CN115976071A - PAP10a基因在调控水稻抗稻瘟病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及PAP10a基因在调控水稻抗稻瘟病中的应用。本发明提供了PAP10a基因在调控水稻抗稻瘟病中的应用，所述PAP10a基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，对受体水稻中的PAP10a基因进行编辑，获得PAP10a敲除的转基因植株pap10a。同时通过过表达转基因技术获得PAP10a过表达转基因植株PAP10a‑OE。通过接种稻瘟病菌Guy11进行抗性鉴定发现，与野生型水稻相比，pap10a更加抗病，PAP10a‑OE则更加感病。证实PAP10a与水稻对稻瘟病的抗性相关，可用于创制水稻稻瘟病抗性新种质。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及PAP10a基因在调控水稻抗稻瘟病中的应用。
背景技术
稻瘟病(Rice blast)是稻作生产中的主要病害，由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引发的真菌性病害可造成大幅度减产，稻瘟病素有“水稻癌症”之称，严重危害水稻的产量和品质。目前，稻瘟病的田间防治手段仍以化学防治为主，结合选用抗病品种，以期达到抗病防治的目的。但随着化学药剂的大量施用以及病原菌的致病性变化，现有的防治方法很难达到绿色生产的需求，因此发掘和选育新的抗性品种是防治水稻稻瘟病的安全有效的策略。
紫色酸性磷酸酶(purple acidphosphatases,PAPs)是一种广泛存在于植物体内的金属磷酸酶类，其在弱酸性条件下表现出最大酶活性，能够有效催化磷酸酯或酸酐的水解。磷是植物生长发育过程中必需的大量营养元素之一，对植物新陈代谢和正常生长发育有着极其重要的作用。磷素不仅构成了生物细胞内包括核酸，磷脂等在内的数百种的重要化合物分子，而且还参与了植物体内许多重要的生理生化过程，如光合作用和能量代谢，酶活性，细胞信号调控等,因此对植物生长发育及作物产量形成等具有重要影响。植物在缺磷条件下，显著诱导分泌多种PAP，将胞外的有机磷降解为无机磷供植物吸收利用，进而提高植物对缺磷胁迫的适应性。在调节植物碳代谢、细胞壁合成和抵御病菌侵染等方面PAPs同样也发挥重要生理作用，但是目前并没有将稻瘟病抗性与PAPs进行关联的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供PAP10a基因在调控水稻抗稻瘟病中的应用，PAP10a负调控水稻对稻瘟病的防御反应，PAP10a过表达植物对稻瘟病菌更易感，敲除PAP10a增强水稻对稻瘟病的抗性，对选育新的水稻抗稻瘟病品种具有重要的研究价值。
本发明提供了PAP10a基因在调控水稻抗稻瘟病中的应用，所述PAP10a基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述PAP10a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种改变水稻对稻瘟病抗性的方法，包括在水稻基因组中，对PAP10a基因进行基因编辑，所述PAP10a基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述基因编辑包括敲低所述PAP10a基因的表达、敲除所述PAP10a基因或过表达所述PAP10a基因。
优选的，敲除所述PAP10a基因的方法包括CRISPR/Cas9基因编辑方法；
过表达所述PAP10a基因的方法包括植物过表达载体的遗传转化方法。
本发明还提供了一种敲除PAP10a基因提高水稻对稻瘟病抗性的方法，包括利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法敲除水稻基因组中PAP10a基因，所述PAP10a基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述植物基因编辑的基础载体包括pRGEB31载体(CRISPR载体构建参考文献Targeted Gene Mutation in Rice Using a CRISPR-Cas9 System)。
本发明还提供了一种过表达PAP10a基因降低水稻对稻瘟病抗性的方法，包括将包含PAP10a基因的植物过表达载体，利用遗传转化的方法转化目标水稻。
优选的，所述植物过表达载体的基础载体包括pTF101-ubi载体。该载体基于商业化载体pTF101.1优化(由寿惠霞等人报道于2010年，文章信息doi:10.1371/journal.pone.0010190)。
本发明还提供了PAP10a基因在创制不同稻瘟病抗性的水稻种质和/或研制水稻稻瘟病药物中的应用。
