CN110904119A

CN110904119A - 一种xndl2基因、蛋白质、过表达载体、抗纹枯病水稻的获取方法和应用

Info

Publication number: CN110904119A
Application number: CN201911249211.8A
Authority: CN
Inventors: 孙倩; 玄元虎; 李天亚; 邱永春; 苑德鹏; 徐晓凤
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2019-12-09
Filing date: 2019-12-09
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2039-12-09
Also published as: CN110904119B

Abstract

本发明提供了一种XNDL2基因、蛋白质、过表达载体、抗水稻纹枯病水稻的获取方法和应用，属于生物技术领域，所述XNDL2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的XNDL2基因具有抗水稻纹枯病的作用，将XNDL2基因导入到水稻中，能够获得抗纹枯病的水稻。

Description

一种XNDL2基因、蛋白质、过表达载体、抗纹枯病水稻的获取方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，尤其涉及一种XNDL2基因、蛋白质、过表达载体、抗水稻纹枯病水稻的获取方法和应用。

背景技术

水稻纹枯病是由立枯丝核菌引起的一种土传真菌病害，为水稻的三大病害之一，也是一种危害遍布全球的水稻病害。该病害在水稻整个生育期均可发生，主要危害叶鞘、叶片，具有危害大、流行性强、寄主范围广等特点，严重影响水稻高产稳产。在农业生产上，水稻纹枯病的防治主要采用药剂防治和栽培管理，但长期使用化学药剂不仅造成环境污染，还会加快病原菌变异，产生耐药性，给纹枯病的防治带来极大的困难，培育稳定的抗病品种才是经济、有效、环保、根本的防治方法方法。

水稻转基因育种技术已经被广泛应用，具有周期短、效率高等特点。目前，通过转基因技术对水稻基因进行操作已经培育了大量的水稻抗病及高产新品种。在水稻中过量表达NPR1基因，显著增强了水稻对病原菌的抗性。利用RNAi技术对水稻中参与植物甘氨酸甜菜碱生物合成的甜菜碱醛脱氢酶基因OsBADH1进行干扰，增强植物对非生物胁迫的耐受性。CRISPR/Cas9是由特异的单个向导RNA(single guided RNA，sgRNA)介导DNA识别，引导Cas9蛋白对靶向基因进行修饰切割，产生双键断裂(double strand breaks，DSBs)的基因编辑技术。CRISPR/Cas9系统能对特定的靶位点进行基因编辑，使靶基因一些碱基产生插入或缺失，该技术已在动植物中广泛应用。

目前，由于我国抗纹枯病水稻种质资源的缺乏，还未发现对纹枯病高抗或免疫的水稻品种。因此，挖掘水稻纹枯病抗性相关基因，利用转基因育种技术改变抗性相关基因表达对水稻抗纹枯病种质资源创制和纹枯病的有效防控具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种XNDL2基因、蛋白质、过表达载体、抗水稻纹枯病水稻的获取方法和应用，本发明提供的XNDL2基因具有抗水稻纹枯病的作用，将XNDL2基因导入到水稻中，能够获得抗纹枯病的水稻。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种XNDL2基因，所述XNDL2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的XNDL2基因在抗水稻纹枯病中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的XNDL2基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的蛋白质在抗水稻纹枯病中的应用。

本发明还提供了一种过表达载体，将上述技术方案所述的XNDL2基因插入到原始载体中，得到过表达载体。

优选的，所述原始载体包括PGA1611载体。

优选的，所述过表达载体的构建方法包括以下步骤：

1)提取水稻RNA，反转录为cDNA，以所述cDNA为模板用引物对进行扩增，得到XNDL2基因；

所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

2)将所述步骤1)得到的XNDL2基因经HindIII和BamHI双酶切，得到酶切XNDL2基因；将所述PGA1611载体经过HindIII和BamHI双酶切，得到酶切载体，将所述酶切XNDL2基因和酶切载体经T4连接酶连接，得到过表达载体。

本发明还提供了一种抗纹枯病水稻的获取方法，将上述技术方案所述的过表达载体转入农杆菌中，得到重组菌，将所述重组菌导入到水稻中，得到抗纹枯病水稻。

优选的，所述农杆菌包括农杆菌LBA4404。

优选的，所述水稻的品种包括Dongjin。

本发明提供了一种XNDL2基因、蛋白质、过表达载体、抗水稻纹枯病水稻的获取方法和应用，所述XNDL2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的XNDL2基因具有抗水稻纹枯病的作用，将XNDL2基因导入到水稻中，能够获得抗纹枯病的水稻。

