CN112725350A

CN112725350A - Os03g57880蛋白及其编码基因在提高水稻对纹枯病抗性中的应用

Info

Publication number: CN112725350A
Application number: CN202011551427.2A
Authority: CN
Inventors: 韩霄; 玄元虎; 林抒今; 刘春�; 孙倩; 周天革
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2021-04-30

Abstract

本发明涉及Os03g57880蛋白及其编码基因在提高水稻对纹枯病抗性中的应用，所述Os03g57880蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述Os03g57880编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明的有益效果主要体现在：本发明通过基因编辑技术对受体水稻中的Os03g57880蛋白质的编码基因进行编辑，获得Os03g57880基因过表达的转基因水稻。通过纹枯病抗性鉴定发现，与野生型水稻对照相比，Os03g57880基因过表达转基因水稻植株表现抗病，因此Os03g57880蛋白及其编码基因可用于创制水稻纹枯病抗性新种质。

Description

Os03g57880蛋白及其编码基因在提高水稻对纹枯病抗性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及Os03g57880蛋白及其编码基因在提高水稻对纹枯病抗性中的应用。

背景技术

水稻纹枯病是由立枯丝核菌（RhizoctoniasolaniKühn）引起的一种土传真菌病害，为水稻的三大病害之一，也是一种危害遍布全球的水稻病害。该病害在水稻整个生育期均可发生，主要危害叶鞘、叶片，具有危害大、流行性强、寄主范围广等特点，严重影响水稻高产稳产。在农业生产上，水稻纹枯病的防治主要采用药剂防治和栽培管理，但长期使用化学药剂不仅造成环境污染，还会加快病原菌变异，产生耐药性，给纹枯病的防治带来极大的困难，培育稳定的抗病品种才是经济、有效、环保、根本的防治方法。水稻转基因育种技术已经被广泛应用，具有周期短、效率高等特点。目前，通过转基因技术对水稻基因进行操作已经培育了大量的水稻抗病及高产新品种，但是，由于我国抗纹枯病水稻种质资源的缺乏，还未发现对纹枯病高抗或免疫的水稻品种。挖掘水稻纹枯病抗性相关基因，利用转基因育种技术改变抗性相关基因表达对水稻抗纹枯病种质资源创制和纹枯病的有效防控具有重要意义。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明目的是提供了一种Os03g57880蛋白、编码基因及其在提高水稻对纹枯病抗性中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种水稻Os03g57880抗病蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

SEQ ID No.1序列如下：

ATGGCGGATCTCGCCGTGCTCCAGTGGTGGCTCGGCGCGATGGTGGCAATGGCGGCGGCCGCGTCGTGGTCCGGCGGTGTCCTGCCGGCGGCGGAGGCGCTGGGGATGAACTGGGGCACGCAGGCGTCGCACCCGCTGCCGCCCAAGATCGTGGCGCAGCTGCTCCAGGACAATGGGATCAAGAAGGTGAAGCTGTTCGACGCCGACCAGGACACCCTCAGCGCGCTCGCCGGGACCGGCATCGAGGTCATGGTCGCCATCCCCAACGTCATGCTCGACTCCATCACGGACTACGACACCGCCAAGGAGTGGGTCCGCCGCAACGTCTCCCGCTACAACTTCGACGGCGGCGTCACCATCAAGTACGTCGCCGTCGGGAACGAGCCGTTCTTGGCGGCATACAATGGCACGTTCGACAAGGTGACGCTGCCGGCGCTGATGAACATCCAGAACGCGCTGAACGACGCCGGCCTCGGCGACAGCATCAAGGCCACCGTGCCGCTCAACGCCGACGTATACGACTCGCCGCAGGACCAGCAGGTGCCGTCGGCGGGGCGGTTCCGCGCCGACATCGCCGACCTGATGACGCAGATGGTGCAGTTCCTGGCCAACAACAGCGCGCCGTTCACCGTCAACATCTACCCTTTCATCAGCCTCTACCTCAACGACGACTTCCCCGTCGACTTCGCCTTCTTCGACGGCGGCGCGACGCCGGTGGTGGACAACGGCATCTCCTACACCAACGTGTTCGACGCCAACTTCGACACGCTGGTGGCGGCGCTCAAGGGCGTCGGCCACGGCGACATGCCCATCGTCGTCGGCGAGGTCGGCTGGCCCACCGACGGCGACAAGCACGCCACCGCCACCTACGCGCAGCGCTTCTACAACGGCCTCCTCAAGCGCCTCGCCGCCAACGCCGGCACGCCGGCGCGGCCGGGGCAGTACATCGAGGTCTACCTCTTCGGCCTCCTCGACGAGGACGCCAAGAGCGTGGCGCCGGGCGACTTCGAGCGCCATTGGGGCATCCTCCGGTTCGACGGCCAGCCCAAGTACCCCGTCGACCTCACCGGGCAGGGCCAGAACACCATGCTCGTGCCGGCCAAGGGCGTGACGTACCTGCCCAGGACGTGGTGCGTCATCAACACCAACGCCAAGGACACCAGCAAGCTCGCCGACAACATCAACTTCGCCTGCACCTTCGCCGACTGCACGGCGCTCGGCTACGGCTCAACCTGCGCCGGCATGGACGCCAATGGCAACGCCTCCTACGCCTTCAACGCCTACTTCCAGGTTCAGAACCAGAAGGACGACGCCTGCGACTTCCAGGGGCTCGCCATGCCCACGCAGACCGACCCCTCCACCCCGGCCTGCAACTTCACAATACAGATCGCCGCCACCTCGGCGGGTCACCGGCGGCGAGCCGGCGCCGCCGTGCTAGCGCTGCTGGCTTTGTTCCGTTTGTTCTTGCTGCATTAG。