有益效果：本发明提供了PAP10a基因在调控水稻抗稻瘟病中的应用，所述PAP10a基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明实施例中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，对受体水稻中的PAP10a基因进行编辑，获得PAP10a敲除的转基因植株pap10a。同时通过过表达转基因技术获得PAP10a过表达转基因植株PAP10a-OE。按照水稻稻瘟病抗性室内离体叶片鉴定技术规程，通过接种稻瘟病菌Guy11(由中国农业大学植物保护学院杨俊教授提供)进行抗性鉴定发现，与野生型水稻相比，pap10a更加抗病，PAP10a-OE则更加感病。证实PAP10a与水稻对稻瘟病的抗性相关，可用于创制水稻稻瘟病抗性新种质。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pap10a转化株系分析图；
图2为PAP10a-OE转化株系分析图；
图3为pap10a和PAP10a-OE转基因水稻接种稻瘟病后表型。
具体实施方式
本发明提供了PAP10a基因在调控水稻抗稻瘟病中的应用，所述PAP10a基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：MVDRIGAAWWCACAVGMLVVGACLAGETSEYRRQLGSAVDMPLDADVFRAPPGRNAPQQVHITQGNHDGTAMIISWVTTIEPGSSTVLYGTSEDNLNFSADGKHTQYTFYNYTSGYIHHCTIKKLEFDTKYYYAVGIGQTVRKFWFRTPPKSGPDVPYTFGLIGDLGQSYDSNITLAHYESNSKAQAVLFVGDLCYADNYPYHDNVRWDTWARFVERNVAYQPWIWTAGNHEIDFAPELGETKPFKPYSYRYPTPYKASGSTAPFWYSVKRASAYIIVLASYSSYGKYTPQYKWLEAEFPKVNRSETPWLIVLLHAPWYNSYNYHYMEGESMRVMYEPWFVKYKVDLVFAGHVHAYERTHRISNVAYNIVNGQCTPVHDQSAPVYITIGDGGNQEGLATNMTAPQPGYSAFRESSFGHAILDIKNRTHAYYTWHRNQDGNAVAADSMWFTNRYWQPTDESLDDSQ。
本发明所述PAP10a基因的核苷酸序列，优选如SEQ ID NO.2所示：ATGGTGGACCGGATCGGCGCCGCGTGGTGGTGCGCGTGCGCCGTGGGGATGCTGGTGGTGGGGGCGTGCCTCGCCGGGGAGACCAGCGAGTACCGGCGCCAGCTCGGCTCCGCCGTCGACATGCCGCTCGACGCCGACGTCTTCCGCGCCCCGCCCGGCCGCAATGCGCCCCAGCAGGTTCATATCACACAAGGAAATCATGATGGCACTGCCATGATAATCTCATGGGTGACAACAATTGAGCCAGGCTCAAGCACTGTGCTCTATGGGACTTCGGAGGATAATCTTAATTTCTCTGCAGATGGAAAACACACTCAGTATACGTTCTACAACTACACCTCAGGATACATTCATCACTGTACAATAAAAAAGTTGGAGTTTGACACAAAATACTACTATGCTGTTGGGATTGGACAAACCGTGAGGAAGTTTTGGTTCAGAACCCCTCCAAAAAGTGGCCCAGATGTTCCATATACATTTGGTCTCATAGGTGATCTTGGTCAGAGCTACGACTCGAATATTACGCTGGCCCATTATGAGTCCAATTCAAAGGCGCAAGCAGTACTTTTCGTTGGGGATCTGTGTTATGCAGATAACTACCCATACCATGACAATGTGAGGTGGGATACATGGGCAAGATTTGTAGAGAGGAATGTTGCCTACCAGCCTTGGATCTGGACAGCTGGAAATCATGAGATAGATTTTGCCCCAGAACTTGGTGAAACGAAGCCATTCAAGCCATACAGCTATAGGTACCCCACACCTTATAAGGCTTCCGGTAGCACGGCACCTTTCTGGTATTCTGTCAAAAGAGCATCTGCTTATATTATTGTCTTGGCATCATATTCATCATATGGAAAGTATACTCCTCAGTACAAGTGGCTTGAAGCTGAGTTTCCCAAGGTTAACAGGAGTGAAACGCCATGGTTGATAGTGCTATTGCATGCTCCGTGGTACAACAGCTATAACTATCACTACATGGAAGGTGAAAGCATGAGAGTTATGTATGAGCCGTGGTTCGTCAAGTACAAAGTTGACCTCGTGTTTGCAGGACATGTTCATGCCTATGAACGGACACACAGGATATCAAATGTCGCGTACAACATTGTGAATGGCCAGTGCACTCCAGTCCATGATCAGTCTGCTCCAGTCTACATAACCATCGGAGATGGAGGAAACCAGGAAGGACTGGCCACCAACATGACGGCGCCGCAGCCTGGCTACTCGGCCTTCAGGGAGTCGAGCTTCGGGCACGCCATCCTGGACATCAAGAACAGGACGCACGCGTACTACACGTGGCACCGCAACCAGGACGGCAACGCTGTGGCGGCTGACTCCATGTGGTTCACCAACAGATACTGGCAGCCGACGGATGAATCTTTGGACGACTCCCAGTGA，其中下划线部分中CACTGCCATGATAATCTCAT是靶向序列，GGG是PAM序列。
本发明实施例中通过基因编辑方法，对水稻基因组中的PAP10a基因进行敲除和过表达，并通过稻瘟病抗性鉴定，结果发现与野生型水稻对照相比，经过基因敲除后的突变株更加抗病，过表达的突变株则更易感病，证实PAP10a与水稻对稻瘟病的抗性调控相关。因此可将所述PAP10a基因应用于调控水稻对稻瘟病的抗性。
本发明还提供了一种改变水稻对稻瘟病抗性的方法，包括在水稻基因组中，对PAP10a基因进行基因编辑，所述PAP10a基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述基因编辑，优选包括敲低所述PAP10a基因的表达、敲除所述PAP10a基因或过表达所述PAP10a基因。本发明对所述基因敲除的方法并没有特殊限定，实施例中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术实现了所述PAP10a基因的敲除。本发明对所述基因过表达的方法并没有特殊限定，实施例中通过植物过表达载体的遗传转化方法实现了所述PAP10a基因的过表达。
本发明还提供了一种敲除PAP10a基因提高水稻对稻瘟病抗性的方法，包括利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法敲除水稻基因组中PAP10a基因，所述PAP10a基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明优选由百格基因科技有限公司进行靶位点序列设计和引物设计，通过网站设计PAP10a基因的靶位点序列CACTGCCATGATAATCTCAT，再结合酶切位点设计引物。
本发明还提供了一种过表达PAP10a基因降低水稻对稻瘟病抗性的方法，包括将包含PAP10a基因的植物过表达载体，利用遗传转化的方法转化目标水稻。
本发明所述植物过表达载体的基础载体优选包括pTF101-ubi载体(草铵膦筛选)，实施例中由百格基因科技有限公司进行载体构建及转化。
本发明还提供了PAP10a基因在创制不同稻瘟病抗性的水稻种质和/或研制水稻稻瘟病药物中的应用。
利用本发明所述PAP10a基因，通过基因编辑的手段可获得更抗稻瘟病的水稻种质，也可获得更易感稻瘟病的水稻种质，可基于实验需求对所述PAP10a基因进行敲除或过表达，以获得不同稻瘟病抗性的水稻种质，而且还可应用于研制或筛选水稻稻瘟病的药物。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的PAP10a基因在调控水稻抗稻瘟病中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
CRISPR/Cas9基因编辑转基因水稻植株pap10a的获得
1)转基因水稻的获得
通过网站(http://www.genome.arizona.edu/crispr/)设计OsPAP10a的靶位点序列，根据载体酶切位点设计引物，正向引物(SEQ ID NO.3)：5’ggcaCACTGCCATGATAATCTCAT3’，反向引物(SEQ ID NO.4)：5’aaacATGAGATTATCATGGCAGTG3’。利用PCR仪对引物进行复性形成双链DNA，PCR反应体系为：正向引物(100μM)1μL，反向引物(100μM)1μL，10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL，ddH2O 7μL。PCR程序为：37℃60分钟；95℃10分钟，按照每个循环下降0.1℃的速度降至25℃，复性产物按照1：200比例稀释置于4℃保存。利用T4 DNA连接酶将经BsaⅠ酶切后的载体pRGEB31和复性产物连接，采用热激法转化大肠杆菌DH5α菌株。挑选阳性克隆进行PCR验证，验证阳性克隆进行测序，经比对正确的质粒转入农杆菌EHA105菌株中，利用该菌株转化水稻品种日本晴，利用潮霉素筛选获得T0代转基因水稻。
2)转基因水稻的鉴定
