WO2022052968A1 - 针对冠状病毒刺突蛋白的单克隆抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
提供了针对冠状病毒S蛋白的抗体或抗原结合片段、编码该抗体或抗原结合片段的核酸、包含该核酸的宿主细胞，以及制备该抗体或抗原结合片段的方法。还提供了该抗体或抗原结合片段在冠状病毒的预防、治疗和/或诊断中的用途。
Description
本发明总体上涉及抗体及其用途。更具体地，本发明涉及针对冠状病毒刺突蛋白的单克隆抗体和抗原结合片段、其制备方法及其用途。
冠状病毒(Coronaviruses，CoV)是单股正链RNA(+ssRNA)病毒，病毒颗粒呈球形或椭圆形，直径约60～220nm。
在几种对人类有致病性的冠状病毒中，大多数与轻度的临床症状有关(Su S,Wong G,Shi W等人，Epidemiology,genetic recombination,and pathogenesis of coronaviruses.Trends Microbiol 2016；24:490–502)，但有两种冠状病毒引起了世界范围内的人类健康威胁问题：一种是重症急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndromes coronavirus(SARS-CoV))，其于2002年到2003年间在37个国家和地区造成8000多例人类感染和774例死亡(Chan-Yeung M,Xu RH.SARS:epidemiology.Respirology 2003；8(suppl):S9–14)；另一种是引起人类新型冠状病毒疾病(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)的2019新型冠状病毒(2019-nCoV)，其从2019年12月至2020年8月造成约2210万例人类感染和约78万例死亡。
冠状病毒SARS-CoV的致死率高于2019-nCoV，但是2019-nCoV在人和人之间的传播速度非常快，因此迫切需要能够中和此类冠状病毒的抗体。
发明概述
本发明人开发了一组能够以高亲和力特异性结合冠状病毒刺突蛋白，从而抑制冠状病毒感染人类的抗体，从而满足了上述需求。
在第一方面，本发明提供了分离的抗冠状病毒S蛋白的抗体或抗原结合片段，其包含(a)SEQ ID NO:2所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；
(b)SEQ ID NO:6所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:8所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；
(c)SEQ ID NO:10所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:12所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；
(d)SEQ ID NO:14所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:16所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；
(e)SEQ ID NO:18所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:20所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；
(f)SEQ ID NO:22所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:24所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；或
(g)SEQ ID NO:26所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:28所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体。
在一些实施方案中，本发明提供了特异性结合冠状病毒S蛋白的分离的抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)SEQ ID NO:29所示的HCDR1或SEQ ID NO:29所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:30所示的HCDR2或SEQ ID NO:30所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:31所示的HCDR3或SEQ ID NO:31所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:32所示的LCDR1或SEQ ID NO:32所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:33所示的LCDR2或SEQ ID NO:33所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:34所示的LCDR3或SEQ ID NO:34所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；
(b)SEQ ID NO:35所示的HCDR1或SEQ ID NO:35所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:36所示的HCDR2或SEQ ID NO:36所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:37所示的HCDR3或SEQ ID NO:37所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:38所示的LCDR1或SEQ ID NO:38所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:39所示的LCDR2或SEQ ID NO:39所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:40所示的LCDR3或SEQ ID NO:40所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；
(c)SEQ ID NO:41所示的HCDR1或SEQ ID NO:41所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:42所示的HCDR2或SEQ ID NO:42所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:43所示的HCDR3或SEQ ID NO:43所示的 HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:44所示的LCDR1或SEQ ID NO:44所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:45所示的LCDR2或SEQ ID NO:45所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:46所示的LCDR3或SEQ ID NO:46所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；
(d)SEQ ID NO:47所示的HCDR1或SEQ ID NO:47所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:48所示的HCDR2或SEQ ID NO:48所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:49所示的HCDR3或SEQ ID NO:49所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:50所示的LCDR1或SEQ ID NO:50所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:51所示的LCDR2或SEQ ID NO:51所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:52所示的LCDR3或SEQ ID NO:52所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；
(e)SEQ ID NO:53所示的HCDR1或SEQ ID NO:53所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:54所示的HCDR2或SEQ ID NO:54所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:55所示的HCDR3或SEQ ID NO:55所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:56所示的LCDR1或SEQ ID NO:56所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:57所示的LCDR2或SEQ ID NO:57所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:58所示的LCDR3或SEQ ID NO:58所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；
(f)SEQ ID NO:59所示的HCDR1或SEQ ID NO:59所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:60所示的HCDR2或SEQ ID NO:60所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:61所示的HCDR3或SEQ ID NO:61所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:62所示的LCDR1或SEQ ID NO:62所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:63所示的LCDR2或SEQ ID NO:63所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:64所示的LCDR3或SEQ ID NO:64所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；或
(g)SEQ ID NO:65所示的HCDR1或SEQ ID NO:65所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:66所示的HCDR2或SEQ ID NO:66所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:67所示的HCDR3或SEQ ID NO:67所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:68所示的LCDR1或SEQ ID NO:68所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:69所示 的LCDR2或SEQ ID NO:69所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:70所示的LCDR3或SEQ ID NO:70所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗体或抗原结合片段包含
