CN116751792B - 一种转录因子下游基因筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转录因子下游基因筛选方法（PER‑seq）。该方法首先制备原生质体，然后将转录因子‑报告基因及空载报告基因分别在原生质体中瞬时表达，最后收集转化成功的细胞，进行转录组测序，分析差异表达基因，筛选目标转录因子的下游靶基因。本发明建立了一种简单快速、高效广适，且不依赖于突变体或过表达转基因株系的转录因子下游调控基因挖掘方法，为解析植物转录调控机制提供了技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种不依赖于突变体或转基因株系的转录因子下游基因筛选方法。
背景技术
转录因子（transcription factor，TF）是一种蛋白质分子，又称为反式作用因子，通过识别靶基因启动子区的顺式作用元件，促进靶基因在特定时空的表达激活和抑制。因此，转录因子是表达调控网络的上游调节因子，控制着下游基因的表达，在植物的生长发育、抗逆反应和信号转导中发挥重要作用。鉴于转录因子在转录调控中的重要意义，筛选其下游调控基因在解析植物发育和抗逆调控机制、构建相应的表达调控网络以及挖掘植物发育与抗逆基因资源中起着关键作用。
目前常见的转录因子下游基因挖掘方法可分为两类：一是筛选与转录因子相结和的基因组片段，包括染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）和DNA亲和纯化测序（DAP-seq），从而获得转录因子的结合片段；二是使用目标转录因子的突变体或过表达株系进行转录组测序（RNA-seq），从而挖掘转录因子激活和抑制的下游基因。其中，ChIP-seq技术（Johnson DSet al.，2007）是通过蛋白质与DNA互作来分析已知转录因子靶基因的技术，其通常利用目标转录因子的过表达株系，且该技术同时存在成本高、信号低、以及重复性不好等不足。DAP-seq技术（O'Malley RC et al.，2016）是使用外源表达蛋白质直接捕获DNA，结合高通量测序技术挖掘下游候选基因，该方法弥补了ChIP-seq技术对植物转基因株系的依赖，但仍然存在大量假阳性信号干扰等问题。另一方面，利用RNA-seq技术对植物的突变体或过表达株系进行高通量测序是一种有效挖掘转录因子下游基因的手段，但是该方法一直受到植物突变体或者转基因株系的制约，突变体致死导致无法取材的限制，以及不同遗传背景和发育时期对靶基因表达影响的干扰。综上，利用突变体或转基因株系挖掘目标转录因子的下游基因仍有一定的局限性（Libault et al.，2017）。由此可见，迫切需要建立一种简单、有效、广适的转录因子下游基因筛选方法。
Opaque2（O2）是玉米籽粒储藏物质合成的关键转录调控因子，也是玉米中研究历史最久且最为重要的基因之一。已有研究报道O2可通过直接激活醇溶蛋白编码基因（Zeins）促进储藏蛋白的合成（Coleman and Larkins，1999; Woo et al.，2001; Larkinset al.，2017），激活蔗糖合成酶编码基因（Sus1和Sus2）促进淀粉合成（Deng et al.，2020），激活糖酵解途径调节基因（cyPPDK1和cyPPDK2）从而促进氮元素的积累（Zhang etal.，2016），以及激活NKD2参与调节糊粉层的发育（Zhan et al.，2018）。然而，迄今对于O2下游基因的表达调控网络仍然了解不足，阻碍了对O2及其靶基因资源的利用，难以满足玉米高产和高品质遗传改良的需求。拟南芥bHLH34是铁元素稳态调控关键基因，已有研究利用该基因的突变体筛选获得其下游基因（Li et al. 2016），包括bHLH38、bHLH39、bHLH100和bHLH101等。更多bHLH34调控基因的挖掘为深入理解植物铁元素稳态调节机理提供依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转录因子下游基因筛选方法。
一种转录因子下游基因筛选方法，按照如下步骤进行：
（1）制备植物原生质体；
（2）将植物转录因子-报告基因及空载报告基因分别在原生质体中瞬时表达；
（3）收集转录因子-报告基因转化成功的细胞，进行转录组测序，分析差异表达基因，筛选步骤（2）中所述转录因子的下游靶基因。
