CN112626040B

CN112626040B - ZmRBOHb基因及其编码蛋白在玉米穗腐病抗性中应用

Info

Publication number: CN112626040B
Application number: CN202011544722.5A
Authority: CN
Inventors: 袁广胜; 兰海; 沈亚欧; 马浪浪; 高世斌; 潘光堂; 郑琦; 何慧; 史家豪; 杨焱; 王智颖; 邹超英
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2040-12-24
Also published as: CN112626040A

Abstract

本发明公开了ZmRBOHb基因及其编码蛋白在玉米穗腐病抗性中应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明对培育广谱、高效、稳定、持久抗病性品种，以及对玉米穗腐病的抗病机理研究的深入，均具有重要的理论和实践意义。

Description

ZmRBOHb基因及其编码蛋白在玉米穗腐病抗性中应用

技术领域

本发明属于生物技术和育种领域，尤其涉及ZmRBOHb基因及其编码蛋白在玉米穗腐病抗性中应用。

背景技术

玉米是全球种植范围最广、产量最大的谷类作物，居三大粮食作物(玉米、小麦、水稻)之首。近年来，由于玉米病虫害时常发生，严重威胁着玉米产量和品种，这其中玉米穗腐病(Maize ear rot)是玉米种植区内常见一种病害，一般品种发病率为5％-10％，感病品种发病率可以达到50％左右，是制约玉米产量提高的重要影响因素，玉米穗腐病由病原菌直接浸染玉米果穗或籽粒而导致玉米产量和质量下降，已引起了全国上下的全面重视。国家农作物品种审定委员2017年颁布的《主要农作物品种审定标准(国家级)》中已经将穗腐病作为其重要评定指标之一。玉米穗腐病的病原菌十分复杂，目前的研究结果证明禾谷镰饱菌(Fusarium graminearum)、拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)、赤霉菌(Gibberella fujikuroi)、曲霉菌(Aspergilllus spp)、青霉菌(Penicillium spp)等在内的20多种病原菌都能引起该病害发生。玉米穗腐病不仅会造成产量的大量损失，而且还会产生多种毒素，如脱氧雪腐镰孢菌烯(deoxynivalenol,DON)、玉米赤霉烯酮(zearalenol,ZEN)和伏马菌素(Fumonisins,FB)等，使玉米品质降低，严重威胁着人畜健康。种植抗性品种是当前防治该病害最经济有效的方式，其关键点是挖掘到有效的抗病基因，为分子辅助育种提供重要的基因资源。

大量研究证实，玉米穗腐病由多基因调控，受少数主基因和微效多基因作用，寻找和挖掘控制该病害的抗病基因面临着极大挑战。近年来，特别是高通量全基因测序和图位克隆策略的不断发展，利用大规模全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)检测、甲基化组和RNA-seq转录组测序等技术方法，可快速实现目标性状功能基因的定位、克隆和功能鉴定。如国内外学者先后克隆了与与玉米穗腐病密切相关的抗性基因，如病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins,PR)、蛋白激酶基因ZmCPK10、鸟苷酸环化酶类蛋白ZmGC1基因、qRfg1和qRfg2基因等。还鉴定到多个与穗腐病表型遗传变异相关的SNP(single-nucleotide polymorphisms,SNP)位点，为玉米抗病机制研究奠定了良好基础。在植物中，NADPH氧化酶隶属于呼吸爆发氧化酶(Respiratory Burst OxidaseHomolog,RBOH)家族，该家族成员都有FAD结合位点或者NADPH结合位点，6个跨膜结构域和一个功能性的氧化酶结构域，研究表明植物中不同RBOH家族成员调控不同的生物过程，如植物免疫应答、非生物胁迫信号途径、木质素化和生长发育等多种不同过程。结合前人研究结果，国内外在玉米穗腐病的病原菌种类、发病机理、抗性遗传机制以及抗病基因功能研究等方面开展了大量研究工作，并取得了阶段性成果，然而，要想从根本上解决穗腐病的危害，还需从分子水平上挖掘和鉴定抗病关键基因，并结合分子设计育种策略来实现抗病新材料的创制及新品种培育。因此，积极寻找抗玉米穗腐病的相关抗病基因并探知其功能，仍是当前玉米抗病育种的关键之所在，优异抗病基因的发掘与利用，不仅对培育广谱、高效、稳定、持久抗病性品种，而且对玉米穗腐病的抗病机理研究的深入，均具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明的目的在于：针对上述现有技术中存在的不足，提供ZmRBOHb基因及其编码蛋白在玉米穗腐病抗性中应用，ZmRBOHb基因是玉米受到禾谷镰饱菌浸染的关键基因，为培育抗穗腐病的玉米新品种提供了有用的基因资源。

