CN111662923A

CN111662923A - 增强植物广谱抗病性的转录因子及应用

Info

Publication number: CN111662923A
Application number: CN201910176533.8A
Authority: CN
Inventors: 何祖华; 翟科然; 邓一文; 李群
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2039-03-08
Also published as: CN111662923B

Abstract

本发明涉及增强植物广谱抗病性的转录因子及应用。本发明揭示了PIBP1通过与PigmR和其它广谱抗病R基因直接互作进而促进自身细胞核蛋白的累积，正调控植物的抗病能力。PIBP1和同源基因作为一类非经典的转录因子结合并激活其下游的防卫基因如OsWAK14和OsPAL1的表达。因此，本发明提出了新的转录因子，其通过与R基因直接互作激活下游抗病基因，赋予植物抗病性的新机制。本发明不仅提供了切实有效的植物改良方法，也为植物广谱免疫机制研究和植物抗病育种提供了新的途径。

Description

增强植物广谱抗病性的转录因子及应用

技术领域

本发明属于分子生物学或植物学领域，更具体地，本发明涉及增强植物广谱抗病性的转录因子及应用。

背景技术

植物病害会造成农作物的大幅减产，甚至绝产，严重影响全球的粮食安全。水稻作为世界上主要的粮食产物，养活了近一半以上的人口。但是，由于自然界中各种病原微生物对水稻的侵害，每年都会导致其产量不同程度减产。其中，真菌病害如稻瘟病(rice blast，由稻瘟病菌Magnaporthe oryzae引起)和细菌病害如白叶枯(bacterial blight，由白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae引起)对水稻产量和品质的影响最为严重。仅稻瘟病(Magnaporthe oryzae)每年造成的减产就相当于总产量的10-30％，至少可以为6千万人口提供一年的粮食需求。近年来，农药的大量和广泛使用在一定程度上减轻了病虫害的影响，但对自然环境及食品安全也带来新的挑战。因此，培育新的抗病品种对于水稻产量和品质的提升具有重大意义。

在与病原菌互作进化过程中，植物进化出特异性的免疫系统。其防御机制可以分为组成型和诱导型两大类。组成性的物理与化学障碍包括植物表面的腊质、角质、木质素、硅细胞等物理屏障和病原菌侵染后植物细胞所产生的酚类物质、硫化物、皂角苷和抗菌蛋白等。诱导型的植物防卫系统是植物受到病原菌侵染而诱导产生的一系列生理生化变化和基因表达水平的改变，又称先天免疫反应(innate immunity)。先天性免疫反应从机制和层次上又可以分为两类：一类是是通过细胞膜上的病原菌分子模式识别受体(patternrecognition receptor，PRR)识别病原物表面存在的分子特征，即病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP；或是microbe-associated molecularpattern，MAMP)，激发病原相关分子模式免疫反应(PAMP-triggered immunity，PTI)；另一类是细胞内存在的具有专化性的抗性蛋白(R蛋白)识别病原微生物的效应蛋白(无毒蛋白)，从而激活下游的专化性防卫反应过程，即效应蛋白诱导的免疫反应(effector-triggered immunity，ETI)。PTI是基础抗病(basal defence)反应的重要组成部分，抗性相对广谱、稳定、持久，但可被病原微生物分泌的效应蛋白所抑制。ETI的抗性更强更专化，常常伴随着侵染部位的超敏反应(hypersensitive response，HR)甚至细胞死亡(celldeath)，现已被广泛应用于水稻育种当中。

目前水稻中克隆的R基因主要包括：介导对白叶枯病抗性的XA1，XA27，xa5，xa13(Os8N3或OsSWEET11)，Os11N3(OsSWEET14)，xa25；介导对稻瘟病抗性的Pita，Pib，Piz-t，Pikm，Pit，Pid3，Pi2，Pi5，Pi9，Pi36，Pi37，Pb1，Pia和Pigm等。根据R蛋白的结构可以将其分成5种类型：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Ser/Thr protein kinase，STK)、细胞内受体蛋白(coiled-coil/Toll or interleukin-1receptor-like nucleotide-bindingsiteleucine-rich repeat，CC/TIR-NBS-LRR)、仅含胞外LRR结构域的跨膜受体(leucine-rich repeat transmembrane，LRR-TM)、受体类激酶(LRR-TM-STK)和其余不属于上述结构的R蛋白。其中大部分的R蛋白属于CC/TIR-NBS-LRR类蛋白。根据目前的研究，认为R基因主要有两个方面的功能。一是识别病原菌的效应蛋白，二是激活下游免疫信号。在这个过程中，NLR的CC或TIR结构域主要通过形成同源或异源多聚体进行下游信号的传递；蛋白序列多样性的LRR结构域在没有病原菌侵染时可以使NLR蛋白抑制自身活性，在病原菌入侵时可以通过改变自身的蛋白构象激活NLR蛋白，从而激活植物的免疫过程。

植物R蛋白通过识别病原菌无毒蛋白而诱导植物产生ETI免疫。目前，植物抗病蛋白与病原菌分泌的无毒蛋白的识别主要分为“直接设别”和“间接设别”。“直接设别”模型即抗病R蛋白可以通过直接与病原菌无毒蛋白的相互作用而识别病原菌。“间接设别”模型主要有“警戒/诱捕”模型警。“警戒模型”中R蛋白通过监视宿主内无毒蛋白对靶标蛋白或其类似蛋白的修饰而间接地识别病原菌。此外，“诱饵模型”是无毒蛋白与诱饵蛋白互作，引起抗病R蛋白识别无毒蛋白。识别病原菌后的R蛋白可以进一步激活植物的ETI免疫信号通路。

ETI通过对抗病基因的表达调控，可使植物免受病原菌的威胁。在这个过程中，转录因子对下游防卫基因的激活或抑制对植物免疫具有重要的调节功能。目前已有部分相关研究，表明NLRs通过与转录因子的直接互作对免疫基因的转录水平进行调控。例如，SPL6，作为SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE类转录因子，可以通过与NLRs的直接互作来调控植物的免疫过程。转录因子bHLH84，响应病原菌的诱导，与NLRs直接互作对下游防卫基因的表达进行调控。NLR MLA10可以在细胞核中通过与转录因子WRKYs和MYB6的三者互作，协同调控植物的免疫反应过程。WRKY45与NLR基因Pb1在细胞核中互作，进而通过抑制WRKY45的蛋白降解促进其下游抗病基因的表达，赋予植物抗病性。同时，水稻基因组中有超过100个WRKY转录因子。有许多WRKY转录因子参与了水稻免疫反应，WRKY62和WRKY76负调控XA21介导的免疫反应。同时，稻瘟病菌的侵染时会诱导WRKY53和WRKY89特异的表达。还发现一些WRKY转录因子特定地响应某一种病原菌的侵染，而另外一些则响应多种病原菌的信号。这表明，不同病原菌激发的植物抗病信号途径下游存在着交叉。

本领域中，尽管已有研究表明NLRs与转录因子的互作直接调控ETI反应过程中防卫基因的表达，但具体的调控机制和参与的转录因子还知之甚少。

发明内容

本发明的目的在于提供增强植物广谱抗病性的转录因子及应用。

在本发明的第一方面，提供提高植物的抗病能力或制备抗病能力提高的植物的方法，包括：(a)促进PIBP1的表达或在细胞核中的定位或积累；(b)促进PIBP1与其下游基因的相互作用(结合)，从而提高下游基因的表达，所述下游基因包括：WAK14，PAL1；或(c)促进PIBP1与NLR蛋白的相互作用(结合)，从而提高NLR蛋白介导的抗病能力，所述的NLR蛋白包括：PigmR，Pizt；其中，所述PIBP1包括其同源物，所述同源物包括(但不限于)：Os06g02240。

在一个优选例中，所述的方法包括：重组表达(或过表达)PIBP1，以提高PIBP1的表达水平或促进其在细胞核中的定位或积累；将PIBP1与核定位信号分子(NLS)相连接(包括：重组表达PIBP1与NLS相连接的分子)，以促进PIBP1在细胞核中的定位或积累。促进NLR蛋白与PIBP1的相互作用(结合)，以促进PIBP1在细胞核中的定位或积累；重组表达(或过表达)PIBP1和/或其下游基因，以促进PIBP1与其下游基因的相互作用；或重组表达(或过表达)PIBP1和/或NLR蛋白，以促进PIBP1与NLR蛋白的相互作用。

在另一优选例中，所述的促进PIBP1与其下游基因的相互作用是：促进PIBP1与其下游基因的启动子的相互作用(结合)，从而提高下游基因的表达。

在另一优选例中，通过包括但不限于农杆菌法的方法制备抗病能力提高的植物。

在本发明的另一方面，提供PIBP1的用途，用于提高植物的抗病能力或制备抗病能力提高的植物；其中，所述PIBP1包括其同源物，所述同源物包括(但不限于)：Os06g02240。

在本发明的另一方面，提供一种PIBP1的衍生物，其是PIBP1与核定位信号分子(NLS)相连接的分子；较佳地其是融合蛋白、融合基因或携带该融合基因的表达载体；其中，所述PIBP1包括其同源物，所述同源物包括(但不限于)：Os06g02240。

在一个优选例中，所述的核定位信号分子包括由ATGCCTAAGAAGAAGAGAAAGGTTGGAGGA(SEQ ID NO:2)或其简并体编码的核定位信号分子。

在本发明的另一方面，提供分离的PIBP1的生物活性片段，其包含对应于PIBP1蛋白序列中第270-279位氨基酸，特别是第275位氨基酸的片段；较佳地，所述的包含对应于PIBP1蛋白序列中第270-279位氨基酸的片段包括(但不限于)：对应于PIBP1蛋白第75-284位的片段，对应于PIBP1蛋白第1-279位的片段；其中，所述PIBP1包括其同源物，所述同源物包括(但不限于)：Os06g02240。

在本发明的另一方面，提供分离的蛋白复合体，其包括：PIBP1，以及NLR蛋白，两者相互作用(结合)；其中，所述的NLR蛋白包括：PigmR，Pizt；其中，所述PIBP1包括其同源物，所述同源物包括(但不限于)：Os06g02240。

在本发明的另一方面，提供分离的蛋白-核酸复合体，其包括：PIBP1，以及PIBP1的下游基因；两者相互作用(结合)；其中，所述下游基因包括：WAK14，PAL1；其中，所述PIBP1包括其同源物，所述同源物包括(但不限于)：Os06g02240；较佳地，所述复合体中，PIBP1结合于其下游基因的启动子区。

在本发明的另一方面，提供所述的复合体的用途，用于作为调控植物的抗病能力的靶点，制备抗病能力增强(提高)的植物；或用于作为筛选靶点，筛选提高植物抗病能力的潜在物质。

在本发明的另一方面，提供一种定向选择抗病能力增强(提高)的植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物体内所述的复合体，若该测试植物中所述复合体的相互作用高于(显著高于)该类(或该种)植物中该复合体相互作用的平均值，则其为(潜在地为)抗病能力增强(提高)的植物；或鉴定植物细胞内PIBP1在细胞中的表达或在细胞核中的定位或积累，若其表达高于(显著高于)该类(或该种)植物中该PIBP1的平均值，或其在细胞核中的定位或积累高于(显著高于)该类(或该种)植物的平均值，则其为(潜在地为)抗病能力增强(提高)的植物。

在本发明的另一方面，提供一种筛选提高植物抗病能力的调节剂的方法，所述方法包括：(1)将候选物质加入到包含所述的复合体的体系中；(2)观测所述复合体中PIBP1与NLR蛋白的相互作用，或PIBP1与其下游基因启动子区的相互作用；其中，若所述候选物质促进(较佳地是统计学上促进；如促进20％以上，较佳地促进50％以上，更佳地促进80％以上)复合体中PIBP1与NLR蛋白的相互作用，或PIBP1与其下游基因启动子区的相互作用，则表明该候选物质是提高植物抗病能力的调节剂；其中，所述PIBP1包括其同源物，所述同源物包括(但不限于)：Os06g02240。