(a)SEQ ID NO:29所示的HCDR1、SEQ ID NO:30所示的HCDR2、SEQ ID NO:31所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:32所示的LCDR1、SEQ ID NO:33所示的LCDR2、SEQ ID NO:34所示的LCDR3；
(b)SEQ ID NO:35所示的HCDR1、SEQ ID NO:36所示的HCDR2、SEQ ID NO:37所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:38所示的LCDR1、SEQ ID NO:39所示的LCDR2、SEQ ID NO:40所示的LCDR3；
(c)SEQ ID NO:41所示的HCDR1、SEQ ID NO:42所示的HCDR2、SEQ ID NO:43所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:44所示的LCDR1、SEQ ID NO:45所示的LCDR2、SEQ ID NO:46所示的LCDR3；
(d)SEQ ID NO:47所示的HCDR1、SEQ ID NO:48所示的HCDR2、SEQ ID NO:49所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:50所示的LCDR1、SEQ ID NO:51所示的LCDR2、SEQ ID NO:52所示的LCDR3；
(e)SEQ ID NO:53所示的HCDR1、SEQ ID NO:54所示的HCDR2、SEQ ID NO:55所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:56所示的LCDR1、SEQ ID NO:57所示的LCDR2、SEQ ID NO:58所示的LCDR3；
(f)SEQ ID NO:59所示的HCDR1、SEQ ID NO:60所示的HCDR2、SEQ ID NO:61所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:62所示的LCDR1、SEQ ID NO:63所示的LCDR2、SEQ ID NO:64所示的LCDR3；或
(g)SEQ ID NO:65所示的HCDR1、SEQ ID NO:66所示的HCDR2、SEQ ID NO:67所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:68所示的LCDR1、SEQ ID NO:69所示的LCDR2、SEQ ID NO:70所示的LCDR3。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗体或抗原结合片段包含
(a)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
(b)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列， 且轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
(c)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
(d)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
(e)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
(f)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；或
(g)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗体或抗原结合片段是完全人抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗体或抗原结合片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体；优选地，是IgG1或IgG4抗体；更优选地，是人IgG1或人IgG4抗体。在一些实施方案中，本发明的抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)
2、Fv、单链Fv、单链Fab、双体抗体(diabody)。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗冠状病毒S蛋白的抗体或抗原结合片段能够特异性结合SARS-CoV-2病毒S蛋白和/或SARS-COV病毒S蛋白。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗冠状病毒S蛋白的抗体或抗原结合片段具有如下特征
(a)如在25℃结合ELISA测定法中测量，以小于约1nM，优选地小于约0.1nM，更优选地小于约0.05nM的EC50结合冠状病毒S蛋白；
(b)如在25℃阻断ELISA测定法中测量，以小于约10nM，优选地小于约5nM，更优选地小于约2nM的IC50阻断冠状病毒S蛋白与分离的ACE2蛋白的结合；
(c)如在假型冠状病毒中和测定法中测量，以小于约10nM，优选地小于约1nM，更优选地小于约0.1nM的IC50中和假型冠状病毒；
(d)如在真冠状病毒中和测定法中测量，以小于约10nM，优选地小于约1nM，更优选地小于约0.1nM的EC50中和真冠状病毒，由此，真冠状病毒不能导致细胞病变效应。
在第二方面，本发明提供了编码上述第一方面所述的抗体或抗原结合片段的核酸、包含所述核酸的载体(优选地，表达载体)、包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核的或真核的，例如，选自大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或抗原结合片段的其它细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是HEK293细胞。
在第三方面，本发明提供了制备本发明的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达编码本发明的抗体或抗原结合片段或编码本发明的核酸的条件下培养本发明的宿主细胞，任选地从所述宿主细胞或从培养基回收本发明的抗体或抗原结合片段。
在第四方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的抗体或抗原结合片段，以及可药用载体。在一些实施方案中，药物组合物包含至少两种本发明的抗体或抗原结合片段，以及可药用载体。
在第五方面，本发明提供了本发明的抗体或抗原结合片段的用途，用于制备预防和/或治疗冠状病毒感染的药物。在一些实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒和/或SARS-COV病毒。
在第六方面，本发明提供了在受试者中预防和/或治疗冠状病毒感染的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的抗体或抗原结合片段、或本发明的药物组合物。在一些实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒和/或SARS-COV病毒。
本发明的抗体可有效阻断和/或抑制冠状病毒感染，能够用于冠状病毒的预防和/或治疗。
在第七方面，本发明提供了检测样品中冠状病毒S蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗体或抗原结合片段，用于实施以下步骤：
(a)将样品与本发明的抗体或抗原结合片段接触；和
(b)检测本发明的抗体或抗原结合片段与冠状病毒S蛋白之间的复合物的形成，
由此，判断来自受试者或个体的样品中是否存在冠状病毒感染。在一个实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒和/或SARS-COV病毒。
附图简述
结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。
图1、图2、图3和图4显示了在结合ELISA测定法中，候选抗体分子与SARS-CoV-2病毒S蛋白的结合曲线和EC50值。
图5、图6、图7和图8显示了在阻断ELISA测定法中，候选抗体阻断SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD结合分离的ACE2蛋白的曲线和IC50值。
图9显示了在假型冠状病毒中和测定法中，候选抗体中和假型SARS-CoV-2病毒的曲线和IC50值。
图10显示了候选抗体对SARS-CoV-2真病毒致细胞病变效应的抑制作用。上方小图：候选抗体抑制SARS-CoV-2真病毒致细胞病变效应；下方小图：不存在候选抗体时，SARS-CoV-2真病毒的致细胞病变效应。
图11显示了在SARS-CoV-2真病毒中和测定法中，候选抗体以及候选抗体的组合中和SARS-CoV-2真病毒的曲线和EC50值。
发明详述
在详细描述本发明之前，应了解，本发明不受限于本说明书中的特定方法及实验条件，因为所述方法以及条件是可以改变的。另外，本文所用术语仅是供说明特定实施方案之用，而不意欲为限制性的。
I.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小10％的下限和比指定数字数值大10％的上限的范围内的数字数值。
术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
术语“2019-nCoV”、“nCoV”、“SARS-CoV-2”和“SARS-CoV2”在本文中可互换地使用，是指引起人类新型冠状病毒疾病(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)的一种冠状病毒，其具有强烈的在人群中传播的能力。
术语“SARS-CoV”、“SARS-CoV-1”和“SARS-CoV1”在本文中可互换地使用，是指引起人类重症急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndromes，SARS)的一种冠状病毒，其于2002年到2003年间在37个国家和地区流行。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。抗体可以是任何型和亚型(例如，IgM、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA1和IgA2)的完整抗体(例如，具有两个全长的轻链和两个全长的重链)。完整抗体的单体是由二硫键连接两个全长的轻链和两个全长的重链形成的一个四肽链分子，也称为Ig分子的单体。抗体单体是构成抗体的基本结构。
“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆或由其中已经转染单个抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域的技术人员已知的方法产生。
本文所用的“分离的抗体”旨在指基本不含其他具有不同抗原特异性的抗体(Ab)的抗体(例如，分离的特异性结合冠状病毒S蛋白的抗体或其抗原结合片段基本不含特异性结合冠状病毒S蛋白以外的抗原的Ab)。
本文所用的“阻断抗体”、“中和性抗体”、“具有中和活性的抗体”或“中和抗体”在本文中可互换地使用，指这样的抗体，其与靶抗原结合或与之相互作用并阻止靶抗原与结合配偶体如受体结合或缔合，因而抑制或阻断本将因靶抗原与结合配偶体如受体的相互作用而产生的生物学反应。在本发明的情况下，指所述抗体与冠状病毒S蛋白的结合导致冠状病毒的至少一种生物活性被抑制。例如，本发明的中和抗体可以阻止或阻断冠状病毒S蛋白与ACE2结合。
