CN102250880A - 利用蛋白磁珠的免疫共沉淀富集转录因子靶标基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用蛋白磁珠的免疫共沉淀富集转录因子靶标基因的方法。它包括带抗原标签转录因子蛋白的表达及其与针对该抗原标签的单克隆抗体的免疫反应形成抗原-抗体复合物，蛋白磁珠对抗原抗体复合物的免疫沉淀反应形成吸附有转录因子蛋白的抗原-抗体-蛋白磁珠复合物。最后利用该复合物与基因组的DNA酶切片段相结合，除去不能与该复合物上的转录因子相结合的DNA片段，即富集到能与转录因子结合的候选靶标基因片段。进一步构建这些富集片段的插入文库，经测序而得到转录因子的靶标基因。本发明通过引进磁珠及改进实验步骤，从而用更简化的方法，却能更高效从基因组中获得能与转录因子蛋白直接结合的靶标基因。

Description

利用蛋白磁珠的免疫共沉淀富集转录因子靶标基因的方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域。更具体涉及一种利用磁珠的免疫共沉淀反应进行转录因子靶标基因体外富集的方法。

背景技术

随着各种生物基因组计划的完成会解析出基因组中可能存在的全部基因的阅读框架，接下来研究基因的表达调控特别是转录水平的表达调控就显得非常迫切。由于转录因子是一类特定的与DNA结合的蛋白质分子，研究转录因子就是研究转录调控的分子机制。因此，对转录因子及其基因的功能研究已成为当前生物学研究领域的热点。如现已从水稻的基因组中预测出2025个转录因子。但只有对它们的功能进行注解，才具有实际的理论意义和应用价值。而注解转录因子功能的实质，就是要在基因组中鉴定出它所调控的靶标基因并确定出它直接或间接影响到的遗传性状。目前，鉴定转录因子靶标基因的方法主要分为两类：即通过转录因子表达水平的改变引起靶基因的表达变化来鉴别靶基因和通过转录因子结合的特异靶序列鉴别靶基因。第一类方法包括对转录因子基因的过量表达、基因敲除和反义抑制等，其优点是可以通过与野生型的对比，直接检测到突变体中受影响基因的表达差异或观测到遗传性状的差异。而局限性在于不能确定转录因子对靶基因是直接调控还是间接调控。第二类就是利用转录因子蛋白本身直接从基因组中获取与其结合的特意靶序列，从而得到其直接调控的靶基因。其中最具代表性的是由Watson等在2000年提出的一种体外直接鉴定转录因子靶基因的高通量Pull-down方法。其基本原理就是通过DNA-蛋白质的相互作用及蛋白之间的特异识别反应，从而形成一个桥梁式作用，最终将目的蛋白的靶基因筛选出来。已报道用该方法得到拟南芥转录因子WRKY53的63个靶基因及水稻转录因子OsBP-73的22个靶基因。本发明是在Pull-down方法的基础上，通过引进磁珠及改进实验步骤，从而用更简化的方法，却能更高效从基因组中获得能与转录因子蛋白直接结合的靶标基因。

发明内容

为了实现上述目的，本发明提供了一种利用蛋白磁珠的免疫共沉淀富集转录因子靶标基因的方法。

本发明采取的技术方案如下：

本发明的方法包括以下步骤：①带抗原标签的转录因子蛋白的表达；②针对所述抗原标签的单克隆抗体与带抗原标签的转录因子蛋白的免疫反应形成抗原-抗体复合物；③针对所述单克隆抗体的免疫球蛋白进行亲和反应的磁珠对抗原-抗体复合物的免疫沉淀反应，进一步形成吸附有转录因子蛋白的抗原-抗体-蛋白磁珠复合物；④最后利用抗原-抗体-蛋白磁珠复合物与基因组DNA片段结合，清洗除去不能与该复合物上的转录因子相结合的DNA片段，即富集到能与转录因子结合的候选靶标基因片段，通过进一步构建这些富集到的候选靶标基因片段的插入文库，经测序而得到转录因子的靶标基因。

其中所述基因组DNA片段的获得包括以下步骤：①提取生物基因组的总DNA；②利用限制性内切酶对提取的总DNA进行单酶切或双酶切；③对酶切完全的片段用连接酶连上相应的限制性酶切接头，而后用相应的接头引物进行PCR扩增以增加基因组DNA片段的数量。