附图说明

图1为xndl2转基因株系测序分析图；

图2为XNDL2-OX过表达重组载体部分结构示意图及分子检测图，其中A为XNDL2-OX过表达重组载体部分结构示意图，B为分子检测图；

图3为xndl2转基因水稻和XNDL2-OX转基因水稻接种纹枯病菌后表型，其中A为xndl2转基因水稻接种纹枯病菌后表型，B为A中病斑面积占叶片面积百分比，C为XNDL2-OX转基因水稻接种纹枯病菌后表型，D为C中病斑面积占叶片面积百分比。

具体实施方式

本发明提供了一种XNDL2基因，所述XNDL2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：

atgggaggagctacaaacttacctccaggtttccacttcttcccctcggatgaagagctcgtcgtccatttcctccgtcgcaaggtctccctcctcccatgccaccctgacatcatcccgacgctgcttccgcatcggtacaatccatgggagctgaatggcaaagcactgcaagctgggaaccagtggtacttcttctgccatctaacacaaagtaggacctcatccaatgggcactggagccccattggagttgatgaaacagtaagaagcggcggccgcaatgttggcttgaagaaaacgctgctattctccattggagagccctctgaaggcatcagaaccaactggatcatgcatgagtaccatctgctagacggggattgcgtcgctggcggtagcagcaacttgactagctcgagctctaacaggaggtctcataggaagagaggccactcaagcatggagtccaacaactgggtgctgtgccgagtgttcgaatcgagctgcggttcacaagtgagcttccacggtgagggcaccgagctttcatgcttagatgaggtgtttttgtcactagatgactacgatgaagtaagtttgccgaataaatag。

本发明还提供了上述技术方案所述的XNDL2基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

MGGATNLPPGFHFFPSDEELVVHFLRRKVSLLPCHPDIIPTLLPHRYNPWELNGKALQAGNQWYFFCHLTQSRTSSNGHWSPIGVDETVRSGGRNVGLKKTLLFSIGEPSEGIRTNWIMHEYHLLDGDCVAGGSSNLTSSSSNRRSHRKRGHSSMESNNWVLCRVFESSCGSQVSFHGEGTELSCLDEVFLSLDDYDEVSLPNK。

本发明还提供了一种过表达载体，将上述技术方案所述的XNDL2基因插入到原始载体中，得到过表达载体。在本发明中，所述原始载体优选包括PGA1611载体，所述PGA1611载体可从韩国国立庆尚大学获得。

在本发明中，所述过表达载体的构建方法优选包括以下步骤：

本发明对提取水稻RNA和反转录为cDNA的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。

在本发明中，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：

5′-aagcttatgggaggagctacaaactt-3′；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：

5′-ggatccctatttattc ggcaaacttac-3′。

在本发明中，所述扩增使用的体系包括：5×SFBuffer(with10mM MgSO₄)10μL、dNTP Mix(10mM each)1μL、上游引物(10μm)2μL、下游引物(10μm)2μL、Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase1μL、模板cDNA 1μL、ddH₂O up to50μL；反应程序优选为：95℃预变性1min；95℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸10min。

本发明对XNDL2基因经HindIII和BamHI双酶切的条件没有特殊限定，采用HindIII和BamHI常规双酶切基因的条件即可，本发明对PGA1611载体经过HindIII和BamHI双酶切的条件没有特殊限定，采用HindIII和BamHI常规双酶切载体的条件即可。本发明对所述酶切XNDL2基因和酶切载体经T4连接酶连接的方法没有特殊限定，采用常规即可。

在本发明中，所述农杆菌优选包括农杆菌LBA4404，所述水稻的品种优选包括Dongjin。本发明对所述过表达载体转入农杆菌的方法没有特殊限定，采用常规过表达载体转入农杆菌的方法即可，本发明对所述重组菌导入水稻的方法没有特殊限定，采用常规重组菌导入水稻的方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

CRISPR/Cas9基因编辑转基因水稻植株xndl2的获得

1)转基因水稻的获得

提供OsXNDL2基因序列给百格基因科技有限公司，由公司进行靶位点序列设计、引物设计、载体构建及转化，转化水稻品种Dongjin，最终得到T0代转基因水稻。

2)转基因水稻的鉴定

得到的转基因植株进一步经测序分析验证，如图1所示。通过对阳性植株测序分析发现，序列1所示的OsXNDL2编码基因序列的第80位碱基后插入了碱基G，在第81至84位碱基发生缺失，使OsXNDL2基因功能丧失(图1)，将这两个基因编辑植株分别命名为xndl2-1、xndl2-2。

实施例2

XNDL2过表达转基因水稻植株的获得

1)用于过表达XNDL2基因的重组载体构建

OsXNDL2(LOC_Os02g34970)基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1第1-615位核苷酸，编码的蛋白为OsXNDL2，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2。