“表位”指与抗体分子的可变区中称为互补位的特异性抗原结合部位相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有一个以上表位。因此，不同抗体可以结合抗原上的不同区域，并可以具有不同的生物学效应。表位可以由连续氨基酸或经蛋白质的三级折叠并接的不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常消失。表位通常在独特空间构象中包括至少3个，并且更通常至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。
术语“全抗体”、“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指包含由二硫键相互连接的至少两条重链(HC)和两条轻链(LC)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ。哺乳动物轻链分类为λ或κ。包含α、δ、ε、γ和μ重链的免疫球蛋白分类为免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。
轻链可变区和重链可变区分别包含间插有三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)的“构架”区。“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”(在本文中与超变区“HVR”可以互换使用)，是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环 (“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(万维网imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义。
然而，应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。例如，对使用Kabat和Chothia编号的CDR区域在不同指派系统定义下的残基范围如下表A所示。
表A.不同指派系统定义下的CDR残基范围
因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
本发明抗体的CDR可以根据本领域的任何方案或其组合人工地评估确定边界。除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
不同轻链或重链的构架区的序列在物种(例如人类)内具有相对保存性。抗体的构架区(其是成分轻链和重链的组合构架区)用以在三维空间中定位和比对CDR。CDR主要负责结合到抗原的表位。具有不同特异性(即针对不同抗原有不同组合位点)的抗体具有不同CDR。尽管抗体与抗体之间的CDR不同，但CDR内仅有限数目的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。
术语“抗原结合片段”是比完整或完全抗体的氨基酸残基数要少的完整或完全抗体的一部分或一段，其能结合抗原或与完整抗体(即与抗原结合片段所来源的完整抗体)竞争结合抗原。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)
2、Fv、单链Fv(scFv)、单链Fab、双体抗体(diabody)、单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)、骆驼Ig、Ig NAR、F(ab)'
3片段、双-scFv、(scFv)
2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。所述术语还包括经遗传工程改造的形式，例如嵌合抗体(例如人类化鼠抗体)、杂结合抗体(例如双特异性抗体)和其抗原结合片段。更详细的描述也请参见：皮尔斯目录与手册(Pierce Catalog and Handbook),1994-1995(皮尔斯化学公司(PierceChemical Co.),罗克福德(Rockford),伊利诺伊州(IL))；Kuby,免疫学杂志,第3版,W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.),纽约,1997。
Fab片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段不同之处在于，重链CH1结构域的羧基末端增添了几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab′-SH是本文关于Fab′的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携有游离硫醇基。F(ab′)2抗体片段最初是作为其间具有铰链半胱氨酸的Fab′片段对产生。还已知抗体片段的其它化学偶合。
“Fv”是含有完全抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施例中，双链Fv种类由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域呈紧密非共价缔合的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域与一个轻链可变结构域可以通过柔性肽连接子共价连接，使得轻链和重链可以按类似于双链Fv种类的“二聚”结构缔合。在这一配置中，每个可变结构域的三个高变区(HVR)相互作用以定义VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。六个HVR共同地赋予对抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或包含仅三个对抗原具有特异性的HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，但亲和力低于完整结合位点。
当谈及抗原和抗体时使用的术语“特异性结合”或“结合”意指抗体与生理条件下相对稳定的抗原形成复合物。用于确定抗体是否与抗原特异性结合的方法是本领域熟知的。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用结合解离平衡常数(K
D)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括现有技术已知以及本文中所描述的那些。
如本文所用，术语“变体”是指已经修饰至少一个，例如1、2或3个氨基酸取代、缺失或添加的重链可变区或轻链可变区，其中包含重链或轻链变体的经修饰的抗原结合蛋白基 本上保留修饰前抗原结合蛋白的生物学特征。在一个实施方案中，含有变体重链可变区或轻链可变区序列的抗原结合蛋白保留修饰前抗原结合蛋白的60％、70％、80％、90％、100％生物学特征。应当理解，可以单独或在与另一个重链可变区或轻链可变区组合修饰每个重链可变区或轻链可变区。本公开的抗原结合蛋白包含与本文描述的重链可变区氨基酸序列90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同源的重链可变区氨基酸序列。本公开的抗原结合蛋白包括与本文描述的轻链可变区氨基酸序列90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同源的轻链可变区氨基酸序列。同源性百分比可以在整个重链可变区和/或整个轻链可变区上，或者百分比同源性可以限于构架区，而对应于CDR的序列与重链可变区和/或轻链可变区内本文中公开的CDR具有100％同一性。如本文所用，术语“CDR变体”是指已经修饰至少一个，例如1、2或3个氨基酸取代、缺失或添加的CDR，其中包含CDR变体的经修饰的抗原结合蛋白基本上保留修饰前抗原结合蛋白的生物学特征。在一个实施方案中，含有变体CDR的抗原结合蛋白保留修饰前抗原结合蛋白的60％、70％、80％、90％、100％生物学特征。应当理解，可以修饰的每个CDR可以单独或与另一个CDR组合修饰。在一个实施方案中，修饰是取代，特别是保守取代。
如本领域已知，在本文中可交换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或者能够通过DNA或RNA聚合酶掺入链的任何底物。
如下进行序列之间序列同一性的计算。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。
还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。
额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。
在本发明中术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已经引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化子”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞以及由此来源的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上与亲代细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本文包括与在初始转化的细胞中筛选或选择的细胞具有相同功能或生物学活性的突变子代。
在本文中，“受试者”、“个体”或“对象”指需要缓解、预防和/或治疗疾病或病症如病毒感染的动物，优选哺乳动物，更优选是人。哺乳动物还包括但不限于农场动物、竞赛动物、宠物、灵长类、马、犬、猫、小鼠和大鼠。该术语包括具有冠状病毒感染或处于具有冠状病毒感染风险的人受试者。在本发明中，向有此需要的受试者施用本发明所述的抗体或本发明所述的药物组合物或制品是指给予有效量的所述抗体或药物组合物或制品等。
如本发明所用，术语“有效量”表示引发例如研究者或临床医师所追求的组织、系统、动物或人的生物学或药学响应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”表示，与没有接受该量的相应受试者相比，引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量，或者使疾病或病况的进展速率降低的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。
II.本发明抗体所针对的冠状病毒
冠状病毒(包括SARS-CoV和2019-nCoV)是被包膜的病毒，具有主要由病毒结构蛋白(例如刺突蛋白(Spike，S)，膜蛋白(Membrane，M)，包膜蛋白(Envelope，E)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N))形成的病毒结构，其中S蛋白、M蛋白和E蛋白均嵌入在病毒包膜中，N蛋白与病毒RNA相互作用，位于病毒颗粒的核心，形成核衣壳(Fehr,A.R.等人，Coronaviruses:An overview of their replication and pathogenesis.Methods Mol.Biol.2015,1282,1–23)。
S蛋白是一种高度糖基化的蛋白，可在病毒颗粒表面形成同源三聚体的刺突，通过与宿主细胞受体结合介导病毒的入侵并决定病毒的宿主特异性。经序列比对，发现2019-nCoV病毒和SARS-CoV病毒的S蛋白具有75％的相似度。SARS-CoV和2019-nCoV均通过S蛋白中的受体结合结构域(receptor binding domain，RBD)与宿主细胞表面表达的ACE2受体结合来感染宿主。预期针对SARS-CoV和2019-nCoV的S蛋白并且阻断S蛋白与ACE2受体结合的高亲和力中和抗体能够有效预防和治疗所述冠状病毒感染。
III.本发明的针对冠状病毒S蛋白的抗体