本发明采用的技术方案如下：

ZmRBOHb基因及其编码蛋白在玉米穗腐病抗性中应用。

ZmRBOHb基因及其编码蛋白在改良玉米穗腐病抗性的遗传育种中应用。

进一步地，ZmRBOHb基因通过与Ca²⁺结合参与植物免疫反应。

进一步地，ZmRBOHb基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

ATGGCAGACACGGTCACGGGCAGTTCAAGGAGGTCACAAGATGACACTGCAACATTAATCCCACACAGTGGCAATTTGGGAGGATCAAGCCGGAAGGGCGTGAAGGCCGCCAGGTTCAAAGATGATGATGAGGTTGTGGAGATCACCATCGTACAGCGCGATTCCATGGCAATCGAAGATGTCAGGGTAGTCGATGATGGCGGCTCAGGGCATGGTGGTGGGTTTGACGGCCTGTCACTTGTGTCACCTTCCTCGTCAAGGAGCGGCAAGCTAGCATCAAAGTTTAGGCAGGTGAAAAATGGGCTAAAGATGAATAACTCAAGCAATAAGGCGCCACAGACACAGTTGGGAAAGAACGTGAGGAAGAGATTGGACAGAAGCAAGAGCGGTGCTGCTGTTGCGCTCAAGGGCTTGCAGTTTGTGACTGCGAAAGTTGGTCATGATGGCTGGGCTGCAGTGGAGAAACGGTTCAACCAGCTACAAGTTGATGGCGTGCTGCTACGTTCGAGATTCGGGAAATGCATTGGGATGGATGGATCTGATGAGTTTGCAATGCAAGTCTTCGATTCATTAGCAAGGAAGAGAGGGATAACGAAGCAGGTGCTGACTAAGGATGAGCTGAAAGATTTCTGGGACCAACTAAGTGATCAGGGTTTTGACAACCGTCTGCGGACATTCTTTGATATGGTTGACAAGAATGCTGATGGAAGGATCACAGCAGAGGAGGTTAAGGAGATCATTAGCCTCAGTGCATCAGCAAACAAGCTTTCCAAACTCAAGGAACGAGCTGATGAGTACACAGCACTCATTATGGAAGAACTTGACCGTGACAACCTGGGATACATTGAGCTTGAGGATCTGGAGGCACTTTTGCTGCAATCACCATCTCAAGCTGCTGCAAGATCAACAACACATAGTTCGAAACTTAGCAAAGCTCTTAGCATGAAGCTTGCATCAAACAAGGGCACAGGTCCATTTTACCACTACTGGCAAGAGTTCATGTACTTCCTTGAGGAGAACTGGAAGCGCATTTGGGTTATGACTCTCTGGCTCTCAATCTGCATTTGCCTCTTTATATGGAAGTTCATCCAATACCGTAATCGAGCTGTATTTCACATCATGGGTTATTGTGTGACCACTGCAAAAGGTGCTGCAGAGACTCTCAAATTCAATATGGCCTTGGTTCTATTTCCTGTTTGCCGAAATACAATCACTTGGATTCGATCGAAGACAAAGATCGGAGCTGTTGTGCCCTTCAATGACAACATAAACTTCCATAAGGTAAGACATATGTACTCAGTAATAGCAGCAGGTGTTGCAGTTGGTGTTGCTTTGCATGCAGGTGCTCACCTGACATGTGATTTTCCTCGGCTGCTCCATGCAAGTGATGCTGCCTATGAACCAATGAAGCCTTTCTTTGGAGACAAAAGGCCACCAAATTACTGGTGGTTTGTAAAGGGAACTGAAGGGTGGACAGGTGTGGTCATGGTTGTACTTATGACTATAGCCTTCGTATTGGCCCAGCCATGGTTTCGGCGTAATAGGCTCAAGGATTCTAATCCCCTCAAGAAAATGACTGGCTTCAATGCCTTTTGGTTTACGCACCACTTATTTGTTATTGTGTATGCACTGCTCGTTGTCCATGGGATCTGCTTATATCTAAGCAGGAAATGGTACAAGAAAACGACCTGGATGTACCTTGCTGTCCCTGTGCTCTTGTATGTAAGTGAGCGCATTCTTCGGCTATTTAGGAGCCATGACGCTGTTAGGATTCAGAAGGTTGCAGTGTATCCGGGGAATGTTTTGGCTCTCTATATGTCTAAGCCACCTGGATTCAGGTACCGGAGTGGGCAGTATATCTTCATAAACTGCCGTGCTGTCTCTCCATACGAATGGCATCCATTTTCCATTACATCAGCACCAGGAGATGATTATCTTAGTGTCCACATTCGCACAAGGGGTGATTGGACTTCACGTCTTAGGACTATCTTCTCTGAGCCGTGCCGCCCTCCAACTGATGGAGAAAGTGGACTCCTAAGAGCTGACCTTTCCAAGGGGATCACAGAGAGCAGCGCCAGGTTCCCTAAACTCTTGATTGATGGACCATATGGTGCTCCGGCGCAAGACTATCGGGAATACGATGTGCTCCTGCTCATTGGACTGGGCATTGGAGCCACTCCATTGATTAGCATTGTGAAGGATGTGCTTAACCACACCCAGCATGGAGGATCTGTTTCAGGCACGGAGCCTGAGGGCAGTGGCAAGGCCAAGAAGAGGCCATTCATGACGAAGAGGGCCTACTTCTACTGGGTGACCAGAGAAGAGGGATCTTTCGAATGGTTCCGAGGGGTCATGAACGAGGTGGCTGAGAAGGACAAGGATGGAGTCATTGAACTCCACAACCACTGCTCTAGTGTGTACGAGGAAGGGGATGCACGTTCTGCACTCATTGTCATGCTCCAAGAGCTCCAGCATGCGAAGAAAGGGGTCGACATCTTGTCTGGAACTAGTGTCAAGACGCACTTCGCGCGTCCCAATTGGCGAAGCGTCTTCAAACATGTTGCAGTGAACCATGAGAACCAACGCGTTGGAGTTTTCTACTGCGGTGAGCCTGTCCTTGTGCCACAGCTACGGCAGTGGTCAGCAGACTTCACCCACAAGACGAACACAAAGTTTGAGTTCCACAAGGAGAACTTCTAA

