CN112553241A

CN112553241A - OsHOX12蛋白及其编码基因在提高水稻对纹枯病抗性中的应用

Info

Publication number: CN112553241A
Application number: CN202011435135.2A
Authority: CN
Inventors: 玄元虎; 孙倩; 李天亚; 韩霄; 刘春�; 林抒今
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2040-12-10
Also published as: CN112553241B

Abstract

本发明涉及OsHOX12蛋白及其编码基因在提高水稻对纹枯病抗性中的应用。所述OsHOX12蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述OsHOX12编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明的有益效果主要体现在：本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对受体水稻中的OsHOX12蛋白质的编码基因进行编辑，获得OsHOX12基因功能丧失的转基因水稻OsHOX12CR‑KO。通过纹枯病抗性鉴定发现，与野生型水稻对照相比，OsHOX12CR‑KO转基因水稻发病较轻，极显著地提高了水稻对纹枯病的抗性，可用于创制水稻纹枯病抗性新种质。

Description

OsHOX12蛋白及其编码基因在提高水稻对纹枯病抗性中的应用

(一)技术领域

本发明涉及OsHOX12蛋白及其编码基因在提高水稻对纹枯病抗性中的应用。

(二)背景技术

水稻纹枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的一种土传真菌病害，为水稻的三大病害之一，也是一种危害遍布全球的水稻病害。该病害在水稻整个生育期均可发生，主要危害叶鞘、叶片，具有危害大、流行性强、寄主范围广等特点，严重影响水稻高产稳产。在农业生产上，水稻纹枯病的防治主要采用药剂防治和栽培管理，但长期使用化学药剂不仅造成环境污染，还会加快病原菌变异，产生耐药性，给纹枯病的防治带来极大的困难，培育稳定的抗病品种才是经济、有效、环保、根本的防治方法。水稻转基因育种技术已经被广泛应用，具有周期短、效率高等特点。目前，通过转基因技术对水稻基因进行操作已经培育了大量的水稻抗病及高产新品种。目前，由于我国抗纹枯病水稻种质资源的缺乏，还未发现对纹枯病高抗或免疫的水稻品种。因此，挖掘水稻纹枯病抗性相关基因，利用转基因育种技术改变抗性相关基因表达对水稻抗纹枯病种质资源创制和纹枯病的有效防控具有重要意义。

含同源异型盒(homeobox，HB)简称同源盒或同源框的蛋白是一类转录因子。HOX基因是同源异型盒家族的成员。HOX家族成员在植物生长发育和抗逆等环节起至关重要的作用。目前已有报道表明OsHOX12直接调控水稻赤霉素降解关键基因EUI1的表达从而影响水稻的生长发育。但转录因子OsHOX12在抗病过程中扮演的角色仍是未知的。有关OsHOX12编码基因与水稻纹枯病抗性间的关系，尤其是通过基因工程技术改变OsHOX12编码基因增强水稻对纹枯病抗性的研究，迄今未见报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供OsHOX12蛋白及其编码基因在提高水稻对纹枯病抗性中的应用。

本发明采用的技术方案是：

OsHOX12蛋白在提高水稻对纹枯病抗性中的应用。

具体的，所述OsHOX12蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

SEQ ID No.2序列如下：

MSREEDEKLLFPSFAFPAECFPEAATSGGEQKKARQRRRRKVKPEAAAALAGESGGDEQAKKRRLSDEQARFLEMSFKKERKLETPRKVQLAAELGLDAKQVAVWFQNRRARHKSKLMEEEFAKLRSAHDAVVLQNCHLETELLKLKERLADVEEEKAKLAAVAAATTGGGGGGGGGSSSPTSSSFSTVTYHPALAGQFGVEAAAEEADLTYMSEYAYNSYMLELAAAGYCGGVYDQFS*。

本发明还涉及OsHOX12编码基因在提高水稻对纹枯病抗性中的应用。

具体的，所述OsHOX12编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。SEQ ID No.1序列如下：

