CN102816773A - 水稻OsWRKY28转录因子基因在改良植物抗病性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程领域，公开了水稻OsWRKY28转录因子基因在改良植物抗病性中的应用。本发明采用反向遗传学方法研究如SEQ ID NO.1所示的水稻WRKY转录因子基因OsWRKY28的功能，发现OsWRKY28基因在水稻抗纹枯病的防御反应中起正调控作用。将OsWRKY28基因构建在合适的植物表达载体上，转化水稻细胞，获得的OsWRKY28过量表达转基因水稻对纹枯病的抗性明显提高。因此，可以利用OsWRKY28基因改良水稻及其它作物的抗病性状，培育出抗纹枯病转基因植物新品种。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及水稻OsWRKY28转录因子基因在改良植物抗病性中的应用。
背景技术
植物病害对植物生长、发育和繁衍产生严重的负面作用，可以导致植物产量下降和品质劣化。然而，植物在与病原微生物互作的长期演化过程中发展了一系列积极的防御机制来保护自身。植物的防御系统主要由局部防御（Localdefense）和系统获得性抗性（Systemic acquired resistance，SAR）构成。植物细胞表面的模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs）对于病原物相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）的识别直接导致PAMP触发性免疫反应（PAMP-triggered immunity，PTI）。但是，在漫长的进化过程中，病原物已经进化出可以终止PAMP触发性信号的效应子（Effector）；与其相对应，植物也进化出能够识别病原菌效应子的抗性蛋白（R proteins），从而诱导效应子触发性免疫反应（Effector-triggered immunity，ETI）。PTI和ETI共同组成了植物的局部防御。PTI和ETI的激活导致一种运动性信号分子的产生，这种信号分子可以从病原菌侵染部位移动到整个植株的各个部位，使植物产生系统获得性抗性。SAR是一种反应速度快、维持时间长、免疫强度大、病原菌抗性谱广的植物防御反应（Bostock.Signal crosstalk and induced resistance:straddling the linebetween cost and benefit.Annual Review of Phytopathology,2005,43;Bernoux et al.New insights in plant immunity signaling activation.Current Opinion in plantBiology,2011,14(5)）。
植物防御反应的产生涉及到非常复杂的基因表达调控网络，转录因子在其中起着关键的作用。转录因子也称为反式作用因子，能够特异地识别并结合真核生物启动子中的顺式作用元件，在mRNA水平上实现对靶基因的转录激活或抑制。从植物感知病原物入侵信号到防御反应基因表达的信号传导网络中，各种转录因子与顺式作用元件间的相互作用构成了基因表达调控的基础（徐玲等,植物抗病抗逆机理的研究概述.江西农业学报,2012,24(3)）。已有研究发现一些抗病相关的转录因子可以识别防御相关的顺式作用元件，调控一系列下游抗病防御反应基因的表达，产生具有抗菌活性的病程相关（PR）蛋白、参与抗菌化合物（植物抗毒素）生物合成的酶、降解毒性物质的酶等，进而使植物的抗病性得以提高（Rushton et al.WRKY transcription factors.Trends in Plant Science,2010,15(5)）。因此，通过基因工程技术增强一个关键转录因子的表达，就能够激活一系列下游抗病防御反应基因的表达，达到综合改良植物抗病性状的目的。与利用一个或少数几个下游抗病基因的传统基因工程策略相比，利用转录因子来改良植物的抗病性，可以获得更为理想的综合效果。
