CN107653251A

CN107653251A - 一种小麦凝集素类基因TaJRL53的抗赤霉病应用

Info

Publication number: CN107653251A
Application number: CN201711104962.1A
Authority: CN
Inventors: 马正强; 贾海燕; 罗艳君; 李国强
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2017-11-10
Filing date: 2017-11-10
Publication date: 2018-02-02
Anticipated expiration: 2037-11-10
Also published as: CN107653251B

Abstract

本发明公开了一种小麦凝集素类基因TaJRL53的抗赤霉病应用。一种小麦凝集素类基因TaJRL53在通过基因工程手段提高小麦对赤霉病抗性中的应用。通过基因工程的方法将本发明提供的小麦凝集素类蛋白转入植物中，可以提高植物对赤霉病的抗性。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响植物的食品安全性，可以广泛应用于各种植物的抗病虫性育种过程。

Description

一种小麦凝集素类基因TaJRL53的抗赤霉病应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种小麦凝集素类基因TaJRL53的抗赤霉病应用。

背景技术

植物在整个生命周期中会面临各种细菌、真菌、病毒、蚜虫、蝗虫、螟虫、飞蛾等病虫害的危害等，这些病虫害对植物生长发育产生诸多不利的影响。为了应对各种病虫害，植物自身形成了一系列调控机制：除了通过在侵染部位合成和积累木质素、植保素等物质来阻止病菌的入侵和扩展之外，植物还通过诱导防卫反应产生广谱抗性来应对病原菌的侵入。研究表明，植物的防卫反应受两类基因的控制，一类是R基因，一类是病程相关基因，前者属于基础抗性，后者属于诱导型抗性。R基因产物作为受体，直接或者间接的参与病原蛋白互作，从而启动植物体内的抗病信号途径。这类抗病反应产生的抗病性较强，但是由于R基因的资源有限，尤其是对某些复杂的数量性状抗病性如小麦的赤霉病抗性，这类R基因的获得尤其困难。除开资源有限较难获得之外，R基因介导的抗性具有病原种类和病原生理小种的特异性，抗谱不广，抗性易于丧失。与R基因相比较，病程相关基因介导的抗性具有抗性持久、抗谱广泛和资源丰富等优点。在缺乏R基因的情况下，通过克隆病程相关基因提高植物的抗性显得尤为重要。这类病程相关基因的共同特点是在经过病原菌诱导后表达量明显升高或减少。

小麦是世界上重要的粮食作物之一，但病虫害的影响往往导致产量和品质的下降。病原菌对植物的侵害及引起的一系列防卫反应在不同植物与病原菌之间存在相似性，因此，我们可以通过抗病反应相关基因的应用来提高植物广谱及长效的抗性。抗病反应的调控因子分为正调控因子和负调控因子两类。正调控因子的超量表达，可以快速而有效的启动抗病反应，提高植物的抗病性，拓宽植物的抗谱；而抑制该基因的表达则会导致抗病性的减弱。

凝集素是一类非免疫起源的糖结合蛋白，各种生物中分布广泛、种类众多，家族内各成员的结构和功能亦差异悬殊。根据特征性质的不同可以将植物凝集素分为七个亚家族：苋科凝集素、葫芦科韧皮部凝集素、橡胶蛋白结构域凝集素、豆科凝集素、单子叶植物甘露糖结合凝集素、Ⅱ型核糖体失活蛋白凝集素和jacalin相关凝集素。目前已报到的小麦JRL基因TaJRLL1,TaJA1,WC1-1和TaHfr-1均与小麦抗病性相关。过量表达Ta-JA1基因可提高烟草对多种病害的抗性，包括烟草野火病菌、黑胫病菌、花叶病毒(Ma et al.2010b)；小麦中甘露糖特异结合型的TaJRL1同样也具有对多种病害的广谱抗性，转TaJRL1的拟南芥植株对赤霉菌和灰霉菌的抗性得到了增强(Xiang et al.2011)，该基因被沉默时，小麦植株对死体寄生的灰霉菌，活体寄生的白粉菌以及兼性寄生的赤霉菌的敏感性增强。但该基因与本发明小麦凝集素类基因TaJRL53的同源性很低，仅43％。本发明与另一已报到的小麦凝集素基因TaJRL2相似度的同源性更低，仅20％同源。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供小麦凝集素类基因TaJRL53(TriticumaestivumJacalinRelatedLectin53)提高小麦赤霉病抗性的应用。

