1 5 10

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P17-A11 HCDR2

<400> 12

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P17-A11 HCDR3

<400> 13

His Ala Thr Leu Met Asn Asn Lys Asp Ile

1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P17-A11 LCDR1

<400> 14

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P17-A11 LCDR2

<400> 15

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P17-A11 LCDR3

<400> 16

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg Thr

1 5

<210> 17

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P16-A3 HC

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Ser Ser Ser Trp Leu Leu Gln Ser Phe Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

130 135 140

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

195 200 205

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

210 215 220

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

225 230 235 240

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

245 250 255

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

260 265 270

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

275 280 285

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

290 295 300

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

305 310 315 320

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

325 330 335

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

340 345 350

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

355 360 365

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

370 375 380

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

385 390 395 400

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

405 410 415

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

420 425 430

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

435 440 445

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 18

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P16-A3 LC

<400> 18

Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Tyr Ser

20 25 30

Leu Val Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ile His Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 19

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P17-A11 HC

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Ala Thr Leu Met Asn Asn Lys Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 20

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P17-A11 LC

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 21

<211> 1371

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P16-A3 HC

<400> 21

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagggcgtat 300

agcagcagct ggctccttca gtccttttac tactacggta tggacgtctg gggccaaggg 360

accacggtca ccgtctcatc agcttccacc aagggcccct ccgtgttccc cctggctccc 420

tcttccaaga gcaccagcgg cggcaccgct gctctgggat gtctggtgaa ggactacttc 480

cctgagcctg tgaccgtgtc ctggaattcc ggcgccctga cctccggcgt gcacacattc 540

cctgctgtgc tgcagtcctc cggcctgtat agcctgtcct ccgtggtgac agtgcctagc 600

tccagcctgg gcacccagac ctatatctgc aacgtgaacc acaagcctag caataccaag 660

gtggacaaga aggtggagcc taagagctgc gacaagaccc acacctgtcc tccatgtcct 720

gctccagaac tgctcggcgg accttccgtg ttcctgtttc ctccaaagcc taaggacacc 780

ctgatgatca gcagaacccc tgaagtgacc tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggat 840

cccgaagtga agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 900

cctagagagg aacagtacaa cagcacctac agagtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac 960

caggattggc tgaacggcaa agagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgct 1020

cctatcgaga aaaccatcag caaggccaag ggccagccta gggaacccca ggtttacaca 1080

ctgcctccaa gcagggacga gctgaccaag aatcaggtgt ccctgacctg cctggtcaag 1140

ggcttctacc cttccgatat cgccgtggaa tgggagagca atggccagcc tgagaacaac 1200

tacaagacaa cccctcctgt gctggacagc gacggctcat tcttcctgta cagcaagctg 1260

acagtggaca agagcagatg gcagcagggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag 1320

gccctgcaca accactacac ccagaagtcc ctgagcctgt ctcctggcaa a 1371

<210> 22

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P16-A3 LC

<400> 22

aacatccagt tgacccagtc tccagtctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60

ctcacttgcc gggcaagtca gggcattggt tattcgttag tctggtatca gaaaaaacca 120

gggacagccc ctaagctcct gatctttgat gcgtccacct tgcaaagtgg cgtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattctg caacttatta ctgtcaacaa gttatacatt acccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa aaggaccgtg gctgccccca gcgtgttcat cttccctcct 360

agcgacgagc agctgaagag cggcaccgct agcgtggtgt gtctgctgaa taacttctat 420

cccagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgccc tgcagagcgg caactcccag 480

gagtccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgagctc caccctgacc 540

ctgtccaagg ctgattatga gaagcacaag gtgtatgctt gcgaggtgac acaccagggc 600

ctgtccagcc ctgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642

<210> 23

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P17-A11 HC

<400> 23

caggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactac 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggccgtat attactgtgc gcgccatgcg 300

acgttgatga ataataagga catatggggc caagggaccc tggtcaccgt ctcatcggct 360

tccaccaagg gcccctccgt gttccccctg gctccctctt ccaagagcac cagcggcggc 420

accgctgctc tgggatgtct ggtgaaggac tacttccctg agcctgtgac cgtgtcctgg 480

aattccggcg ccctgacctc cggcgtgcac acattccctg ctgtgctgca gtcctccggc 540

ctgtatagcc tgtcctccgt ggtgacagtg cctagctcca gcctgggcac ccagacctat 600

atctgcaacg tgaaccacaa gcctagcaat accaaggtgg acaagaaggt ggagcctaag 660

agctgcgaca agacccacac ctgtcctcca tgtcctgctc cagaactgct cggcggacct 720

tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag gacaccctga tgatcagcag aacccctgaa 780

gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccac gaggatcccg aagtgaagtt caattggtac 840

gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gtacaacagc 900

acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag 960

tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg cctgctccta tcgagaaaac catcagcaag 1020

gccaagggcc agcctaggga accccaggtt tacacactgc ctccaagcag ggacgagctg 1080

accaagaatc aggtgtccct gacctgcctg gtcaagggct tctacccttc cgatatcgcc 1140

gtggaatggg agagcaatgg ccagcctgag aacaactaca agacaacccc tcctgtgctg 1200

gacagcgacg gctcattctt cctgtacagc aagctgacag tggacaagag cagatggcag 1260

cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320

aagtccctga gcctgtctcc tggcaaa 1347

<210> 24

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体P17-A11 LC

<400> 24

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa aaggaccgtg gctgccccca gcgtgttcat cttccctcct 360

agcgacgagc agctgaagag cggcaccgct agcgtggtgt gtctgctgaa taacttctat 420

cccagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgccc tgcagagcgg caactcccag 480

gagtccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgagctc caccctgacc 540

ctgtccaagg ctgattatga gaagcacaag gtgtatgctt gcgaggtgac acaccagggc 600

ctgtccagcc ctgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642

Claims

1.特异性结合冠状病毒S蛋白的分离的抗体或抗原结合片段，其包含

(a)SEQ ID NO:1所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与上述6个CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体；或