水稻纹枯病是世界性的水稻三大病害之一，其病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）。立枯丝核菌是一种半腐生真菌，寄主范围非常广，在人工接种条件下可危害43科263种植物（彭绍裘等.水稻纹枯病及其防治.上海:上海科学技术出版社,1986）。随着高产水稻品种的大力推广，水稻种植密度和氮肥用量逐渐增加，近年来水稻纹枯病的危害呈直线上升趋势。目前在我国南方部分稻区，纹枯病已经成为最严重的常发性水稻病害，无论是发病面积还是造成的经济损失，总量均居水稻病害之首（毛碧增等.转化双价防卫基因获得抗纹枯病水稻.植物生理与分子生物学学报,2003,29(4)）。但是，由于立枯丝核菌具有强腐生性和宽寄主范围的特点，一直没有寻找到较高抗性水平的水稻纹枯病抗性遗传资源，开展常规抗病遗传育种研究难度大且进程缓慢。抗源的匮乏也导致纹枯病抗性R基因克隆的研究尚未取得实质性进展，有关抗纹枯病防御反应的分子机制研究仍在起步阶段。目前，在抗纹枯病基因工程育种中应用的目标基因主要是几丁质酶基因、β-1，3-葡聚糖酶基因等下游防御反应基因（Shah et al.Enhanced sheath blight resistance in transgenic rice expressing anendochitinase gene from Trichoderma virens.Biotechnology Letters,2009,31(2)）。因此，发掘在水稻抗纹枯病防御反应中具有关键调控作用的转录因子基因对于抗病转基因水稻新品种的培育意义重大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供水稻OsWRKY28转录因子基因在改良植物抗病性中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：水稻OsWRKY28转录因子基因在改良植物抗病性中的应用，具体为水稻OsWRKY28转录因子基因在培育抗纹枯病植物品种中的应用；所述的水稻OsWRKY28转录因子基因为水稻WRKY转录因子基因OsWRKY28；
所述的水稻WRKY转录因子基因OsWRKY28的编码核苷酸序列如下所示：ATGGCTAAGATGCTTCCTCCTCCGAGCCAGTCAGTCCCCTCTCGCCCACCTTCTTGGCTATATATTCCTCCTCGTCGTCGCCATGGCACCTTCACTAGCTCATGCGCATTTCGGCTCTCGCCTTCTTCGCCTTCTTCTCCTCCTCCTCCTGTTCTTGATTTTCAGTATATTCAATTCATGGATTCGTGGATTGAGCAGACTTCCCTGAGCTTGGACCTCAACGTCGGCCTGCCGTCGACGGCGAGGAGATCATCGGCTCCGGCGGCGCCGATTAAGGTTCTCGTGGAGGAGAACTTCTTGTCCTTCAAGAAGGATCACGAGGTTGAGGCGCTGGAGGCGGAGCTCCGGCGAGCGAGCGAGGAGAACAAGAAGCTGACCGAGATGCTTCGGGCGGTGGTGGCCAAGTACACCGAGCTGCAGGGACAGGTCAACGACATGATGTCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGTCAACGCCGGGAACCACCAGTCGTCGACGTCGGAGGGCGGCTCGGTGTCGCCATCGAGGAAGCGGATCCGTAGCGTCGACAGCCTCGACGACGCCGCCCACCACCGCAAGCCATCCCCTCCGTTCGTCGCCGCCGCCGCAGCCGCGGCCTACGCCTCCCCCGACCAGATGGAGTGCACGTCGGCGGCCGCCGCCGCCGCCGCGAAGCGCGTCGTCCGCGAGGACTGCAAGCCCAAGGTCTCCAAGCGCTTCGTCCACGCCGACCCCTCCGACCTCAGCCTCGTGGTGAAGGATGGGTATCAATGGCGGAAGTACGGGCAGAAGGTGACGAAGGACAACCCGTGCCCGCGAGCCTACTTCAGGTGCTCGTTCGCGCCGGCGTGCCCGGTGAAGAAGAAGGTGCAGCGCAGCGCCGACGACAACACCGTCCTCGTCGCCACGTACGAGGGCGAGCACAACCACGCCCAGCCGCCGCACCACGACGCCGGCAGCAAGACCGCCGCCGCCGCCAAGCACTCACAGCACCAGCCGCCACCGAGCGCCGCCGCCGCCGTCGACCGGCAGCAGCAAGAGCAGGCGGCGGCGGCCGGGCCGTCGACGGAGGTGGCGGCGAGGAAGAACCTGGCCGAGCAGATGGCGGCGACGCTGACGAGGGACCCCGGGTTCAAGGCGGCGCTCGTCACGGCGCTCTCCGGCCGGATCCTCGAGCTCTCGCCGACCAAGAACTGA；
