CN114113629B - His-tag标签蛋白浓度的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种His‑tag标签蛋白浓度的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：制备固化蛋白溶液；制备浓度标准曲线，并将待测样品制备成样品溶液；利用ProteinA传感器捕获固化蛋白溶液中的固化蛋白，之后利用固化有所述固化蛋白的ProteinA传感器捕获样品溶液内的His‑tag标签蛋白并进行检测，将检测结果代入所述浓度标准曲线中，得到待测样品中的His‑tag标签蛋白浓度。本发明的His‑tag标签蛋白浓度的检测方法，与传统方法免疫印迹法及酶联免疫吸附法相比，具有通量高、操作简便、检测快速、灵敏度高、结果准确的优势。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质检测技术领域，涉及含组氨酸标签(His-tag)蛋白的浓度定量测定。具体涉及基于生物膜干涉技术(Bio-layer interaction，BLI)的高通量测定His-tag标签蛋白浓度的方法。
背景技术
运用基因重组技术生产的蛋白质数量和种类越来越多，其中在重组蛋白质末端添加亲和“标签”的技术最常见。His标签是基因重组技术中经常用到的一种标签，其序列为六个组氨酸HHHHHH。His标签的特点是分子量小，基本不改变蛋白质的生物结构，不改变蛋白质的溶解性，更重要的是使蛋白质的纯化变得极为方便，根据组氨酸上的咪唑环可以与二价金属离子结合的原理，人们可以利用金属离子亲和层析技术纯化带有His标签的蛋白。
His标签蛋白作为一种生物制品，在研发、生产阶段均需要进行蛋白含量检测。特别是在研发早期，需要对蛋白表达情况进行大量筛选。目前，His-tag标签蛋白的传统检测方法是免疫印迹法(Western blotting)或酶联免疫吸附法(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)。
免疫印迹法是一种将高分辨电泳和免疫化学分析技术相结合的复杂技术。该方法主要是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质；以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该方法可以用于蛋白质表达的初步评估，但不能进行准确定量，并且对实验员要求高，操作步骤复杂，检测周期长及检测通量低，不满足研发早期大量检测的需求。
酶联免疫吸附法将已知的抗原或者抗体包被在96孔微孔板上，待检测的样品被其捕获后，洗涤未结合的样品；再加入酶标记的二抗与抗体或者抗原-样品复合物结合，洗涤后加入酶催化底物使之变色，颜色的深浅与待检样品的浓度呈线性关系。酶联免疫吸附实验虽然克服了免疫印迹定量不准确及检测通量低的问题，但是仍然存在对实验人员要求高，操作步骤繁琐，实验周期长，实验结果准确性及重复性差的缺陷。
生物膜干涉技术(Bio-layer interaction，BLI)是近年来出现的一种分子相互作用技术。原理是通过在光纤制成的生物传感器底端覆盖生物分子相容层，固定相互作用分子中的一种，形成新的具有反应特异性的生物膜层。当生物膜层与另一种分子结合时，生物层厚度增加，反射光干涉光谱曲线产生可测量的变化，通过检测这种位移变化来反映蛋白分子的浓度。该技术通量高、操作简便、检测快速、灵敏度高、结果准确。但是现有的生物膜干涉技术多用于检测分子间的相互作用，对定量测量蛋白浓度方面没有明确的应用。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术的缺陷以及实现上述目的，本发明提供了一种基于BLI技术测定His-tag标签蛋白浓度的方法。
一种His-tag标签蛋白浓度的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：制备固化蛋白溶液；制备浓度标准曲线，并将待测样品制备成样品溶液；利用ProteinA传感器捕获固化蛋白溶液中的固化蛋白，之后利用固化有所述固化蛋白的ProteinA传感器捕获样品溶液内的His-tag标签蛋白并进行检测，将检测结果代入所述浓度标准曲线中，得到待测样品中的His-tag标签蛋白浓度。
利用BLI技术检测His-tag标签蛋白，首先用ProteiA传感器捕获合适浓度的抗His-tag抗体(含Fc区域，可以与ProteinA结合)；然后再与不同浓度的His-tag标签蛋白结合；结合在生物传感器上的生物分子形成一层生物膜，此生物膜对透过传感器的可见光造成干涉现象，干涉现象以干涉光谱的位移的方式被检测到，通过蛋白的结合速率对蛋白进行浓度定量。
