CN112255420B - 利用bli技术检测新型冠状病毒中和性抗体的方法 - Google Patents

利用bli技术检测新型冠状病毒中和性抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用BLI技术检测新型冠状病毒中和性抗体的方法，先将同一浓度的人ACE2蛋白捕获到生物传感器表面上，再将新型冠状病毒棘突蛋白RBD分别与不同浓度的待测中和性抗体预混，再将各混合液分别与捕获到生物传感器表面上的人ACE2蛋白接触，根据基于BLI技术的分子互作仪器检测到的干涉光谱的相对位移强度变化计算抑制率，绘制抑制曲线，计算IC50。本发明操作简单，快速高效，检测全过程无需包被和反复加样、洗板，15min内即可得到实验结果。检测反应在黑色孔板中进行，可实现大批量样品的新冠中和抗体的检测，与传统定性检测不同，通过计算IC50值，可以快速比较不同新冠中和性抗体的抑制能力。

Description

利用BLI技术检测新型冠状病毒中和性抗体的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种利用BLI技术检测新型冠状病毒中和性抗体的方法。
背景技术
2019年新发现的新型冠状病毒，即SARS-CoV-2 (2019-nCoV)，与2002年报道的SARS冠状病毒和2012年报道的MERS冠状病毒同属于冠状病毒科β属，是目前已知的第七种能感染人类的冠状病毒。新型冠状病毒由膜表面的四种糖蛋白（棘突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核蛋白）以及RNA核酸链组成，其中棘突蛋白（spike protein）是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有S1与S2两个亚基。S1主要包含有受体结合区（receptorbinding domain，RBD），负责识别细胞的受体。SARS-CoV-2的刺突蛋白与人血管紧张素转化酶2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）蛋白互作来感染人的呼吸道上皮细胞。棘突蛋白负责新冠病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，是新冠中和抗体的重要作用位点和疫苗设计的关键靶点。
新冠中和性抗体，可以阻断病毒刺突蛋白RBD/Human ACE2蛋白的结合，从而阻止病毒侵染人的呼吸道上皮细胞。
目前，常用的分子水平的筛选方法是酶联免疫吸附实验（ELISA），主要过程是将刺突蛋白RBD包被到96孔酶标板上，孵育过夜后洗去多余蛋白，加入待测抗体和Human ACE2蛋白，孵育后洗涤，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，孵育后洗涤，最后加入HRP的显色试剂，反应半小时后终止，在酶标仪上读数，测定OD450值，通过OD值和颜色深浅判断抗体是否为中和性抗体。但ELISA检测操作步骤多，时间长，需要经过多次洗板、加样、显色，无法实现高通量检测，且包被蛋白可能会遮盖一些结合位点，造成假阴性结果。因此，亟需开发筛选新型冠状病毒中和性抗体的新技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用BLI技术检测新型冠状病毒中和性抗体的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供一种利用BLI技术检测新型冠状病毒中和性抗体的方法，先将同一浓度的人ACE2蛋白捕获到生物传感器表面上，再将新型冠状病毒棘突蛋白RBD分别与不同浓度的待测中和性抗体预混，得到不同浓度的混合液，然后将各混合液分别与捕获到生物传感器表面上的人ACE2蛋白接触，根据基于BLI技术的分子互作仪器检测到的干涉光谱的相对位移强度变化来检测新型冠状病毒中和性抗体的抑制效率。通过计算抑制率，绘制抑制曲线，计算IC50值，可以快速比较不同新冠中和性抗体的抑制能力。
本发明中，所述检测包括定性和定量检测。
本发明中，所述生物传感器和基于BLI技术的分子互作仪器均可来自Fortebio公司，仪器型号包括但不限于Octet RED96系统，Octet RED384系统，Octet K2系统，OctetQke系统，Octet Qk384系统，Octet HTX系统等。
前述的方法，基于BLI技术的分子互作仪器的检测参数设置如下：
运行以下程序：①Baseline 60-180s，基线步骤；②Loading 180-300s，传感器捕获人ACE2蛋白；③Baseline2 60-180s，基线步骤；④Association 180-300s，传感器上的ACE2蛋白结合预混的新冠棘突蛋白RBD和新冠中和性抗体，检测此步骤最终的结合信号；⑤Dissociation 0-20s，解离步骤。其中，解离步骤为可选项。
转速：1000rpm；运行温度：30℃；采集频率：Standard kinetics（5.0 Hz，averaging by 20）。