在本发明的另一方面，提供一种筛选提高植物抗病能力的调节剂的方法，所述方法包括：(1)将候选物质加入到包含PIBP1的体系中；(2)观测所述体系中PIBP1的表达或活性；其中，若所述候选物质促进(较佳地是统计学上促进；如促进20％以上，较佳地促进50％以上，更佳地促进80％以上)PIBP1的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物抗病能力的调节剂；其中，所述PIBP1包括其同源物，所述同源物包括(但不限于)：Os06g02240。

在一个优选例中，还包括设置对照组与测试组，以观测候选物质在测试组与对照组中的区别。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对所述PIBP1或其同源物、PIBP1或其同源物的下游基因、NLR蛋白，或它们上游或下游蛋白设计的上调剂、激动剂、干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物(如激素)等。

在另一优选例中，所述的体系选自：植物细胞体系(细胞培养物体系)、植物亚细胞体系、溶液体系、植物组织体系、植物器官体系。

在另一优选例中，所述方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或转基因试验，以从候选物质中进一步确定在提高植物抗病能力方面效果优异的物质。

在另一优选例中，以上方法、用途或复合体中，所述的PIBP1，还包括其衍生物、变体或生物活性片段；较佳地，所述的生物活性片段为包含对应PIBP1蛋白序列中第270-279位氨基酸，特别是第275位氨基酸的片段；较佳地，所述的衍生物是PIBP1与NLS相连接的分子，或能表达所述分子的构建体(如表达质粒)；较佳地，所述变体包括与PIBP1序列同源性高于80％(更佳地高于85％，高于90％，高于95％，高于98％或高于99％)、但对应PIBP1蛋白序列中第270-279位氨基酸，特别是第275位氨基酸保持保守的变体。

在另一优选例中，所述的包含对应PIBP1蛋白序列中第270-279位氨基酸的片段包括(但不限于)：PIBP1第75-284位的片段，PIBP1第1-279位的片段。

在另一优选例中，以上方法、用途或复合体等技术方案中，所述的抗病能力包括：抵抗真菌病害的能力；较佳地包括：抵抗稻瘟病菌的能力。

在另一优选例中，以上方法、用途或复合体等技术方案中，所述的NLR蛋白(PigmR或Pizt)包括其同源物，或它们的衍生物、变体或生物活性片段；较佳地，所述的生物活性片段为包含对应NLR蛋白或其同源物序列中卷曲螺旋(coiled-coil，CC)结构域氨基酸(如PigmR中第1-187位)的片段；较佳地，所述变体是与NLR蛋白或其同源物序列同源性高于80％(更佳地高于85％，高于90％，高于95％，高于98％或高于99％)、但对应NLR蛋白或其同源物序列中卷曲螺旋结构域保持保守的变体。

在另一优选例中，以上方法、用途或复合体等技术方案中，所述的植物包括禾本科植物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、PigmR与PIBP1互作并依赖于其CC结构域。

(A)酵母双杂交实验显示PigmR通过其CC结构域与PIBP1互作。PigmR蛋白结构示意图。CC，螺旋-螺旋结构域；NBS，核酸结合序列；LRR,富含亮氨酸重复序列。BD，蛋白结合结构域融合蛋白；AD，蛋白激活结构域融合蛋白；EV，空载；SD/-L-T-H，缺少亮氨酸、色氨酸、组氨酸的基本培养基；SD/-L-T，缺少亮氨酸和色氨酸的基本培养基；3AT，3-氨基三唑.

(B)双分子荧光素互补实验在烟草中验证PigmR和PIBP1的互作。蓝色至红色代表互作荧光由弱到强。

(C)利用双分子荧光互补实验在水稻原生质体中验证PigmR-CC和PIBP1的互作。nVenus和cCFP空载及cCFP-PigmR-NBS作为阴性对照。NLS-RFP融合蛋白作为细胞核的标记蛋白。标尺，5μm。

(D)在Nipponbare背景下的转基因植株PigmR-7Myc-6His和PIBP1-GFP中，通过免疫共沉淀验证两者互作。融合蛋白分别使用GFP和Myc抗体进行免疫印迹杂交。

(E)体外pulls down实验验证GST-PigmR-CC和His-PIBP1的互作。融合蛋白分别使用GST和His抗体进行免疫印迹杂交。

图2、PIBP1正调控PigmR和Pizt介导的抗病性。

(A)稻瘟病(小种TH12)接种7天后，NIL-Pigm、PIBP1-RNAi/NIL-Pigm和PIBP1-OE/NIL-Pigm代表性株系的发病表型。Nipponbare作为感病对照标尺，1cm。

稻瘟病侵染叶片7天后的病斑面积。图中的数值代表侵染面积占整张叶片的比例。统计叶片数n＝15。稻瘟病菌的生长量。通过qRT-PCR以水稻ACTIN1为内参对接种叶片真菌28S rDNA进行计算。

(B)酵母双杂交检测PIBP1与Pish，Pid3，Pi9和Pizt的CC结构域的互作。EV，空载。

(C)荧光素双分子互补实验在烟草中验证PIBP1/Pizt-CC和PIBP1/Pi9-CC的互作。PigmR-NBS作为阴性对照。蓝色至红色代表互作强度由弱到强。

(D)PIBP1-KO/Pizt株系接种无毒小种CH97，7天后的表型分析。量取的病斑长度和稻瘟病菌的生长量分析。稻瘟病的生长量通过qRT-PCR以水稻ACTIN1为内参对接种叶片真菌28S rDNA进行计算获得。标尺，1cm.

图3、PIBP1具有PigmR依赖性的细胞核蛋白累积。

(A)PIBP1-YFP在NIL-Pigm和Nipponbare原生质体中的亚细胞定位分析。NLS-RFP(RFP)指示细胞核定位。右侧显示不同亚细胞定位形式的细胞所占的比例。标尺，5μm。

(B)稳定转基因PIBP1-GFP/Nipponbare和PIBP1-GFP/NIL-Pigm根尖中PIBP1-GFP的亚细胞定位。被放大的方形图片突出显示细胞核部分。DAPI染色指示细胞核的位置。右侧显示不同亚细胞定位形式的细胞所占的比例。标尺，10μm。

(C)PIBP1-GFP/Nipponbare和PIBP1-GFP/NIL-Pigm转基因水稻中，PIBP1-GFP的细胞核蛋白组分分析。Histone H3作为细胞核的标记蛋白，PEPC作为细胞质的标记蛋白。Actin用作总蛋白上样量对照。

(D)在Nipponbare原生质体中，PigmR-CC-CFP促进PIBP1蛋白的细胞核累积。CFP作为阴性对照。箭头指示细胞核的位置。标尺，5μm。

(E)NIL-Pigm原生质体中，PIBP1^S275A和PIBP1亚细胞定位分析。RFP信号指示细胞核的位置。标尺，5μm。

(F)PIBP1-YFP蛋白信号在细胞核中的分布。I_N，细胞核信号强度；I_T，总信号强度。星号代表显著性差异，Student’s t test(**p<0.01)。数据采集于15个观测细胞。

(G)对NIL-Pigm原生质体中表达的PIBP1-YFP或PIBP1^S275A-YFP的细胞核蛋白组分进行分析，以共表达的YFP作为对照。PEPC作为细胞质标记蛋白显示所提取的细胞核蛋白没有细胞质的污染，Histone H3作为细胞核的标记蛋白。星号显示PIBP1-YFP目的蛋白。

(H)PIBP1-YFP和PIBP1^S275A-YFP在NIL-Pigm原生质体中细胞核蛋白丰度分析。统计结果由三次独立实验计算所得。

图4、细胞核定位的PIBP1与其抗病性相关。

(A)NLS-PIBP1-GFP/Nipponbare转基因根尖中的PIBP1具有细胞核定位。DAPI染色指示细胞核的位置。标尺，10μm。

(B)稻瘟病(小种TH12)接种7天后，Nipponbare、PIBP1-GFP/Nipponbare和NLS-PIBP1-GFP/Nipponbare代表性株系的发病表型。NIL-Pigm作为抗病对照。标尺，1cm。稻瘟病侵染叶片7天后的病斑长度统计。统计叶片数n＝15。稻瘟病菌的生长量。通过qRT-PCR以水稻ACTIN1为内参对接种叶片真菌28S rDNA进行计算。小写字母代表显著性差异(p<0.05)。

(C)PIBP1与PigmS在酵母中不能不互作。PIBP1/PigmR作为阳性对照。

(D)35S::PigmS/NIL-Pigm原生质体中PIBP1-YFP的细胞核定位减少。右侧显示PIBP1的细胞核定位比例，由超过100个细胞计算获得。箭头指示细胞核的位置。叶绿体的位置由自发荧光光显示(Chl)。标尺，5μm。

图5、PIBP1特异性结合富含AT碱基核酸序列并具有转录激活活性。

(A)PIBP1对DNA基序(M1to M4)的结合特异性分析。不同的标记探针分别与His-PIBP1孵育结合，相应的100倍的非标记双链DNA或单链DNA探针用于竞争结合实验。图中箭头指示游离探针或DNA-蛋白复合物。

(B)His-PIBP1对四种不同的DNA基序的相对结合活力分析。图下数字表示不同DNA基序的相对结合比率。

(C)PIBP1对DNA基序(M2和M4)不同突变类型的探针结合能力分析。突变后的碱基序列标为红色。

(D)PIBP1不同蛋白结构域对DNA结合能力的影响。EMSA显示RRM结构域不具有DNA结合活性。

(E)PIBP1在酵母体内具有转录激活活性，并且依赖于其RRM结构域。BD，GAL4DNA结合结构域；CDS，蛋白编码序列；Δ，缺失相应氨基酸。空载(EV)作为阴性对照。

图6、PIBP1直接结合并激活下游抗病基因OsWAK14和OsPAL1。

(A)EMSA验证His-PIBP1可以结合OsWAK14富含AT碱基的启动子区P1和P2。His蛋白作为阴性对照。TSS，转录起始位点。

(B)在转基因PIBP1-OE/NIL-Pigm中，通过ChIP-qPCR验证PIBP1-GFP可以在水稻体内结合OsWAK14启动子区。NIL-Pigm作为阴性对照。小写字母代表显著性差异(p<0.05)。

(C)NLS-PIBP1在烟草中激活OsWAK14的表达。LUC的相对活性根据内参REN的信号计算得到。

(D)稻瘟病菌YN2接种后，OsWAK14在Nipponbare和NIL-Pigm中的诱导表达。两周的水稻幼苗在喷雾接种后，不同的时间点收集样品用于基因表达分析。水稻ACTIN1用作内参。

(E)稻瘟病菌TH12接种后，OsWAK14在PIBP1-RNAi/NIL-Pigm、PIBP1-OE/NIL-Pigm和NIL-Pigm的基因表达量分析。

(F)稻瘟病(小种TH12)接种7天后，NIL-Pigm、OsWAK14-KO-1和OsWAK14-KO-9代表性株系的发病表型。Nipponbare作为感病对照。标尺，1cm。

(G)EMSA验证His-PIBP1可以结合OsPAL1富含AT碱基的启动子区P1和P2。His蛋白作为阴性对照。TSS，转录起始位点。

(H)在转基因PIBP1-OE/NIL-Pigm中，通过ChIP-qPCR验证PIBP1-GFP可以在水稻体内结合OsPAL1启动子区。NIL-Pigm作为阴性对照。