具体的，所述应用为：通过基因编辑，使水稻OsHOX12基因功能丧失，得到对纹枯病抗性增强的转基因水稻。

所述基因编辑方法为：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在OsHOX12基因第566位碱基后插入碱基T，使OsHOX12基因功能丧失，获得转基因水稻OsHOX12CR-KO。

本发明的有益效果主要体现在：本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对受体水稻中的OsHOX12蛋白质的编码基因进行编辑，获得OsHOX12基因功能丧失的转基因水稻OsHOX12CR-KO。通过纹枯病抗性鉴定发现，与野生型水稻对照相比，OsHOX12CR-KO转基因水稻发病较轻，极显著地提高了水稻对纹枯病的抗性，可用于创制水稻纹枯病抗性新种质。

(四)附图说明

图1为OsHOX12在接种纹枯病菌后不同时间点的相对表达水平。

图2为OsHOX12CR-KO转基因水稻测序分析图。

图3为OsHOX12CR-KO转基因水稻接种纹枯病后表型。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：OsHOX12在接种纹枯病菌后不同时间点的相对表达水平检测

将4℃保存的纹枯病菌菌株——立枯丝核菌AG1-IA菌株(菌株由沈阳农业大学魏松红老师实验室提供)于超净工作台内接种在PDA培养基上，置于26℃培养箱连续培养2～3d，用0.7cm无菌打孔器在菌落边缘取菌饼用于接菌实验。

在灭菌的培养皿中放入两张用无菌水浸湿的已灭菌滤纸，选取健康无病虫害损伤的、叶龄相同的野生型水稻叶片，剪成大小均等的七份，叶背朝上，整齐的摆放在滤纸上，用接种针或牙签在每片叶子的中部位置扎一个小眼，将打孔器提前打好的菌饼接种在叶片打孔位置，盖上盖子后置于27℃培养室培养，将湿度保持在90％左右，三次重复。

对接种立枯丝核菌后0、24、48、72h的野生型水稻叶片取样，提取水稻叶片RNA，反转录为cDNA，用如下引物进行RT-PCR方法鉴定：

OsHOX12引物为：

OsHOX12-F:GCGCCGACGGAGGATTAA；

OsHOX12-R:AGGGCAACACGACTGATGAT；

内参基因为Ubiquitin，内参引物为：

Ubiquitin-F:CACGGTTCAACAACATCCAG；

Ubiquitin-R:TGAAGACCCTGACTGGGAAG。

结果如图1所示，OsHOX12在接种纹枯病菌后表达量上调，且随着接菌时间变长，表达量逐渐上调。

实施例2：CRISPR/Cas9基因编辑转基因水稻植株OsHOX12CR-KO的获得

1)转基因水稻的获得

提供OsHOX12基因序列(SEQ ID No.1)给百格基因科技有限公司，由公司进行靶位点序列设计、引物设计、载体构建及转化，转化水稻品种中花11。最终得到T0代转基因水稻。

2)转基因水稻的鉴定

得到的转基因植株进一步经测序分析验证，结果如图1所示。通过对阳性植株测序分析发现，其序列1所示的OsHOX12编码基因序列的第566位碱基后插入了碱基T，使OsHOX12基因功能丧失(图2)，将此基因编辑植株命名为OsHOX12CR-KO。

实施例3：OsHOX12CR-KO转基因水稻接种纹枯病菌后表型观察

采用纹枯病菌接种水稻离体叶片的方法进行抗性鉴定。将野生型对照、OsHOX12CR-KO转基因水稻叶片接纹枯病菌。

将4℃保存的纹枯病菌菌株于超净工作台内接种在PDA培养基上，置于26℃培养箱连续培养2～3d，用0.7cm无菌打孔器在菌落边缘取菌饼用于接菌实验。

在灭菌的培养皿中放入两张用无菌水浸湿的已灭菌滤纸，选取健康无病虫害损伤的、叶龄相同的叶片，剪成大小均等的七份，叶背朝上，整齐的摆放在滤纸上，用接种针或牙签在每片叶子的中部位置扎一个小眼，将打孔器提前打好的菌饼接种在叶片打孔位置，盖上盖子后置于27℃培养室培养，将湿度保持在90％左右，三次重复。

