CN106701895B

CN106701895B - 与玉米抗旱性相关的单体型及其分子标记

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Publication number: CN106701895B
Application number: CN201510437662.XA
Authority: CN
Inventors: 秦峰; 毛虎德; 王宏伟; 刘升学; 李志刚
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2015-07-23
Filing date: 2015-07-23
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2035-07-23
Also published as: CN106701895A

Abstract

本发明公开了一种与玉米抗旱性相关的单体型及其分子标记。本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定玉米的抗旱性状的方法，包括如下步骤：检测待测玉米基因组中ZmNAC111基因上游是否缺失82bp的DNA分子，以确定待测玉米的单体型是单体型甲纯合还是单体型乙纯合，根据所述待测玉米的单体型确定玉米抗旱性性状：单体型甲纯合的待测玉米的抗旱性高于或候选高于单体型乙纯合的待测玉米；所述单体型甲纯合为待测玉米基因组中ZmNAC111基因上游缺失82bp的DNA分子，所述单体型乙纯为待测玉米基因组中ZmNAC111基因上游含有82bp的DNA分子。本发明为玉米的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育抗旱玉米品种或研究中具有重要意义。

Description

与玉米抗旱性相关的单体型及其分子标记

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种与玉米抗旱性相关的单体型及其分子标记。

背景技术

植物在复杂多变的环境中生长发育，常受到逆境胁迫，其中干旱是影响和限制植物生长发育的主要逆境因子，甚至会导致植物死亡，严重影响农业生产。因此，培育抗旱作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。玉米(Zea mays L.)是重要的粮食作物之一，培育抗旱玉米品种对提高玉米产量具有重要意义。

虽然提高玉米耐旱性已经成为目前玉米遗传改良的重要目标，但是发现和鉴定玉米耐旱性的遗传成分越来越成为一个挑战。尽管有关于玉米耐旱性遗传图谱的相关报道，但是，迄今为止关于玉米耐旱性的数量性状位点(QTL)还未被克隆。基于遗传连锁的QTL作图已经被广泛用来鉴定与开花时间，分枝结构，光周期敏感性，穗腐病抗性等性状相关的基因。但是，该方法通常会花费很长的时间用来构建群体。另外，为了获得精确的图谱信息，通常需要很大的群体数量及多步自交和回交来缩小候选基因的区域。近年来，基于连锁不平衡的全基因组关联分析(GWAS)作为一个新的研究策略，已经被用来鉴定作物复杂的数量性状位点。随着高通量测序技术的发展以及统计分析方法的改善，GWAS已经被应用于越来越多作物中。在玉米中，GWAS已经被用来检测包括种子β-胡萝卜素，油份含量及开花时间在内的一些复杂性状。尽管有关于玉米耐旱性的关联分析的报道，但是候选基因及其遗传变异仍然需要进一步鉴定。

在玉米基因组中，约85％的基因组成分由转座子(TEs)组成，而且基因序列中嵌入了大量的转座子。为了维持基因组的稳定性，转座子通常通过DNA和染色质的修饰而被沉默。越来越多的数据表明，转座子在植物进化和环境适应中起了很重要的作用。例如，tb1基因上游～60kb处一个转座的插入与增强玉米顶端优势相关；ZmCCT基因上游～2kb处CACTA转座子的插入与玉米光周期敏感性相关；ZmRAP2.7基因上游～70kb处一个微型转座因子(MITE)的插入与玉米开花时间相关。TE能够通过DNA及染色质甲基化影响附近基因表达。在植物中，MITE转座子可通RNA介导的DNA甲基化(RdDM)途径使自身及附近DNA序列或组蛋白发生甲基化，从而影响附近基因的表达。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定玉米的抗旱性状的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测玉米基因组中ZmNAC111基因上游是否缺失如下82bp的DNA分子：CTCCCTCCGTTTCTTTTTATTAGTCGCTGGATAGTGCAATTTTGCA

CTATCCAGCGACTAATAAAAAGAAACGGAGGGAGTA，以确定待测玉米的单体型是单体型甲纯合还是单体型乙纯合，根据所述待测玉米的单体型确定玉米抗旱性性状：单体型甲纯合的待测玉米的抗旱性高于或候选高于单体型乙纯合的待测玉米；所述单体型甲纯合为待测玉米基因组中ZmNAC111基因上游缺失所述82bp的DNA分子，所述单体型乙纯为待测玉米基因组中ZmNAC111基因上游含有所述82bp的DNA分子。

本发明另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测玉米是否为抗旱玉米方法。

CTATCCAGCGACTAATAAAAAGAAACGGAGGGAGTA，以确定待测玉米的单体型是单体型甲纯合还是单体型乙纯合，根据所述待测玉米的单体型确定玉米是否为抗旱玉米；若待测玉米为单体型甲纯合，则待测玉米为或候选为抗旱玉米，若待测玉米为单体型乙纯合，则待测玉米为或候选为非抗旱玉米；所述单体型甲纯合为待测玉米基因组中ZmNAC111基因上游缺失所述82bp的DNA分子，所述单体型乙纯为待测玉米基因组中ZmNAC111基因上游含有所述82bp的DNA分子。

上述方法中所述非抗旱玉米为在干旱胁迫下存活率小于5％的玉米，所述抗旱玉米为在干旱胁迫下存活率大于等于5％的玉米。所述干旱胁迫为不浇水至植物生长土壤中的相对含水量为0,且保持7天。

其中，抗旱玉米又可以分为中间型玉米和抗旱型玉米；

中间型玉米为存活率﹤40％，且≥5％的玉米；

抗旱型玉米为存活率≥40％的玉米。

上述方法中，所述检测待测玉米基因组中ZmNAC111基因上游是否缺失所述82bp的DNA分子的方法为1)或2)：

1)、直接测序；

2)、用能扩增含有所述82bp的DNA片段的引物对待测玉米基因组DNA进行扩增，根据PCR产物的大小判断是否缺失所述82bp的DNA分子。

上述方法中，所述能扩增含有所述82bp的DNA片段的引物对由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成；

所述根据PCR产物的大小判断是否缺失所述的82bp的DNA分子为如下：

若所述PCR产物的大小仅为142bp，则待测玉米2条同源染色体上ZmNAC111基因的上游均缺失所述82bp的DNA分子；

若所述PCR产物的大小为142bp和224bp，则待测玉米1条同源染色体上ZmNAC111基因的上游含有所述82bp的DNA分子，另一条同源染色体上ZmNAC111基因的上游缺失所述82bp的DNA分子；

若所述PCR产物的大小仅为224bp，则待测玉米2条同源染色体上ZmNAC111基因的上游均含有所述82bp的DNA分子。

本发明的第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定玉米的抗旱性状或鉴定或辅助鉴定待测玉米是否为抗旱玉米的试剂。

本发明提供的试剂，是检测待测玉米基因组中ZmNAC111基因上游是否缺失如下82bp的DNA分子：CTCCCTCCGTTTCTTTTTATTAGTCGCTGGATAGTGCAATTTTGCA