提取水稻品种Dongjin的RNA，反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以SEQ ID Mo.3：5′-AAGCTTATGGGAGGAGCTACAAACTT-3′和SEQ ID No.4：5′-GGATCCCTATTTATTCGGCAAACTTAC-3′为引物扩增，以反转录获得的cDNA为模板扩增，采用RT-PCR法克隆水稻Dongjin的OsXNDL2基因，具体反应体系如下：5×SFBuffer(with 10 mM MgSO4)10μL、dNTPMix(10mM each)1μL、上游引物(10μm)2μL、下游引物(10μm)2μL、Phanta Super-FidelityDNA Polymerase1μL、模板cDNA 1μL、ddH2O up to 50μL；反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸10min。得到627bp的PCR产物，该PCR产物具有序列表中序列1自615位核苷酸。

用HindIII和BamHI酶切该PCR产物，得到的酶切产物与经过同样酶切得到的13094bp的PGA1611载体(Piao HL,Xuan YH,Park SH,Je BI,Park SJ,ParkSH,Kim CM,Huang J,Wang GK,Kim MJ,Kang SM,Lee IJ,Kwon TR,Kim YH,Yeo US,Yi G,Son D,HanCD.OsCIPK31,aCBL-interacting protein kinase is involved in germination andseedling growth under abiotic stress conditions in rice plants.MolCells.2010,30:19-27；公众可从韩国国立庆尚大学获得)骨架连接，使该PCR产物插入PGA1611载体的HindIII和BamHI位点间，得到终载体。

经过测序，该重组载体为将序列表中SEQ ID No.1自5′末端第1位-615位核苷酸插入PGA1611载体的HindIII和BamHI酶切位点间(结构示意图如图2中的A所示)，为XNDL2过表达载体，为PGA1611-OsXNDL2。该具有反向重复的重组表达载体用Ubiquitin基因的启动子。

2)过表达OsXNDL2基因转基因水稻的获得

将上述获得的PGA1611-OsXNDL2转入农杆菌LBA4404，得到重组菌。将该重组菌提取质粒，送去测序，该质粒为PGA1611-OsXNDL2，将含有该质粒的重组菌命名为LBA4404/PGA1611-OsXNDL2。

将LBA4404/PGA1611-OsXNDL2导入到水稻品种Dongjin中，潮霉素筛选，获得T0代转PGA1611-OsXNDL2水稻，即为XNDL2过表达转基因株系，命名为XNDL2-OX。

3)XNDL2-OX转基因水稻植株分子鉴定

对上述获得的T0代XNDL2-OX转基因水稻和野生型水稻Dongjin(WT)进行分子鉴定，提取各种水稻根的总RNA经反转录后，用如下引物进行qRT-PCR方法鉴定：使用promega试剂盒，根据说明书进行qPCR检测，以水稻Ubiqutin作为内参基因，反应体系如下：cDNA模板1μl、qPCR MIX 5μl、Forward primer(OsXNDL2-F)0.5μl、Reverse primer(OsXNDL2-R)0.5μl、ddH₂O 3μl、Total 10μl。每个样品设置3个生物学重复，3个技术重复，采用2步法加熔接曲线，PCR反应程序如下：95℃预变性30s；95℃变性5s，64℃退火20s，循环40次；95℃1min；55℃30s，95℃30s。

OsXNDL2引物为：

OsXNDL2-F(SEQ ID No.5):tcctccgtcgcaaggtctc；

OsXNDL2-R(SEQ ID No.6):ctttgtgttagatggcagaagaagt；

内参基因为Ubiquitin，内参引物为

Ubiquitin-F(SEQ ID No.7):cacggttcaacaacatccag；

Ubiquitin-R(SEQ ID No.8):tgaagaccctgactgggaag。

结果如图2中的B所示，T0代XNDL2-OX转基因水稻中OsXNDL2的平均相对表达量明显高于野生型水稻Dongjin(WT)中OsXNDL2的平均相对表达量。

实施例3

xndl2转基因水稻和XNDL2-OX转基因水稻接种抗纹枯病后表型观察

采用纹枯病菌接种水稻离体叶片的方法进行抗性鉴定。将野生型对照、xndl2转基因水稻和XNDL2-OX转基因水稻叶片接纹枯病菌。

将4℃保存的常规纹枯病菌菌株于超净工作台内接种在PDA培养基上，置于26℃培养箱连续培养2-3d，用0.7cm无菌打孔器在菌落边缘取菌饼用于接菌实验。

在灭菌的培养皿中放入两张用无菌水浸湿的已灭菌滤纸，选取健康无病虫害损伤的、叶龄相同的叶片，剪成大小均等的七份，叶背朝上，整齐的摆放在滤纸上，用接种针或牙签在每片叶子的中部位置扎一个小眼，将打孔器提前打好的菌饼接种在叶片打孔位置，盖上盖子后置于27℃培养室培养，将湿度保持在90％左右，三次重复。