发明人发现胼胝质（callose）是一种以β-1,3键结合的葡聚糖，是围绕每个筛孔的边缘积累的碳水化合物，胼胝质的沉积在植物生长发育和抗病性等方面发挥着重要的作用，而Os03g57880编码的蛋白可以调控胼胝质的沉积，从而影响植物的生长发育和抗病机制。

一种水稻Os03g57880抗病蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

SEQ ID No.2序列如下：

MADLAVLQWWLGAMVAMAAAASWSGGVLPAAEALGMNWGTQASHPLPPKIVAQLLQDNGIKKVKLFDADQDTLSALAGTGIEVMVAIPNVMLDSITDYDTAKEWVRRNVSRYNFDGGVTIKYVAVGNEPFLAAYNGTFDKVTLPALMNIQNALNDAGLGDSIKATVPLNADVYDSPQDQQVPSAGRFRADIADLMTQMVQFLANNSAPFTVNIYPFISLYLNDDFPVDFAFFDGGATPVVDNGISYTNVFDANFDTLVAALKGVGHGDMPIVVGEVGWPTDGDKHATATYAQRFYNGLLKRLAANAGTPARPGQYIEVYLFGLLDEDAKSVAPGDFERHWGILRFDGQPKYPVDLTGQGQNTMLVPAKGVTYLPRTWCVINTNAKDTSKLADNINFACTFADCTALGYGSTCAGMDANGNASYAFNAYFQVQNQKDDACDFQGLAMPTQTDPSTPACNFTIQIAATSAGHRRRAGAAVLALLALFRLFLLH*。

一种水稻Os03g57880抗病蛋白编码基因在增强水稻植株对纹枯病的抗性方面的应用。

一种能过表达Os03g57880抗病蛋白编码基因的水稻的培育方法，其特征在于，所述的培育方法包括如下步骤：

a、水稻Os03g57880抗病蛋白编码基因的获取；

b、构建Os03g57880抗病蛋白编码基因的超表达载体；

c、将超表达载体导入表达细胞中；

d、进行细胞培养得到植株，筛选得到抗纹枯病的水稻；

f、培育得到抗纹枯病水稻株系。

所述的超表达载体包括promoter部分和目的基因部分。

所述的promoter部分为pGA1611载体经HindIII和BamHI双酶切而来；所述的目的基因部分为所述的Os03g57880抗病蛋白的编码基因。

所述的步骤c采用农杆菌转化法。

所述的超表达载体的启动子为Ubiquitin基因启动子、CaMV35启动子中的一种或多种。

一种含水稻Os03g57880抗病蛋白编码基因的农杆菌，其特征在于，所述的农杆菌可应用于权利要求7中所述的一种具有Os03g57880抗病蛋白的编码基因的水稻的培育方法。

所述的农杆菌细胞中至少含有一个由所述的超表达载体组成的质粒。

具体的，所述的应用为：通过基因编辑，使Os03g57880基因在水稻细胞中过表达，得到具有纹枯病抗性的转基因水稻。

本发明的有益效果主要体现在：

1、本发明通过基因编辑技术对受体水稻中的Os03g57880蛋白质的编码基因进行编辑，获得Os03g57880基因过表达的转基因水稻，提高了水稻植株的抗病性；

2、本发明为水稻的抗纹枯病研究提供了一种新的思路，使得人们在这方面的研究更进一步；

附图说明

图1为Os03g57880 CRISPR KO（突变体）与野生型植株部分基因片段上的碱基对比

图2为超表达载体示意图

图3为Os03g57880 CRISPR OX（过表达型）和Os03g57880 CRISPR KO在接种纹枯病菌后不同时间点的相对表达水平（#1，接种后0h；#2，接种后24h；#4，接种后48h；#5，接种后72h）