所述磁珠为能针对抗体的免疫球蛋白进行亲和反应的磁珠，主要是包裹有protein A 蛋白的磁珠或包裹有任何其他针对一抗的球蛋白起到二抗抗体作用的蛋白磁珠。

如图1所示，本发明的核心内容包括以下几个部分：①通过蛋白表达技术获得带抗原标签的转录因子后，加入对抗原标签起特异性结合的抗体形成抗原-抗体复合物；②加入针对抗体的免疫球蛋白起亲和反应的蛋白磁珠，结合成吸附有转录因子的抗原-抗体-磁珠蛋白复合物；③加入基因组DNA的限制酶酶切片段，使转录因子与其识别的靶标DNA片段相结合；④清洗磁珠除去不能结合的DNA片段后裂解释放出靶标DNA片段。

本发明的优点：

与常规Pull-down方法相比， 本发明存在以下明显的优点：

1、利用蛋白磁珠（如对IgG蛋白有亲和作用的protein A磁珠）对抗原-抗体复合物的免疫共沉淀反应，形成直接吸附有转录因子蛋白的抗原-抗体-蛋白磁珠复合物。不需要另外通过镍柱纯化得到转录因子蛋白，减少了操作步骤。而传统的pull down技术需要将表达出来带抗原标签的转录因子蛋白用镍柱等进行纯化。这对通过蛋白表达技术得到的表达量极低的转录因子蛋白尤为重要，因为其表达量低难以被镍柱纯化。

2、利用免疫反应直接对转录因子蛋白进行亲和免疫共沉淀，特异性高，提高吸附的专一性。

3、用专一吸附免疫球蛋白的蛋白包裹的磁珠代替专一吸附免疫球蛋白的蛋白包裹的琼脂糖（如sephrose protein A）进行实验操作，利用磁力架对磁珠的吸附作用清洗磁珠，除去不能与抗原-抗体-蛋白磁珠复合物上的转录因子相结合的DNA片段，省去离心步骤，使清洗操作更为简便，清洗效率更高。 

4、吸附的蛋白可以立即连续在一管内进行反应，简化了操作过程并避免多次换管引起的交叉污染。

附图说明

图1为本发明的技术流程图。

图2为水稻转录因子SUSIRI基因的原核表达载体PET-SU的PCR检测 (A)与酶切鉴定（B），M为λDNA+HindIII分子量标准；A: CK为SUSIRI基因正对照；1为PET-SU载体转化子；2为空白对照；B: 1为BamHI/SacI酶切；2为BamHI/SmaI酶切；

图3为IPTG诱导表达产物的Western blot检测；其中1：诱导上清；2:诱导沉淀；3:未诱导上清；M:蛋白分子量标准；

图4为水稻总DNA的EcoRI/MseI酶切（A）以及DNA酶切接头片段的PCR扩增（B）；其中 M：λ/HindIII分子量标准(λ/HindIII DNA Marker )；

图5为结合SUSIRI蛋白的免疫磁珠富集的DNA靶标片段的PCR扩增；M：Trans DNA 分子量标准II；

图6为含有磁珠富集的靶标DNA片段转化子的PCR检测；M：Trans DNA 分子量标准II；1-14：含有靶标片段的转化子。

具体实施方式

本发明的一种利用蛋白磁珠的免疫共沉淀富集转录因子靶标基因的方法，具体操作步骤如下：

1、转录因子基因的原核或真核表达载体的构建及对表达菌的转化

选择带有抗原标签的原核或真核表达载体（如带有6XHis标签的Novagen公司的原核表达载体pET-28系列或Invitrogen公司的毕赤酵母真核表达载体pPIC及pGAP系列），设计转录因子基因的上游引物及下游引物（带有限制性酶切位点），将已克隆得到的转录因子基因全长重新用PCR克隆进pMD18-T载体，再用相应的限制性内切酶对连接的转录因子基因和原核或真核表达载体进行双酶切，将转录因子基因融合进原核或真核表达载体，构建成末端带有抗原标签的转录因子的表达载体。将重组质粒转化表达菌株（如原核大肠杆菌BL21或真核的毕赤酵母GS115）, 经鉴定后备用。