CTATCCAGCGACTAATAAAAAGAAACGGAGGGAGTA的物质。

上述试剂中，所述物质为由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成的引物对。

本发明第四个目的是提供鉴定或辅助鉴定玉米的抗旱性状或鉴定或辅助鉴定待测玉米是否为抗旱玉米的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，含有上述的试剂。

上述的试剂或上述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定玉米的抗旱性状中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的试剂或上述的试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定玉米的抗旱性状产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的试剂或上述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测玉米是否为抗旱玉米中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的试剂或上述的试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测玉米是否为抗旱玉米产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述的方法、上述的试剂或上述的试剂在培育抗旱玉米中的应用也是本发明保护的范围。

本发明还保护一种培育抗旱玉米的方法，包括培育选择上述单体型甲纯合的玉米。

或一种DNA片段，为如下1)-3)中任一种：

1)其为如下82bp的DNA分子：CTCCCTCCGTTTCTTTTTATTAGTCGCTGGATAGTGCAATTTTGCA

CTATCCAGCGACTAATAAAAAGAAACGGAGGGAGTA；

2)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的DNA分子；

3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的DNA分子；

所述DNA片段在调控玉米抗旱性中的应用。

本发明的实验证明，本发明通过对262个玉米自交系组成的自然变异群体中与抗旱性相关的基因ZmNAC111遗传变异分析，找到了形成玉米不同抗旱性的多态性位点(InDel-572)，该多态性位点仅存在两种单体型，因此可以通过检测该多态性位点的情况，即可找到抗旱性相对较高的玉米。本发明为玉米的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育抗旱玉米品种或研究中具有重要意义。

附图说明

图1为两种ZmNAC111基因单体型在抗旱型玉米和旱敏感型玉米中的序列差异。

图2为对不同分离群体各单株中分子标记InDel-572进行PCR扩增的结果。其中，从上至下的三幅图依次为分离群体CIMBL91×BY4944、CIMBL55×GEMS54、CIMBL55×CIMBL9的结果，泳道P1为亲本—玉米自交系BY4944、GEMS54、CIMBL9，泳道P2为亲本—CIMBL91和CIMBL55，其余泳道为各分离群体中的不同单株。

图3为ZmNAC111基因的相对表达水平与存活率的相关分析。其中，图A、B和C分别为苗期干旱处理后正常生长(RLWC＝98％)、中度干旱(RLWC＝70％)和极度干旱(RLWC＝58％)时的结果。红色点表示纯合单体型甲，绿色点表示纯合单体型乙。

图4为不同亚群中本发明两种单体型的等位基因频率。ZmNAC111基因序列来自190份无MITE转座子插入的玉米自交系及72份有MITE转座子插入的玉米自交系。TST为热带或亚热带血缘材料；SS为温带血缘材料；NSS为B73衍生系材料；MIXED为混合血缘材料。

图5为ZmNAC111优异等位基因型分析。(a)五个亲本苗期存活率。(b)在正常生长和干旱胁迫处理下，ZmNAC111基因的相对表达水平。(c)三个分离群体的F2单株PCR分型。(d)三个分离群体的F2单株基因型分型统计结果。(e)三个分离群体中，ZmNAC111优异等位基因型的耐旱效应。以上试验数据均是三次生物学重复的均值。(t-test,**p<0.01)。

图6为ZmNAC111耐旱及敏感基因型DNA甲基化及组蛋白H3K9me2分析。(a)McrBC-qPCR分析ZmNAC111基因组8各位点(R1-R8)DNA甲基化状态。(b)BSP1区域胞嘧啶C甲基化，灰色、绿色和蓝色分别代表CG、CHG和CHH位点胞嘧啶C甲基化。(c)ChIP-qPCR分析ZmNAC111基因组8各位点(R1-R8)组蛋白H3K9me2甲基化状态。(d)ZmNAC111基因组8各位点(R1-R8)及BSP1位置。利用t-test进行显著性检验，*p<0.05，**p<0.01。

图7为35S:gZmNAC111-B73及35S:gZmNAC111-CIMBL55株系中ZmNAC111基因表达分析。(a)载体构建示意图。MITE转座子用红色框表示，R1-R8及BSP1位置用横线表示。(b)左边：比较35S:gZmNAC111-B73(红点)及35S:gZmNAC111-CIMBL55(绿点)株系中ZmNAC111基因的表达。(c)右边：用内置在R程序中的lm函数对35S:gZmNAC111-B73(红色)和35S:gZmNAC111-CIMBL55(绿色)株系中ZmNAC111基因的表达进行方差分析。

图8为35S:gZmNAC111-B73及35S:gZmNAC111-CIMBL55株系耐旱性分析。(a)35S:gZmNAC111-B73及35S:gZmNAC111-CIMBL55转基因拟南芥株系耐旱性。(b)转基因拟南芥株系中ZmNAC111基因表达量。(c)转基因拟南芥株系存活率统计。利用t-test进行显著性检验，*p<0.05，**p<0.01。

图9为35S:gZmNAC111-B73及35S:gZmNAC111-CIMBL55株系中ZmNAC111基因DNA甲基化及组蛋白H3K9me2分析。(a)McrBC-qPCR分析ZmNAC111基因组8各位点(R1-R8)DNA甲基化状态。(b)BSP1区域胞嘧啶C甲基化，灰色、绿色和蓝色分别代表CG、CHG和CHH位点胞嘧啶C甲基化。(c)ZmNAC111基因组8各位点(R1-R8)及BSP1位置。利用t-test进行显著性检验，*p<0.05，**p<0.01。

图10为野生型及RdDM突变体背景下对35S:gZmNAC111-B73和35S:gZmNAC111-CIMBL55基因表达水平进行qRT-PCR分析。

图11为RdDM突变体中ZmNAC111启动子区DNA及组蛋白H3K9me2甲基化分析。(a)McrBC-qPCR检测R1区域DNA甲基化状态。(b)ChIP-qPCR检测R1及R2区域组蛋白H3K9me2状态。(c)拟南芥RdDM突变体背景下ZmNAC111启动子区BSP1区域CG(灰色)，CHG(绿色)，CHH(蓝色)位点胞嘧啶甲基化分析。利用t-test进行显著性检验，*p<0.05，**p<0.01。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的生物材料信息如下：

载体pGKX：文献：Qin F,Sakuma Y,Tran LS,Maruyama K,Kidokoro S,et al.(2008)Arabidopsis DREB2A-interacting proteins function as RING E3 ligases andnegatively regulate plant drought stress-responsive gene expression.PlantCell 20:1693-1707.公众可从中国科学院植物研究所获得；

根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株：文献：Scholthof HB,Alvarado VY,Vega-Arreguin JC,Ciomperlik J,Odokonyero D,et al.(2011)Identification of anARGONAUTE for antiviral RNA silencing in Nicotiana benthamiana.Plant Physiol156:1548-1555，公众可从中国科学院植物研究所获得；

载体pBI121：文献：Qin F,Kakimoto M,Sakuma Y,Maruyama K,Osakabe Y,et al.(2007)Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to droughtand heat stresses in Zea mays L.Plant J 50:54-69，公众可从中国科学院植物研究所获得；

