CN116751272B - Nac079基因在调控水稻抗纹枯病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及NAC079基因在调控水稻抗纹枯病中的应用。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，对受体水稻中的NAC079基因进行编辑，获得NAC079敲除的转基因植株nac079。同时通过过表达转基因技术获得NAC079过表达转基因植株NAC079OX。按照水稻纹枯病抗性活体叶鞘鉴定技术规程，通过接种纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)AG1‑IA进行抗性鉴定发现，与野生型水稻相比，nac079植株更加抗病，NAC079OX植株则更加感病。证实了NAC079基因与水稻对纹枯病的抗性相关，可用于创制水稻纹枯病抗性新种质。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及NAC079基因在调控水稻抗纹枯病中的应用。
背景技术
由立枯丝核菌(Rhizoctonia solaniKühn)引起的水稻纹枯病(Ricesheathblight,ShB)已成为限制水稻产量的主要病害之一，且有逐年加重的趋势。由于病原菌的致病特性，化学防治仍是现阶段主要防治手段。但随着化学药剂的大量施用以及病原菌的致病性变化，现有的防治方法很难达到绿色生产的需求，因此发掘和选育新的抗性品种是防治水稻纹枯病的安全有效的策略。
NAC转录因子是植物所特有的一类转录因子家族，是由序列高度同源的矮牵牛(Petunia hybrida)的NAM(No apical meristem)和拟南芥的ATAF1/2以及CUC2(Cup-shaped cotyledon)三种基因归类并命名为NAC基因家族。NAC转录因子家族参与了激素响应、抗逆响应、信号转导等多项表达调控网络的途径。NAC转录因子家族在植物体内不同生长阶段均有表达，此外在环境变化、机械损伤以及病原菌侵染时也被诱导表达，其家族成员在功能上同样具有多样性。NAC转录因子参与了器官建成、激素响应、信号转导等多项表达调控网络的途径，研究其功能及表达调控的分子网络是目前的热点问题。多种基因的有序表达最终决定了植物的生长发育过程，NAC转录因子则在这一系列的生长发育过程中充当着一种“调控开关”的作用。但是目前并没有将纹枯病病抗性与NAC转录因子进行密切关联的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供NAC079基因在调控水稻抗纹枯病中的应用，NAC079基因负调控水稻对纹枯病的防御反应，NAC079过表达植物对纹枯病菌更易感，敲除NAC079基因增强水稻对纹枯病的抗性，对选育新的水稻抗纹枯病品种具有重要的研究价值。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了NAC079基因在调控水稻抗纹枯病中的应用，所述NAC079基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述调控水稻抗纹枯病包括：通过负调控NAC079基因的表达来增加水稻的纹枯病抗性或通过正调控NAC079基因的表达来降低水稻的纹枯病抗性。
本发明提供了一种改变水稻纹枯病抗性的方法，包括：在水稻基因组中，对NAC079基因进行基因编辑，所述NAC079基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述基因编辑包括敲低所述NAC079基因的表达、敲除所述NAC079基因或过表达所述NAC079基因。
本发明提供了一种NAC079基因的表达载体，所述表达载体包括NAC079基因和基础载体；所述NAC079基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述基础载体包括pTF101-ubi载体。
本发明提供了一种靶向水稻NAC079基因的sgRNA，所述sgRNA包括sgRNA-S和sgRNA-A；所述sgRNA-S的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述sgRNA-A的核苷酸序列如SEQID No.4所示。
本发明提供了一种NAC079基因的敲除载体，所述表达载体包括上述技术方案所述的sgRNA和基础载体；所述NAC079基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述基础载体包括pRGEB31载体。
本发明提供了NAC079基因或上述技术方案所述的表达载体或上述技术方案所述的sgRNA或上述技术方案所述的敲除载体在培育不同纹枯病抗性的水稻种质和/或筛选水稻纹枯病药物中的应用，所述NAC079基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
有益效果：