2、 转录因子基因在表达菌株中的诱导表达

   分别按照不同表达菌株的诱导条件，对菌株进行诱导表达。用超声破碎或其他针对具体表达菌株推荐的方法裂解表达菌株，离心获取裂解液的上清部分。

、表达蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳及抗原标签的Western blot检测 

灌制分离胶浓度为12%，积层胶为5%的SDS聚丙烯酰胺凝胶。用适当体积1×SDS凝胶上样缓冲液制备样品，加样（样品为步骤2中表达菌裂解液的上清部分），8V/cm电压电泳，电泳结束后对凝胶进行固定、考马斯亮蓝染色。Western blot方法用硝酸酸纤维素膜（Whatman公司）对凝胶进行转膜、加入针对抗原标签的特异抗体（一般为商业公司制成品，如针对6XHis标签的单克隆抗体）为一抗进行免疫杂交。其中第一抗体反应是按说明的稀释浓度将抗原标签单抗加进封闭缓冲液中；加入针对一抗的二抗进行显色反应。二抗体反应是按1：500（或具体说明书的稀释浓度）加进封闭缓冲液中。膜冲洗3-4次后放入显色液中显色或进行胶片曝光显影。

4、 用免疫磁珠直接吸附表达蛋白

经Western blot确证获得带有抗原标签的目的蛋白后，向裂解液的上清中加入10μl 针对抗原标签的单抗,室温下振荡孵育1h，使抗体与抗原结合形成Ab-Ag结合物。如选用Invitrogen免疫磁珠Dynabeads proteinA，可按说明书清洗免疫磁珠Dynabeads proteinA 后，将Ab-Ag结合物加入到含Dynabeads proteinA的离心管中，室温轻轻振荡孵育20min，形成Dynabeads-Ab-Ag复合物，用400μl的PBS pH7.4清洗复合物3-4次，得到专一吸附于磁珠的转录因子蛋白。

5、真核生物总DNA的提取及酶切

提取真核生物的总DNA。取10 μg总DNA在50 μl反应体系（反应体系是指限制性内切酶的酶切体系。主要包括一定单位限制性内切酶、与内切酶对应的缓冲液、一定量的基因组DNA、最后加水补足至50μl。根据实际使用的内切酶的不同，酶活单位数与对应的缓冲液配方不同）中用两种不同限制性内切酶（如EcoRI和MseI）酶消化3h，取5μl酶切产物电泳检测酶切效果，确定酶切完全。用

6、接头的制备及其与酶切DNA的连接

针对步骤5所用的限制性内切酶设计不同的接头序列，与酶切的DNA产物相连接。如分别针对EcoRI和MseI合成的四条寡核苷酸引物为：EcoRI linker 1：CTCGTAGACTGCGTACC和EcoRI linker 2：AATTGGTACGCAGTCTAC；以及MseI linker 1：GACGATGAGTCCTGAG和MseI linker 2：TACTCAGGACTCAT，而后按等摩尔数的比例退火（反应条件为：94℃，10min；37℃，30min）分别形成EcoRI和MseI粘性末端的双链接头AdpterE和AdpterM。经T₄DNA连接酶作用，使得酶切DNA片段两端加上退火形成特异性的接头。并以连接产物为模板，进行扩增。如对EcoRI和MseI的双酶切连接产物，可利用引物EcoRI + A：GACTGCGTACCAATTCA和MseI + C：GATGAGTCCTGAGTAAC扩增连接产物。

7、 结合在磁珠上的转录因子蛋白对DNA靶标片段的吸附

向经步骤4制备得到的Dynabeads-Ab-Ag复合物的离心管中加入10μl的10×DNA结合缓冲液（200 mM Tris pH 7.6, 500 mMNaCl, 10 mMMgCl₂, 2mM EDTA, 50% 甘油, 5 mMDTT, 0.5 mM PMSF），15μl带有接头的基因组DNA片段扩增混合物（步骤6制备），2μg poly-dIdC，加水补至100μl。混匀后冰上放置30min。将反应复合物置于磁力架上，去上清。用400μl的PBS，pH7.4清洗重复3-4次，以除去不能被磁珠吸附的DNA片段。加入50μl 裂解缓冲液（500 mM Tris-HCl pH 9.0, 20 mM EDTA, 10 mM NaCl,0.2% SDS），轻轻混匀，室温孵育2min，将Dynabeads-Ab-Ag- DNA复合物分离。将分离混合物置于磁力架上除去Dynabeads proteinA，留取的上清用氯仿纯化获得DNA片段。用引物（如EcoRI + A和MseI + C）进行PCR反应。PCR产物用PCR产物纯化回收试剂盒回收，并克隆至载体pMD18-T。

8、 候选靶标基因的鉴定

将连有候选靶标片段pMD18-T的克隆送至生物公司测序。将测序结果在NCBI数据库 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）或其他的基因组数据库上进行比对分析，并确定候选基因的结构和功能。