根癌农杆菌GV3101菌株：文献：Jing Y,Zhang D,Wang X,Tang W,Wang W,et al.(2013)Arabidopsis chromatin remodeling factor PICKLE interacts withtranscription factor HY5 to regulate hypocotyl cell elongation.Plant Cell 25:242-256，公众可从中国科学院植物研究所获得；

哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana(Columbia ecotype))：文献：Yamaguchi-Shinozaki K,Shinozaki K(1994)A novel cis-acting element in anArabidopsis gene is involved in responsiveness to drought,low-temperature,orhigh-salt stress.Plant Cell 6:251-264.公众可从中国科学院植物研究所获得。

拟南芥RdDM突变体dcl2-1；dcl3-1；dcl4-2(CS16391)、suvh4-3(Salk_105816)、rdr2-2(SALK_059661)、ago4-5(CS9927)、drm1-2；drm2-2(CS16383)购自拟南芥信息资源中心(The Arabidopsis Information Resource)。公众可从中国科学院植物研究所获得。

下述实施例中多态性位点的命名方法为标记类型+序号；其中，InDel代表插入或缺失；序号是以玉米自交系B73基因组DNA中ZmNAC111基因的起始密码子(ATG)中的A记为“+1”；InDel-572代表在起始密码子(ATG)中的A的上游第572位碱基下游存在1个或多个碱基的插入或缺失；

玉米自交系B73基因组DNA中ZmNAC111基因的基因组序列如序列表序列1所示，，自序列1的5’端第878—2569位编码序列表序列2所示的蛋白；自序列1的5’端第878位为起始密码子ATG的中的碱基A。

实施例1、与玉米抗旱性相关的单体型及其分子标记与应用

一、鉴定单体型的分子标记InDel-572及其特异引物

1、测序鉴定单体型的分子标记InDel-572

对表3所示的262份玉米自交系中ZmNAC111基因的编码区、5’和3’端非翻译区的2.3kb基因组片段分四段进行测序，结果用MEGA5.0(http://www.megasoftware.net/)比对。根据比对结果分析，在研究中发现，在玉米基因组DNA中ZmNAC111基因的起始密码子ATG上游的如下82bp的DNA分子：CTCCCTCCGTTTCTTTTTATTAGTCGCTGGATAGTGCAATTTTGCA

CTATCCAGCGACTAATAAAAAGAAACGGAGGGAGTA，其表现出核苷酸多态性(图1)：

部分玉米自交系的同源染色体上均有所示的82bpDNA分子，命名为单体型乙纯合玉米；

部分玉米自交系的同源染色体上均没有所示的82bpDNA分子，命名为单体型甲纯合玉米；

部分玉米自交系的一条同源染色体上没有所示的82bpDNA分子，另一条同源染色体上有所示的82bpDNA分子，命名为单体型甲和乙杂合玉米。

因此，所示的82bpDNA分子为分子标记InDel-572。

2、PCR鉴定单体型的分子标记InDel-572

(1)设计引物

根据玉米基因组上所示82bpDNA分子两侧的保守序列，设计如下特异引物对：

F：5’-AGCACGATTCTAGTACTAACCGCAGGACTTCTTG-3’(如序列表序列2所示)；

R：5’-GACTGCCATTTTGTTTTCGCCGATGCA-3’(如序列表序列3所示)。

(2)、以玉米基因组DNA为模板，用步骤(1)设计的引物对进行PCR扩增，扩增条件为：

262份玉米自交系的单体型结果如表3所示，

若扩增产物的大小仅为142bp，则待测玉米为单体型甲纯合的玉米；若扩增产物的大小为仅224bp，则待测玉米为单体型乙纯合的玉米；若扩增产物的大小为142bp和224bp，则待测玉米为单体型甲和乙杂合的玉米。

二、分子标记InDel-572及其特异引物对确定玉米抗旱性性状

以抗旱型玉米自交系CIMBL55(表3中序号1)，CIMBL91(表3中序号8)为父本，旱敏感型玉米自交系GEMS54(表3中序号172),BY4944(表3中序号192),CIMBL9(表3中序号193)为母本杂交，再自交2代，获得三个分离群体CIMBL91×BY4944的F3代、CIMBL55×GEMS54的F3代、CIMBL55×CIMBL9的F3代。

亲本CIMBL91、BY4944、GEMS54、CIMBL9及其F3代单株分别用上述设计的特异引物对F/R进行PCR扩增，若扩增产物的大小为142bp，则待测玉米为单体型甲纯合的玉米；若扩增产物的大小为224bp，则待测玉米为单体型乙纯合的玉米；若扩增产物的大小为142bp和224bp，则待测玉米为单体型甲和乙杂合的玉米，结果如表1、表2和图2(第一行为CIMBL91×BY4944的F3代，第二行为CIMBL55×GEMS54的F3代，第一行为CIMBL55×CIMBL9的F3代，)所示。

取亲本CIMBL91、BY4944、GEMS54、CIMBL9、单体型甲纯合的F3代单株、单体型乙纯合的F3代单株种子，催芽后移栽到栽培盆(长×宽×深为0.70×0.50×0.18米，盛有5千克蛭石和5千克草炭土混合的栽培基质)中，每盆种植180株，在温室中，于光周期为每天16小时光照和8小时黑暗、温度为白天28℃、夜晚22℃、空气湿度60％的条件下培养10天，将植株进行干旱处理(即不浇水)，待土壤相对含水量(即采用购于北京盟创伟业科技有限公司的土壤水分仪SU-LA(W)，测得的土壤中水分的体积百分含量)达到0％后一周，进行复水。复水6天后统计各亲本及群体中各基因型植株的存活率(将复水6天后地上部未能转绿的植株，定义为死亡植株，将复水6天后地上部能转绿的植株定义为存活植株；存活率为存活植株占总植株数的百分比)。实验重复三次，每次重复约180个单株，取均值进行统计分析。结果如表1和表2所示。

表1、亲本的基因型及干旱处理后的存活率统计结果

亲本	基因型	存活率(％)
			CIMBL55	单体型甲纯合	82.9
CIMBL91	单体型甲纯合	65.6
			BY4944	单体型乙纯合	2.1
GEMS54	单体型乙纯合	4.1
			CIMBL9	单体型乙纯合	2.1

表2、抗旱与旱敏感的杂交分离群体的基因型及干旱处理后的存活率统计结果

注：表2中结果后的小写字母为群体内不同基因型植株经单因素方差分析(one-way ANOVA)在P<0.05的显著性，含有相同小写字母表示差异不显著，不含有相同小写字母表示差异显著；结果后的大写字母为群体内不同基因型植株经单因素方差分析(one-wayANOVA)在P<0.01的显著性，含有相同大写字母表示差异不显著，不含有相同大写字母表示差异极显著。表2中，各群体基因型分离比均符合孟德尔遗传定律。

表1和表2的结果表明：无论是亲本比较还是F3代的群体比较，单体型甲纯合的玉米抗旱性大于单体型乙纯合的玉米抗旱性。

因此，可以根据鉴定待测玉米基因组中ZmNAC111基因上游是否缺失所示的82bp的DNA分子(分子标记InDel-572)，以确定待测玉米的单体型是单体型甲纯合还是单体型乙纯合，根据所述待测玉米的单体型确定玉米抗旱性状：单体型甲纯合的待测玉米的抗旱性高于或候选高于单体型乙纯合的待测玉米；所述单体型甲纯合为待测玉米基因组中ZmNAC111基因上游缺失所示的82bp的DNA分子，所述单体型乙纯为待测玉米基因组中ZmNAC111基因上游含有所示的82bp的DNA分子。