进一步地，ZmRBOHb基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

MADTVTGSSRRSQDDTATLIPHSGNLGGSSRKGVKAARFKDDDEVVEITIVQRDSMAIEDVRVVDDGGSGHGGGFDGLSLVSPSSSRSGKLASKFRQVKNGLKMNNSSNKAPQTQLGKNVRKRLDRSKSGAAVALKGLQFVTAKVGHDGWAAVEKRFNQLQVDGVLLRSRFGKCIGMDGSDEFAMQVFDSLARKRGITKQVLTKDELKDFWDQLSDQGFDNRLRTFFDMVDKNADGRITAEEVKEIISLSASANKLSKLKERADEYTALIMEELDRDNLGYIELEDLEALLLQSPSQAAARSTTHSSKLSKALSMKLASNKGTGPFYHYWQEFMYFLEENWKRIWVMTLWLSICICLFIWKFIQYRNRAVFHIMGYCVTTAKGAAETLKFNMALVLFPVCRNTITWIRSKTKIGAVVPFNDNINFHKVRHMYSVIAAGVAVGVALHAGAHLTCDFPRLLHASDAAYEPMKPFFGDKRPPNYWWFVKGTEGWTGVVMVVLMTIAFVLAQPWFRRNRLKDSNPLKKMTGFNAFWFTHHLFVIVYALLVVHGICLYLSRKWYKKTTWMYLAVPVLLYVSERILRLFRSHDAVRIQKVAVYPGNVLALYMSKPPGFRYRSGQYIFINCRAVSPYEWHPFSITSAPGDDYLSVHIRTRGDWTSRLRTIFSEPCRPPTDGESGLLRADLSKGITESSARFPKLLIDGPYGAPAQDYREYDVLLLIGLGIGATPLISIVKDVLNHTQHGGSVSGTEPEGSGKAKKRPFMTKRAYFYWVTREEGSFEWFRGVMNEVAEKDKDGVIELHNHCSSVYEEGDARSALIVMLQELQHAKKGVDILSGTSVKTHFARPNWRSVFKHVAVNHENQRVGVFYCGEPVLVPQLRQWSADFTHKTNTKFEFHKENF

进一步地，如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

进一步地，如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明以玉米抗、感穗腐病为材料，首次获得玉米抗、感材料在禾谷镰孢菌胁迫下DNA甲基化水平动态变化的甲基化谱，从中鉴定到与玉米穗腐病抗性相关基因ZmRBOHb，该基因参属于呼吸爆发氧化酶基因家族，参与植物活性氧ROS反应的免疫反应，在植物抗病免疫过程中扮演重要作用；

2、根据ZmRBOHb基因在接种禾谷镰孢菌后抗、感材料之间的表达量变化，以及与该基因关联基因的表达量变化，本发明确定ZmRBOHb是玉米应答禾谷镰孢菌侵染引起穗腐病的关键基因；

3、ZmRBOHb基因的克隆，对玉米穗腐病的抗病机理研究的深入以及在培育抗玉米穗腐病新品种中有重要应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明抗病材料IBM-81、感病材料IBM-85接种禾谷镰孢菌后表型；A：叶鞘抗病表型；B：叶片DAB染色对比图；C：叶片台盼蓝染色对比图；