一种小麦凝集素类基因TaJRL53在通过基因工程手段提高小麦对赤霉病抗性中的应用；所述的小麦凝集素类基因核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；该基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。该蛋白包含353个氨基酸，等电点为5.27，含有1个jacalin结构域，为AA307-AA353，一个dirigent结构域，为AA104-AA176。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中超量表达的载体，将本发明所提供的凝集素类基因TaJRL53导入植物细胞，可获得改变植物对赤霉病抗性的转基因细胞系及转基因植株。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行筛选，可以对载体进行加工，如加入抗生素标记基因(如：潮霉素、卡那霉素和庆大霉素)，加入抗生素标记基因之后的载体用于转化，可以在转化后的植物培养基中加入抗生素，抑制非转基因细胞系和植株的生长，有助于快速和有效的获得转基因植株。为了便于观察外源基因的表达，可以在载体中启动子和外源基因之间加入报告基因(GUS基因、GFP和荧火虫荧光素酶报告基因)，构建报告基因和外源基因融合表达的载体，该载体用于遗传转化，可以通过观察报告基因的表达与否和表达量高低，推测外源基因在植物体内表达情况。为了转基因植物释放的安全性，也可以构建载体时不携带任何筛选标记基因，而在苗期进行PCR检测。含有本发明的TaJRL53表达载体可通过使用基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道，电击，显微注射，Ti质粒，Ri质粒或植物病毒等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化后的植物细胞培育成完整的植株。被转化的植株材料既可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物，如：水稻、棉花、小麦、大豆、烟草、拟南芥、大麦、高粱、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等。

有益效果

通过基因工程的方法将本发明提供的小麦凝集素类蛋白转入植物中，可以提高植物对赤霉病的抗性。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响植物的食品安全性，可以广泛应用于各种植物的抗病虫性育种过程。

附图说明

图1为转基因小麦的PCR检测。Bobwhite：转基因小麦的受体材料；1-5：以Bobwhite小麦为受体，获得的TaJRL53超量表达的转基因植株；下同。

图2为转基因小麦中TaJRL53的表达水平显著提高。

图3为转基因小麦的赤霉菌抗性得到提高。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：小麦凝集素基因JRL53cDNA序列的获得。

本研究通过转录组分析发现TaJRL53在赤霉菌侵染的花絮中上调表达，用MapVector软件设计引物P1，P1引物对如下：F-5'-AGCCTAATTAATGGCCACAACCACCG-3'(SEQID NO:3)；R:5'-TATACGGCCGGATGGTATAAACACCAATCGAAG-3'(SEQ ID NO:4)。以抗病种质望水白的穗部cDNA作为模板，用英俊公司的Trizol试剂盒提取小麦穗部的总RNA，采用Promega公司的反转录试剂盒进行反转录，合成单链cDNA。用引物P1进行PCR扩增，扩增体系为25μL，包含模板10-20ng、正反引物各5pmol、dNTP2.5mmol、0.1Ur-TaqDNA聚合酶和1×PCR缓冲液。扩增的程序是：94℃变性5分钟；36个循环，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟30秒；最后72℃延伸5分钟。通过PCR扩增，获得了包含开放读码框的1059bp的核苷酸序列，如SEQIDNO：1所示。该序列编码353个氨基酸，如SEQIDNO：2所示，等电点为5.27，含有1个jacalin结构域和1个dirigent结构域，分别为AA307-AA353、AA104-176。

实施例2：转TaJRL53基因小麦的赤霉菌抗性得到提高。

以抗病种质望水白的穗部cDNA作为模板，利用引物P2进行PCR扩增，P2引物对如下：F-5'-TACGCTGCAGATGGCCACAACCACCG-3'(SEQ ID NO:5)；R-5'-ATGCCTGCAGGATGGTATAAACACCAATCGAAG-3'(SEQ ID NO:6)。将扩增得到的PCR产物用限制性内切酶PstI进行酶切后，与经过同样限制性内切酶进行酶切的PTA2中间载体进行连接，利用HindIII酶切位点将pAT载体上Ubiquitin::TaJRL53::Ter表达核插入pUCBS表达载体骨架上，构成TaJRL53基因枪稳定转化的表达载体。构建好的载体通过热击法转化到DH5α大肠杆菌菌株中，通过含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行筛选，获得阳性克隆。参照1993年Weeks发表在PlantPhysiol第102期1077-1084页上的文章中的材料与方法，以幼胚短暂培养产生的可以较高频率再生出可育植株的愈伤组织为受体，采用基因枪法将Ubiquitin启动子控制下的TaJRL53基因导入感赤霉病小麦Bobwhite，将基因枪转化后的愈伤放置于含有20mg/LG418的MS培养基上进行筛选，待分化出幼苗后一次在30mg/L、40mg/L的MS培养基上筛选，最后获得的再生苗移入含有1mg/LNAA的MS培养基生根，待根长出后剪取叶片，提取DNA进行PCR检测，获得TaJRL53超量表达的转基因小麦。将T0代转基因小麦叶片和非转基因叶片同时接种赤霉菌，3天后进行赤霉病抗性鉴定，所用赤霉菌为江苏省内感染小麦的强赤霉菌(F4,F15,F17,F34)菌株的混合物。结果表明，转基因植株对赤霉菌的抗性增强，叶片上赤霉菌菌丝生长变慢(图1-3)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种小麦凝集素类基因TaJRL53的抗赤霉病应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1059