(b)SEQ ID NO:3所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与上述6个CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体。

2.特异性结合冠状病毒S蛋白的分离的抗体或抗原结合片段，其包含

(a)SEQ ID NO:5所示的HCDR1或SEQ ID NO:5所示的HCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:6所示的HCDR2或SEQ ID NO:6所示的HCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:7所示的HCDR3或SEQ ID NO:7所示的HCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；SEQ ID NO:8所示的LCDR1或SEQ ID NO:8所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:9所示的LCDR2或SEQ ID NO:9所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:10所示的LCDR3或SEQ ID NO:10所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；或

(b)SEQ ID NO:11所示的HCDR1或SEQ ID NO:11所示的HCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:12所示的HCDR2或SEQ ID NO:12所示的HCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:13所示的HCDR3或SEQ ID NO:13所示的HCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；SEQ ID NO:14所示的LCDR1或SEQ ID NO:14所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:15所示的LCDR2或SEQ ID NO:15所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:16所示的LCDR3或SEQ ID NO:16所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

优选地，特异性结合冠状病毒S蛋白的分离的抗体或抗原结合片段包含

(a)SEQ ID NO:5所示的HCDR1、SEQ ID NO:6所示的HCDR2和SEQ ID NO:7所示的HCDR3；SEQ ID NO:8所示的LCDR1、SEQ ID NO:9所示的LCDR2和SEQ ID NO:10所示的LCDR3；或

(b)SEQ ID NO:11所示的HCDR1、SEQ ID NO:12所示的HCDR2和SEQ ID NO:13所示的HCDR3；SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:15所示的LCDR2和SEQ ID NO:16所示的LCDR3。

3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体或抗原结合片段，其包含

(a)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:1的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:2的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；或

(b)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:3的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:4的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；

优选地，所述分离的抗体包含

(b)SEQ ID NO:19或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链序列，以及SEQ ID NO:20或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链序列；

优选地，所述分离的抗体或抗原结合片段为完全人抗体。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体；优选地，其是IgG1或IgG4抗体；更优选地，其是人IgG1或人IgG4抗体。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、单链Fab、双体抗体(diabody)。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其具有一种或多种以下特性：

(a)在25℃ELISA测定法中测量，以小于约10nM，例如小于约8nM的IC50阻断冠状病毒S蛋白与分离的ACE2蛋白的结合；

(b)在25℃生物膜层干涉测定法中测量，以小于约1nM，例如约0.8nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM的结合解离平衡常数K_D结合冠状病毒S蛋白；

(c)在FACS测定法中测量，以小于约2nM，例如约1.8nM、1.5nM、1.2nM、0.9nM、0.6nM、0.3nM的IC50阻断冠状病毒S蛋白与细胞上表达的天然ACE2蛋白的结合；

(d)在细胞病变法中测量，以小于约0.5nM，例如约0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM的抗体滴度保护50％细胞不受100TCID₅₀攻击病毒液感染；

优选地，所述冠状病毒是2019-nCoV病毒。

7.多特异性抗体，其包含特异性结合冠状病毒S蛋白表位的权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，优选地，所述多特异性抗体是双特异性抗体。

8.抗体组合，其包含特异性结合冠状病毒S蛋白表位的权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，和/或其他特异性结合冠状病毒S蛋白表位的抗体或抗原结合片段。

9.分离的核酸，其编码权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段或编码权利要求7所述的多特异性抗体。

10.包含权利要求9的核酸的载体，优选地所述载体是表达载体，例如ExpiCHO载体。

11.包含权利要求9的核酸或权利要求10的载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的选自大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或抗原结合片段、多特异性抗体的其它细胞，最优选地，所述宿主细胞是293细胞或CHO细胞。

12.制备权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段、或权利要求7所述的多特异性抗体的方法，所述方法包括在适于表达编码权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段或编码权利要求7所述的多特异性抗体的核酸的条件下培养权利要求11的宿主细胞，任选地从所述宿主细胞或从培养基回收权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段、或权利要求7所述的多特异性抗体。

13.药物组合物，其包含权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求7所述的多特异性抗体、或权利要求8所述的抗体组合，以及可药用载体。

14.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段、或权利要求7所述的多特异性抗体的用途，用于制备预防和/或治疗冠状病毒感染的药物，例如，所述冠状病毒是2019-nCoV病毒。

15.在受试者中预防和/或治疗冠状病毒感染的方法，包括向受试者施用有效量的权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求7所述的多特异性抗体、权利要求8所述的抗体组合、或权利要求13的药物组合物，例如，所述冠状病毒是2019-nCoV病毒。

16.检测样品中冠状病毒S蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求7所述的多特异性抗体、或权利要求8所述的抗体组合，用于实施以下步骤：

(a)将样品与权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求7所述的多特异性抗体、或权利要求8所述的抗体组合接触；和

(b)检测权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求7所述的多特异性抗体、或权利要求8所述的抗体组合与冠状病毒S蛋白之间的复合物的形成，例如，所述冠状病毒是2019-nCoV病毒。