在玉米育种中，应选择抗旱性较高的单体型甲纯合的玉米进行育种。

三、分子标记InDel-572及其特异引物对鉴定玉米抗旱性中的应用

1、抗旱性调查

将表3所示的262份玉米自交系组成的自然变异群体种植在栽培池(6×1.4×0.22米，长×宽×深)中，用5吨壤土混合0.25吨腐熟的鸡粪作栽培基质，分装于两池中。每池均分成105个小区，每个小区可种植9棵苗。待三片真叶苗龄时停止浇水，进行干旱处理，一直持续到土壤相对含水量降到零后7天进行复水，复水6天后统计存活率。统计分析中用到的干旱表型数据，均为独立重复试验的均值。结果如表3所示。

表3、262份玉米自交系组成的自然变异群体的抗旱性调查结果

表3中的亚群(MIXED，NSS，SS和TST)的划分依据文献：Yang X，Gao S，Xu S，ZhangZ，Prasanna B，et al.(2011)Characterization of a global germplasm collectionand its potential utilization for analysis of complex quantitative traits inmaize.Molecular Breeding 28:511-526，其中，TST＝热带或亚热带血缘，NSS＝温带血缘，SS＝B73衍生系，MIXED＝混合血缘。

表3所示262个玉米自交系均记载在如下文献中：Yang X，Gao S，Xu S，Zhang Z，Prasanna B，et al.(2011)Characterization of a global germplasm collection andits potential utilization for analysis of complex quantitative traits inmaize.Molecular Breeding 28:511-526.和Li H，Peng Z，Yang X，Wang W，Fu J，et al.(2013)Genome-wide association study dissects the genetic architecture of oilbiosynthesis in maize kernels.Nat Genet 45:43-50.公众可从中国科学院植物研究所获得。

根据停止浇水7天再复水6天统计的存活率(表3)，将玉米分为抗旱玉米和非抗旱玉米，

抗旱玉米为存活率≥5％的玉米；

非抗旱玉米为存活率﹤5％的玉米；

其中，抗旱玉米又可以分为中间型玉米和抗旱型玉米；

中间型玉米为存活率﹤40％，且≥5％的玉米；

抗旱型玉米为存活率≥40％的玉米。

2、分子标记InDel-572及其特异引物对鉴定

分别以262个玉米自交系玉米基因组DNA为模板，用上述设计的特异引物对F/R进行PCR扩增，扩增条件同上述一。

若扩增产物的大小为142bp，则待测玉米为单体型甲纯合的玉米；若扩增产物的大小为224bp，则待测玉米为单体型乙纯合的玉米；若扩增产物的大小为142bp和224bp，则待测玉米为单体型甲和乙杂合的玉米。

单体型甲纯合的待测玉米的抗旱性高于或候选高于单体型乙纯合的待测玉米。

262个玉米结果如表1所示，可以看出，

190个单体型甲纯合的玉米，其中，35个单体型甲纯合的玉米实际为抗旱型、98个单体型甲纯合的玉米实际为中间型、57个单体型甲纯合的玉米实际为旱敏感型；可以看出，单体型甲纯合确定为抗旱玉米的准确率达到70％；

72个单体型乙纯合的玉米，其中，0个单体型乙纯合的玉米实际为抗旱型、18个单体型乙纯合的玉米实际为中间型、54个单体型乙纯合的玉米实际为旱敏感型；可以看出，单体型乙纯合确定是否为非抗旱玉米的准确率达到75％；

因此，可以根据鉴定待测玉米基因组中ZmNAC111基因上游是否缺失所示的82bp的DNA分子(分子标记InDel-572)，以确定待测玉米的单体型是单体型甲纯合还是单体型乙纯合，根据所述待测玉米的单体型确定玉米是否为抗旱玉米；若待测玉米为单体型甲纯合，则待测玉米为或候选为抗旱玉米，若待测玉米为单体型乙纯合，则待测玉米不为或候选不为抗旱玉米；所述单体型甲纯合为待测玉米基因组中ZmNAC111基因上游缺失所示的82bp的DNA分子，所述单体型乙纯为待测玉米基因组中ZmNAC111基因上游含有所示的82bp的DNA分子。

3、不同亚群中单体型的等位频率分析

分析表3所示的262份材料的单体型甲和乙的频率，结果如表3和图4所示。结果表明，热带血缘亚群的单体型甲的基因型频率明显高于其他亚群，而这正与热带血缘亚群存活率高于其他亚群的结果相一致。这说明单体型甲是增强玉米抗旱性的有价值的遗传资源。

实施例2、分子标记InDel-572与ZmNAC111基因表达的相关性研究

1、ZmNAC111基因的表达水平和存活率显著相关

为了确定基因表达和蛋白活性对抗旱性的贡献差异，分析了表3的133份玉米自交系材料：B73、CIMBL9、CIMBL59、CIMBL79、SC55、GEMS21、GEMS6、K10、BY4944、CML121、CIMBL143、BY4839、CML191、M153、ZHENG653、YU374、7381、LK11、K12、GY923、WH413、CIMBL151、P178、238、JH59、XUN971、8902、LIAO5114、ZHENG32、ZHI41、SHEN5003、TIE7922、DAN360、MO17、K14、CML189、FCD0602、TY5、TY1、CML360、CML361、CIMBL11、CIMBL27、GEMS54、CIMBL137、GEMS4、CML422、ZHENG35、GEMS14、MO113、GEMS48、CIMBL150、D863F、J4112、TY6、CML162、BY804、QI205、TY3、CIMBL29、CML20、GEMS66、TY2、GEMS32、05W002、CIMBL116、GEMS28、R15X1141、U8112、CML163、YE52106、GEMS44、CIMBL68、CIMBL133、CIMBL141、CIMBL28、JI63、GEMS10、303WX、CIMBL109、CI7、CIMBL111、CIMBL10、GEMS60、CIMBL23、CIMBL69、SY1128、GEMS65、GEMS46、835A、CIMBL149、GEMS30、SY1039、YE8001、CIMBL18、CML171、CIMBL4、CIMBL96、GEMS58、CIMBL157、CIMBL12、CML304、CIMBL95、CIMBL1、ZB648、GEMS37、CHUAN48-2、SW92E114、CML170、CIMBL53、GEMS5、CIMBL62、CIMBL42、JH96C、CIMBL127、CIMBL46、CIMBL2、CIMBL92、CIMBL32、CML69、CML298、CIMBL75、GEMS41、CML118、268、CIMBL91、CIMBL22、CIMBL115、CIMBL123、CIMBL54、CIMBL19、CIMBL70、CIMBL55在正常生长、轻度和极度干旱三个水平下的ZmNAC111基因的mRNA水平和存活率及二者的相关性。具体如下：