实施例1：免疫磁珠对水稻WRKY转录因子SUSIRI靶标基因的富集

水稻基因SUSIRI是从粳稻日本晴的幼穗中克隆到的一个WRKY家族的转录因子基因。为获得它的靶标基因以阐明其生物学功能，将克隆到的SUSIRI基因的全长cDNA（SUSIRI基因的详细信息参见：陈坚,林忠平,段远霖,等.水稻中一个SUSIBA2相似基因的克隆与表达分析.分子植物育种, 2008, 6(3): 579-582）插入到PET-28a载体中，构建成在末端含有6XHis抗原标签的原核表达载体PET-SU。Western blot检测显示：IPTG诱导后表达载体PET-SU可在大肠杆菌BL21（DE3）plysS中能表达出63kD的目的蛋白，在诱导2-3h 后SUSIRI蛋白表达量最高。进一步运用磁珠以水稻全基因组DNA为目标，以原核表达出的SUSIRI蛋白为诱饵富集能与其结合的DNA靶标片段，共获得21条核苷酸序列。序列比对发现：这些候选靶标基因包含叶绿体被膜蛋白基因、叶绿素光合蛋白基因、转座蛋白基因及一些未知蛋白基因等。其中有16个序列含有W-box核心元件，13个序列含有W-box元件，5个序列含有糖代谢相关元件。这些元件都是已知WRKY转录因子的作用位点。

材料与方法

1.1 实验材料

供试的水稻材料日本晴（Oryza sativa sub. Japonica var. Nipponbare）；供试的大肠杆菌菌株为DH5α、BL21（DE3）plysS；原核表达载体为PET-28a购自Novagen公司，该载体本身带有6XHis标签的表达框，克隆载体pMD18-T购自Takara公司。除免疫磁珠Dynabeads ProteinA购自invitrogen公司外，其余免疫反应用的His标签单克隆抗体，HRP标记羊抗小鼠IgG及DAB底物显色试剂盒均购自北京天根生物公司。

1.2  SUSIRI基因原核表达载体的构建及对原核表达菌的转化

设计上游引物：CAGGATCCATGGCTGCAATTATGAAC（含BamHI位点）及下游引物：ATGAGCTCTCACGGACCCATGA（含SacI位点）将已得到的SUSIRI基因全长重新用PCR克隆进pMD18-T载体，再用BamHI和SacI对已连接的SUSIRI基因、原核表达载体PET-28a进行双酶切，将目的片段与PET-28a载体相连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，经对转化子的PCR鉴定、酶切鉴定与测序，得到末端带有His标签SUSIRI基因原核表达载体PET-SU。将重组质粒PET-SU转化原核表达菌株BL21（DE3）plysS, 经鉴定后备用。

1.3 SUSIRI基因在大肠杆菌的诱导表达

取1ml含重组质粒的原核表达菌接种于10ml LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。再按1%体积转接于100ml LB液体培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6-0.8后将菌液平分为两份，其中一份加入IPTG（终浓度0.4mmol/L），将两份菌液同时放在28℃摇床培养2-4h。菌液离心收集菌体，按菌液：60mM Tris-Cl缓冲液（pH8.0）=20:1的比例重悬菌体，超声波破碎细胞，离心分别收集上清与沉淀。

1.4原核表达蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot检测 

灌制分离胶浓度为12%，积层胶为5%的SDS聚丙烯酰胺凝胶。用适当体积1×SDS凝胶上样缓冲液制备样品，加样，8V/cm电压电泳，电泳结束后对凝胶进行固定、考马斯亮蓝染色。按照文献（王关林，方宏筠主编：植物基因工程.科学出版社 2002，pp863-865）介绍的Western blot方法用硝酸酸纤维素膜（购自Whatman）对凝胶进行转膜、免疫杂交。其中第一抗体反应是按1：1000的稀释浓度将His标签单抗加进TNT封闭缓冲液中；二抗体反应是按1：500的稀释浓度将羊抗鼠IgG-HRP加进TNT封闭缓冲液中。膜冲洗3-4次后放入DAB显色液中显色。

1.5 用免疫磁珠直接吸附原核表达蛋白

经Western blot确证获得带有His标签的目的蛋白后，向2ml细菌裂解液的上清（步骤1.3）中加入10μl His标签单抗（1μg/μl）,室温下振荡孵育1h，使抗体与抗原结合形成Ab-Ag结合物。按Invitrogen说明书清洗免疫磁珠Dynabeads proteinA 后，将Ab-Ag结合物加入到含Dynabeads proteinA的离心管中，室温轻轻振荡孵育20min，形成Dynabeads-Ab-Ag复合物，用400μl的PBS pH7.4清洗复合物3-4次，得到专一吸附。