图2为DNA甲基化分析及差异甲基化基因鉴定与功能KEGG分析；其中，不同背景下差异甲基化启动子的基因分别有14737，19300和17903个；A：CpG背景下甲基化基因在不同材料间的分布，共有的基因有23个；B：CHG背景下甲基化基因在不同材料间的分布，共有的基因有187个；C：CHH背景下甲基化基因在不同材料间的分布，共有的基因有122个；D：差异甲基化基因的KEGG分析；

图3为qRT-PCR检测抗性基因ZmRBOHb在抗、感病玉米材料中表达模式和关联基因在不同时间段的表达量；A：抗病基因ZmRBOHb在抗(IBM-81)、感(IBM-85)病玉米材料表达模式；B：关联的蛋白激酶基因ZmCPK5在抗(IBM-81)、感(IBM-85)病玉米材料中接菌不同时间段表达量；C：关联的转录调控因子基因WRKY48在抗(IBM-81)、感(IBM-85)病玉米材料中接菌不同时间段表达量；D：关联的SA生物合成过程关键酶基因SID2在抗(IBM-81)、感(IBM-85)病玉米材料中接菌不同时间段表达量；

图4为ZmRBOHb亚细胞定位结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

ZmRBOHb基因及其编码蛋白在玉米穗腐病抗性中应用，具体包括：

与玉米穗腐病抗性相关基因ZmRBOHb获得方法：取接菌后72小时的玉米抗(IBM-81)、感(IBM-85)材料的苞叶，利用全基因组DNA甲基化测序技术对抗、感材料在禾谷镰孢菌胁迫前后苞叶组织DNA甲基化水平进行检测，鉴定到DNA甲基化差异位点，从表观遗传水平解析玉米在禾谷镰刀菌胁迫下的DNA甲基化动态变化。

对差异甲基化基因进行KEGG分析，在植物-病原菌互作通路中，挖掘到28个特异基因，发现ZmRBOHb基因存在极其显著的甲基化水平改变。

通过克隆该基因全长序列，显示该基因编码区序列长度为2697bp，编码899个氨基酸。

通过生物信息学分析发现该基因含有一个钙离子结合区域，因此该基因可以被Ca²⁺结合从而引起活性氧爆发(Reactive oxygen species,ROS)来参与植物免疫反应，该基因在植物抗病免疫过程，即玉米应答禾谷镰孢菌侵染过程中扮演重要角色。

以抗、感玉米穗腐病为材料，利用全基因组DNA甲基化测序手段对这抗、感材料进行测序，检测抗、感玉米在应答病原菌胁迫条件下抗性基因的差异甲基化情况，借助于KEGG富集得到了调控相关差异甲基化基因，结合分子生物学和生物信息学方法获得抗性基因ZmRBOHb，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

与玉米穗腐病抗性相关基因ZmRBOHb的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

包含上述与玉米穗腐病抗性相关基因ZmRBOHb特征性引物对，引物对序列如下所示：

上游(F)：5'-ATGGCAGACACGGTCACGGG-3'；

下游(R)：5'-GAAGTTCTCCTTGTGGAACTC-3'；

PCR程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；60℃退火30s；68℃延伸5s；共35个循环；68℃再延伸10min。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例

1、玉米材料抗病表型鉴定

本发明所用的玉米材料(IBM-81)、(IBM-85)来源于四川农业大学玉米研究所，田间种植玉米材料，玉米授粉后10-15天，对这两个材料进行人工接种禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)，用注射器将制备好的禾谷镰孢菌孢子悬浮液2mL(浓度为2.5-3.0×10⁵个/mL)注射于果穗中上部的籽粒与苞叶之间，套袋、保湿，促使玉米感染穗腐病。表型鉴定结果显示玉米材料IBM-81属于高抗病材料，玉米材料IBM-85属于高感病材料，抗病性呈现显著性差异，尤其在两个材料的叶鞘上对病害的敏感程度表现出明显的差别(图1A)。在叶片上，两个材料之间对病害的敏感程度表现出明显的差别，在对叶片人工接种禾谷镰刀菌后，利用二氨基联苯胺(DAB，3,3-diaminobenzidine)染色，结果证明禾谷镰刀菌在抗性材料中的生长受到了明显的抑制(图1B)。当用台盼蓝染色叶片时，结果显示感病材料IBM-85叶片中台盼蓝染色的面积明显大于抗性材料IBM-81叶片中的(图1C)。综合以上结果可知抗(IBM-81)、感(IBM-85)材料之间对禾谷镰孢菌的抗性存在极大差异，可用作后续抗病基因挖掘与分离。