本发明提供了NAC079基因在调控水稻抗纹枯病中的应用，所述NAC079基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过实验证明了NAC079基因负调控水稻对纹枯病的防御反应，具体包括：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，对受体水稻中的NAC079基因进行编辑，获得NAC079敲除的转基因植株nac079。同时通过过表达转基因技术获得NAC079过表达转基因植株NAC079 OX。按照水稻纹枯病抗性活体叶鞘鉴定技术规程，通过接种纹枯病菌(Rhizoctonia solani)AG1-IA(由沈阳农业大学植物保护学院魏松红教授提供)进行抗性鉴定发现，与野生型水稻相比，nac079植株更加抗病，NAC079 OX植株则更加感病。证实了NAC079基因与水稻对纹枯病的抗性相关，可用于创制水稻纹枯病抗性新种质。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为nac079转化株系测序结果分析图；
图2为过表达载体Pubi-OsNAC079的部分载体示意图(A)和NAC079 OX转化株系表达量测序结果(B)；
图3为野生型(ZH11)、nac079转基因水稻和NAC079 OX转基因水稻接种纹枯病后表型结果。
具体实施方式
本发明提供了NAC079基因在调控水稻抗纹枯病中的应用，所述NAC079基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：MAGASNLPPG FHFFPSDEELIIHFLRRKASLLPCQPDIVPTLILNLYDPWELNGKALQSGNQWYFFSHATQTRTSPNGHWKPIADETVISGGCNVGLKKTLIFFIGEPFEAIKTNWVMHEYHLMDGSTNCSSSSTSSSSSKRSHKKKGHSDTESKNWVICRVFESSYDSQVSFHEEGTELSCLDEVFLSLDDYDEVSFAK。
本发明所述NAC079基因的核苷酸序列，优选如SEQ ID NO.2所示，具体为：5’-GCAAGCACCTGCTCTCATCTTCTCCCCGTAGCCTTAGCTTCCACCCG CCTGCCTAGTCTATCTACTTCTTCTGCCTTACACTTCACCTCAGCCATGGCTGGAGCTTCCAACCTTCCTCCCGGTTTCCACTTCTTCCCGTCAGATGAAGAGCTCATCATTCATTTCCTCCGCCGCAAGGCCTCCCTCCTCCCTTGCCAACCTGACATCGTCCCTACTCTGATCTTGAATCTCTATGATCCATGGGAATTGAATGGTATGGGTCTAATATTTACCTCTATATGTTGTTGTTTTTGTCTTAGTCATAGCTGAGTGTTGATGTCAAACATTTTTACAGGTAAAGCACTCCAATCCGGTAACCAATGGTACTTCTTCAGTCATGCGACGCAGACTAGGACCTCGCCAAATGGGCACTGGAAACCCATTGCTGATGAGACAGTTATTAGTGGTGGTTGTAATGTTGGCCTGAAGAAGACCCTCATTTTCTTCATTGGGGAGCCCTTTGAGGCGATCAAAACTAACTGGGTCATGCATGAGTACCACCTAATGGATGGGAGTACCAATTGCAGCAGTAGCAGTACTTCAAGCAGTTCAAGCAAGCGGTCCCACAAGAAAAAAGGTCACTCAGACACAGTGAGTGCTGTACTGCTATATGCGTGTTTATT TATCGTGTTTAGTACTATATATCAATTGCATGACTATTTAACGTGGCTAACATATATGCATGCATGATCATTGCAGGAATCCAAGAACTGGGTGATATGCCGAGTGTTCGAATCGAGTTATGATTCACAAGTGAGCTTCCATGAGGAGGGCACGGAACTGTCATGCTTAGATGAGGTGTTTCTATCCCTAGACGACTATGATGAAGTCAGTTTTGCCAAATAATTAGAACCTTTATAGGAGCTGTTAGTAGGTTAGGTCCTTCACCTATCAAAACATTTGATCACAGTGATTCTCGCAAGAAAACTTAGTTTTATAAGATCAAATGGTTTGATAGCTGTTGAACCTAATGATCTAATAGACCAGATATGTAATTACTCATCTCCTCCCAGGAGTTGCATGCAACAAATTTGAGCTAGTTTTTAAG-3’。
在本发明中，所述调控水稻抗纹枯病优选包括：通过负调控NAC079基因的表达来增加水稻的纹枯病抗性或通过正调控NAC079基因的表达来降低水稻的纹枯病抗性。