(I)NLS-PIBP1在烟草中激活OsWAK14的表达。LUC的相对活性根据内参REN的信号计算得到。小写字母代表显著性差异(p<0.05)。

(J)稻瘟病菌(TH12)接种后36h，OsPAL1在NIL-Pigm、PIBP1-RNAi/NIL-Pigm和PIBP1-OE/NIL-Pigm中的基因表达分析。

水稻ACTIN1作为内参对照(D、E和J)。星号代表显著性差异(Student’s t test，*p<0.05，**p<0.01)。

图7、PIBP1同源基因Os06g02240作为转录因子参与调控PigmR介导的稻瘟病抗性。

(A)EMSA分析PIBP1同源蛋白对富含AT碱基DNA序列(M2，upper；M4，down)的结合活性。

(B)酵母中PIBP1同源基因转录激活活性分析，显示仅Os06g02240具有转录激活活性。EV，空载，用作阴性对照。

(C)PigmR-CC和PIBP1同源基因Os06g02240在酵母中特异性互作。PIBP1作为阳性对照。EV，空载，作为阴性对照。

(D)烟草中荧光素双分子互补实验验证Os06g02240和PigmR-CC的互作。蓝色至红色代表互作强度由弱至强。

(C)酵母双杂交验证Os06g02240和Pi9及Pizt的CC结构域互作，与Pish及Pid3的CC结构域不互作。

(D)烟草中荧光素双分子互补实验验证Os06g02240/Pi9-CC及Os06g02240/Pizt-CC的互作。蓝色至红色代表互作强度由弱至强。

(E)EMSA验证His-Os06g02240可以结合OsWAK14和OsPAL1富含AT碱基的启动子区P1和P2。

(F)NLS-Os06g02240在烟草中激活OsWAK14和OsPAL1的表达。LUC的相对活性根据内参REN的信号计算得到。星号代表具有显著性差异(Student’s t test，**p<0.01)。

(G)稻瘟病菌(TH12)接种Os06g02240-KO/NIL-Pigm、(PIBP1/Os06g02240)-KO/NIL-Pigm两个独立的株系7天后的发病表型。标尺，1cm。稻瘟病侵染叶片病斑长度统计。统计叶片数n＝15。稻瘟病菌的生长量。通过qRT-PCR以水稻ACTIN1为内参对接种叶片真菌28SrDNA进行计算。小写字母代表显著性差异(p<0.05)。

图8、PIBP1同源基因及PIBP1-PigmR互作分析。

(A)PigmR-7Myc-6His/Nipponbare转基因具有稻瘟病抗性。图中显示两个独

立的Pigm-7Myc-6His/Nipponbare转基因株系(#6和#7)对稻瘟病的抗性。

(B)图中显示Pigm-7Myc-6His/Nipponbare转基因株系的蛋白鉴定，Nipponbare和NIL-Pigm作为蛋白阴性对照。蛋白分子量(kDa)在图中标识。标尺，1cm。

(C)使用MegAlign软件对PIBP1和同源基因(Sobic.001G115300.1.p，Gh_D12G1546，AT1G67950.3，Traes_4BS_929BB66A2)蛋白序列的比对分析。

(D)使用Mega 6软件对水稻、高粱、小麦、棉花中PIBP1的同源基因进行进化树分析。

(E)酵母双杂交实验中不同截断形式的PIBP1蛋白示意图。蓝色代表互作，灰色代表没有互作，白线代表氨基酸突变位置。

(F)借助酵母双杂交系统检测不同截断和点突形式的PIBP1蛋白(PIBP1^S275A和PIBP1^{E274A/D277A/E278A})和PigmR-CC的互作(如图A所示)，结果显示PIBP1与PigmR-CC的互作依赖于其275位的丝氨酸。

(G)PIBP1^S275A在酵母中蛋白表达检测。PIBP1^3A(全长PIBP1)作为阳性对照，融合蛋白BD-PigmR-CC，AD-，PIBP1^S275A，PIBP1^3A，分别使用Gal4-BD和Gal4-AD抗体进行免疫印记杂交。星号代表相应的目的蛋白。

图9、PIBP1影响PigmR和Pizt的抗病性，但对Pish的功能没有影响。

(A)qRT-PCR鉴定PIBP1在PIBP1-RNAi/NIL-Pigm(独立株系#1和#3)，PIBP1-OE/NIL-Pigm(独立株系#7和#8)转基因水稻中RNA的表达量，以野生型NIL-Pigm为对照。

(B)不同的PIBP1过表达转基因植株中PIBP1-GFP和NLS-PIBP1-GFP蛋白水平鉴定。使用GFP抗体进行免疫印记杂交实验，Actin作为蛋白上样量对照。

(C)qRT-PCR鉴定PigmR在PIBP1-RNAi/NIL-Pigm(独立株系#1和#3)，PIBP1-OE/NIL-Pigm(独立株系#7和#8)转基因中的表达量，以野生型NIL-Pigm为对照。

(D)NIL-Pigm背景下PIBP1基因敲除株系的代表类型。

(E)Nipponbare，NIL-Pigm和PIBP1-KO/NIL-Pigm株系接种稻瘟病菌TH12 7天后的表型分析。

(F)稻瘟病侵染叶片7天后的病斑面积。图中的数值代表侵染面积占整张叶片的比例。统计叶片数n＝15。

(G)PIBP1与Pish在酵母中没有互作。

(H)PIBP1和Pish在酵母中的蛋白表达。融合蛋白pGADT7-，PIBP1，Pish(左栏)，融合蛋白pGBKT7-，Pish，PIBP1(右栏)，分别使用HA和Myc抗体进行免疫印记杂交。星号代表相应的目的蛋白。

(I)qRT-PCR对PIBP1在野生型Nipponbare，PIBP1-RNAi/Nipponbare和PIBP1-OE/Nipponbare中基因表达量进行检测。

(J)对Nipponbare，PIBP1-RNAi/Nipponbare和PIBP1-OE/Nipponbare株系接种稻瘟病无毒小种YN2 7天后的表型。

(K)PIBP1与Pid3在酵母中不能互作。

(L)酵母中蛋白表达检测。上栏(AD)，pDEST22-PIBP1，使用GAL4-AD抗体检测；中间栏(BD)，pDEST32-Pizt-CC(泳道1)，-Pi9-CC(泳道2)，-Pid3-CC(泳道3)，-Pid3(泳道4)，使用GAL4-BD抗体进行检测。丽春红染色作为蛋白上样量对照。星号代表目的蛋白。

(M)PigmR和其他NLRs的CC结构域的蛋白比对，保守氨基酸位点由黑色标出。

(N)ZH11(Pizt)背景下PIBP1基因敲除株系的代表类型示意图。

图10、PIBP1的表达模式和亚细胞定位分析。

(A)qRT-PCR分析PIBP1的组织特异性表达模式。L1，两周幼苗的叶；L2，四周苗的叶；LS1，两周幼苗的叶鞘；LS2，四周苗的叶鞘；R1，两周幼苗的根；R2，四周苗的根；P1，幼穗；P2，正在抽穗的穗.水稻ACTIN1作为内参。

(B)NIL-Pigm接种稻瘟病菌(TH12)不同时间点PIBP1的基因诱导表达分析，以接种水的苗子作为对照。水稻ACTIN1作为内参。星号代表显著性差异(Student’s t test，**p<0.01)。

(C)PIBP1-GFP在转基因植株PIBP1-GFP/Nipponbare根尖中的亚细胞定位。30％蔗糖溶液质壁分离前(上栏)后(下栏)，PIBP1的亚细胞定位。

(D)PIBP1-GFP在转基因PIBP1-GFP/NIL-Pigm和PIBP1-GFP/Nipponbare叶鞘中的亚细胞定位。叶绿体的定位由其自发荧光显示(Chl)。箭头指示细胞核的位置。图中右侧显示PIBP1-GFP在Nipponbare和NIL-Pigm背景下不同亚细胞定位的比例。标尺，5μm。

(E)PIBP1-YFP在Pizt(ZH11)和Pi9(Ky-Pi9)原生质体中的亚细胞定位。RFP荧光指示细胞核的位置。标尺，5μm。

(F)稻瘟病侵染后，PIBP1在PIBP1-GFP/NIL-Pigm和PIBP1-GFP/Nipponbare叶鞘细胞中的亚细胞定位没有发生改变。(TH12和YN2均是NIL-Pigm无毒小种；TH12是Nipponbare的无毒小种，YN2是Nipponbare的无毒小种；水处理作为对照)。箭头指示稻瘟病菌的侵染位置。标尺，10μm。

(G)Nipponbare原生质体中PigmR-YFP，PigmR-CC-YFP和PigmS-YFP的亚细胞定位。叶绿体定位由其自发荧光显示(Chl)。标尺，5μm。

(H)Pizt-CC和Pi9-CC促进PIBP1蛋白的细胞核累积。Pizt-CC-CFP或Pi9-CC-CFP分别和PIBP1-YFP共同转化Nipponbare原生质体。箭头指示细胞核的位置。图中显示PIBP1-YFP具有细胞核定位细胞所占转化细胞的比例。标尺，5μm。

图11、PigmS-CC可以与PIBP1互作。

(A)对转基因植株PIBP1-OE/Nipponbare和NLS-PIBP1-OE/Nipponbare的细胞核蛋白组分分析。PEPC作为细胞质标记蛋白，Histone H3作为细胞核的标记蛋白。Actin作为总蛋白的上样量对照。

(B)PIBP1与PigmS-CC在酵母中互作。

(C)NIL-Pigm和35S::PigmS/NIL-Pigm中PigmR和PigmS的基因表达量分析。以水稻ACTIN1作为内参对照。

图12、PIBP1的核酸结合活性及自身互作验证。

(A)PIBP1的体外核酸结合活性分析。相应的的融合蛋白分别与poly(U)、DNA和单链DNA(ssDNA)进行孵育。星号代表目的蛋白。

(B)考马斯亮蓝染色检测外源纯化的His、His-PIBP1和His-PIBP1^Δ5-74蛋白。纯化蛋白的浓度根据BSA的浓度梯度计算。星号显示目的蛋白。MALDI-TOF鉴定分析蛋白条带1-6所对应的蛋白。

(C)外源纯化后不同的PIBP1产物(对应图A)经MALDI-TOF鉴定分析，显示相应蛋白所含有的PIBP1蛋白的片段。蓝色代表鉴定到的蛋白片段对应PIBP1蛋白的位置。

(D)RNA EMSA。His-PIBP1或His-PIBP1^Δ5-74分别与稻瘟病菌(TH12)处理或水处理后的生物素标记的总RNA进行孵育结合，没有生物素标记的相对应RNA(100倍)用于冷探针竞争实验。His蛋白作为阴性性对照。游离探针和RNA-蛋白复合物的位置在图中标记显示。

(E)EMSA验证ChIP-seq鉴定的可以与PIBP1结合的DNA区段。Cy5标记的探针分别与His-PIBP1孵育结合。相应的100倍的非标记探针用于竞争结合实验。图中箭头表示游离探针或DNA迁移条带。

(F)His-PIBP1对DNA基序2和4的结合具有明显的浓度依赖性。His蛋白作为阴性对照。FP，未加蛋白。

(G)考马斯亮蓝染色检测外源纯化蛋白His、His-PIBP1-RRM、His-PIBP1and His-PIBP1^Δ5-74。蛋白浓度由不同浓度梯度的BSA显示。星号指示目的蛋白。