前述的方法，混合液与捕获到生物传感器表面上的人ACE2蛋白接触的接触条件为：30℃接触3-5min。
前述的方法，所述生物传感器位于绿色的传感器盒子上，传感器末端浸在含运行buffer的黑色预湿板中，黑色预湿板置于蓝色的传感器盒子底座上。
优选地，人ACE2蛋白溶液的浓度为2-10μg/mL，按每孔200μL加入到分析样品阵列孔中。
优选地，将50-100nM待测中和性抗体溶液按1.5-2倍浓度梯度稀释，然后将不同浓度的待测中和性抗体溶液分别与50nM新型冠状病毒棘突蛋白RBD溶液按等体积混合，得到不同浓度的混合液，然后将各混合液按每孔200μL分别加入到分析样品阵列孔中。
本发明中，用于配制所述人ACE2蛋白溶液、所述待测中和性抗体溶液和所述新型冠状病毒棘突蛋白RBD溶液的试剂为：含0-0.02% Tween-20和0-0.1% BSA的PBS溶液，pH7.4；或者，含0-0.02% Tween-20和0-0.1% BSA的HEPES溶液，pH7.4；或者，含0-0.02%Tween-20和0-0.1% BSA的Tris溶液，pH7.4；或者购自Fortebio公司的10×KineticBuffer。
优选地，所述试剂为：含0.02% Tween-20和0.1% BSA的PBS溶液，pH7.4。
本发明方法所述的新型冠状病毒中和性抗体可选自抗体1、抗体2、抗体3，均为抗新型冠状病毒S1蛋白RBD段的中和性抗体，抗体2来自于新冠康复患者，测定其可变区序列并通过重组形成的，该抗体购自上海祥耀生物科技有限公司；抗体1和抗体3是通过新冠棘突蛋白S1免疫小鼠得到的。
Fortebio公司的Octet系统利用生物膜层干涉（Bio-Layer Interferometry，BLI）实时监测分子间相互作用。该技术通过生物传感器来实现，其原理为：光通过传感器的生物膜层后会发生透射与反射，反射光的频率受到生物膜层厚度的影响。一些频率的反射光会与入射光产生相长干涉现象，而另一些受到了相消干涉。这些干涉光波被光谱仪所检测到，并形成一幅干涉光谱，并以干涉光谱的相对位移强度（nm）显示。因此，结合到传感器表面的分子一旦有数量上的增减，光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位移，而这种位移直接反应出传感器表面生物膜的厚度。当结合在传感器生物膜上的分子A与溶液中的分子B结合，使生物膜层厚度增加，因而产生相对位移，这个相对位移随着分子B结合量的增加而增加，最后达到一个平衡状态，从而能实时记录分子间相互作用的过程，包括结合速度，解离速度，亲和力等测定。
本发明利用BLI技术筛选新型冠状病毒中和性抗体的主要过程是：先将人ACE2捕获到生物传感器，进而结合预混的新冠棘突蛋白RBD（单浓度）与新冠中和性抗体（多浓度），结合一段时间后，记录结合步骤结束时每个传感器对应的信号。随着中和抗体浓度升高，可与传感器上的人ACE2结合的新冠棘突蛋白RBD减少，对应结合信号降低，直至无结合信号（图1）。
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
（一）操作简单，快速高效：检测全过程无需包被和反复加样、洗板，只需加样后直接在仪器上检测，15min内即可得到实验结果。
（二）实时监测：整个实验过程都可实时监控，可以清楚地了解反应过程。
（三）高通量：检测反应在黑色96孔板或384孔板中进行，可实现大批量样品的新冠中和抗体的检测。
（四）常规方法只能定性检测抗体是否具有中和效应，本发明可以同时实现定性和定量检测，通过抑制曲线比较不同抗体的抑制能力。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中新冠棘突蛋白RBD与人ACE2结合曲线。
图2为本发明较佳实施例中新冠中和性抗体antibody1的中和实验结果。
图3为本发明较佳实施例中新冠中和性抗体antibody2的中和实验结果。
图4为本发明较佳实施例中新冠中和性抗体antibody3的中和实验结果。
图5为本发明较佳实施例中新冠中和性抗体抑制曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实验材料及试剂：
1、人ACE2蛋白可参见GenBank:NP_068576.1。
2、新冠棘突蛋白RBD可参见GenBank:QHD43416.1。
3、新冠中和性抗体，antibody1（抗体1）与antibody3（抗体3）是通过新冠棘突蛋白S1免疫小鼠得到的，antibody2（抗体2）是从新冠康复患者体内获取可变区序列并重组得到的。
4、黑色96孔板，购自Greiner，Cat. No. 655209。
5、样品稀释液Buffer：含0.02% Tween-20和0.1% BSA的PBS溶液，pH7.4。
6、生物传感器来自Fortebio公司
7、检测仪器来自Fortebio公司的Octet RED96系统。
实施例1 新冠棘突蛋白RBD和人ACE2结合实验
1、配制蛋白：将人ACE2蛋白稀释至10μg/mL，每孔200μL加入到黑色96孔板中，将新冠棘突蛋白RBD从100nM开始进行2倍浓度梯度稀释，每孔200μL加入到分析样品列。