术语“针对冠状病毒S蛋白的抗体”、“抗冠状病毒S蛋白的抗体”、“抗S蛋白抗体”、“冠状病毒S蛋白抗体”、“S蛋白抗体”或“结合S蛋白的抗体”在本文中可互换地使用，是指这样的本发明的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合冠状病毒S蛋 白(例如，2019-n CoV S蛋白、SARS-CoV S蛋白)，由此所述抗体可以用作靶向冠状病毒S蛋白的诊断剂、预防剂和/或治疗剂。
本发明的抗体和抗原结合片段以高亲和力特异性结合冠状病毒S蛋白。在一些实施方案中，本发明的抗体是阻断抗体或中和抗体，其中抗体可以结合冠状病毒S蛋白，并阻断冠状病毒S蛋白与ACE2的结合。在一些实施方案中，该阻断抗体或中和抗体可以用于预防冠状病毒感染和/或治疗冠状病毒感染的个体。
在一些实施方案中，本发明的冠状病毒S蛋白抗体特异性结合冠状病毒S蛋白，其包含
(a)SEQ ID NO:2所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；
(b)SEQ ID NO:6所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:8所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；
(c)SEQ ID NO:10所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:12所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；
(d)SEQ ID NO:14所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:16所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；
(e)SEQ ID NO:18所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:20所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；
(f)SEQ ID NO:22所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:24所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；或
(g)SEQ ID NO:26所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:28所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体。
在一些实施方案中，本发明的冠状病毒S蛋白抗体结合哺乳动物冠状病毒S蛋白，例如人冠状病毒S蛋白、猴冠状病毒S蛋白。例如，本发明的冠状病毒S蛋白抗体与冠状病毒S蛋白上的表位(例如，线性或构象表位)特异性结合。
在一些实施方案中，本发明的冠状病毒S蛋白抗体具有以下一个或多个特性：
(a)如在25℃结合ELISA测定法中测量，以小于约1nM，优选地小于约0.1nM，更优选地小于约0.05nM的EC50结合冠状病毒S蛋白；
(b)如在25℃阻断ELISA测定法中测量，以小于约10nM，优选地小于约5nM，更优选地小于约2nM的IC50阻断冠状病毒S蛋白与分离的ACE2蛋白的结合；
(c)如在假型冠状病毒中和测定法中测量，以小于约10nM，优选地小于约1nM，更优选地小于约0.1nM的IC50中和假型冠状病毒；
(d)如在真冠状病毒中和测定法中测量，以小于约10nM，优选地小于约1nM，更优选地小于约0.1nM的EC50中和真冠状病毒，由此，真冠状病毒不能导致细胞病变效应。
在一些实施方案中，本发明的冠状病毒S蛋白抗体包含
(a)SEQ ID NO:29所示的HCDR1或SEQ ID NO:29所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:30所示的HCDR2或SEQ ID NO:30所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:31所示的HCDR3或SEQ ID NO:31所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:32所示的LCDR1或SEQ ID NO:32所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:33所示的LCDR2或SEQ ID NO:33所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:34所示的LCDR3或SEQ ID NO:34所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；
(b)SEQ ID NO:35所示的HCDR1或SEQ ID NO:35所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:36所示的HCDR2或SEQ ID NO:36所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:37所示的HCDR3或SEQ ID NO:37所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:38所示的LCDR1或SEQ ID NO:38所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:39所示的LCDR2或SEQ ID NO:39所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:40所示的LCDR3或SEQ ID NO:40所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；
(c)SEQ ID NO:41所示的HCDR1或SEQ ID NO:41所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:42所示的HCDR2或SEQ ID NO:42所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:43所示的HCDR3或SEQ ID NO:43所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:44所示的LCDR1或SEQ ID NO:44所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:45所示的LCDR2或SEQ ID NO:45所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:46所示的LCDR3或SEQ ID NO:46所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变 体；
(d)SEQ ID NO:47所示的HCDR1或SEQ ID NO:47所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:48所示的HCDR2或SEQ ID NO:48所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:49所示的HCDR3或SEQ ID NO:49所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:50所示的LCDR1或SEQ ID NO:50所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:51所示的LCDR2或SEQ ID NO:51所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:52所示的LCDR3或SEQ ID NO:52所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；
(e)SEQ ID NO:53所示的HCDR1或SEQ ID NO:53所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:54所示的HCDR2或SEQ ID NO:54所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:55所示的HCDR3或SEQ ID NO:55所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:56所示的LCDR1或SEQ ID NO:56所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:57所示的LCDR2或SEQ ID NO:57所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:58所示的LCDR3或SEQ ID NO:58所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；
(f)SEQ ID NO:59所示的HCDR1或SEQ ID NO:59所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:60所示的HCDR2或SEQ ID NO:60所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:61所示的HCDR3或SEQ ID NO:61所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:62所示的LCDR1或SEQ ID NO:62所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:63所示的LCDR2或SEQ ID NO:63所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:64所示的LCDR3或SEQ ID NO:64所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；或
(g)SEQ ID NO:65所示的HCDR1或SEQ ID NO:65所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:66所示的HCDR2或SEQ ID NO:66所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:67所示的HCDR3或SEQ ID NO:67所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:68所示的LCDR1或SEQ ID NO:68所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:69所示的LCDR2或SEQ ID NO:69所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:70所示的LCDR3或SEQ ID NO:70所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变 体。
在一些实施方案中，在CDR中的所述氨基酸残基替换是保守氨基酸残基替换。
在一些实施方案中，本发明的冠状病毒S蛋白抗体或抗原结合片段包含
(a)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
(b)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
(c)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
(d)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