(H)酵母双杂交验证PIBP1的自身互作。EV，空载。

(I)PIBP1在植物体内的互作。烟草中荧光素双分子荧光互补实验验证PIBP1的自身互作。蓝色至红色代表互作强度由弱变强。

(J)水稻原生质体中双分子荧光互补实验验证PIBP1的自身互作。未融合蛋白的nVenus和CFP空载及PigmR-NBS作为阴性对照。叶绿体的位置由自发荧光光显示(Chl)。标尺，5μm。

图13、PIBP1直接调控OsWAK14和OsPAL1的表达。

(A)EMSA验证His-PIBP1不能与缺乏AT碱基的OsWAK14的启动子区段P3结合。His蛋白作为阴性对照。

(B)YFP、PIBP1-YFP和NLS-PIBP1-YFP在烟草中的亚细胞定位。HTR4-YFP作为细胞核的标记蛋白。图中放大部分显示烟草中细胞核的定位。标尺，10μm。

(C)转录激活实验中，效应子和报告基因的载体示意图。

(E)NIL-Pigm中OsWAK14基因不同敲除株系(OsWAK14-KO-1and OsWAK14-KO-9)的突变类型示意图。

(F)稻瘟病菌TH12接种后，OsPAL1在Nipponbare和NIL-Pigm中的诱导表达。

图14、PIBP1的同源基因Os06g02240作为转录因子参与调控水稻的稻瘟病抗性。

(A)PIBP1和同源基因Os04g53330，Os06g02240及Os11g34680的蛋白序列比对分析。序列保守性的RRM区由红线标出。

(B)PIBP1三个同源基因在NIL-Pigm原生质体中的亚细胞定位。NLS-RFP作为细胞核的标记蛋白。标尺，5μm。

(C)考马斯亮蓝染色检测外源表达的PIBP1同源蛋白。星号指示目的蛋白。外源纯化蛋白的浓度由BSA的浓度梯度标识。

(D)酵母中PIBP1同源基因的自身互作鉴定，显示仅Os06g02240具有自身互作的能力。

(E)烟草中荧光素双分子互补实验验证Os06g02240在植物体内的自身互作。PigmR-NBS作为阴性对照。蓝色至红色代表互作强度由弱至强。

(F)借助酵母双杂交系统检测不同截断形式的Os06g02240蛋白和PigmR-CC的互作，结果显示Os06g02240与PigmR-CC的互作依赖于其C端结构域。

(G)酵母双杂交实验中不同截断形式的Os06g02240蛋白示意图。蓝色代表互作，灰色代表没有互作，红色代表RRM。

(H)酵母双杂交验证Os06g02240和Pi9及Pizt的CC结构域互作，与Pish及Pid3的CC结构域不互作。

(I)烟草中荧光素双分子互补实验验证Os06g02240/Pi9-CC及Os06g02240/Pizt-CC的互作。PigmR-NBS作为阴性对照。蓝色至红色代表互作强度由弱至强。

(J)Os06g02240-KO/NIL-Pigm和(PIBP1/Os06g02240)-KO/NIL-Pigm转基因突变类型示意图。分别选取两个独立的转基因株系用于病原菌接种分析。

(K)PIBP1转录因子家族调控水稻稻瘟病抗性的机制模型。PIBP1通过与广谱抗病PigmR/NLRs的直接互作促进自身细胞核蛋白的累积。细胞核定位的PIBP1s作为一类非典型性的转录因子可以结合在区富含AT碱基的抗病基因OsWAK14和OsPAL1的启动子区域。以某种未知的机制，响应病原菌侵染的诱导，激活下游防卫基因的表达，赋予水稻抗病性。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了PIBP1及其同源物(同源基因Os06g02240)作为一类新的转录因子，通过与广谱抗病R基因(pigmR)直接互作，促进自身细胞核蛋白的累积，从而激活下游免疫基因的表达的全新机制。同时，将广谱免疫受体NLR介导的病原菌识别与免疫转录激活直接联系在一起。本发明的技术方案不仅提供了切实有效的植物改良方法，也为植物广谱免疫机制研究和植物抗病育种提供了新的视角和手段。

基因、多肽及植物

如本文所用，所述的“植物”是存在本发明所主张的机制的植物，也即所述的植物中存在PIBP1或其同源物(如Os06g02240等)、其下游基因(如WAK14，PAL1)或它们的同源物、NLR蛋白(如PigmR，Pizt)或其同源物，且存在它们之间的相互作用机制。较佳地，所述的“植物”包括(但不仅限于)：禾本科植物，如禾本科稻属植物(如水稻)，禾本科小麦属植物(如小麦)，禾本科玉米属植物(如玉米)等。

本发明中，所述的PIBP1可以是具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽，所述的PigmR可以是具有GenBank登录号KU904633所示序列的多肽，所述的Pizt可以是具有GenBank登录号DQ352040所示序列的多肽，所述的WAK14可以是具有GenBank登录号AK241637所示序列的多肽，所述的PAL1可以是具有GenBank登录号AK102817所示序列的多肽。

本发明中还包括具有与上述PIBP1、PigmR、Pizt、WAK14、PAL1相同功能的序列变异形式，包括：变体、衍生物、片段、同源物。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(例如为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，进行1个氨基酸的取代。任何与所述的PIBP1、PigmR、Pizt、WAK14、PAL1同源性高(比如同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且保留相同功能/活性的蛋白也包括在本发明内。来源于水稻以外其它物种的与PIBP1、PigmR、Pizt、WAK14、PAL1多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中。

本发明中，还包括分离的PIBP1的生物活性片段，其包含对应于PIBP1蛋白序列中第270-279位氨基酸，经验证该区域是发挥蛋白之间相互作用的关键性区域，特别是第275位氨基酸的片段。较佳地，所述的包含对应于PIBP1蛋白序列中第270-279位氨基酸的片段包括但不限于：对应于PIBP1蛋白第75-284位的片段，对应于PIBP1蛋白第1-279位的片段。应理解，其它的蛋白片段也是可应用的，只要其包括了270-279位氨基酸，特别是第275位氨基酸。本发明也包括编码该生物活性片段的核酸分子以及携带该核酸分子的表达载体。所述的生物活性片段也可以应用于建立相互作用的体系，研究或观测其它调控物质对该种相互作用的影响作用。

本发明中，还包括PIBP1与NLS相连接的分子，较佳地其是融合蛋白或融合基因。也包括了携带该融合基因的表达载体。PIBP1与NLS相连接的分子可被重组表达于细胞中，从而增加PIBP1在核内的聚集作用。

应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种的上述蛋白或基因、它们之间的相互作用及其机制，但是其它物种中也有基于这些多肽及其相互作用的机制，因此本发明中，其它物种的相应调控机制及参与这一调控的多肽也在本发明考虑的范围之内。

改良植物的方法及应用

本发明揭示了PIBP1及其同源物作为一类新的转录因子，通过与pigmR直接互作，促进自身细胞核蛋白的累积，从而激活下游免疫基因的表达的全新机制，这一分子机制在理论研究和植物改良中具有重要的应用价值。

NLR(Nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat)类蛋白在植物免疫调控中扮演着重要角色。但是，其所介导的免疫激活和抗病信号转导机制还不清楚。本发明人之前定位到稻瘟病抗性基因簇Pigm，其编码多个CC(coiled-coil)类型的NLRs，其中同源多聚化的PigmR具有广谱抗病功能。PigmS可以通过与PigmR竞争形成异源多聚体抑制PigmR的抗病性，从而维持水稻产量与抗病性的平衡。为了解析PigmR的广谱抗病机制，本发明人通过酵母筛库找到了一系列PigmR的互作蛋白(PigmR-Interacting and BlastResistance Protein，PIBPs)。本发明中，以水稻位研究对象，发现含具有RRM(RNA-recognition motif)结构域的PIBP1能与PigmR及广谱抗病R基因Pizt和Pi9特异性互作，但与小种专化抗性R基因Pish和Pid3不互作。PIBP1转基因株系的病原菌接种结果表明，PIBP1正调控PigmR和Pizt的抗病性，但对Pish的抗病功能没有贡献。借助水稻原生质体及转基因株系对PIBP1的亚细胞定位研究发现，PigmR和其他广谱抗病NLRs(Pizt和Pi9)可以明显促进PIBP1在细胞核中的累积，而且细胞核定位的PIBP1赋予水稻抗病性。同时，PigmR促进PIBP1细胞核蛋白累积的过程可以被其拮抗性受体PigmS所抑制，暗示了PigmS降低抗病性的可能机制。有意思的是，体外核酸结合实验表明PIBP1不但具有经典的RNA结合活性而且具有DNA结合活性。鉴于PIBP1的细胞核定位对于其抗病性至关重要，本发明人随后对其DNA结合活性展开了进一步分析。通过ChIP-Seq及EMSA，发现PIBP1可以结合富含碱基AT的DNA保守基序并且不依赖于RRM。同时，酵母单杂交实验验证了PIBP1具有依赖于RRM的转录激活活性和大部分转录因子的同源多聚化形式。这些结果暗示细胞核定位的PIBP1可能是一类新的转录因子。通过ChIP-Seq和RNA-Seq的关联分析，本发明人找到了一个PIBP1调控的下游抗病基因OsWAK14。EMSA和ChIP-qPCR验证了PIBP1可以与OsWAK14启动子结合；Dual-Luc证实了细胞核定位的PIBP1可以显著性激活OsWAK14的表达；Pigm位点可以显著提高水稻OsWAK14的RNA水平；转基因敲除OsWAK14显著降低PigmR的抗病性。通过同样的方法，本发明人还鉴定到PIBP1的另一个调控靶标OsPAL1。这表明PigmR通过促进PIBP1的细胞核累积进而调控OsWAK14和OsPAL1的表达从而影响水稻对稻瘟病的抗性。为了进一步研究PIBP1是否代表一类新的转录因子，本发明人对PIBP1同源蛋白的转录因子活性进行分析。发现Os06g02240具有：细胞核定位、富含AT基序的DNA结合活性、转录激活活性、同源多聚化的形式，同时还可以结合并激活OsWAK14和OsPAL1。有意思的是，与PIBP1相同，Os06g02240与PigmR、Pizt、Pi9存在特异性互作，和Pish、Pid3不互作。进一步病原菌接种分析发现，单独敲除Os06g02240显著降低PigmR的抗病性。有意思的是，PIBP1和Os06g02240双突变的材料比单基因的突变感病性更强，这暗示PIBP1和Os06g02240作为同种类型的转录因子参与调控广谱抗病R基因的免疫过程，并具有功能冗余。因此，本发明揭示了PIBP1及其同源基因Os06g02240作为一类新的转录因子，通过与广谱抗病R基因直接互作，促进自身细胞核蛋白的累积，从而激活下游免疫基因的表达的全新机制。同时，将广谱免疫受体NLR介导的病原菌识别与免疫转录激活直接联系在一起，为植物广谱免疫机制研究和水稻抗病育种提供了新的视角和手段。

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种通过调控本发明的机制，来提高植物的抗病能力的方法。

一种方式，可通过促进PIBP1在细胞核中的定位或积累来提高植物的抗病能力。更具体地，可通过包括但不限于以下的方式来进行：重组表达(或过表达)PIBP1，以提高PIBP1的表达水平或促进其在细胞核中的定位或积累；将PIBP1与NLS相连接(如重组表达PIBP1与NLS相连接的分子)，以促进PIBP1在细胞核中的定位或积累。作为核定位信号分子，NLS有助于PIBP1在细胞核中的聚集；或，促进NLR蛋白与PIBP1的相互作用(结合)，以促进PIBP1在细胞核中的定位或积累。

另一种方式，可通过促进PIBP1与其下游基因(如WAK14，PAL1)的相互作用(结合)，提高下游基因的表达，从而提高植物的抗病能力。例如但不限于，重组表达(或过表达)PIBP1和/或其下游基因，以促进PIBP1与其下游基因的相互作用。