2、禾谷镰孢菌胁迫下抗感材料全基因组DNA甲基化测序分析

取接菌后72小时的玉米抗IBM-81、感IBM-85材料的苞叶，利用全基因组DNA甲基化测序技术(Whole Genome Bisulfite Sequencing,WGBS)对抗、感材料胁迫前后苞叶组织DNA甲基化水平进行检测，鉴定DNA甲基化差异位点，对测序后得到的原始数据进行过滤，截去接头以及reads首尾质量低于3或N的碱基，去除不能形成paired reads的测序数据，最终获得的clean reads用于后续分析(表1)。

表1全基因组DNA甲基化测序数据

注：Q20：即当碱基错误识别的概率是1％，或正确率是99％作为评判标准

Q30：碱基错误识别的概率是0.1％，或正确率是99.9％作为评估标准

通过解析病菌胁迫前后玉米苞叶组织中基因本体区域及启动子区域DNA甲基化水平变化。在CG，CHG和CHH背景下，差异甲基化启动子的基因分别有14737，19300和17903个，其中在CG背景下四个数据集共有的基因有23个，在CHG和CHH背景下则分别由187个和122个(图2A、B、C)。分别对188，167和245个为S81_CKvsS81_T和S81_TvsS85_T共有，但既不在S81_CKvsS85_CK也不在S85_CKvsS85_T的基因进行差异甲基化基因的KEGG分析，三种背景下差异甲基化的基因都集中在植物-病原菌互作的通路(图2D)，在植物-病原菌互作通路中，共挖掘到28个基因参与该通路。通过基因注释，发现这28个基因主要包括钙调蛋白家族成员RBOH、CDPK家族、CML家族、病程相关蛋白、CNGC、WRKY转录因子以及蛋白激酶类抗性基因家族。进一步对这些特异差异基因分析发现ZmRBOHb基因启动子区域在CG背景下存在极其显著的甲基化水平的改变，确定ZmRBOHb是玉米应答禾谷镰孢菌侵染的重要基因。

3、抗性基因ZmRBOHb在抗、感病玉米材料表达模式和关联基因在不同时间段的表达量

为验证ZmRBOHb基因在玉米抗、感材料中表达模式，取人工接种禾谷镰孢菌72小时的玉米抗IBM-81、感IBM-85材料的苞叶，按照Trizol试剂盒操作说明提取RNA，RNA提取步骤如下：称取0.3g新鲜苞叶放入研钵中，待液氮快干时迅速研磨，反复几次，直至磨细；将磨细的粉末用小勺收集到2mL的RNAase-free的离心管中，用1mL枪头吸取1mL Trizol加入离心管中；室温放置20-30min，取一管提取RNA，其余放于-80℃保存；将离心机预冷，在匀浆液中加入300uL氯仿，颠倒混匀1min，冰上放置5min，12000r/min离心20min，吸取上清，提取总RNA。利用提取的总RNA反转录成cDNA。cDNA合成步骤如下：用SYBR Green Assay试剂盒从总RNA中反转录得到基因组cDNA模板，反应体系为：

RT Enzyme Mix 1μL，RTPrimer Mix4 1μL，5×RT

Buffer2 4μL，反应液10μL，用双蒸水定容至20μL。反应程序：37℃15min，85℃5s，4℃保存。利用合成的cDNA作为模板，设计ZmRBOHb基因引物扩增该基因编码区，引物序列如下：

上游(F)：5'-ATGGCAGACACGGTCACGGG-3'；

下游(R)：5'-GAAGTTCTCCTTGTGGAACTC-3'；

用设计的引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：Taq Mix 7.5μL，上下游引物分别为0.75μL，cDNA模板1μL，用双蒸水定容至15μl。PCR扩增程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；60℃退火30s；68℃延伸5s；共35个循环；68℃再延伸10min。

以ZmActin为内参基因，通过荧光定量PCR检测抗感植株中ZmRBOHb基因的表达差异。在玉米抗IBM-81、感IBM-85材料接菌72小时，ZmRBOHb基因出现了明显的下调(图3-1)，证实ZmRBOHb是特异响应禾谷镰孢菌侵染的抗性基因。

为进一步验证ZmRBOHb基因在响应病原菌侵染的应答机制，通过生物信息学分析与ZmRBOHb的互作基因，结果发现该基因与ZmCDPK5、ZmWRKY48和水杨酸生物合成过程中的关键酶基因sid2有直接或间接相关。为了验证这关联基因的相关性，利用qRT-PCR对玉米抗IBM-81、感IBM-85材料接种禾谷镰孢菌后0天、2-4天的这些关联基因的表达量进行检测。结果证明ZmCDPK5在接菌后内呈上升趋势，相对于感性材料，ZmCDPK5的表达也表现出显著的提高(图3-2)。同时转录因子ZmWRKY48的表达量在抗性材料接菌后第2天开始就出现显著差异，在第3天达到最大值，其后逐渐下降，且在处理和对照之间差异一直极其显著；在感病材料中ZmWRKY48的表达量存在显著差异，但是差异表达出现在第2天和第3天之间，在第4天达到最大值(图3-3)。对于水杨酸生物合成过程中的关键酶基因SID2在接菌后3天的抗性材料出现大量表达且差异显著，且从接种后0d开始呈现逐渐上升的趋势；而在对照中，其表达量并没有明显的改变；在感病材料中，SID2的表达在接菌后表达量上升后下降(图3-4)。这些结果证明ZmRBOHb在应答禾谷镰孢菌胁迫过程中参与特定免疫反应，可调节相关联的基因协同差异表达，共同参与调控禾谷镰孢菌胁迫下玉米防御反应。