本发明实施例中通过基因编辑方法，对水稻基因组中的NAC079基因进行敲除和过表达，并通过纹枯病抗性鉴定，结果发现与野生型水稻对照相比，经过基因敲除后的突变株更加抗病，过表达的突变株则更易感病，证实NAC079与水稻对纹枯病的抗性调控相关。因此可将所述NAC079基因应用于调控水稻对纹枯病的抗性。
本发明还提供了一种改变水稻对纹枯病抗性的方法，包括：在水稻基因组中，对NAC079基因进行基因编辑，所述NAC079基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明中，所述基因编辑优选包括敲低所述NAC079基因的表达、敲除所述NAC079基因或过表达所述NAC079基因。本发明对所述基因敲除的方法并没有特殊限定，实施例中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术实现了所述NAC079基因的敲除。本发明对所述基因过表达的方法并没有特殊限定，实施例中通过植物过表达载体的遗传转化方法实现了所述NAC079基因的过表达。
本发明还提供了一种NAC079基因的表达载体，所述表达载体包括NAC079基因和基础载体；所述NAC079基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明中，所述表达载体中的基础载体优选包括pTF101-ubi载体。本发明所述pTF101-ubi载体基于商业化载体pTF101.1优化，由寿惠霞等人报道于2010年，文章信息【Zheng L,Cheng Z,Ai C,etal.Nicotianamine,a Novel Enhancer of Rice Iron Bioavailability to Humans[J].Plos One,2010,5.】，doi:10.1371/journal.pone.0010190。本发明实施例中NAC079基因的表达载体优选由百格基因科技有限公司进行载体构建及转化。
本发明还提供了一种靶向水稻NAC079基因的sgRNA，所述sgRNA包括sgRNA-S和sgRNA-A；所述sgRNA-S的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：5’-ggcaCTCCAATCCGGTAACCAA-3’；所述sgRNA-A的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体为：5’-aaacTTGGTTACCGGATTGGAG-3’；其中小写的序列为BsaⅠ酶切后黏性末端序列。
本发明所述sgRNA的靶序列为SEQ ID NO.2中序列CTCCAATCCGGTAACCAA是靶向序列(SEQ ID No.13)，SEQ ID NO.2中加粗的TGG是PAM序列。
本发明还提供了一种NAC079基因的敲除载体，所述表达载体包括上述技术方案所述的sgRNA和基础载体；所述NAC079基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明中，所述敲除载体中的基础载体优选包括pRGEB31载体。所述敲除载体的构建优选参考文献【Xie K,Minkenberg B,Yang Y.Targeted Gene Mutation in Rice Using aCRISPR-Cas9 System[J].BIO-PROTOCOL,2014,4(17).】。本发明所述敲除载体可以敲除NAC079基因，可用于提高水稻的纹枯病抗性。本发明实施例中NAC079基因的敲除载体优选由百格基因科技有限公司进行载体构建及转化。
本发明还提供了NAC079基因或上述技术方案所述的表达载体或上述技术方案所述的sgRNA或上述技术方案所述的敲除载体在培育不同纹枯病抗性的水稻种质和/或筛选水稻纹枯病药物中的应用，所述NAC079基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
利用本发明所述NAC079基因，通过基因编辑的手段可获得更抗纹枯病的水稻种质，也可获得更易感纹枯病的水稻种质，可基于实验需求对所述NAC079基因进行敲除或过表达，以获得不同纹枯病抗性的水稻种质，而且还可应用于研制或筛选水稻纹枯病的药物。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的NAC079基因在调控水稻抗纹枯病中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
CRISPR/Cas9基因编辑转基因水稻植株nac079的获得
1)转基因水稻的获得