另一种方式，可通过促进PIBP1与NLR蛋白(如PigmR，Pizt)的相互作用，从而提高NLR蛋白介导的抗病能力。例如但不限于，重组表达(或过表达)PIBP1和/或NLR蛋白，以促进PIBP1与NLR蛋白的相互作用。

可以采用本领域人员熟知的多种方法来上调或提高PIBP1、PIBP1和/或其下游基因、PIBP1和/或NLR蛋白的表达或活性，例如但不限于：将它们的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入植物中；或对它们进行功能获得性点突变；或利用强启动子增强它们的表达。

应理解，在得知了PIBP1的核定位特性、PIBP1与NLR蛋白的相互作用以及PIBP1与其下游基因之间的相互作用后，还可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节参与该机制及参与所述相互作用的各个基因/蛋白，以及它们的上下游基因/蛋白，以实现对植物抗病能力的调节。

筛选方法

在得知了本发明的分子机制以及参与该分子机制的基因或蛋白以后，可基于该新发现来筛选促进植物的抗病能力的物质。

本发明提供了一种筛选提高植物抗病能力的调节剂的方法，包括：(1)将候选物质加入到包含所述的复合体的体系中；(2)观测所述复合体中PIBP1与NLR蛋白的相互作用，或PIBP1与其下游基因启动子区的相互作用；其中，若所述候选物质促进复合体中PIBP1与NLR蛋白的相互作用，或PIBP1与其下游基因启动子区的相互作用，则表明该候选物质是提高植物抗病能力的调节剂。

本发明还提供了一种筛选提高植物抗病能力的调节剂的方法，包括：(1)将候选物质加入到包含PIBP1的体系中；(2)观测所述体系中PIBP1的表达或活性；其中，若所述候选物质促进PIBP1的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物抗病能力的调节剂。

以蛋白或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。

在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术(GST-Pull Down)、双分子荧光互补实验、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术等。

本发明还提供了定向选择抗病能力增强的植物的方法，所述方法包括：鉴定测试禾本科植物体内所述的复合体(PIBP1以及NLR蛋白复合体，或PIBP1以及PIBP1的下游基因的复合体)，若该测试植物中所述复合体的相互作用高于该类物中该复合体相互作用的平均值，则其为抗病能力增强的禾本科植物。植物中蛋白-蛋白之间、蛋白-核酸之间相互作用的平均值是本领域人员能够确定的，例如可以通过随机收集一定数量该种植物，利用本领域经典的方法来确定这种相互作用，根据统计学规则来确定这一平均值。

本发明还提供了定向选择抗病能力增强的禾本科植物的方法，所述方法包括：鉴定禾本科植物细胞内PIBP1在细胞中的表达或在细胞核中的定位或积累，若其表达高于该类植物中该PIBP1的表达平均值，或其在细胞核中的定位或积累高于该类植物细胞核定位的平均值，则其为抗病能力增强的禾本科植物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

1、植物材料、突变体建立、基因编辑及转基因植物的建立

水稻(Oryza sativa)品种：Nipponbare(NIP)，ZH11

水稻转基因植株均由相应载体转化野生型或近等基因系获得，具体参考试验方法。水稻材料每年两季，夏季种于上海松江农场，冬季种于海南陵水基地。

突变体及转基因植株构建

NIL-Pigm,35S::PigmS/NIL-Pigm：参照文章Deng,Y.,Zhai,K.,Xie,Z.,Yang,D.,Zhu,X.,Liu,J.,Wang,X,,Qin,P.,Yang,Y.,and Zhang,G.,et al.(2017).Epigeneticregulation of antagonistic receptors confers rice blast resistance with yieldbalance.Science 355,962-965。

PIBP1-RNAi/Nipponbare，PIBP1-RNAi/NIL-Pigm：本发明人选取PIBP1CDS上的160bp及3′UTR上的372bp作为目的片段，使用特异性引物PCR后，将目的片段插入RNAi载体PTCK303中。使用农杆菌EHA105分别转化Nipponbare和NIL-Pigm，获得相应的转基因植株。靶点DNA区段序列如下(SEQ ID NO:3)：

GGTAGACAGGGCCGAAGAGGAGAGGAAAGCGATCATGTGGGAAGAGAGGAATGGGCTTGTAAGTGATTATGCCAAGATCCATCTTGATGAACCCTCTTCATGGGAGCCTGCAGTTCTTCCGTTGGAATCTGTGGATGAGCAGAAGCTCCAGGCTGTGTGATCTGCACAATCCAATGGTGGTCGTTTCTCTGCACGTCATTCTTTTGTTCATGTCCAATATAGAAGATTGTTTTTCACCGCTGCACGGTAGCAAAAATATTGAGCTTATTGCCTATAGTATGATGTAAATTTTAGAAATTCCCCATGTGTTTTCTTCCAGCTTTGTTATAGACCACTGAAAGGCTTACTTGTTCAGTGTTAGACATGGAAATGAAAGTTGTTCCAGACTTCCAGGCATACCTCTTGTTATGGTAGAACATGTTTCTGTGAGTTATCTCAGAACTATTTGTGCTCTGATATTCTGAAGCTACATGTGTAAGGCCCAAATCTGGGAAATAATCAAGGTCAAAATGAAATGCAGACAATATTTCCT

PIBP1CRISPR/Cas9(PIBP1-KO/NIL-Pigm)，PIBP1-KO/Pizt：本发明人选取PIBP1CDS上特异性序列TTACATTTAAGGACTCACA(SEQ ID NO:4)作为靶点，参照以往的方法(Ma,X.,et al.(2015).A robust CRISPR/Cas9system for convenient,high-efficiencymultiplex genome editing in monocot and dicot plants.Mol.Plant 8,1274-1284)，以U6a作为启动子构建到CRISPR/Cas9的载体上。使用农杆菌EHA105分别转化NIL-Pigm和含有Pizt的水稻品种ZH11，获得相应的转基因植株。

pUBI::PIBP1-GFP(PIBP1-OE)/Nipponbare，pUBI::PIBP1-GFP(PIBP1-OE)/NIL-Pigm：本发明人将PIBP1的全长CDS经过特异性引物扩增后，连接到载体PUN1301-GFP中。使用农杆菌EHA105分别转化Nipponbare和NIL-Pigm，获得相应的转基因植株。

pUBI::NLS-PIBP1-GFP/Nipponbare：本发明人在PIBP1的全长CDS前加入NLS的核定位信号序列ATGCCTAAGAAGAAGAGAAAGGTTGGAGGA(SEQ ID NO:1)，然后连接到载体PUN1301-GFP中。使用农杆菌EHA105转化Nipponbare，获得相应的转基因植株。

pUBI::PigmR-7Myc-6His/Nipponbare：本发明人将PigmR的全长CDS经过特异性引物扩增后，连接到载体PUN1301-7Myc-6His中。使用农杆菌EHA105转化Nipponbare，获得相应的转基因植株。

OsWAK14-KO/NIL-Pigm：本发明人选取OsWAK14CDS上的特异性序列CTGCAGTCTACGGAGTTGG(SEQ ID NO:5)作为靶点，参照以往的方法(Ma et al.,2015)，以U6a作为启动子构建到CRISPR/Cas9的载体上。使用农杆菌EHA105转化NIL-Pigm，获得相应的转基因植株。

Os06g02240-KO/NIL-Pigm：本发明人选取Os06g02240 CDS上的特异性序列TGCAACTGTGCAAGACATTA(SEQ ID NO:6)作为靶点，参照以往的方法(Ma et al.,2015)，以U3作为启动子构建到CRISPR/Cas9的载体上。使用农杆菌EHA105转化NIL-Pigm，获得相应的转基因植株。

(PIBP1/Os06g02240)-KO/NIL-Pigm：本发明人选取PIBP1CDS上的特异性序列TTCATTGAATGCTTCAAAAA(SEQ ID NO:7)和Os06g02240 CDS上的特异性序列TGCAACTGTGCAAGACATTA(SEQ ID NO:8)作为靶点，参照以往的方法(Ma et al.,2015)，分别以U6a和U3作为启动子构建到CRISPR/Cas9的载体上。使用农杆菌EHA105转化NIL-Pigm，获得相应的转基因植株。

2、菌株与培养基

大肠杆菌菌株(Escherichia coli)：DH5α，Rosetta(DE3)(唯地，上海)。

农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)：EHA105(唯地，上海)，GV3101(唯地，上海)。

酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)：AH109，Y187(唯地，上海)。

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)：TH12，YN2，CH97为公共稻瘟病小种。

3、常用培养基

LB培养基(1L)：NaCl 10g，酵母提取物5g，Tryptone 10g，pH 7.0，固体需加入15g琼脂粉。

YPDA培养基(1L)：酵母提取物10g，Peptone 20g，葡萄糖20g，0.2％Adenine 15ml，固体需加入20g/L琼脂粉。

SOB液体培养基(1L)：Peptone 20g，酵母提取物5g，NaCl 0.5g，KCl，0.186g，pH7.0，使用前加入5ml 2M MgCl₂。

AB液体培养基(1L)：KH₂PO₄ 3g，NaH₂PO₄ 1g，NH₄Cl 1g，MgSO₄·7H₂O。

300mg，KCl 150mg，CaCl₂ 10mg；FeSO₄·7H₂O 2.5mg，Glucose 5g。

NBD培养基(1L)：NB Basal Medium(PhytoTech)4.1g，蔗糖30g，1ml 2,4-D溶液(1000×)，pH 5.8，固体需加入4.5g Phytagel。

MS水稻分化培养基(1L)：Murashige&Skoog Basal Medium with Vitamins(PhytoTech)4.43g，蔗糖30g，6-BA 3mg/L，NAA 0.5mg/L，pH 5.8，固体需加入4.5gPhytagel。

1/2MS水稻生根培养基(1L)：Murashige&Skoog Basal Medium with Vitamins(PhytoTech)2.215g，蔗糖20g，pH 5.8，固体需加入4.2g Phytagel。

4、稻瘟菌接种

将不同的稻瘟病小种进行活化，25℃培养大约10天左右，用灭菌水冲洗培养基，洗下孢子液。用40um滤膜过滤后，检测孢子浓度，调至1×10⁵孢子/ml。

田间接种稻瘟病：

水稻生长约4周，具有3-6个分蘖，但没有抽穗的植株。用注射器刺入未抽出新叶的叶鞘下方约2-3cm处，注射孢子液，至液体从新叶中心涌出。7-10天后观察表型。

离体叶片接种：

取4周的幼苗叶片，剪取约5-8cm，两端注意保湿，防止叶片失水。注射器针头轻轻划破叶片表层。滴孢子液至伤口处，注意保湿保温，5-7天后观察表型。

喷雾接种：

生长10-14天的幼苗，使用喷雾器将孢子液均匀喷洒于叶片上。25℃培养箱中24h黑暗培养，随后12h-光/12h-黑暗，注意保温保湿。培养5-10天，观察表性。

稻瘟病的生长量统计参照以下方法：取一定量的稻瘟病侵染的水稻叶片，在液氮中磨碎。加入400ul的提取缓冲液，震荡混匀。加入400ul/氯仿(1:1，pH＝8.0)后，剧烈震荡10min。14,000rpm离心5min，将上清转移至新管中。加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀5-10min。14,000rpm离心5min，去除上清。加入1ml 70％的乙醇清洗沉淀，7500rpm，5min，去除上清，室温干燥。加入40ul的ddH₂O或TE溶液(含有10μg/ml RNase)溶解沉淀。按照Real-time PCR的检测方法，检测稻瘟病菌DNA的相对含量。

5、RNA体外结合实验

1.分别取25mg poly(U)-agarose，dsDNA-agarose和ssDNA-agarose在2mL ddH₂O中重悬，并用Binding buffer清洗两遍。