所述的植物指的是对立枯丝核菌敏感的植物，包括水稻、玉米、高粱、小麦、马铃薯、大豆、胡萝卜、番茄、棉花等，优选为水稻；
所述的水稻WRKY转录因子基因OsWRKY28在培育抗纹枯病植物品种中的应用的步骤如下：应用植物基因工程技术，将水稻WRKY转录因子基因OsWRKY28转化入植物细胞，得到表达OsWRKY28转录因子的植物品种；
其中，使用PCR技术或反转录PCR技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsWRKY28基因部分以及全长DNA或与其同源的一段DNA。将上述分离到包含OsWRKY28基因的序列与合适的植物表达载体连接，转化植物，获得表达OsWRKY28基因的抗纹枯病转基因植物。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：水稻抗纹枯病遗传资源的缺乏导致抗纹枯病的常规育种工作至今还没有取得真正突破性进展。植物抗病基因工程技术可以突破物种间的生殖隔离和远缘杂交不亲合性的限制，为纹枯病的抗性育种带来了希望。然而，目前在抗纹枯病基因工程研究中，大多数是通过转入单个或少数几个下游抗病防御反应基因（几丁质酶基因、β-1，3-葡聚糖酶基因等）的方法来提高作物的抗病性，抗病效果往往不太稳定或不够彻底。本发明的发明人通过基因功能研究，发现OsWRKY28基因在水稻抗纹枯病的防御反应中起正调控作用，其过量表达时能够提高水稻对纹枯病的抗性。OsWRKY28基因编码的蛋白是转录因子，可以转录激活一系列下游抗病防御反应基因的表达，赋予转基因植物良好的抗病效果，从而克服转入个别抗病防御反应基因的不足之处。
附图说明
图1是用2mM SA喷施处理三周龄水稻苗后的OsWRKY28基因的表达谱分析图。
图2是用100μM JA喷施处理三周龄水稻苗后的OsWRKY28基因的表达谱分析图。
图3是用立枯丝核菌RH-9接种处理分蘖期水稻后的OsWRKY28基因的表达谱分析图。
图4是载体pFGC1008的结构示意图。
图5是OsWRKY28过量表达转基因水稻的分子检测图；上面一行是内参基因UBC的RT-PCR结果，下面一行是OsWRKY28基因的RT-PCR结果；WT指的是野生型水稻品种9311。
图6是OsWRKY28过量表达转基因水稻接种立枯丝核菌后的病斑长度统计图；WT指的是野生型水稻品种9311。
图7是抗病防御反应基因在OsWRKY28过量表达转基因水稻中的表达分析图；上面一行是内参基因UBC的RT-PCR结果，其余行分别是PR1a、PR1b、PR10、NH1、PBZ1、Betv1、LOX、PAL1基因的RT-PCR结果；WT指的是野生型水稻品种9311。
图8是OsWRKY28 RNAi转基因水稻的分子检测图；上面一行是内参基因UBC的RT-PCR结果，下面一行是OsWRKY28基因的RT-PCR结果，WT指的是野生型水稻品种9311。
图9是OsWRKY28 RNAi转基因水稻接种立枯丝核菌后的病斑长度统计图；WT指的是野生型水稻品种9311。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
首先，对于实施例的内容进行简要概述：本发明前期对水稻受立枯丝核菌侵染24小时后的全基因组表达谱芯片进行了分析，发现水稻WRKY转录因子基因OsWRKY28的表达能被立枯丝核菌侵染所诱导，因此本发明对OsWRKY28基因在植物抗纹枯病中的功能和应用开展了研究。本发明的发明人从立枯丝核菌诱导的水稻叶片cDNA文库中分离克隆出包含OsWRKY28基因全长编码框（如SEQ ID NO.1所示）的DNA片段。采用荧光定量PCR技术分析OsWRKY28基因在多种因子刺激下的表达谱，结果表明OsWRKY28基因的表达能被SA、JA处理及立枯丝核菌侵染诱导而剧烈上调（图1～3）。在水稻中过量表达OsWRKY28基因，转基因植株对纹枯病的抗性以及PR1a等8个下游抗病防御反应基因的表达都得到明显提高（图5～7）。而采用RNA干扰技术抑制OsWRKY28基因的表达，转基因植株对立枯丝核菌的侵染则更为敏感（图8和9）。上述结果表明OsWRKY28基因在水稻抗纹枯病的防御反应中起正调控作用，可以利用该基因改良水稻及其它作物的抗病性状，培育出抗病转基因植物新品种。