1.6水稻总DNA的提取及酶切

取水稻种子，表面消毒后接种到MS基本培养基上，在25℃，12h光周期下培养，获得无菌苗。用CTAB法提取水稻的总DNA。取10 μg总DNA在50 μl反应体系中用限制性内切酶EcoRI和MseI酶消化3h（该反应所用2种内切酶均购自NEB公司，除提取水稻的总DNA外，反应体系中包括：50mM NaCl,100mM Tris-HCl,10mM MgCl₂,0.025% Triton X-100以及5U 的EcoRI和10U的MseI，用双蒸水将总体积补足至50μl），取5μl酶切产物电泳检测酶切效果，确定酶切完全。用氯仿纯化酶切产物。

1.7接头的制备及其与水稻酶切DNA的连接

将合成的四条寡核苷酸引物EcoRI linker 1：CTCGTAGACTGCGTACC和EcoRI linker 2：AATTGGTACGCAGTCTAC；MseI linker 1：GACGATGAGTCCTGAG和MseI linker 2：TACTCAGGACTCAT分别按等摩尔数的比例退火（反应条件为：94℃，10min；37℃，30min），形成EcoRI和MseI粘性末端的双链接头AdpterE和AdpterM。经T₄DNA连接酶作用，使得酶切水稻DNA片段两端加上退火形成特异性的接头。并以连接产物为模板，利用引物EcoRI + A：GACTGCGTACCAATTCA和MseI + C：GATGAGTCCTGAGTAAC扩增连接产物。反应条件为：94℃预扩增3min；30循环的94℃，1min；56℃，1min；72℃，1min；以及72℃延伸5min。

1.8筛选DNA靶标片段

向经1.5制备得到的Dynabeads-Ab-Ag复合物的离心管中加入10μl的10×DNA结合缓冲液（200 mM Tris pH 7.6, 500 mMNaCl, 10 mMMgCl₂, 2mM EDTA, 50% 甘油, 5 mMDTT, 0.5 mM PMSF），15μl带有接头的水稻DNA片段扩增混合物（1.7制备），2μg poly-dIdC，加水补至100μl。混匀后冰上放置30min。将反应复合物放置磁力架上，去上清。用400μl的PBS，pH7.4清洗重复3-4次。加入50μl 裂解缓冲液（500 mM Tris-HCl pH 9.0, 20 mM EDTA, 10 mM NaCl,0.2% SDS），轻轻混匀。室温孵育2min，将Dynabeads-Ab-Ag- DNA复合物分离。将分离混合物放置磁力架上除去Dynabeads proteinA，留取的上清用氯仿纯化获得DNA片段。用引物EcoRI + A和MseI + C进行PCR反应（反应条件同1.7）。PCR产物用PCR产物纯化回收试剂盒回收，并克隆至载体pMD18-T。

1.9 候选靶标基因的鉴定

将连有候选靶标片段pMD18-T的克隆送至北京博尚生物公司测序。测序结果在NCBI数据库 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）和水稻基因组数据库（http://www.gramene.org/）进行比对分析，并确定候选基因的结构和功能。

2 结果与分析

2.1 原核表达载体的构建及鉴定

将SUSIRI基因与PET-28a载体融合构建成的原核表达载体命名为PET-SU。目的基因SUSIRI经PCR检测，扩增出1588bp的片段（图2A）。选取BamHI/SacI和BamHI/SmaI两组酶对PET-SU酶切。每一组酶切结果都是只出现两条带。根据酶切位点在载体中的位置，可以确定载体PET-SU切开的较小片段分别为：1588bp和2847bp（如图2B箭头所指），结果可以看出，酶切的片段符合预期的大小。为防止连入表达载体的片段发生移码而引起表达错误或不表达，将构建好的载体送至上海博尚生物公司进行测序，测序结果显示构建好的两个表达载体在序列上没有发生移码错误。

基因在大肠杆菌中的表达与检测

将重组质粒PET-SU转化大肠杆菌BL21（DE3）plysS，加入IPTG诱导表达4h，菌体经超声波破碎后分为上清和沉淀两种。SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色，没有发现明显的目的条带。但是通过Western blot检测发现，诱导后上清与沉淀中均有大小为63kD的目的表达产物（图3）。这说明，SUSIRI基因在载体PET-28a中诱导后有表达，但是表达产物的量很小。