2.向100ul agarose悬浮液中分别加入5μg HIS-PIBP1，4℃旋转孵育1h。

3.孵育结束后，加入1ml Wash buffer，清洗3-5次。最后一次，吸尽上清。

4.沉淀中加入50-100μl蛋白上样缓冲液。沸水浴5min。SDS-PAGE检测蛋白。

Binding buffer:50mM Tris-HCl(pH 7.5)，50mM NaCl。

Wash buffer:50mM Tris-HCl(pH 7.5)，50mM NaCl，0.5％Nonidet P-40。

6、转录激活实验

酵母转录激活实验

将目的基因构建到pDEST32(Invitrogen)载体上，使融合DNA结合结构域。酵母转化参照上述方法，将转化后的单克隆分别点板于亮氨酸单缺陷型培养基，亮氨酸、组氨酸双缺陷培养基。28℃培养3天，观察菌落生长。

烟草中双荧光素酶报道系统检测转录激活

将含有目的质粒的农杆菌按照一定比例混后，参照上述方法，进行烟草注射，瞬时表达目的蛋白。按照Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)的方法进行测定Ren和Luciferase的荧光值。

实施例1、PigmR互作蛋白PIBP1的筛选与分析

本发明人通过图位克隆，鉴定到一个广谱持久抗瘟性新位点Pigm。Pigm是一个编码多个NBS-LRR类抗病基因的基因簇，其中编码的功能蛋白PigmR具有广谱抗病性。为了解释PigmR广谱抗病性机制，本发明人进行了酵母筛库，利用Invitrogen公司的Gateway体系的pDEST32/pDEST22载体系统，将PigmR-CC结构域(图1A)构建到pDEST32中作为bait进行筛库(稻瘟菌接种后的水稻cDNA酵母文库)。筛选到27个与PigmR互作的蛋白PIBPs(PigmR-Interacting and Blast Resistance Protein)。本发明人经过反复比较，预测PIBP1与PigmR具有较强的互作。

为了证实PigmR与PIBP1的互作，本发明人进行了酵母双杂交实验。发现PigmR全长蛋白可以与PIBP1互作，并依赖于其CC结构域(图1A)。烟草体内的荧光素双分子互补实验进一步证实了两者的互作(图1B)。为了验证两者在水稻体内的互作，本发明人在Nipponbare的背景下构建了PigmR-7Myc-6His过表达的植株(pUBI::PigmR-7Myc-6His/Nipponbare)，并通过田间注射接种稻瘟菌证实了该转基因具有抗病功能(图8A和8B)。同时，本发明人借助水稻原生质体瞬时表达系统发现PigmR-CC与PIBP1的互作主要发生在细胞核中(图1C)。随后，Co-IP实验证实了PigmR全长蛋白与PIBP1在水稻体内的相互作用(图1D)。此外，体外Pull-down实验也证实了Pigm CC结构域与PIBP1的直接互作(图1E)。通过预测发现PIBP1(Os03g50560)编码一个RRM(RNA recognize motif)类蛋白，并且其氨基酸序列在其他物种中具有高度保守性(图8C)。PIBP1同源蛋白进化分析发现，该类蛋白在单子叶和双子叶植物中都存在，暗示其可能具有重要功能(图8D)。为了进一步探索PIBP1与PigmR互作的关键氨基酸，本发明人对PIBP1的全长蛋白进行了序列截短，利用酵母双杂交系统，对不同形式的PIBP1与PigmR的互作进行检测。本发明人发现，PIBP1与PigmR的互作并不依赖于其RRM。但是，270-279位氨基酸缺失的PIBP1会丧失与PigmR的互作(图8E和8F)。进一步，通过氨基酸突变，本发明人发现PIBP1 275位丝氨酸对于PIBP1-PigmR的互作是必须的(图8E-8G)。

实施例2、PIBP1正调控PigmR介导的抗病性但对Pish没有影响

为了探究PIBP1是否影响PigmR对稻瘟病的抗性，本发明人在NIL-Pigm(Nipponbare背景下Pigm的近等基因系)的背景下，构建了PIBP1-RNAi和PIBP1-OE(PIBP1-GFP)的转基因株系(图9A和9B)(PIBP1-RNAi/NIL-Pigm和pUBI::PIBP1-GFP(PIBP1-OE)/Nipponbare)。Real-time结果显示，PIBP1-RNAi或PIBP1-OE并不影响PigmR RNA的表达(图9C)。田间注射接种稻瘟病菌发现，PIBP1-RNAi株系与对照NIL-Pigm相比，出现明显感病，而过表达株系与NIL-Pigm没有差异(图2A)。同时，本发明人利用Crisper-Cas9技术，在NIL-Pigm背景下得到了PIBP1敲除突变体(PIBP1CRISPR/Cas9(PIBP1-KO/NIL-Pigm))。对其进行病原菌接种分析，得到了同样的结果(图9D-9F)。这说明，PIBP1正调控PigmR介导的抗病性。野生型Nipponbare中含有小种专化抗病性NLR基因Pish，通过酵母互作分析，发现PIBP1不能与Pish互作(图2B、9G和9H)。随后，本发明人在Nipponbare背景下，敲低PIBP1(PIBP1-RNAi/Nipponbare)，对转基因植株进行无毒小种YN2接种分析发现，PIBP1并不影响Pish对无毒小种YN2的抗性(图9I和9J)。

以上结果显示，PIBP1正调控PigmR介导的抗病性，但对Pish的抗病功能没有影响。

实施例3、PIBP1与广谱抗病基因特异性互作并正调控Pizt介导的抗病性

为了进一步探究PIBP1是否特异性参与到PigmR的免疫过程，本发明人检测了PIBP1与其他NLR之间的互作。发现，PIBP1与广谱抗病NLR基因Pizt、Pi9存在互作，但与小种转化性NLR基因Pid3不互作(图2B、2C、9K和9L)。通过蛋白序列比对，显示这类广谱抗病NLR蛋白在蛋白序列上具有高度保守性(图9M)。暗示PIBP1可能通过与这类保守的R基因互作，参与到植物的广谱抗病。随后，本发明人在水稻品种ZH11(含有Pizt)背景下，将PIBP1敲除，对转基因植株进行病原菌接种分析发现，与ZH11相比，PIBP1-KO显著降低Pizt对无毒小种CH97的抗性(图2D)。

以上结果表明，PIBP1可以与广谱抗病NLR互作并介导其抗病性，但对于小种专化性NLR的抗病性没有贡献。

实施例4、PIBP1在Nipponbare和NIL-Pigm背景下，具有不同的细胞核累积现象

利用Real-time PCR的方法检测PIBP1在不同水稻组织中的表达丰度。发现，PIBP1在水稻的根、叶片、节、节间、穗中均有不同程度的表达(图10A)。同时，对接种稻瘟菌M.oryzae后的NIL-Pigm不同时间点检测PIBP1的基因表达情况。结果显示，与对照相比，PIBP1在24h和48h表达量明显上调(图10B)。说明PIBP1的表达在一定程度上，响应病原菌的诱导。

为了更好地研究PIBP1如何行使抗病功能，本发明人利用不同的技术手段对其亚细胞定位进行分析。在Nipponbare和NIL-Pigm的水稻原生质体中分别瞬时表达PIBP-YFP发现，在NIL-Pigm背景下，绝大部分(95.3％)的细胞中PIBP1呈现出细胞核定位。与NIL-Pigm不同，在Nipponbare原生质体中，PIBP1仅有59.7％的细胞具有明显的细胞核定位，其余细胞并未展现出细胞核定位(图3A)。为了进一步验证这一现象，本发明人在Nipponbare和NIL-Pigm背景下分别构建了PIBP-GFP的转基因株系，并挑选出蛋白表达量一致的株系，对其亚细胞定位展开分析(图9B)。与水稻瞬时表达结果相似，PIBP1-GFP在93.7％的NIL-Pigm细胞中具有细胞核定位，在PIBP1-GFP/Nipponbare根尖细胞中，63.3％细胞中PIBP1具有较弱的细胞核定位，36.7％细胞没有细胞核定位信号(图10B)。通过根尖细胞的质壁分离实验发现，在Nipponbare中PIBP1主要定位于细胞边缘(图10C)。同时，通过对PIBP1-GFP/Nipponbare和PIBP1-GFP/NIL-Pigm转基因植株叶鞘原生质体荧光观察，进一步证实了这一现象(图10D)。随后，通过对转基因株系中，不同细胞组分的蛋白含量分析，在蛋白水平再次验证了这个有趣的现象(图3C)。相似的，在Pizt和Pi9的背景下检测到PIBP1具有较强的细胞核定位现象(图10E)。为了进一步探究这种差异性亚细胞定位是否响应病原菌的诱导，本发明人对PIBP1-GFP/Nipponbare和PIBP1-GFP/NIL-Pigm转基因植株叶鞘进行接种病原菌TH12(NIL-Pigm，无毒小种；Nipponbare，有毒小种)和YN2(NIL-Pigm，无毒小种；Nipponbare，无毒小种)，结果表明，这种差异性细胞核定位并未受到影响(图10F)。

因此，PIBP1在NIL-Pigm和Nipponbare中具有不同的亚细胞定位(细胞核定位)，并且这种差异并不响应于病原菌的诱导。

实施例5、PigmR促进PIBP1的细胞核定位

为了深入研究PIBP1细胞核定位与PgmR的关系，本发明人首先检测了PigmR的亚细胞定位。在Nipponbare水稻原生质体中，PigmR、PigmR-CC的亚细胞定位与YFP相似，均是遍在分布(具有细胞核定位)(图10G)。随后的Nipponbare原生质体转化实验表明，与CFP和PIBP1-YFP共转化相比(44.7％)，PigmR-CC-CFP和PIBP1-YFP共转化会导致PIBP1-YFP的细胞核定位明显增多(83.3％)。为了进一步验证这一现象，本发明人在NIL-Pigm原生质体中，转入不能与PigmR互作的PIBP1突变体形式(PIBP1^S275A)，发现PIBP1的细胞核定位信号明显减弱，蛋白水平进也进一步验证(图3E-3H)。这说明PigmR-CC与PIBP1的互作可以促进PIBP1的细胞核定位。同时，在Nipponbare水稻原生质体中共转化PIBP1和Pizt-CC或PIBP1和Pi9-CC，发现PIBP1的细胞核定位比例同样明显增加。暗示了广谱抗病NLRs通过与PIBP1直接互作，促进其细胞核定位的保守机制。

实施例6、细胞核定位的PIBP1可以提高Nipponbare抗病性

广谱抗病基因NLRs可以促进PIBP1的细胞核定位。为了解析这种细胞核定位与水稻抗病性是否相关，本发明人在Nipponbare的背景下，将细胞核定位信号NLS与PIBP1偶联，强制PIBP1进入细胞核，并成功构建了NLS-PIBP1-OE/Nipponbare转基因株系。通过根尖细胞的亚细胞定位观察及蛋白实验，证实了NLS-PIBP1可以导致PIBP1的细胞核定位(图4A和11A)。随后，通过蛋白水平鉴定，在转基因NLS-PIBP1-OE/Nipponbare和PIBP1-OE/Nipponbare中选取了蛋白表达量一致的株系，进行病原菌接种试验(图9B)。结果表明，与Nipponbare相比，PIBP1-OE/Nipponbare更抗病。这可能是由于过表达PIBP1导致细胞核内的蛋白组分增多所造成的(图2B)。值得注意的是，与PIBP1-OE/Nipponbare相比，NLS-PIBP1-OE/Nipponbare具有更强的抗病性(图2B)。

