CN114774579B - 小麦TaDTG6基因与抗旱性相关的单体型及其分子标记和应用 - Google Patents

小麦TaDTG6基因与抗旱性相关的单体型及其分子标记和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了小麦TaDTG6基因与抗旱性相关的单体型及其分子标记和应用，涉及基因检测技术领域。本发明通过对210个小麦品种组成的自然变异群体中与抗旱性相关的基因TaDTG6遗传变异分析，找到了形成小麦不同抗旱性的所述多态性位点(InDel574)，该多态性位点仅存在两种单体型。实验证明，通过检测所述多态性位点的情况，即可找到抗旱性相对较高的小麦。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育抗旱小麦品种或研究中具有重要意义。

Description

小麦TaDTG6基因与抗旱性相关的单体型及其分子标记和应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及小麦TaDTG6基因与抗旱性相关的单体型及其分子标记和应用。
背景技术
植物在复杂多变的环境中生长发育，常受到逆境胁迫，其中干旱是影响和限制植物生长发育的主要逆境因子，甚至会导致植物死亡，严重影响农业生产。因此，培育抗旱作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。
小麦(Triticum aestivumL.)是全世界人民最主要的碳水化合物和蛋白质来源。据测算，到2050年时全球小麦的产量至少还需要增长60％才能够满足那时全球人口的需要。因此，迫切需要寻找有效的育种手段来提高小麦产量。尽管全球小麦种植面积和产量取得了突飞猛进的增长，但是干旱、高温、高盐等非生物逆境严重影响小麦产量。在诸多环境胁迫因素中，干旱对农业生产的威胁是最严重的一个世界性问题。研究表明，作物耐旱性遗传改良的关键是优良耐旱基因的克隆和利用。因此，对小麦进行抗旱基因挖掘对培育抗旱小麦品种并提高小麦产量具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供小麦TaDTG6基因与抗旱性相关的单体型及其分子标记和应用，扩大抗旱性相关基因的数量，为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育抗旱小麦品种或研究中具有重要意义。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于多态性位点预测小麦抗旱性的引物组合，所述多态性位点位于SEQ ID No.1所示序列自5’末端的第2964～2989位；
所述引物组合包括核苷酸序列如SEQ ID No.4～7所示的引物。
优选的，在所述多态性位点包括无碱基插入和插入SEQ ID No.3所示的序列。
优选的，在所述多态性位点产生三种基因型，其中单体型甲纯合基因型为在等位基因的所述多态性位点处无碱基插入/无碱基插入；单体型乙纯合基因型为在等位基因的多态性位点处插入SEQ ID No.3所示的序列/插入SEQ ID No.3所示的序列；单体型甲和乙杂合基因型为在等位基因的多态性位点处无碱基插入/插入SEQ ID No.3所示的序列。
本发明还提供了一种利用上述引物组合鉴定和/或辅助鉴定小麦抗旱性的方法，包括以下步骤：以小麦基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.4～5所示的引物对进行第一扩增，得第一扩增产物；
以第一扩增产物为模板，利用SEQ ID No.6～7所示的引物对进行第二扩增，得第二扩增产物；
当所述第二扩增产物的长度为188bp时，判定小麦为单体型甲纯合基因型；
当所述第二扩增产物的长度为214bp时，判定小麦为单体型乙纯合基因型；
当所述第二扩增产物的长度为188bp和214bp时，判定小麦为单体型甲和乙杂合基因型；
单体型甲纯合基因型的抗旱性优于单体型乙纯合基因型和单体型甲和乙杂合基因型。
优选的，所述第一扩增的程序包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，40循环；72℃再延伸5min；
所述第二扩增的程序包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40循环；72℃再延伸5min。
本发明还提供了包含多态性位点的DNA分子或DNA片段在调控小麦抗旱性中的应用，所述多态性位点位于SEQ ID No.1所示序列自5’末端的第2964～2989位。
优选的，所述DNA分子或DNA片段包括以下DNA片段的任意一种：a).小麦基因组DNA上的任意一段含有SEQ ID No.1所示自5’末端第2390～3031位核苷酸的DNA片段或DNA分子；
b).小麦基因组DNA上的任意一段含有SEQ ID No.1所示自5’末端第2390～3137位核苷酸的DNA片段或DNA分子；
c).与a)或b)所述的DNA片段或DNA分子具有至少70％同源性的DNA片段或DNA分子；
d).与a)、b)或c)所述的DNA片段或DNA分子杂交的DNA片段或DNA分子。
本发明还提供了一种鉴定小麦抗旱性种质的方法，包括以待测小麦基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.4～5所示的引物对进行第一扩增，得第一扩增产物；
以第一扩增产物为模板，利用SEQ ID No.6～7所示的引物对进行第二扩增，得第二扩增产物；
当所述第二扩增产物的长度为188bp时，判定小麦为单体型甲纯合基因型；
当所述第二扩增产物的长度为214bp时，判定小麦为单体型乙纯合基因型；
当所述第二扩增产物的长度为188bp和214bp时，判定小麦为单体型甲和乙杂合基因型；
单体型甲纯合基因型的抗旱性优于单体型乙纯合基因型和单体型甲和乙杂合基因型。
本发明还提供了一种培育抗旱性小麦的方法，对小麦的基因型进行鉴定，筛选单体型甲纯合基因型的小麦。
