CN114989283A

CN114989283A - Tcp19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用

Info

Publication number: CN114989283A
Application number: CN202210680893.3A
Authority: CN
Inventors: 孙倩; 玄元虎; 林秋君; 梅琼; 杨硕; 陈欢; 李卓
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2022-06-15
Filing date: 2022-06-15
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2042-06-15
Also published as: CN114989283B

Abstract

本发明提供了TCP19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用，涉及生物技术领域。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑对受体水稻中的TCP19蛋白质的编码基因进行编辑，获得TCP19敲除的转基因植株tcp19。同时通过过表达转基因技术获得TCP19过表达转基因植株TCP19‑OX。通过纹枯病抗性鉴定发现，与野生型水稻对照相比，tcp19更抗病，TCP19‑OX更感病。证实TCP19蛋白与水稻对纹枯病的抗性相关，TCP19敲除增强水稻对纹枯病的抗性，可用于创制水稻纹枯病抗性新种质，证实了本发明所述应用对水稻抗纹枯病种质资源创制和纹枯病的有效防控具有重要意义。

Description

TCP19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及TCP19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用。

背景技术

水稻纹枯病(Rice sheath blight)是一种世界性病害，由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起。该病菌寄主范围广，致病力强，严重影响水稻高产稳产。目前，病害防控手段以化学防治为主，但化学防治成本高、污染环境，且易导致病原菌产生抗药性。因此，采用资源节约型和环境友好型防治措施成为农业生产的迫切需求。选育和栽培抗病品种是水稻纹枯病最为经济、安全和有效的防治策略。

转录调控是真核生物基因表达调控的重要机制。植物在受到病原物侵袭时，入侵信号会通过一个复杂的级联途径传递到植物细胞内，激发转录因子启动下游靶基因的转录表达，作为抗病响应。目前，已有多项研究证实转录因子参与水稻抗纹枯病调控。前人研究表明，WRKY家族中转录因子OsWRKY4、OsWRKY80和OsWRKY13均正调控水稻对纹枯病的抗性；转录因子OsASR2可通过调控防御基因Os2H16的表达提高对纹枯病的抗性；过表达转录因子LPA1可激活PIN-FORMED1a提高水稻对纹枯病的抗性；LPA1可与转录因子OsIDD3和OsIDD13形成转录复合体共同调控水稻对纹枯病的抗性。但是目前关于转录因子调控水稻纹枯病的研究较少，仍有待继续深入挖掘并研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供TCP19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用，TCP19转录因子负调控水稻对纹枯病的防御反应，TCP19过表达对纹枯病更敏感，敲除TCP19增强水稻对纹枯病的抗性，对水稻抗纹枯病种质资源创制和纹枯病的有效防控具有重要意义。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了TCP19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用，所述TCP19蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，编码所述TCP19蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种高抗水稻纹枯病的水稻种质的创制方法，包括抑制目标水稻的基因组中TCP19蛋白的表达。

优选的，所述抑制的方法包括基因敲除。

有益效果：本发明提供了TCP19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用，实施例中通过CRISPR/Cas9基因编辑对受体水稻中的TCP19蛋白质的编码基因进行编辑，获得TCP19敲除的转基因植株tcp19。同时通过过表达转基因技术获得TCP19过表达转基因植株TCP19-OX。通过纹枯病抗性鉴定发现，与野生型水稻对照相比，tcp19更抗病，TCP19-OX更感病。证实TCP19蛋白与水稻对纹枯病的抗性相关，TCP19敲除增强水稻对纹枯病的抗性，可用于创制水稻纹枯病抗性新种质，证实了本发明所述应用对水稻抗纹枯病种质资源创制和纹枯病的有效防控具有重要意义。

附图说明

图1为tcp19转化株系测序分析图；

图2为TCP19-OX转化株系分子检测图；

图3为tcp19和TCP19-OX转基因水稻接种纹枯病后表型。

具体实施方式

本发明提供了TCP19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用，所述TCP19蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：MDVTGDGGGGGQRPNFPLQLLGKKEEQTCSTSQTAGAGGGGVVGANGSAAAAPPKRTSTKDRHTKVDGRGRRIRMPAICAARVFQLTRELGHKTDGETIEWLLQQAEPAVIAATGTGTIPANFTSLNISLRSSGSSLSIPSHLRLAGLAGPRFGGGARAADAWDRVVGLGFGGAADAPSSATSSSSSPLLLSFHSGSVGLDVSPPSASTSPAAADLSRKRRWEQEMQQQQQYQQQMAGYTQSQIPAGTVWMVPSSNAQAAGGGAPPGGGGESIWTFPQSG。