由于His-tag标签蛋白(多聚组氨酸标签蛋白)不带有Fc可结晶段(fragmentcrystallizable，Fc)，无法用ProteinA传感器直接捕获，所以采用固化蛋白的间接方法进行捕获和检测。通过这样的方法，不仅样品制备简单，待测样品只需进行简单离心或者稀释后，直接检测；且无需标记、无需显色反应，即可进行样品检测，避免标记试剂或者显色试剂对环境的污染；检测全过程没有包被抗体、反复加样、反复加试剂、反复洗板操作；设备参数设置完成即可上样检测，实验流程简便、易于实验人员操作；能够实现高通量、提高检测效率，实现大量样品批量检测；整个实验过程操作步骤简单，外界因素对实验结果影响较小，保证了实验结果的准确可靠及可重复性；同时选取ProteinA传感器能够实现传感器的再生的回收，实现传感器的重复利用。
根据本发明的一些优选实施方面，所述浓度标准曲线的制备包括如下步骤：用稀释液将固化蛋白稀释到浓度为5μg/mL～20μg/mL；利用ProteinA传感器捕获不同浓度的固化蛋白溶液中的固化蛋白，根据固化蛋白的固化高度(Bingding，单位nm；在一定的固化时间)选择合适的固化蛋白的浓度；在所述合适的固化蛋白的浓度下，将标准品进行系列稀释，并利用固化有固化蛋白的ProteinA传感器捕获标准品中的标签蛋白并进行检测，根据检测结果通过设备分析软件Data Analysis 11.1自动拟合建立浓度-结合速率的标准曲线。
根据本发明的一些优选实施方面，稀释后的所述标准品浓度范围为0.3906μg/mL～50μg/mL。
根据本发明的一些优选实施方面，所述合适的固化蛋白的浓度为10～15μg/mL。
根据本发明的一些优选实施方面，固化蛋白的固化高度为≥1.0nm。
根据本发明的一些优选实施方面，所述检测方法包括传感器的再生步骤：将检测了样品的传感器先经过甘氨酸浸洗再生5～10s，再用稀释液进行复性操作5～10s，再生和复性操作各进行多次。
根据本发明的一些优选实施方面，所述检测方法包括传感器的保存步骤：实验完全结束后，将ProteinA传感器在蔗糖溶液中浸泡至少30s，之后烘干并室温密封保存。
根据本发明的一些优选实施方面，所述固化蛋白为抗His-tag抗体固化蛋白，包括Anti-His Tag Rabbit pAb和/或Anti-6His Tag antibody。
根据本发明的一些优选实施方面，所述检测为利用生物分子相互作用分析系统进行检测。
根据本发明的一些优选实施方面，所述稀释液为含0～0.02％Tween20和0～0.1％BSA的PBS溶液，pH为7.4。
由于采用了以上的技术方案，相较于现有技术，本发明的有益之处在于：本发明的His-tag标签蛋白浓度的检测方法，基于生物膜干涉技术原理，不仅样品制备简单，待测样品只需进行简单离心或者稀释后，直接检测；且无需标记、无需显色反应，即可进行样品检测，避免标记试剂或者显色试剂对环境的污染；检测全过程没有包被抗体、反复加样、反复加试剂、反复洗板操作；设备参数设置完成即可上样检测，实验流程简便、易于实验人员操作；能够实现高通量、提高检测效率，实现大量样品批量检测；整个实验过程操作步骤简单，外界因素对实验结果影响较小，保证了实验结果的准确可靠及可重复性；同时选取ProteinA传感器能够实现传感器的再生的回收，实现传感器的重复利用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明优选实施例中固化蛋白浓度与固化高度的关系曲线图；
图2为本发明优选实施例1中的标准曲线的示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明利用BLI技术检测His-tag标签蛋白的浓度，首先用ProteiA传感器捕获合适浓度的抗His-tag抗体(含Fc区域，可以与ProteinA结合)；然后再与不同浓度的His-tag标签蛋白结合；结合在生物传感器上的生物分子形成一层生物膜，此生物膜对透过传感器的可见光造成干涉现象，干涉现象以干涉光谱的位移的方式被检测到，通过蛋白的结合速率对蛋白进行浓度定量。
以下实施例中采用的试剂耗材以及设备的信息如表1和表2所示：
表1主要试剂耗材信息：
实施例中用于稀释固化蛋白、标准品及待测样品的稀释液为含0～0.02％Tween20和0～0.1％BSA的PBS溶液，pH为7.4或者购买Pall公司的10×Kinetic Buffer。
表2主要仪器信息表
| 设备名称 | 型号 | 厂家 |
| 生物分子相互作用分析系统 | Fortebio Octet Red96e | PALL |
| 生物分子相互作用分析系统 | Fortebio Octet K2 | PALL |
| 微型涡旋混匀仪 | WH-2 | 上海沪西分析仪器有限公司 |