优选的，所述鉴定方法包括测序或PCR-RFLP。
有益效果：本发明提供了一种基于多态性位点预测小麦抗旱性的引物组合，通过对210个小麦品种组成的自然变异群体中与抗旱性相关的基因TaDTG6遗传变异分析，找到了形成小麦不同抗旱性的所述多态性位点(InDel574)，该多态性位点仅存在两种单体型。实验证明，通过检测所述多态性位点的情况，即可找到抗旱性相对较高的小麦。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育抗旱小麦品种或研究中具有重要意义。
附图说明
图1为本发明两种单体型在抗旱型小麦和旱敏感型小麦中的序列差异；
图2为本发明两种单体型中分子标记InDel574进行PCR扩增的结果；
图3为210份小麦品种TaDTG6基因核苷酸多态性分析；
图4为T3代单体型乙过表达小麦株系的qRT-PCR结果；
图5为T3代单体型乙过表达小麦株系的westernblotting结果；
图6为T3代单体型乙过表达小麦株系经干旱处理并复水3天后的表型；
图7为T3代单体型乙过表达小麦株系经干旱处理并复水3天后的存活率统计结果；
图8为T3代单体型甲过表达小麦株系的qRT-PCR结果；
图9为T3代单体型甲过表达小麦株系的westernblotting结果；
图10为T3代单体型甲过表达小麦株系经干旱处理并复水3天后的表型；
图11为T3代单体型甲过表达小麦株系经干旱处理并复水3天后的存活率统计结果；
图12为T3代单体型甲沉默小麦株系的qRT-PCR结果；
图13为T3代单体型甲沉默小麦株系的westernblotting结果；
图14为T3代单体型甲沉默小麦株系经干旱处理并复水3天后的表型；
图15为T3代单体型甲沉默小麦株系经干旱处理并复水3天后的存活率统计结果。
具体实施方式
本发明提供了一种基于多态性位点预测小麦抗旱性的引物组合，所述多态性位点位于SEQ ID No.1所示序列自5’末端的第2964～2989位；
所述引物组合包括核苷酸序列如SEQ ID No.4～7所示的引物。
在本发明中，所述多态性位点优选位于小麦TaDTG6基因中，实施例中优选以小麦中国春(Chinese Spring)参考基因组DNA中TaDTG6基因的起始密码子(ATG)中的A记为“+1”，并以此顺序进行排序。在本发明中所述TaDTG6基因的基因组序列如SEQ ID No.1所示，自SEQ ID No.1的5’端第2390～3031位编码SEQ ID No.2所示的蛋白；自SEQ ID No.1的5’端第2390位为起始密码子ATG的中的碱基A。
在本发明实施例中，利用210份小麦品种的TaDTG基因包括ATG上游的序列进行扩增、测序和比对发现，在TaDTG6基因的起始密码子ATG下游的第574位碱基下游，单体型甲纯合基因型的小麦品种中无缺失DNA片段，单体型乙纯合基因型的小麦品种中插入26bp的DNA片段，将该多态性位点命名为InDel574，该位点的多态性可作为分子标记用于鉴定小麦中上述多态性位点的情况。
本发明基于所述多态性位点组成了小麦抗旱性相关的单体型，且该多态性位点在不同小麦自交系中共存在两种单体型(图1)，即三种基因型。本发明所述多态性位点，优选包括无碱基插入和插入SEQ ID No.3所示的序列。本发明所产生的三种基因型，包括单体型甲纯合基因型(A型)、单体型乙纯合基因型(B型)和单体型甲和乙杂合基因型(C型)，其中A型为在等位基因的所述多态性位点处无碱基插入/无碱基插入；B型为在等位基因的多态性位点处插入SEQ ID No.3所示的序列/插入SEQ ID No.3所示的序列；C型为在等位基因的多态性位点处无碱基插入/插入SEQ ID No.3所示的序列。在本发明中，所述“/”前为一条同源染色体上的情况，所述“/”后为另一条同源染色体上的情况。
本发明基于所述多态性位点设计了两对引物，第一对引物为SEQ IDNo.4和SEQ IDNo.5所示的单链DNA，第二对引物为SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7所示的单链DNA。
本发明还提供了一种利用上述引物组合鉴定和/或辅助鉴定小麦抗旱性的方法，包括以下步骤：以小麦基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.4～5所示的引物对进行第一扩增，得第一扩增产物；
以第一扩增产物为模板，利用SEQ ID No.6～7所示的引物对进行第二扩增，得第二扩增产物；
当所述第二扩增产物的长度为188bp时，判定小麦为单体型甲纯合基因型；
当所述第二扩增产物的长度为214bp时，判定小麦为单体型乙纯合基因型；
当所述第二扩增产物的长度为188bp和214bp时，判定小麦为单体型甲和乙杂合基因型；
单体型甲纯合基因型的抗旱性优于单体型乙纯合基因型和单体型甲和乙杂合基因型。
本发明利用上述两对引物进行扩增时，优选采用两步PCR法，第一对引物的模板为小麦基因组DNA，第二对引物以第一对引物扩增的产物为模板进行扩增。
本发明在利用上述两对引物进行扩增时，优选的扩增体系相同，但扩增程序略有不同，且所述第一扩增的程序，优选包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，40循环；72℃再延伸5min；所述第二扩增的程序，优选包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40循环；72℃再延伸5min。在本发明中，所述扩增体系优选以20μL计，包括Taq酶10μL，DNA模板1μL，上下游引物(10mM)各0.5μL，超纯水8μL。
本发明还提供了包含多态性位点的DNA分子或DNA片段在调控小麦抗旱性中的应用，所述多态性位点位于SEQ ID No.1所示序列自5’末端的第2964～2989位。
本发明对所述小麦的类型并没有特殊限定，优选包括小麦栽培种或小麦杂交种。本发明所述DNA分子或DNA片段，优选包括以下DNA片段的任意一种：