4、ZmRBOHb蛋白亚细胞定位

在Gramene下载目的基因转录本序列，根据目标序列设计亚细胞定位引物序列(上游引物：5'-ATGGCAGACACGGTCACGGG-3'；下游引物：5'-GAAGTTCTCCTTGTGGAACTC-3')，玉米的cDNA为模板，扩增出基因CDS序列全长，经测序验证后，采用同源重组法将目的片段构建入pM999-eGFP基础载体上，获得了用于转化的质粒pM999-ZmRBOHb。利用PEG转化法将亚细胞定位载体转到新鲜制备的玉米原生质体(B73)中，在激光共聚焦显微镜下明显的观察到ZmRBOHb在细胞膜上特异表达(图4)。ZmRBOHb编码区序列与绿色荧光蛋白报告基因(GFP)融合，并用CaMV35S启动子驱动，构建成瞬时表达载体，转化玉米原生质。激光共聚焦结果显示ZmRBOHb定位在细胞膜上，作为对照的空载体表达的GFP蛋白在各个细胞器和细胞核中分布。

结果说明，ZmRBOHb基因在响应禾谷镰孢菌侵染的玉米穗腐病中具有重要作用，该基因在调控玉米抗穗腐病中具有较好的应用潜力。本发明挖掘出的抗病ZmRBOHb基因为后续利用基因工程手段进行分子育种增强玉米抗病性具有潜在的应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> ZmRBOHb基因及其编码蛋白在玉米穗腐病抗性中应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2700

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcagaca cggtcacggg cagttcaagg aggtcacaag atgacactgc aacattaatc 60