(e)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
(f)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；或
(g)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，在与特定序列编号的重链可变区和轻链可变区具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列中，其与特定序列编号的重链可变区和轻链可变区相比较而言的氨基酸变化不是发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明涉及上文描述的冠状病毒S蛋白抗体或抗原结合片段，所述抗体包含人类或灵长类动物来源的轻链恒定区和/或重链恒定区。
在一些实施方案中，本发明的冠状病毒S蛋白抗体是IgG类抗体，特别地是是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体；优选地，其是IgG1或IgG4抗体；更优选地，其是人IgG1或人IgG4抗体。
在本发明的一些实施方案中，本文所述的氨基酸变化包括氨基酸的取代、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸变化为氨基酸取代，优选地保守取代。保守取代是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸取代，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸取代，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸取代。示例性的取代如下表B所示：
表B.示例的氨基酸取代
| 原始残基 | 示例性取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg(R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln；His；Asp、Lys；Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu；Asn | Glu |
| Cys(C) | Ser；Ala | Ser |
| Gln(Q) | Asn；Glu | Asn |
| Glu(E) | Asp；Gln | Asp |
| Gly(G) | Ala | Ala |
| His(H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu，Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 | Leu |
| Leu(L) | 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met(M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe(F) | Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Tyr |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Val；Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr；Phe | Tyr |
| 原始残基 | 示例性取代 | 优选的取代 |
| Tyr(Y) | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val(V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 | Leu |
在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸变化发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸变化发生在Fc区。在一些实施方案中，提供了包含含有一个或多个突变的Fc结构域的抗冠状病毒S蛋白抗体。在一个实施方案中，抗冠状病毒S蛋白抗体的Fc区是人恒定区的全部部分。Fc区直接参与补体激活、C1q结合、C3活化和Fc受体结合。Fc区中的结合位点引起与C1q结合。这类结合位点是现有技术已知的并且例如由Thommesen,J.E.等人,Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等人,J.Virol.75(2001)12161-12168描述。这类结合位点例如是L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引编号)。IgG1、IgG2和IgG3亚类抗体通常显示激活补体、结合C1q和激活C3，而IgG4不激活补体系统、不结合C1q且不激活C3。在一个实施方案中，Fc区是包含突变S228P和/或L235E和/或P329G的人IgG4亚类(根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施方案中，Fc区是包含突变L234A和L235A和任选地P329G(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG1亚类。
在一个实施方案中，本发明包括含有Fc结构域的抗冠状病毒S蛋白抗体，该Fc结构域包含IgG4铰链区中的S108P突变以促进二聚体稳定化。前述Fc结构域突变和本文公开的抗体可变结构域内的其他突变的任意可能的组合都包含在本发明的范围之内。
在某些实施方案中，本文中所提供的冠状病毒S蛋白抗体经改变以增加或降低其糖基化的程度。对冠状病毒S蛋白抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
当冠状病毒S蛋白抗体包含Fc区时，可以改变与Fc区连接的糖类。在一些应用中，除去不想要的糖基化位点的修饰可以是有用的，例如除去岩藻糖模块以提高抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等(2002)JBC277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以调节补体依赖性细胞毒性(CDC)。
IV.本发明的核酸以及包含其的宿主细胞
在一个方面，本发明提供了编码以上任何冠状病毒S蛋白抗体或其抗原结合片段或其任一条链的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或HEK293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。
在一个实施方案中，本发明提供了包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。
一旦已经制备了用于表达的表达载体或DNA序列，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，磷酸钙沉淀、原生质体融合、逆转录病毒的转导、病毒转染、电穿孔、基于脂质的转染、基因枪或其他常规技术。
用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法，根据使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞变动或优化。
另外，可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物，选出已经稳定将DNA掺入至其染色体中的细胞。标记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性(例如，抗生素)或重金属(如铜)抗性等。可选择标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。也可能需要额外元件以便最佳合成mRNA。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。
在一个实施方案中，提供了包含本发明多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含本发明表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体的其它细胞。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌。宿主细胞还可以是真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，例如昆虫细胞等。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK 293或293F细胞)、293细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(Hep G2)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、CHOS细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如Y0、NS0、P3X63和Sp2/0等。适于产生蛋白质的哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞或HEK 293细胞。
V.本发明的冠状病毒S蛋白抗体的生产和纯化
在一个实施方案中，本发明提供了制备冠状病毒S蛋白抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达编码所述冠状病毒S蛋白抗体的核酸的条件下培养包含编码所述冠状病毒S蛋白抗体的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，以及任选地分离所述冠状病毒S蛋白抗体。在某个实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收冠状病毒S蛋白抗体。
为了重组产生本发明的冠状病毒S蛋白抗体，首先分离编码本发明冠状病毒S蛋白抗体的核酸，并将所述核酸插入载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序，例如通过使用能够与编码本发明冠状病毒S蛋白抗体的核酸特异性结合的寡核苷酸探针进行。
如本文所述制备的本发明的冠状病毒S蛋白抗体可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的冠状病毒S蛋白抗体的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。
VI.本发明的冠状病毒S蛋白抗体的活性测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的冠状病毒S蛋白抗体鉴定、筛选或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
可以通过已知的方法例如ELISA等对本发明的冠状病毒S蛋白抗体测试其对冠状病毒S蛋白的结合活性。本文中公开了例示性方法。
本发明还提供了用于鉴定具有生物学活性的冠状病毒S蛋白抗体的测定法。生物学活性可以包括例如阻断冠状病毒S蛋白与细胞表面ACE2的结合。
VII.药物组合和药物制剂