a).小麦基因组DNA上的任意一段含有SEQ ID No.1所示自5’末端第2390～3031位核苷酸的DNA片段或DNA分子；
b).小麦基因组DNA上的任意一段含有SEQ ID No.1所示自5’末端第2390～3137位核苷酸的DNA片段或DNA分子；
c).与a)或b)所述的DNA片段或DNA分子具有至少70％同源性的DNA片段或DNA分子；
d).与a)、b)或c)所述的DNA片段或DNA分子杂交的DNA片段或DNA分子。
在本发明中，扩增包含所述2390～3031位核苷酸的DNA片段或DNA分子的引物对优选如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示，且扩增包含所述2390～3137的DNA片段或DNA分子的引物对优选如SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7所示。
本发明还提供了一种鉴定小麦抗旱性种质的方法，包括以待测小麦基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.4～5所示的引物对进行第一扩增，得第一扩增产物；
以第一扩增产物为模板，利用SEQ ID No.6～7所示的引物对进行第二扩增，得第二扩增产物；
当所述第二扩增产物的长度为188bp时，判定小麦为单体型甲纯合基因型；
当所述第二扩增产物的长度为214bp时，判定小麦为单体型乙纯合基因型；
当所述第二扩增产物的长度为188bp和214bp时，判定小麦为单体型甲和乙杂合基因型；
单体型甲纯合基因型的抗旱性优于单体型乙纯合基因型和单体型甲和乙杂合基因型。
本发明所述方法优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明还提供了一种培育抗旱性小麦的方法，对小麦的基因型进行鉴定，筛选单体型甲纯合基因型的小麦。
本发明对所述基因型的鉴定方法并没有特殊限定，优选包括上述的两步PCR法、测序法或或PCR-RFLP。当利用测序法进行所述基因型的确定时，本发明优选利用SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的引物对扩增待测小麦的基因组DNA中任意一段含有所述多态性位点的DNA片段后进行测序。
下面结合实施例对本发明提供的小麦TaDTG6基因与抗旱性相关的单体型及其分子标记和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中多态性位点的命名方法为标记类型+序号；其中，标记类型有SNP和InDel两种，SNP代表单核苷酸多态性，InDel代表插入或缺失；序号是以小麦中国春(Chinese Spring)参考基因组DNA中TaDTG6基因的起始密码子(ATG)中的A记为“+1”；如SNP181代表在起始密码子(ATG)中的A的下游第181位碱基处存在单核苷酸多态性；InDel574代表在起始密码子(ATG)中的A的下游第574位碱基下游存在1个或多个碱基的插入或缺失。
实施例1
与小麦抗旱性相关的单体型及其分子标记与应用
一、鉴定单体型的分子标记InDel574及其特异引物
将表3所示210份小麦品种的TaDTG基因包括ATG上游的序列进行扩增、测序和比对发现，在TaDTG6基因的起始密码子ATG下游的第574位碱基下游，单体型甲纯合的小麦品种中无缺失DNA片段，单体型乙纯合的小麦品种中插入26bp的DNA片段，将该多态性位点命名为InDel574，所述26bp的DNA片段的序列如SEQ ID No.3所示。该位点的多态性可作为分子标记用于鉴定小麦中上述多态性位点的情况，具体方法如下：
1、根据InDel574两侧的保守序列，设计特异引物对SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。
2、以小麦基因组DNA为模板，用步骤1设计的引物对进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，40循环；72℃再延伸5min。
3、根据InDel574两侧的保守序列，设计特异引物对SEQ ID No.6和SEQ ID No.7。
4、以步骤2扩增得到的小麦基因组DNA为模板，用步骤3设计的引物对进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40循环；72℃再延伸5min。
若扩增产物的大小为188bp，则待测小麦为单体型甲纯合的小麦；若扩增产物的大小为214bp，则待测小麦为单体型乙纯合的小麦；若扩增产物的大小为188bp和214bp，则待测小麦为单体型甲和乙杂合的小麦，如图2所示。
二、应用分子标记InDel574及其特异引物对不同小麦进行分型及抗旱性分析
以抗旱型小麦品种Jinmai47(表3中序号120)为父本，旱敏感型小麦品种GLUYASEARLY(表3中序号44)，Yangmai13(表3中序号70)为母本杂交，杂交后代与母本回交4代，再自交2代，获得两个近等基因系Jinmai47×GLUYAS EARLY和Jinmai47×Yangmai13。BC4F2代单株用上述(一)中设计的引物和方法进行两步PCR扩增，若扩增产物的大小为188bp，则待测小麦为单体型甲纯合的小麦；若扩增产物的大小为214bp，则待测小麦为单体型乙纯合的小麦；若扩增产物的大小为188bp和214bp，则待测小麦为单体型甲和乙杂合的小麦。
从上述BC4F2分离群体中单体型甲纯合的小麦种子和单体型乙纯合的小麦种子播种于栽培盆(长×宽×深为0.50×0.30×0.2米，盛有3千克蛭石和3千克草炭土混合的栽培基质)中，每盆种植96株，在温室中，于光周期为每天16小时光照和8小时黑暗、温度为白天14℃、夜晚12℃、空气湿度60％的条件下培养21天，将植株进行干旱处理(即不浇水)，待土壤相对含水量(即采用购于北京盟创伟业科技有限公司的土壤水分仪SU-LA(W)，测得的土壤中水分的体积百分含量)达到0％后一周，进行复水。复水3天后统计各亲本及群体中各基因型植株的存活率(将复水3天后地上部未能转绿的植株，定义为死亡植株，将复水3天后地上部能转绿的植株定义为存活植株；存活率为存活植株占总植株数的百分比)。实验重复三次，取均值进行统计分析。结果如表1和表2所示，单体型甲纯合的小麦抗旱性大于单体型乙纯合的小麦抗旱性。在小麦育种中，应选择抗旱性较高的单体型甲纯合的小麦进行育种。