2.3 免疫磁珠吸附的SUSIRI蛋白对水稻基因组中靶标片段的富集

用限制性内切酶EcoRI和MseI酶切粳稻日本晴总DNA，3h后可以将DNA完全切开（图4A）。接头与DNA片段连接后，用接头引物对连接的DNA片段进行PCR扩增，可获得高量的带有特异性接头的DNA片段（图4B）。 

用含有SUSIRI表达蛋白的细菌裂解液的上清进行靶标DNA的富集。经proteinA免疫磁珠吸附，洗脱，得到水稻基因组中能与SUSIRI蛋白结合的DNA靶标片段。如图5所示，用PCR扩增获得的富集的DNA靶标片段产物经琼脂糖凝胶电泳，呈弥散状，其中有数条不容易区分的亮带。弥散带从大于100bp延伸到1kb。

磁珠富集的候选靶基因的克隆测序及生物信息分析

将PCR产物经纯化回收后克隆至载体pMD18-T上，转化大肠杆菌后随机挑取单克隆进行PCR鉴定，结果如图6所示：连入克隆载体的DNA片段从大于100bp到1kb不等，其中以100bp-200bp之间的条带较多，与图5中的DNA片段大小范围相同。

选取所有含大于200bp和部分含100bp-200bp之间的富集DNA片段的转化子进行测序，在30个测序样品中，共得到28个不同的序列。测序结果在NCBI数据库和水稻基因组数据库进行比对分析，共筛选出21个SUSIRI可能的基因靶标序列。结果显示，这些阳性克隆中的候选靶基因有叶绿体被膜蛋白基因、叶绿素光合蛋白基因、转座蛋白基因及一些未知蛋白基因等。进一步对克隆序列进行作用元件分析，发现共有16个序列含有W-box核心元件as-1 box： TGAC，其中13个序列含有完整的W-box元件；5个序列含有糖代谢相关元件（SRE：Sucrose Responsive Element和Sugar Respressive Element），其中一个序列含有与大麦的糖应答元件相同的SURE，但却是一个拟似的反转录转座基因（Putative retroelement）。分析结果见表1。

表1  免疫磁珠富集的SUSIRI的候选靶基因

已知绝大多数的植物WRKY转录因子家族能够与靶基因DNA序列中的W-box（(T)(T)TGAC(C/T)）结合，且W-box中的核心部分as-1box的TGAC是不变的，这对WRKY的结合功能是非常必要的。但也有例外，如拟南芥AtWRKY6就已经被证明其对AtWRKY42的表达有调控作用，而AtWRKY42基因的启动子中确没有W-box。因此，不能把不含W-box的序列从候选靶基因中排除出去。本发明以水稻WRKY转录因子SUSIRI为操作对象，对其靶基因进行了体外富集。共获得21条候选靶标基因的核苷酸序列。序列比对发现：这些候选靶标基因中有16个序列含有W-box核心元件。其中13个序列是含有较完整的W-box元件，4个序列还含有糖代谢相关元件，这些元件都是已知WRKY转录因子的作用位点。在余下5个不含W-box核心元件序列中，1个含有与WRKY转录因子的作用的糖代谢相关元件，另外4个有可能就属于新例外的靶基因。由此可见，通过本发明富集到的转录因子的靶基因的效率较高，从而充分地证实了本发明的可行性。

Claims (2)

1.一种利用蛋白磁珠的免疫共沉淀富集转录因子靶标基因的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：①带抗原标签的转录因子蛋白的表达；②针对所述抗原标签的单克隆抗体与带抗原标签的转录因子蛋白的免疫反应形成抗原-抗体复合物；③针对所述单克隆抗体的免疫球蛋白进行亲和反应的磁珠对抗原-抗体复合物的免疫沉淀反应，进一步形成吸附有转录因子蛋白的抗原-抗体-蛋白磁珠复合物；④最后利用抗原-抗体-蛋白磁珠复合物与基因组DNA片段结合，清洗除去不能与该复合物上的转录因子相结合的DNA片段，即富集到能与转录因子结合的候选靶标基因片段，通过进一步构建这些富集到的候选靶标基因片段的插入文库，经测序而得到转录因子的靶标基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基因组DNA片段的获得包括以下步骤：①提取生物基因组的总DNA；②利用限制性内切酶对提取的总DNA进行单酶切或双酶切；③对酶切完全的片段用连接酶连上相应的限制性酶切接头，而后用相应的接头引物进行PCR扩增以增加基因组DNA片段的数量。

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