上述133份材料中ZmNAC111基因的相对表达水平和存活率间相关分析的方法和结果如下：

用1‰(v/v)Topsin-M(Rotam Crop Sciences Ltd.)灭菌处理玉米种子10分钟，然后用去离子水漂洗三次，最后放在铺有滤纸的培养皿上，28℃下催芽三天，将出芽的种子转移到营养土。苗龄3叶时进行停水处理，在相对叶片含水量(RLWC)为98％(正常生长，停水5天)、70％(中度干旱，停水8天)和58％(重度干旱，停水13天)时，分别取叶片，从不少于三棵苗中，用TRIZOL(Biotopped)法分离出总RNA，紧接着用DNAseⅠ(Takara)法消除基因组的污染，然后用Nanodrop1000(Thermo Scientific product，USA)测定浓度，统一取5微克跑0.8％琼脂糖胶。取1微克总RNA，用重组M-MLV反转录酶(Promega)，以1微克Oligo(dT)23为引物，进行cDNAs的合成。采用荧光实时定量PCR，分析133份材料中ZmNAC111基因的相对表达水平。用特异引物F4和R4对基因ZmNAC111的cDNA进行PCR扩增，以基因ZmUbi-2(GenBank:AFW66445.1)为内参，引物为FU和RU。实时荧光定量PCR在实时荧光定量PCR仪AppliedBiosystems Step One Real-Time PCR System(ABI,USA)上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2^-ΔΔCT计算相对表达水平。

ΔΔC_T＝(C_T.Target－C_T.ZmUbi-2)_{Time x}－(C_T.Target－C_T.ZmUbi-2)_{Time 0}

Time x表示任意时间点，Time₀表示经ZmUbi-2校正后1倍量的目标基因表达。

上述引物的序列如下：

F4：5’-CTACTATGACGACGACAACT-3’；(如序列表序列4所示)

R4：5’-CACTCGCTTCCTCTTGTT-3’；(如序列表序列5所示)

FU：5’-TGGTTGTGGCTTCGTTGGTT-3’；(如序列表序列6所示)

RU：5’-GCTGCAGAAGAGTTTTGGGTACA-3’。(如序列表序列7所示)

用SPSS12.0软件对所得133份材料的ZmNAC111基因的相对表达水平与其存活率，进行相关分析。

结果如图3所示，在轻度干旱(相对叶片含水量RLWC＝70％，图3B)及重度干旱(相对叶片含水量RLWC＝58％，图3C)时，ZmNAC111基因的表达水平均与存活率显著相关(P值分别为9.29E-04和9.03E-06)；在正常生长(相对叶片含水量RLWC＝98％，图3A)条件下，与存活率没有显著关联(P值为5.09E-02)。结果表明，干旱胁迫下ZmNAC111基因的诱导表达，而不是本底或缓慢的表达，是影响干旱胁迫下玉米存活的重要因素，ZmNAC111基因为抗旱相关基因。

2、ZmNAC111优异等位基因型分析

亲本CIMBL91、BY4944、GEMS54、CIMBL9及其F3代单株按照上述1中的方法苗龄3叶时进行停水处理，在相对叶片含水量(RLWC)为98％(正常生长，停水5天)、70％(中度干旱，停水8天)和58％(重度干旱，停水13天)时，分别取叶片，检测ZmNAC111基因的相对表达量，且统计存活率。

结果如图5，图5a是比较了五个亲本的耐旱表型，敏感亲本(单体型乙纯合)BY4944、GEMS54、CIMBL9的存活率分别是2.1％、4.1％、2.1％，两个耐旱型亲本(单体型甲纯合)CIMBL55、CIMBL91分别为82.9％、65.6％。在干旱胁迫条件下，五个亲本中ZmNAC111基因的表达均受胁迫诱导上调，而且两个耐旱型亲本的表达量始终高于敏感亲本(图5b)。每一个F3分离群体，通过PCR基因分型统计超过200个单株，基因型分离比均符合孟德尔遗传定律(图5c)。干旱实验表明，纯和优异等位基因型株系的存活率显著高于纯和敏感基因型的株系(图5e)。综上所述，在玉米苗期耐旱性方面，ZmNAC111的遗传变异有重要贡献，ZmNAC111优异等位基因型是增强玉米耐旱性的有价值的遗传资源。

上述结果表明，单体型甲纯合的玉米(耐旱型亲本)的ZmNAC111表达量大于单体型乙纯合的玉米(敏感亲本)。

3、ZmNAC111耐旱及敏感基因型DNA甲基化及组蛋白H3K9me2分析

上述研究表明，ZmNAC111基因的表达量，是影响玉米苗期耐旱性自然变异的重要因素。因此，启动子区显著的多态性位点InDel-572可能是ZmNAC111基因的功能变异位点。

为了分析MITE转座子的插入与ZmNAC111表达量变化之间的关系，本研究对正常生长及干旱处理下的上述耐旱型自交系CIMBL55及干旱敏感自交系B73中ZmNAC111启动子区的DNA甲基化及组蛋白H3K9me2水平进行了检测。

通过McrBC-qPCR对ZmNAC111基因组8个位点进行检测。取正常生长(RLWC＝98％)及干旱处理(RLWC＝70％)下的自交系B73及CIMBL55新鲜叶片进行DNA提取并纯化。将纯化后的DNA溶于50μl水中，按以下步骤进行酶切反应：10×buffer 5μl，100×BSA 0.5μl，100×GTP 0.5μl，DNA模板1μl，McrBC酶(Takara)1μl(对照组加水)，最后加水补至50μl，37℃过夜酶切。以酶切后的产物为模版进行荧光定量PCR反应。所用引物列于表4中中。结果如图6a所示，B73中ZmNAC111启动子区R1、R2两个位点存在较高程度的DNA甲基化，而其他位点的DNA甲基化状态与CIMBL55相似。相反，CIMBL55中各位点的甲基化状态相似，未检测到较高程度的DNA甲基化。

进一步通过亚硫酸氢处理各个样品后对ZmNAC111启动子MITE位点附近的400bp序列进行BSP测序。将纯化后的DNA溶于水中，根据EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZymoResearch,Orange,CA)试剂盒说明处理基因组DNA。以处理后的DNA为模版扩增片段，其中以B73为模版扩增后的条带大小为433bp，CIMBL55为模版扩增后的条带大小为350bp。扩增片段连接到pGEM-T载体上进行测序，每个样品选取8-10个克隆进行测序后统计DNA甲基化比例。所用引物列于表4中中。

结果如图6b所示，与上述McrBC-qPCR结果相符相符，B73中此400bp区域富含DNA甲基化修饰，主要是CpHpH位点的甲基化，而CIMBL55中该位点主要以较少的CpG位点甲基化形式存在。