表1亲本的基因型及干旱处理后的存活率统计结果
Figure GDA0004059651610000091
Figure GDA0004059651610000101
表2BC4F2近等基因系的基因型及干旱处理后的存活率统计结果
Figure GDA0004059651610000102
注：表2中结果后的小写字母为群体内不同基因型植株经单因素方差分析(one-wayANOVA)在P<0.05的显著性，含有相同小写字母表示差异不显著，不含有相同小写字母表示差异显著；结果后的大写字母为群体内不同基因型植株经单因素方差分析(one-wayANOVA)在P<0.01的显著性，含有相同大写字母表示差异不显著，不含有相同大写字母表示差异极显著。
实施例2
与小麦抗旱性相关的单体型的发现
1、抗旱性调查
将210份小麦品种(已在文章中公开，并且公众可从西北农林科技大学获得：MaoH,Li S,Chen B,Jian C,Mei F,Zhang Y,Li F,Chen N,Li T,Du L,Ding L,Wang Z,ChengX,Wang X,Kang Z.Variation in cis-regulation of aNAC transcription factorcontributes to drought tolerance in wheat.Mol Plant.2022,15(2):276-292.)组成的自然变异群体种植在栽培池中，用营养土和蛭石作栽培基质，分装于两池中。每池均分成210个小区，每个小区可种植12棵苗。待三片真叶苗龄时停止浇水，进行干旱处理，一直持续到土壤相对含水量降到零后7天进行复水，复水3天后统计存活率。统计分析中用到的干旱表型数据，均为独立重复试验的均值。结果如表3所示，根据存活率，将抗旱性分成三种类型：抗旱型为存活率≥40％的小麦品种；旱敏感型为存活率﹤10％的小麦品种；中间型为10％≤存活率﹤40％的小麦品种。
表3210份小麦品种组成的自然变异群体的抗旱性调查结果
Figure GDA0004059651610000111
Figure GDA0004059651610000121
Figure GDA0004059651610000131
Figure GDA0004059651610000141
Figure GDA0004059651610000151
Figure GDA0004059651610000161
Figure GDA0004059651610000171
Figure GDA0004059651610000181
Figure GDA0004059651610000191
2、多态性位点统计
对表3所示的210份小麦品种中TaDTG6基因的编码区、5’和3’端非翻译区约3.0kb基因组片段进行测序，分三段进行测序。
第一段：SEQ ID No.1的第1位-第898位，所用引物序列为SEQ ID No.10和SEQ IDNo.11；
第二段：SEQ ID No.1第786位-第2350位，所用引物序列为SEQ IDNo.12和SEQ IDNo.13；
第三段：SEQ ID No.1第1949位-第3137位，所用引物序列为SEQ IDNo.14和SEQ IDNo.15。
测序结果用MEGA5.0(http://www.megasoftware.net/)比对。根据比对结果分析核苷酸多态性，得到17个多态性位点，其中有14个SNP和3个InDels(图3所示)，最小等位基因频率(MAF)≥0.05。根据多态性位点InDel574，可将210份小麦品种中TaDTG6基因序列分为两种单体型，即单体型甲Del574和单体型乙In574。
实施例3
过表达单体型乙TaDTG6-BIn574不影响小麦抗旱性
1、重组载体的构建
将单体型乙TaDTG6In574 CDS序列(图1所示)克隆到pCAMBIA3301的HindIII和EcoRI酶切位点间(位于Ubi启动子下游)，并经测序证实，获得重组载体pCAMBIA3301-GZ1。
2、重组根癌农杆菌的获得
将重组载体pCAMBIA3301-GZ1转化根癌农杆菌EHA105菌株，获得含有重组载体pCAMBIA3301-GZ1的重组农杆菌Y；
将空载体pCAMBIA3301转化根癌农杆菌EHA105菌株，获得含有空载体pCAMBIA3301的重组农杆菌CK。
3、转基因小麦的获得
将重组农杆菌Y用农杆菌介导的基因转化法转化小麦品种Fielder(以下也称为野生型小麦)，得到T0代植株，并种植于温室(16h-光照/8h-黑暗)；T0代植株经PCR鉴定(SEQ IDNo.20和SEQ ID No.21)后获得阳性植株，自交后获得T1代种子；T1代植株再经PCR鉴定后获得阳性植株，自交后获得T2代种子，同时随机选取阳性苗和阴性苗按照步骤4的方法进行qRT-PCR检测，确定过表达单体型乙TaDTG6In574的表达量。T2代植株再经PCR鉴定后获得阳性植株，自交后获得T3代种子。
将重组农杆菌CK按照上述方法转化到小麦品种Fielder(以下也称为野生型小麦)，直到得到T3代转pCAMBIA3301小麦株系(VC)。
T0代表示转化当代所长成的植株；T1代表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株；T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株。T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。
上述农杆菌介导的基因转化法的具体步骤如下：