根据OsNAC079基因的核苷酸序列设计OsNAC079的靶位点序列为CTCCAATCCGGTAACCAA(SEQ ID No.13)，根据载体酶切位点设计引物，其中正向引物为：5’-ggcaCTCCAATCCGGTAACCAA-3’(SEQ ID No.3)，反向引物为：5’-aaacTTGGTTACCGGATTGGAG-3’(SEQ ID No.4)。利用PCR仪对正向引物和反向引物进行复性形成双链DNA，PCR反应体系为：正向引物1μL、反向引物1μL、10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL和ddH2O 7μL；所述正向引物和反向引物的浓度均为100μM。PCR程序为：37℃，60分钟；95℃，10分钟，按照每个循环下降0.1℃的速度降至25℃，复性产物按照1：200的体积比稀释后，得到复性产物，置于4℃保存。利用T4 DNA连接酶将经BsaⅠ酶切后的载体pRGEB31和所述复性产物连接，采用热激法转化大肠杆菌DH5α菌株。挑选阳性克隆进行PCR验证，验证阳性克隆进行测序，经比对正确的质粒转入农杆菌EHA105菌株中，利用该菌株转化水稻品种ZH11，利用潮霉素筛选获得T0代转基因水稻。
2)转基因水稻的鉴定
得到的转基因植株经测序分析验证，测序引物信息如下：
NAC079-F1：5’-GCTGGAGCTTCCAACCTTCC-3’(SEQ ID NO.5)；
NAC079-R1：5’-GTGGGACCGCTTGCTTGAAC-3’(SEQ ID NO.6)；
测序的反应体系为：
| 组分 | 体积 |
| TaqMix | 5μL |
| TemplatecDNA | 1μL |
| Forwardprimer | 0.5μL |
| Reverseprimer | 0.5μL |
| ddH2O | 3μL |
| Intotal | 10μL |
测序的反应程序为：
测序结果如图1所示。
通过对阳性植株测序分析发现，nac079突变植株分别在编码区356bp和358bp处有1个碱基的缺失。
实施例2
NAC079过表达转基因水稻植株的获得
1)用于过表达NAC079基因的重组载体构建
OsNAC079基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的第1～1087位核苷酸，编码的蛋白为OsNAC079，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据骨架载体pTF101-ubi酶切位点设计扩增OsNAC079核苷酸序列的引物，正向引物和反向引物5’端均带有18bp与骨架载体重叠的序列，正向引物序列如SEQ ID NO.7所示：5’-tgcaggtcgactctagagATGGCTGGAGCTTCCAAC-3’，反向引物如SEQ ID NO.8所示：5’-tcgagctcggtacccgggTTTGGCAAAACTGACTTC-3’。
以水稻品种ZH11 cDNA为模板，常规的PCR程序扩增OsNAC079核苷酸序列。PCR反应体系为：cDNA 1μL、正向引物1μL、反向引物1μL、2×PCR mix25μL和ddH2O 22μL；所述正向引物和反向引物的浓度均为10μM)PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸1.5分钟，33个循环；72℃终延伸10分钟。经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收片段，扩增片段大小为1087bp。
用限制性内切酶BamHⅠ酶切载体pTF101-ubi，经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化载体。利用苏州神洲基因有限公司提供的无缝克隆试剂盒(产品货号为GB2001-48)，将回收的OsNAC079核苷酸序列产物和线性化pTF101-ubi载体进行同源重组获得OsNAC079的过表达载体Pubi-OsNAC079，采用热激法转化大肠杆菌DH5α菌株。挑选阳性克隆进行PCR验证，阳性克隆进一步进行测序验证，经比对正确的质粒转入农杆菌EHA101菌株中。
2)过表达OsNAC079基因转基因水稻的获得
利用农杆菌介导的转基因方法，将上述获得的Pubi-OsNAC079过表达载体转化水稻品种ZH11，利用草铵膦筛选获得T0代转基因水稻，即为OsNAC079过表达转基因株系，命名为NAC079 OX。具体操作由百格基因科技有限公司完成。
3)NAC079 OX转基因水稻植株分子鉴定
对上述获得的8个T0代NAC079 OX转基因水稻和野生型水稻ZH11(记为WT)进行分子鉴定，提取各种水稻根的总RNA经反转录后，用如下引物进行RT-PCR方法鉴定：
NAC079基因引物信息如下：
PF：5’-AAGCACTCCAATCCGGTAAC-3’(SEQ ID NO.9)；
PR：5’-GTGGGACCGCTTGCTTGAAC-3’(SEQ ID NO.10)；
内参基因引物信息如下：
F：5’-GACGGACGCACCCTGGCTGA-3’(SEQ ID NO.11)；
R：5’-TGCTGCCAATTACCATATACC-3’(SEQ ID NO.12)；。
RT-PCR的反应体系为：
| 组分 | 体积 |
| TaqMix | 10μL |
| TemplatecDNA | 3μL |
| Forwardprimer | 1μL |
| Reverseprimer | 1μL |
| ddH2O | 5μL |