ccacacagtg gcaatttggg aggatcaagc cggaagggcg tgaaggccgc caggttcaaa 120

gatgatgatg aggttgtgga gatcaccatc gtacagcgcg attccatggc aatcgaagat 180

gtcagggtag tcgatgatgg cggctcaggg catggtggtg ggtttgacgg cctgtcactt 240

gtgtcacctt cctcgtcaag gagcggcaag ctagcatcaa agtttaggca ggtgaaaaat 300

gggctaaaga tgaataactc aagcaataag gcgccacaga cacagttggg aaagaacgtg 360

aggaagagat tggacagaag caagagcggt gctgctgttg cgctcaaggg cttgcagttt 420

gtgactgcga aagttggtca tgatggctgg gctgcagtgg agaaacggtt caaccagcta 480

caagttgatg gcgtgctgct acgttcgaga ttcgggaaat gcattgggat ggatggatct 540

gatgagtttg caatgcaagt cttcgattca ttagcaagga agagagggat aacgaagcag 600

gtgctgacta aggatgagct gaaagatttc tgggaccaac taagtgatca gggttttgac 660

aaccgtctgc ggacattctt tgatatggtt gacaagaatg ctgatggaag gatcacagca 720

gaggaggtta aggagatcat tagcctcagt gcatcagcaa acaagctttc caaactcaag 780

gaacgagctg atgagtacac agcactcatt atggaagaac ttgaccgtga caacctggga 840

tacattgagc ttgaggatct ggaggcactt ttgctgcaat caccatctca agctgctgca 900

agatcaacaa cacatagttc gaaacttagc aaagctctta gcatgaagct tgcatcaaac 960

aagggcacag gtccatttta ccactactgg caagagttca tgtacttcct tgaggagaac 1020

tggaagcgca tttgggttat gactctctgg ctctcaatct gcatttgcct ctttatatgg 1080

aagttcatcc aataccgtaa tcgagctgta tttcacatca tgggttattg tgtgaccact 1140

gcaaaaggtg ctgcagagac tctcaaattc aatatggcct tggttctatt tcctgtttgc 1200

cgaaatacaa tcacttggat tcgatcgaag acaaagatcg gagctgttgt gcccttcaat 1260

gacaacataa acttccataa ggtaagacat atgtactcag taatagcagc aggtgttgca 1320

gttggtgttg ctttgcatgc aggtgctcac ctgacatgtg attttcctcg gctgctccat 1380

gcaagtgatg ctgcctatga accaatgaag cctttctttg gagacaaaag gccaccaaat 1440

tactggtggt ttgtaaaggg aactgaaggg tggacaggtg tggtcatggt tgtacttatg 1500

actatagcct tcgtattggc ccagccatgg tttcggcgta ataggctcaa ggattctaat 1560

cccctcaaga aaatgactgg cttcaatgcc ttttggttta cgcaccactt atttgttatt 1620

gtgtatgcac tgctcgttgt ccatgggatc tgcttatatc taagcaggaa atggtacaag 1680

aaaacgacct ggatgtacct tgctgtccct gtgctcttgt atgtaagtga gcgcattctt 1740

cggctattta ggagccatga cgctgttagg attcagaagg ttgcagtgta tccggggaat 1800

gttttggctc tctatatgtc taagccacct ggattcaggt accggagtgg gcagtatatc 1860

ttcataaact gccgtgctgt ctctccatac gaatggcatc cattttccat tacatcagca 1920

ccaggagatg attatcttag tgtccacatt cgcacaaggg gtgattggac ttcacgtctt 1980

aggactatct tctctgagcc gtgccgccct ccaactgatg gagaaagtgg actcctaaga 2040

gctgaccttt ccaaggggat cacagagagc agcgccaggt tccctaaact cttgattgat 2100

ggaccatatg gtgctccggc gcaagactat cgggaatacg atgtgctcct gctcattgga 2160

ctgggcattg gagccactcc attgattagc attgtgaagg atgtgcttaa ccacacccag 2220

catggaggat ctgtttcagg cacggagcct gagggcagtg gcaaggccaa gaagaggcca 2280

ttcatgacga agagggccta cttctactgg gtgaccagag aagagggatc tttcgaatgg 2340

ttccgagggg tcatgaacga ggtggctgag aaggacaagg atggagtcat tgaactccac 2400

aaccactgct ctagtgtgta cgaggaaggg gatgcacgtt ctgcactcat tgtcatgctc 2460

caagagctcc agcatgcgaa gaaaggggtc gacatcttgt ctggaactag tgtcaagacg 2520

cacttcgcgc gtcccaattg gcgaagcgtc ttcaaacatg ttgcagtgaa ccatgagaac 2580

caacgcgttg gagttttcta ctgcggtgag cctgtccttg tgccacagct acggcagtgg 2640

tcagcagact tcacccacaa gacgaacaca aagtttgagt tccacaagga gaacttctaa 2700

<210> 2

<211> 899

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Asp Thr Val Thr Gly Ser Ser Arg Arg Ser Gln Asp Asp Thr