重组农杆菌Y接种于含有25mg/L壮观霉素的YEB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD600为0.5。取小麦幼胚放置于装满保存液的2mL离心管，46℃热处理3min，4℃、2000转/分钟离心10分钟。将准备好的重组农杆菌加入处理好的幼胚，22℃黑暗培养3天，转移到新的培养基上28℃黑暗培养7-10天。通过不同浓度草胺膦筛选，最后转移到分化培养基上，分化后转移到生根培养基上培养，一定大小后移入营养土中。
4、qRT-PCR检测转基因小麦
取步骤3获得的野生型小麦(WT)、T3代转pCAMBIA3301小麦株系(VC)、T3代转单体型乙TaDTG6-BIn574小麦株系(OE1-OE3)，用TRIZOL(Biotopped)法分离出总RNA，紧接着用DNAseⅠ(Takara)法消除基因组的污染，然后用Nanodrop1000(Thermo Scientificproduct,USA)测定浓度，统一取5微克跑0.8％琼脂糖胶。取1微克总RNA，用重组M-MLV反转录酶，以1微克Oligo(dT)23(Promega)为引物，进行cDNAs的合成，用特异引物SEQ ID No.16和SEQ ID No.17对单体型乙TaDTG6In574的cDNA进行qRT-PCR定量，以小麦的基因TaActin1为内参，内参基因引物为SEQ IDNo.18和SEQ ID No.19。
T3代转单体型乙TaDTG6In574小麦株系OE1-OE3中目的基因TaDTG6的表达量显著高于野生型WT(图4)。western blotting结果显示小麦株系OE1-OE3中TaDTG6蛋白水平显著高于野生型WT(图5)。T3代转pCAMBIA3301小麦株系和野生型小麦结果无显著差异。
5、转基因小麦的抗旱性表型分析
取T3代转单体型乙TaDTG6In574小麦株系(OE1、OE2、OE3)、野生型小麦(WT)植株和T3代转pCAMBIA3301小麦株系种子，播种到装有0.5kg营养土的盒子中(25.0cm×15.0cm×10.0cm)，正常条件下生长21天后，进行干旱处理(即停止浇水)，20-30天后，表型差异明显即WT植株叶片明显干枯而OE1、OE2、OE3株系叶片严重萎蔫时复水。复水3天后统计各株系植株的存活率(将表现为能正常生长和收种的植株定义为存活植株，将表现为严重受旱害且不能正常生长和收种的植株定义为死亡植株；存活率为各株系中存活植株数目占总植株数的百分比)。实验设3次重复，每次重复各株系的植株数不少于18株，取平均值进行统计分析。
结果如图6所示，T3代转单体型乙TaDTG6In574小麦株系复水后的存活率与野生型小麦WT无显著差异。复水3天后统计各株系植株的存活率结果如图7所示，T3代转单体型乙TaDTG6In574小麦株系复水后的存活率为17％-25％，与野生型小麦无显著差异。T3代转pCAMBIA3301小麦株系和野生型小麦结果无显著差异。
实施例4
过表达单体型甲TaDTG6Del574提高小麦抗旱性
1、重组载体的构建
将SEQ ID No.1的第2390-3031位所示的DNA片段(单体型甲TaDTG6Del574)克隆到pCAMBIA3301的HindIII和EcoRI酶切位点间(位于Ubi启动子下游)，并经测序证实，获得重组载体pCAMBIA3301-GZ2，该重组载体表达SEQ ID No.2所示的TaDTG6蛋白。
2、重组根癌农杆菌的获得
将重组载体pCAMBIA3301-GZ2转化根癌农杆菌EHA105菌株，获得含有重组载体pCAMBIA3301-GZ2的重组农杆菌Y；
将空载体pCAMBIA3301转化根癌农杆菌EHA105菌株，获得含有空载体pCAMBIA3301的重组农杆菌CK。
3、转基因小麦的获得
将重组农杆菌Y用农杆菌介导的基因转化法转化小麦品种Fielder(以下也称为野生型小麦)，得到T0代植株，并种植于温室(16h-光照/8h-黑暗)；T0代植株经PCR鉴定(引物为SEQ ID No.20和SEQ ID No.21)后获得阳性植株，自交后获得T1代种子；T1代植株再经PCR鉴定后获得阳性植株，自交后获得T2代种子，同时随机选取阳性苗和阴性苗按照步骤4的方法进行qRT-PCR检测，确定过表达单体型甲TaDTG6Del574的表达量。T2代植株再经PCR鉴定后获得阳性植株，自交后获得T3代种子。
将重组农杆菌CK按照上述方法转化到小麦品种Fielder(以下也称为野生型小麦)，直到得到T3代转pCAMBIA3301小麦株系(VC)。
上述农杆菌介导的基因转化法的具体步骤如下：
重组农杆菌Y接种于含有25mg/L壮观霉素的YEB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD600为0.5。取小麦幼胚放置于装满保存液的2mL离心管，46℃热处理3min，4℃、2000转/分钟离心10分钟。将准备好的重组农杆菌加入处理好的幼胚，22℃黑暗培养3天，转移到新的培养基上28℃黑暗培养7-10天。通过不同浓度草胺膦筛选，最后转移到分化培养基上，分化后转移到生根培养基上培养，一定大小后移入营养土中。
4、qRT-PCR检测转基因小麦
取步骤3获得的野生型小麦(WT)、T3代转pCAMBIA3301小麦株系(VC)、T3代转单体型甲TaDTG6Del574小麦株系(OE1-OE3)，用TRIZOL(Biotopped)法分离出总RNA，紧接着用DNAseⅠ(Takara)法消除基因组的污染，然后用Nanodrop1000(Thermo Scientific product,USA)测定浓度，统一取5微克跑0.8％琼脂糖胶。取1微克总RNA，用重组M-MLV反转录酶，以1微克Oligo(dT)23(Promega)为引物，进行cDNAs的合成，用特异引物SEQ IDNo.16和SEQ IDNo.17对基因TaDTG6Del574的cDNA进行qRT-PCR定量，以小麦的基因TaActin1为内参，引物对为SEQ ID No.18和SEQ ID No.19.