接种后72h拍照，结果如图3所示，与野生型对照相比，xndl2基因敲除转基因水稻更感病，病斑面积占叶片面积80％(图3中的A和B)，OsXNDL2-OX转基因水稻更抗病，病斑面积占叶片面积20％，表明OsXNDL2-OX增强了水稻对纹枯病的抗性(图3中的C和D)。

由以上实施例可以得知，本发明提供的XNDL2基因具有抗水稻纹枯病的作用，将XNDL2基因导入到水稻中，能够获得抗纹枯病的水稻。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 一种XNDL2基因、蛋白质、过表达载体、抗纹枯病水稻的获取方法和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 615

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggaggag ctacaaactt acctccaggt ttccacttct tcccctcgga tgaagagctc 60

gtcgtccatt tcctccgtcg caaggtctcc ctcctcccat gccaccctga catcatcccg 120

acgctgcttc cgcatcggta caatccatgg gagctgaatg gcaaagcact gcaagctggg 180

aaccagtggt acttcttctg ccatctaaca caaagtagga cctcatccaa tgggcactgg 240

agccccattg gagttgatga aacagtaaga agcggcggcc gcaatgttgg cttgaagaaa 300

acgctgctat tctccattgg agagccctct gaaggcatca gaaccaactg gatcatgcat 360

gagtaccatc tgctagacgg ggattgcgtc gctggcggta gcagcaactt gactagctcg 420

agctctaaca ggaggtctca taggaagaga ggccactcaa gcatggagtc caacaactgg 480

gtgctgtgcc gagtgttcga atcgagctgc ggttcacaag tgagcttcca cggtgagggc 540

accgagcttt catgcttaga tgaggtgttt ttgtcactag atgactacga tgaagtaagt 600

ttgccgaata aatag 615

<210> 2

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Gly Ala Thr Asn Leu Pro Pro Gly Phe His Phe Phe Pro Ser

1 5 10 15

Asp Glu Glu Leu Val Val His Phe Leu Arg Arg Lys Val Ser Leu Leu

20 25 30

Pro Cys His Pro Asp Ile Ile Pro Thr Leu Leu Pro His Arg Tyr Asn

35 40 45

Pro Trp Glu Leu Asn Gly Lys Ala Leu Gln Ala Gly Asn Gln Trp Tyr

50 55 60

Phe Phe Cys His Leu Thr Gln Ser Arg Thr Ser Ser Asn Gly His Trp

65 70 75 80

Ser Pro Ile Gly Val Asp Glu Thr Val Arg Ser Gly Gly Arg Asn Val

85 90 95

Gly Leu Lys Lys Thr Leu Leu Phe Ser Ile Gly Glu Pro Ser Glu Gly

100 105 110

Ile Arg Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr His Leu Leu Asp Gly Asp

115 120 125

Cys Val Ala Gly Gly Ser Ser Asn Leu Thr Ser Ser Ser Ser Asn Arg

130 135 140

Arg Ser His Arg Lys Arg Gly His Ser Ser Met Glu Ser Asn Asn Trp

145 150 155 160

Val Leu Cys Arg Val Phe Glu Ser Ser Cys Gly Ser Gln Val Ser Phe

165 170 175

His Gly Glu Gly Thr Glu Leu Ser Cys Leu Asp Glu Val Phe Leu Ser

180 185 190

Leu Asp Asp Tyr Asp Glu Val Ser Leu Pro Asn Lys

195 200

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagcttatgg gaggagctac aaactt 26

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatccctat ttattcggca aacttac 27

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcctccgtcg caaggtctc 19

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctttgtgtta gatggcagaa gaagt 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cacggttcaa caacatccag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgaagaccct gactgggaag 20

Claims

1.一种XNDL2基因，其特征在于，所述XNDL2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的XNDL2基因在抗水稻纹枯病中的应用。

3.权利要求1所述的XNDL2基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.权利要求3所述的蛋白质在抗水稻纹枯病中的应用。

5.一种过表达载体，其特征在于，将权利要求1所述的XNDL2基因插入到原始载体中，得到过表达载体。

6.根据权利要求5所述的过表达载体，其特征在于，所述原始载体包括PGA1611载体。

7.根据权利要求5或6所述的过表达载体，其特征在于，所述过表达载体的构建方法包括以下步骤：

所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

8.一种抗纹枯病水稻的获取方法，其特征在于，将权利要求5～7任一项所述的过表达载体转入农杆菌中，得到重组菌，将所述重组菌导入到水稻中，得到抗纹枯病水稻。

9.根据权利要求8所述的获取方法，其特征在于，所述农杆菌包括农杆菌LBA4404。

10.根据权利要求8所述的获取方法，其特征在于，所述水稻的品种包括Dongjin。