得到的转基因植株经测序分析验证，如图1所示。通过对阳性植株测序分析发现，pap10a-1和pap10a-2突变植株分别在编码区223bp处和221bp处增加了1个T碱基，而pap10a-3突变植株则在222bp处有2个碱基的缺失。
测序引物信息如下：
PAP10a-F1(SEQ ID NO.5)：ATTGGTTGCAGGGCCCTTTTACGA；
PAP10a-R1(SEQ ID NO.6)：GTCCAATCCCAACAGCATAGT。
实施例2
PAP10a过表达转基因水稻植株的获得
1)用于过表达PAP10a基因的重组载体构建
OsPAP10a基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2第1-1395位核苷酸，编码的蛋白为OsPAP10a，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
根据骨架载体pTF101-ubi酶切位点设计扩增OsPAP10a核苷酸序列的引物，正向引物和反向引物5’端均带有18bp与骨架载体重叠的序列，正向引物序列(SEQ ID NO.7)：5’tgcaggtcgactctagagATGGTGGACCGGATCGGC3’，反向引物(SEQ ID NO.8)：5’tcgagctcggtacccgggTCACTGGGAGTCGTCCAA3’。
以水稻品种日本晴cDNA为模板，常规的PCR程序扩增OsPAP10a核苷酸序列。PCR反应体系为：cDNA 1μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，2×PCRmix 25μL,ddH2O 22μL。PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃1.5分钟，33个循环；72℃终延伸10分钟。经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收片段，扩增片段大小为1398bp。
用限制性内切酶BamHⅠ酶切载体pTF101-ubi，经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化载体。利用苏州神洲基因有限公司提供的无缝克隆试剂盒，将回收的OsPAP10a核苷酸序列产物和线性化pTF101-ubi载体进行同源重组获得OsPAP10a的过表达载体Pubi-OsPAP10a，采用热激法转化大肠杆菌DH5α菌株。挑选阳性克隆进行PCR验证，阳性克隆进一步进行测序验证，经比对正确的质粒转入农杆菌EHA101菌株中。
2)过表达OsPAP10a基因转基因水稻的获得
利用农杆菌介导的转基因方法，将上述获得的Pubi-OsPAP10a过表达载体转化水稻品种ZH11，利用草铵膦筛选获得T0代转基因水稻，即为OsPAP10a过表达转基因株系，命名为PAP10a-OE。具体操作由百格基因科技有限公司完成。
3)PAP10a-OE转基因水稻植株分子鉴定
对上述获得的8个T0代PAP10a-OE转基因水稻和野生型水稻ZH11(WT)进行分子鉴定，提取各种水稻根的总RNA经反转录后，用如下引物进行RT-PCR方法鉴定：
PF(SEQ ID NO.9)：GAGATAGATTTTGCCCCAGAACT，
PR(SEQ ID NO.10)：AGCTTCAAGCCACTTGTACTGAG；
内参引物信息如下：
F(SEQ ID NO.11):GACGGACGCACCCTGGCTGA
R(SEQ ID NO.12)：TGCTGCCAATTACCATATACC。
结果如图2所示，PAP10a-OE转基因水稻OE-1、OE-10、OE-17和OE-20中PAP10a表达量均明显比野生型高。
实施例3
pap10a转基因水稻和PAP10a-OE转基因水稻接种稻瘟病菌后表型观察
采用离体叶片接种稻瘟病菌的方法进行抗性鉴定。
孢子悬浮液制备：将冻存保管的稻瘟病菌菌饼接种于PDA培养基上，待培养基上长出灰白色菌落时，挑取菌落转移到新的PDA培养基上。待菌落长满培养皿后，用无菌水刮掉上层菌丝，滤液涂布到番茄燕麦培养基上28℃光暗交替(12h:12h)培养7d-15d，待出现大量灰褐色孢子时，用无菌水进行洗脱，再用3层无菌纱布过滤孢子悬浮液，将孢子悬浮液浓度调整至2×105～3×105个/mL，备用。接种前加入吐温-20，使吐温-20终浓度为0.1％。
离体接种：水稻长至3-4叶期，将顶叶、倒数第2片叶剪下，叶片正面朝上平铺于用灭菌6-BA润湿的滤纸上。每段叶片用牙签轻微划伤，在划伤处放置20μL孢子悬浮液，28℃培养箱中黑暗处理24h后，恢复正常光照培养，每天记录发病情况，并于5d后统计发病情况，每个处理3次重复。