在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种本文所述的任何冠状病毒S蛋白抗体的组合物，优选地组合物为药物组合物。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含至少两种本发明的抗体或抗原结合片段。例如，本发明的组合物包含两种本发明的抗体或抗原结合片段，以及可药用载体。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含摩尔比为1:(0.5～1)的两种本发明的抗体或抗原结合片段，以及可药用载体。例如，本发明的组合物包含摩尔比为1:0.5的两种本发明的抗体或抗原结合片段，以及可药用载体；本发明的组合物包含摩尔比为1:1的两种本发明的抗体或抗原结合片段，以及可药用载体。
在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料。
在一个实施方案中，组合物(例如，药物组合物)包含本发明的冠状病毒S蛋白抗体，以及一种或多种其它治疗剂(例如抗感染活性剂、小分子药物)的组合。所述抗感染活性剂、小分子药物是用来治疗、预防或缓解受试者中冠状病毒感染的任何抗感染活性剂、小分子药物，包括但不限于瑞德西韦、利巴韦林、奥司他韦、扎那米韦、羟氯喹、干扰素-α2b、镇痛药、阿奇霉素和皮质类固醇。在本发明的上下中，冠状病毒感染包括由冠状病毒(包括但不限于2019-n CoV、SARS-CoV)引起的感染。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物或药物制剂包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。
如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、 白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”,第五版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准药用载体和/或赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。
可以通过将具有所需纯度的本发明的冠状病毒S蛋白抗体与一种或多种任选的药用辅料(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备包含本文所述的冠状病毒S蛋白抗体的药物制剂，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。
本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它抗感染活性成分，例如其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明的冠状病毒S蛋白抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
VIII.组合产品或试剂盒
在一些实施方案中，本发明还提供了组合产品，其包含本发明的冠状病毒S蛋白抗体或其抗原结合片段，或者还包含一种或多种其它治疗剂(例如，抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等)。
在一些实施方案中，所述组合产品中的两种或多种成分可以依次、分开或同时联合施用给受试者。
在一些实施方案中，本发明还提供了包含本发明的冠状病毒S蛋白抗体、药物组合物或组合产品的试剂盒，以及任选的指导施用的包装插页。
在一些实施方案中，本发明还提供了包含本发明的冠状病毒S蛋白抗体、药物组合物、组合产品的药物制品，任选地，所述药物制品还包括指导施用的包装插页。
IX.本发明的冠状病毒S蛋白抗体的预防和/或治疗用途
本发明提供了用于预防受试者中冠状病毒相关疾病或病患的方法，其包括向受试者施用本发明的抗体、抗体组合。
具有冠状病毒相关疾病风险的受试者包括与感染者接触的受试者或以一些其他方式暴露于冠状病毒的受试者。预防剂的施用可以在表现出冠状病毒相关疾病的症状特征之前施用，以便阻止疾病，或可选择地延迟疾病的进展。
本发明还提供了治疗患者中冠状病毒相关疾病的方法。在一个实施方案中，该方法涉及将中和冠状病毒的本发明的抗体或抗体组合施用至所述疾病的患者。
在一些实施方案中，提供了治疗患者中冠状病毒感染的方法，所述方法包括施用选自由抗体分子P3-11、P5-22、P10-20、P14-37、P14-44、P15-16和P23-29组成的组的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，提供了治疗患者中冠状病毒感染的方法，所述方法包括施用由抗体分子P5-22和P14-44组成的组的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，提供了治疗患者中冠状病毒感染的方法，所述方法包括施用抗体分子P5-22和P14-44组成的且摩尔比为1:1的组的抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以交叉中和人和动物传染性冠状病毒分离株。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段在冠状病毒感染后的最初24小时内施用。
X.用于诊断和检测冠状病毒的方法和组合物
在一些实施方案中，本文中提供的任何冠状病毒S蛋白抗体可以用于检测冠状病毒在生物样品中的存在。
术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法。
在一个实施方案中，提供了用于诊断或检测方法中的冠状病毒S蛋白抗体。在另一个方面中，提供检测冠状病毒在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括检测冠状病毒S蛋白在生物样品中的存在。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的冠状病毒S蛋白抗体在允许冠状病毒S蛋白抗体与冠状病毒S蛋白结合的条件下接触，并检测在冠状病毒S蛋白抗体和冠状病毒S蛋白之间是否形成复合物。复合物的形成表示存在冠状病毒。该方法可以是体外或体内方法。
用于冠状病毒的示例性诊断测定包括例如使用本发明的抗冠状病毒S蛋白接触从患者获得的样品，其中使用可检测的标记或报告分子标记抗冠状病毒S蛋白或用作捕获配体以选择性地从患者样品分离冠状病毒。备选地，未标记的抗冠状病毒S蛋白可与本身被可检测地标记的第二抗体组合在诊断应用中使用。可检测的标记或报告分子可以是放射性同位素、如
3H、
14C、
32P、
35S或
125I；荧光或化学发光的部分如荧光素异硫氰酸酯或罗丹明，或酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。可用于检测或测量样品中冠状病毒的具体的示例性测定包括酶连接的免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。
可在根据本发明的冠状病毒诊断测定中使用的样品包括从患者可获得的任何生物样品，其包含在正常或生理条件下可检测量的冠状病毒刺突蛋白或其片段。在一些实施方案 中，生物样品是血液、血清、咽拭子、下呼吸道样本(如气管分泌物、气管吸取物、肺泡灌洗液)或生物来源的其他样品。一般而言，将测量从健康患者获得的特定样品中的冠状病毒刺突蛋白水平(例如未受与冠状病毒相关的疾病所扰的患者)以初始性地建立基线或标准冠状病毒水平。该冠状病毒基线水平可随后与从疑似具有冠状病毒相关病况或与该病况相关的症状的个体获得的样品中测量的冠状病毒水平进行比较。
特异性针对冠状病毒刺突蛋白的抗体可不包含其他标记物，或其可包含N-末端或C末端的标记物。在一个实施方案中，标记物是生物素。在结合测定中，标记物(如果存在的话)的位置可确定肽相对于所结合的表面的方向。例如，如果表面以抗生物素蛋白包被，包含N末端生物素的肽将被定向，使得肽的C末端部分远离表面。
XI.本发明的示例性抗冠状病毒S蛋白的抗体的序列
表1.抗体的VH和VL序列(带下划线的序列为CDR序列)
表2.抗体的重链可变区CDR序列
表3.抗体的轻链可变区CDR序列
描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成对本发明的保护范围的限制。
通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明的范围。这些实施例并不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。
实施例1、单个B细胞的分选
从新型冠状病毒感染康复患者获取10mL全血，置于肝素收集管中。使用淋巴细胞分离液密度梯度离心进行分离，然后使用B细胞分离试剂盒(EasySep
TM Human B Cell Enrichment Kit，STEMCELL公司，目录号19054)进行B细胞分离。使用Alexa Fluor
TM 488试剂盒(Invitrogen公司，目录号A20181)、Alexa Fluor
TM 647试剂盒(Invitrogen公司，目录号A20186)、SARS-CoV-2S1蛋白(Acro公司，目录号S1N-C52H3)和SARS-CoV-2S蛋白三聚体(Acro公司，目录号SPN-C52H8)，根据制造商的说明书，利用带荧光素的S蛋白结合分离后的B细胞，在BD FACSAria II上进行单个B细胞的分选。将分选 到的单个B细胞以一个孔一个细胞的方式置于含有HEPES裂解缓冲液(10％NP-40，无RNase)的96孔板中。
实施例2、人单个B细胞的克隆
将实施例1获得的96孔细胞培养板从－80℃移至室温，进行RT-PCR。使用的试剂和反应体积如下，合成抗体重链、轻链cDNA。
取上述的抗体重链、轻链cDNA作为模板，以位于5’端Leader及FR1区的引物为上游引物，以位于抗体恒定区及FR4区的引物为下游引物，利用巢式PCR扩增出抗体重链可变区基因、轻链可变区基因。
PCR完成后进行琼脂糖凝胶电泳，将400bp左右，且轻重链可以配对的PCR产物直接送测序。将测序结果利用MEGA7软件进行分析比对，合适的抗体可变区序列用于后续抗体质粒的构建。
实施例3、抗体表达质粒的构建及表达
通过PCR扩增抗体重链、轻链可变区基因片段。分别将重链可变区基因片段、轻链可变区基因片段通过南京诺维赞公司的同源重组酶(
目录号：C112-01)连接到pcDNA3.1载体中，其中恒定区选择IgG1亚类，获得轻链质粒和重链质粒。
然后将同一抗体的轻链质粒与重链质粒按1:1的摩尔比混合，经聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences，目录号：23966)转染HEK293细胞，培养5-7天后，细胞活力低于60％时，收集细胞培养上清并用Protein A亲和柱纯化出单克隆抗体。
实施例4、抗体与新型冠状病毒(nCov)S蛋白的结合实验
将nCoV S(ACRO，SPN-C52H4)以1ug/ml的浓度每孔100ul各包被1块96孔微量培养板，4℃静置过夜；
洗板机洗板(300ul*3)后均加入300ul PBST+5％BSA封闭，室温静置1h；
洗板机洗板(300ul*3)后加入实施例3制备的抗体，即，每孔加100ul抗体样品，将抗体从10nM开始3倍梯度稀释(12个浓度，横向稀释)，置于水平摇床室温300rpm反应1.5h；
洗板机洗板(300ul*3)后均加入100ul 1:5000稀释的HRP缀合的山羊抗人IgG Fc第二抗体，置于水平摇床室温300rpm反应35min；
洗板机洗板2次后加100ul TMB显色(提前30min将TMB液体放至室温避光备用)，室温避光显色2min后加100ul终止液终止反应，酶标仪读板OD450。结果如图1－图4所示。
由图1－图4可见，候选抗体分子P3-11以0.02257nM的EC50、P5-22以0.02259nM的EC50、P10-20以0.01841nM的EC50、P14-37以0.01607nM的EC50、P14-44以0.02128nM的EC50、P15-16以0.02282nM的EC50、P23-29以0.03641nM的EC50特异性结合SARS-Cov-2S蛋白，所述抗体分子均与SARS-Cov-2S蛋白有强的特异性结合能力。
实施例5、抗体阻断新型冠状病毒(nCov)S蛋白与ACE2结合的实验