所述植物原生质体的来源为玉米、小麦、高粱、水稻、拟南芥、烟草、棉花或大豆。
所述植物原生质体来源为植物的叶片、叶鞘、根、茎、花、胚或胚乳。
所述报告基因为荧光蛋白、β-葡萄糖苷酸酶（GUS）或双荧光素酶（LUC）。
所述荧光蛋白为绿色荧光蛋（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）或红色荧光蛋白（mCherry、DsRed和RFP）。
利用所述转录因子下游基因筛选方法筛选到的Opaque2下游靶基因，所述靶基因为ZmSWEET4c、ZmMRP6和ZmABH3。
本发明的有益效果：本发明通过将转录因子与荧光蛋白在原生质体中融合表达，经特定温度和时间培养使外源蛋白高效积累，进而利用转录组测序检测上述原生质体的转录组，获得的差异表达基因为转录因子的下游调控候选基因。该方法简单快速、高效广适，且不依赖于突变体或过表达转基因株系，为解析植物转录调控机制提供了技术支撑。
附图说明
图1 为PER-seq技术流程与转录组测序结果；
图中：A，转录因子与荧光蛋白融合表达（TF-GFP）载体转化玉米叶肉细胞原生质及RNA-seq的技术流程图；B，转录组测序结果（火山图），取-log10(FDR)<0.05和|Fold Change| > 1为表达显著变化的标准，红色点示上调表达基因，绿色点示下调表达基因，灰色点示表达变化不显著的基因。
图2 为实施例1可有效筛选O2转录因子的下游调控基因；
图中： O2-GFP和GFP对比组为利用本发明的PER-seq技术筛选获得的结果，WT和o2对比组为利用o2突变体与其野生型对照转录组测序的筛选结果，Known targets示已知的O2下游调控基因，New targets示利用本发明筛选获得新的的O2靶基因。
图3 为O2转录因子与下游靶基因启动子结合。
图4 为双荧光素酶实验结果；
图中：目标转录因子效应蛋白（Effector）表达载体和报告基因（Reporter）表达载体结构示意图，REN为海肾荧光素酶，LUC为萤火虫荧光素酶；效应子和报告基因共转化玉米叶肉原生质体，在瞬时双荧光素酶检测中，O2激活了ZmZp15、ZmSWEET4c、ZmMRP6和ZmABH3启动子（ATG上游2 kb）驱动报告基因的表达；数据以平均值±标准差表示，与相应的对照组比较差异显著（t检验， ****P<0.0001)。
图5 为Zmzp15、ZmSWEET4c、ZmMRP6和ZmABH3基因在O2突变体中的表达相较于野生型显著降低；数据以平均值±标准差表示，与相应的对照组比较差异显著（t检验， ****P<0.0001）。
图6 为PER-seq技术筛选拟南芥转录因子bHLH34的下游基因；
图中：A，转录组测序结果（火山图），取-log10(FDR)<0.05和|Fold Change| > 2为表达显著变化的标准，红色点示上调表达基因，绿色点示下调表达基因，灰色点示表达变化不显著的基因；B，已知bHLH34下游基因在PER-seq数据中的差异表达。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1
一、利用PER-seq技术挖掘新的O2下游调控基因
1.1以玉米的黄化苗叶片为材料制备原生质体
（1）玉米（自交系B73）幼苗于28℃避光培养，待其生长至三叶期取黄化苗第二片叶中间部分，切为0.8mm宽的细丝，转移至酶解液中，28℃，35 rpm，黑暗中酶解4小时，获得原生质体。
（2）在酶解液中加入等体积的W5缓冲液，轻轻混匀，使用250目网筛过滤，将滤液在4℃条件下100 g离心2分钟，收集原生质体。
（3）加入W5缓冲液重悬原生质体，冰上孵育30分钟，再次弃去上清，收集原生质体。
（4）加入MMg溶液重悬原生质体，镜检观察细胞数目与形态，此时原生质体制备完成并置于冰上待用。
试剂配方：酶解液（20 mL）：2 mL 0.2 M MES，0.2 mL 2 M KCl，1.46 g 甘露醇，0.3 g Cellulase R10，0.08 g Macerozyme R10，ddH2O定容至20 mL，调节pH至5.7，55℃水浴中孵育10分钟，然后冷却至室温，加入0.2 mL 1 M CaCl2和20 mg的BSA，再用0.45 μm的滤器过滤后使用。W5缓冲液（200 mL）：2 mL 0.2 M MES，15.4 mL 2 M NaCl，0.5 mL 2 MKCl，25 mL 1 M CaCl2，ddH2O定容到200 mL。MMg溶液（100 mL）：2 mL 0.2 M MES，0.75 mL 2M MgCl2，50 mL 0.8 M甘露醇，ddH2O定容至100 mL。