另外，本研究还对ZmNAC111基因组蛋白H3K9me2进行了分析。取正常生长(RLWC＝98％)及干旱处理(RLWC＝70％)下的自交系B73及CIMBL55新鲜叶片进行蛋白提取。首先将需要处理的植物组织或叶片剪碎后放入50mL离心管中；每管中加入37mL 1％甲醛溶液，使材料完全浸润在溶液中，真空抽滤20min，处理完后的材料呈透明状；每管中加入2.5mL 2M的Glycine溶液，真空抽滤10min。然后用ddH₂O洗涤两次，用吸水纸去除残留水渍，液氮冰冻后置于-80℃保存。染色质免疫共沉淀(ChIP)参照Bowler等的方法。用于ChIP实验的抗体为anti-H3(Abcam；ab1791)和anti-H3K9me2(Abcam；ab1220)。以洗脱后的产物为模版，通过qPCR对基因组8个位点进行检测。所用引物列于表4中。结果如图6c所示，B73中ZmNAC111启动子区R1、R2、R3、R4四个位点存在较高程度的组蛋白甲基化，而其他位点的组蛋白甲基化状态与CIMBL55相似。

通过上述分析表明，干旱敏感自交系中ZmNAC111启动子区因82bp MITE转座子的插入而导致该位点及其附近DNA和组蛋白发生甲基化，从而造成其下游基因ZmNAC111表达量下降，使得有82bp MITE转座子插入的玉米材料中ZmNAC111表达量普遍低于无转座子插入的材料，即使在干旱处理下，该现象依然存在(图6)。

参考文献：Bowler,C.et al.Chromatin techniques for plant cells.PlantJ.39,776-789(2004).

表4引物列表

4、35S:gZmNAC111-B73及35S:gZmNAC111-CIMBL55株系中ZmNAC111基因表达分析

为了更充分的证明RNA介导的DNA及组蛋白H3K9me2(B73中ZmNAC111启动子区R1、R2、R3、R4四个位点存在较高程度的组蛋白甲基化)甲基化与ZmNAC111基因表达变化的关系，本研究选择在拟南芥中模拟RdDM调控过程。

35S:gZmNAC111-B73株系的构建：将源于敏感型玉米自交系B73的包括ZmNAC111基因-800bp启动子区和5’和3’-UTR的DNA片段导入野生型拟南芥中，培育，得到T₂代转ZmNAC111拟南芥B73(35S:gZmNAC111-B73)；

35S:gZmNAC111-CIMBL55株系的构建：将源于耐旱型玉米自交系CIMBL55的包括ZmNAC111基因-800bp启动子区和5’和3’-UTR的DNA片段导入野生型拟南芥中，培育，得到T₂代转ZmNAC111拟南芥CIMBL55(35S:gZmNAC111-CIMBL55)。

具体如下：如图7a所示，首先设计引物以敏感型玉米自交系B73及耐旱型玉米自交系CIMBL55为模版扩增ZmNAC111基因组，包括-800bp启动子区，5’及3’-UTR。

自交系B73的扩增引物为：B73-F1:AGCTGTTGCGGACTATCAAATAC

B73-R1:AACGTGCATGGGTCGTCAT；

自交系CIMBL55扩增引物为:CIMBL55-F1:AGCTGTTGCGGACTATCAAATAC

CIMBL55-R1:AACGTGCATGGGTCGTCAT；

分别以敏感型玉米自交系B73及耐旱型玉米自交系CIMBL55的基因组DNA为模板，用对应的扩增引物进行扩增。将得到的扩增片段分别连接至载体pGKX的Not I和Xho I酶切位点间(位于35S启动子下游)，得到重组载体pGZ(B73)和重组载体pGZ(CIMBL55)。

将重组载体pGZ(B73)和重组载体pGZ(CIMBL55)分别转化根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株，获得重组农杆菌X(B73)和重组农杆菌X(CIMBL55)。

将重组农杆菌X(B73)和重组农杆菌X(CIMBL55)分别用花芽浸泡法转化野生型哥伦比亚生态型拟南芥，收获T₁代种子；将T₁代种子用含有30mg/L卡那霉素的MS培养基筛选并将抗性苗种植收种，获得T₂代种子；将T₂代种子用含有30mg/L卡那霉素的MS培养基筛选，挑选卡那霉素抗性分离比符合3:1的卡那霉素抗性苗种植,抗性幼苗为T₂代转ZmNAC111拟南芥B73和T₂代转ZmNAC111拟南芥CIMBL55。下述引物的序列如下：

F1：5’-ATGCCGAGAAGCGGCGGCG-3’(序列表序列8)；

R1：5’-CTACTGCATCCCGATGTGGC-3’(序列表序列9)；

FC1：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’(序列表序列10)；

RC1：5’-GCATCAATTCGATCACTCAGAG-3’(序列表序列11)。

T₁代表示转化当代所结的种子及由它所长成的植株；T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株；T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。

上述花芽浸泡法的具体步骤如下：

取重组农杆菌X或CK接种于含有50mg/L卡那霉素、和5mg/L四环素的LB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.8，25℃、5000转/分钟离心2分钟，除去上清液，用重悬溶液(溶剂为水，溶质蔗糖和silwet77的浓度分别为50g/L、0.02％(体积百分含量))重悬菌体，获得侵染液。用移液器将侵染液点在花蕾及生长点，用薄膜覆盖，保湿2天后，置于正常条件下生长，收获种子。

分别提取T₂代转ZmNAC111拟南芥B73和T₂代转ZmNAC111拟南芥CIMBL55植株RNA，反转录得到cDNA为模板，用特异引物F1和R1对基因ZmNAC111的cDNA进行PCR扩增，以拟南芥中的基因Actin2为内参，引物为FC和RC。对ZmNAC111基因表达量进行分析。

结果如图7b,c所示，35S:gZmNAC111-CIMBL55株系中由于没有82bp MITE插入使得ZmNAC111的表达量普遍高于35S:gZmNAC111-B73(有82bp MITE插入)，与玉米自交系B73及CIMBL55中的结果相似，这也进一步证明了启动子区82bp MITE转座子的插入可抑制ZmNAC111基因的表达。

5、35S:gZmNAC111-B73及35S:gZmNAC111-CIMBL55株系耐旱性分析

为了进一步明确ZmNAC111表达量与植株耐旱性的关系，以35S:gZmNAC111-B73及35S:gZmNAC111-CIMBL55纯合过表达株系为材料，进行耐旱性实验。

干旱实验中，将在MS培养基上生长了10天的过表达株系35S:gZmNAC111-B73-2，23及35S:gZmNAC111-CIMBL55-5，-12和野生型植株(VC)同时移苗至相同重量(250g)的营养土中，正常灌溉生长2周左右，停止浇水后做连续的干旱胁迫处理，至表达植株与野生型植株的存活率出现明显差异后复水，6天后统计存活率。

从图8a可以看出，复水后，与野生型植株相比，过表达拟南芥植株较野生型更早出现叶片枯竭萎蔫、失绿、直至整株植物死亡。

ZmNAC111表达量如图8b，35S:gZmNAC111-CIMBL55高于35S:gZmNAC111-B73。

统计结果显示图8c，野生型植株存活率达到30％，而过表达株系大部分存活，其存活率分别为35S:gZmNAC111-B73-2为60％、35S:gZmNAC111-B73-23为65％、35S:gZmNAC111-CIMBL55-5为80％、35S:gZmNAC111-CIMBL55-12为85％。

实验结果表明，35S:gZmNAC111-B73由于有82bp MITE插入使得ZmNAC111表达量低于35S:gZmNAC111-CIMBL55(没有有82bp MITE插入)，从而使得35S:gZmNAC111-B73株系存活率低于35S:gZmNAC111-CIMBL55。