图4为野生型植株、Os03g57880 CRISPR KO和Os03g57880 CRISPR OX转基因水稻接种纹枯病后表型及面积对比

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明中，所述的突变体是指Os03g57880蛋白的编码基因的部分碱基发生缺失或取代的植株，即在突变体植株体内不会产生Os03g57880蛋白。

实施例1：Os03g57880突变体和过表达植株的获得

如图1和图2、通过基因修饰获得Os03g57880突变体和过表达植株。

1) Os03g57880突变体的获得

提供Os03g57880基因序列给百格基因科技有限公司，由该公司进行靶位点序列设计、引物设计、载体构建及转化，转化水稻品种中花11号，最终得到T0代转基因水稻。

对得到的T0代转基因水稻进一步测序分析验证，结果如图1所示。通过对阳性植株测序分析发现，其序列所示Os03g57880编码基因序列的第468位碱基后缺失碱基G，使Os03g57880基因功能丧失，将此基因编辑植株命名为Os03g57880 KO。

2) Os03g57880过表达植株的获得

提取水稻RNA，反转录为cDNA。以此cDNA为模板扩增Os03g57880。将PCR扩增产物插入PGA1611载体，得到Os03g57880过表达载体，如图2。该具有反向重复的重组表达载体用Ubiquitin基因的启动子。

将上述获得的PGA1611-Os03g57880转入农杆菌LBA4404，得到重组菌。将该重组菌提取质粒，送去测序，该质粒为PGA1611-Os03g57880，将含有该质粒的重组菌命名为LBA4404/PGA1611-Os03g57880。

将LBA4404/PGA1611-Os03g57880导入到水稻品种东晋中，用潮霉素筛选，获得T0代转PGA1611-Os03g578802水稻，进一步得到Os03g57880过表达转基因株系，命名为Os03g57880 OX。

对上述获得的T0代Os03g57880 OX转基因水稻和野生型水稻东晋（WT）进行分子鉴定，提取各种水稻根的总RNA经反转录后，进行RT-PCR检测，所用的引物如下：

Os03g57880引物为:

Os03g57880-F：CCATCAATCCGTCACCGTCT

Os03g57880-R：ACGCGGTTACTTCTCACTGG

结果如图3所示，由图可见，T0代Os03g57880 OX转基因水稻中Os03g57880的平均相对表达量明显高于野生型水稻东晋（WT）中Os03g57880的平均相对表达量，且随着接菌时间变长，表达量逐渐上调，48h时表达量达到最高值，随后回落。

实施例2：Os03g57880突变体和过表达植株转基因水稻接种纹枯病菌后表型观察

采用立枯丝核菌接种水稻离体叶片的方法进行抗性鉴定。将野生型对照、Os03g57880突变体和过表达植株转基因水稻叶片分别接纹枯病菌——立枯丝核菌R.solani AGI-1A，菌株由沈阳农业大学植物保护学院魏松红老师实验室提供。

1）将4℃保存的纹枯病菌菌株于超净工作台内接种在PDA培养基上，置于26℃培养箱连续培养2~3 d，用0.7cm无菌打孔器在菌落边缘取菌饼用于接菌实验。

2）选取长势良好的野生型、Os03g57880突变体和过表达植株转基因水稻植株，在灭菌的培养皿中放入两张用无菌水浸湿的已灭菌滤纸，选取健康无病虫害损伤的、叶龄相同的叶片，剪成大小均等的8份，叶背朝上，整齐的摆放在滤纸上，用接种针或牙签在每片叶子的中部位置扎一个小眼，将打孔器提前打好的菌饼接种在叶片打孔位置，盖上盖子后置于27 ℃培养室培养，将湿度保持在90%左右。

3）重复步骤3）三次。

4）接种72 h后拍照，结果如图4所示，与野生型对照相比，Os03g57880CR-KO转基因水稻表现感病，病斑面积占叶片面积48%左右；Os03g57880 CRISPR OX转基因水稻表现抗病（病斑面积占叶片面积20%左右），说明Os03g57880参与调控水稻纹枯病的抗性，Os03g57880基因功能过表达能显著提高水稻对纹枯病的抗性。