1.2将载体pRTL2-GFP和pRTL2-O2-GFP在原生质体中瞬时表达
（1）本实施例选择将O2与GFP进行融合表达，同时探索该融合蛋白的适宜孵育温度及培养时间。首先，将GFP植物表达的空载载体pRTL2-GFP用Xho I和Xba I双酶切，回收载体骨架。克隆O2基因的CDS区，通过重组克隆构建O2-GFP融合表达载体pRTL2-O2-GFP。将重组载体转化Trans-T1菌株，筛选正确克隆。
（2）将菌株pRTL2-GFP和pRTL2-O2-GFP大量培养，提取质粒并浓缩至1000 ng/μL备用。
（3）在2 mL的离心管中加入20 μL的质粒和200 μL的原生质体，混匀后再加入220μL的40%的PEG-Ca2+溶液，混匀后室温静置30分钟。
（4）加入 880 μL 的 W5 缓冲液，室温条件下100 g离心2分钟，弃上清。
（5）加入1 mL的W5 缓冲液，于黑暗中25℃培养 14小时。
试剂配方：40% PEG-Ca2+（4 mL）：1.6 g PEG4000，0.4 mL 1 M CaCl2，1 mL 0.8 M甘露醇，ddH2O定容至4.0 mL。
1.3收集转化成功的细胞，进行转录组测序。
本实施例中通过在玉米叶肉细胞原生质体中表达转录因子O2与GFP的融合蛋白，收集转化成功的细胞进行转录组测序（图1A）。
该实施例鉴定出2487个差异表达基因，其中1715个基因表达上调，722个基因下调（图1B）。该实施例获得的差异表达基因数目多于利用o2突变体与野生型籽粒的转录组数据所获得的差异表达基因数目（Li et al., 2015; Zhan et al., 2018），表明本发明具有更好的筛选效率。其次，本发明除筛选到已被证实的O2的下游调控基因外，还获得了未报道的靶基因ZmSWEET4c、ZmMRP6和ZmABH3等，从而扩展了O2的调控网络（图2）。在此基础上，使用MEME-ChIP（Motif Analysis of Large Nucleotide Datasets）对上调表达基因的启动子区进行motif富集分析，结果发现了保守基序“TGAC”和“GTCA”，该基序与已知的O2结合顺式作用元件GCN4-motif（“TGACTCA”）和GCN4 like-motif（“TAGTCA”）的核心序列一致。综上，本实施例证实PER-seq技术能有效筛选目标转录因子的下游基因，相较于传统的转录组测序，本发明筛选目标转录因子的靶基因不依赖于突变体或转基因株系，因此可大幅缩短时间和降低成本。同时，本发明可通过对候选调控基因的启动子进行保守基序分析，有效预测目标转录因子所结合的顺式作用元件。
二、验证本实施例筛选到的O2下游调控新基因
通过凝胶阻滞实验、双荧光素酶报告实验验证O2对新获得靶基因启动子的结合与转录激活；以及利用荧光定量PCR检测o2突变体中候选基因的表达水平，证实O2可直接调控本发明新筛选到的下游靶基因ZmSWEET4c、ZmMRP6和ZmABH3。上述实验选择已知的O2下游基因ZmZp15作为对照。
2.1 EMSA实验证实O2蛋白与其下游基因ZmZp15、ZmSWEET4c、ZmMRP6和ZmABH3的启动子直接结合
2.1.1 O2蛋白的制备
（1）构建原核表达载体pET28a-O2
使用Xho I和EcoR I双酶切蛋白原核表达载体pET28a。克隆O2基因的CDS区，通过重组克隆构建载体pET28a-O2。将重组载体转化Trans-T1菌株中培养，并进行测序。测序正确后转化至BL21（DE3）菌株中进行原核表达实验。
（2）O2蛋白的表达
将100 mL的菌液摇床培养至菌液浓度OD600值达到0.5，使用浓度为1.0 mmol·L-1的IPTG诱导菌液，16℃，150 rpm摇床培养16小时，4℃，12000 rpm离心10分钟收集菌体。
（3）O2蛋白的纯化