接种后72h拍照，结果如图3所示，与野生型对照相比，OsHOX12CR-KO转基因水稻发病较轻，病斑面积仅占叶片面积15％左右(图3A，B)，表明OsHOX12基因功能的丧失可显著提高水稻对纹枯病的抗性。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> OsHOX12蛋白及其编码基因在提高水稻对纹枯病抗性中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atgagccgtg aggaggatga gaagctgctg ttcccttcgt tcgccttccc ggcggagtgc 60

ttcccggaag ccgccacctc cggtggcgag cagaagaagg ctcggcagcg gcggaggagg 120

aaggtgaagc cggaagcggc ggcagcgttg gctggagaga gcggagggga tgagcaggcg 180

aagaagcggc ggctgagcga cgagcaggcg cggtttctgg agatgagctt caagaaggag 240

cggaagctgg agacgccgcg caaggtgcag ctcgccgcgg agctgggcct cgacgccaag 300

caggtcgccg tctggttcca gaaccgccgc gcccgccaca agagcaagct catggaggag 360

gagttcgcca agctccgctc cgcccacgac gccgtcgtcc tccagaactg ccacctcgag 420

accgagttgc tgaagctgaa ggagaggctg gcggatgtag aggaggagaa ggcgaagcta 480

gcagctgtcg ccgcggcgac gaccggcggc ggtggtggcg gcggcggcgg cagcagcagc 540

ccgacctcgt cgtcgttctc cacggtgacg taccacccgg cgctggcggg gcagttcggc 600

gtggaggcgg cggccgagga ggccgacctc acctacatga gtgagtacgc gtacaacagc 660

tacatgctgg agttggcggc ggccggctac tgcggcgggg tctacgacca attcagctga 720

<210> 2

<211> 239

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Ser Arg Glu Glu Asp Glu Lys Leu Leu Phe Pro Ser Phe Ala Phe

1 5 10 15

Pro Ala Glu Cys Phe Pro Glu Ala Ala Thr Ser Gly Gly Glu Gln Lys

20 25 30

Lys Ala Arg Gln Arg Arg Arg Arg Lys Val Lys Pro Glu Ala Ala Ala

35 40 45

Ala Leu Ala Gly Glu Ser Gly Gly Asp Glu Gln Ala Lys Lys Arg Arg

50 55 60

Leu Ser Asp Glu Gln Ala Arg Phe Leu Glu Met Ser Phe Lys Lys Glu

65 70 75 80

Arg Lys Leu Glu Thr Pro Arg Lys Val Gln Leu Ala Ala Glu Leu Gly

85 90 95

Leu Asp Ala Lys Gln Val Ala Val Trp Phe Gln Asn Arg Arg Ala Arg

100 105 110

His Lys Ser Lys Leu Met Glu Glu Glu Phe Ala Lys Leu Arg Ser Ala

115 120 125

His Asp Ala Val Val Leu Gln Asn Cys His Leu Glu Thr Glu Leu Leu

130 135 140

Lys Leu Lys Glu Arg Leu Ala Asp Val Glu Glu Glu Lys Ala Lys Leu

145 150 155 160

Ala Ala Val Ala Ala Ala Thr Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

165 170 175

Gly Ser Ser Ser Pro Thr Ser Ser Ser Phe Ser Thr Val Thr Tyr His

180 185 190

Pro Ala Leu Ala Gly Gln Phe Gly Val Glu Ala Ala Ala Glu Glu Ala

195 200 205

Asp Leu Thr Tyr Met Ser Glu Tyr Ala Tyr Asn Ser Tyr Met Leu Glu

210 215 220

Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Val Tyr Asp Gln Phe Ser

225 230 235

Claims

1.OsHOX12蛋白在提高水稻对纹枯病抗性中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述OsHOX12蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.OsHOX12编码基因在提高水稻对纹枯病抗性中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述OsHOX12编码基因核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

5.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述用于为：通过基因编辑，使水稻OsHOX12基因功能丧失，得到对纹枯病抗性增强的转基因水稻。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述基因编辑方法为：在OsHOX12基因第566位碱基后插入碱基T。