取ACE2-Fc(ACRO，AC2-H5257)以1ug/ml的浓度包被1块96孔微量培养板，4℃静置过夜；
洗板机洗板(300ul*3)后加入300ul PBST+5％BSA封闭板，室温静置1h；
洗板机洗板(300ul*3)后备用；
另外地向1块新的96孔板中的每孔加入10ul 2200ng/ml的Biotin-ncov RBD(KACTUS，COV-VM4BDB)，再每孔加入100ul抗体样品，将抗体从900nM开始3倍梯度稀释(12个浓度，横向稀释)，所述Biotin-抗原的终浓度均为200ng/ml；置于水平摇床室温300rpm反应15min；将这块板中的反应液移至BSA封闭和洗板后的板中，置于水平摇床室温300rpm反应1.5h；
洗板机洗板(300ul*3)后加入100ul 1:2000稀释的eBioscience Avidin HRP第二抗体(Invitrogen，目录号：18-4100-51)，置于水平摇床室温300rpm反应35min；
洗板机洗板2次后加100ul TMB显色(提前30min将TMB液体放至室温避光备用)，室温避光显色5min后加100ul终止液终止反应，酶标仪读板OD450。结果如图5－图8所示。
由图5－图8可见，候选抗体分子P3-11以1.097nM的IC50、P5-22以1.084nM的IC50、P10-20以0.9568nM的IC50、P14-37以1.135nM的IC50、P14-44以0.8625nM的IC50、P15-16以1.387nM的IC50、P23-29以1.196nM的IC50阻断SARS-Cov-2S蛋白与其受体ACE2的结合，所述抗体分子均对SARS-Cov-2S蛋白与其受体ACE2的结合有很强的阻断作用。
实施例6、假型SARS-CoV-2病毒的中和实验
制备了实施例4和实施例5中的各候选抗体分子，以及作为对照的同种型人IgG1抗体。购买了表达SARS-CoV-2S蛋白的假病毒(Genscript，目录号C628AFE090，1.5X 10
8IFU/mL)。配制了DMEM细胞培养基，其包含89％DMEM高糖培养基、10％FBS和1％GLUTAMAX。
实验中使用的试剂信息如下表所示。
实验中使用的材料信息如下表所示。
SARS-CoV-2假病毒的中和实验方法如下。
溶液配制：取冻存的Bio-Glo Luciferase Assay System，于4℃避光融化，在生物安全柜中避光将Bio-Glo Luciferase Assay System里的溶液与粉末混合，10mL每管分装于11mL离心管中避光保存于-40℃冰箱。
准备细胞：取培养好的HEK293/ACE2细胞(Genescript R10232004)消化，以密度为6.67×10
4个细胞/mL重悬于DMEM细胞培养基中，在白底96孔板中每孔加入150uL细胞悬液，每孔细胞为1×10
4个，加上盖子在二氧化碳培养箱培养8-10h。
稀释抗体：用DMEM细胞培养基稀释抗体，从120nM按3:1梯度稀释(或者，从40nM按3:1梯度稀释)，稀释后体积为50uL。
与假病毒培养：37℃水浴融化Pseudovirus(S envelop)假病毒；向稀释好的抗体中每孔加入10uL假病毒，冰上孵育1h；将经孵育的抗体与假病毒的混合体系依次各50uL加至白底96孔板中培养的细胞，使得抗体终浓度为30nM开始按3:1梯度稀释(或者，从10nM按3:1梯度稀释)；将白底96孔板放回二氧化碳培养箱中继续培养48h。
检测：48h后，取出一支分装冻存的Bio-Glo Luciferase Assay System，于4℃避光融化。从培养箱中取出培养48h的白底96孔板，小心吸去100uL培养基，加入Bio-Glo Luciferase Reagent溶液100ul/孔，迅速使用酶标仪检测。结果如图9所示。
由图9可见，候选抗体分子P3-11以0.08292nM的IC50、P5-22以0.008285nM的IC50、P10-20以0.05256nM的IC50、P14-37以0.06416nM的IC50、P14-44以0.2680nM的IC50、P15-16以0.02257nM的IC50、P23-29以0.08994nM的IC50阻断假病毒与HEK293/ACE2细胞的结合，初步表明所述抗体分子在细胞水平上对假病毒S蛋白与细胞表面受体ACE2的结合有很强的阻断作用。
实施例7、SARS-CoV-2真病毒中和实验
实验病毒株：SARS-CoV-2真病毒为自江苏省新型冠状病毒感染的肺炎临床病例分离的毒株
细胞系：VERO-E6细胞属于绿猴肾细胞系，天然表达ACE2。绿猴ACE2与人ACE2非常保守，序列同源性达到95％。本实施例选择用VERO-E6细胞系代替表达人ACE2的细胞系进行实验。
实验方法：
用SARS-CoV-2真病毒感染VERO-E6细胞。感染5天后，用Karber法计算50％组织培养物(在本实施例中为细胞)感染剂量(TCID
50)。
采用微量病毒抑制实验方法进行中和抗体活性验证。使用固定量病毒(100TCID
50)与不同稀释度的等体积抗体混合后，感染长成单层的VERO-E6细胞，每个抗体稀释度做复孔检测。实验同时设正常细胞对照。
接种后逐日观察细胞有无CPE(cytopathic effect)(病毒致细胞病变效应)，连续观察3-5天。CPE结果见图10。
由图10可见，在足量的本发明抗体的存在下，细胞100％免受病毒所致的CPE。在无抗体存在下，仅加入病毒的对照组呈现100％CPE。
使用实施例4和实施例5中的各候选抗体分子，第四天对SARS-CoV-2真病毒的中和结果如图11所示。
由图11可见，候选抗体分子P3-11以0.1950μg/mL的EC50、P5-22以0.006571μg/mL的EC50、P10-20以约0.07519μg/mL的EC50、P14-37以0.1861μg/mL的EC50、P14-44以0.7081μg/mL的EC50、P15-16以0.09766μg/mL的EC50、P23-29以0.04883μg/mL的EC50中和SARS-CoV-2真病毒对VERO-E6细胞的感染，表明了所述抗体分子在细胞水平上对SARS-CoV-2真病毒S蛋白与细胞表面受体ACE2的结合有很强的阻断作用。
同样地，将候选抗体分子P5-22和候选抗体分子P14-44(1:1摩尔比)组合后，进行了真病毒的中和实验，结果表明该组合以0.009883μg/mL的EC50中和SARS-CoV-2真病毒对VERO-E6细胞的感染(图11)，表明了本发明的抗体组合也能够很强地在细胞水平上阻断SARS-CoV-2真病毒S蛋白与细胞表面受体ACE2的结合。抗体组合提供了防止病毒突变可能对一种抗体阻断的逃逸。
以上描述了本发明的示例性实施方案，本领域技术人员应当理解的是，这些公开内容仅是示例性的，在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此，本发明不限于文中列举的具体实施方案。
Claims (14)
- 分离的抗冠状病毒S蛋白的抗体或抗原结合片段，其包含(a)SEQ ID NO:2所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；(b)SEQ ID NO:6所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:8所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；(c)SEQ ID NO:10所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:12所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；(d)SEQ ID NO:14所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:16所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；(e)SEQ ID NO:18所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:20所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；(f)SEQ ID NO:22所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:24所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体；或(g)SEQ ID NO:26所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:28所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与所述6个CDR中的任一CDR具有不超过3个氨基酸残基替换的CDR变体。
- 根据权利要求1所述的分离的抗体或抗原结合片段，其包含(a)SEQ ID NO:29所示的HCDR1或SEQ ID NO:29所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:30所示的HCDR2或SEQ ID NO:30所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:31所示的HCDR3或SEQ ID NO:31所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:32所示的LCDR1或SEQ ID NO:32所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:33所示的LCDR2或SEQ ID NO:33所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:34所示的LCDR3或SEQ ID NO:34所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；(b)SEQ ID NO:35所示的HCDR1或SEQ ID NO:35所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:36所示的HCDR2或SEQ ID NO:36所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:37所示的HCDR3或SEQ ID NO:37所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:38所示的LCDR1或SEQ ID NO:38所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:39所示的LCDR2或SEQ ID NO:39所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:40所示的LCDR3或SEQ ID NO:40所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；(c)SEQ ID NO:41所示的HCDR1或SEQ ID NO:41所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:42所示的HCDR2或SEQ ID NO:42所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:43所示的HCDR3或SEQ ID NO:43所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:44所示的LCDR1或SEQ ID NO:44所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:45所示的LCDR2或SEQ ID NO:45所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:46所示的LCDR3或SEQ ID