向菌体中加入20 mL裂解缓冲液、蛋白酶抑制剂，重悬菌体，将菌液于冰上超声破碎，之后 4℃、12000 rpm、离心20分钟，保留上清，即获得粗提蛋白液。取4 mL的Ni-NTAAgarose填入准备好的无填料层析柱，即可获得蛋白纯化所需镍柱。首先，将粗蛋白液重复过镍柱两次，使目的蛋白与镍柱填料结合；然后分别用20 mL不同咪唑浓度的杂蛋白清洗缓冲液洗去杂蛋白；最后使用8 mL的洗脱缓冲液清洗镍柱，获得目的蛋白。
试剂配方：裂解缓冲液：0.02 mol·L-1咪唑、0.02 mol·L-1 Tris、0.5 mol·L-1NaCl、10%甘油、0.5% TritonX-100（pH 8.0）。杂蛋白清洗缓冲液：0.04 mol·L-1 咪唑或0.08 mol·L-1咪唑、0.02 mol·L-1 Tris、0.5 mol·L-1 NaCl、10%甘油、0.5% TritonX-100（pH 8.0）。洗脱缓冲液：0.25 mol·L-1 咪唑、0.02 mol·L-1 Tris、0.5 mol·L-1 NaCl、10%甘油（pH 8.0）。
2.1.2 启动子探针制备
选择基因ZmZp15、ZmSWEET4c、ZmMRP6和ZmABH3启动子区的GCN4-motif或GCN4like-motif及其两侧的基序合成5’-FAM标记的荧光探针（表1）。
表1 EMSA探针序列
2.1.3 6% TBE凝胶的制备及预电泳
按照表2中次序加入各个溶液并混合均匀，灌入胶板中，室温放置30分钟待TBE凝胶完全凝固后开始预电泳（4℃，100 V，电泳1小时），电泳缓冲液为预冷的0.5×TBE缓冲液。
表2 6% TBE凝胶配方
2.1.4 凝胶阻滞实验
将O2蛋白分别与各个探针孵育结合，进行TBE凝胶电泳，EMSA结果表明转录因子O2能够直接与本发明筛选到的下游靶基因ZmZp15、ZmSWEET4c、ZmMRP6和ZmABH3的启动子区的GCN4基序结合；加入竞争探针（WT comp）可使阻滞条带减弱，而加入突变的竞争探针（mutcomp）后，阻滞条带无明显变化（图3）。
2.2 双荧光素酶实验证实O2可激活其下游基因ZmZp15、ZmSWEET4c、ZmMRP6和ZmABH3启动子的表达
2.2.1 载体的构建
将载体 pGreenII-62SK 和 p0800-LUC 分别用 Bam HI 和 Hind III以及Bam HI和 Nco I 双酶切，回收线性载体骨架；克隆O2基因的CDS区，通过重组克隆构建效应蛋白表达载体pGreenII-62SK-O2。同时，以玉米B73基因组DNA为模板克隆ZmZp15、ZmSWEET4c、ZmMRP6和ZmABH3基因启动子区ATG上游2 kb序列，通过重组克隆构建报告基因载体p0800-pZp15-LUC、p0800-pSweet4c-LUC、p0800-pMrp6-LUC和p0800-pAbh3-LUC。转化Trans-T1菌株中培养，并进行测序挑选正确克隆。
2.2.2 以玉米的黄化苗为材料制备原生质（参考1.1的方法）。
2.2.3双荧光素酶报告基因活性的测定
（1）分别提取质粒 pGreenII-62SK、pGreenII-62SK-O2、p0800-pZp15-LUC、p0800-pSweet4c-LUC、p0800-pMrp6-LUC和p0800-pAbh3-LUC，浓缩至1000 ng/μL备用。
（2）分别将各 10 μL 质粒 pGreenII-62SK 和报告基因载体混合，共同转化玉米叶肉细胞原生质体；分别将各10 μL效应蛋白表达质粒 pGreenII-62SK-O2和报告基因载体混合，共同转化玉米叶肉细胞原生质体。转化后的原生质体于黑暗中培养 14 小时（转化步骤参考1.2）。
（3）转化后的原生质体100 g、4℃离心2分钟收集细胞，加入100 μL的1×Lysis溶液，涡旋震荡混匀裂解细胞，冰上静置30分钟。
（4）12000 rpm、4℃离心10分钟去除细胞碎片，将上清液转移至3个新的 1.5 mL离心管中，每管20 μL。
（5）向离心管中加入100 μL LARII（萤火虫荧光素酶底物）轻轻混匀，然后选择GloMax20/20LUMINOMETER 仪器程序 DLR-0-INJ，点击Measure Luminescence检测荧光数值。
（6）待上一步完成之后，取出离心管，加入100 μL的Stop&Glo Reagent（LUC 终止液及海肾荧光素酶的底物）轻轻混匀，将离心管放入仪器中，再次读取荧光数值。
（7）记录仪器显示的萤火虫荧光素酶活性测量值 RLUs1、海肾荧光素酶活性测量值 RLUs2 和 RLUs1/ RLUs2 比值。