pap10a突变体植株离体接种结果显示，pap10a突变体植株的病斑小于野生型，结果表现为更抗病。PAP10a-OE转基因植株离体接种结果显示过表达植株的病斑长度也比野生型更长，表明过表达植株更易感稻瘟病菌。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.PAP10a基因在调控水稻抗稻瘟病中的应用，所述PAP10a基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述PAP10a基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.一种改变水稻对稻瘟病抗性的方法，其特征在于，包括在水稻基因组中，对PAP10a基因进行基因编辑，所述PAP10a基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述基因编辑包括敲低所述PAP10a基因的表达、敲除所述PAP10a基因或过表达所述PAP10a基因。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，敲除所述PAP10a基因的方法包括CRISPR/Cas9基因编辑方法；
过表达所述PAP10a基因的方法包括植物过表达载体的遗传转化方法。
6.一种敲除PAP10a基因提高水稻对稻瘟病抗性的方法，其特征在于，包括利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法敲除水稻基因组中PAP10a基因，所述PAP10a基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述植物敲除载体的基础载体包括pRGEB31载体。
8.一种过表达PAP10a基因降低水稻对稻瘟病抗性的方法，其特征在于，包括将包含PAP10a基因的植物过表达载体，利用遗传转化的方法转化目标水稻。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述植物过表达载体的基础载体包括pTF01-ubi载体。
10.PAP10a基因在创制不同稻瘟病抗性的水稻种质和/或研制水稻稻瘟病药物中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116004570A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-04-25 | 沈阳农业大学 | 一种水稻叶绿素含量调控基因OsCTR1及其编码蛋白质和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003000898A1 (en) * | 2001-06-22 | 2003-01-03 | Syngenta Participations Ag | Plant genes involved in defense against pathogens |
| CN105420208A (zh) * | 2015-12-02 | 2016-03-23 | 浙江大学 | 水稻酸性磷酸酶基因OsPAP10c及其应用 |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003000898A1 (en) * | 2001-06-22 | 2003-01-03 | Syngenta Participations Ag | Plant genes involved in defense against pathogens |
| CN105420208A (zh) * | 2015-12-02 | 2016-03-23 | 浙江大学 | 水稻酸性磷酸酶基因OsPAP10c及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JINGLUAN TIAN: "Overexpression of OsPAP10a, A Root-Associated Acid Phosphatase, Increased Extracellular Organic Phosphorus Utilization in Rice", 《JOURNAL OF INTEGRATIVE PLANT BIOLOGY》, vol. 54, no. 9, 13 July 2012 (2012-07-13), pages 633 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116004570A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-04-25 | 沈阳农业大学 | 一种水稻叶绿素含量调控基因OsCTR1及其编码蛋白质和应用 |
| CN116004570B (zh) * | 2022-12-06 | 2023-09-19 | 沈阳农业大学 | 一种水稻叶绿素含量调控基因OsCTR1及其编码蛋白质和应用 |
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