在本发明中，编码所述TCP19蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示：ATGGATGTCACCGGAGACGGCGGAGGAGGAGGGCAACGGCCCAATTTCCCCCTGCAGCTCCTCGGGAAGAAGGAGGAGCAGACGTGCTCGACGTCGCAGACTGCCGGGGCGGGCGGCGGCGGCGTCGTGGGCGCGAATGGGTCGGCGGCGGCGGCGCCGCCGAAGCGGACGTCGACGAAGGACCGGCACACGAAGGTGGACGGGCGGGGGCGGCGCATCCGGATGCCGGCGATCTGCGCCGCGCGGGTGTTCCAGCTGACGCGGGAGCTCGGGCACAAGACCGACGGCGAGACCATCGAGTGGCTGCTGCAGCAGGCGGAGCCGGCGGTGATCGCGGCGACCGGGACGGGCACCATCCCGGCCAACTTCACCTCCCTCAACATCTCCCTCCGCTCCTCCGGCTCGTCGCTCTCCATCCCTTCTCACCTCCGCCTTGCCGGCTTGGCTGGCCCTCGCTTCGGCGGCGGCGCGCGGGCGGCGGACGCGTGGGACCGCGTCGTCGGCCTCGGGTTCGGCGGTGCGGCCGACGCCCCGTCCTCCGCCACCTCCTCCTCCTCGTCGCCGCTTCTGCTGAGCTTCCACTCCGGTAGCGTCGGCCTTGACGTGTCGCCGCCGTCGGCGTCGACCTCCCCGGCCGCCGCCGACCTCTCCCGGAAGCGGCGGTGGGAGCAAGAAATGCAGCAGCAGCAGCAGTACCAGCAGCAGATGGCCGGGTACACGCAGAGCCAAATTCCTGCGGGCACGGTGTGGATGGTGCCGAGCAGCAACGCGCAGGCCGCCGGTGGCGGCGCTCCGCCGGGAGGCGGCGGCGAGTCGATTTGGACGTTCCCGCAGTCAGGGAGCGGCGGCGGCGGCGGCGCGGCGACAGTGTACCGTGGCGTGCCAAGCGGACTACATTTCATGAACTTCCCGGCGACACCAATGGCGCTGCTCCCCGGCGGGCAGCAGCTCGGCCTCGCCGGCGCCGGCGGGGGTGGCGAGGGGCACCCGGGGATCCTCGCCGCGCTCAATGCCTACCGCGCACAGGCCGCGCAGCCGGACGCCGGCGCGGCGGCGCAGAATGGAGCGCAAGGCTCAAGTCAGCATCGTCAGCATCAGCATCACGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGACGAGCGGCATGAGAGCATGAGCGCCAGCGACTCGTAG。

本发明所述调控优选包括通过基因编辑方法，对水稻基因组中的TCP19蛋白质的编码基因进行敲除和超表达，并通过纹枯病抗性鉴定，结果发现与野生型水稻对照相比，经基因敲除后的突变株更抗病，超表达的突变株更感病，证实TCP19蛋白与水稻对纹枯病的抗性相关，TCP19敲除增强水稻对纹枯病的抗性，可用于创制水稻纹枯病抗性新种质。本发明对所述TCP19敲除的方法并没有特殊限定，优选包括利用CRISPR/Cas9基因编辑对受体水稻中的TCP19蛋白质的编码基因进行编辑。

本发明所述抑制TCP19蛋白表达，优选包括敲除水稻基因组中TCP19蛋白的编码基因。本发明优选通过CRISPR/Cas9基因编辑技术进行基因敲除，实施例中优选提供TCP19基因序列给公司，由百格基因科技有限公司进行靶位点序列设计、引物设计、载体构建及转化。

本发明所述抑制的方法优选包括基因敲除，所述基因敲除的方法优选包括CRISPR/Cas9基因编辑。本发明所述CRISPR/Cas9基因编辑的方法优选与上述相同，在此不再赘述。

下面结合实施例对本发明提供的TCP19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

CRISPR/Cas9基因编辑转基因水稻植株tcp19的获得

1)转基因水稻的获得

提供TCP19基因序列(SEQ ID NO.2)给公司，由公司进行靶位点序列设计、引物设计、载体构建及转化，转化水稻品种ZH11。最终得到T₀代转基因水稻。

2)转基因水稻的鉴定

得到的转基因植株进一步经测序分析验证，如图1所示。通过对阳性植株测序分析发现，5#和12#植株在TCP19编码区281bp处增加了1个T碱基，而25#和26#突变体植株在281bp处增加了1个G碱基(图1中A)，图谱分析显示25#为杂合态，5#、12#和26#为纯合态(图1中B)。