双荧光素酶检测结果表明，转录因子O2可显著激活ZmZp15、ZmSWEET4c、ZmMRP6和ZmABH3启动子驱动的报告基因（LUC）的表达（图4），证实了O2对新获得下游靶基因ZmSWEET4c、ZmMRP6和ZmABH3启动子的转录激活作用。
2.3 qRT-PCR检测基因ZmZp15、ZmSWEET4c、ZmMRP6和ZmABH3在O2突变体和野生型籽粒中的相对表达量
取授粉后20天的o2突变体和野生型玉米籽粒，提取胚乳RNA并通过反转录获得cDNA。以cDNA为模板进行qRT-PCR分析，引物见表3。结果如图5所示，基因ZmZp15、ZmSWEET4c、ZmMRP6和ZmABH3在o2突变体中的表达量均显著低于野生型，进一步证实本发明新筛选到的靶基因在植物体内受到目标转录因子O2的调控。同时也表明，相较于依赖突变体和转基因株系的常规转录组测序和ChIP-Seq技术，本发明能以更低的成本和更短的时间获得转录因子的下游靶基因。
表3 qRT-PCR引物序列
实施例2
利用PER-seq技术挖掘拟南芥转录因子bHLH34的下游调控基因
1.1 以拟南芥叶片为材料制备原生质体
（1） 将拟南芥的叶片切为0.8 mm宽的细丝，转移至酶解液中，28℃，35 rpm，黑暗中酶解5小时，获得原生质体。
（2） 原生质体分离和转化流程同实施例1。
1.2 将载体pRTL2-GFP和pRTL2-bHLH34-GFP在原生质体中瞬时表达
（1）本实施例选择将拟南芥bHLH34与GFP进行融合表达，同时探索该融合蛋白的适宜孵育温度及培养时间。首先，将GFP植物表达的空载载体pRTL2-GFP用Xho I和Xba I双酶切，回收载体骨架。克隆bHLH34基因的CDS区，通过重组克隆（Infusion cloning）构建bHLH34-GFP融合表达载体pRTL2-bHLH34-GFP。将重组载体转化Trans-T1菌株，筛选正确克隆。
（2）将菌株pRTL2-GFP和pRTL2-bHLH34-GFP大量培养，提取质粒并浓缩至1000 ng/μL备用。
（3）原生质体的瞬时转化同实施例1。
1.3收集转化成功的细胞，进行转录组测序。
本实施例中通过在拟南芥叶肉细胞原生质体中表达转录因子bHLH34与GFP的融合蛋白，收集转化成功的细胞进行转录组测序（图6）。
该实施例鉴定出2982个差异表达基因，其中2611个基因表达上调，371个基因下调（图6A）。图6B显示该实施例可以筛选到93%的已知bHLH34下游基因（Li et al. 2016），表明本发明在拟南芥中具有很好的筛选效率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (4)
1.一种转录因子下游基因筛选方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
（1）制备植物原生质体；
（2）将植物转录因子-报告基因及空载报告基因分别在原生质体中瞬时表达；所述植物转录因子-报告基因为植物转录因子和报告基因融合表达的基因；
（3）收集转录因子-报告基因转化成功的细胞，进行转录组测序，分析差异表达基因，筛选步骤（2）中所述转录因子的下游靶基因；
所述转录因子为Opaque2，利用所述转录因子下游基因筛选方法筛选到的Opaque2下游靶基因为ZmSWEET4c、ZmMRP6和ZmABH3；所述ZmSWEET4c基因的ID号为Zm00001d015912，所述ZmMRP6基因的ID号为Zm00001d009243，所述ZmABH3基因的ID号为Zm00001d050021；
所述植物原生质体的来源为玉米。
2.根据权利要求1所述转录因子下游基因筛选方法，其特征在于，所述植物原生质体来源为植物的叶片、叶鞘、根、茎、花、胚或胚乳。
3.根据权利要求1所述转录因子下游基因筛选方法，其特征在于，所述报告基因为荧光蛋白。
4.根据权利要求3所述转录因子下游基因筛选方法，其特征在于，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋、黄色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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