6、35S:gZmNAC111-B73及35S:gZmNAC111-CIMBL55株系中ZmNAC111基因DNA甲基化及组蛋白H3K9me2分析

通过上述分析表明，35S:gZmNAC111-B73株系中ZmNAC111启动子区MITE转座子的插入可抑制ZmNAC111基因的表达。进一步对35S:gZmNAC111-B73及35S:gZmNAC111-CIMBL55株系中ZmNAC111启动子区的DNA甲基化水平进行了检测。

首先，通过McrBC-qPCR对ZmNAC111基因组8个位点进行检测。取正常生长3周的35S:gZmNAC111-B73及35S:gZmNAC111-CIMBL55株系进行DNA提取并纯化。将纯化后的DNA溶于50μl水中，按以下步骤进行酶切反应：10×buffer 5μl，100×BSA 0.5μl，100×GTP0.5μl，DNA模版1μl，McrBC酶(Takara)1μl(对照组加水)，最后加水补至50μl，37℃过夜酶切。以酶切后的产物为模版进行荧光定量PCR反应。所用引物列于表4中。结果如图9a所示，35S:gZmNAC111-B73株系中ZmNAC111启动子区R1位点存在较高程度的DNA甲基化，而其他位点的DNA甲基化状态与CIMBL55相似。相反，35S:gZmNAC111-CIMBL55株系中各位点的甲基化状态相似。

进一步通过亚硫酸氢处理各个样品后对ZmNAC111启动子MITE位点附近的400bp序列进行BSP测序。将纯化后的DNA溶于水中，根据EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZymoResearch,Orange,CA)试剂盒说明处理基因组DNA。以处理后的DNA为模版扩增片段，其中以5S:gZmNAC111-B73为模版扩增后的条带大小为433bp，35S:gZmNAC111-CIMBL55为模版扩增后的条带大小为350bp。扩增片段连接到pGEM-T载体上进行测序，每个样品选取8-10个克隆进行测序后统计DNA甲基化比例。所用引物列于表4中。结果如图9b所示，与上述McrBC-qPCR结果相符相符，35S:gZmNAC111-B73株系中此400bp区域富含DNA甲基化修饰，主要是CpHpH位点的甲基化，而35S:gZmNAC111-CIMBL55株系中该位点主要以少量的CpG位点甲基化形式存在。

另外，本研究还对ZmNAC111基因组蛋白H3K9me2进行了分析。取正常生长3周的35S:gZmNAC111-B73及35S:gZmNAC111-CIMBL55株系进行蛋白提取。首先将需要处理的植物组织或叶片剪碎后放入50mL离心管中；每管中加入37mL 1％甲醛溶液，使材料完全浸润在溶液中，真空抽滤20min，处理完后的材料呈透明状；每管中加入2.5mL 2M的Glycine溶液，真空抽滤10min。然后用ddH₂O洗涤两次，用吸水纸去除残留水渍，液氮冰冻后置于-80℃保存。染色质免疫共沉淀(ChIP)参照Bowler等的方法。用于ChIP实验的抗体为anti-H3(Abcam；ab1791)和anti-H3K9me2(Abcam；ab1220)。以洗脱后的产物为模版，通过qPCR对基因组8个位点进行检测。所用引物列于表4中。通过qPCR对基因组8个位点进行检测，结果如图9c所示，35S:gZmNAC111-B73中ZmNAC111启动子区R1、R2两个位点存在较高程度的组蛋白甲基化，而其他位点的组蛋白甲基化状态与35S:gZmNAC111-CIMBL55相似。

以上结果表明，35S:gZmNAC111-B73中ZmNAC111启动子区因82bp MITE转座子的插入而导致该位点及其附近DNA和组蛋白发生甲基化，从而造成其下游基因ZmNAC111表达量低于35S:gZmNAC111-CIMBL55(无82bp MITE转座子插入)，与玉米中的结果相一致。

7、RdDM突变体中ZmNAC111基因表达分析

为了更深入理解MITE功能，将两个35S:gZmNAC111-B73株系(OE2、OE23)与拟南芥RdDM突变体dcl2-1；dcl4-2、suvh4-3、rdr2-2、ago4-5、drm1-2；drm2-2杂交，通过PCR筛选获得纯合株系。

再此基础上对ZmNAC111基因的表达进行分析，结果如图10。结果表明，在突变体rdr2-2、ago4-5、drm1-2；drm2-2背景下，ZmNAC111基因的表达水平很大程度的提高，与35S:gZmNAC111-CIMBL55株系中ZmNAC111基因的表达水平相似，说明MITE转座子的插入可通过RdDM途径抑制ZmNAC111基因的表达。而突变体dcl2-1；dcl4-2、suvh4-3背景下，ZmNAC111基因的表达水平得到部分提高，表明在RdDM途径中起重要功能的是DCL3，而不是DCL2和DCL4。SUVH4是一个组蛋白甲基转移酶，主要负责组蛋白甲基化修饰，如H3K9me2，该基因突变主要影响组蛋白甲基化修饰，并部分影响DNA甲基化修饰，表明MITE转座子的插入还可造成附近组蛋白的甲基化修饰，从而抑制基因表达。

以上结果表明，在植物体内82bp MITE转座子的插入可通过RdDM途径介导自身及附近DNA序列发生甲基化，并且导致组蛋白发生甲基化，从而抑制ZmNAC111基因的表达。

8、RdDM突变体中ZmNAC111启动子区DNA及组蛋白H3K9me2甲基化分析

进一步对拟南芥RdDM突变体背景下35S:gZmNAC111-B73启动子区的DNA甲基化水平进行了检测。

首先，通过McrBC-qPCR对ZmNAC111基因组R1位点进行检测。取正常生长3周的35S:gZmNAC111-B73及35S:gZmNAC111-CIMBL55株系进行DNA提取并纯化。将纯化后的DNA溶于50μl水中，按以下步骤进行酶切反应：10×buffer 5μl，100×BSA 0.5μl，100×GTP0.5μl，DNA模版1μl，McrBC酶(Takara)1μl(对照组加水)，最后加水补至50μl，37℃过夜酶切。以酶切后的产物为模版进行荧光定量PCR反应。所用引物列于表4中。结果如图11a所示，dcl2-1；dcl4-2、suvh4-3中ZmNAC111启动子区R1位点仍存在较高程度的DNA甲基化，而其他位点的DNA甲基化状态与CIMBL55相似。

进一步通过亚硫酸氢处理各个样品后对ZmNAC111启动子MITE位点附近的400bp序列进行BSP。将纯化后的DNA溶于水中，根据EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZymoResearch,Orange,CA)试剂盒说明处理基因组DNA。以处理后的DNA为模版扩增片段，其中以5S:gZmNAC111-B73为模版扩增后的条带大小为433bp，35S:gZmNAC111-CIMBL55为模版扩增后的条带大小为350bp。扩增片段连接到pGEM-T载体上进行测序，每个样品选取8-10个克隆进行测序后统计DNA甲基化比例。所用引物列于表4中。结果如图11c所示，与上述McrBC-qPCR结果相符相符，suvh4-3中此400bp区域富含DNA甲基化修饰，而rdr2-2、ago4-5、drm1-2；drm2-2中该位点主要以个别CpG位点甲基化形式存在。