2、设置程序进行检测：先将同一浓度的人ACE2捕获到传感器上，再结合不同浓度的新冠棘突蛋白RBD。
新冠棘突蛋白RBD与人ACE2结合曲线见图1。
实施例2 新冠中和性抗体阻断实验
本实施例提供一种耗时短，高通量，高灵敏的利用BLI技术筛选新型冠状病毒中和抗体的方法，该方法15min内即可实现新冠中和性抗体的筛选，且操作简单，无需多次洗板。该方法包括：
1、配制蛋白和抗体：将人ACE2蛋白稀释至10μg/mL，每孔200μL加入到Load列，将新冠棘突蛋白RBD稀释至50nM，将新冠中和性抗体从54nM开始进行1.5倍浓度梯度稀释，将稀释好的新冠棘突蛋白RBD与新冠中和性抗体按等体积混合，将混合后的新冠棘突蛋白RBD与新冠中和性抗体每孔200μL加入到分析样品列。
2、设置程序进行检测：先将同一浓度的人ACE2捕获到传感器上，再结合混合后的新冠棘突蛋白RBD（25nM）与新冠中和性抗体（27-0nM）。
仪器参数设置如下：
运行以下程序：①Baseline 60s，基线步骤；②Loading 180s，传感器捕获ACE2蛋白；③Baseline2 60s，基线步骤；④Association 180s，传感器上的ACE2蛋白结合预混的新冠棘突蛋白RBD和新冠中和性抗体，检测此步骤最终的结合信号；⑤Dissociation 20s，解离步骤。
转速：1000rpm；运行温度：30℃；采集频率：Standard kinetics（5.0 Hz，averaging by 20）。
新冠中和性抗体antibody1、antibody2和antibody3的中和实验结果分别见图2~图4。新冠中和性抗体抑制曲线见图5。
如图2-图4所示，随着抗体浓度的升高，结合信号逐渐降低，直至几乎没有信号，表现了不同抗体浓度下的抑制情况。图5的抑制曲线，根据IC50值的大小，antibody1（5.838）<antibody3（8.232）<antibody2（9.053），得出antibody1的抑制能力最强，antibody3次之，antibody2抑制能力最弱。
实施例3 新冠棘突蛋白RBD浓度的优化
以新冠中和性抗体antibody2为例，通过优化新冠棘突蛋白RBD的浓度（100nM，50nM，25nM，12.5nM），测定IC50值及检测范围，比较不同条件下检测灵敏度。结果见表1：
Figure 379873DEST_PATH_IMAGE001
从以上实验结果可以看出，随着新冠棘突蛋白RBD浓度的降低，检测范围变宽，IC50值越低，灵敏度越高，但新冠棘突蛋白RBD浓度不宜过低，否则检测信号也会随之降低，因此最终选择终浓度为25nM的新冠棘突蛋白RBD最佳。
实施例4 实验基质的影响
本发明方法可以检测血清中的新冠中和抗体，验证不同血清基质（Buffer，10%、20%、50%、100%人血清）中对IC50的干扰。以新冠中和抗体antibody2为例，计算不同基质中曲线的IC50值。不同基质测定结果见表2：
Figure 102978DEST_PATH_IMAGE002
从以上实验结果可以看出，随着血清浓度的增加，对IC50的影响很小。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.利用BLI技术检测新型冠状病毒中和性抗体的方法，其特征在于，先将同一浓度的人ACE2蛋白捕获到生物传感器表面上，再将新型冠状病毒棘突蛋白RBD分别与不同浓度的待测中和性抗体预混，得到不同浓度的混合液，然后将各混合液分别与捕获到生物传感器表面上的人ACE2蛋白接触，根据基于BLI技术的分子互作仪器检测到的干涉光谱的相对位移强度变化来检测新型冠状病毒中和性抗体的抑制效率；通过计算抑制率，绘制抑制曲线，计算IC50值，从而比较不同新型冠状病毒中和性抗体的抑制能力；
基于BLI技术的分子互作仪器的检测参数设置如下：
运行以下程序：①Baseline 60-180s，基线步骤；②Loading 180-300s，传感器捕获人ACE2蛋白；③Baseline2 60-180s，基线步骤；④Association 180-300s，传感器上的ACE2蛋白结合预混的新冠棘突蛋白RBD和新型冠状病毒中和性抗体，检测此步骤最终的结合信号；⑤Dissociation 0-20s，解离步骤；
转速：1000rpm；运行温度：30℃；采集频率：Standard kinetics 5.0 Hz，averaging by20；
人ACE2蛋白溶液的浓度为2-10μg/mL，按每孔200μL加入到分析样品阵列孔中；
将50-100nM待测中和性抗体溶液按1.5-2倍浓度梯度稀释，然后将不同浓度的待测中和性抗体溶液分别与50nM新型冠状病毒棘突蛋白RBD溶液按等体积混合，得到不同浓度的混合液，然后将各混合液按每孔200μL分别加入到分析样品阵列孔中；
用于配制所述人ACE2蛋白溶液的试剂为：含0.02% Tween-20和0.1% BSA的PBS溶液，pH7.4；
用于配制所述待测中和性抗体溶液和所述新型冠状病毒棘突蛋白RBD溶液的试剂为：含0.02% Tween-20和0.1% BSA的PBS溶液，pH7.4。
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