1 5 10 15

Ala Thr Leu Ile Pro His Ser Gly Asn Leu Gly Gly Ser Ser Arg Lys

20 25 30

Gly Val Lys Ala Ala Arg Phe Lys Asp Asp Asp Glu Val Val Glu Ile

35 40 45

Thr Ile Val Gln Arg Asp Ser Met Ala Ile Glu Asp Val Arg Val Val

50 55 60

Asp Asp Gly Gly Ser Gly His Gly Gly Gly Phe Asp Gly Leu Ser Leu

65 70 75 80

Val Ser Pro Ser Ser Ser Arg Ser Gly Lys Leu Ala Ser Lys Phe Arg

85 90 95

Gln Val Lys Asn Gly Leu Lys Met Asn Asn Ser Ser Asn Lys Ala Pro

100 105 110

Gln Thr Gln Leu Gly Lys Asn Val Arg Lys Arg Leu Asp Arg Ser Lys

115 120 125

Ser Gly Ala Ala Val Ala Leu Lys Gly Leu Gln Phe Val Thr Ala Lys

130 135 140

Val Gly His Asp Gly Trp Ala Ala Val Glu Lys Arg Phe Asn Gln Leu

145 150 155 160

Gln Val Asp Gly Val Leu Leu Arg Ser Arg Phe Gly Lys Cys Ile Gly

165 170 175

Met Asp Gly Ser Asp Glu Phe Ala Met Gln Val Phe Asp Ser Leu Ala

180 185 190

Arg Lys Arg Gly Ile Thr Lys Gln Val Leu Thr Lys Asp Glu Leu Lys

195 200 205

Asp Phe Trp Asp Gln Leu Ser Asp Gln Gly Phe Asp Asn Arg Leu Arg

210 215 220

Thr Phe Phe Asp Met Val Asp Lys Asn Ala Asp Gly Arg Ile Thr Ala

225 230 235 240

Glu Glu Val Lys Glu Ile Ile Ser Leu Ser Ala Ser Ala Asn Lys Leu

245 250 255

Ser Lys Leu Lys Glu Arg Ala Asp Glu Tyr Thr Ala Leu Ile Met Glu

260 265 270

Glu Leu Asp Arg Asp Asn Leu Gly Tyr Ile Glu Leu Glu Asp Leu Glu

275 280 285

Ala Leu Leu Leu Gln Ser Pro Ser Gln Ala Ala Ala Arg Ser Thr Thr

290 295 300

His Ser Ser Lys Leu Ser Lys Ala Leu Ser Met Lys Leu Ala Ser Asn

305 310 315 320

Lys Gly Thr Gly Pro Phe Tyr His Tyr Trp Gln Glu Phe Met Tyr Phe

325 330 335

Leu Glu Glu Asn Trp Lys Arg Ile Trp Val Met Thr Leu Trp Leu Ser

340 345 350

Ile Cys Ile Cys Leu Phe Ile Trp Lys Phe Ile Gln Tyr Arg Asn Arg

355 360 365

Ala Val Phe His Ile Met Gly Tyr Cys Val Thr Thr Ala Lys Gly Ala

370 375 380

Ala Glu Thr Leu Lys Phe Asn Met Ala Leu Val Leu Phe Pro Val Cys

385 390 395 400

Arg Asn Thr Ile Thr Trp Ile Arg Ser Lys Thr Lys Ile Gly Ala Val

405 410 415

Val Pro Phe Asn Asp Asn Ile Asn Phe His Lys Val Arg His Met Tyr

420 425 430

Ser Val Ile Ala Ala Gly Val Ala Val Gly Val Ala Leu His Ala Gly

435 440 445

Ala His Leu Thr Cys Asp Phe Pro Arg Leu Leu His Ala Ser Asp Ala

450 455 460

Ala Tyr Glu Pro Met Lys Pro Phe Phe Gly Asp Lys Arg Pro Pro Asn

465 470 475 480

Tyr Trp Trp Phe Val Lys Gly Thr Glu Gly Trp Thr Gly Val Val Met

485 490 495

Val Val Leu Met Thr Ile Ala Phe Val Leu Ala Gln Pro Trp Phe Arg

500 505 510

Arg Asn Arg Leu Lys Asp Ser Asn Pro Leu Lys Lys Met Thr Gly Phe

515 520 525

Asn Ala Phe Trp Phe Thr His His Leu Phe Val Ile Val Tyr Ala Leu

530 535 540

Leu Val Val His Gly Ile Cys Leu Tyr Leu Ser Arg Lys Trp Tyr Lys

545 550 555 560

Lys Thr Thr Trp Met Tyr Leu Ala Val Pro Val Leu Leu Tyr Val Ser

565 570 575

Glu Arg Ile Leu Arg Leu Phe Arg Ser His Asp Ala Val Arg Ile Gln

580 585 590

Lys Val Ala Val Tyr Pro Gly Asn Val Leu Ala Leu Tyr Met Ser Lys

595 600 605

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610 615 620

Arg Ala Val Ser Pro Tyr Glu Trp His Pro Phe Ser Ile Thr Ser Ala

625 630 635 640

Pro Gly Asp Asp Tyr Leu Ser Val His Ile Arg Thr Arg Gly Asp Trp

645 650 655

Thr Ser Arg Leu Arg Thr Ile Phe Ser Glu Pro Cys Arg Pro Pro Thr

660 665 670

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675 680 685

Glu Ser Ser Ala Arg Phe Pro Lys Leu Leu Ile Asp Gly Pro Tyr Gly

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705 710 715 720

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725 730 735

Asn His Thr Gln His Gly Gly Ser Val Ser Gly Thr Glu Pro Glu Gly

740 745 750

Ser Gly Lys Ala Lys Lys Arg Pro Phe Met Thr Lys Arg Ala Tyr Phe

755 760 765

Tyr Trp Val Thr Arg Glu Glu Gly Ser Phe Glu Trp Phe Arg Gly Val

770 775 780

Met Asn Glu Val Ala Glu Lys Asp Lys Asp Gly Val Ile Glu Leu His

785 790 795 800

Asn His Cys Ser Ser Val Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Arg Ser Ala Leu

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Leu Ser Gly Thr Ser Val Lys Thr His Phe Ala Arg Pro Asn Trp Arg

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Ser Val Phe Lys His Val Ala Val Asn His Glu Asn Gln Arg Val Gly

850 855 860

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Ser Ala Asp Phe Thr His Lys Thr Asn Thr Lys Phe Glu Phe His Lys

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Glu Asn Phe

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcagaca cggtcacggg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaagttctcc ttgtggaact c 21

Claims

1.如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的ZmRBOHb基因或如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的ZmRBOHb基因编码蛋白在玉米穗腐病抗性中应用。

2.如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的ZmRBOHb基因或如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的ZmRBOHb基因编码蛋白在改良玉米穗腐病抗性的遗传育种中应用。