结果如图8所示，T3代转TaDTG6小麦株系OE1-OE3中单体型甲TaDTG6Del574的表达量显著高于野生型WT。westernblotting结果显示小麦株系OE1-OE3中TaDTG6蛋白水平显著高于野生型WT(图9)。T3代转pCAMBIA3301小麦株系和野生型小麦结果无显著差异。
5、转基因小麦的抗旱性表型分析
取T3代转TaDTG6小麦株系(OE1、OE2、OE3)、野生型小麦(WT)植株和T3代转pCAMBIA3301小麦株系种子，播种到装有0.5kg营养土的盒子中(25.0cm×15.0cm×10.0cm)，正常条件下生长21天后，进行干旱处理(即停止浇水)，20-30天后，表型差异明显即WT植株叶片明显干枯而OE1、OE2、OE3株系叶片严重萎蔫时复水。复水3天后统计各株系植株的存活率(将表现为能正常生长和收种的植株定义为存活植株，将表现为严重受旱害且不能正常生长和收种的植株定义为死亡植株；存活率为各株系中存活植株数目占总植株数的百分比)。实验设3次重复，每次重复各株系的植株数不少于18株，取平均值进行统计分析。
结果如图10所示，T3代转单体型甲TaDTG6Del574小麦株系复水后的存活率高于野生型小麦WT。复水3天后统计各株系植株的存活率结果如图11所示，T3代转单体型甲TaDTG6Del574小麦株系复水后的存活率为90％-100％，显著高于野生型小麦WT。T3代转pCAMBIA3301小麦株系和野生型小麦结果无显著差异。
实施例5
沉默单体型甲TaDTG6降低小麦抗旱性
1、重组载体的构建
将SEQ ID No.1的第2609-2906位所示的DNA片段用引物SEQ ID No.20和SEQ IDNo.21扩增后克隆到pWMB006的BamHI和XhoI酶切位点间(位于Ubi启动子下游)，并经测序证实，获得重组载体pWMB006-GZ。
2、重组根癌农杆菌的获得
将重组载体pWMB006-GZ转化根癌农杆菌EHA105菌株，获得含有重组载体pWMB006-GZ的重组农杆菌Y。
将空载体pWMB006转化根癌农杆菌EHA105菌株，获得含有空载体pWMB006的重组农杆菌CK；
3、转基因小麦的获得
将重组农杆菌Y用农杆菌介导的基因转化法转化小麦品种Fielder(以下也称为野生型小麦)，得到T0代植株，并种植于温室(16h-光照/8h-黑暗)；T0代植株经PCR鉴定(引物为SEQ ID No.22和SEQ ID No.23)后获得阳性植株，自交后获得T1代种子；T1代植株再经PCR鉴定后获得阳性植株，自交后获得T2代种子，同时随机选取阳性苗和阴性苗按照步骤4的方法进行qRT-PCR检测，确定过表达TaDTG6的表达量。T2代植株再经PCR鉴定后获得阳性植株，自交后获得T3代种子。
将重组农杆菌CK按照上述方法转化到小麦品种Fielder(以下也称为野生型小麦)，直到得到T3代转pWMB006小麦株系。
上述农杆菌介导的基因转化法的具体步骤如下：
重组农杆菌Y接种于含有25mg/L壮观霉素的YEB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD600为0.5。取小麦幼胚放置于装满保存液的2mL离心管，46℃热处理3min，4℃、2000转/分钟离心10分钟。将准备好的重组农杆菌加入处理好的幼胚，22℃黑暗培养3天，转移到新的培养基上28℃黑暗培养7-10天。通过不同浓度草胺膦筛选，最后转移到分化培养基上，分化后转移到生根培养基上培养，一定大小后移入营养土中。
4、qRT-PCR检测转基因小麦
取步骤3获得的野生型小麦、T3代转pWMB006小麦株系、T3代转pWMB006-GZ小麦株系(RI1-RI3)，用TRIZOL(Biotopped)法分离出总RNA，紧接着用DNAseⅠ(Takara)法消除基因组的污染，然后用Nanodrop1000(Thermo Scientific product,USA)测定浓度，统一取5微克跑0.8％琼脂糖胶。取1微克总RNA，用重组M-MLV反转录酶，以1微克Oligo(dT)23(Promega)为引物，进行cDNAs的合成，用特异引物SEQ ID No.16和SEQ ID No.17对基因TaDTG6的cDNA进行qRT-PCR定量，以小麦的基因TaActin1为内参，引物为SEQ ID No.18和SEQ ID No.19。
图12的结果表明，T3代转pWMB006-GZ小麦株系RI1-RI3中目的基因TaDTG6的表达量显著低于野生型WT。此外，westernblotting结果显示小麦株系RI1-RI3中TaDTG6蛋白水平显著低于野生型WT(图13)。T3代转pWMB006小麦株系和野生型小麦结果无显著差异
5、转基因小麦的抗旱性表型分析
取T3代TaDTG6沉默小麦株系(RI1、RI2、RI3)、野生型小麦(WT)植株和T3代转pCAMBIA3301小麦株系种子，播种到装有0.5kg营养土的盒子中(25.0cm×15.0cm×10.0cm)，正常条件下生长21天后，进行干旱处理(即停止浇水)，20-30天后，表型差异明显即WT植株叶片明显干枯而RI1、RI2、RI3株系叶片严重萎蔫时复水。复水3天后统计各株系植株的存活率(将表现为能正常生长和收种的植株定义为存活植株，将表现为严重受旱害且不能正常生长和收种的植株定义为死亡植株；存活率为各株系中存活植株数目占总植株数的百分比)。实验设3次重复，每次重复各株系的植株数不少于18株，取平均值进行统计分析。
结果如图14所示，T3代转pWMB006-GZ小麦株系复水后的存活率低于野生型小麦。复水3天后统计各株系植株的存活率结果如图15所示，T3代转pWMB006-GZ小麦株系复水后的存活率为8％～15％，显著低于野生型小麦。T3代转pWMB006小麦株系和野生型小麦结果无显著差异
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 小麦TaDTG6基因与抗旱性相关的单体型及其分子标记和应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3137
<212> DNA
<213> 小麦(Triticum aestivumL.)