实施例1 OsWRKY28基因的分离克隆
以水稻品种9311（何光明等.水稻抗衰老IPT基因与抗白叶枯病基因Xa23的聚合研究.遗传学报,2004,31(8)）为材料，在分蘖期（10周龄）接种立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的强致病性菌株RH-9（李爱宏等.转基因株系及不同水稻品种的几丁质酶活力及纹枯病抗性.作物学报,2003,29(4)）。将纹枯病菌的菌丝块接种在PDA培养基上，25℃暗培养3天，以Gilson10mL移液器的吸头（D10mL，Gilson公司）作为打孔器，在菌丝培养物的外缘打取菌丝琼脂条（直径1.8mm，长3mm），用镊子将菌丝琼脂条嵌入茎秆自上而下第3叶鞘内侧，使叶鞘保持原有包茎状态。24小时后，剪取接菌部位水稻叶鞘，用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取总RNA（方法参见Trizol说明书），继而用逆转录酶M-MLV（Invitrogen公司）将总RNA逆转录合成cDNA第一链（方法参见逆转录酶说明书），反应条件为：25℃5min；37℃60min；70℃10min。以cDNA为模板，利用OsWRKY28基因特异性引物F1（5’-GTATAGGCGCGCCATGGCTAAGATGCTTCC-3’，下划线处是AscI酶切位点）和R1（5’-AAGGGATCCTCAGTTCTTGG TCGGCGAG-3’，下划线处是BamHI酶切位点）进行PCR，扩增出含有OsWRKY28基因全长编码框的DNA片段，反应条件为：94℃预变性2min，然后进入下列循环：96℃30sec；60℃30sec，72℃2min，共进行30个循环；最后72℃延伸2min。将上述PCR扩增产物连接到pGEM-T载体（Promega公司）上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（TaKaRa公司），筛选阳性克隆进行测序验证，将正确的重组质粒命名为pGEM-OsWRKY28，扩增得到的连接有酶切位点的OsWRKY28基因的序列如下：
GGCGCGCCATGGCTAAGATGCTTCCTCCTCCGAGCCAGTCAGTCCCCTCTCGCCCACCTTCTTGGCTATATATTCCTCCTCGTCGTCGCCATGGCACCTTCACTAGCTCATGCGCATTTCGGCTCTCGCCTTCTTCGCCTTCTTCTCCTCCTCCTCCTGTTCTTGATTTTCAGTATATTCAATTCATGGATTCGTGGATTGAGCAGACTTCCCTGAGCTTGGACCTCAACGTCGGCCTGCCGTCGACGGCGAGGAGATCATCGGCTCCGGCGGCGCCGATTAAGGTTCTCGTGGAGGAGAACTTCTTGTCCTTCAAGAAGGATCACGAGGTTGAGGCGCTGGAGGCGGAGCTCCGGCGAGCGAGCGAGGAGAACAAGAAGCTGACCGAGATGCTTCGGGCGGTGGTGGCCAAGTACACCGAGCTGCAGGGACAGGTCAACGACATGATGTCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGTCAACGCCGGGAACCACCAGTCGTCGACGTCGGAGGGCGGCTCGGTGTCGCCATCGAGGAAGCGGATCCGTAGCGTCGACAGCCTCGACGACGCCGCCCACCACCGCAAGCCATCCCCTCCGTTCGTCGCCGCCGCCGCAGCCGCGGCCTACGCCTCCCCCGACCAGATGGAGTGCACGTCGGCGGCCGCCGCCGCCGCCGCGAAGCGCGTCGTCCGCGAGGACTGCAAGCCCAAGGTCTCCAAGCGCTTCGTCCACGCCGACCCCTCCGACCTCAGCCTCGTGGTGAAGGATGGGTATCAATGGCGGAAGTACGGGCAGAAGGTGACGAAGGACAACCCGTGCCCGCGAGCCTACTTCAGGTGCTCGTTCGCGCCGGCGTGCCCGGTGAAGAAGAAGGTGCAGCGCAGCGCCGACGACAACACCGTCCTCGTCGCCACGTACGAGGGCGAGCACAACCACGCCCAGCCGCCGCACCACGACGCCGGCAGCAAGACCGCCGCCGCCGCCAAGCACTCACAGCACCAGCCGCCACCGAGCGCCGCCGCCGCCGTCGACCGGCAGCAGCAAGAGCAGGCGGCGGCGGCCGGGCCGTCGACGGAGGTGGCGGCGAGGAAGAACCTGGCCGAGCAGATGGCGGCGACGCTGACGAGGGACCCCGGGTTCAAGGCGGCGCTCGTCACGGCGCTCTCCGGCCGGATCCTCGAGCTCTCGCCGACCAAGAACTGAGGATCC。
实施例2 OsWRKY28基因的表达谱分析
以水稻品种9311为材料，采用与实施例1相同方法对分蘖期（10周龄）水稻接种立枯丝核菌菌株RH-9，模拟对照组（mock）接入空白琼脂条，分别在接种前（0h）及接种后6h、12h、24h、48h、72h剪取水稻叶鞘，放入液氮保存。对3周龄水稻苗分别喷施2mM水杨酸（SA，用pH6.5的双蒸水配制）和100μM茉莉酸（JA，用0.1%（v/v）乙醇溶液配制），模拟对照组分别喷施这两种溶液中的溶剂成分，所有溶液都加入0.05%（v/v）的Tween20以增加叶片表面黏附性，分别在喷施前（0h）及喷施后0.5h、1h、3h、6h、9h、12h、24h剪取水稻叶片，放入液氮保存。用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取各水稻样品总RNA（方法参见Trizol说明书），再用DNaseI（RNase free，Promega公司）消化总RNA以去除基因组DNA污染（方法参见DNaseI说明书），继而用逆转录酶M-MLV（Invitrogen公司）将总RNA逆转录合成cDNA第一链（方法参见逆转录酶说明书），反应条件为：25℃5min；37℃60min；70℃10min。以cDNA为模板，将UBC基因作为内参基因（UBC基因扩增引物为：F3：5’-CCGTTTGTAGAGCCATAATTGCA-3’和R3：5’-AGGTTGCCTGAGTCACAGTTAAGTG-3’），利用OsWRKY28基因特异性引物F4（5’-GGCGCCGATTAAGGTTCTC-3’）和R4（5’-CCTGCAGCTCGGTGTACTTG-3’）进行实时定量PCR，反应条件为：95℃预变性2min，然后进入下列循环：95℃15sec，60℃35sec，共进行40个循环。在上述处理条件下的实时定量PCR检测结果显示OsWRKY28基因的表达能被立枯丝核菌侵染、SA和JA喷施处理不同程度地诱导而剧烈上调（如图1～3所示），表明OsWRKY28基因是一个与植物抗病防御反应相关的转录因子基因。
实施例3 OsWRKY28基因过量表达转基因水稻的产生和抗病鉴定
用AscI和BamHI对实施例1中获得的质粒pGEM-OsWRKY28进行双酶切，分离纯化OsWRKY28基因全长编码框序列，将该序列连接到如图4所示的植物表达载体pFGC1008（Kerschen et al.Effectiveness of RNA interference intransgenic plants.FEBS letters.2004,566(1)）的AscI和BamHI酶切位点之间，重组的详细步骤按TaKaRa公司限制性内切酶和T4连接酶说明书标准操作，将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，通过酶切筛选阳性克隆并进行测序确认，将正确的重组质粒命名为pRSE-OsWRKY28，其为含有OsWRKY28基因的过量表达载体。将该质粒转入农杆菌菌株LBA4404（Hiei et al.Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA.The Plant Journal.1994,6(2)）。