表格中的两套生物分子相互作用分析系统均可实现本发明中的实验；微型涡旋混匀仪在固化蛋白溶液、标准品溶液、样品溶液制备中的每一步都会用到。
实施例一
本实施例中的His-tag标签蛋白浓度检测方法具体包括如下步骤：
1.制备标准曲线
1.1固化蛋白的浓度选择
固化蛋白溶液的制备：分别将抗His-tag抗体固化蛋白Anti-His Tag Rabbit pAb及Anti-6His Tag antibody用稀释液稀释到浓度为5μg/mL～20μg/mL，并按每孔200μL加入到96孔微孔板中，同时将稀释液设置为空白对照。
固化蛋白的捕获和检测：首先将ProteinA传感器在稀释液中浸泡平衡10分钟，然后浸入到固化蛋白溶液中，将不同浓度的固化蛋白溶液捕获到传感器上，进行检测。检测结果如图1和下表所示。
| 固化蛋白浓度(μg/mL) | 固化高度(nm) |
| 20 | 2.1 |
| 10 | 1.3 |
根据实验经验设定固化蛋白的浓度选择固化高度≥1.0nm的即可，根据图1和上表的实验结果，选择固化蛋白为Anti-6His Tag antibody，且浓度为10μg/mL。
1.2标准曲线
当固化蛋白浓度为10μg/mL时，将标准品进行系列稀释，建立标准曲线。
标准品溶液的制备：用稀释液将标准品分别稀释至浓度为50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.5626μg/mL、0.7812μg/mL、0.3906μg/mL。
将固化了固化蛋白的ProteinA传感器浸入到标准品溶液中60-180s进行捕获和检测。
根据检测结果绘制得到如图2所示的标准曲线。图2中，横坐标为浓度(μg/mL)，纵坐标为蛋白的结合速率。当标准品浓度为0.3906μg/mL～50μg/mL时，R2＝0.9999，线性关系良好，可以用于样品的定量检测。
2.检测
待测样品溶液制备：将收集到的细胞上清溶液或者其他粗样品溶液12000rpm高速离心10分钟，取上清溶液，按每孔200μL加入到96孔微孔板中上机检测。如果待测样品浓度过高，可以将样品用稀释液进行适当稀释后再检测。即可以根据标准曲线范围对样品进行稀释或者不稀释操作。
捕获检测物质：将固化了固化蛋白的ProteinA传感器浸入到待测样品中60-180秒进行捕获和检测。
3.再生传感器
将检测了样品的传感器先经过10mM甘氨酸(pH2.0)浸洗再生5～10s，再用稀释液进行复性操作5～10s，再生和复性操作各3次。
4.结果的计算
将待测样品的检测结果代入标准曲线中，获得待测样品中His-tag标签蛋白的浓度。
如图2和下表格所示，根据仪器测得的结合速率得到对应的浓度，再根据稀释倍数得到样品对应的实际浓度。
| 样品 | 结合速率 | 测得浓度(μg/mL) | 稀释倍数 | 计算浓度(μg/mL) |
| S1-1 | 0.2351 | 33.3 | 40 | 1332.8 |
| S1-2 | 0.2359 | 33.4 | 40 | 1337.4 |
| S1-3 | 0.2404 | 34.1 | 40 | 1363.9 |
| S1-4 | 0.2392 | 33.9 | 40 | 1357.1 |
| S1-5 | 0.2407 | 34.1 | 40 | 1365.6 |
| S1-6 | 0.2455 | 34.9 | 40 | 1394.2 |
5.传感器的保存
传感器保存：实验完全结束后，将ProteinA传感器在20％蔗糖(PBS)溶液中浸泡1min，37℃烘干5min，室温密封保存。
上述步骤中基于BLI技术的分子互作仪器的参数设置如下：
(1)固化蛋白参数设置：
| 步骤 | 时间(s) | 转速(rpm) | 说明 |
| Quantitation | 60～180 | 800～1000 | 捕获固化蛋白 |
| Regeneration | 5 | 800～1000 | 再生传感器 |
| Neutration | 5 | 800～1000 | 中和传感器 |
(2)检测运行参数设置：
| 步骤 | 时间(s) | 转速(rpm) | 说明 |
| Capture | 60～180 | 800～1000 | 捕获待测蛋白 |
| Buffer | 60～120 | 800～1000 | 平衡传感器 |
| Sample | 60～120 | 800～1000 | 捕获待测蛋白 |
运行温度25～30℃；采集频率：Standard(5.0Hz)。
实施例二方法验证
重复性：将样品稀释至线性曲线范围内，重复制备6份进行检测，RSD＝1.6％，方法重复性良好。
准确性：蛋白的理论浓度为1300μg/mL，分别将样品稀释20倍、50倍、400倍各两份进行检测，样品回收率为100.8％。