序列表

<110> 福州市闽侯县福州大学生物科学与工程学院

<120> Os03g57880蛋白及其编码基因在提高水稻对纹枯病抗性中的应用

<160> 2

<170> SEQ ID No.1

<210> 1

<211> 1476

<212> DNA

<213> Os03g57880蛋白的编码基因

<400> 1

atggcggatc tcgccgtgct ccagtggtgg ctcggcgcga tggtggcaat ggcggcggcc 60

gcgtcgtggt ccggcggtgt cctgccggcg gcggaggcgc tggggatgaa ctggggcacg 120

caggcgtcgc acccgctgcc gcccaagatc gtggcgcagc tgctccagga caatgggatc 180

aagaaggtga agctgttcga cgccgaccag gacaccctca gcgcgctcgc cgggaccggc 240

atcgaggtca tggtcgccat ccccaacgtc atgctcgact ccatcacgga ctacgacacc 300

gccaaggagt gggtccgccg caacgtctcc cgctacaact tcgacggcgg cgtcaccatc 360

aagtacgtcg ccgtcgggaa cgagccgttc ttggcggcat acaatggcac gttcgacaag 420

gtgacgctgc cggcgctgat gaacatccag aacgcgctga acgacgccgg cctcggcgac 480

agcatcaagg ccaccgtgcc gctcaacgcc gacgtatacg actcgccgca ggaccagcag 540

gtgccgtcgg cggggcggtt ccgcgccgac atcgccgacc tgatgacgca gatggtgcag 600

ttcctggcca acaacagcgc gccgttcacc gtcaacatct accctttcat cagcctctac 660

ctcaacgacg acttccccgt cgacttcgcc ttcttcgacg gcggcgcgac gccggtggtg 720

gacaacggca tctcctacac caacgtgttc gacgccaact tcgacacgct ggtggcggcg 780

ctcaagggcg tcggccacgg cgacatgccc atcgtcgtcg gcgaggtcgg ctggcccacc 840

gacggcgaca agcacgccac cgccacctac gcgcagcgct tctacaacgg cctcctcaag 900

cgcctcgccg ccaacgccgg cacgccggcg cggccggggc agtacatcga ggtctacctc 960

ttcggcctcc tcgacgagga cgccaagagc gtggcgccgg gcgacttcga gcgccattgg 1020

ggcatcctcc ggttcgacgg ccagcccaag taccccgtcg acctcaccgg gcagggccag 1080

aacaccatgc tcgtgccggc caagggcgtg acgtacctgc ccaggacgtg gtgcgtcatc 1140

aacaccaacg ccaaggacac cagcaagctc gccgacaaca tcaacttcgc ctgcaccttc 1200

gccgactgca cggcgctcgg ctacggctca acctgcgccg gcatggacgc caatggcaac 1260

gcctcctacg ccttcaacgc ctacttccag gttcagaacc agaaggacga cgcctgcgac 1320

ttccaggggc tcgccatgcc cacgcagacc gacccctcca ccccggcctg caacttcaca 1380

atacagatcg ccgccacctc ggcgggtcac cggcggcgag ccggcgccgc cgtgctagcg 1440

ctgctggctt tgttccgttt gttcttgctg cattag 1476

<210> 2

<211> 491

<212> PRT

<213> Os03g57880蛋白

<400> 2

Met Ala Asp Leu Ala Val Leu Gln Trp Trp Leu Gly Ala Met Val Ala

1 5 10 15

Met Ala Ala Ala Ala Ser Trp Ser Gly Gly Val Leu Pro Ala Ala Glu

20 25 30

Ala Leu Gly Met Asn Trp Gly Thr Gln Ala Ser His Pro Leu Pro Pro

35 40 45

Lys Ile Val Ala Gln Leu Leu Gln Asp Asn Gly Ile Lys Lys Val Lys

50 55 60

Leu Phe Asp Ala Asp Gln Asp Thr Leu Ser Ala Leu Ala Gly Thr Gly

65 70 75 80

Ile Glu Val Met Val Ala Ile Pro Asn Val Met Leu Asp Ser Ile Thr

85 90 95

Asp Tyr Asp Thr Ala Lys Glu Trp Val Arg Arg Asn Val Ser Arg Tyr

100 105 110

Asn Phe Asp Gly Gly Val Thr Ile Lys Tyr Val Ala Val Gly Asn Glu

115 120 125

Pro Phe Leu Ala Ala Tyr Asn Gly Thr Phe Asp Lys Val Thr Leu Pro