采用农杆菌介导法将OsWRKY28基因过量表达载体pRSE-OsWRKY28导入水稻品种9311。从9311的成熟胚诱导出胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织与农杆菌进行共培养（操作步骤详见Hiei et al.Efficient transformation of rice(Oryzasativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of theT-DNA.The Plant Journal.1994,6(2)），在含20～50mg/L潮霉素的培养基上进行抗性愈伤组织的筛选、预再生、再生及长根培养，最终产生T0代转基因植株（操作步骤详见Zhu et al.Enhancing disease resistances of Super Hybrid Rice with fourantifungal genes.Science in China Ser C.2007,50(1)）。
T0代转基因植株自交产生后代，选取6个（分别为株系2、5、7、11、16、17）独立的T3代OsWRKY28过量表达转基因纯合株系进行抗纹枯病鉴定。将转基因材料、野生型材料（即未转基因的水稻品种9311）、抗病对照品种奇妙香（李爱宏等.转基因株系及不同水稻品种的几丁质酶活力及纹枯病抗性.作物学报,2003,29(4)）和感病对照品种Lemont（Rodrigues et al.Effect of silicon and hostresistance on sheath blight development in rice.Plant Disease.2001,85(8)）浸种催芽后播种在营养土（Jiffy公司）中育苗，3周后将秧苗移栽到泥土中，每盆（直径15cm）种1株。水稻长至分蘖期（10周龄）时接种纹枯病菌菌株RH-9，接种方法参见实施例1，每株植株选3个分蘖茎秆接种，将接菌的水稻材料移至25～28℃荫棚下迷雾保湿。7d后调查发病情况，测量接种茎秆上病斑的长度，将每株植株接种的茎秆上所有的病斑长度加在一起得到该植株的总病斑长度。结果表明（如图5和6所示），OsWRKY28过量表达转基因水稻茎秆上的病斑长度明显小于野生型对照植株，OsWRKY28过量表达能够增强水稻对纹枯病的抗性。
实施例4 OsWRKY28基因调控下游抗病防御反应基因的分析
选取6个（分别为株系2、5、8、10、13、17）独立的T3代OsWRKY28过量表达转基因纯合株系，分析可能受OsWRKY28基因调控的下游抗病防御反应基因。选取8个有代表性的抗病防御反应基因，分别是PR1a、PR1b、PR10、NH1、PBZ1、Betv1、LOX、PAL1。将转基因材料、野生型材料在正常条件下培养至3周，剪取水稻苗的叶片，用实施例1的方法提取叶片总RNA及进行反转录PCR检测。抗病防御反应基因的特异性引物分别是：PR1a基因上游引物F5（5’-TTATCCTGCTGCTTGCTGGT-3’）和下游引物R5（5’-GGTCGTACCACTGCTTCTCC-3’）；PR1b基因上游引物F6（5’-ACGGGCGTACGTACTGGCTA-3’）和下游引物R6（5’-CTCGGTATGGACCGTGAAG-3’）；PR10基因上游引物F7（5’-CGCAGCTCACATTATCAAGTCAGA-3’）和下游引物R7（5’-GAAGCAGCAATACGGAGATGGATG-3’）；NH1基因上游引物F8（5’-TGGCAGGTGAGAGTCTACGA-3’）和下游引物R8（5’-AGGTGGATTTGCACCAGAAC-3’）；PBZ1基因上游引物F9（5’-ATGGCTCCGGCCTGCGTCTCCGA-3’）和下游引物R9（5’-GGCATATTCGGCAGGGTGAGCGA-3’）；Betv1基因上游引物F10（5’-GCAGGGAGCGTATACAAGACCAA-3’）和下游引物R10（5’-CACGCCACAGTAACATGACCACAA-3’）；LOX基因上游引物F11（5’-GGAGAGGTTCCTGGACAA-3’）和下游引物R11（5’-AGATGGATGTGCTGTTGG-3’）；PAL1基因上游引物F12（5’-GACACTCAGCACCAACTC-3’）和下游引物R12（5’-TTGATAGCCACAAGAACCTT-3’）。结果表明（图7），PR1a等8个抗病防御反应基因在OsWRKY28过量表达转基因水稻中的表达得以明显提高，很可能是受OsWRKY28基因调控的下游靶基因。