本发明旨在开发一种操作简单易学、无需任何标记、检测通量高、结果准确可靠的His-tag标签蛋白浓度检测的方法，用在研发早期细胞株筛选阶段大批量样品的检测与评估中。该方法没有任何标记过程，可以直接检测细胞培养上清或者其他来源的粗样品中His-tag蛋白的浓度。本发明的基本实验步骤：固化蛋白(抗His-tag标签蛋白的抗体)-结合待检测物质(His-tag标签蛋白)-ProteinA传感器再生-固化蛋白……，检测一个样品整个实验时间可控制在2.5-5min，检测灵敏度可达到0.39μg/mL。
每个样品的单纯检测环节只需十几秒至几分钟，可以对多个样品进行批量处理后同时上机检测，整个检测时间(80个样品为例)最快可在30分钟内完成。实验人员打开设备预热，准备试剂耗材，制备标准品溶液，加样过程等只需30分钟左右即可完成。样品上机检测过程，实验人员可以开展其他工作。检测完毕，实验人员只需要5分钟左右分析数据、出具报告。
实验设备使用Fortebio Octet系列产品，操作简单方便，易学习，降低了对实验人员的要求。并且方法中用到的ProteinA传感器可以多次再生重复使用，大大节约耗材成本。
本发明基于生物膜干涉技术原理，建立一种间接检测His-tag标签蛋白的方法。该技术方法与传统方法免疫印迹法及酶联免疫吸附法相比，具有通量高、操作简便、检测快速、灵敏度高、结果准确的优势。
与现有技术相比，本发明(1)样品制备简单：待测样品不需要经过复杂的样品前处理、标记等步骤，只需进行简单离心或者稀释后，直接检测。
(2)无需标记、无需显色反应：整个实验操作，没有标记步骤，也不需要显色反应即可进行样品检测。避免标记试剂或者显色试剂对环境的污染。
(3)实验流程简便、易于实验人员操作：检测全过程没有包被抗体、反复加样、反复加试剂、反复洗板操作；设备参数设置完成即可上样检测。
(4)高通量、提高检测效率：可以将样品同时加入96孔或者384孔板中进行实验，实现大量样品批量检测。
(5)降低检测成本：实验选择的ProteinA传感器，采取再生步骤后可以多次再生重复使用，节约耗材，降低检测成本。
(6)整个实验过程操作步骤简单，外界因素对实验结果影响较小，保证了实验结果的准确可靠及可重复性。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种His-tag标签蛋白浓度的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：制备固化蛋白溶液；制备浓度标准曲线，并将待测样品制备成样品溶液；利用ProteinA传感器捕获固化蛋白溶液中的固化蛋白，之后利用固化有所述固化蛋白的ProteinA传感器捕获样品溶液内的His-tag标签蛋白并进行检测，将检测结果代入所述浓度标准曲线中，得到待测样品中的His-tag标签蛋白浓度；
所述浓度标准曲线的制备包括如下步骤：用稀释液将固化蛋白稀释到浓度为5μg/mL~20μg/mL；利用ProteinA传感器捕获不同浓度的固化蛋白溶液中的固化蛋白，根据固化蛋白的固化高度选择合适的固化蛋白的浓度；在所述合适的固化蛋白的浓度下，将标准品进行系列稀释，并利用固化有固化蛋白的ProteinA传感器捕获标准品中的标签蛋白并进行检测，根据检测结果建立浓度-结合速率的标准曲线；
所述合适的固化蛋白的浓度为10~15μg /mL；固化蛋白的固化高度为≥1.0nm；所述固化蛋白为抗His-tag抗体固化蛋白，包括Anti-His Tag Rabbit pAb和/或Anti-6His Tagantibody；
所述检测为利用生物分子相互作用分析系统基于生物膜干涉技术进行检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，稀释后的所述标准品浓度范围为0.3906μg/mL~50μg/mL。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括传感器的再生步骤：将检测了样品的传感器先经过甘氨酸浸洗再生5~10s，再用稀释液进行复性操作5~10s，再生和复性操作各进行多次。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括传感器的保存步骤：实验完全结束后，将ProteinA传感器在蔗糖溶液中浸泡至少30s，之后烘干并室温密封保存。
5. 根据权利要求1~4任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述稀释液为含0~0.02%Tween20和0~0.1% BSA的PBS溶液。
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