NO:46所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；(d)SEQ ID NO:47所示的HCDR1或SEQ ID NO:47所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:48所示的HCDR2或SEQ ID NO:48所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:49所示的HCDR3或SEQ ID NO:49所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:50所示的LCDR1或SEQ ID NO:50所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:51所示的LCDR2或SEQ ID NO:51所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:52所示的LCDR3或SEQ ID NO:52所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；(e)SEQ ID NO:53所示的HCDR1或SEQ ID NO:53所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:54所示的HCDR2或SEQ ID NO:54所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:55所示的HCDR3或SEQ ID NO:55所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:56所示的LCDR1或SEQ ID NO:56所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:57所示的LCDR2或SEQ ID NO:57所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:58所示的LCDR3或SEQ ID NO:58所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；(f)SEQ ID NO:59所示的HCDR1或SEQ ID NO:59所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:60所示的HCDR2或SEQ ID NO:60所示的HCDR2的不 超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:61所示的HCDR3或SEQ ID NO:61所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:62所示的LCDR1或SEQ ID NO:62所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:63所示的LCDR2或SEQ ID NO:63所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:64所示的LCDR3或SEQ ID NO:64所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；或(g)SEQ ID NO:65所示的HCDR1或SEQ ID NO:65所示的HCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:66所示的HCDR2或SEQ ID NO:66所示的HCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:67所示的HCDR3或SEQ ID NO:67所示的HCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；以及SEQ ID NO:68所示的LCDR1或SEQ ID NO:68所示的LCDR1的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:69所示的LCDR2或SEQ ID NO:69所示的LCDR2的不超过3个氨基酸残基替换的变体、SEQ ID NO:70所示的LCDR3或SEQ ID NO:70所示的LCDR3的不超过3个氨基酸残基替换的变体；优选地，所述分离的抗体或抗原结合片段包含(a)SEQ ID NO:29所示的HCDR1、SEQ ID NO:30所示的HCDR2、SEQ ID NO:31所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:32所示的LCDR1、SEQ ID NO:33所示的LCDR2、SEQ ID NO:34所示的LCDR3；(b)SEQ ID NO:35所示的HCDR1、SEQ ID NO:36所示的HCDR2、SEQ ID NO:37所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:38所示的LCDR1、SEQ ID NO:39所示的LCDR2、SEQ ID NO:40所示的LCDR3；(c)SEQ ID NO:41所示的HCDR1、SEQ ID NO:42所示的HCDR2、SEQ ID NO:43所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:44所示的LCDR1、SEQ ID NO:45所示的LCDR2、SEQ ID NO:46所示的LCDR3；(d)SEQ ID NO:47所示的HCDR1、SEQ ID NO:48所示的HCDR2、SEQ ID NO:49所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:50所示的LCDR1、SEQ ID NO:51所示的LCDR2、SEQ ID NO:52所示的LCDR3；(e)SEQ ID NO:53所示的HCDR1、SEQ ID NO:54所示的HCDR2、SEQ ID NO:55所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:56所示的LCDR1、SEQ ID NO:57所示的LCDR2、SEQ ID NO:58所示的LCDR3；(f)SEQ ID NO:59所示的HCDR1、SEQ ID NO:60所示的HCDR2、SEQ ID NO:61所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:62所示的LCDR1、SEQ ID NO:63所示的LCDR2、SEQ ID NO:64所示的LCDR3；或(g)SEQ ID NO:65所示的HCDR1、SEQ ID NO:66所示的HCDR2、SEQ ID NO:67所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:68所示的LCDR1、SEQ ID NO:69所示的LCDR2、SEQ ID NO:70所示的LCDR3。
- 根据权利要求1或2所述的分离的抗体或抗原结合片段，其包含(a)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；(b)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；(c)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；(d)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；(e)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；(f)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；或(g)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序 列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；优选地，所述分离的抗体或抗原结合片段为完全人抗体或抗原结合片段。
- 根据权利要求1至3中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体；优选地，其是IgG1或IgG4抗体；更优选地，其是人IgG1或人IgG4抗体。
- 根据权利要求1至4中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、单链Fab、双体抗体(diabody)。
- 根据权利要求1至5中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒。
- 分离的核酸，其编码权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
- 包含权利要求7的核酸的载体，优选地所述载体是表达载体。
- 包含权利要求7的核酸或权利要求8的载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的选自大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或抗原结合片段的其它细胞，最优选地，所述宿主细胞是HEK293细胞。
- 制备权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达编码权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段的核酸的条件下培养权利要求9的宿主细胞，任选地从所述宿主细胞或从培养基回收权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
- 药物组合物，其包含权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，以及可药用载体；优选地，包含权利要求1至6中任一项所述的至少两种抗体或抗原结合片段，以及可药用载体；更优选地，包含权利要求1至6中任一项所述的摩尔比为1:(0.5～1)的两种抗体或抗原结合片段，以及可药用载体；更优选地，包含权利要求1至6中任一项所述的摩尔比为1:1的抗体或抗原结合片段(a)和抗体或抗原结合片段(b)，以及可药用 载体。
- 根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段或权11所述的药物组合物的用途，用于制备预防和/或治疗冠状病毒感染的药物，例如，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒。
- 在受试者中预防和/或治疗冠状病毒感染的方法，包括向受试者施用有效量的权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段、或权利要求11的药物组合物，例如，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒。
- 检测样品中冠状病毒S蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，用于实施以下步骤：(a)将样品与权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触；和(b)检测权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段与冠状病毒S蛋白之间的复合物的形成，例如，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒。
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