<400> 1
gcaaattgtt gctgctgacc cgtgcctccc ccttcttgaa actgctccat cagcattaaa 60
ttttgcactt cccattattt gtggctgcca agaggatgca cgaaccggtt ggggtcccct 120
cctgtcttga cttctcccgt ttatgatatc caattctgag ataaagctcc gtataaatgc 180
atcagttgat tacggagact taaaaatatc ctcgtgagta gcctttcttc tgtctcccca 240
tatcgcccaa gccgtcacca ccactcggat aaattctttc ccatccagac tctcgtgcaa 300
tgcaaagagc caatctttag cactctcttg ctggtgtacg atgagcttct cgaccaattc 360
ttcgggtgcc aaggcccaaa tgctcctagc cagcgcacag gtaaggagcg catgcctcca 420
tgtatccttc gctccgcaca gcgggcatga gttcgtctcg gccatatgac gatgatgcaa 480
aacctcacca ctgggcatag agtgtctggc caggcgccaa agaaacattc gaagtttgga 540
aggaacttgg atatgccaca ggacgctcca taccttttcc tcttgcccag ccgacgattc 600
ctcattgcca tgccaccagt tgtccctgtt cgtcctcgtt ctgaggatca tccgataagc 660
cgaactgaca gtaaacaccc ctgtactttc ttcatgccat gcccagaagt ccggtagcct 720
cctcgtacaa actggaattt taaggatctc ctcggcgtca aaaggagtaa aaatagtgtg 780
aatcatccct tccttccact gcgtcgaagt attgtctagg aggtctacta ccttttctgg 840
aggattagga attaatgaca ccaaaggcct cttgaaacta tctcgaggga tccaattatt 900
cctccatatg tgtgtagtgt ctccatcacc aatccttcga actattcctt gagctaagat 960
atctctccca tccagaattg ctcgccaaat ctgtgatgaa cgtgagccca actctgcatc 1020
caacaaattg cattgaggaa agtaaacaac ctttagtatt tgcgcactca aagaggattc 1080
ttctgtcaag actctccatg cttggcgggc aaggagtgct aggttaaaaa tatccatatc 1140
tcgaaaacca aggcccccca gctgcttcgg ttggatcata gtgtcccacg caacccagct 1200
gggttttctt tttccttctt tactgcccca ccaaaactgc cgtataattg atgttatatt 1260
ctcacataaa ccccgtggca accggaaaca agacatagaa tatacgggta tggcttgagc 1320
gaccgatttg atcaagacct ctttccctgc tgcagacagt aacttctcca tccatccttt 1380
gatcttctcc caaacccgat ctcgcagata tttaaaggta ccgtttttgg actggccaac 1440
atctgttggc atgccaagat actgctcatt cagggactca ttctggacat gtaaagtatt 1500
tttgatctct gtcctcaaag gaagcgggca acctgggctg aagaagattg atgatttgtc 1560
attatttata cgatgtcctg aagcattgca ataactatcc aataggtttg acactgcaac 1620
cgaaccctct acactagcct taaaaagcag taggctgtca tctgcaaaca aaaggtggtt 1680
gatagatggg gctgttgggg ccaccttaat acctgcaagt gatgactgtg aactggattt 1740
caggaggcac gaaaggccct ctgctgcaat caagaataag taggagaaga tcgggtctcc 1800
ctgtcggatt cctctggtag gtctgaaaga ctcgagcttc tcaccattaa aaatgacaga 1860
aaagggtact gaataaatca tacccattac tgtggtgatc cactgccgag agaagccgaa 1920
ttatactgtt aatgtgatcc aacagacccc gcggtagtaa ctccaaaccc agaaacgaac 1980
aaaagcagag cccagcagcc cacaacgctc gatcgcgcgc cgtcgcaacc caaaatggcc 2040
catggcagcg cgtcgcgggc gtcaccatcg ccttccgtgc agcttccagc tggtttgaga 2100
gccaactgaa acaccccacc tatccaaaaa aaaaaaaaaa cgccgcgccc gcgagagcct 2160
actcccgccc atggcacatc gaaccttcac ttcactccgg ctggctcctc gtgtcacccc 2220
gcgtttgcag cagcgcaccg cacgcactcc ctcccatccc atccatccat ccatcagatg 2280
cgtagctata taaaccgccg ccggatattt ccctcccaaa cccaaactca aaccaagcca 2340
ggcactgcca ctgaggcaca caagtccacc tcgaacggac tgatcactga tggagcgggc 2400
gtactgcggc agcggctact cgtcgtcggg aacgaagtct ccggcggccg gcgaccggga 2460
ggagggcacg tacatgacgg tgtcgtcggc gccgcccaag cggcggacgg ggaggaccaa 2520
ggtcagggag acgaggcacc cggtgtacaa gggggtgcgc agcaggaacc ccggccggtg 2580
ggtctgcgag ctgcgcgagc cgcacgggaa gcagaggcta tggctcggca ccttcgacac 2640
cgccgagatg gcggctcgcg cgcacgacgt cgccgccctc gcgctccgcg gccgcgccgc 2700
gtgcctcaac ttcgccgact cgccgcgcac gctgcgggtg ccgccgcagg ggggcggcca 2760
cgacgagata cgccgggccg cggtcgaggc ggctgaactg ttccgcccgg cgcctgggca 2820
gcggaatgca gctaccgagg tgccggctgc ttcgccggta gacgcgggga acgcggagct 2880
cgtcgcaaac tctccttact acctcatgga tggattggaa ttcgaaatgc agagctacct 2940
tgacatggcg cacggcatgc tcatcgacgt ggatcgagga ggactacgac tgcgaggtca 3000
gcctgtggaa ctactgatgg cgcgcacctg agccggcccg gccctggcgt tctcgattca 3060
ctgtacatac agcctattat ggtcatccag gacgacctgt acttgtggtg tgttggtgtg 3120
atatttttcc tgctatt 3137
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> 小麦(Triticum aestivumL.)