测序引物：TCP19-F1(SEQ ID NO.3)：TCCTCGGGAAGAAGGAGGAG

TCP19-R1(SEQ ID NO.4)：AAGCGAGGGCCAGCCAAG。

实施例2

TCP19过表达转基因水稻植株的获得

1)用于过表达TCP19基因的重组载体构建

OsTCP19基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2第1-1164位核苷酸，编码的蛋白为OsTCP19，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

扩增序列片段克隆入植物表达载体PGA1611载体(Piao HL,XuanYH,Park SH,JeBI,Park SJ,Park SH,Kim CM,Huang J,Wang GK,Kim MJ,Kang SM,Lee IJ,Kwon TR,KimYH,Yeo US,Yi G,Son D,Han CD.OsCIPK31,aCBL-interactingprotein kinase isinvolved in germination and seedling growth under abiotic stress conditionsin rice plants.Mol Cells.2010,30:19-27；公众可从韩国国立庆尚大学获得)骨架连接，得到OsTCP19基因的过表达载体。

2)过表达OsTCP19基因转基因水稻的获得

将上述获得的PGA1611-OsTCP19过表达载体转入农杆菌LBA4404，并转化水稻品种ZH11，潮霉素筛选，获得T0代转PGA1611-OsTCP19水稻，即为TCP19-OX过表达转基因株系，命名为TCP19-OX。具体操作由未米生物公司完成。

2)TCP19-OX转基因水稻植株分子鉴定

对上述获得的7个T₀代TCP19-OX转基因水稻和野生型水稻ZH11(WT)进行分子鉴定，提取各种水稻根的总RNA经反转录后，用如下引物进行RT-PCR方法鉴定：

TCP19-F2(SEQ ID NO.5):TTGGCGACCTCGTATTGGGAA

TCP19-R2(SEQ ID NO.6):CAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACT

内参基因为Ubiquitin，内参引物为

Ubiquitin-F(SEQ ID NO.7):CACGGTTCAACAACATCCAG

Ubiquitin-R(SEQ ID NO.8):TGAAGACCCTGACTGGGAAG

结果如图2所示，TCP19-OX转基因水稻OX12、OX17和OX31中TCP19表达量均明显比野生型高。

实施例3

tcp19转基因水稻和TCP19-OX转基因水稻接种抗纹枯病后表型观察

采用活体和离体接种纹枯病菌的方法进行抗性鉴定。

离体接种：将4℃保存的常规纹枯病菌菌株接种于PDA平板培养基上，待2-3d长满皿备用。水稻生长到4-5叶期时，从顶叶剪取10cm左右的叶段，叶背朝上平铺于灭菌的用6-BA润湿的滤纸上。将长满菌的PDA平板用灭菌的打孔器打孔，菌饼贴于水稻叶片中间平整部位上，每个处理10片叶段，设置3次重复。喷布无菌水对叶片进行保湿，26℃培养箱培养。每12h调查记录病斑扩展情况。

活体接种：用喷壶将待接菌的水稻叶鞘部位喷湿。用无菌镊子取长满纹枯病菌菌丝的木皮，插入水稻植株下数第三片叶子的叶鞘中。再次用喷壶喷湿夹有木皮的叶鞘部位，用保鲜膜缠住接菌部位进行保湿，置于正常生长条件下继续培养。72h后取下保鲜膜。每个处理3次重复。接种10～15d后调查统计。

tcp19突变体植株活体接种结果显示，tcp19突变体植株的病斑小于野生型病斑，26#植株表现更抗病(图3中A)；离体接种病斑面积占叶片面积显著高于突变体植株，与活体结果相一致(图3中B)。

TCP19-OX转基因植株离体接种结果显示过表达植株的病斑面积占叶片面积的70％以上，而野生型只有30％左右，且过表达植株的云纹状病斑更典型(图3中C)；活体接种时，病斑长度较野生型也更长(图3中D)，说明过表达植株更感纹枯病菌。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> TCP19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 280

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Val Thr Gly Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gln Arg Pro Asn Phe

1 5 10 15

Pro Leu Gln Leu Leu Gly Lys Lys Glu Glu Gln Thr Cys Ser Thr Ser

20 25 30

Gln Thr Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Val Val Gly Ala Asn Gly Ser