另外，本实验还对ZmNAC111基因组蛋白H3K9me2进行了分析，通过ChIP-qPCR对基因组R1,R2,位点进行检测。取正常生长3周的35S:gZmNAC111-B73及35S:gZmNAC111-CIMBL55株系进行蛋白提取。首先将需要处理的植物组织或叶片剪碎后放入50mL离心管中；每管中加入37mL 1％甲醛溶液，使材料完全浸润在溶液中，真空抽滤20min，处理完后的材料呈透明状；每管中加入2.5mL 2M的Glycine溶液，真空抽滤10min。然后用ddH₂O洗涤两次，用吸水纸去除残留水渍，液氮冰冻后置于-80℃保存。染色质免疫共沉淀(ChIP)参照Bowler等的方法。用于ChIP实验的抗体为anti-H3(Abcam；ab1791)和anti-H3K9me2(Abcam；ab1220)。以洗脱后的产物为模版，通过qPCR对基因组R1位点进行检测。所用引物列于表4中。结果如图11b所示，dcl2-1；dcl4-2中ZmNAC111启动子区R1,R2位点存在较高程度的组蛋白甲基化，而其他突变体中组蛋白甲基化状态与CIMBL55相似。

Claims

1. 一种辅助鉴定玉米的抗旱性状的方法，包括如下步骤：检测待测玉米基因组中ZmNAC111 基因上游是否缺失如下82bp的DNA分子：CTCCCTCCGTTTCTTTTTATTAGTCGCTGGATAGTGCAATTTTGCA

CTATCCAGCGACTAATAAAAAGAAACGGAGGGAGTA，以确定待测玉米的单体型是单体型甲纯合还是单体型乙纯合，根据所述待测玉米的单体型确定玉米抗旱性性状：单体型甲纯合的待测玉米的抗旱性候选高于单体型乙纯合的待测玉米；所述单体型甲纯合为待测玉米基因组两条同源染色体中ZmNAC111 基因上游均缺失所述82bp的DNA分子，所述单体型乙纯合为待测玉米基因组两条同源染色体中ZmNAC111 基因上游均含有所述82bp的DNA分子；

所述待测玉米为待测玉米自交系。

2.一种辅助鉴定待测玉米是否为抗旱玉米方法，包括如下步骤：检测待测玉米基因组中ZmNAC111 基因上游是否缺失如下82bp的DNA分子：CTCCCTCCGTTTCTTTTTATTAGTCGCTGGATAGTGCAATTTTGCA

CTATCCAGCGACTAATAAAAAGAAACGGAGGGAGTA，以确定待测玉米的单体型是单体型甲纯合还是单体型乙纯合，根据所述待测玉米的单体型确定玉米是否为抗旱玉米；若待测玉米为单体型甲纯合，则待测玉米候选为抗旱玉米，若待测玉米为单体型乙纯合，则待测玉米候选为非抗旱玉米；所述单体型甲纯合为待测玉米基因组两条同源染色体中ZmNAC111 基因上游均缺失所述82bp的DNA分子，所述单体型乙纯合为待测玉米基因组两条同源染色体中ZmNAC111 基因上游均含有所述82bp的DNA分子；

所述待测玉米为待测玉米自交系。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述非抗旱玉米为在干旱胁迫下存活率小于5%的玉米，所述抗旱玉米为在干旱胁迫下存活率大于等于5%的玉米。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述检测待测玉米基因组中ZmNAC111 基因上游是否缺失如下82bp的DNA分子：CTCCCTCCGTTTCTTTTTATTAGTCGCTGGATAGTGCAATTTTGCA

CTATCCAGCGACTAATAAAAAGAAACGGAGGGAGTA的方法为1）或2）：

1）、直接测序；

2）、用能扩增含有所述82bp的DNA分子的引物对待测玉米基因组DNA进行扩增，根据PCR产物的大小判断是否缺失所述82bp的DNA分子。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

所述能扩增含有所述82bp的DNA片段的引物对由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成；

所述根据PCR产物的大小判断是否缺失所述82bp的DNA分子的标准为如下：

若所述PCR产物的大小仅为142bp，则待测玉米2条同源染色体上ZmNAC111 基因的上游均缺失所述82bp的DNA分子；

若所述PCR产物的大小仅为224bp，则待测玉米2条同源染色体上ZmNAC111 基因的上游均含有所述82bp的DNA分子。

6.一种辅助鉴定玉米的抗旱性状或辅助鉴定待测玉米是否为抗旱玉米的试剂，是检测待测玉米基因组中ZmNAC111 基因上游是否缺失如下82bp的DNA分子：CTCCCTCCGTTTCTTTTTATTAGTCGCTGGATAGTGCAATTTTGCA

CTATCCAGCGACTAATAAAAAGAAACGGAGGGAGTA的物质；

所述待测玉米为待测玉米自交系。

7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于：所述物质为由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成的引物对。

8.辅助鉴定待测玉米自交系的抗旱性状或辅助鉴定待测玉米自交系是否为抗旱玉米的试剂盒，其含有权利要求6或7所述的试剂。

9.权利要求6或7所述的试剂在辅助鉴定玉米自交系的抗旱性状中的应用；

或权利要求6或7所述的试剂在制备辅助鉴定玉米自交系的抗旱性状产品中的应用；

或权利要求6或7所述的试剂在辅助鉴定待测玉米自交系是否为抗旱玉米中的应用；

或权利要求6或7所述的试剂在制备辅助鉴定待测玉米自交系是否为抗旱玉米产品中的应用。

10.权利要求8所述的试剂盒在辅助鉴定玉米自交系的抗旱性状中的应用；

或权利要求8所述的试剂盒在制备辅助鉴定玉米自交系的抗旱性状产品中的应用；

或权利要求8所述的试剂盒在辅助鉴定待测玉米自交系是否为抗旱玉米中的应用；

或权利要求8所述的试剂盒在制备辅助鉴定待测玉米自交系是否为抗旱玉米产品中的应用。

11.权利要求1-5任一所述的方法在培育抗旱玉米中的应用。

12.权利要求6或7所述的试剂在培育抗旱玉米中的应用。

13.权利要求8所述的试剂盒在培育抗旱玉米中的应用。

14.一种培育抗旱玉米的方法，包括培育权利要求1中所述单体型甲纯合的玉米。

15.一种DNA片段，为如下82bp的DNA分子：CTCCCTCCGTTTCTTTTTATTAGTCGCTGGATAGTGCAATTTTGCA

CTATCCAGCGACTAATAAAAAGAAACGGAGGGAGTA。

16.如下82bp的DNA分子：CTCCCTCCGTTTCTTTTTATTAGTCGCTGGATAGTGCAATTTTGCA

CTATCCAGCGACTAATAAAAAGAAACGGAGGGAGTA在调控玉米抗旱性中的应用；

所述应用为将所述82bp的DNA分子插入玉米ZmNAC111基因实现调控玉米自交系抗旱性。