<400> 2
Met Glu Arg Ala Tyr Cys Gly Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Gly Thr Lys
1 5 10 15
Ser Pro Ala Ala Gly Asp Arg Glu Glu Gly Thr Tyr Met Thr Val Ser
20 25 30
Ser Ala Pro Pro Lys Arg Arg Thr Gly Arg Thr Lys Val Arg Glu Thr
35 40 45
Arg His Pro Val Tyr Lys Gly Val Arg Ser Arg Asn Pro Gly Arg Trp
50 55 60
Val Cys Glu Leu Arg Glu Pro His Gly Lys Gln Arg Leu Trp Leu Gly
65 70 75 80
Thr Phe Asp Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala
85 90 95
Leu Ala Leu Arg Gly Arg Ala Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Pro
100 105 110
Arg Thr Leu Arg Val Pro Pro Gln Gly Gly Gly His Asp Glu Ile Arg
115 120 125
Arg Ala Ala Val Glu Ala Ala Glu Leu Phe Arg Pro Ala Pro Gly Gln
130 135 140
Arg Asn Ala Ala Thr Glu Val Pro Ala Ala Ser Pro Val Asp Ala Gly
145 150 155 160
Asn Ala Glu Leu Val Ala Asn Ser Pro Tyr Tyr Leu Met Asp Gly Leu
165 170 175
Glu Phe Glu Met Gln Ser Tyr Leu Asp Met Ala His Gly Met Leu Ile
180 185 190
Asp Val Asp Arg Gly Gly Leu Arg Leu Arg Gly Gln Pro Val Glu Leu
195 200 205
Leu Met Ala Arg Thr
210
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgagccacc gccattggct gggccg 26
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcattgcaat aactatccaa tagg 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
attgcctgtc caacgtgtaa 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgcaaactct ccttactacc tca 23
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgtatgtaca gtgaatcgag aacg 24
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggagcggg cgtactg 17
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcaggtgcgc gccatcag 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcaaattgtt gctgctgac 19
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
taattggatc cctcgagata g 21
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcccttcctt ccactgcg 18
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tggcagtgcc tggcttg 17
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccgcggtagt aactccaaa 19
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aatagcagga aaaatatcac acca 24
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agacgcgggg aacgc 15
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcagtagttc cacaggctga cc 22
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaatctggca tcacactttc tac 23
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtctcaaaca taatctgggt catc 24
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcgatgctca ccctgttgtt tg 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgtataattg cgggactcta atc 23
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cggcagtaga taaagagtac ccac 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
catgaacatt aaagtgatac gtgg 24

Claims (7)

1.一种基于多态性位点预测小麦抗旱性的引物组合，其特征在于，所述多态性位点位于SEQ ID No.1所示序列自5’末端的第2964～2989位；
所述引物组合包括核苷酸序列如SEQ ID No.4～7所示的引物；
在所述多态性位点包括无碱基插入和插入SEQ ID No.3所示的序列。
2.根据权利要求1所述引物组合，其特征在于，在所述多态性位点产生三种基因型，其中单体型甲纯合基因型为在等位基因的所述多态性位点处无碱基插入/无碱基插入；单体型乙纯合基因型为在等位基因的多态性位点处插入SEQ ID No.3所示的序列/插入SEQ IDNo.3所示的序列；单体型甲和乙杂合基因型为在等位基因的多态性位点处无碱基插入/插入SEQ ID No.3所示的序列。
3.一种利用权利要求1或2所述引物组合鉴定小麦抗旱性的方法，其特征在于，包括以下步骤：以小麦基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.4～5所示的引物对进行第一扩增，得第一扩增产物；
以第一扩增产物为模板，利用SEQ ID No.6～7所示的引物对进行第二扩增，得第二扩增产物；
当所述第二扩增产物的长度为188bp时，判定小麦为单体型甲纯合基因型；
当所述第二扩增产物的长度为214bp时，判定小麦为单体型乙纯合基因型；
当所述第二扩增产物的长度为188bp和214bp时，判定小麦为单体型甲和乙杂合基因型；
单体型甲纯合基因型的抗旱性优于单体型乙纯合基因型和单体型甲和乙杂合基因型。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述第一扩增的程序包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，40循环；72℃再延伸5min；
所述第二扩增的程序包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40循环；72℃再延伸5min。
5.包含多态性位点的DNA分子或DNA片段在调控小麦抗旱性中的应用，其特征在于，所述多态性位点位于SEQ ID No.1所示序列自5’末端的第2964～2989位；在所述多态性位点包括无碱基插入和插入SEQ ID No.3所示的序列。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述DNA分子或DNA片段为a)或b)所示的DNA片段：a).小麦基因组DNA上的任意一段有SEQ IDNo.1所示自5’末端第2390～3031位核苷酸的DNA片段或DNA分子；
b).小麦基因组DNA上的任意一段有SEQ ID No.1所示自5’末端第2390～3137位核苷酸的DNA片段或DNA分子。
7.一种培育抗旱性小麦的方法，其特征在于，对小麦的基因型进行鉴定，筛选单体型甲纯合基因型的小麦；
所述单体型甲纯合基因型通过权利要求3或4所述方法鉴定得到。
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