35 40 45

Ala Ala Ala Ala Pro Pro Lys Arg Thr Ser Thr Lys Asp Arg His Thr

50 55 60

Lys Val Asp Gly Arg Gly Arg Arg Ile Arg Met Pro Ala Ile Cys Ala

65 70 75 80

Ala Arg Val Phe Gln Leu Thr Arg Glu Leu Gly His Lys Thr Asp Gly

85 90 95

Glu Thr Ile Glu Trp Leu Leu Gln Gln Ala Glu Pro Ala Val Ile Ala

100 105 110

Ala Thr Gly Thr Gly Thr Ile Pro Ala Asn Phe Thr Ser Leu Asn Ile

115 120 125

Ser Leu Arg Ser Ser Gly Ser Ser Leu Ser Ile Pro Ser His Leu Arg

130 135 140

Leu Ala Gly Leu Ala Gly Pro Arg Phe Gly Gly Gly Ala Arg Ala Ala

145 150 155 160

Asp Ala Trp Asp Arg Val Val Gly Leu Gly Phe Gly Gly Ala Ala Asp

165 170 175

Ala Pro Ser Ser Ala Thr Ser Ser Ser Ser Ser Pro Leu Leu Leu Ser

180 185 190

Phe His Ser Gly Ser Val Gly Leu Asp Val Ser Pro Pro Ser Ala Ser

195 200 205

Thr Ser Pro Ala Ala Ala Asp Leu Ser Arg Lys Arg Arg Trp Glu Gln

210 215 220

Glu Met Gln Gln Gln Gln Gln Tyr Gln Gln Gln Met Ala Gly Tyr Thr

225 230 235 240

Gln Ser Gln Ile Pro Ala Gly Thr Val Trp Met Val Pro Ser Ser Asn

245 250 255

Ala Gln Ala Ala Gly Gly Gly Ala Pro Pro Gly Gly Gly Gly Glu Ser

260 265 270

Ile Trp Thr Phe Pro Gln Ser Gly

275 280

<210> 2

<211> 1164

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggatgtca ccggagacgg cggaggagga gggcaacggc ccaatttccc cctgcagctc 60

ctcgggaaga aggaggagca gacgtgctcg acgtcgcaga ctgccggggc gggcggcggc 120

ggcgtcgtgg gcgcgaatgg gtcggcggcg gcggcgccgc cgaagcggac gtcgacgaag 180

gaccggcaca cgaaggtgga cgggcggggg cggcgcatcc ggatgccggc gatctgcgcc 240

gcgcgggtgt tccagctgac gcgggagctc gggcacaaga ccgacggcga gaccatcgag 300

tggctgctgc agcaggcgga gccggcggtg atcgcggcga ccgggacggg caccatcccg 360

gccaacttca cctccctcaa catctccctc cgctcctccg gctcgtcgct ctccatccct 420

tctcacctcc gccttgccgg cttggctggc cctcgcttcg gcggcggcgc gcgggcggcg 480

gacgcgtggg accgcgtcgt cggcctcggg ttcggcggtg cggccgacgc cccgtcctcc 540

gccacctcct cctcctcgtc gccgcttctg ctgagcttcc actccggtag cgtcggcctt 600

gacgtgtcgc cgccgtcggc gtcgacctcc ccggccgccg ccgacctctc ccggaagcgg 660

cggtgggagc aagaaatgca gcagcagcag cagtaccagc agcagatggc cgggtacacg 720

cagagccaaa ttcctgcggg cacggtgtgg atggtgccga gcagcaacgc gcaggccgcc 780

ggtggcggcg ctccgccggg aggcggcggc gagtcgattt ggacgttccc gcagtcaggg 840

agcggcggcg gcggcggcgc ggcgacagtg taccgtggcg tgccaagcgg actacatttc 900

atgaacttcc cggcgacacc aatggcgctg ctccccggcg ggcagcagct cggcctcgcc 960

ggcgccggcg ggggtggcga ggggcacccg gggatcctcg ccgcgctcaa tgcctaccgc 1020

gcacaggccg cgcagccgga cgccggcgcg gcggcgcaga atggagcgca aggctcaagt 1080

cagcatcgtc agcatcagca tcacggcggc ggcggcggcg gcggcgacga gcggcatgag 1140

agcatgagcg ccagcgactc gtag 1164

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctcgggaa gaaggaggag 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagcgagggc cagccaag 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttggcgacct cgtattggga a 21

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caaagatcgt tatgtttatc ggcact 26

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cacggttcaa caacatccag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgaagaccct gactgggaag 20

Claims

1.TCP19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用，其特征在于，所述TCP19蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，编码所述TCP19蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.一种高抗水稻纹枯病的水稻种质的创制方法，其特征在于，包括抑制目标水稻的基因组中TCP19蛋白的表达。

4.根据权利要求3所述创制方法，其特征在于，所述抑制的方法包括基因敲除。