这些结果表明，Nipponbare背景下，PIBP1的细胞核定位可以增强其抗病性。

实施例7、PigmS通过降低PIBP1的细胞核定位，使其产生感病性

PigmR通过自身互作形成同源二聚体，发挥广谱抗病功能，PigmS可以与PigmR竞争形成异源二聚体抑制PigmR介导的广谱抗病性。PigmS遍在表达的亚细胞定位与PigmR相似(图10G)。通过酵母双杂交实验发现，虽然PIBP1与全长PigmS不互作，但与其CC结构域存在互作，暗示PigmS的其他结构域可能对其分子间互作进行调控(图4C和S4B)。本发明人在NIL-Pigm中过表达PigmS(35S::PigmS/NIL-Pigm)，会明显降低PigmR介导的抗病性。有意思的是，在35S::PigmS/NIL-Pigm原生质体中过表达PIBP1-YFP的结果表明，与Nipponbare中PIBP1的亚细胞定位相似，16.7％的细胞中PIBP1不具有细胞核定位，30.7％细胞中的PIBP1具有较弱的细胞核定位(图4D和11C)。这说明PigmS的表达可以抑制PigmR对PIBP1细胞核累积的功能。这些结果表明，PigmS可以抑制PigmR对PIBP1细胞核蛋白的累积作用，为PigmS降低PigmR的抗病性提供了一个可能的机制。

实施例8、PIBP1是一类转录因子

PIBP1是一个编码RRM(RNA recognize motif)结构域的蛋白，本发明人预测其可能具有RNA结合活性。为了验证这个猜想，本发明人体外表达并纯化了His-PIBP1重组蛋白，并通过MALDI-TOF质谱实验鉴定了蛋白纯度(图12A-12C)。随后，体外核酸结合实验，表明PIBP1不但可以结合RNA类似物Poly(U)，而且可以结合ssDNA和dsDNA(图12A)。同时，对RRM结构域的核酸结合功能分析发现RRM缺失的PIBP1对RNA和ssDNA的结合活性显著降低或丧失，但对dsDNA的结合活性并没有影响(图12A)。为了进一步验证PIBP1在水稻体内的RNA结合活性，本发明人采用RNA-EMSA实验，将接种稻瘟菌前后的水稻RNA与PIBP1体外孵育结合。与体外RNA结合实验的结果一致，PIBP1对接种稻瘟菌前后的水稻RNA都具有结合活性，并且依赖于其RRM结构域(图12D)。

鉴于PIBP1的细胞核定位对于其抗病功能至关重要，本发明人借助ChIP-Seq，对其体内的DNA结合活性进行了分析。实验以NIL-Pigm为对照，对PIBP1-OE/NIL-Pigm的ChIP样品进行测序，分析得到基因区上被PIBP1富集的434个DNA区段。为了寻找PIBP1结合的顺式作用元件，本发明人对PIBP1富集的DNA进一步分析得到4种具有代表性的DNA序列(图5A)。EMSA结果表明PIBP1可以与4种不同的DNA序列结合(图5A)。随后，对ChIP-Seq鉴定到的PIBP1结合区段进行EMSA分析，发现PIBP1几乎可以和大部分的体内鉴定位点体外结合(图12E)。DNA结合强度分析发现，PIBP1对DNA序列2和4具有较强的结合活性(图5B)。为了避免PIBP1对DNA的结合是由于其RNA结合活性所导致的非特异性结合，本发明人用4种DNA对应的相同序列的单链DNA进行冷探针竞争结合实验。结果表明，DNA序列1和3的单链形式可以显著竞争PIBP1对其双链DNA的结合，竞争效率与未标记的双链DNA相似。PIBP1对双链DNA 2和4的结合不能被其相应的单链DNA竞争，但可以被相应的未标记的双链DNA有效竞争(图5A)。这说明，DNA序列2和4是PIBP1结合DNA的特异性顺式作用元件。同时，EMSA结果显示，PIBP1对这两个DNA序列的特异性结合呈现出明显的蛋白浓度依赖效应(图12F)。

为了寻找与PIBP1特异性结合的核心序列，本发明人对DNA序列2和4分别进行了不同形式的碱基突变。用突变后的探针进行EMSA，结果发现，不管DNA基序2或4，当碱基G或C突变为A或T后，PIBP1对突变探针的结合都会明显增强。并且，随着A或T碱基数目的增多，PIBP1的结合活性逐渐增强。同时，当碱基A或T突变为G或C时，PIBP1对突变探针的结合会明显减弱，并且伴随着GC突变碱基数目的增加，与PIBP1的结合显著减弱甚至消失(图5C)。以上结果表明，富含AT碱基的DNA序列是PIBP1结合的核心顺式作用元件。体外核酸结合实验表明，PIBP1的RRM结构域决定其RNA结合活性，但其DNA结合活性并不受RRM的影响(图12A)。为了进一步探索PIBP1的DNA结合活性所依赖的结构域，本发明人对截短后的PIBP1分别进行EMSA(图12G和5D)。结果发现，单独的RRM结构域并不具备DNA结合活性，同时RRM缺失的PIBP1仍然保留其DNA结合活性。这表明，PIBP1可以结合富含AT碱基的DNA序列并且不依赖于其RRM结构域。

基于以上的研究，本发明人猜测PIBP1可能作为一类新转录因子参与到植物免疫过程当中。因此，本发明人对PIBP1的转录激活活性进行研究。在酵母转录激活实验中，将PIBP1及其不同的结构域与GAL4的结合结构域进行融合，单独的GAL4的结合结构域作为阴性对照。转化酵母后发现，PIBP1蛋白具有转录激活活性，RRM结构域缺失的PIBP1蛋白其转录激活活性完全丧失，而C端缺失的PIBP1蛋白并不影响转录激活活性(图5E)。说明，PIBP1具有转录激活活性并且依赖于其RRM结构域。

大部分的转录因子都可以形成同源二聚体或多聚体来行使功能。为了探究新型转录因子PIBP1是否同经典转录因子相似，首先利用酵母双杂交系统，对其自身的互作进行了验证(图5H)。随后，烟草体内荧光素双分子互补实验进一步证实(图12I)。同时，利用水稻原生质体系统的BiFC实验，发现PIBP1可以在细胞核和细胞质中形成同源二聚体或多聚体(图12J)。

实施例9、PIBP1直接结合并激活下游抗病基因OsWAK14和OsPAL1

为了寻找PIBP1直接调控的下游基因，本发明人对病原菌(TH12)接种后的PIBP1-RNAi/NIL-Pigm和NIL-Pigm进行RNA-Seq分析。与NIL-Pigm相比，PIBP1-RNAi/NIL-Pigm中有1919个基因发生了明显的变化，暗示PIBP1确实参与到基因的转录调控过程中。本发明人将RNA-Seq和ChIP-Seq的数据进行关联分析，通过寻找ChIP-Seq中被PIBP1富集且RNA-Seq中表达有变化的基因，发现7个可能的下游靶基因。因为已有研究表明WAK基因家族在植物免疫中发挥重要功能，同时，OsWAK14正调控水稻对稻瘟病的免疫抗性也已有报道。所以，本发明人选择对候选靶标基因OsWAK14进行分析，发现其启动子区中包含2个富含AT碱基的DNA区段。通过EMSA验证，发现PIBP1可以特异地与OsWAK14启动子区富含AT碱基的P1和P2结合并且不依赖于其RRM，而与阴性对照P3没有结合(图6A和13A)。同时，ChIP-qPCR证明了PIBP1在水稻体内对OsWAK14启动子的结合(图6B)。为了进一步探究PIBP1对OsWAK14启动子的结合是否影响基因表达，本发明人随后利用双荧光素报告系统在烟草体内进行研究分析。由于PIBP1在烟草中的不具有细胞核定位，所以构建了NLS-PIBP1的融合蛋白，并验证了NLS-PIBP1在烟草中的细胞核定位(图13B)。结果表明，PIBP1自身对OsWAK14的转录激活相比于空载有微量激活但并不显著，而核定位的NLS-PIBP1可以显著诱导OsWAK14的基因表达(图6C和S6C)。以上研究结果表明，PIBP1可以通过直接结合OsWAK14启动子，激活其基因的表达。

随后，本发明人对水稻体内OsWAK14的基因表达模式进行分析，发现病原菌接种NIL-Pigm后，OsWAK14具有PIBP1类似的表达模式(图6D和13D)。OsWAK14受病原菌诱导表达，并在60h达到峰值。同时，无论是接种TH12(无毒小种-NIL-Pigm，有毒小种-Nipponbare)还是YN2(无毒小种-NIL-Pigm，无毒小种-Nipponbare)，NIL-Pigm中OsWAK14的表达量都显著高于Nipponbare，说明Pigm调控了OsWAK14的基因表达。随后发现，PIBP1-RNAi/NIL-Pigm可以显著降低OsWAK14的表达，并且PIBP1-OE/NIL-Pigm在一定程度上增强了OsWAK14的表达(图6E)，表明Pigm对OsWAK14基因表达的调控依赖于PIBP1。

为了进一步探究OsWAK14作为PIBP1的下游靶标基因，是否参与到PigmR的抗病过程中，本发明人利用Crisper-Cas9技术构建了OsWAK14/NIL-Pigm的敲除突变体(图13E)。对其进行病原菌接种分析，发现OsWAK14的敲除显著降低PigmR介导的抗病性(图6F)。这说明，OsWAK14作为PIBP1调控的靶标基因，参与到PigmR介导的免疫信号通路当中。

水稻的苯丙氨酸代谢途径广泛参与到植物的免疫过程当中。有意思的是，本发明人发现NIL-Pigm在接种病原菌以后，OsPAL1的表达量明显诱导高表达，并且表达量显著高于Nipponbare(图13F)。对其启动子区分析，发现两个PIBP1可能结合的富含AT碱基的序列(图6G)。体外EMSA证明了PIBP1可以结合在OsPAL1的启动子区(图6G)。同时，通过ChIP-qPCR进一步证明了PIBP1在水稻体内对OsPAL1启动子的结合(图6H)。烟草体内的双荧光素报告系统随后证实了PIBP1对OsPAL1的转录激活相比于空载有微量但不显著激活，而NLS-PIBP1可以显著诱导OsPAL1基因的表达(图6I)。这些表明，PIBP1可以通过直接结合OsPAL1启动子，激活基因表达。随后发现，NIL-Pigm背景中PIBP1-RNAi可以显著降低OsPAL1的表达，而PIBP1-OE则显著增强了OsPAL1的表达(图6J)。

这些结果表明，OsPAL1是PIBP1调控的另外一个下游靶标基因。

实施例10、PIBP1的同源基因Os06g02240具有转录因子的活性

通过蛋白序列比对分析发现，PIBP1与水稻中Os11g34680，Os06g02240和Os04g53330的同源性较高(图14A)。为了探究PIBP1的同源基因是否也具有转录因子活性，本发明人进行了以下研究。首先，在水稻原生质体中分别表达融合有荧光蛋白YFP的Os11g34680，Os06g02240和Os04g53330，发现三种蛋白都具有细胞核定位信号(图14B)。随后，表达并纯化了融合标签蛋白His的Os11g34680，Os06g02240和Os04g53330三种外源蛋白，以PIBP1的DNA结合序列2和4为探针，分别进行EMSA实验(图14C和7A)。结果发现，蛋白Os06g02240对DNA序列2和4都具有较强的结合，蛋白Os11g34680对DNA序列2和4的结合较弱，而蛋白Os04g53330对DNA序列没有结合活性。酵母转录激活活性实验结果表明，仅Os06g02240具有转录激活活性(图7B)。同时，与经典的转录因子相似，Os06g02240可以形成同源二聚体或多聚体，而Os04g53330和Os11g34680并不具备此活性(图14D和14E)。同时，酵母双杂交结果表明，不同于Os04g53330和Os11g34680，Os06g02240与PIBP1类似，可以与PigmR互作，并且依赖于其C端结构域(图7C、7D、14G和14F)。有意思的是，Os06g02240与其他广谱抗病NLRs(Pizt、Pi9)可以互作，但与小种专化性NLRs(Pish、Pid3)不互作(图14H和14I)。进一步对Os06g02240的转录因子活性进行分析，发现Os06g02240同样可以结合PIBP1的下游靶标基因OsWAK14、OsPAL1的启动子区域(图7E)，并激活其基因表达(图7F)。暗示其可能以PIBP1类似的功能形式参与到水稻的免疫过程当中结合以上实验，本发明人认为PIBP1的同源基因Os06g02240也具有转录因子活性。