| Intotal | 20μL |
RT-PCR的反应程序为：
结果如图2所示，NAC079 OX转基因水稻OX 1(#1)、OX 2(#2)中NAC079表达量均明显比野生型高。
实施例3
nac79转基因水稻和NAC079 OX转基因水稻接种纹枯病菌后表型观察
采用活体叶鞘接种纹枯病菌的方法进行抗性鉴定，实验方法如下：
纹枯病菌种制备：将4℃保管的纹枯病菌(Rhizoctonia solani)AG1-IA(由沈阳农业大学植物保护学院魏松红教授提供，公开于(Li S,Peng X,Wang Y,et al.The EffectorAGLIP1 in Rhizoctonia solani AG1 IA Triggers Cell Death in Plants andPromotes Disease Development Through Inhibiting PAMP-Triggered ImmunityinArabidopsis thaliana[J].Frontiers in Microbiology,2019,10:2228)用打孔器挑取菌饼接种于PDA培养基上，倒置培养，待培养基上长满灰白色菌丝时，挑取培养基外围菌饼并将菌饼转移到幼苗水稻叶片上，使纹枯病菌侵染水稻叶片并活化。待叶片被侵染直至纹枯病菌生出菌核后，将菌核置于PDA培养基上培养至菌丝长满培养皿后取出备用。
接种前准备：在水稻纹枯病菌培养基上用打孔器或者枪头打下一个菌饼。将打好的菌饼菌丝一面扣置于PDA培养基上，在菌饼周围靠近培养皿边缘处铺好木皮(规格为0.5cm×0.3cm×0.15mm，且需经过高温高压湿热灭菌处理)。待菌丝爬上木皮布满培养皿后取出备用。
活体接种：选取三叶期的成熟水稻植株，选取近根处同叶龄同位置的完全叶处，将布满菌丝的木片轻柔放置于该叶鞘处，喷施适量的无菌水，并用保鲜膜轻微包缠以保证湿度和防止木片脱落(待植株发病，需要4～7天)；同时设置野生型水稻品种ZH11作为对照。每天记录发病情况，并于7天后统计发病情况，每个处理3次重复。结果见图3。
nac079突变体植株离体接种结果显示，nac079突变体植株的病斑小于野生型，结果表现为更抗病。NAC079 OX转基因植株离体接种结果显示过表达植株的病斑长度也比野生型更长，表明过表达植株更易感纹枯病菌。
综上所述，NAC079基因负调控水稻对纹枯病的防御反应，NAC079过表达植物对纹枯病菌更易感，敲除NAC079基因增强水稻对纹枯病的抗性，对选育新的水稻抗纹枯病品种具有重要的研究价值。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (7)
1.NAC079基因在调控水稻抗纹枯病中的应用，所述NAC079基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述调控水稻抗纹枯病包括：通过负调控NAC079基因的表达来增加水稻的纹枯病抗性或通过正调控NAC079基因的表达来降低水稻的纹枯病抗性。
2.一种改变水稻纹枯病抗性的方法，其特征在于，包括：在水稻基因组中，对NAC079基因进行基因编辑，所述NAC079基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基因编辑包括敲低所述NAC079基因的表达、敲除所述NAC079基因或过表达所述NAC079基因。
4.一种NAC079基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括NAC079基因和基础载体；所述NAC079基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基础载体为pTF101-ubi载体。
5.一种靶向水稻NAC079基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA-S和sgRNA-A；所述sgRNA-S的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述sgRNA-A的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
6.一种NAC079基因的敲除载体，其特征在于，所述敲除载体包括权利要求5所述的sgRNA和基础载体；所述NAC079基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基础载体为pRGEB31载体。
7.NAC079基因或权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的sgRNA或权利要求6所述的敲除载体在培育不同纹枯病抗性的水稻种质和/或筛选水稻纹枯病药物中的应用，所述NAC079基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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