130 135 140

Ala Leu Met Asn Ile Gln Asn Ala Leu Asn Asp Ala Gly Leu Gly Asp

145 150 155 160

Ser Ile Lys Ala Thr Val Pro Leu Asn Ala Asp Val Tyr Asp Ser Pro

165 170 175

Gln Asp Gln Gln Val Pro Ser Ala Gly Arg Phe Arg Ala Asp Ile Ala

180 185 190

Asp Leu Met Thr Gln Met Val Gln Phe Leu Ala Asn Asn Ser Ala Pro

195 200 205

Phe Thr Val Asn Ile Tyr Pro Phe Ile Ser Leu Tyr Leu Asn Asp Asp

210 215 220

Phe Pro Val Asp Phe Ala Phe Phe Asp Gly Gly Ala Thr Pro Val Val

225 230 235 240

Asp Asn Gly Ile Ser Tyr Thr Asn Val Phe Asp Ala Asn Phe Asp Thr

245 250 255

Leu Val Ala Ala Leu Lys Gly Val Gly His Gly Asp Met Pro Ile Val

260 265 270

Val Gly Glu Val Gly Trp Pro Thr Asp Gly Asp Lys His Ala Thr Ala

275 280 285

Thr Tyr Ala Gln Arg Phe Tyr Asn Gly Leu Leu Lys Arg Leu Ala Ala

290 295 300

Asn Ala Gly Thr Pro Ala Arg Pro Gly Gln Tyr Ile Glu Val Tyr Leu

305 310 315 320

Phe Gly Leu Leu Asp Glu Asp Ala Lys Ser Val Ala Pro Gly Asp Phe

325 330 335

Glu Arg His Trp Gly Ile Leu Arg Phe Asp Gly Gln Pro Lys Tyr Pro

340 345 350

Val Asp Leu Thr Gly Gln Gly Gln Asn Thr Met Leu Val Pro Ala Lys

355 360 365

Gly Val Thr Tyr Leu Pro Arg Thr Trp Cys Val Ile Asn Thr Asn Ala

370 375 380

Lys Asp Thr Ser Lys Leu Ala Asp Asn Ile Asn Phe Ala Cys Thr Phe

385 390 395 400

Ala Asp Cys Thr Ala Leu Gly Tyr Gly Ser Thr Cys Ala Gly Met Asp

405 410 415

Ala Asn Gly Asn Ala Ser Tyr Ala Phe Asn Ala Tyr Phe Gln Val Gln

420 425 430

Asn Gln Lys Asp Asp Ala Cys Asp Phe Gln Gly Leu Ala Met Pro Thr

435 440 445

Gln Thr Asp Pro Ser Thr Pro Ala Cys Asn Phe Thr Ile Gln Ile Ala

450 455 460

Ala Thr Ser Ala Gly His Arg Arg Arg Ala Gly Ala Ala Val Leu Ala

465 470 475 480

Leu Leu Ala Leu Phe Arg Leu Phe Leu Leu His

485 490

Claims

1.一种水稻Os03g57880抗病蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种水稻Os03g57880抗病蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种水稻Os03g57880抗病蛋白编码基因在增强水稻植株对纹枯病的抗性方面的应用。

4.一种能过表达Os03g57880抗病蛋白编码基因的水稻的培育方法，其特征在于，所述的培育方法包括如下步骤：

a、水稻Os03g57880抗病蛋白编码基因的获取；

b、构建Os03g57880抗病蛋白编码基因的超表达载体；

c、将超表达载体导入表达细胞中；

d、进行细胞培养得到植株，筛选得到抗纹枯病的水稻；

f、培育得到抗纹枯病水稻株系。

5.根据权利要求4所述的一种能过表达Os03g57880抗病蛋白编码基因的水稻的培育方法，其特征在于，所述的超表达载体包括promoter部分和目的基因部分。

6.根据权利要求5所述的一种能过表达Os03g57880抗病蛋白编码基因的水稻的培育方法，其特征在于，所述的promoter部分为pGA1611载体经HindIII和BamHI双酶切而来；所述的目的基因部分为所述的Os03g57880抗病蛋白的编码基因。

7.根据权利要求4所述的一种具有Os03g57880抗病蛋白的编码基因的水稻的培育方法，其特征在于，所述的步骤c采用农杆菌转化法。

8.根据权利要求4所述的一种具有Os03g57880抗病蛋白的编码基因的水稻的培育方法，其特征在于，所述的超表达载体的启动子为Ubiquitin基因启动子、CaMV35启动子中的一种或多种。

9.一种含水稻Os03g57880抗病蛋白编码基因的农杆菌，其特征在于，所述的农杆菌可应用于权利要求7中所述的一种具有Os03g57880抗病蛋白的编码基因的水稻的培育方法。

10.根据权利要求9所述的一种含水稻Os03g57880抗病蛋白编码基因的农杆菌，其特征在于，所述的农杆菌细胞中至少含有一个由所述的超表达载体组成的质粒。