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 1

atggccacaa ccaccgaaga acccaccatc accatggaga cctgcggcga cgacgtctcc 60

gacccaacca tggagaccat cggcgtcctc tctgatgtct ccatggcgag cagaagcctc 120

cccgtaggcg tcgtctccac caatttcaag gtcactcgtg gcttcggtgg aatcgcggag 180

aacgtcaagg tgaacgtcga caggctgtat ctacgccagg tcatgacggg ctgggacgcg 240

aatcagtcag acgtgataca gcccaatgcc gtgacagggc taggtaaaac tgctgtgaac 300

aactggggtg tctatgacgg tgctggctcc aaggcggaac ttgttgccaa aacgcacggt 360

atgcacacac ttgctggcaa atggagcaat tggtttaccc tggcgtttgt ggtcggaagg 420

ttcgaagcgt ccactcttca ggttatggga gctaatgatg aggatgaagc agataatgac 480

tgggccattg taggtgggac cggtgaattc gcaatggctc gcggtatcat ccggagaaga 540

gtatatagta taacaaacaa tacattaaca catgcgctta ctattgaatt cttctgccac 600

atgacggagg tcgtcccttc acctacaaag agaggaacag ttggtggaaa tagaggcacc 660

ctgcctcggg aaatggaagg caaatcccaa cgtctagaaa atgtgacaat ctaccatgta 720

ggtgcagttg aagggtttca attttcctac gtggacgaag atgggaaaat ccgcaccact 780

gatacttggg gtcgagtaca tcctgatcct ttgcgcaaga cggaaataaa gtttggccca 840

tcagagtttg tgaaaaaggt caatggggct cagagaggag gcgagggctg gctgtcaaga 900

tttgagatcg tcaccaccca caaaacgtat ggtccttttg gagttgacaa tggcactcca 960

aatttcagtt ataccgtgcc ggaggacgag acggtggtgg gtttctttgg aaacactgat 1020

aacattttcg tcacttcgat tggtgtttat accatctaa 1059

<210> 2

<211> 352

<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 2

Met Ala Thr Thr Thr Glu Glu Pro Thr Ile Thr Met Glu Thr Cys Gly

1 5 10 15

Asp Asp Val Ser Asp Pro Thr Met Glu Thr Ile Gly Val Leu Ser Asp

20 25 30

Val Ser Met Ala Ser Arg Ser Leu Pro Val Gly Val Val Ser Thr Asn

35 40 45

Phe Lys Val Thr Arg Gly Phe Gly Gly Ile Ala Glu Asn Val Lys Val

50 55 60

Asn Val Asp Arg Leu Tyr Leu Arg Gln Val Met Thr Gly Trp Asp Ala

65 70 75 80

Asn Gln Ser Asp Val Ile Gln Pro Asn Ala Val Thr Gly Leu Gly Lys

85 90 95

Thr Ala Val Asn Asn Trp Gly Val Tyr Asp Gly Ala Gly Ser Lys Ala

100 105 110

Glu Leu Val Ala Lys Thr His Gly Met His Thr Leu Ala Gly Lys Trp

115 120 125

Ser Asn Trp Phe Thr Leu Ala Phe Val Val Gly Arg Phe Glu Ala Ser

130 135 140

Thr Leu Gln Val Met Gly Ala Asn Asp Glu Asp Glu Ala Asp Asn Asp

145 150 155 160

Trp Ala Ile Val Gly Gly Thr Gly Glu Phe Ala Met Ala Arg Gly Ile

165 170 175

Ile Arg Arg Arg Val Tyr Ser Ile Thr Asn Asn Thr Leu Thr His Ala

180 185 190

Leu Thr Ile Glu Phe Phe Cys His Met Thr Glu Val Val Pro Ser Pro

195 200 205

Thr Lys Arg Gly Thr Val Gly Gly Asn Arg Gly Thr Leu Pro Arg Glu

210 215 220

Met Glu Gly Lys Ser Gln Arg Leu Glu Asn Val Thr Ile Tyr His Val

225 230 235 240

Gly Ala Val Glu Gly Phe Gln Phe Ser Tyr Val Asp Glu Asp Gly Lys

245 250 255

Ile Arg Thr Thr Asp Thr Trp Gly Arg Val His Pro Asp Pro Leu Arg

260 265 270

Lys Thr Glu Ile Lys Phe Gly Pro Ser Glu Phe Val Lys Lys Val Asn

275 280 285

Gly Ala Gln Arg Gly Gly Glu Gly Trp Leu Ser Arg Phe Glu Ile Val

290 295 300

Thr Thr His Lys Thr Tyr Gly Pro Phe Gly Val Asp Asn Gly Thr Pro

305 310 315 320

Asn Phe Ser Tyr Thr Val Pro Glu Asp Glu Thr Val Val Gly Phe Phe

325 330 335

Gly Asn Thr Asp Asn Ile Phe Val Thr Ser Ile Gly Val Tyr Thr Ile

340 345 350

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcctaatta atggccacaa ccaccg 26

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tatacggccg gatggtataa acaccaatcg aag 33

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tacgctgcag atggccacaa ccaccg 26

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgcctgcag gatggtataa acaccaatcg aag 33

Claims

1.一种小麦凝集素类基因TaJRL53在通过基因工程手段提高植物对赤霉病抗性中的应用；所述的小麦凝集素类基因核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。