实施例5 OsWRKY28基因沉默表达转基因水稻的产生和抗病鉴定
在NCBI数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对OsWRKY28基因mRNA序列，在其3’端及非编码区找到以下特异性区间，可作为靶区间构建OsWRKY28的RNAi基因沉默载体。
AAGAACTGATCCATCGTTAGAACGCCGATGAACTTTGCTCGATTTAGCTGAGATCGATCGATCAATTTACACGGTAAAATTTTAGAGTTGATCGATTTGCATGGCTTTGATCGGAGTTAGGCTAGAGAGAGAGAGGATTAACTGTGTATATTTAGTGATTGATTTTAATTAGCTCGCTCTACACGTGCCAAGGTGGCAGTTTAAGCAAAACGTACGATAATTCGTTGCAATTTGTAATTCAGCTAGAAGATTAGTGTATTCATGGAGATCTATTCAGAGTCTCCCAGATATATATATAGAGAGAG；
OsWRKY28基因沉默载体的构建过程与上述过量表达载体构建过程类似：以同样的方法获得立枯丝核菌诱导的叶片cDNA文库，作为模板，用OsWRKY28基因特异性引物F2（5’-CGACTAGTGGCGCGCCAAGAACTGATCCATCGTTAGAAC-3’，下划线处分别为SpeI、AscI酶切位点）和R2（5’-CATGGATCCATTTAAATCTCTCTCTATATATATATC-3’，下划线处分别为BamHI、SwaI酶切位点）进行PCR，扩增出含有上述OsWRKY28基因特异性序列的DNA片段，反应条件为：94℃预变性2min；96℃30sec，60℃30sec，72℃2min，30个循环；72℃延伸2min。将获得的含有OsWRKY28基因特异性序列的DNA片段用AscI和SwaI双酶切后插入pFGC1008载体的相应酶切位点得到中间载体，再将含有OsWRKY28基因特异性序列的DNA片段用Bam HI和SpeI双酶切后插入中间载体的相应酶切位点，具体重组步骤按TaKaRa公司限制性内切酶和T4连接酶说明书标准操作，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，通过PCR及测序鉴定为正确的阳性克隆即含有OsWRKY28基因沉默载体，命名为pRSI-OsWRKY28。
将pRSI-OsWRKY28转入农杆菌菌株LBA4404，采用农杆菌介导的转化法将这一OsWRKY21基因沉默载体导入9311受体材料，获得转基因植株（具体方法与实施例3相同）。
选取6个（分别为株系1、4、9、11、12、18）独立的OsWRKY28 RNAi转基因纯合株系进行抗纹枯病鉴定，立枯丝核菌接种方法与实施例3类似，不同之处是在接种前1天用100μM JA对OsWRKY28 RNAi植株和野生型植株进行喷施预处理。结果表明（如图8和9所示），OsWRKY28基因沉默转基因水稻茎秆上的病斑长度大于野生型对照植株，证实了OsWRKY28基因沉默使水稻对立枯丝核菌的侵染更加敏感。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.水稻OsWRKY28转录因子基因在改良植物抗病性中的应用，其特征在于：所述的水稻OsWRKY28转录因子基因在培育抗纹枯病植物品种中的应用；所述的水稻OsWRKY28转录因子基因为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻WRKY转录因子基因OsWRKY28。
2.根据权利要求1所述的水稻OsWRKY28转录因子基因在改良植物抗病性中的应用，其特征在于：所述的植物是对立枯丝核菌敏感的植物。
3.根据权利要求2所述的水稻OsWRKY28转录因子基因在改良植物抗病性中的应用，其特征在于：所述的植物为水稻、玉米、高粱、小麦、马铃薯、大豆、胡萝卜、番茄或棉花。
4.根据权利要求1～3任一项所述的水稻OsWRKY28转录因子基因在改良植物抗病性中的应用，其特征在于步骤如下：应用植物基因工程技术，将水稻WRKY转录因子基因OsWRKY28转化入植物细胞，得到表达OsWRKY28转录因子的植物品种。
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