随后，本发明人利用Crisper-Cas9技术构建了Os06g02240-KO/NIL-Pigm和(PIBP1/Os06g02240)-KO/NIL-Pigm的水稻敲除突变体(图14J)。对其进行病原菌接种分析，发现Os06g02240单基因敲除后会显著降低PigmR介导的抗病性。而PIBP1和Os06g02240的双突突变体会更加感病(图7G)。这说明PIBP1和Os06g02240作为新的一类转录因子特异性的参与到PigmR广谱抗病NLRs的免疫信号通路中，并且具有一定的功能冗余。

根据以上的研究结果，本发明人对具有RRM结构域的PIBP1这类新的转录因子提出如下的抗病机制模型：在广谱抗病PigmR/NLRs的材料中，NLRs可以促进PIBP1s的细胞核定位的累积，这个过程不受病原菌的影响。细胞核定位的PIBP1s作为一类非典型性的转录因子可以结合在区富含AT碱基的抗病基因OsWAK14和OsPAL1的启动子区域。响应病原菌的侵染，激活下游防卫基因的表达，赋予水稻抗病性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 增强植物广谱抗病性的转录因子及应用

<130> 191522

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 284

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza.sativa L.)

<400> 1

Met Glu Val Arg Thr Val Lys Val Ser Asn Ile Ser Leu Asn Ala Ser

1 5 10 15

Lys Arg Glu Ile Thr Glu Phe Phe Ser Phe Ser Gly Asp Ile Glu Tyr

20 25 30

Val Glu Met Gln Ser Glu Ser Glu Arg Ser Gln Leu Ala Tyr Val Thr

35 40 45

Phe Lys Asp Ser Gln Gly Ala Asp Thr Ala Val Leu Leu Ser Gly Ala

50 55 60

Thr Ile Val Asp Arg Ser Val Ile Ile Thr Pro Val Val Asn Tyr Gln

65 70 75 80

Leu Pro Pro Asp Ala Arg Lys Gln Ser Ala Gly Glu Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Ala Glu Ser Val Val Arg Lys Ala Glu Asp Val Val Ser Ser Met Leu

100 105 110

Ala Lys Gly Phe Val Leu Ser Lys Asp Ala Leu Asn Val Ala Arg Ser

115 120 125

Phe Asp Glu Arg His Asn Ile Leu Ser Asn Ala Thr Ala Thr Val Ala

130 135 140

Ser Leu Asp Arg Gln Tyr Gly Val Ser Glu Lys Ile Ser Leu Gly Arg

145 150 155 160

Ala Ile Val Gly Ser Lys Val Lys Glu Val Asp Asp Arg Tyr Gln Val

165 170 175

Ser Glu Leu Thr Lys Ser Ala Leu Ala Ala Ala Glu Gln Lys Ala Ser

180 185 190

Ile Ala Ser Ser Ala Ile Met Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ala Gly Ala

195 200 205

Ser Trp Leu Thr Ser Ala Phe Gly Met Val Thr Lys Ala Ala Gly Asp

210 215 220

Met Ser Ser Met Thr Lys Asp Lys Val Asp Arg Ala Glu Glu Glu Arg

225 230 235 240

Lys Ala Ile Met Trp Glu Glu Arg Asn Gly Leu Val Ser Asp Tyr Ala

245 250 255

Lys Ile His Leu Asp Glu Pro Ser Ser Trp Glu Pro Ala Val Leu Pro

260 265 270

Leu Glu Ser Val Asp Glu Gln Lys Leu Gln Ala Val

275 280

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 核定位信号(NLS)

<400> 2

atgcctaaga agaagagaaa ggttggagga 30

<210> 3

<211> 532

<212> DNA

<213> 靶DNA(target DNA)

<400> 3

ggtagacagg gccgaagagg agaggaaagc gatcatgtgg gaagagagga atgggcttgt 60

aagtgattat gccaagatcc atcttgatga accctcttca tgggagcctg cagttcttcc 120

gttggaatct gtggatgagc agaagctcca ggctgtgtga tctgcacaat ccaatggtgg 180

tcgtttctct gcacgtcatt cttttgttca tgtccaatat agaagattgt ttttcaccgc 240

tgcacggtag caaaaatatt gagcttattg cctatagtat gatgtaaatt ttagaaattc 300

cccatgtgtt ttcttccagc tttgttatag accactgaaa ggcttacttg ttcagtgtta 360

gacatggaaa tgaaagttgt tccagacttc caggcatacc tcttgttatg gtagaacatg 420

tttctgtgag ttatctcaga actatttgtg ctctgatatt ctgaagctac atgtgtaagg 480

cccaaatctg ggaaataatc aaggtcaaaa tgaaatgcag acaatatttc ct 532

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 靶DNA(target DNA)

<400> 4

ttacatttaa ggactcaca 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 靶DNA(target DNA)

<400> 5

ctgcagtcta cggagttgg 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 靶DNA(target DNA)

<400> 6

tgcaactgtg caagacatta 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 靶DNA(target DNA)

<400> 7

ttcattgaat gcttcaaaaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 靶DNA(target DNA)

<400> 8

tgcaactgtg caagacatta 20

Claims

1.提高植物的抗病能力或制备抗病能力提高的植物的方法，包括：

(a)促进PIBP1的表达或在细胞核中的定位或积累；

(b)促进PIBP1与其下游基因的相互作用，从而提高下游基因的表达，所述下游基因包括：WAK14，PAL1；

(c)促进PIBP1与NLR蛋白的相互作用，从而提高NLR蛋白介导的抗病能力，所述的NLR蛋白包括：PigmR，Pizt；

其中，所述PIBP1包括其同源物，所述同源物包括：Os06g02240。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：

重组表达PIBP1，以提高PIBP1的表达水平或促进其在细胞核中的定位或积累；

将PIBP1与核定位信号分子相连接，以促进PIBP1在细胞核中的定位或积累。

促进NLR蛋白与PIBP1的相互作用，以促进PIBP1在细胞核中的定位或积累；

重组表达PIBP1和/或其下游基因，以促进PIBP1与其下游基因的相互作用；或

重组表达PIBP1和/或NLR蛋白，以促进PIBP1与NLR蛋白的相互作用。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的促进PIBP1与其下游基因的相互作用是：促进PIBP1与其下游基因的启动子的相互作用，从而提高下游基因的表达。

4.PIBP1的用途，用于提高植物的抗病能力或制备抗病能力提高的植物；其中，所述PIBP1包括其同源物，所述同源物包括：Os06g02240。

5.一种PIBP1的衍生物，其是PIBP1与核定位信号分子相连接的分子；较佳地其是融合蛋白、融合基因或携带该融合基因的表达载体；其中，所述PIBP1包括其同源物，所述同源物包括：Os06g02240。

6.分离的PIBP1的生物活性片段，其包含对应于PIBP1蛋白序列中第270-279位氨基酸，特别是第275位氨基酸的片段；较佳地，所述的包含对应于PIBP1蛋白序列中第270-279位氨基酸的片段包括：对应于PIBP1蛋白第75-284位的片段，对应于PIBP1蛋白第1-279位的片段；其中，所述PIBP1包括其同源物，所述同源物包括：Os06g02240。

7.分离的蛋白复合体，其包括：PIBP1，以及NLR蛋白，两者相互作用；其中，所述的NLR蛋白包括：PigmR，Pizt；其中，所述PIBP1包括其同源物，所述同源物包括：Os06g02240。

8.分离的蛋白-核酸复合体，其包括：PIBP1，以及PIBP1的下游基因；两者相互作用；其中，所述下游基因包括：WAK14，PAL1；其中，所述PIBP1包括其同源物，所述同源物包括：Os06g02240；较佳地，所述复合体中，PIBP1结合于其下游基因的启动子区。

9.权利要求7或8所述的复合体的用途，用于作为调控植物的抗病能力的靶点，制备抗病能力增强的植物；或用于作为筛选靶点，筛选提高植物抗病能力的潜在物质。

10.一种定向选择抗病能力增强的植物的方法，所述方法包括：

鉴定测试植物体内权利要求7或8所述的复合体，若该测试植物中所述复合体的相互作用高于该类植物中该复合体相互作用的平均值，则其为抗病能力增强的植物；或

鉴定植物细胞内PIBP1在细胞中的表达或在细胞核中的定位或积累，若其表达高于该类植物中该PIBP1的平均值，或其在细胞核中的定位或积累高于该类植物的平均值，则其为抗病能力增强的植物。

11.一种筛选提高植物抗病能力的调节剂的方法，所述方法包括：

(1)将候选物质加入到包含权利要求7或8所述的复合体的体系中；

(2)观测所述复合体中PIBP1与NLR蛋白的相互作用，或PIBP1与其下游基因启动子区的相互作用；其中，若所述候选物质促进复合体中PIBP1与NLR蛋白的相互作用，或PIBP1与其下游基因启动子区的相互作用，则表明该候选物质是提高植物抗病能力的调节剂；其中，所述PIBP1包括其同源物，所述同源物包括：Os06g02240。

12.一种筛选提高植物抗病能力的调节剂的方法，所述方法包括：(1)将候选物质加入到包含PIBP1的体系中；(2)观测所述体系中PIBP1的表达或活性；其中，若所述候选物质促进PIBP1的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物抗病能力的调节剂；其中，所述PIBP1包括其同源物，所述同源物包括：Os06g02240。

13.如权利要求1-3任一所述的方法，权利要求4所述的用途，权利要求5所述的PIBP1的衍生物，权利要求7或8所述的复合体，其特征在于，所述的PIBP1，还包括其衍生物、变体或生物活性片段；较佳地，所述的生物活性片段为包含对应PIBP1蛋白序列中第270-279位氨基酸，特别是第275位氨基酸的片段；较佳地，所述的衍生物是PIBP1与NLS相连接的分子，或能表达所述分子的构建体；较佳地，所述变体包括与PIBP1序列同源性高于80％、但对应PIBP1蛋白序列中第270-279位氨基酸，特别是第275位氨基酸保持保守的变体。

14.如权利要求1-3、10-12任一所述的方法，权利要求4或9所述的用途，其特征在于，所述的抗病能力包括：抵抗真菌病害的能力；较佳地包括：抵抗稻瘟病菌的能力。

15.如权利要求1-3、11任一所述的方法，权利要求7所述的复合体，其特征在于，所述的NLR蛋白包括其同源物，或它们的衍生物、变体或生物活性片段；较佳地，所述的生物活性片段为包含对应NLR蛋白或其同源物序列中卷曲螺旋结构域氨基酸的片段；较佳地，所述变体是与NLR蛋白或其同源物序列同源性高于80％、但对应NLR蛋白或其同源物序列中卷曲螺旋结构域保持保守的变体；较佳地，所述的NLR蛋白包括PigmR或Pizt。

16.如权利要求1～3、10～12任一所述的方法，权利要求4、9任一所述的用途，所述的植物包括禾本科植物。